234 J. SC~OR~LLER und H. TXNZLE~:

sucht, wobei w~ihrend des Abhi~ngens bei + 2 ° C bakterielle Einflfisse nach M6glich- keit eingeschriinkt wurden.

Ffir die Deutung der mit der Reffung verbundenen t tydratat ionsph~nomene wurden die Begrfffe ,,Net.toladungs-Effekt" und , ,Stereo-Effekt" eingefiihrt und erlitutert.

Innerhalb der ersten 24 Std nach dem Schlachten n immt die t tydra ta t ion des Gewebes nur auf der basisehen, nieht aber auf der saueren Seite des Muskel-I. P. ab. Die Abnahme ist um so st£rker, je h6her der pH-Wert des Muskels ist. Dieser Befund wird auf Grund der elektrostatischen Theorie der Wasserbindung damit erkl£rt, dab innerhalb der ersten Std nach dem Tod des Tieres mehrwertige Metallionen des Muskels bei pH _-> 6 in das MuskeleiweiB eingebaut werden und so eine Verdichtung und Dehydratat ion des Gewebes bedingen.

In dem Zeitxanm yon 1--7 Tagen naeh dem Sehlaehten sind sowohl auf der basischen Ms auch auf der saueren Seite des Muskel-I. P. tiydratationsi~nderungen festzustellen. Die Analyse dieser p.-Hyclratat ionskurven ffihrt zu der Annahme, dab w&hrend der Fleisehreifung die Anzahl der verfiigbaren Carboxylgruppen und in geringerem Umfange aueh der basischen Grnppen des MuskeleiweiBes zunimmt. Als Ursaehe hierffir werden proteolytische Vorg/~nge diskutiert.

Eine inerk]iehe Verschiebung des I. P. des Muskels konnte weder beim Eintreten des Rigor morris noch bei l&ngerem Abhi~ngen des Fleisches beobachtet werden. Dagegen war eine Beeinflussung des I. P. durch die HShe des Fremdwasserzusatzes festzustellen.

Beitr~ige zur Biochemie der K~isereifung

X X I V . Mit te i lung

Oer enzymatische Argininabbau in reifendem fiauermilchkiise

Von

J. fiCHOa~LLER nnd H. T2[NZLER

Mitteitung aus dem Institut liar Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechnologie der Teehnischen Universi~t Berlin*

Mi~ 4 Text~bbildtmgen

(Eingegangen am 21. Juni 1958)

Der Argininabbau in reifendem K~se besitzt vor allem deshMb Interesse, weil die genannte Aminosiiure in freier Form einen yon versehiedenen Autoren Ms widerlich, unangenehm oder bitters/iB bezeichneten Gesehmack aufweist, der zweifellos bei anomal reffendem K£se an der abweiehenden Geschmaeksbildung beteiligt ist. I n einer friiheren Arbeit ha t ten wir I eingehende Bilanzen des Arginins ftir reifenden Sauermi]chk~se aufgestellt und in ~bereinst immung mit vielen Angaben der Literatur gefunden, dab Arginin bei normaler Reifung zwar freigesetzt wird, jedoeh schnell und praktisch quanti ta t iv durch enzymatische Umsetzungen ans dem K~semilieu ver- sehwindet.

* Die vorliegende Arbeit wurde durch eine Beihflfe yon Freunden der Technischen Universit~t Berlin gefOrder$. Hierf'tir sei auch an dieser Stelle verbindlich gedankb.

