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Die Muskelrelaxanzien Rocuronium, Vecuronium,
Pancuronium, Atracurium und Succinylcholin aktivieren TRPA1 - und TRPV1 - Rezeptoren nozizeptiver Neurone
Aus der Klinik für Anästhesiologie
der
Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Bernhard Kellner
Als Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Markus F. Neurath
Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachterin: Prof. Dr. Carla Nau
Tag der mündlichen Prüfung: 28. Januar 2020
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
1.1. Deutsch 1
1.2. Englisch 2
2. Einleitung 4
2.1. Einführung in das Thema 4
2.2. Muskelrelaxanzien 5
2.2.1. Historie 5
2.2.2. Chemische Entwicklung der Muskelrelaxanzien 7
2.2.3. Rocuronium 8
2.2.4. Pharmakokinetik 8
2.2.5. Pharmakodynamik 9
2.2.6. Einsatz bei Nieren- und Lebererkrankungen 10
2.2.7. Einsatz bei sehr jungen und alten Patienten 12
2.2.8. Zusammensetzung der Rocuronium-Injektionslösung 12
2.3. Nozizeptives System 13
2.3.1. Allgemeines 13
2.4. Transient receptor potential-Kanäle 15
2.4.1. Hitzenozizeption 15
2.4.2. Kältenozizeption 16
2.4.3. Chemonozizeption 17
2.4.4. Mechanonizizeption 19
2.4.5. Zentrales nozizeptives System 20
2.4.6. Struktur und Funktion der TRP-Kanäle 22
3. Material und Methoden 26
3.1. Chemikalien und Lösungen 26
3.2. Zellkultur und heterologe Expression in HEK293t-Zellen 26
3.3. Patch-Clamp-Experimente 27
4. Ergebnisse 30
4.1. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPA1 30
4.2. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPA1-
exprimierende Zellen durch die TRPA1-Antagonisten AP-18 und
HC-030031 32
4.3. Für die Aktivierung von hTRPA1 durch Rocuronium sind bestimmte
Aminosäuren im N-terminalen Ende des Proteins notwendig 33
4.4. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPV1 35
4.5. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPV1-
exprimierende Zellen durch den TRPV1-Antagonisten Capsazepin 38
4.6. Rocuronium verursacht keine Sensibilisierung der Protonen-induzierten
Stromantwort bei hTRPV1 38
4.7. Die Thermo-TRPs als weitere Mitglieder der TRP-Kanalfamilie werden
durch Rocuronium nicht aktiviert 40
4.8. Weitere klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien aktivieren ebenfalls
hTRPA1 41
5. Diskussion 43
5.1. Injektionsschmerz durch Anästhetika und andere Medikamente 43
5.2. Aktivierung von hTRPA1 und hTRPV1 durch Rocuronium 45
5.3. Saurer pH-Wert der klinisch-verwandten Rocuronium-Präparationen 48
5.4. Andere Muskelrelaxanzien 49
5.5. Klinische Relevanz 50
6. Literaturverzeichnis 52
7. Abbildungsverzeichnis 68
8. Abkürzungsverzeichnis 70
1
1. Zusammenfassung
1.1. Deutsch
Hintergrund und Ziele: Bei der Applikation des Muskelrelaxans Rocuronium (Esmeron®) im Rahmen
der Einleitung einer Allgemeinanästhesie wird sehr häufig ein Injektionsschmerz
beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die direkte Aktivierung
nozizeptiver C-Fasern. Diese Arbeit soll untersuchen, ob Rocuronium und die
chemisch-verwandten Muskelrelaxanzien Pancuronium und Vecuronium sowie
die strukturell unterschiedlichen Wirkstoffe Atracurium und Succinylcholin
Agonisten an nozizeptiven TRP-Kanälen - und hier insbesondere am
Irritanzienrezeptor TRPA1 und am Capsaicinrezeptor TRPV1 - sind und über
diesen Mechanismus nozizeptive Nervenfasern aktivieren können.
Methoden: Human embryonic kidney (HEK) 293t-Zellen wurden mit Wildtyp- und Mutanten-
cDNAs von TRPA1, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 und TRPM8 mit Hilfe des
Nanofectin Kits transient transfiziert. Zusätzlich wurde CD8-pih3m cotransfiziert
um Zellen, die das gewünschte Protein exprimieren, mittels anti-CD8-
Immunobeads identifizieren zu können. Zur Messung wurden die Zellen in ein
Bad aus calciumfreier Extrazellularlösung eingebracht und aus Borosilikat
gezogene Pipetten zur Hälfte mit Intrazellularlösung gefüllt. Die Patch-Clamp-
Experimente wurden in der Whole-Cell-Konfiguration bei Zimmertemperatur
durchgeführt. Das Haltepotential wurde auf -60 mV eingestellt.
Ergebnisse und Beobachtungen: Rocuronium aktiviert hTRPA1 dosisabhängig ab einer Konzentration von
10 nM, hTRPV1 ab einer Konzentration von 1 nM. In hohen Konzentrationen
verringert sich die Stromamplitude bei beiden Kanälen wieder, was auf eine
zusätzlich blockierende Eigenschaft von Rocuronium in hohen Konzentrationen
an beiden Kanälen hinweisen kann. Dazu konnte gezeigt werden, dass
Rocuronium Carvacrol-induzierte Ströme in hTRPA1-exprimierende Zellen und
Capsaicin-induzierte Ströme in hTRPV1-exprimierende Zellen anteilig blockiert.
Die Mutante hTRPA1-3C zeigt im Vergleich zum Wildtyp stark verminderte und
die Mutante hTRPA1-3CK keine Einwärtsströme durch Rocuronium. Ein
2
niedriger pH sensibilisiert hTRPV1 für die Aktivierung durch Rocuronium nicht,
es zeigte sich tendenziell eine Blockade von hTRPV1. Vecuronium,
Pancuronium, Atracurium und Succinylcholin induzieren ebenfalls deutliche
Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende Zellen.
Schlussfolgerung: Rocuronium aktiviert hTRPA1 und hTRPV1 im heterologen Expressionssystem
in klinisch-relevanten Konzentrationen. In höheren Konzentrationen werden
beide Kanäle durch Rocuronium blockiert. Die Aktivierung von hTRPA1 wird
über bestimmte Aminosäuren im N-terminalen Rest vermittelt. Die Aktivierung
beider Kanäle in nozizeptiven Neuronen könnte mit verantwortlich sein für den
klinisch-beobachteten Brennschmerz durch Rocuronium.
1.2. Englisch
Background and objective: Pain on injection of rocuronium is a frequently observed side effect during
induction of general anaesthesia. A possible explanation is a direct activation of
nociceptive C-fibres. This study explores whether rocuronium and the chemical
analogs vecuronium and pancuronium as well as the structurally distinct muscle
relaxants atracurium and succinylcholin are agonists of nociceptive TRP-
channels, especially of the irritant receptor TRPA1 and the capsaicin receptor
TRPV1 and thus could lead to an activation of nociceptive C-fibres.
Methods: Recombinant TRPA1, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 and TRPM8 were
transiently expressed in human embryonic kidney (HEK) 293t-cells and were
transfected with the Nanofectin Kit. In order to identify transfection-positive cells
by anti-CD8-immunobeads, cells were cotransfected with the reporter plasmid
CD8-pih3m. To perform patch clamp experiments, the cells were covered with
calcium-free extracellular solution and borosilicate patch pipettes were filled half
with internal solution. The experiments were performed by means of whole-cell
patch clamp recordings at room temperature. Cells were clamped at -60 mV
during recordings.
Results: Rocuronium evokes inward currents in hTRPA1 beginning at a concentration of
10 nM and in hTRPV1 at a concentration of 1 nM. At higher concentrations
3
rocuronium-evoked inward currents decreased. This could indicate a blocking
effect of rocuronium in both channels. Carvacrol-evoked inward currents in
hTRPA1 expressing cells and capsaicin-evoked inward currents in hTRPV1
expressing cells are both partially blocked by rocuronium. Rocuronium-evoked
inward currents in the mutant hTRPA1-3C are markedly smaller compared to
wild-type TRPA1. In the mutant hTRPA1-3CK rocuronium did not induce any
current. A pH of 6 was not able to sensitize hTRPV1 for the activation by
rocuronium. Rocuronium tends to block hTRPV1 instead. Vecuronium,
pancuronium, atracurium and succinylcholin also evoked distinct inward
currents in hTRPA1-expressing cells.
Conclusion: Rocuronium activates hTRPA1 und hTRPV1 in clinically relevant concentrations
in a heterologous expression system. At higher concentrations both channels
are blocked. The activation of hTRPA1 is mediated by distinct N-terminal amino
acids. The activation of both channels in nociceptive fibres could be
accountable for the clinically observed burning pain evoked by the application of
rocuronium.
4
2. Einleitung
2.1. Einführung in das Thema
Rocuronium ist ein in der Anästhesiologie weit verbreitetes, nicht-
depolarisierendes Muskelrelaxans, welches sich durch einen schnellen
Wirkungseintritt und eine mittellange Wirkdauer auszeichnet [70]. Eine
unerwünschte und oft beobachtete Nebenwirkung ist allerdings ein
Injektionsschmerz bei der intravenösen Injektion mit einer Inzidenz von
75 - 100% [2, 40, 127]. Dieser äußert sich, je nach Lage der intravenösen
Kanüle, durch heftige Abwehrbewegungen im Handgelenk oder des gesamten
Arms, in den Rocuronium injiziert wurde. Bereits 1995, im Jahr der
Markteinführung, wurden die brennenden Schmerzen im Rahmen der
Präkurarisierung von wachen Patienten mit Rocuronium von Moorthy et al.
sowie bei bewusstlosen Patienten nach der Applikation von Propofol durch
Lockey et al. beschrieben [97, 109]. Als mögliche Ursachen wurden die
Freisetzung von Bradykinin, der saure pH der Zubereitung oder die
unphysiologische Osmolarität der Lösung diskutiert, welche alle für sich oder in
Kombination nozizeptive Nervenendigungen aktivieren können [20, 88, 97]. Von
Borgeat und Kwiatkowski konnte bei fünf Patienten gezeigt werden, dass
physiologische Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 4 keinen
Injektionsschmerz verursachte, [19] wohingegen Arndt und Klement einen
Injektionsschmerz bei einem pH ab 4 beobachteten [88]. Genauso konnte
gezeigt werden, dass verdünntes Rocuronium mit einer Konzentration von
0,5 mg/ml im Gegensatz zu unverdünntem Rocuronium mit einer Konzentration
von 10 mg/ml keinen Injektionsschmerz verursachte, obwohl beide
Aufbereitungen die gleiche Osmolarität und den gleichen pH-Wert hatten [134].
2003 zeigten Koppert et al. einen konzentrationsabhängigen (1 und 10 mg/ml)
Injektionsschmerz von Vecuronium und Rocuronium in vivo, welcher
unabhängig vom pH zu sein schien. Da die Schmerzintensität unabhängig von
den gemessenen Mediatoren wie Bradykinin, Histamin und Trypsin war, wurde
eine direkte Aktivierung der Nozizeptoren in unmyelinisierten C-Fasern über
einen noch unbekannten Mechanismus postuliert [17].
Ziel dieser Arbeit ist es zu untersuchen, ob Rocuronium ein Agonist an
bestimmten nozizeptiven Kanälen ist, vor allem an TRPA1, einem
Irritanziensensor, der durch Senföl, Tränengas und Umweltgifte aktiviert werden
5
kann, sowie an TRPV1, dem Sensor für den scharfen Inhaltsstoff von
Chilischoten (Capsaicin), der auch durch Hitze und Protonen aktiviert werden
kann. Weiterhin soll untersucht werden, über welchen Mechanismus die
Aktivierung der Nozizeptoren vermittelt wird. Aufgrund widersprüchlicher
Aussagen vorhergehender Untersuchungen wird außerdem der Einfluss des
pH-Wertes auf das Öffnungsverhalten der Kanäle untersucht. Vecuronium
verursacht ebenso wie Rocuronium einen Injektionsschmerz, jedoch mit viel
geringerer Intensität, [17, 41, 83] sodass Vecuronium und das ebenfalls aus
einem Steroidgerüst bestehende Pancuronium als potenzielle Agonisten
untersucht werden. Auch wenn keine Berichte über Schmerzsensationen bei
der intravenösen Injektion von Atracurium und Succinylcholin vorliegen, werden
zu Vervollständigung der Experimente diese Relaxanzien ebenso auf ihre
Fähigkeit hin TRP-Kanäle zu aktivieren untersucht.
2.2. Muskelrelaxanzien
Muskelrelaxanzien sind ein bedeutender pharmakologischer Bestandteil der
modernen balancierten Anästhesie. Die erste Unterteilung der
Muskelrelaxanzien in zwei große Klassen stammt aus dem Jahr 1951 von
Daniel Bovent. Er traf eine Einteilung der Muskelrelaxanzien in pachycurares
mit nicht-depolarisierenden und leptocurares mit depolarisierenden
Eigenschaften [21]. Die Wirkung von depolarisierenden Muskelrelaxanzien
konnte im Gegensatz zu den nicht-depolarisierenden Muskelrelaxanzien nicht
durch Acetylcholinesteraseinhibitoren aufgehoben werden.
Bis heute ist eine Einteilung in diese zwei Gruppen üblich, wobei in dieser
Arbeit Succinylcholin als alleiniger Vertreter der depolarisierenden
Muskelrelaxanzien untersucht wird und auf der Seite der nicht-
depolarisierenden die Substanzen Atracurium, Pancuronium, Vecuronium und
insbesondere Rocuronium untersucht werden.
2.2.1. Historie
Erstmals wurden muskelrelaxierende Substanzen von Peter Martyr d’Anghera
im Jahr 1516 in seiner Briefsammlung „De Orbe Novo“ beschrieben, in denen er
6
von vergifteten Pfeilen berichtete, welche von den Ureinwohnern Südamerikas
bei der Jagd nach Tieren eingesetzt wurden [129].
78 Jahre später wurde das Pfeilgift in dem Buch „The Discovery of the Large,
Rich, and Beautiful Empire of Guiana“ unter dem Namen Urari erwähnt [124].
Der Versuch einer europäischen Übersetzung gab dem Gift aus zahlreichen
Übersetzungsmöglichkeiten den allgemein anerkannten Namen Curare. Dieses
Gift wurde aus den Reben der alkaloidhaltigen Pflanzen Chondrodendron
tomentosum und Strychnos toxifera gewonnen [16].
Die Entwicklung analytischer Methoden machte es 1935 Harold King in Oxford
erstmals möglich, aus einer Probe des Museums der Pharmaceutical Society
d-Tubocurarine zu isolieren. Er fand heraus, dass es sich um ein großes,
starres Molekül mit zwei terminalen, tertiären Ammoniumgruppen handelt [86].
Später zeigte sich, dass diese Erkenntnis nur teilweise richtig war, da es sich
bei einer der Ammoniumgruppen in Wahrheit um ein tertiäres Amin handelt.
Schließlich waren es 1942 Oscar Winterstein und James Dutcher, denen es
zuerst gelang, das Alkaloid d-Tubocurarine aus Proben einer Chondrodendron
tomentosum zu gewinnen [150].
Zwischenzeitlich hatte Claude Bernard bewiesen, dass Curare an der Nerv-
Muskel Reizweiterleitung wirkt [13]. Zudem wurde die Funktionsweise von
Acetylcholin, bei der neuromuskulären Reizweiterleitung Mitte des 19.
Jahrhunderts unter anderem von Dale et al. erforscht [49]. Erste Anwendungen
von Curare an Kleintieren [25] sowie an zwei Patienten [14] zeigten, dass durch
eine Beatmung die Komplikation der Apnoe behandelt werden konnte.
Mit diesem Wissen applizierten die Anästhesisten Harold Randall Griffith und
Enid Johnson einem jungen Mann während einer Appendektomie Curare und
publizierten im Juli 1942 die erfolgreiche Anwendung von Curare im
Fachjournal „Anesthesiology“ [66].
