Naunyn-Sehmiedebergs Arch. Pharmak. u. exp. Path. 259, 307--313 (1968)

Behandlung yon Substanz P-Pr~iparaten mit Aluminiumoxid

F. L ~ B E O K und K. STA~K~

Pharmakologisches Institut der Universit/£t Tfibingen

Eingegangen am 30. November 1967

Treatment o/Substance P Preparations with Aluminium Oxide Summary. 1. By shaking solutions of substance P-extracts from brain in 70 per

cent methanol with aluminium oxide, the adsorbable fraction Fb (according to ZETLV,~) is transformed into the unadsorbable fraction Fa. A large proportion of the concomitant peptides is adsorbed.

2. By choosing optimal concentrations, a substance P-preparation (fraction ~a) containing 175 u/rag dried extract (= 3200 u/rag protein) has been obtained in a relatively simple way in 80 per cent yield.

Key-Words: Substance P -- Brain Extracts.

Zusammen/assung. 1. Durch Sehiitteln yon Substanz P-haltigen Extrakten aus Gehirn mit Aluminiumoxid in 70°/o methanolischer LSsung wird die adsorbierbare Fraktion Fb (naeh Z]~TL]~R) in die nicht adsorbierbare Fraktion Fa umgewandelt. Dabei wird ein groBer Tell yon Begleit-Peptiden adsorbiert.

2. Bei Wahl optimaler Konzentrationen wurde damit auf verhgltnismgBig einfache Weise ein Substanz P-Priiparat (Fraktion Fa) mit etwa 175 E/rag Troeken- extrakt (= 3200 E/rag Protein) in 80°/0iger Ausbeute gewormem

Schli)zselw6rter: Substanz P -- Gehimextrakte.

Al, lmbdumoxidsiiulen werden seit PEICNOW (1953) zur Anreicherung yon Substanz P (ira folgenden: , ,SP") verwendet. Z~TLv~R (1961) land, dab ein Teil der Aktivit/~t yon SP-Pr/ iparaten yon anionotropem Aluminiumoxid aus 70°/0igem Methanol nicht adsorbiert wird (Frakt ion , ,Fa") ; die naehfolgende Elut ion mit Wasser ergibt eine Frak t ion , ,Fb", mi t n / i 0 - N a O H eine dri t te , ,Fc". Bei mehrfacher Rechromatographie finden sich im Elua~ schlieBlich nur mehr die Frakt ionen Fa und Fc, woraus man auf eine , ,Spal tung" yon Fb schliegen kann (Z~TL~I~ U. BALDAVF, 1967). P ~ C O W erzielte durch Eiut ion mi t ~bsteigenden Konzent ra t ionen yon Methanol aus einem Pr/~parat yon 5 E /mg bei 87,5°/0iger Ausbeute eine Anreieherung au f 172 E/rag; bei Z]~TL~,~ U. ]3ALDAUF (1967) lagen die Aktivit / i ten, entsprechend Fa bzw. Fb bzw. Fc, bei 12 bzw. 20 bzw. 33 E/rag. I n Anlehnung an frfihere Verfahren (Literatur siehe LE1V:[BECK U. Z:ETLER, 1962) matersuchten wir verschiedene Var ianten der Behandlung yon SP-Pr/~paraten mi t Aluminiumoxid, um ein nu t die Frak t ion Fa enthaltendes SP-Pr/~parat mi t m6glichst hoher Ausbeute und Aktivit/~t zu erhalten.

22 Naunyn-Sehmiedebergs Arch. Pharmak. exp. Path., Bd. 259

308 F. LEMBECK und K. STARKE:

Rinderstammhirn: salzsaure Extraktion

und Hitzedenaturierung

Ammonsulfat-F~lhmg

1 Eisessig-Extraktion

~ther-Fifllung

Me~hanol-F~llung

I ¥

2 × Schfitteln in 700/0 Methanol mit A1208

t 2 × Sehtitteln in Wasser

mit A120 a

1 Sediment

Rfiekstand

~berstand

Rfiekstand

~berstand

Rficks~and

~berst~nde: Fa 1 und Fa 2

~berstgnde: Fb 1 und Fb 2

Abb. 1. Schema des Reinigungsverfahrens ffir Substanz P

M e t h o d i k

1. Ammoniumsul]at-Eisessig-~ther-Ver]ahren (Abb. 1). Rinderstammhirn wurde innerhalb yon 3 Std nach der Schlachtung grob zerkleinert und in der vierfachen Menge kochender n/10-HC1 mit einem Ultra-Turrax homogenisiert. Die Menge wurde zum Sieden erhitzt, nach dem Abkiihlen mit NaHCOa auf pH 5,5--6,0 eingestellt und zentrifugiert. Der filtrierte ~bers~and wurde in vacuo auf 0,2 des Ausgangs- volumens eingeengt und mit dem 2,3fachen Volumen ges~ttigter (20 ° C) Ammon- sulfatl6sung versetzt. Nach etwa 12 stfindigem Stehen bei 4 ° C wurde der SP-haltige Niederschlag abzentrifugiert und getrocknet.