1 SC]~OR~IiJLLER, J., H. LIESE U. H. WINTER: Diese Z. 98, 347 (1954).

Beitr~ge zur Biochemie der Kasereifung. XXIV 235

Un te r eingehender Wfirdigung der Li te ra tur ha t t en wir in unseren Unte r suchungen die fe rmenta t iven Abbau- u n d UmbaumSgl ichkei ten des Arginins erSrtert, ohne jedoch d e n enzymat ischen l~eakt ionsmechanismus n~her zu prfifen. Von den dort in Erw~gung gezogenen Fe rmen t sys temen kann , wie im folgenden gezeigt wird, die Mitwirkung der klassischen Arginase sowie der yon verschiedenen Autoren I beschrie- benen Heteroarginase, die vor allem auf D-Arginin eingestellt ist, ausgeschlossen werden. Desgleichen spielt die Decarboxylierung des Arginins zu Agmat in keine t~olle: in einer vorhergehenden Arbei t 2 ha t t en wir gezeigt, dab Magermilchk~se keine Arginindecarboxylaseakt iv i tg t aufweist. Auch an Umamin ie rungen ist die in Rede stehende Aminos~ure bier nach unseren Befunden 3 n icht beteiligt. Wirkungs- m5glichkeiten im R a h m e n des enzymat ischen Argin inabbaues durch mikrobielle Aminosi~ureoxydasen, durch die yon WALKE~ 19524 beschriebene Argininsuccinase, durch die 1940 entdeckte Transamidinase 5 oder durch ein 1955 aufgefundenes Fer- men t 6, das Argin in zu Guan id inobu ty ramid oxydiert, sind n icht auszuschlieBen. I n der vorl iegenden Arbei t konzent r ie r ten wir unser Interesse auf einen Abbauweg, der nach dem Schema: Argin in -~ Citrull in d- HI-Is -+ Orni th in + N H s d- C02 verl~uft, bei dem also lcein Harns tof f auf t r i t t u n d dami t die Betefligung der Urease n icht notwendig ist.

1940 land HILLS 7, dal] Streptokokkenstgmme Arginin in 2 Mole ~ t t 8, 1 Mol C02 und 1 Mol Ornithin hydrolysieren. Nr~EN u. Mitarb. 8 best~tigten diese Befunde. HIT.LS nannte das hierfiir verantwortliche Ferment Arginindihydrolase. Citrnllin als Zwisehenprodukt konnte nicht gefal~t werden. Bereits 1931 hatte jedoch ACKE~A~ 9 bei Bebriitung yon Arginin mit Fgulnis- bakteriemMischkultnren Citrullin erhalten, H o ~ 1° kam zu denselben Ergebnissen ffir (arginase- freie) Kulturen yon Bacillus pyosyaneus und Bacillus coll. ttORN g~b diesem Fermenttypus den N~men Arginindesimiduse. AXA~ATS~ und SEKn~E n fanden beim Abbau yon Arginin mit Strepto- coccus/aecalis zu Ornithin gleichfalls Citrullin als Zwisehenstufe. Die Autoren schlugen fiir das die Spaltung des Arginins zu Citrullin und ~Hs katalysierende Ferment den Namen Metaarginase statt der ihrer Meinung nach irrefiihrenden Bezeiehnung Arginindesimid~se vor. Fiir die weitere Spaltung des Citrullins zu Ornithin, NH 8 und CO2 maehten sie ein zweites Ferment, die Citrullinase verantwortlich. Sie und andere Autoren ~ bewiesen, da~ HILLS Arginindehydrolase ein Sammel- begriff ffir die Enzyme Arginindesimidase (Metaarginase) und Citrullinase ist. Zahlreiche Mit- teilungen der Literatur an den verschiedenartigsten Mikroorganismen weisen in dieselbe Riehtung, so bei Clostridium wdchii ~, Salmonella enteridis ~, Clostridium per/ringens ~, Pseudomonas ovalis ~,

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236 J. SC~O~M~L~E~ und H. TXNZLE~:

verschiedenen Streptokokken 1 und B~ckerhefe 2. SLADE ~ best~tigte die yon AKA~ATSU gefundenen Ergebnisse und sehlug fiir Citrullinase den Namen Citrullinureidase vor. KOI%ZENOVSK¥ und W E ~ t studierten den fiber Citrullin zu Ornithin ffihrenden Argininabbau bei Streptococcus lactis, aueh bei virulenten Stammen yon Pasteurella tularensis wurde Citrullinaseaktivit~t nach- gewiesen ~. Je nach der Mikroorganismenart liegt das pn-Optimum dieser Fermente bei 5,6--7,0, unterseheidet sich damit also wesentlieh yon dem der klassischen Arginase. Arginindesimidase wirkt spezifisch auf L-Arginin, lediglich Gu~nidylessigs~ure wird in geringem Ausma~ gespalten. Das l~ermen~ ist best~ndig gegen langdauernde Dialyse und seheint kein Cofcrment zu ben6tigen. Cu++, Mg÷+, Hg++ und Zn++ hemmen stark, weniger u. a. Arsenit und Hydroxylamin, Citrullinase ist spezifisch auf L-Citrullin eingestellt, inaktiv gegenfiber ~-Citrullin und I-Iarnstoff.