John Halton, ein Anästhesist aus Liverpool, publizierte zusammen mit CecilI
Gray 1946 die Erfahrungen mit Intocostrin, das erste durch die Firma Squibb in
den Vereinigten Staaten kommerziell produzierte Muskelrelaxans. Sie
beschrieben erstmals die als Liverpool-Technik bekannte Triade aus Hypnose,
Analgesie und Muskelrelaxation, die bis heute in Form der balancierten
Anästhesie Anwendung findet [64].
7
2.2.2. Chemische Entwicklung der Muskelrelaxanzien
Im Jahr 1860 erkannten Thomas Richard Fraser und Alexander Cum Brown
erstmals, dass die Umwandlung der tertiären Stickstoffgruppe von Alkaloiden
wie Atropin, Brucine, Codein, Morphin und Nikotin in ihre quartäre Form
Curare-ähnliche Aktivität zeigen [30]. In der zweiten Hälfte des 20.
Jahrhunderts wurden die ersten synthetischen Muskelrelaxanzien entwickelt.
Aufgrund der Erkenntnis, dass Dekamethylen mit zwei tertiären
Ammoniumgruppen gute neuromuskuläre Blockadeeigenschaften hat sowie
dem Wissen, dass kleine Moleküle einen depolarisierenden und große
Moleküle eine nicht-depolarisierenden Block generieren können, [28]
entwickelten mehrere Arbeitsgruppen in den 1950er Jahren Suxamethonium.
Es handelt sich um einen Bischolinester der Bernsteinsäure, welcher zwei
Moleküle Cholin miteinander verbindet (Abb. 1).
In den 1960ern entwickelte C.L. Hewett Pancuronium, indem er zwei
Acetylcholin-Moleküle in ein Steroidgerüst einbrachte [27]. Die Erkenntnis, dass
der vagolytische Effekt von Pancuronium auf die quartäre Gruppe am A-Ring
und die muskelrelaxierende Eigenschaft auf die Gruppe des D-Rings
zurückzuführen ist, [26] machte die chemische Modifikation der Substanz
möglich. Durch eine Demethylierung des A-Rings konnte mit Vecuronium eine
nebenwirkungsärmere Substanz hergestellt werden. Mit der Erkenntnis, dass
die Anschlagszeit bei weniger potenten Mitteln kürzer ist, erfolgte die weitere
Modifikation der Aminogruppen. Durch eine Substitution der quartären Gruppe
entstand das weniger potente, aber schneller wirkende, monoquartäre
Aminosteroid Rocuronium mit einer Anschlagszeit nahe der von
Succinylcholin [23].
Parallel arbeiteten andere Gruppen mit Bisbenzylisochinolinen vom
Tubocurarine-Typ. So entwickelten J.B. Stenlake und seine Mitarbeiter
Atracurium, [72] das in seiner Darreichungsform ein Razemat aus 10 Isomeren
ist und eine relevante Histaminfreisetzung verursacht. Heute wird das reine
Cis-Isomer von Atracurium, Cisatracurium, klinisch häufig verwendet (Abb. 1).
8
Abbildung 1: Strukturformeln von Rocuronium, Vecuronium, Pancuronium, Atracurium und Suxamethonium
2.2.3. Rocuronium
2.2.4. Pharmakokinetik
Die Pharmakokinetik von Rocuronium entspricht, mit Ausnahme des
schnelleren Wirkeintritts, der von Vecuronium [18, 104]. Es hat eine ED95 von
0,3 mg/kg [46, 58].
Bei normaler Nieren- und Leberfunktion beträgt das Verteilungsvolumen
203 ml/kg, die Clearance 3,7 ml/kg/min und die t½β-Eliminationshalbwertszeit
73 min [54]. Die Plasmaproteinbindung beträgt 25%, so dass Änderungen der
Plasmaprotein-Konzentration lediglich zu geringen Veränderungen der freien
Plasmafraktion führen [148].
Die Verstoffwechselung von Rocuronium findet durch Decarboxylierung am
17. Kohlenstoffatom statt. Dabei entsteht 17-Desacetylrocuroniom, welches der
einzige im Plasma nachgewiesene Metabolit ist [1, 135]. Er trägt
höchstwahrscheinlich nicht zur neuromuskulären Blockade bei, da er 20fach
weniger potent als Rocuronium ist [111].
Rocuronium) Vecuronium) Pancuronium)
Atracurium) Suxamethonium)
9
2.2.5. Pharmakodynamik
Muskelrelaxanzien wirken als Antagonisten an der postsynaptischen Membran
der motorischen Endplatte. Sie blockieren die elektrochemische Koppelung am
nikotinischen Acetylcholinrezeptor. Diese befinden sich dort in einer Dichte von
10000 – 20000 Moleküle/μm2 [50]. Der Rezeptor ist ein Transmembranprotein,
welches einen Liganden-gesteuerten Ionen-Kanal bildet, der in erster Linie für
Natrium- (Na+), aber auch für Kalium- (K+) und Calcium- (Ca2+) Ionen
durchlässig ist. Der reife Rezeptor setzt sich aus den fünf homologen
Untereinheiten (α, β, α, ε, δ) zusammen [87, 102]. Die Bindungsstelle befindet
sich jeweils zwischen der α/β und der α/ε-Einheit. Beide Bindungsstellen
müssen für die Aktivierung des Kanals besetzt sein. Sind mehr als 75% der
Rezeptoren besetzt, kann man erste Effekte der Relaxation beobachten, bis es
schließlich nach Blockierung von 95% der Rezeptoren zur schlaffen Lähmung
der quergestreiften Muskulatur kommt [144]. So lange sich das Relaxans im
synaptischen Spalt befindet, ist seine Aktivität durch eine sich wiederholende
Besetzung und Dissoziation der Bindungsstellen gekennzeichnet [22]. Die dafür
erforderliche Dosis wird durch die ED95 beschrieben. Sie beträgt für Rocuronium
0,3 mg/kg. Die empfohlene Einleitungsdosis von Rocuronium für die
endotracheale Intubation beträgt 0,6 mg/kg (2 x ED95), eine Vollrelaxation
besteht nach 60 - 90 s [44]. Vervierfacht man die Dosis der ED95 auf insgesamt
1,2 mg/kg, so können sehr schnell gute Intubationsbedingungen erreicht
werden, die denen nach Applikation von 1 mg/kg Succinylcholin entsprechen
(rapid sequence induction, RSI) [101]. Allerdings besteht bei dieser Dosierung
eine verlängerte Wirkdauer. Rocuronium ist in einer Dosierung von 1,0 mg/kg
zur RSI zugelassen. Die Erhaltungsdosis von Rocuronium beträgt 0,15 mg/kg,
wobei bei einer Coapplikation mit Substanzen wie Antibiotika, Steroiden,
Anticholinergika, intravenöse und insbesondere inhalative Anästhetika die
Dosis aufgrund einer Wirkungsverstärkung auf etwa 0,075 - 0,1 mg/kg
angepasst werden muss [93, 147].
Rocuronium ist in Kombination mit Hypnotika und ggf. Analgetika zur Einleitung
sowie auch zur Aufrechterhaltung einer Allgemeinanästhesie geeignet. Es hat
aufgrund seiner vergleichsweise geringen Potenz eine kurze Anschlagszeit,
wodurch die 95%ige Blockade der Muskelantwort rasch erreicht wird. Unter
Isofluran-Anästhesie liegt nach Applikation von 0,6 mg/kg Rocuronium die
10
Erholung der train-of-four-ratio (T4/T1) auf 25% bei 42 min [135]. Der sog. train-
of-four (TOF) ist das während einer Narkose am meisten verwendete
Stimulationsmuster für die Überwachung der Muskelrelaxation. Hierbei werden
mit einer Frequenz von 2 Hz vier Impulse abgegeben, wobei die Reizabnahme
von der ersten bis zur vierten Muskelantwort mit der zunehmenden Relaxation
korreliert. Dieses Verhältnis (T4/T1) wird als TOF-Ratio bezeichnet. Beim nicht
relaxierten Muskel beträgt sie 1,0 und wird bei zunehmender Relaxierung
kleiner.
Zusätzlich zu den nebenwirkungsbehafteten Acetylcholinesterasehemmern wie
z.B. Neostigmin steht seit Oktober 2008 ein Medikament zur Reversierung der
Wirkung von Rocuronium zur Verfügung: Sugammadex (Bridion®) ist ein
γ-Cyclodextrin, welches die Wirkung von Rocuronium durch Aufnahme eines
Rocuronium-Moleküls in das Innere des Zuckerrings (Enkapsulierug) aufhebt
[114]. Die Affinität von Sugammadex ist für Rocuronium am höchsten, aber
auch die Wirkung anderer steroidaler Muskelrelaxanzien wie z.B. Vecuronium
kann aufgehoben werden. Das Anwendungsspektrum für Sugammadex
umfasst neben der Reversierung einer postoperativen Restkurarisierung
(PORC) ebenso die Reversierung einer Einleitungsdosis von Rocuronium bei
einer RSI. Dies stellt einen großen Fortschritt in der Anwendungssicherheit von
Rocuronium dar, da nun im Falle einer gefürchteten cannot intubate, cannot
ventilate-Situation die durch Rocuronium verursachte neuromuskuläre Blockade
vollständig innerhalb von ca. 1,5 min aufgehoben werden kann. Dies erfordert
die Applikation von Sugammadex in einer Dosierung von 16 mg/kg. Für die
routinemäßige Aufhebung der Relaxation richtet sich die Dosis nach der
Akzeleromyographie. Die Dosen bewegen sich hierbei zwischen 2 - 4 mg/kg bei
einer mittleren Dauer zur Erholung des T4/T1-Verhältnisses auf 0,9 von 2 -
3 min [114].
2.2.6. Einsatz bei Nieren- und Lebererkrankungen
Die Angaben in der Literatur über die Ausscheidung von Rocuronium sind
uneinheitlich. In der Fachinformation wird angegeben, dass die Ausscheidung
in 24 Stunden unverändert zu 30 - 47% über den Urin erfolgt [54, 146]. Mittels
radioaktiv-markiertem Rocuronium konnte gezeigt werden, dass innerhalb von
9 Tagen 47% des Rocuroniums über den Urin und 43% über den Stuhl
11
ausgeschieden werden [54]. Khuenl-Brady et al. zeigten 1990 im Tierversuch
bei Katzen, dass 73% des Rocuroniums in der Leber gespeichert, respektive
biliär ausgeschieden wurden [85].
Anders verhält sich die Ausscheidung bei einer Nieren- bzw. Leberinsuffizienz.
Zahlreiche Untersuchungen erbrachten unterschiedliche Ergebnisse. In einer
Studie, welche terminal-niereninsuffiziente Patienten untersuchte, die eine
allogene, postmortale Nierenspende erhalten hatten, ergaben sich ein um 28%
gesteigertes Verteilungsvolumen und eine um 37% verlängerte Eliminations-
halbwertszeit. Die Clearance war in beiden Gruppen gleich und es zeigten sich
keine Unterschiede bezüglich der Pharmakodynamik [130]. In einer weiteren
Studie von Cooper et al. zeigten sich nach Applikation von 0,6 mg/kg
Rocuronium längere Erholungszeiten, jedoch ohne statistische Signifikanz [45].
Die gleiche Studie zeigte die Unvorhersehbarkeit der Wirkdauer. Die Erholung
der T4/T1-Ratio auf 25% zeigte nach einer Applikation von 0,6 mg/kg
Rocuronium eine Variation von 35 - 115 min bei niereninsuffizienten gegenüber
32 - 60 min bei gesunden Patienten. Zusammenfassend betrachtet ist die
Wirkdauer bei eingeschränkter Nierenfunktion verlängert und auch weniger gut
vorauszusehen [45].
Die Funktion der Leber hat ebenfalls starken Einfluss auf die Pharmakokinetik
von Rocuronium. Allerdings sind die Ergebnisse verschiedener Studien
divergent. Eine Studie zeigte, dass die Wirkung von Rocuronium bei
leberinsuffizienten Patienten, ähnlich wie bei eingeschränkter Nierenfunktion
einer großen Variabilität unterliegt und der Wirkeintritt (108 ± 33 s bei
Gesunden vs. 158 ± 56 s bei Patienten mit Zirrhose) sowie die Wirkdauer
verlängert sind [84]. Die Erholung der TOF-Ratio auf 75% und 90% des
Ausgangswerts betrug 75 ± 25 und 88 ± 29 min bei Patienten mit Zirrhose vs.
57 ± 11 und 64 ± 13 min bei Gesunden. Das zentrale Verteilungsvolumen war
bei den Erkrankten mit 104 ± 21 ml/kg im Gegensatz zu den Gesunden mit
78 ± 24 ml/kg deutlich erhöht, wobei sich eine lineare Abhängigkeit zwischen
dem Verteilungsvolumen und der Anschlagszeit ergab. Die Eliminationskinetik
zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen [84].
Eine Leberinsuffizienz führte zudem zu keiner Veränderung der
Rezeptoraffinität. Eine Bestimmung der EC50 ergab für Gesunde 1030 µg/l und
Patienten mit Zirrhose 1060 µg/l, was darauf schließen lässt, dass die
12
verlängerten Erholungszeiten auf pharmakokinetische Effekte zurückzuführen
sind [135].
2.2.7. Einsatz bei sehr jungen und alten Patienten
Eine Studie an Kindern zwischen 4 und 11 Jahren zeigte, dass jüngere Kinder
eine relativ zu ihrem Körpergewicht höhere Clearance besitzen. Unterschiede
bezüglich des Verteilungsvolumens ergaben sich nicht, sodass sich mit
steigendem Alter und Gewicht eine längere t½β ergab [54, 141].
Untersuchungen bei Säuglingen ergaben verlängerte t½β-Eliminations-
halbwertszeiten von 1,1 ± 0,2 min bei Reifgeborenen (0 - 27 Tage) im Rahmen
signifikant-höherer Verteilungsvolumina und einer geringeren relativen
Clearance [54, 147].
Bei geriatrischen Patienten ergeben sich Änderungen der Pharmakokinetik
unter anderem aufgrund schlechterer renaler Clearance. Die maximale
neuromuskuläre Blockade wurde bei 65- bis 80-Jährigen im Vergleich zu 20- bis
45-Jährigen mit 3,7 ± 1,1 min gegenüber 3,1 ± 0,9 min langsamer erreicht, bei
jedoch ähnlicher Potenz der Blockade. Die Zeit bis zu einer Erholung der TOF-
Ratio um 25% war mit 11,8 ± 8,1 min vs. 8,0 ± 6,5 min signifikant länger.
Unterschiede bezüglich der Potenz ergaben sich nicht [15].
2.2.8. Zusammensetzung der Rocuronium-Injektionslösung
Rocuronium ist unter dem Handelsnamen Esmeron® seit 1994 als
Injektionslösung erhältlich. Die fertige Injektionslösung hat einen pH-Wert
zwischen 3,8 und 4,2. Neben Wasser für Injektionszwecke und Natriumchlorid
enthält die Zubereitung Essigsäure (50%) und Natriumacetat zur pH-Einstellung
[54].
13
2.3. Nozizeptives System
2.3.1. Allgemeines
2.3.2. Peripheres nozizeptives System
Der menschliche Körper ist in der Lage, potenziell schädliche Reize von nicht-
schädlichen zu differenzieren. Bei überschwelligen, potenziell schädlichen
Reizen werden hierfür spezialisierte Nervenfasern aktiviert, die sog.