Je 3 g dieses Pr~cipitats wurden dreimM mit 5 ml 99°/0iger Essigs~ure durch halbstiindiges Schiitteln ex~rahier~ und zentrifugiert. Der vereinig~e Eisessigextrakt wurde mit dem fiinffachen Volumen peroxidfreiem Ather versetz~. Nach 12s~iin- digem Stehen bei 4 ° C wurde der entstandene Niederschlag abgetrennt und mehr- reals mit ~_ther gewaschen (vgl. STARKE, 1964).

Behandlung yon Substanz P-Pr~paraten mit Aluminiumoxid 309

2. Methanol-Fdllung. Der nach 1) gewonnene Extrakt wurde in Portionen zu 1 g in 30 ml Wasser gel5st und mit Methanol auf 100 ml aufgefiillt. Der Niederschlag wurde naeh 1 Std abzentrifugiert und zweimM mit wenig 70°/0igem Methanol ge- wasehen. Die vereinigten ~berst~nde wurden in vaeuo zur Trockne gebracht.

3. Schi~tteln mit Aluminiumoxid. ,,Aluminiumoxid aktiv sauer Merck" wurde 15 rain mit 15 ml Wasser/100 g geschiittelt und anschlieBend mit 70°/oigem Me- thanol (v/v) gewaschen. Mit diesem Aluminiumoxid wurden drei Versuehsreihen durchgefiihrt:

a) Zu je 1 g A120 a wurden lVIengen yon 10, 20, 30, 50, 100 mg des SP-Extraktes nach 2), gel6st in 5 ml 70°/0igem Methanol, zugesetzt und 2 Std gesehiittelt. Dann wurde der ~berstand (,,Fa-l") abzentrifugiert und das Sediment noehmMs mit der gleiehen Menge 70°/oigem Methanol 2 Std geschiittelt. Naeh Abtrennen dieses ~berstandes (,,Fa-2") wurde nacheinander zweimal je 2 Std mit Wasser geschiittelg (,,Fb-l" und ,,Fb-2"). Alle vier Fraktionen wurden in vacuo zur Troekne gebraeht.

b) Die unter a) geschilderten Versuche wurden unter Verwendung yon ?% 3 g Al203 wiederholt.

c) Mit den so ermittelten giinstigen 1gengenverhgltnissen wurden die Versuehe bei 4, 22 und 35 ° C wiederholt.

4. Siiulenchromatographie. An Aluminiumoxid, wie oben (vgl. 3.), vorbehandelt. Einzelheiten bei ZETL]~ (1961).

5. SP-Bestimmung. Am isolierten Meerschweinchen-Ileum unter Zusatz yon Atropin, Mepyramin nnd Methysergid (Moth. vgl. LElYIBECK ll . ZETL]~I%, 1962).

6. Protein-Bestimmung. Mit dem Folin-Reagens (Low~¥ et M., 1951). 7. Pa2ier-Elektrophorese. Auf Filterpapier Machery und Nagel 2214a in Aeetat-

puffer (pH4,95, Ionenstiirke 0,05) wurde 0,5--1 mg SP-Extrak% 6 em breit auf- getragen. Laufzeit 6 Std bei 210 V, Zimmertemperatur.

8. SP-Standard. Ein Pr£parat der Fa. Sanabo aus l%inderdarm mit 13,2 E/rag.

Ergebnisse I n 7 Ans/~tzen wurden Por t ionen yon 540--1045 g S tammhirn ver-

arbeitet. Die Ex t r ak t e nach Methodik 1) enthielten 33- -104 E SP/mg Trockensubstanz, Die Ausbeute, bezogen auf das Fi l t ra t nach der II i tze- Denatur ierung, betrug 71 (54--90)0/0 . Bei L6sung in 70°/0igem Methanol gem~g Methodik 2) bildete sich ein Niederschlag, welcher keine SP enthielt. Die Ausbeute, bezogen auf den E x t r a k t nach 1), betrug in 13 Ans/~tzen durchschnit t l ich 94 (69--109)°/0 . I n drei orientierenclen Versuchen mit einer Methanolkonzentra t ion yon 80°/o (v/v) fanden wir in der LSsung 62, 66 und 71°/o der eingesetzten Aktivit/~t und im Nieder- schlag bis zu 1 t E/rag SP.