W i r haben, wie erwahnt , dem hier e ingehend e rSr te r ten Reak t ionsmechan i smus , der insbesondere dureh das Auf t r e t en yon Citrul l in und Orni th in gekennzeichnet ist, unsere A u f m e r k s a m k e i t gewidmet . Die Aufk l~rung des Abbauweges war vor al lem da du rch ersehwert , daI~ e inmal die be iden hier ans tehenden F e r m e n t t y p e n neben- e inander wi rksam sind, zum anderen eine I~eihe der A rg in in spa l t p roduk t e wei teren f e rmen ta t iven A b b a u m e c h a n i s m e n unter l iegt . I m Z usa mme nha ng m i t den genann- t en F rages te l lungen erschien es uns zunachs t notwendig , aueh der Anwesenhe i t yon Urease und H a r n s t o f f in re i fendem K~se naehzugehen.

Eigene Untersuchungen 1. Ureaseaktivitgt des Kgses

I n g i n s i e h t auf die wei te Verb re i tung der Urease in Mikroorganismen erscheint es du rchaus wahrseheinl ich, dab auch in re i fendem Kase Urease mikrobie l le r H e r k u n f t zu l i n d e n ist .

Wir haben mit Harnstoff Ms Substrat nach dem ausgezeichneten, yon COl~WAY ~ angegebenen Verfahren (als Diffusionszellen dienten Porzellanschalen der Fa. Haldenw~nger, Berlin) die

%

~4 5 1o 15 zo T~go f5

l~e/Pungsal/er Abb. 1. Ureaseaktivi~t im Rei]ungsverlaut

NI-Is-Abspaltung verfolgt. 0,1--0,5 mg zugesetzterHarn- stoff konnten zu 100 3= 3% wiedergefunden werden. Bebrfitet wurden K~sesuspensionen bei 37 ° C und Pit 6,9 (Phosphatpuffer) fiber 4 Std.

Abb. 1 zeigt den Ver lauf der U r e a s e a k t i v i t a t im Gesamtk~se. Der friseh hergeste l l te K~se u n d K e r n yon bis zu 4 Tage a l ten K a s e p r o b e n waren ureasefrei , ers t naeh 7 Tagen war im K e r n sehr geringe (1,2%) Harns to f f spa l tung festzu- stellen. I n sgesamt k a n n die Ureaseak t i v i t~ t des Kases als sehr schwach bezeichnet werden. Wei- tere Versuche zeigten, dab yon der gesamten

E n z y m a k t i v i t g t e twa 30% durch Phospha tpu f f e r PH 6,9 ex t r ah i e r t und auch in A c e t o n t r o c k e n p r ~ p a r a t e n e r f ag t werden kann. E ine ge t r enn t gezfichtete u n d unter - suehte R o t s e h m i e r e k u l t u r (Bacterium linens) war ureasefrei , sie k a n n also n ieh t als Quelle de r E n z y m a k t i v i t g t des Kgses angesehen werden.

2. Harnsto]/gehalt des Kgses Die oben erw£hnte Conway-lKethode wurde aueh zur I - Ia rns tof fbes t immung

b e n u t z t ; die Kasesuspens ion wurde m i t Urease (General Bioehemieals Inc. , Labo- r a t o r y Pa rk , Chagrin Fal ls , Ohio) bei pn 6,9 bebrf i te t .

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Beitr~ge zur Bioehemie der K/~sereifung. XXIV 237

Vorversuche zeigten, dab Vollmilch 22,9 mg/100 ml und handelsfiblicher Quark 5,6mg/100g Harnstoff enthielten. Stark gereifter Harzer K~se verschiedener Herkunft war in allen Fallen harnstoffffei. Harnstoffbestimmungen im Verlauf der Reifung lieferten die in Tab. 1 mitgeteilten Ergebnisse.