Nozizeptoren [153]. Nozizeptoren sind durch ihre biophysiologische wie
molekulare Konfiguration dazu in der Lage schädliche thermische,
mechanische und chemische Stimuli zu erfassen. Nozizeptoren sind
pseudounipolare Nervenzellen, die ihr Zellsoma in den Spinalganglien und
zentral im Ganglion trigeminale haben. Nach Erlanger und Gasser kann man
zwei große Klassen von Nozizeptoren unterscheiden: die dünnen,
myelinisierten Aδ-Fasern, welche den ersten, akuten, gut lokalisierbaren
Schmerz übertragen, und die unmyelinisierten C-Fasern, die für die
Wahrnehmung des zweiten, dumpfen und weniger gut-lokalisierbaren
Schmerzes verantwortlich sind. Die Aδ-Fasern lassen sich in zwei weitere
Subpopulationen einteilen. Typ I nimmt chemische und mechanische Stimuli
wahr und hat eine sehr hohe Reizschwelle für thermische Reize (> 50°C). Der
Typ II Aδ-Nozizeptor hat eine niedrigere Schwelle für Hitze, dafür eine höhere
für mechanische Reize [8].
Die unmyelinisierten C-Fasern sind polymodale Rezeptoren, welche Hitze und
mechanische Stimuli wahrnehmen können. Von besonderem Interesse sind
hierbei hitzesensible Fasern, die ihre mechanische Sensibilität erst im Rahmen
einer Verletzung entwickeln. Sie reagieren vergleichsweise sensibel auf
chemische Reize. Die Heterogenität der Nozizeptoren erfordert eine weitere
Unterteilung der C-Fasern nach neuroanatomischen und molekularen
Gesichtspunkten. So setzen die peptidergen C-Nozizeptoren die Neuropeptide
Substanz P und calcitonin gene–related peptide (CGRP) frei und tragen den
Neurotrophin Rezeptor tropomyosin receptor kinase A (TrkA), welcher nerve
growth factor (NGF) binden kann. Die nicht-peptidergen C-Fasern tragen den
Ret proto-oncogene (c-Ret) Neurotrophin Rezeptor, welcher Angriffspunkt für
den glia-derived neurotrophic factor (GDNF) Neurturin und Artemin ist.
14
Eine weitere Unterscheidung der Nozizeptoren kann anhand der Expression
verschiedener Transmembranproteine getroffen werden, welche sowohl im
Verlauf des Axons wie auch an den Zellkörpern exprimiert werden (Abb. 2). So
können Reize in beide Richtungen sowohl detektiert als auch übertragen
werden. Zur Depolarisation der nozizeptiven Endigung kann entweder die
Initiierung eines Einwärtsstroms oder die Blockade eines Auswärtsstroms
führen. Ein Einwärtsstrom entsteht durch die Aktivierung oder Öffnung von
unterschiedlichen liganden- oder spannungsgesteuerten Na+- und Ca2+-
Kanälen. Für den Auswärtsstrom sind hauptsächlich K+-Ionen verantwortlich
welche durch spezifische K+-Kanäle die Zelle verlassen. Zu den
ligandengesteuerten Kanälen zählen u.a. die transient receptor potential (TRP)
-Rezeptoren sowie die acid sensing ion channels (ASICs). Die wichtigsten
Vertreter der K+-Kanäle sind die der Subfamilie K, Nummer 2 und 4 (KCNK2/4).
Abbildung 2: Schematische Darstellung des zentralen und peripheren Endes eines Nozizeptors (aus Woolf 2007)
15
2.4. Transient receptor potential-Kanäle
2.4.1. Hitzenozizeption
Für die Wahrnehmung von angenehmer Wärme einerseits und schädlicher
Hitze andererseits sind unterschiedliche Transduktionsproteine in sensorischen
Nerven zuständig. Es konnten nozizeptive Fasern mit unterschiedlichen
Schwellen gefunden werden. Der Mensch empfindet Wärme > 42°C als
schädlich bzw. schmerzhaft. Dies entspricht z.B. der Reizschwelle von
Schmerzreiz-wahrnehmenden C- und Typ II Aδ-Nozizeptoren.
Ein Fortschritt in der Aufklärung der sensorischen Vorgänge auf molekularer
Ebene ergab sich durch die Entdeckung des Capsaicin-Rezeptors, TRPV1, der
durch den Inhaltsstoff der Chilischote und andere Vanilloide sowie auch durch
Temperaturen > 42°C aktiviert wird. Parallelen leiten sich aus mehreren
Beobachtungen ab: a) in der Mehrzahl der hitzesensiblen Nozizeptoren werden
TRPV1-Kanäle exprimiert; b) Hitze- und Capsaicin-induzierte Ströme in
elektrophysiologischen Experimenten zeigen Gemeinsamkeiten;
c) Schmerzreizsensibilisierende und proinflammatorische Substanzen
(Protonen, Neurotrophine, Bradykinin) verstärken die Reizantwort von TRPV1.
Die weitere Erforschung der auf molekularer Ebene gewonnenen Erkenntnisse
erfolgte im Tierexperiment. Es konnte gezeigt werden, dass Knockout-Mäuse,
bei denen TRPV1 nicht exprimiert wurde (TRPV1-/-), in der Wahrnehmung von
schädlicher Hitze deutlich eingeschränkt waren. Nachdem die Hitzenozizeption
jedoch nicht vollständig erloschen war, mussten weitere Mechanismen zur
Wahrnehmung schmerzhafter Hitzereize beitragen. In Untersuchungen an
präparierten Nervenzellen aus Spinalganglien (dorsal root ganglion, DRG)
konnten vorwiegend solche Neurone mit einer Reizschwelle von 42°C
nachgewiesen werden [35]. Spinalganglien mit einer Reizschwelle > 50°C
waren seltener [115]. Bei Wild-Typ Mäusen konnte eine Hypersensibilisierung
der Hitzewahrnehmung durch die gleichen Substanzen wie in vitro erreicht
werden. Die Ergebnisse lassen so weiterhin folgern, dass der Nozizeptor
sowohl chemisch als auch thermisch durch Hitze moduliert werden kann.
Weitere Untersuchungen an Mäusen verglichen TRPV1-/- Mäuse mit Mäusen,
bei denen das zentrale Nervenende von nozizeptiven Neuronen mit
hochdosiertem Capsaicin zerstört wurde. Die mit Capsaicin behandelten Mäuse
waren deutlich unempfindlicher gegenüber schmerzhafter Hitze. Daraus kann
16
man folgern, dass sowohl die TRPV1-abhängige wie auch TRPV1-unabhängige
Wahrnehmung schädlicher Hitze über Nozizeptoren vermittelt wird, welche
TRPV1 exprimieren [33]. 2007 identifizierten Lumpkin und Catarina weitere
Wärmesensoren der TRP-Familie, die sowohl auf große Hitze (> 50°C) als auch
auf moderate Wärme (ca. 30°C) reagieren. Im heterologen Expressionssystem
wird TRPV2 bei ca. 50°C aktiviert, TRPV3 und TRPV4 haben ihre Reizschwelle
zwischen 25 und 30°C. TRPV2 wird in einer Subpopulation der Aδ-Fasern
exprimiert. Sie entsprechen in ihren biophysischen Eigenschaften denen der
Nozizeptoren mit einer sehr hohen Reizschwelle. TRPV3- und TRPV4-Knock-
out-Mäuse zeigten zudem in der Wahrnehmung von Temperatur ein
verändertes Verhalten [67]. Generell sind die Mechanismen der
Hitzenozizeption aber noch nicht vollständig erforscht.
2.4.2. Kältenozizeption
Die meisten Kältsensoren zeigen sowohl für Menthol als auch bei
Temperaturen von ca. 25 °C eine Aktivierung. Der herausragende Rezeptor
zur Wahrnehmung von unschädlicher Kälte ist TRPM8. TRPM8-/--Mäuse zeigen
auf zellulärer und neuronaler Ebene einen substantiellen Verlust der Menthol-
und Kältesensitivität über eine große Temperaturspanne von 30°C bis 10°C,
meiden aber im Experiment kalte Oberflächen ab einer Temperatur kleiner
10°C [11, 43]. Wie im Fall von TRPV1 bei Hitze ist die Sensibilität für Kälte nicht
komplett erloschen, sodass es weitere Sensoren geben muss, welche für die
nozizeptive Aktivierung ab < 12°C verantwortlich sind. Der Irritanziensensor
TRPA1 ist hierfür ein potenzieller Kandidat, da dieser auch bei der
Registrierung von Kälte und der Wahrnehmung kühlender Agentien wie Icilin
und Menthol eine Rolle zu spielen scheint [7, 79]. Dennoch sind bezüglich der
intrinsischen Kältesensitivität noch nicht alle Fragen geklärt [7, 79, 113, 155].
Diese Diskrepanzen konnten auf zellulärer Ebene nicht in letzter Konsequenz
geklärt werden. Eine Untersuchung zeigte z.B. eine normale Kälteantwort in
TRPA1-/- trigeminalen Neuronen bei einer Temperaturreduktion von 23°C auf
6°C, [9] wogegen eine andere Untersuchung eine Abnahme der
Kältesensitivität an trigeminalen Neuronen bei TRPA1-/--Mäusen zeigen
konnte [82]. Bautista et al. untersuchten 2006 das Verhalten von TRPA1-
Knock-out-Mäusen, und konnten in der Wahrnehmung von Kälte keinen
17
Unterschied zu den Wild-Typ-Mäusen feststellen. Weitere Untersuchungen von
Karashima et al. bestätigten diese Ergebnisse, konnten jedoch auch zeigen,
dass bei längerer Kältexposition die Wild-Typ-Mäuse zu springen begannen.
Sieht man dieses Phänomen als Hypersensibilisierung bei prolongierter
Kälteexposition, so lässt sich ableiten, dass TRPA1 im Rahmen einer akuten
Verletzung zur Kältewahrnehmung beiträgt, nicht jedoch per se zur
schmerzhaften Wahrnehmung von Kälte. Einzelfaser-Messungen von TRPA1
Knock-out-Mäusen zeigten im Einklang mit den vorher genannten Ergebnissen
keine Einbußen in der Kältesensibilität [33].
Weitere Membranproteine in Form spannungsgesteuerter Na+-, K+-Kanäle und
zweiporiger KCNK K+-Kanäle steuern die Feineinstellung der Reizschwelle und
die Verbreitung des Kältereizes [137, 154]. Sie können wie z.B. der
spannungsabhängige K+-A-Kanal (Kv1) spezifisch geblockt werden, was eine
Erhöhung der Temperaturreizschwelle und eine Verhaltensänderung der Mäuse
im Tierexperiment zur Folge hat. Die Modulation von KCNK2 (TREK-1) und
KCNK4 (TRAAK) spielt nicht nur bei der Kältewahrnehmung sondern auch bei
der Wahrnehmung mechanischer Stimuli und Stimuli durch schädliche Hitze
eine Rolle. Mäuse, die diese Kanäle nicht exprimieren, haben Defizite in der
Wahrnehmung von Druck, Hitze und Kälte [117]. Welche Aufgabe diese
Sensoren neben der Modulation der Nozizeptorsensibilität haben ist jedoch bis
dato unklar.
2.4.3. Chemonozizeption
Die Wahrnehmung schädigender (Umwelt-)Reize an den natürlichen
Körperbarrieren sowie im Körperinneren ist die Aufgabe der Chemonozizeption.
In diesem Feld spielt TRPA1 eine wichtige Rolle, da der Rezeptor sowohl bei
der akuten Schmerzwahrnehmung als auch an Sensibilisierungsvorgängen
beteiligt ist.
TRPA1 ist wie die bereits vorher besprochenen Mitglieder der TRP-Kanal-
Familie sensibel für reizende/ schädliche Umweltstoffe, welche in
Nahrungsmitteln zu finden sind. Hierzu zählen Isothiocyanate (Senf,
Meerrettich), Zimtaldehyde und Allicin (Knoblauch) [10, 73, 99]. Die Aktivierung
des Kanals durch die chemisch sehr unterschiedlichen Substanzen erfolgt
durch kovalente Bindung mit reaktiven Aminosäuren auf der Basis ihrer
18
Elektrophilie. So scheint nicht das Grundgerüst der chemischen Struktur für die
Aktivierung des Kanals entscheidend zu sein, sondern die Reaktionsfähigkeit
mit der Thiolgruppe N-terminaler Cysteine [69, 98]. Weitere Liganden des
Rezeptors sind das Alkylierungsmittel Iodacetamid, das im Zigarettenrauch
vorkommende Acrolein, Acetaldehyd und Formaldehyd sowie das endogene
4-Hydroxynonenal, welches unter anderem verantwortlich für Schäden durch
oxidativen Stress ist [100, 133]. Ca2+, obgleich es keinen direkten schädlichen
Reiz darstellt, verstärkt die Wirkung anderer Liganden, die zu einer Erhöhung
des intrazellulären Ca2+ führen [155]. Die Komplexität der Wirkung auf den
Kanal wird aufgrund der Tatsache deutlich, dass Ca2+ ebenso
desensibilisierende Eigenschaften aufweist [3]. Weiterhin sind Lokalanästhetika
(Lidocain), intravenöse Hypnotika (Propofol, Etomidat) und volatile Anästhetika
Liganden des Kanals [53, 57, 95].
Abbildung 3: Übersicht der TRP-Rezeptoren exprimiert in sensorischen Neuronen (aus Levine und Alessandri-Haber, 2007)
19
2.4.4. Mechanonizizeption
Die qualitativ und quantitativ differenzierte Wahrnehmung mechanischer Reize
unterschiedlicher Intensität erfordert eine Vielzahl von Neuronen mit
unterschiedlichen Reizschwellen. Neben den schon erwähnten, für die
Nozizeption wichtigen Fasern, spielen auch die Aβ-Fasern mit einer niedrigeren
Reizschwelle bei der Wahrnehmung von leichter Berührung, leichtem Druck
und Vibration eine Rolle.
Die Transformation des Reizes erfolgt auch hierbei durch spezielle
Transduktionsproteine, die in den freien Nervenenden in der Haut exprimiert
werden. Die Ionenkanaluntereinheiten des MEC-4- und MEC-10-Gens der
Degenerinen/ Epithelialen Natriumkanäle (DEG/ ENaC) konnten in
Caenorhabditis elegans als Mechanotransduktoren identifiziert werden [36].
Die Suche nach einem Korrelat bei Säugetieren hatte bis dato keinen Erfolg. So
zeigten die in Säugetieren orthologen Ionenkanäle ASIC 1, 2 und 3 in Knock-
out-Versuchen bei Nagetieren keinen entscheidenden Einfluss auf die
Mechanotransduktion [52, 118, 122]. Fehlt jedoch das orthologe
stomatinähnliche Protein MEC-2, das im Komplex mit MEC-4/10 auftritt, so
kommt es zur reduzierten Wahrnehmung leichter Berührung, die
Mechanonozizeption bleibt jedoch unbeeinträchtigt [145]. Neben den
epithelialen Natriumkanälen sind auch die in der Kältenozizeption bereits
vorgestellten Kalliumkanäle KCNK 2 und 4 Gegenstand der Forschung [117].
TRPV2 wird in Nervenfasern exprimiert, die sowohl auf thermische als auch auf
mechanische Reize reagieren [31]. Der Kanal kann in vitro durch Saugen an
der Zelle und osmotische Stimuli direkt aktiviert werden [112]. Ein weiterer
Vertreter der TRP-Familie, TRPV4, kommt wohl als Dehnungssensor in der
Niere und im Urothel vor [62, 107]. TRPV4-/--Knock-out-Mäuse zeigen z.B. nach
einer Entzündung Veränderungen in Form einer mechanischen wie
thermischen Hyperalgesie. Auf die akute Nozizeption scheint das Fehlen von
TRPV4 keinen Einfluss zu haben [4, 38, 63].