Die Versuchsreihen laut l~/Iethodik 3a) und 3b) wurden mit einem Pr/ tparat von 64,5 E/rag Trockensubstanz (143E/rag Protein) durch- gef/ihrt. Die Aktivit~ttsausbeuten in den Frakt ionen Fa-1 und Fb-1 sind in Abb. 2 dargestellt. Die nicht eingezeiehneten Ausbeuten in Fa-2 und Fb-2 lagen wesentlich niedriger als in den ersten Frakt ionen jedes L6sungsmittels. Bei den Ans/~tzen mi t 3 g (start 1 g) Aluminium- oxid erschienen jewefls hShere Anteile in Fa-1 als bei den Ans~tzen mi t 1 g Alumininmoxid. J e grSBer das Mengenverh/~ltnis , ,Aluminiumoxid: E x t r a k t " , desto mehr Akt iv i tg t fanden wit in ~ e t h a n o l gel6st, je

22*

310 ~. LEMBECK und K. STA~Kr :

kleiner, desto mehr in den w/~l~rigen Fraktionen. Die Gesamtausbeute (Fa-1 + Fa-2 A- Fb-1 -F Fb-2) war in den Ans/~tzen mit 3 g (Methodik 3b) Aluminiumoxid hSher (urn 95°/o) als in den Ans/~tzen mit 1 g (Methodik 3a) Aluminiumoxid (nur einmal hSher als 60°/o).

%

80

&

6O

o

II 8 j °

/x 2 0 - I

_ o

I I I I I 129 258 387 774 1290 E/rot 2 4 6 10 20 mg/ml

Abb.2. 5 ml der 700/0 methanolischen ExtraktlSsung der angegebenen Konzen- trationen (Abszisse: in ~flligr~mm bzw. E/ml) wurden mit 1 g (% *) bzw. 3 g (~, A) AI~O 8 geschfit~elt. Als Ordinate wurden die Ausbeuten des ersten methanolischen Extraktes (Fa-l : . , A) und des ersten w~$rigen Extraktes (Fb-l: o, A) in Prozent

der eingesetzten Aktivit~t angegeben (Werte aus zwei Ans~tzen)

Diese Versuche ergaben, dab mi t Mengen yon 6,7--10 mg des SP- Pr~par~tes (entsprechend 430--645E) pro Gramm Aluminiumoxid Ausbeuten yon etwa 800/o in den beiden meth~nolischen Fraktionen erzielt warden. Die SP-Konzentration stieg dabei yon 64,5 E/rag auf 160--190 E/mg Trockenextrakt (Tabelle). Man erkennt, da~ die Aktivit~t pro Milligramm Trockensubstanz nur auf das 2,7/ache stieg, pro MiUi. gramm Protein jedoch auf das 22/ache.

Bei konstanten Mengenverh/~ltnissen prfiften wir in je 6 Ans&tzen bei 4, 22 und 35 ° C den Einflul~ der Temperatur auf die Adsorption. Ausbeuten in den Fraktionen (Fa-1 + Fa-2): bei 4°C 42--540/0, bei 22 ° C 70--79°/o, bei 35 ° C 55--940/0; in den Fraktionen (Fb-1 + Fb-2) bei 4 ° C 10--15°/o, bei 22 ° C 14--15°/o, bei 35 ° C 10--13°/o . Angesichts der weiten Schwankungen innerhalb der einzelnen Gruppen ist eine Zu-

Behandlung yon Substanz P-Pr~paraten mit Alumimumoxid 311

Tabelle. Behandlung eines Substanz P-PrSparates (6~,5 E/mg Trockenmasse bzw. 143 E/mg Protein) mit AlaO~. Bei Versuchen mit 240 mg Pr(tparat (*) wurde in

seehs Portionen zu dO mg gearbeitet

Extrakt- Konzen- Extrakt/ menge in mg tration der Al203 in und E S P Extrakt- mg/g und

16sung in E/g mg/ml und Elml

SP-Ausbeute in E Gehalt in E/rag und Prozent der Extrakt und eingesetzten E/rag Protein d lctivitiit

Fa-lq-2 Fb-lq-2 Fa-l-~2 Fb- l+2

20 4 6,7 1290 258 430

20 4 6,7 1290 258 430

30 6 10 1935 387 645

30 6 10 1935 387 645

240* 4 8 15480 258 516

240* 4 8 15480 258 516

1092 207 176 34 85 16 3040 116

992 207 162 34 77 16 2610 116

1620 366 180 56 84 19 3680 123

1620 413 186 64 84 21 3520 181

13775 2045 180 44 89 13 2300 80

11600 3220 163 58 75 31 4000 111

Nittelwerte 175 48 82 18 3192 121

n~hme der Ausbeute in den methanolischen Fr~ktionen mit der Tem- peratur mSglich, aber nieht deutlieh.