Zur Bebriitung gelangten 2 ml einer 20°/oigen K/~sesuspension (p. 6,9; 0,5 mlUreasel6sung, 30 min) ; Blindwerte gegen hitzeinaktivierte Ureaseauf- schwemmungen. Aus den Ergebnissen geht hervor, dab die Hauptmenge des in der Milch enthaltenen Harnstoffes nieht in den Quark tibergeht und dab fdr den Abbau der geringen verbleibenden ttarn- stoffmengen die mikrobiell gebildete, yon aul~en nach innen vordringende Urease ausreicht, um schon nach kurzer Reifungsdauer (etwa 5 Tage)harnstoff- freie Produkte zu liefern.

3. Er/assung der lclassischen Arginase in rei/endem K5se

Zur Kl~rung der Frage, ob in reifendem K~se Arginase vorkommt, wurde die Bestim-

TabeUe 1. Harnsto]]gehalt im Verlau~ der Kgserei]ung

Harnstoff 1 Alter K/iseanteil

rag/100 g

frischer Quark

2 Tage

4 Tage

7 Tage

9 Tage

Gesamt l~inde Kern Gesamt Rinde Kern Gesamt l~inde Kern Gesamt Gesamt

4,7 1,9 5,0 3,1 0 2,2 0 0 0,8 0 0

mung des etwa gebfldeten Harnstoffs als spezifischen Spaltproduktes durchgefiihrt. Da Urease unter Umst~nden arginoly~isehe Aktivit~t entfalten kann~, wurde auf Harnstoff

mit Hilfe der yon VAN SLX~ und AgcmsALI) 8 angegebenen Farbreaktion mit c~-Isonitroso- propiophenon gepriift. Das yon den Autoren angegebene Verfahren wurde unver/~ndert fiber- nommen (Eiehkurve an Harnstoff-StandardlSsungen, Messung im ELKO II gegen Filter S 53, Bebriitung 20%iger K/~sesuspensionen mit ArgininlSsungen bei p~ 9,5).

In zahlreichen Suspensionen yon K/~sen verschiedener Herkunft und verschiedenen Reifungsalters fiel die Reaktion auf arginolytisch gebildeten Harnstoff negativ aus. Um die schwache, bei p~ 9,5 und den kurzen Bebrfitungszeiten (20--40 rain) kaum wirkende Ureaseaktiviti~t mit Sicherheit auszuschlieBen, wurden Bebriitungs- ans~tze mit 1 Tropfen 0,01 m-KupferchloridiSsung versetzt. Diese Zugabe hemmte naeh Vorversuchen Urease vSllig, beeinfluBte jedoch ein aus ttundeleber gewonnenes Arginasepraparat kaum. Auch in diesem Fall konnte kein Harnstoff gefunden werden. SchlieBlich haben wir -- mit negativem Erfotg -- versucht, etwa vorhandene geringe Arginasemengen durch Co ++ und durch Fe(II)-S04 ~- Cystein zu aktivieren. Desgleichen gelang es nieht, durch ZellaufsehluB mit Glaspulver arginaseaktive Glycerinextrakte zu erhalten, so dab auch keine Desmofermentfraktion vorliegt.

Die bisher besehriebenen Versuche schlieBen das Vorkommen yon Arginase im Sauermilchk/~se aus. Bei sehr langer Bebrfitungsdauer zeigte sich jedoch eine sehwaehe Rotf/~rbung, deren Auftreten yon uns dem Citrullin zugeschrieben wurde. Diese Verbindung reagiert nach ARCHIBALD 4 mit dem Reagens gleichfalls positiv, wenn auch etwa 20real schwacher.