Der Stellenwert von TRPA1 in der Mechanonozizeption ist nicht eindeutig
geklärt. In zwei Studien zeigten TRPA1-Knock-out-Mäuse eine unveränderte
mechanische Wahrnehmung, [12, 119] wohingegen zwei andere Arbeiten hier
Defizite zeigten [91, 92]. Abschließend bleibt festzuhalten, dass die meisten
bisher untersuchten Proteine keine signifikanten Beiträge sowohl im Rahmen
20
der Mechanozeption als auch im Rahmen der Mechanonozizeption in
Säugetieren zu leisten scheinen. Eine relativ neue Kandidatenfamilie ist die
Familie der Piezo-Proteine, von welcher bisher die Subgruppen Piezo 1 und
Piezo 2 bekannt sind. Sie umfassen vermutlich 30 Transmembrandomänen und
ähneln keinen bis dato bekannten Ionenkanälen oder Proteinklassen. Piezo-
Proteine könnten weiterhin als nicht-leitende Untereinheiten von Kanalproteinen
fungieren, indem sie die Expression steuern oder die Kanaleigenschafften
verändern [125].
2.4.5. Zentrales nozizeptives System
Die primär afferenten nozizeptiven Neurone ziehen in das Hinterhorn des
Rückenmarks, wo der synaptische Kontakt mit dem zweiten Neuron der
nozizeptiven Bahn hergestellt wird. Das Hinterhorn wird nach Rexed in die
anatomisch und elektrophysiologisch unterschiedlichen Laminae I - X eingeteilt.
Die thermorezeptiven und nozizeptiven Afferenzen (Aδ- und C-Fasern)
projizieren in die oberflächlich gelegenen Laminae wobei C-Fasern in die
Laminae I und II und Aδ-Fasern in die Laminae I und V projizieren. Die
synaptische Übertragung erfolgt durch exzitatorische Neurotransmitter wie z.B.
die Aminosäure Glutamat und durch Neuropeptide wie Substanz P und CGRP,
die bei Verletzungen und anhaltendem Schmerz modulierend auf die
Nozizeption wirken. Die niederschwelligen Aβ-Fasern der Mechanorezeptoren
und Propriozeptoren projizieren in die tiefer gelegenen Laminae III, IV und V;
sie reagieren in der Regel nicht auf Schmerzreize. Lamina V enthält vorwiegend
wide dynamic range (WDR) Neurone, die Input von den dicken, myelinisierten
Aβ-Faser der Mechanorezeptoren und dazu sowohl direkten als auch indirekten
Input der nozizeptiven afferenten Aδ- und C-Fasern erhalten [149]. Die Neurone
der Lamina V sind vermutlich für das Schmerzphänomen des übertragenen
Schmerzes verantwortlich, bei dem Stimuli aus unterschiedlichen Regionen auf
ein und das selbe Neuron konvergieren. Höhergelegene Zentren können dann
den eigentlichen Ursprungsort des Schmerzes nicht mehr diskriminieren.
Die Nervenfasern verlaufen nachdem sie auf Segmentebene gekreuzt haben
kontralateral im Vorderseitenstrang zum Thalamus und Hirnstamm und
schließlich weiter zum Kortex (Abb. 4). Der Vorderseitenstrang untergliedert
sich in fünf aufsteigende Bahnen: der spinoretikuläre, der spinomesenzephale,
21
der spinothalamische, der cervikothalamische und der spinothalamische Trakt.
Der Vorderseitenstrang ist die zentrale nozizeptive Bahn und weist eine
somatotope Gliederung auf, wobei zervikal eintretende Fasern lateral und
sakrale Fasern medial verlaufen. Wie aus dem Namen bereits hervorgeht,
projiziert die Bahn in den Thalamus, wo im Nucleus ventralis posteromedialis
und posterolateralis die Umschaltung auf das dritte Neuron der nozizeptiven
Bahn stattfindet. Deren Fasern projizieren unter anderem zu den
somatosensorischen Kortexarealen S1 und S2 [8]. Die viszeralen Afferenzen
nehmen ihren Weg zum Thalamus über den Nervus Vagus [47].
Dem aufsteigenden nozizeptiven System steht das absteigende inhibitorische
System gegenüber, welches seinen Ursprung im periaquäduktalen Grau (PAG)
hat. Das PAG selbst wiederum steht mit dem Kortex, dem limbischen System
und dem Hypothalamus in Kontakt und wird aus diesen Bereichen heraus
reguliert. Im PAG werden unterschiedliche inhibitorische Rezeptoren wie Opiat-,
Cannabinoid- und GABA-Rezeptoren exprimiert. Die wichtigsten hemmenden
Systeme sind das noradrenerge System mit dem Locus coeruleus als zentralen
Kern in der Pons und das serotonerge System mit seinem Ursprung im Nucleus
raphe magnus in der rostroventralen Medulla [8].
Kortikale wie subkortikale Zentren, die an der Schmerzverarbeitung teilnehmen,
sind das vordere Zingulum, die Insel, der frontale Kortex, der primäre (S1) und
sekundäre (S2) somatosensorische Kortex sowie die Amygdala [120]. Stark
vereinfacht kann man das System in einen vom medialen Thalamus und einen
vom lateralen Thalamus ausgehenden Teil differenzieren. Das laterale System,
auch somatosensorisches System, ist für die Diskriminierung von Ursprung und
Intensität des Schmerzes zuständig und leitet die Wahrnehmung zu den
entsprechenden Hirnarealen [29, 78]. Über die medialen Kernanteile des
Thalamus wird die schmerzhafte Wahrnehmung auf vorwiegend limbische
Gebiete projiziert, die für die affektiv-emotionale Schmerzwahrnehmung
zuständig sind [123, 139]. Die Insel nimmt einen Platz zwischen beiden
Systemen ein. Sie prozessiert schmerzhafte und nicht-schmerzhafte Stimuli und
hat vermutlich auch eine Rolle bei der Affektbewertung von
Schmerzreizen [120].
22
Abbildung 4: Überblick über das nozizeptive System des Menschen (aus Basbaum 2009)
2.4.6. Struktur und Funktion der TRP-Kanäle Einteilung der TRP-Rezeptorfamilie Die TRP-Rezeptoren, welche sich wie bereits beschrieben stark in ihrem
Aktivierungsmechanismus und ihrer Selektivität unterscheiden, werden auf
Basis ihrer Aminosäuresequenzhomologie in 6 große Unterfamilien eingeteilt;
TRPC 1-2 (Canonical), TRPV (Vanilloid) 1-6, TRPM (Melastatin) 1-8, TRPP 1-3
(Polycystin), TRPML 1-3 (Mucolipin) und TRPA1 (Ankyrin) [42, 92, 108]. Neben
TRPV1 sind auch TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPA1 und TRPM8 in den
Neuronen der Spinalganglien exprimiert und tragen zur Transduktion
chemischer, thermischer und mechanischer Stimuli bei (Abb. 5). Es handelt
sich um Kationenkanäle mit einer selektiven Permeabilität für Ca2+ und Na+ [42,
140]. Ihr Aufbau ist gleich dem vieler spannungsgesteuerter Ionenkanäle. Sie
bestehen aus 6 Transmembrandomänen. Beide Enden, N- und C-terminal,
liegen intrazellulär und sind unterschiedlich beschaffen. Die Pore besteht aus
einem pore-loop zwischen den Transmembranregionen 5 und 6 (Abb. 5).
23
TRPA1 TRPA1 stellt das einzige Mitglied der Ankyrin-Subfamilie bei Säugetieren dar.
Er ist in zahlreichen Geweben und Zellen, wie etwa sensorischen Neuronen,
Haarzellen des Innenohrs, im vaskulären Endothel, im Herz, Hirn und Pankreas
zu finden [151]. Die Pore des Kanals weißt einen Durchmesser von 110 pm auf
und erweitert sich bei Aktivierung je nach Agonist bis auf einen Durchmesser
von 138 pm [81]. Änderungen in der Leitfähigkeit eines einzelnen Kanals sind
weniger durch den Agonisten selbst als vielmehr durch die Anwesenheit von
Polyphosphaten bedingt, welche vermutlich an die Ankyrin-Repeat-Domäne
(ARD) binden [48, 80] und so eine Aktivierung über die ARD und die Pore
selbst verursachen.
Die am N-terminalen Ende befindliche ARD baut sich aus 14 Ankyrin-Repeats
auf. Diese Repeats stellen eine 33 Aminosäuren lange Sequenz dar, welche
eine β-α-α-β Struktur ausbilden, über die Proteininteraktionen vermittelt werden.
Der ARD wird eine Funktion in der Mechanonozizeption, [113] als
Bindungsstelle für Proteine [60] und zahlreiche weitere Liganden, vergleichbar
wie bei TRPV1, zugesprochen [96]. Zur näheren Untersuchung wurden die
Ankyrin-Repeats in zwei Schritten entfernt, Δ 1-4 und Δ 1-12. Beide Mutationen
zeigten in elektrophysiologischen Untersuchungen einen vollständigen
Funktionsverlust [116].
TRPA1 kann durch zahlreiche elektrophile Substanzen über kovalente
Wechselwirkung an N-terminal gelegenen Cysteinen und Lysinen aktiviert
werden [69, 98] (Abb. 5): Isothiocyanate (wie sie in Senföl, Wasabi und
Meerrettich enthalten sind), Methylsalicylate (in Wintergrünöl), Zimtaldehyde (in
Zimt) [7], Allicin und Diallyldisulfide (in Knoblauch) [9, 98], Acrolein (in Abgasen
und Tränengas) [9], und endogene Substanzen wie H2O2, Alkenyl-Aldehyd,
4-Hydroxynonenal, 4-Oxo-Nonenal, 4-Hydroxyhexenal, Cyclopentanon,
Prostaglandin, 15-Deoxy-δ (12,14) -Prostaglandin [5, 133].
Weiter Substanzen wie Δ9-Tetrahydrocannabinol [73], Menthol und Menthol-
Analoga [79], Nikotin [131], Clotrimazol [106], Dihydropyridine [55] und
Allgemeinanästhetika [103] aktivieren TRPA1 über einen langsamen,
unbekannten Mechanismus. Sie zeigen zudem oft bimodale Eigenschaften, d.h.
sie können Einwärtsströme in hohen Konzentrationen auch blockieren.
Die kovalenten Wechselwirkungen mit den Thiolgruppen der N-terminal
gelegenen Cysteine stellen den stärksten Aktivierungsmechanismus dar. Diese
24
Wechselwirkung kann in Form von Thiocarbamaten (z.B. Senföl), Michael-
Addition (z.B. Enone), Cystein-Disulfidbrücken oder Alkylierung stattfinden [34].
Ein Kanal lagert sich aus vier TRPA1-Untereinheiten zusammen. Gezeigt sind die Transmembrandomänen (TM1 - TM6), welche die Membran durchspannen sowie der lange zytoplasmatisch gelegene N-Terminus. Die ovalen Formen sind Ankyrin-Repeat-Domänen; die gestrichelte Box zeigt eine EF-Hand (Helix-Loop-Helix-Motiv aus geladenen Aminosäuren, welche Ca2+-Ionen binden können). Die farbigen Kreise stehen für die Cystein-Reste, die nach Macpherson et al. und Hineman et al. für die kovalente Aktivierung von mouse TRPA1 (rot), human TRPA1 (grün) oder beide (blau) sind. Reprented by the permission from Springer Nature: Nature 445, Chemical biology: Sticky spices; Michael J. Caterina; Copyright © Springer Nature 2007. DOI: https://doi.org/10.1038/nature05565 TRPV1 Der transient receptor potential Vanilloid Typ 1 Ionenkanal (TRPV1) ist ein
Mitglied der TRPV-Unterfamilie. Er wurde 1997 entdeckt und stellte das erste
Membranprotein dar, von dem gezeigt werden konnte, dass es direkt an der
Nozizeption beteiligt ist. Die TRPV-Rezeptorfamilie ist in zwei Gruppen
aufgeteilt. Die eine Gruppe bildet die thermosensiblen TRPV1, TRPV2, TRPV3
und TRPV4, die andere die nicht-thermosensiblen TRPV5 und TRPV6. Der
molekulare Aufbau des Kanals entspricht dem der anderen TRP-Kanäle und
besteht aus 6 Transmembrandomänen (S1-S6), einer pore-loop zwischen S5-
S6 und intrazellulär gelegenen N- und C-Termini [32] (Abb. 6). N-terminal findet
man bei TRPV1 lediglich 6 ARDs, welche in der Kanalzusammensetzung, [37]
Abbildung 5: Struktur einer TRPA1 Untereinheit
25
bei der Interaktion mit Hilfsproteinen [110] und in der Ausbildung einer
tetrameren Struktur eine Rolle zu spielen scheinen [96]. Zusätzlich haben sie
eine ATP- und Calmodulin-Bindungsstelle, [96] welche die Kanal-Sensitivität in
Bezug auf Calciumkonzentration und vielleicht sogar metabolischen Status
beeinflussen [121]. Der C-Terminus hat ebenso einen entscheidenden Einfluss
auf die Kanalfunktion. Schneidet man die 31 bzw. 72 C-terminal gelegenen
Aminosäuren ab, so kommt es zunehmend zu Einbußen bei der Sensitivität für
Capsaicin, für pH, Hitze und spannungsaktivierter Ströme [138]. Im
C-terminalen Ende liegt die sogenannte TRP-box welche für die tetramere
funktionelle Zusammenlagerung von TRP-Kanälen zuständig ist [59]. TRPV1
bildet nämlich, wie auch andere TRP-Kanäle, quartäre Strukturen, welche einen
TRP-Kanal, ein Proteingerüst und andere Moleküle wie Phospholipase C (PLC)
und Proteinkinase C (PKC) enthalten [136]. Diese Gruppierung in
Makromolekülen bedingt die Spezifität, Sensitivität und Geschwindigkeit
intrazellulärer Signalwege [90]. Außerdem stellt eine solche Makromolekül-
bildung eine Erklärung für die unterschiedlichen pharmakologischen Reaktionen
auf Vanilloide oder Protonen der nativen Kanälen dar. Tatsächlich zeigt die
Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie eine viereckige Anordnung von TRPV1
um eine zentrale wässrige Pore [71]. Dabei kann es sich um homo- und
heterotetramere Moleküle mit TRPV2 und 3 handeln, die unterschiedliche
Sensitivität und Spezifität aufweisen [39, 68].
Die Aktivierung des Kanals findet durch viele unterschiedliche Mechanismen
statt. Der wohl bekannteste Ligand Capsaicin aktiviert den Kanal über eine
kooperative Bindung an einer intrazellulären Bindungsstelle an der
Transmembrandomäne S3 [74]. Es gibt jedoch Hinweise, dass Capsaicin
mehrere Bindungsstellen am Rezeptor besitzt [61, 77, 138]. Im Gegensatz zu
Capsaicin treten Protonen mit einer extrazellulär gelegenen Bindungsstelle in
Wechselwirkung, wodurch sie den Kanal aktivieren und für Capsaicin wie auch
Hitze sensibilisieren können [75]. Protonen können in sehr hohen
Konzentrationen den Kanal auch über die Capsaicin-Bindungsstelle aktivieren
[126]. Die temperaturabhängige Kanalaktivität wird über die eben schon
angesprochene C-terminal gelegene Region reguliert. Entfernt man die
Aminosäuren 741 bis 752, so verliert der Kanal jegliche
Temperatursensibilität [24].
26
3. Material und Methoden
3.1. Chemikalien und Lösungen
Die getesteten Muskelrelaxanzien wurden in Extrazellularlösung gelöst und
Stocklösungen in Konzentrationen von 100 mM und 1 mM für Rocuronium,
10 mM für Pancuronium, 0,01 mM für Vecuronium (alle Sigma-Aldrich,
Taufkirchen, Deutschland), 10 mM für Atracurium (von Euticals, Rozzano,
Italien) und 100 mM für Succinylcholin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas,
USA) hergestellt. Als Standard-/ Kontrollagonisten dienten Capsaicin,
Carvacrol, 4αPDD (4α-Phorbol 12,13-didecanoate), Menthol (alle Sigma-
Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) und 2-APB (Tocris/Biozol, Eching,
Deutschland). Der Capsaicin-Stock (0,01 mM) war in Ethanol gelöst; Menthol
(100 mM), 2-APB (50 mM), Carvacrol (100 mM), 4αPDD (10 µM) wurden in
DMSO gelöst. Zur Blockade von Einwärtsströmen wurden die spezifischen
Antagonisten, Capsazepin (10 mM), AP-18 (beide Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland) und HC-030031 (100 µM) (BioTrend, Köln, Deutschland), alle
gelöst in DMSO, eingesetzt.