Die Identit / i t der Fraktionen (Fa-1 ~- Fa-2) mit Zetlers , ,Fa" wurde s~ulenchromatographiseh und papierelektrophoretiseh best~tigt. In drei Versuehen wurden je 10rag ( = 1380 E SP) eines vereinigten Extraktes (Fa-1 ~- Fa-2) auf Aluminiumoxids/~ulen (8 g) aufgetragen. Mit 70°/oigem ~e thano l wurden im Durehsehnitt 1086 E ( ~ 80°/o) e]uiert, mi t Wasser ~nsehlieBend durehschnittlieh 51 E (N 4O/o). S~ulen- chromatographic yon entsprechenden Ext rak ten vor der Schiittelung mit A120 ~ lieferte mehr als 1/3 der Gesamtausbeute Ms Fb, wertiger als 2/3 als Fa.

Papierelektrophoretisch ergab ein Pr/~loarat , bestehend aus Fa-1 -k Fa-2, nur eine aktive Zone, yore Auftragspunkt 4 0 - - 6 0 m m in kathocliseher Richtung. Diese Stelle wurde mi t Bromphenolblau nicht angef~trbt.

Diskussion Die ersten Schritte fiber Hitze-Denaturierung, Ammonsulfat-Fi~llung,

Eisessig-~ther-F£11ung wurden in der herkSmmliehen Weise (Lit. siehe LE~IB]~CK U. ZETLEt~, 1962) durchgeffihr~. Das anschlieBende Sehiitteln mit Aluminiumoxid fiihrte unter den ermittelten optimalen Verh/ilt-

3 1 2 F. LE]KBECK und K. STARKE:

nissen in durchschnittlich 80°]0iger Ausbeute zu einem Pr/~parat, welches im ehromatographischen Verhalten an Aluminiumoxids/~ulen und elektrophoretisch Zetlers Fraktion Fa entspraeh.

Bei den durchgefiihrten Varianten der Aluminiumoxid-Behandlung zeigte sieh:

1. Je grSBer das Mengenverh/~ltnis , ,Alumininmoxid:Extrakt" war, um so hSher war die Ausbeute in den methanolisehen Fraktionen, d. h. in Fa. War diese Relation klein, dann wurde offenbar wenig Ausgangs- substanz Fb ,,gespa]ten"; nachfolgend war mit Wasser mehr Fb zu eluieren.

2. Bei g]eiehem Verh/~ltnis , ,Alumininmoxid:Extrakt" war mit hSherer Aluminiumoxidkonzentration (3 g gegenfiber i g Aluminium- oxid/5 ml LSsung) bzw. mit h6herer Extraktkonzentrat ion sowohl die Gesam~ausbeute als aueh die Ausbeute in den methanolisehen Fraktionen (Fa-I ~- Fa-2) h6her.

3. Der EinfluI3 der Temper~tur auf die Ver~eflung der Ak t iv i t~ war nicht deu~lieh.

Bis auf die hShere Gesamtausbeute bei gr5Berer Aluminiumoxid- menge lassen sich diese Beobachtungen durch eine Aluminiumoxid- abh~ngige ,,Umwandlung" des Fb-Antefles der SP zugunsten cler Fa- Fraktion deuten. ~be r die Natur dieser Reaktion kann allerdings niches Bindendes gesag~ werden (Zv, TLE~ u. B~DXUF, 1967). Es erseheint aher vertretbar, ffir biologisehe Versuehe und weitere Anreicherungssehritte nunmehr Fa als Standard zu benutzen, da Fb einer Umwandlung zu Fa unterliegen kann. Ferner zeigen manche Gewebe nur Fa (Retina; It~LD et al., 1966), manehe Fb (Substantia nigra; Hv, IZMA~N u. L~MBV, CK, 1966), andere beide Fraktionen (ZETLV, R, 1961). Ferner ergab die Lipid- Extr~ktionsmethode (I-I~IZMAN~ et al., 1966) nut Fa.

Beim Sehiitteln mi~ A]uminiumoxid bleibt ein grol3er Teil der Begleitproteine und damit der Verunreinigungen adsorbiert. Die SP- Konzentratiou, bezogen auf den mit dem Folin-Reagens gemessenen Proteingehalt, steigt auf das 22 fache. Es ist darum bei SP-Pr~parationen wesentlich, neben den Einheiten l~ro Troclcengewicht auch die Einheiten 1oro Protelnmenge anzugeben.

Die Arbei~ wurde mi~ Ilnters~iitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft durchgefiihr~.

Frau G. Flzise~ danken wir fiir die sorgf~ltige Mi~arbeit.

L i t e r a t u r

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Prof. Dr. F. LE~[BECK Pharmakologisches Institut 7400 Tiibingen, Wilhelmstr. 56