Zur Klarung dieser Frage haben wir derartige positive Ans/~tze nach Bebrfitung mit aktiver und hitzeinaktivierter UreaselSsung gepriift: beide Versuche lieferten die gleichen schwach positiven Farbreaktionen; damit ist Harnstoff als Ursache der Farbung auszuschlieBen. Die erste Bestatigung dafiir, dab Citrullin hier die farb-

1 Bereehnet auf asehefreie Troekensubstanz. 2 Vgl. GREENBERO, :D. M. in Methods in Enzymology. Bd. II. New York: Acad. Press Inc.,

Publ. 1955; daselbst S. 370. a SLYKE, ~). ~). VAN, U. 1~. M. ARCHIBALD: J . biol. Chem. 165, 293 (1946).

ARCmBALD, 1~. M. : J. biol. Chem. 1~7, 507 (1945).

238 J. SC~O~ffLLER undH. TX~ZLE~:

bildende Substanz darstellt, also Arginindesimidase den Argininabbau katalysiert, ]ieferte die Bestimmung des p . -Opt imums dieser Reaktion.

Bebrfitung unter Zusatz verschiedener Puffer (p. 5- -8 Phosphat, p~ 8--11 Gly- kokoll-NaOtt) ergab, dab die maximale ~arbentwieklung zwischen p~ 6,0 und 6,5 lag, also mit dem pH-Optimum der Arginindesimidase zusammenfiel.

Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen, dab erwartungsgemg$ die klas- sische Arginase im Sauermflehk/ise nieht fagbar ist. Das Ferment wurde bisher lediglieh in h6heren Pflanzen und Tieren, nieht aber in Mikroorganismen gefunden. Da und dort besehriebene , ,Arginase"-Aktivitgten mikrobieller t terkunft , vor allem in der glteren Li teratur sind mit Vorsicht zu werten. Sie grfinden sieh entweder auf unzureichende Spezifitgt der Untersuchungsmethoden oder werden verstgndlich durch die erst in letzter Zeit erfolgte Aufgliederung vieler Arginin spaltender Ferment- gruppen.

4. Qualitative Untersuehungen zum enzymatischen Argininabbau In den folgenden Untersuchungen soil der eindeutige Naehweis ffir die Citru]lin-

bildung und ffir das weitere Schicksal dieses Argininabbauproduktes geffihrt werden. Wir benutzten dazu die yon uns mehrmals beschriebene Ringchromatographie und ent-

wickelten sie ffir den vorliegenden Zweck derart, dab sie uns den Naehweis aller hier inter- essierenden Abbaustufen er]aubte: Citrullin und Ornithin im Rahmen der Arginindihydrolase, Putrescin als Decarboxylierungsprodukt des gebfldeten Ornithins und schlieBlich Agmatin als mSg]iehes Abbauprodukt einer Arginindecarboxylase. Als Testsubstanzen dienten L-Arginin- hydroehlorid (Bayer-Leverkusen), L-Citrullin, L-Ornithinhydrochlorid, Agmatinsulfat und Putreseindihydroehlorid (ttoffmann-la Roche, Basel). Als L6sungsmittel ausgezeiehnet geeignet war ein Gemisch yon Phenol, n-Butanol, Eisessig, Wasser 20:20:8:40. Bespriiht wurde mit 0,2 g Ninhydrin in 95 ml n-Butanol und 5 ml n,Essigsgure.

Zur Klgrung der Reaktionsfolgen war ein Fermentansatz notwendig, der nieht die Vielzahl aller im ursprtinglichen Extrakt vorliegenden, bei der Papierchromatographie empfindlieh st6renden Salze und ninhydrinpositiven Substanzen enthielt. Wir haben deshalb die Kgse- suspension an der Zentrifuge (20 min, 13000 U/min) mehrmals mit Wasser gewaschen, den Riiek- stand in Wasser resuspendiert und mit Arginin nach pH-Einstellung mit wenigen Tropfen tIC1 oder NaOtt (1% 6,5) bebriitet. Das bier benutzte Fermentpraparat war ninhydrinnegativ.