Die calciumfreie Standard-Extrazellularlösung enthielt 140 mM NaCl, 5 mM KCl,
2 mM MgCl2, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES und 5 mM EGTA als Ca2+-
Komplexbildner. Die Lösung wurde mit Tetramethylammonium (TMA) auf einen
pH von 7,4 titriert. Die Intrazellularlösung bestand aus 140 mM KCl, 2 mM
MgCl2, 10 mM HEPES und 5 mM EGTA, die Lösung wurde mit KOH auf pH 7,4
eingestellt.
3.2. Zellkultur und heterologe Expression in HEK293t-Zellen
HEK293t-Zellen (human embryonic kidney-Zellen) sind embryonale
Nierenstammzellen, die sich durch ihre problemlose Kultivierung, einfache
Möglichkeit der Transfektion und niedrige endogene Expression der zu
untersuchenden Kanäle auszeichnen. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2
und 95% O2 in DMEM (Nährmedium Dulbecco’s modified Eagle medium), 1%
Penicillin/ Streptomycin, 30 mM HEPES, 10% FBS (fetal bovin serum) (alle von
Gibco/Inyitrogen, Karlsruhe Deutschland) und 1% Taurin (Sigma-Aldrich,
27
München, Deutschland) bis zu einer Dichte von 70 - 80% in 7 ml-
Zellkulturflaschen kultiviert.
Zur Transfektion wurden die Zellen mittels 0,05% Trypsin-EDTA
(Gibco/Inyitrogen, Karlsruhe, Deutschland) in 35 mm Zellkulturschälchen
aufgeteilt und am selben Tag bei einer Dichte von erneut 70 - 80% transfiziert.
Die Transfektion erfolgte mit dem Nanofectin Kit der Firma PAA-The Cell
Culture Company. Nanofectin ist ein positiv geladenes Polymer, welches in
einen offenporigen Nanopartikel eingebettet ist. Nur der DNA-Nanopartikel-
Komplex kann dann bevorzugt in die Zelle aufgenommen werden und führt so
zu einer gut reproduzierbaren Transfektionsrate der Zellen. Nach einer
Inkubationszeit von 12 - 15 h wurden die Zellen in 35 mm Zellkulturschälchen
ausgesät und nach 4 - 8 h gemessen. Die verwendete hTRPA1-cDNA stammt
von Dr. Paul Heppenstall (EMBL, Monoterondo, Italien), die restlichen cDNAs
wurden von Dr. David Julius (UCSF, San Francisco, USA) zu Verfügung
gestellt. Die Mutation von drei Serinen zu Cysteinen in hTRPA1 erfolgte
schrittweise durch das Einfügen von Cystein an den Positionen 621, 641 und
665 in den Plasmid-Vektor pTRE. Bei der Mutation hTRPA1-3CK wurde analog
an Position 710 ein Arginin für ein Lysin eingefügt. Die cDNAs wurden
entsprechend ihrer Expression in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt:
hTRPA1 (1,6 µg), rTRPV1 (1 µg), mTRPA1 (5 µg), rTRPV2 (2 µg), rTRPV3
(2 µg), rTRPV4 (2 µg), rTRPM8 (2 µg), hTRPA1-C621S/C641S/C665S (1,6 µg),
hTRPA1-C621S/C641S/C665S/K708R (1,6 µg). Um transfizierte Zellen zu
identifizieren wurde als Reporterplasmid CD8-pih3m (1 µg) zugegeben. Mittels
anti-CD8-Immunobeads (anti-CD8 Dynabeads®, Dynal Biotech, Oslo,
Norwegen) konnten so transfizierte Zellen identifiziert werden.
3.3. Patch-Clamp-Experimente
Die Messungen der Ströme durch die Ionenkanäle erfolgte durch die von den
beiden Physiologen Sakmann und Neher 1976 beschriebene Patch-Clamp-
Technik, bei der sehr kleine Ströme in der Größenordnung von pA über
Zellmembranen detektiert werden können. So wurde die Untersuchung
einzelner Ionenkanäle in der Zellmembran erst möglich.
Die Membranströme wurden mit einem Verstärker der Marke Axopatch 200B
registriert und mit einem Analog-Digital-Wandler (Digitizer, Digidata 1440A)
28
digitalisiert. Die Erfassung und Auswertung der Daten am Computer erfolgte mit
der Software pCLAMP 8.1/ 10.0 und Clampfit (alle von: Axon Instruments/
Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien USA). Die zur Messung verwendeten
Elektroden wurden aus Borosilikat-Glasröhren (TW150F-3, World Precision
Instruments, Berlin, Deutschland) mit einem Pipettenziehgerät (PP830,
Narishge, Japan) gezogen. Der Widerstand der verwendeten Pipetten betrug
1,5 - 2 MΩ.
Die am Tag der Messung gesplitteten Zellen wurden von Nährmedium befreit,
mit Extrazellularlösung gewaschen, anti-CD8 Dynabeads® zugegeben und das
Zellkulturschälchen schließlich mit etwa 2 ml Extrazellularlösung aufgefüllt. Die
Pipette wurde bis zur Hälfte mit Intrazellularlösung gefüllt und an dem
Vorverstärker angebracht. Mit Hilfe eines Mikromanipulators (Typ PP-830,
Naishige, Japan) und eines auf einem Anti-Schwingungstisch gelagerten
Mikroskops (Eclipse TE2000-S, Nikon, Düsseldorf, Deutschland) näherte man
sich der Zelle an. Die Messung erfolgte mit der Methode der Ganz-Zell-
Spannungsklemme, die eine Detektion der Ströme über der ganzen
Zellmembran ermöglicht (Abb. 6). Hierbei bewegt man die Pipette bis zum
Kontakt mit der Zelle, der Widerstand erhöht sich dabei um wenige MΩ. Durch
einen kurzen Sog an der Pipette wird die Verbindung zwischen der Pipette und
der Zelle vollständig, worauf sich ein hoher Widerstand > 1 GΩ, der sog.
Gigaseal, zwischen der Zelle und der Pipette ausbildet (Abb. 6 A). Saugt man
nun weiter an der Pipette, durchbricht man die Zellmembran und es entsteht
eine hochohmige, sehr stabile Verbindung zwischen der Pipette und der
Zelle (Abb. 6 B).
Abbildung 6: Whole-Cell Konfiguration
(A) Annäherung an die Zelle, der Widerstand erhöht sich um wenige Ohm. Durch kurzen Sog bildet sich der sog. „Gigaseal“ aus. (B) Die Zellmembran wird durch weiteren Sog durchbrochen und so eine Öffnung zum Zellinneren geschaffen.
29
Da man beim Öffnen der Zelle zwangsläufig Membranbestandteile in den
Mündungsbereich der Pipette zieht kann man als Faustregel eine Verdopplung
des Widerstands zwischen Pipette und Bad annehmen. Durch diese Methode
erhält man eine Konfiguration, die es ermöglicht Ströme über der gesamten
Zellmembran zu messen. Weiterhin werden durch den hochohmigen
Widerstand Leckströme und das daraus folgende Hintergrundrauschen stark
vermindert, wodurch sich die Aufnahmequalität verbessert.
Alle Patch-Clamp-Experimente wurden bei einem Haltemembranpotential von
-60 mV und bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Applikation der Lösungen erfolgte schwerkraftgetrieben mit einem
Polytetrafluorethylen-Glas-Multiperfusionssystem.
30
4. Ergebnisse
4.1. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPA1
Zunächst wurde untersucht, ob Rocuronium mit dem Irritanziensensor TRPA1
interagiert. Hierfür wurde Rocuronium in steigender Konzentration auf in
HEK293t-Zellen heterolog-exprimierten humanen TRPA1 (hTRPA1) bis zum
Erreichen eines Steady States appliziert. Die Zellen wurden während der
Applikation bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten. Bereits ab einer
Konzentration von 10 nM konnten durch Rocuronium induzierte Einwärtsströme
beobachtet werden. Die Größe der Einwärtsströme war konzentrations-
abhängig. Die mittleren Stromamplituden betrugen bei 10 nM 198,2 ± 131,6 pA,
n=6; bei 100 nM 210,9 ± 35,4 pA, n=10; bei 1 µM 507,3 ± 204,4 pA, n=12; bei
10 µM 646,3 ± 200,1 pA, n=9; bei 100 µM 1207,2 ± 212,0 pA, n=35; bei 1 mM
281,3 ± 46,2 pA, n=18; bei 10 mM 229,7 ± 58,2 pA, n=16; bei 15mM 143,4 ±
19,5 pA, n=10. Wie bereits aus den Werten zu entnehmen ist, zeigte sich ab
einer Konzentration von 1 mM eine Abnahme der durchschnittlichen
Stromamplituden, möglicherweise bedingt durch eine parallele Blockade des
Rezeptors durch Rocuronium. Ab einer Konzentration von 10 mM war zudem
eine rasche Zunahme des Einwärtsstroms nach Auswaschen durch
Extrazellularlösung zu beobachten (Abb. 7 A, B). Dieses als resurgent current
bezeichnete Phänomen wurde bereits für Maus-TRPA1 (mTRPA1) bei einer
Aktivierung durch Lidocain oder Menthol beschrieben, bei hTRPA1 wurden
durch diese Substanzen keine resurgent currents verursacht [95, 152] (Abb. 7
A). Die Zunahme der Stromamplitude nach Auswaschen erfolgte deutlich
rascher als die ursprüngliche Aktivierung durch Rocuronium. Auch dies ist
möglicherweise auf einen Block des Kanals im offenen Zustand
zurückzuführen.
Um die blockierenden Eigenschaften von Rocuronium weiter zu untersuchen
wurde getestet, ob Rocuronium auch Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende
HEK-Zellen durch den Standard-Agonisten Carvacrol verringert. Hierzu wurden
Einwärtsströme durch 250 µM Carvacrol induziert und anschließend
Rocuronium in verschiedenen Konzentrationen coappliziert (6 - 8 Zellen pro
Konzentration). Im Durchschnitt blockiert Rocuronium in einer Konzentration
von 1 µM den Carvacrol-Einwärtsstrom zu 61 ± 14%, bei 10 µM zu 47 ± 19%
31
und bei 100 µM zu 86 ± 5%. Die Blockade war nach Beendigung der
Rocuronium-Applikation teilweise auswaschbar (Abb. 7 C, D).
Abbildung 7: Rocuronium aktiviert und blockiert hTRPA1
(A) Repräsentative Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen. Rocuronium aktiviert hTRPA1 ab einer Konzentration von 100 nM. Die Konzentration der klinischen Rocuronium-Präparation (10 mg/ml) beträgt 16,4 mM, der Plasmaspiegel nach Einleitungsdosis beträgt 5 - 10 µg/ml (8 - 16 µM). Untransfizierte Zellen zeigten keinen Einwärtsstrom auf 100 µM Rocuronium (nicht gezeigt). Um einer Desensibilisierung vorzubeugen wurde pro Zelle nur eine Konzentration getestet. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert. (B) Dosis-Wirkungskurve von Rocuronium an hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen. Rocuronium aktiviert hTRPA1 mit einer EC50 von ca. 3 µM, die EC50 wurde nur anhand der Konzentrationen von 100 nM bis 100 µM errechnet. In Konzentrationen > 100 µM scheint die Aktivierung von hTRPA1 durch eine gleichzeitige Blockade des Rezeptors überlagert zu werden. Pro Konzentration wurden zwischen 6 und 35 Zellen getestet. (C) Rocuronium blockiert eine Aktivierung von hTRPA1. hTRPA1 wird durch 250 µM Carvacrol aktiviert, die anschließende, zusätzliche Applikation von 100 µM Rocuronium führt zu einer schnellen Blockade des Carvacrol-induzierten Einwärtsstroms. Nach Beendigung der Rocuronium-Applikation ist die Blockade teilweise auswaschbar. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Carvacrol wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Rocuronium, welches ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurde. (D) Die Blockade von hTRPA1 durch Rocuronium ist konzentrationsabhängig. 1 µM Rocuronium blockiert im Durchschnitt 61 ± 14% des Carvacrol-induzierten Einwärtsstroms, 10 µM 47 ± 19%, 100 µM Rocuronium blockieren 86 ± 5% des Einwärtsstroms. Für jede Konzentration wurden 6 - 8 Zellen getestet.
A"
B"
C"
!!!ds!
32
4.2. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPA1-exprimierende Zellen durch die TRPA1-Antagonisten AP-18 und HC-030031
Um zu zeigen, dass die gemessenen Einwärtsströme durch eine Aktivierung
von hTRPA1 verursacht werden, wurden Rocuronium-induzierte
Einwärtsströme mit AP-18 blockiert. 2007 zeigten Petrus et. al, dass AP-18 eine
Aktivierung von hTRPA1 durch Zimtaldehyd in einer Konzentration von 50 µM
mit einer IC50 von 4,5 µM blockiert [119]. Die Aktivierung von hTRPA1 durch
Rocuronium konnte in unseren Experimenten durch 50 µM AP-18 jedoch
lediglich zu 76,5 ± 26,3% (p < 0,05) und in einer Konzentration von 200 µM zu
81,7 ± 34% (p < 0,05) blockiert werden. Durch erneute Applikation von
Rocuronium ließ sich die Blockade nur sehr langsam und lediglich zu einem
geringen Anteil aufheben (Abb. 8 A).
In weiteren Experimenten wurden Rocuronium-induzierte Ströme mit
HC-030031 blockiert. HC-030031 ist spezifisch für TRPA1 und blockiert
Einwärtsströme unabhängig von der aktivierenden Substanz [105]. Die
Aktivierung von hTRPA1 erfolgte mit Rocuronium in einer Konzentration von
100 µM. HC-030031 wurde mit der Rocuronium-Testlösung coappliziert und
blockierte in einer Konzentration von 100 µM die Einwärtsströme im
Durchschnitt um 99,4 ± 0,9% (p < 0,05) (Abb. 8 A, B). Die Blockade erfolgte
schnell und war durch alleinige Applikation der Rocuronium-Testsubstanz
wieder auswaschbar.
33
Abbildung 8: Rocuronium-induzierte Ströme lassen sich durch die hTRPA1 Antagonisten HC-030031 und AP-18 blockieren
(A) HC-030031 blockiert die Aktivierung von hTRPA1 vollständig in einer Konzentration von 100 µM, AP-18 verursacht eine partielle Blockade in einer Konzentration von 200 µM. hTRPA1 wurde mit Rocuronium in einer Konzentration von 100 µM aktiviert. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit HC-030031 oder AP-18, welche ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurden. (B) Bei den Experimenten erfolgte eine Aktivierung von hTRPA1 mit Rocuronium in einer Konzentration von 100 µM. HC-030031 blockiert in einer Konzentration von 100 µM den Einwärtsstrom im Durchschnitt zu 99,4 ± 0,9% (p < 0,05), AP-18 in einer Konzentration von 50 µM zu 76,5 ± 26,3% (p<0,05) und in einer Konzentration von 200 µM zu 81,7 ± 34% (p < 0,05).
4.3. Für die Aktivierung von hTRPA1 durch Rocuronium sind bestimmte Aminosäuren im N-terminalen Ende des Proteins notwendig
Für TRPA1 wurden unterschiedliche Aktivierungsmechanismen beschrieben.
So sind für die Aktivierung und Blockade durch Menthol bestimmte
Aminosäuren in der Transmembranregion 5 notwendig, [152] für die Aktivierung
durch Calcium wurde eine sog. EF-Hand-Domain im N-Terminus identifiziert
[155]. Irritierende Substanzen beinhalten auf molekularer Ebene häufig reaktive
chemische Gruppen. So besitzt das im Senföl vorkommende Allylisothiocyanat
(AITC, TRPA1-Aktivator) eine reaktive Schwefelgruppe. Das u.a. im
Zigarettenrauch vorkommende Irritanz Acrolein (ebenfalls ein TRPA1-Agonist)
ist ein starkes Elektrophil und fungiert häufig als sog. Michael-Akzeptor. Viele
700 pA 20 S
100µM Rocuronium 200µM AP-18
Nor
mal
isie
rter R
ocur
oniu
m-
Ein
wär
tsst
rom
Roc
. 100
µM
Roc. 1
00 µM
+
HC–030
031 1
00 µM
Roc. 1
00 µM
Roc
. 100
µM
Roc. 1
00 µM
+
AP-18 50
µM
Roc. 1
00 µM
+
AP-18 20
0 µM
100µM Rocuronium 100µM HC-03003
300 pA
20 S
A
B
34
TRPA1-Agonisten haben sehr unterschiedliche Molekülgrundstrukturen,
besitzen aber eine chemisch-reaktive Gruppe, welche mit bestimmten Cystein-
Resten im N-Terminus interagiert und eine kovalente Bindung mit diesen
eingehen kann.
Hinman et al. zeigten, dass nach Mutation von drei Cystein-Resten an den
Stellen 621, 641 und 665 zu Serin der Kanal durch elektrophile Agonisten (z.B.
Acrolein, AITC) nur noch in exorbitant hohen Dosen aktivierbar ist. Die
zusätzliche Mutation eines Lysin-Restes zu Arginin an der Stelle 710 macht den
Kanal komplett insensitiv für AITC. 2-APB, welches über einen bis dato
unbekannten Mechanismus TRPA1 aktiviert, ruft weiterhin eine Aktivierung des
Kanals hervor. Gegenüber den Agonisten wie Menthol oder Carvacrol ist den
reaktiven oder elektrophilen Agonisten gemein, dass die Kinetik der
Einwärtsströme sehr langsam ist und die Agonisten manchmal über Minuten
appliziert werden müssen bis sich ein Strommaximum einstellt. Diese
Zeitverzögerung im Gegensatz zur schnellen Stromkinetik bei Menthol und
Carvacrol wird der Diffusion über die Zellmembran sowie dem Eingehen der
kovalenten Bindung zugeschrieben. Vergleicht man die Kinetik der
Rocuronium-induzierten Einwärtsströme mit denen von AITC oder Carvacrol, so
ähnelt diese stark der Kinetik von AITC. Auf der Suche nach einem
Aktivierungsmechanismus von Rocuronium untersuchten wir also zunächst die
für elektrophile Substanzen nahezu insensible hTRPA1-Mutation
C621S/C641S/C665S (hTRPA1-3C). Diese zeigte analog zur Aktivierung von
hTRPA1 durch AITC ebenso um 75,3% (p < 0,05) reduzierte Einwärtsströme
auf die Applikation von 100 µM Rocuronium, jener Konzentration, welche beim
Wildtyp die durchschnittlich größten Ströme hervorruft (Abb. 9 A, B). Die
zusätzliche Mutation des Lysins zu Arginin an der Stelle 710
(C621S/C641S/C665S/K710R, hTRPA1-3CK) machte die Mutation für 100 µM
Rocuronium vollständig insensibel (p < 0,05), zeigte allerdings weiterhin eine
Aktivierbarkeit durch 1 mM 2-APB (Abb. 9 A, B). Die Abnahme der
Stromamplitude von hTRPA1-3C gegenüber der Mutanten hTRPA1-3CK war
statistisch nicht signifikant (p > 0,05). Letztendlich konnten wir mit diesen
Experimenten zeigen, dass sich Rocuronium trotz einer sehr unterschiedlichen
Molekularstruktur bei der Aktivierung von TRPA1 analog zu den elektrophilen
Agonisten wie AITC und Acrolein verhält [57, 69, 98, 152].
35
Abbildung 9: Aminosäuren im N-terminalen Rest von TRPA1 vermitteln die Rocuronium-induzierte Aktivierung
(A) Die hTRPA1-Mutante C621S/C641S/C665S zeigt im Vergleich zum Wildtyp um 75,3% verkleinerte Einwärtsströme durch 100 µM Rocuronium (p < 0,05). Die hTRPA1-Mutation C621S/C641S/C665S/K710R kann durch Rocuronium nicht mehr aktiviert werden (p > 0,05), die Mutation ist aber durch 1 mM 2-APB weiterhin aktivierbar (nicht gezeigt). Zellen wurden bei -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States oder aber für mindestens 1,5 min appliziert. (B) Vergleich der durch 100 µM Rocuronium verursachten durchschnittlichen Einwärtsstromamplituden. Für jeden Genotyp wurden zwischen 8 und 35 Zellen gemessen.
4.4. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPV1
TRPA1 und TRPV1 sind in nozizeptiven Neuronen coexprimiert und bilden
möglicherweise Heterotetramere [56]. Aus diesem Grund untersuchten wir im
Folgenden den humanen TRPV1-Rezeptor auf seine Aktivierbarkeit durch
Rocuronium im heterologen Expressionssystem in HEK293t-Zellen. Auch hier
ließen sich bereits mit sehr niedrigen Konzentrationen ab 1 nM Einwärtsströme
induzieren und es zeigte sich eine Konzentrationsabhängigkeit der Aktivierung.
Die mittleren Stromamplituden betrugen bei 1 nM 173,8 ± 89,3 pA, n=6; bei
10 nM 433,5 ± 334,5 pA, n=10; bei 100 nM 783,0 ± 615,7 pA, n=10; bei 1 µM
1116,7 ± 1513,3 pA, n=7; bei 10 µM 836,4 ± 1603,9 pA, n=13; bei 100 µM
186,8 ± 185,6 pA, n=9; bei 1 mM 115,4 ± 114,0 pA, n=8; bei 15mM
30,0 ± 25,4 pA, n=10 (Abb. 10 A, B). Ähnlich wie die Aktivierung von hTRPA1
verläuft die Aktivierung von hTRPV1 zweiphasig: in Konzentrationen zwischen
1 nM und 1 µM nehmen die Einwärtsströme an Größe zu; in höheren
Konzentrationen ab 10 µM nehmen die Einwärtsströme wieder ab. Im Bereich
der klinisch-verwendeten Konzentration in Höhe von 15 mM kommt es nur noch
zu einer transienten und kleinen Aktivierung. Nach Applikation dieser
Konzentrationen zeigten sich auch hier beim Auswaschen der Rocuronium-
Lösung häufig resurgent currents, welche bis zur höchsten getesteten
36
Konzentration von 15 mM deutlich an Größe zunahmen. Auch hier lag
wiederum eine zusätzliche blockierende Komponente von Rocuronium an
hTRPV1 nahe, sodass in weiteren Experimenten untersucht wurde, ob
Rocuronium in Coapplikation mit anderen Agonisten den Kanal suffizient
blockieren kann. Hierzu wurde hTRPV1 zunächst mit 100 nM Capsaicin
aktiviert, anschließend erfolgte die Coapplikation von 100 nM Capsaicin und
1 µM oder 100µM Rocuronium. 1 µM Rocuronium führte zu einer Reduktion des
Einwärtsstroms um 49,9 ± 18,6%, 100 µM Rocuronium zu einer Reduktion des
Capsaicin-induzierten Einwärtsstroms um 54,4 ± 24,4% (Abb. 10 E).
Für einige Agonisten von TRPA1 und/oder TRPV1 sind speziesspezifische
Aktivierungsmechanismen bekannt. Aus diesem Grund untersuchten wir
TRPV1 der Ratte (rTRPV1) auf seine Aktivierbarkeit durch Rocuronium.
Zunächst wurde 1 µM Rocuronium auf rTRPV1-exprimierende HEK-Zellen
gegeben, im Anschluss erfolgte die Gabe von 100 nM Capsaicin zur
Generierung eines maximalen Einwärtsstroms für jede individuelle Zelle. Rein
morphologisch waren die induzierten Einwärtsströme sehr ähnlich (Abb. 10 A,
C). Normierte man die Rocuronium-Ströme auf den jeweils folgenden
Capsaicin-Strom, so erreichten die Rocuronium-Ströme bei rTRPV1 im Schnitt
54,2 ± 41,6% des Capsaicin-Stroms, bei hTRPV1 allerdings nur 15,9 ± 14,9%
(Abb. 10 D).
1 nM 10 nM 1 µM 100 nM 10 µM 100 µM 1 mM 15 mM
25 S
500 pA
A
Inw
ard
curr
ent i
n pA
cRocuronium in µM
B
37
Abbildung 10: Rocuronium aktiviert und blockiert TRPV1
(A) Repräsentative Einwärtsströme in hTRPV1-exprimierende HEK293t-Zellen. Rocuronium aktiviert hTRPV1 ab einer Konzentration von 1 nM. Die Konzentration der klinischen Rocuronium-Präparation (10 mg/ml) beträgt 16,4 mM, der Plasmaspiegel nach Einleitungsdosis beträgt 5 - 10 µg/ml (8 - 16 µM). Untransfizierte Zellen zeigten keinen Einwärtsstrom auf 100 µM Rocuronium (nicht gezeigt). Um einer Desensibilisierung vorzubeugen, wurde pro Zelle nur eine Konzentration getestet. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert. (B) Dosis-Wirkungskurve von Rocuronium an hTRPV1-exprimierenden HEK293t-Zellen. In Konzentrationen > 1 µM scheint die Aktivierung von hTRPV1 durch eine gleichzeitige Blockade des Rezeptors überlagert zu werden. (C) Repräsentativer Einwärtsstrom in eine rTRPV1-exprimierende HEK293t-Zelle. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert. (D) Normalisiert man die Einwärtsströme von hTRPV1 und rat TRPV1 auf die Capsaicin-Kontrollströme, so zeigt sich im direkten Speziesvergleich bei hTRPV1 eine Aktivierung von 15,9 ± 14,9% und bei ratTRPV1 von 54,2 ± 41,6%. (E) Repräsentative Ströme der Blockade der Capsaicin-induzierten Ströme durch Coapplikation von Rocuronium 1 µM und 100 µM. (F) Normalisierte Rocuronium-Einwärtsströme. Rocuronium blockiert eine Aktivierung von hTRPV1 durch Capsaicin ab einer Konzentration von 1 µM. hTRPV1 wird durch 100 nM Capsaicin aktiviert. Die anschließende Coapplikation von 1 µM Rocuronium führt zu einer Blockade von 49,9 ± 18,6%, bei 100 µM Rocuronium zu einer Blockade von 54,4 ± 24,4% des Capsaicin-induzierten Einwärtsstroms. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Capsaicin wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Rocuronium, welches ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurde.
Roc 1 µM
25 S
500 pA
C
Capsaicin 100 nM Rocuronium 100 µM
Capsaicin 100 nM Rocuronium 1 µM
25 S
!
500 pA
No
rmie
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Ro
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Ein
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rom
Capsaicin 100 nM
hTRPA1 ratTRPV1
D
E F
No
rmie
rter
Ro
uro
niu
m-
Ein
wär
tsst
rom
Capsicin 100 nM
Capsaicin 100nM + Roc. 1µM
Capsaicin 100nM +
Roc. 100µM
!
38
4.5. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPV1-exprimierende Zellen durch den TRPV1-Antagonisten Capsazepin
Zur Kontrolle, dass es sich bei der Applikation von Rocuronium auf hTRPV1
nicht um unspezifische Effekte handelt, wurde Rocuronium mit dem TRPV1-
Antagonisten Capsazepin coappliziert. Capsazepin, welches ein synthetisches
Analogon von Capsaicin ist, blockiert spezifisch die Aktivierung von TRPV1
durch Agonisten wie Capsaicin und Resiniferatoxin, allerdings nicht die TRPV1-
Antwort auf Hitze [142]. Ein durch 1 µM Rocuronium induzierter Einwärtsstrom
in hTRPV1-exprimierende HEK-Zellen wurde durch die Coapplikation von
10 µM Capsazepin vollständig blockiert (Abb. 11 A, B).
Abbildung 11: Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPV1-exprimierende Zellen durch den TRPV1-Antagonisten Capsazepin.
Capsazepin blockiert die Aktivierung von hTRPV1 in einer Konzentration von 10 µM. hTRPV1 wurde mit Rocuronium in einer Konzentration von 1 µM aktiviert. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Capsazepin, welches ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurde.
4.6. Rocuronium verursacht keine Sensibilisierung der Protonen-induzierten Stromantwort bei hTRPV1
Klinisch-gebräuchliche Injektionslösungen von Rocuronium (z.B. Esmeron®)
haben zur Stabilisation der Lösung einen sauren pH-Wert in Höhe von 3,8 - 4,2.
TRPV1 lässt sich durch Protonen, also einen sauren pH-Wert, der kleiner als
6,3 ist, aktivieren [32]. Für TRPV1 ist ebenfalls bekannt, dass bei Applikation
Rocuronium 1µM Capsazepin 10 µM
25 S
!
500 pA
A" B"
Roc
uron
ium
Ein
wär
tsst
rom
Rocuronium 1 µM Rocuronium 1 µM + Capsazepin 10 µM
39
niedriger Konzentrationen zweier Agonisten eine Sensibilisierung des
Rezeptors erfolgen kann, z.B. durch Protonen für Capsaicin und Hitze [132]
oder durch Lidocain für Capsaicin und Hitze [94]. Bisher wurde, wie bereits
erwähnt, der Injektionsschmerz von Rocuronium-haltigen Lösungen nur dem
sauren pH-Wert der Lösung zugeschrieben. Hier stellte sich nun die Frage, ob
die kombinierte Applikation der TRPV1-Agonisten Rocuronium und Protonen
ebenfalls eine Sensibilisierung der Einwärtsströme in TRPV1-exprimierende
Zellen verursacht. Hierzu wurde zunächst in calciumfreier Lösung durch einen
pH-Wert von 6 ein Strom in hTRPV1-exprimierende HEK-Zellen induziert, in
einer zweiten Applikation wurde pH 6 mit 10 µM oder 100 µM Rocuronium
kombiniert (Abb. 12 A). Die für andere Agonistenkombinationen beschriebene
Sensibilisierung konnte in unseren Experimenten nicht nachvollzogen werden,
vielmehr zeigten sich in der Tendenz bei der kombinierten zweiten Applikation
leicht rückläufige Einwärtsstromamplituden. Während bei einer Konzentration
von 10 µM Rocuronium eine Stromabnahme von 1,3 ± 11% beobachtet wurde,
zeigte sich bei einer Konzentration von 100 µM eine Abnahme des
Einwärtsstroms um 27 ± 32 % (Abb. 12 B).
ES pH 6,0
ES pH 6,0 + Roc. 100 µM
ES pH 6,0
ES pH 6,0 + Roc. 10 µM
10 s
3 nA
Nor
mal
isie
rter
Roc
uron
ium
–
Einw
ärts
stro
m
Roc. 1
00 µM
+
ES pH 6,
0
ES pH 6
ES pH 6
Roc. 1
0 µM +
ES pH 6,
0
A"
B"
40 Abbildung 12: Rocuronium verursacht keine Sensibilisierung der Protonen-induzierten Stromantwort bei hTRPV1
(A) Bei Coapplikation von Rocuronium und Protonen kommt es zu keiner Sensibilisierung der Stromantwort bei hTRPV1. Bei steigenden Rocuroniumkonzentrationen (10 µM/ 100 µM) zeigt sich eine in der Tendenz verringerte Stromantwort. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, pH 6,0 wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Rocuronium, ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States. (B) Rocuronium blockiert in einer Konzentration von 10 µM die Stromantwort um durchschnittlich 1,3 ± 11%, in einer Konzentration von 100 µM um durchschnittlich 27 ± 32%.