1. Bebrfitung yon Arginin mit dem Fermentprgpara t zeigte im Chromatogramm, dab die Aminosgure fiber Citrullin und Ornithin zu Putrescin abgebaut wird. Agmatin konnte nicht gefaBt werden. Diesem Abbauweg folgten grundsgtzlich alle unter- suchten Kgseproben; Alter des Kgses und p~ des

Tabelle 2. Bebr~tung yon Arginin mit Rotschmiere. bakterien

Bebriitungs- I dauer Arginin Citrullin

Std I

o [ + + + + - - 5,5 [ + + + +++

27 +

0rnithin Putrescin

++++ - -

Bebrfitungsansatzes verursachten lediglich graduelle Untersehiede der Spaltungsgeschwindigkeit und damit der faBbaren Spalt- produkte.

2. Bebrfitung yon Arginin mit einer gotschmierekultur. Zur Be- brfitung, die sieh fiber 5,5 und 27 Std erstreckte, diente die oben (Seite 236) erwghnte t~einkultur der Rotschmierebakterien, yon

der eine mehrfach gewaschene Abschwemmung gewonnen wurde. Tab. 2 zeigt, dab die Rotschmierebakterien wohl das Dihydrolasesystem, jedoch keine Ornithin- decarboxylase enthalten.

3. Bebrfitung yon Ornithin mit Kgseferment. Der an sich sehon oben erwiesene Abbau des Ornithins zu Putrescin (Abschnitt 1) konnte zusgtzlich bei Bebrfitung yon 10 ml OrnithinlSsung (= 17 mg Ornithin) mit 10 ml ~'erraentsuspension bei p~ 5 papierchromatographisch eindeutig sichergestellt werden.

Beitrage zur Biochemie der Kasereifung. XXIV 239

4. Bebrfitung yon Putrescin mit Kitseferment. Bebrfitet man 10 ml der Ferment- suspension mit 10 ml PutreseinlSsung ( = 15 mg Putresein) in der fiblichen Weise und chromatographiert , so zeigt sich, dab Putrescin auch naeh 24 Std Bebrfitung nicht angegrfffen wird. Es stellt also das Endprodukt der hier untersuehten enzymatischen Argininhydrolyse dar.

5. Bebrfitung yon Agmatin mit Ki~seferment. Aueh hier war nach 24 Std Bebriitung kein Angriff des Agmatins festzustellen.

Zusammen/assend best/~tigen die hier mitgeteilten Untersuchungen die oben gei~uBerte Annahme, dab Arginin im Sauermilehki~se nicht dureh die klassische Arginase, sondern durch das Dihydrolasesystem, also dureh Arginindesimidase und Citrullinase fiber Citrullin zu Ornithin abgebaut wird. Die letztgenannte Substanz wird durch die yon uns frfiher nachgewiesene spezifische Deearboxylase zu Putresein gespalten 1. Putrescin selbst unterliegt keiner weiteren faBbaren Spaltung. In Uber- einstimmung mit frfiheren Befunden unseres Arbeitskreises f inder auBerdem auch keine Decarboxylierung yon Arginin zu Agmatin statt . Die Kl~rung der Frage, welehe Mikroorganismen in K~se als TrKger des Dihydrolasesystems anzusehen sind~ liegt nicht im l~ahmen dieser Arbeit. Von den naeh DREW~S 2 in Sauermflchk~se vor- kommenden Mikrofloren, n~mlieh insbesondere Oidium lactis, PenicilIium henne- bergi, Mycoderma-Arten, Thermobakterien, Streptobakterien, s£ureproteolytisehe Mikrokokken und Corynebakterien, sind wie oben zitiert (S. 235) lediglieh Strepto- kokken auf Dihydrolaseaktiviti~t untersucht worden. I~ach unseren Versuchen kommen die hier in l~ede stehenden Fermente in Bacterium linens vor.

5. Quantitative Er/assung der Arginindesimidase und Citrullinase

I m Anschlul3 an die vorstehend besehriebenen qualitativen Orientierungsversuche sollen zun£ehst die l%rmente Arginindesimidase und Citrullinase n~her gekenn- zeiehnet und ihre Aktivit~t im Reifungsverlauf studiert werden.