4.7. Die Thermo-TRPs als weitere Mitglieder der TRP-Kanalfamilie werden durch Rocuronium nicht aktiviert
Während TRPV1 als Markerprotein für nozizeptive Neurone angesehen werden
kann, da der Kanal in der Mehrzahl der entsprechenden Neuronen exprimiert
wird, ist TRPA1 nur in einem kleineren Anteil der nozizeptiven Neurone zu
finden, hier aber in einer signifikanten Überlappung mit TRPV1. Die
sogenannten Thermo-TRPs (TRP-Kanäle welche durch bestimmte
Temperaturen aktiviert werden) TRPV2, TRPV3, TRPV4 sowie TRPM8 werden
ebenso in Nozizeptoren exprimiert. Da in der Vergangenheit durch
verschiedene Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte, dass Substanzen, welche
TRPV1 und/ oder TRPA1 aktivieren, ebenso die Thermo-TRPs aktivieren
können, [57] untersuchten wir die genannten Kanäle auf deren Aktivierbarkeit
durch 10 µM bzw. 100 µM Rocuronium (n = mindestens 7 für jeden Rezeptor
für jede Konzentration). Die jeweiligen Rocuronium-Konzentrationen wurden für
100 s appliziert. Um zu zeigen, dass die Zellen den gewünschten Kanal auch
exprimieren, wurde im Anschluss mit einem Kontrollagonisten ein Strom
induziert. Um unerwünschte Effekte wie z.B. eine Desensibilisierung zu
vermeiden, wurde pro Zelle nur eine Rocuronium-Konzentration getestet. Alle
untersuchten Kanäle (TRPV2-V4 sowie TRPM8) zeigten auf die Applikation von
10 µM bzw. 100 µM Rocuronium keine Einwärtsströme oder sonstige
Veränderungen der Stromkurve, wohingegen alle Kontrollagonisten suffiziente
Ströme auslösen konnten (Abb. 13).
41
Abbildung 13: TRPV2-V4 und TRPM8 werden durch Rocuronium nicht aktiviert
Weder 10 µM (nicht gezeigt) noch 100µM Rocuronium verursachen Einwärtsströme in HEK293t-Zellen, die nozizeptive Thermo-TRP-Kanäle rTRPV2, hTRPV3, rTRPV4 oder rTRPM8 exprimierten. Pro Kanal und Konzentration wurden mindestens 7 Zellen getestet, die Expression des jeweiligen Kanals wurde mit einem Kontrollagonisten verifiziert. Die Zellen wurden bei -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States oder aber für mindestens 100 s appliziert.
4.8. Weitere klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien aktivieren ebenfalls hTRPA1
Schmerzen bei intravenöser Injektion sind nur für Rocuronium klinisch
beschrieben, aber die enge strukturelle Verwandtschaft mit Pancuronium und
Vecuronium lässt vermuten, dass diese beiden Derivate ebenso das Potential
aufweisen hTRPA1 zu aktivieren. Wie einleitend beschrieben, ist TRPA1 dafür
bekannt, dass er durch viele nicht-strukturverwandte Chemikalien aktiviert
werden kann. Deswegen wurde die Familie der Benzylisochinolone mit einem
ihrer Vertreter, dem Atracurium, und ebenso Succinylcholin als einziger
Vertreter der nicht-depolarisierenden Muskelrelaxanzien, welches aus zwei
Acetylcholin-Molekülen besteht, getestet.
Erstaunlicherweise induzierten alle getesteten Substanzen Einwärtsströme in
hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen mit folgenden mittleren Stromstärken:
10 µM Pancuronium: 765,5 ± 345,9 pA, n=6; 100 µM Vecuronium:
544,1 ± 497,3 pA, n=10; 10 µM Atracurium: 143,9 ± 114,3 pA, n=9; und
schließlich 100 µM Succinylcholin: 664,1 ± 491,6 pA, n=10 (Abb. 14).
42
Abbildung 14: Weitere klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien aktivieren ebenfalls hTRPA1 in HEK293t-Zellen
(A) Repräsentative, durch verschiedene Muskelrelaxanzien verursachte Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen. Sowohl nicht-depolarisierende als auch depolarisierende Muskel-relaxanzien sind potente Agonisten für hTRPA1. Für jedes Relaxanz wurde eine Konzentration getestet. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, die verschiedenen Substanzen wurden bis zum Erreichen eines Steady-states appliziert. (B) Vergleich der durchschnittlichen Einwärtsstromamplituden der verschiedenen Muskelrelaxanzien. Für jede Substanz wurden zwischen 5 und 10 Zellen gemessen.
Rocuronium Vecuronium Pancuronium Atracurium Succinylcholin
43
5. Diskussion Rocuronium ist eines der am häufigsten verwendeten, nicht-depolarisierenden
Muskelrelaxanzien im klinischen Alltag. Die Anwendung wird jedoch durch eine
unerwünschte Wirkung, nämlich einen unangenehmen, brennenden
Injektionsschmerz eingeschränkt. Dieser limitiert die Anwendung besonders für
die Präkurarisierung oder das Priming bei bewusstseinsklaren Patienten und in
der Kinderanästhesie. Neben dem sauren pH-Wert der klinisch-gebräuchlichen
Lösungen sowie einer unphysiologischen Osmolalität der Aufbereitung wurde
ebenfalls eine Aktivierung von nozizeptiven Neuronen durch Rocuronium selbst
diskutiert, wie sie bereits für zahlreiche Anästhetika wie Propofol, Lidocain und
auch volatile Anästhetika gezeigt werden konnte [94, 95, 103]. Alle genannten
Substanzen aktivieren Mitglieder der TRP-Kanal-Familie und scheinen einen
Großteil ihrer algogenen Wirkung über die Irritanziensensoren TRPA1 und
TRPV1 zu vermitteln. Die molekularen Mechanismen, welche aber zur
Verursachung des Injektionsschmerzes von Rocuronium-haltigen Lösungen
beim Menschen beitragen, sind bis dato ungeklärt.
Mit der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Rocuronium und
weitere, klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien sowohl aus der Gruppe der
Aminosteroide als auch aus anderen Gruppen, Agonisten für nozizeptive TRP-
Kanäle im heterologen Expressionssystem sind.
5.1. Injektionsschmerz durch Anästhetika und andere Medikamente
In der Anästhesie verwendete Medikamente verursachen relativ häufig sowohl
Schmerzen bei intravenöser Injektion als auch in der Folge nach Injektion
Rötungen, Schwellungen und Thrombophlebitiden. Als in den 1980er Jahren
Etomidat und Propofol in der Klinik eingeführt wurden und beide Medikamente
heftige Schmerzen bei intravenöser Injektion verursachten, entstand eine rege
wissenschaftliche Diskussion, welchem Umstand diese Schmerzen
zuzuschreiben seien. Immer wieder diskutiert wurden als Algogene in
entsprechenden Präparationen sowohl die Lösungsmittel für diese lipophilen
Wirkstoffe als auch der pH-Wert und die Osmolalität der entsprechenden
Lösungen. Ebenso wurde lange darüber diskutiert, ob es sich um einen direkten
Effekt durch entsprechende Substanzen handelt, oder ob die Schmerzen erst
44
durch die Freisetzung von körpereigenen algogenen Substanzen wie Histamin
oder Bradykinin verursacht werden. In einer richtungsweisenden Arbeit konnten
Arndt und Kollegen 1991 zeigen, dass der Injektionsschmerz von
unterschiedlichen Präparationen in menschlichen peripheren Venen durch
polymodale Nozizeptoren in der Venenwand vermittelt wird [6]. Die
entsprechenden Wirkstoffe selbst (Propofol, Etomidat und in der Folge auch
Rocuronium) wurden lange Zeit nicht als die Verursacher von
Injektionsschmerzen verdächtigt. Erst Blunk et al. zeigten in einer Arbeit 2003
mittels verschiedener Versuchsansätze, dass die Aminosteroid-
Muskelrelaxanzien Rocuronium und Vecuronium selbst konzentrationsabhängig
Schmerzen im Humanversuch hervorrufen, sowie kutane nozizeptive C-Fasern
im Tierversuch aktivieren können.
Mittels dermaler Mikrodialyse wurde im Humanversuch gezeigt, dass
Vecuronium und Rocuronium in einer Konzentration von 10 mg/ml (16,4 mM)
bei den Probanden deutliche Schmerzen hervorrufen und algogene Mediatoren
wie Histamin, Tryptase und Bradykinin im Gewebe freisetzen. Weiterhin
konnten sie in diesem Versuchsaufbau zeigen, dass beide Substanzen eine
lokale Vasodilatation verursachen und in einer Konzentration von 10 mg/ml
auch eine Axon-Reflex-Antwort verursachen. Die Medikamentenzubereitung
entsprach allerdings nicht den klinisch-verwandten Lösungen, es wurden
Präparationen mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet, um den sauren pH der
klinischen Lösungen als Schmerzverursacher auszuschließen.
Überraschenderweise zeigte sich, dass der Umfang der beobachteten
Mediatorenfreisetzung nicht mit den empfundenen Schmerzen der Probanden
korrelierte, sodass den Autoren ein indirekter Weg der Schmerzentstehung
über die gemessenen Mediatoren unwahrscheinlich erschien. Im in vitro
Versuch am Haut-Nerven-Präparat der Maus verursachten sowohl Rocuronium
als auch Vecuronium in einer Konzentration von 10 mg/ml (pH 7,4) eine direkte
Aktivierung von nozizeptiven C-Fasern sowie eine Desensibilsierung bei
verlängerter Applikation.
Lidocain und andere Lokalanästhetika verursachen bei der Injektion z.B. zur
Leitungsanästhesie auch einen brennenden Schmerz, welcher wahrscheinlich
aufgrund der begleitenden Natriumkanalblockade schnell abnimmt. Leffler und
Kollegen konnten 2008 zeigen, dass die Aktivierung von nozizeptiven Neuronen
durch Lokalanästhetika von der Expression von TRPA1 und TRPV1 abhängt.
45
Ebenso konnten sie zeigen, das Lokalanästhetika das pronozizeptive Peptid
CGRP aus Nerven freisetzen können. Die gleichen molekularen Mechanismen
konnte die Arbeitsgruppe ebenso für die Aktivierung von nozizeptiven Neuronen
durch Propofol zeigen. Matta et al. zeigten in einer anderen Arbeit im
Tierversuch, dass für nozizeptives Verhalten ausgelöst durch Propofol TRPA1
der Hauptmediator zu sein scheint.
5.2. Aktivierung von hTRPA1 und hTRPV1 durch Rocuronium
Aufgrund der beschriebenen Vorarbeiten lag es nahe, die von Blunk und
Mitarbeitern beschriebenen algogenen Wirkungen von Rocuronium und
Vecuronium auf ihre Vermittlung hin durch TRP-Kanäle zu untersuchen. Die
hier gezeigten Daten zeigen im heterologen Expressionssystem eine klare
Aktivierung von TRPA1 und TRPV1 von Mensch und Nagern in einem
Konzentrationsbereich ab ca. 10 nM für hTRPV1 und ca. 100 nM für hTRPA1.
Die Aktivierung findet in Konzentrationsbereichen statt, die noch unter dem
Plasmaspiegel nach Gabe einer Einmaldosis liegen (ca. 8 - 16µM).
Untransfizierte HEK293t-Zellen zeigten nie eine Reaktion auf die Applikation
von Rocuronium.
Eine Besonderheit, die bei der Aktivierung von TRPA1 und TRPV1 durch
Propofol und Lokalanästhetika auftritt, sind sogenannte resurgent currents, wie
sie von Leffler et al. für Lidocain bei rTRPA1, jedoch nicht bei hTRPA1 gezeigt
werden konnten [95].
Resurgent currents wurden zunächst bei spannungsgesteuerten Natrium-
Kanälen gezeigt und werden auf eine Blockade des offenen Kanals
zurückgeführt [65]. Nach Applikation von hohen Dosen von Rocuronium an
hTRPA1 und hTRPV1 konnte beobachtet werden, dass es nach der
eigentlichen Aktivierung des Kanals während des Ausspülens von Rocuronium
zu einem zweiten Einwärtsstrom kommt (Abb. 10 A, 1 mM und 15 mM). Von
daher wurden ebenso etwaige zusätzliche, blockierende Eigenschaften von
Rocuronium bei beiden Kanälen untersucht und es konnte gezeigt werden,
dass Rocuronium TRPA1 und TRPV1 nicht nur aktiviert, sondern in höheren
Konzentrationsbereichen (nachgewiesen ab ca. 1 µM) die Aktivierung der
Kanäle durch andere Agonisten auch blockiert.
46
Für die Aktivierung von TRPA1 und TRPV1 sind in der Literatur verschiedene
Bindungsstellen und Mechanismen beschrieben. So gibt es Agonisten, welche
die Zellmembran erst überwinden müssen um den Kanal mittels einer
kooperativen [76] oder gar einer kovalenten Bindung [69, 98] zu aktiveren.
Andere Agonisten wiederum können die Kanäle von der Außenseite her
aktivieren [75] oder aber durch second-messenger Kaskaden, wie etwa durch
Bradykinin bei TRPA1 [143]. Der bereits beschriebene kovalente
Aktivierungsmechanismus von TRPA1 basiert auf Wechselwirkungen mit
C-terminal gelegenen Cysteinen des Proteins. Eine Mutation von bestimmten
Cystein-Resten im Bereich des N-Terminums (Austausch durch Serin) macht
TRPA1 für die Aktivierung durch Agonisten mit reaktiven Gruppen (Senföl,
Acrolein) weniger oder gar unempfindlich.
Rocuronium zeigte bei dieser Mutante (hTRPA1-C621S/C641S/C665S;
hTRPA1-3C) wesentlich geringere Einwärtsströme bei voll-erhaltener
Sensibilität für den Kontrollagonisten Carvacrol. Der zusätzliche Austausch
eines an Position 708 gelegenen Lysins durch Arginin führte zu
einer vollständigen Unempfindlichkeit der Mutante (hTRPA1-
C621S/C641S/C665S/K708R; hTRPA1-3CK) für Rocuronium.
Aus diesen Ergebnissen kann prinzipiell gefolgert werden, dass eine Interaktion
mit den oben genannten Aminosäuren den wahrscheinlichen
Aktivierungsmechanismus für TRPA1 durch Rocuronium darstellt. Für die
Aktivierung von TRPA1 scheint im Gegensatz zu den „normalen“ Interaktionen
zwischen Rezeptoren und Agonisten nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip nicht
die sterische Grundstruktur, sondern das Vorhandensein von reaktiven
Gruppen entscheidend zu sein [69, 98]. Allerdings besitzt Rocuronium keine
hoch-reaktiven Gruppen wie sie klassische TRPA1-Agonisten besitzen.
Außerdem erfolgt die Aktivierung von TRPA1 über diesen Mechanismus aus
dem Zellinneren. Die Diffusion über die Zellmembran ist für die lipophilen und
reaktiven Agonisten problemlos möglich.
Rocuronium liegt bei pH 7,4 als einfach-geladenes, quarternäres Ammonium
vor. Dieser Umstand erschwert die Diffusion über die Zellmembran erheblich,
sodass nicht davon ausgegangen werden kann, dass durch Diffusion
nennenswerte intrazelluläre Konzentrationen erreicht werden können. Eine
mögliche Erklärung könnte sein, dass TRPA1 eine große Membranpore besitzt,
über die Moleküle wie der Farbstoff Yo-Pro mit einem Molekulargewicht von
47
630 g/mol ins Zellinnere gelangen können. Rocuronium wäre mit einem
Molekulargewicht von knapp 530 g/mol möglicherweise ebenso dazu in der
Lage das Zellinnere über die geöffnete Pore von TRPA1 zu erreichen. Da sich
eine geringe Anzahl von TRPA1-Kanälen immer in einem geöffneten Zustand
befinden, könnte die Permeation über diese offenen Kanäle die langsame
Stromkinetik in niedrigeren Konzentrationen erklären. Durch die intrazelluläre
Aktivierung von TRPA1 käme es nach und nach zu einer schnelleren
Stromkinetik.
Rocuronium-induzierte Einwärtsströme bei hTRPA1 wurden mit den
Antagonisten AP-18 und HC-030031 untersucht. Während AP-18, welches die
Aktivierung von hTRPA1 durch Zimtaldehyd vollständig blockiert, Rocuronium-
induzierte Ströme selbst in hoher Konzentrationen nur teilweise verringern
konnte, blockierte HC-030031 (ein weiterer Antagonist für TRPA1) die Ströme
vollständig. Da für beide Antagonisten die Blockademechanismen unzureichend
geklärt sind, kann letztendlich hieraus kein weiterer Hinweis für die
Aktivierungsmechanismen von TRPA1 generiert werden.
Einwärtsströme von hTRPV1 ließen sich nahezu vollständig durch Capsazepin
blockieren. Capsazepin interagiert ebenso wie Capsaicin mit der intrazellulär
gelegenen Vanilloid-Bindungsstelle, die sich in den Transmembranregionen
3 und 4 befindet [74]. Hieraus könnte man folgern, dass Rocuronium TRPV1
möglicherweise durch Interaktion mit der Capsaicin-Bindungsstelle von TRPV1
aktiviert. Zur endgültigen Aufklärung des Aktivierungsmechanismus für TRPV1
durch Rocuronium sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich.
In nozizeptiven Neuronen werden mehrere, unterschiedliche Thermo-TRP-
Kanäle exprimiert. Hierzu zählen neben TRPA1 und TRPV1 auch TRPV2,
TRPV3, TRPV4 und TRPM8. Für Propofol konnte durch Fischer et al. 2010 eine
Aktivierung von TRPV3 gezeigt werden. Lidocain aktiviert TRPV1, TRPA1 und
interagiert auch mit TRPM8 (Leffler et al., unpublizierte Daten der AG Nau) [57].
Für Rocuronium konnten in zwei unterschiedlichen Konzentrationen keine
Interaktionen mit anderen Thermo-TRP-Kanälen gezeigt werden. Es zeigten
sich weder Hinweise auf Aktivierung, noch auf Blockade der entsprechenden
Kanäle.
48
5.3. Saurer pH-Wert der klinisch-verwandten Rocuronium-Präparationen
Aus Gründen der Stabilität haben klinisch-verwandte Rocuronium-
Präparationen einen pH-Wert zwischen 3,8 und 4,2. Lange Zeit wurde
angenommen, dass allein dieser saure pH-Wert die Schmerzhaftigkeit der
Rocuronium-Injektion verursacht. Für die Wahrnehmung von Protonen in
nozizeptiven Neuronen sind Mitglieder der ASICs sowie der Capsaicinrezeptor
TRPV1 verantwortlich. Neuere Untersuchungen zeigen bei TRPA1 eine
Spezies-Abhängigkeit, so scheint der humane TRPA1 ebenfalls durch Protonen
aktiviert zu werden [51]. TRPV1 zeichnet sich als Integrator unterschiedlicher
Stimuli aus, denn er ist nicht nur durch Capsaicin und Hitze aktivierbar, sondern
eben auch durch Protonen im sauren Milieu und viele andere Stoffe [32, 75].
Die Aktivierung von TRPV1 durch Protonen kann bei Raumtemperatur und
einem niedrigem pH < 6 direkt erfolgen. Neben den aktivierenden
Eigenschaften haben Protonen vor allem einen sensibilisierenden Einfluss auf
TRPV1, so sind Ströme durch Capsaicin oder Hitze erheblich größer im sauren
als im neutralen Milieu. Als mögliche Bindungsstellen wurden extrazelluläre
Protonen-Bindungsstellen an den Aminosäuren E600 und E648 identifiziert
[75]. Bei sehr niedrigem pH ist auch eine Aktivierung über die Capsaicin-
Bindungsstelle möglich [126]. In unserem Versuchsaufbau erfolgte nach der
Applikation von calciumfreier Extrazellularlösung mit einem pH-Wert von 6 die
kombinierte Applikation von pH 6 mit 10 µM bzw. 100 µM Rocuronium. In
diesem Setting zeigte sich unabhängig von der Rocuronium-Konzentration
keine Vergrößerung der Stromamplitude unter kombinierter Applikation von
Protonen und Rocuronium. Vielmehr konnte eine, wenn auch nicht signifikante,
Reduktion der Ströme unter Kombination der Agonisten gesehen werden. Dies
ist zum einen durch den Umstand erklärbar, dass Rocuronium im sauren Milieu
protoniert wird und dadurch zweifach positiv geladen ist. Wie bereits zuvor
diskutiert, ist die Permeation von Rocuronium über die Zellmembran
möglicherweise notwendig um TRPV1 über die Capsaicin-Bindungsstelle zu
aktivieren. Dies könnte durch die Verdoppelung der positiven Ladung deutlich
erschwert oder unmöglich sein. TRPV1 verfügt ebenso wie TRPA1 über eine
große Membranpore, durch die Substanzen wie z.B. das Membran-
impermeable Lokalanästhetikum QX-314 die Membran überwinden
können [128]. Eine mögliche Permeation durch die Pore von TRPV1 könnte
49
durch die Veränderung der Ladung ebenso erschwert oder unmöglich werden.
Ebenso muss aber auch bedacht werden, dass Rocuronium die Capsaicin-
induzierte Aktivierung von TRPV1 blockiert. Möglicherweise ist Rocuronium in
Gegenwart eines (potenteren) Agonisten nur ein Partialagonist, der sich bei
entsprechender Konzentration der potenteren Substanz als Antagonist verhält
und dadurch eine Abnahme der Stromamplitude bewirkt.
Insgesamt erscheint es jedoch unklar, ob ein pH-Wert von 4 einen Schmerzreiz
bei der Applikation hervorruft. So beschrieben Klement und Arndt 1991 in einer
kleinen Studie, dass erst ein pH-Wert < 3,5 Schmerzen bei intravenöser
Injektion hervorruft [88]. Auch bei den Mikrodialyse-Versuchen von Blunk hatten
die Probanden bei Infusion einer Testlösung mit einem pH-Wert von 3,8 keine
Schmerzen. Erst die Kombination mit Rocuronium oder Vecuronium
verursachte bei den Probanden einen Injektionsschmerz.
5.4. Andere Muskelrelaxanzien
Vecuronium wird klinisch meist in einer Konzentration von 1 mg/ml verwendet,
da es als Muskelrelaxans deutlich potenter als Rocuronium ist. Blunk und
Mitarbeiter konnten zeigen, dass Vecuronium in einer Konzentration von
10 mg/ml im humanen Schmerzmodell ebenso algogen wirkt wie Rocuronium.
Es erscheint von daher naheliegend, dass die verminderte Inzidenz von
Injektionsschmerzen bei der Injektion von Vecuronium der niedrigeren
Konzentration geschuldet ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass
100 µM Vecuronium ebenso dazu in der Lage ist, hTRPA1 zu aktivieren. Dies
stellt eine mögliche Erklärung für die von Blunk beobachteten nozizeptiven
Wirkungen von Vecuronium dar.
Durch Koppert und Kollegen wurde bereits 2001 gezeigt, dass Atracurium im
humanen Schmerzmodell durch dermale Mikrodialyse (pH 3,5; gleicher
Versuchsaufbau wie die Versuche zu Rocuronium und Vecuronium durch Blunk
et al.) keine Schmerzen, sondern einen Juckreiz verursacht, was im Einklang
mit der klinischen Beobachtung der Schmerzlosigkeit der Injektion steht [89].
Erstaunlicherweise zeigte sich durch Atracurium eine stabile Aktivierung von
hTRPA1 in Patch-Clamp-Experimenten im heterologen Expressionssystem.
Ebenso verursachten Pancuronium und Succinylcholin eine Aktivierung von
hTRPA1 in HEK293t-Zellen. Diese Befunde stehen im Widerspruch zur
50
klinischen Beobachtung, dass die Injektion aller drei genannten
Muskelrelaxanzien schmerzlos verläuft.
Limitierend ist an dieser Stelle allerdings, dass nur ein Screening auf die
Aktivierung von hTRPA1 mit jeweils einer Konzentration durchgeführt wurde
und keine Dosis-Wirkungskurven erstellt wurden. Ebenso fehlen zur genaueren
Charakterisierung Experimente mit TRPA1-Antagonisten. Inwieweit die
beobachtete Aktivierung von TRPA1 durch Pancuronium, Atracurium und
Succinylcholin somit eine Relevanz hat, kann momentan nicht beurteilt werden.
5.5. Klinische Relevanz
Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse stellen eine mögliche Erklärung für
den brennenden Injektionsschmerz von Rocuroniumpräparationen (pH 4) bei
der Einleitung einer Narkose dar. Außerdem könnte die von Blunk et al.
postulierte Aktivierung von C-Fasern durch Rocuronium bei einem pH-Wert von
7,4 im Haut-Nerven-Präparat der Maus durch eine Aktivierung von TRPA1 und
TRPV1 erklärt werden [17].
Trotzdem ist eine definitive kausale Zuordnung, welcher Anteil der
Rocuroniumpräparation welche Schmerzen bei Injektion verursacht nicht ohne
weiteres möglich. Die große Unbekannte stellt hierbei der pH-Wert dar. Blut und
Gewebe besitzen eine große Pufferkapazität und somit kann nicht davon
ausgegangen werden, dass der injizierte pH-Wert auch dem pH-Wert
entspricht, welcher an der nozizeptiven Endigung in der Venenwand ankommt.
Die Arbeiten von Klement und Blunk zeigen zwar, dass ein pH-Wert von 4 bzw.
3,8 im humanen Schmerzmodell keine Schmerzen verursacht, allerdings
können auch sie nicht quantifizieren, welcher pH-Wert letztendlich am
Nozizeptor ankommt.
So kann aus der Kombination dieser Arbeiten mit den hier gezeigten Daten
nicht die These generiert werden, dass der Injektionsschmerz nach
Rocuroniumapplikation ausschließlich auf Rocuronium zurückzuführen ist. Es
spricht jedoch vieles dafür, dass es in vivo zu einer Aktivierung von TRPA1,
TRPV1 und möglicherweise anderen nozizeptiven Transduktionsproteinen
durch Rocuronium und den sauren pH-Wert der Rocuroniumpräparation kommt.
Spannend bleibt ferner die Frage, in wie weit die Applikation von TRPA1- und
TRPV1-Agonisten das nozizeptive System während einer Anästhesie
51
modulieren und somit auf die Entstehung von akuten und chronischen
postoperativen Schmerzen Einfluss nehmen können.
So kann mit dieser Arbeit zur Liste von perioperativ-verabreichten TRP-Kanal-
Aktivatoren und -Modulatoren (Propofol, volatile Anästhetika, Lokalanästhetika)
die Gruppe der Muskelrelaxanzien hinzugefügt werden. Ob alle verwendeten
Medikamente möglicherweise die Entstehung von chronischen postoperativen
Schmerzen begünstigen bleibt Gegenstand weiterer klinischer Forschung.
52
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7. Abbildungsverzeichnis Abb.1:
Rocuronium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2019.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Rocuronium_structure.png, „Rocuronium structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Vecuronium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Vecuronium_structure.png,
„Vecuronium structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Pancuronium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pancuronium.svg, „Pancuronium
structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Atracurium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Atracurium.svg, „Atracurium structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Succinylcholin Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Suxamethonium-chloride-2D-
skeletal.svg, „Succinylcholin structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Abb. 2:
Reprinted from the publication: Neuron 2007: 55; Clifford J.Woolf, Qiufu Ma;
Nociceptors – Noxious Stimulus Detectors, Page No. 354, Figure 1B: The
Nociceptor, Copyright © 2007, with permission from Elsevier.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.07.016
Abb. 3:
Reprinted from the publication: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular
Basis of Disease 2007, Volume 1772; Jon D. Levine, Nicole Alessandri-Haber;
TRP channels: targets for the relief of pain, Page 997, Figure 1, Copyright ©
2007, with permission from Elsevier.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2007.01.008
Abb. 4:
Reprinted form the publication: Cell 2009, Volume139; Allan I. Basbaum, Diana
M. Bautista, Grégory Scherrer, David Julius; Cellular and Molecular
Mechanisms of Pain, Page 269, Figure 2: Anatomy of the Pain Pathway;
Copyright © 2009, with permission from Elsevier.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.09.028
69
Abb. 5:
Reprinted with permission from Springer Nature: Nature 445, Chemical biology:
Sticky spices; Michael J. Caterina; Copyright © Springer Nature 2007. DOI:
https://doi.org/10.1038/nature05565
Abb. 6:
Reprented from Elsevier books: Medical Physiology 2017; Edward G. Moczydlowski; Chapter 6, 141-172, Electrophysiology of the Cell Membrane, figure 6-14, Patch-clamp methods; Copyright © 2017, with permission from Elsevier.
Abb. 7-14:
Eigenproduktion
70
8. Abkürzungsverzeichnis 4αPDD 4α-Phorbol 12,13-didecanoate
2-APB 2-Aminoethoxydiphenyl borate
AITC 3-Isothyocyanato-1-propen
AP-18 4-(4-Chlorophenyl)-3-methyl-3-buten-2-one oxime
ARD Ankyrin-Repeat-Domäne
ASICs acid sensing ion channels
ATP Adenositriphospaht
BCTC 4-(3-Chloro-2-pyridinyl)-N-[4-(1,1-dimethylethyl)phenyl]-1-
piperazin-carboxamid
cDNA complementary deoxyribonucleic acid
CD8-pih3m Reporter Antigen, cluster of differentiation 8
CGRP calcitonin gene-related peptide
c-Ret Rezeptor-Tyrosinkinase
CO2 Kohlendioxid
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DRG dorsal root ganglion (Spinalganglion)
EC50 mittlere effektive Konzentration
ED50 mittlere effektive Dosis
ED95 effektive Dosis für gewünschte Wirkung bei 95%
der Patienten
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure
ENaC/DEG epithelialer Natriumkanal
FBS fetal bovin serum
GABA γ-Aminobuttersäure
GDNF glia-derived neurotrophic factor
HC-030031 2-(1,3-Dimethyl-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-7H-purin-7-yl)-
N-(4-isopropylphenyl)acetamid, selektiver TRPA1-
Antagonist
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HEK293t-Zellen human embryonic kidney 293t-Zellen
H2O2 Wasserstoffperoxid
IC50 mittlere inhibitorische Konzentration
71
KCl Kaliumchlorid
KCNK2/4 Kalium-Kanal Subfamilie K, Mitglied 2/4
KOH Kaliumhydroxid
Kv1 Spannungsabhängiger Kalium-A-Kanal
MEC-2 Gen der Untereinheit 2 epithelialer Na+-Kanäle
MEC-4/10 Gene der Untereinheiten 4/10 epithelialer N+-Kanäle
MgCl2 Magnesiumchlorid
NaCl Natriumchlorid
NGF nerve growth factor
O2 Sauerstoff
PAG Periaquäduktales Grau
PKC Proteinkinase C
PLC Phospholipase C
pTRE Plasmid Vektor
RSI rapid sequence induction
TOF Train-of-Four
TMA Tetramethylammonium
TM 5/6 Transmembranregionen fünf und sechs
TRAAK Synonym für KCNK4
TREK-1 Synonym für KCNK2
TrkA tropomyosin receptor kinase A
TRP transient receptor potential
T½β Eliminationshalbwertszeit
PORC postoperative Restkurarisierung
WDR wide dynamic range Neurone