Unter den gegebenen MSglichkeiten zur gleichzeitigen Erfassung beider Enzym- typen erschien uns neben der S~ulenehromatographie und der Elution yon Papier- chromatogrammen insbesondere die oben mit gutem Erfolg benutzte Conway- Technik aussiehtsreich. Bei beiden Fermentreaktionen wird N H 3 gebildet:

I . Arginindes imidase > Arginin + H20 -~ Citrullin + NHa,

II. Citrullinase ~ Citrullin + H20 ~ Ornithin + CO 2 + NHa.

I m Rahmen dieser Methode stSren weder freie Aminos~uren noch Salze. Ffir die Aktivitii tsbestimmung der Arginindesimidase erhob sich jedoeh die Frage, ob das nach I bei der Argininspaltung entstehende Citrullin yon der im Bebrtitungsansatz ebenfalls anwesenden Citrullinase naeh I I welter gespalten v¢ird. Damit ware die getrennte Erfassung der Arginindesimidase unmSglich. Nun hat ten jedoch OoI~SKY ~ und andere Autoren gefunden, daI3 Citrullinase ohne A_ktivierung mit ATP, ADP oder AMP, Mg ++ oder Mn ++ + anorganischem P kaum aktiv ist. Falls diese Ver- haltnisse auch ffir die Citrullinase des Kases zutreffen, lieBen sieh in einem nicht- aktivierten Ansatz die Arginindesimidase, in einer aktivierten Probe die Citrullinase bestimmen. Zur Kl~rung dieser fiir die Anwendung des Verfahrens entscheidenden Frage diente folgender Versuch :

1 SCHORMiTLLER, J., U. H. HUT]t: Zit. S. 235, Anm. 2. DREWES, K. : Milchforsch. 18, 289 (1937).

30GINSK¥, E. L., u. 1~. r . GEHRIG: Zit. S. 235, Anm. 12.

240 J. SC~OR~V~ER und H. T~ZLER:

Je 16 ml 10°/oiger K~sesuspension in 0,5 ml Phosphatpuffer PH 6,5 wurden mit 4 ml Arginin- bzw. Citrullinl6sung (je 800 mg/100 ml) bei 37 ° C bebrfitet. Nach entsprechenden Zeiten wurden in 0,5 ml der Ans~tze nach CoNwAY das gebildete :NIt 8 ermittelt. Zur Korrektur wurde der NI-I3- Blindwert abgezogen, der bus Bebriitungsansi~tzen resultierte, die start der Aminos~uren ent- sprechende Wassermengen enthielten. Die Umrechnung erfolgte nach den Beziehungen:

a) ml 0,01 n-HC1 × 2,103 = mg gespMtenes Arginin und b) ml 0,01 n-HC1 × 1,75 ~ mg gespaltenes Citrullin.

Untersuehungen an Kiisen versehiedenen Alters und verschiedener t te rkunf t ergaben, dab trotz langer Bebriitungszeiten unter den geschilderten Versuchs-

7gOt ~ . . . . .

o V - - - ' ~ r ~" "F , , 1o 15 ~ 0 f s S / d 3'0 8ebrUlun#szeil

0 5

Abb. 2. Spaltung yon Arginin und Citrullin bei Bebr~- tung von K~isesuspensionen in Abh~ngigkeit yon der Zeit.

Arginin--, Citrullin - - -

bedingungen nur sehr geringe Citrullin- spaltung eintritt. In Abb. 2 ist das Er- gebnis eines derartigen Versuches graphiseh dargestellt.

Auf Grund der durehgeffihrten Mes- sungen kann bei kurzzeitigen Bebriitungen ffir die Bestimmung beider Ferment typen im Rahmen vergleiehenderUntersuchnngen die aus der Citrullinspaltung s tammende NH~-Bildung vernachl~ssigt werden.

6. K e n n z e i c h n u n g der A r g i n i n d e s i m i d a s e

Mit Hilfe oben besehriebener Conway- Versuchstechnik wurden ffir das genannte Ferment folgende Eigenschaften ermittelt :

a) Das Enzym ist ausgesprochen zellgebunden. Untersuchungen an Kgsesuspen- sionen sowie an den durch hochtouriges Zentrifugieren geschiedenen Fraktionen des Sedimentes und der iiberstehenden LSsung zeigten, daB praktisch die gesamte Akt ivi ta t der Ausgangssuspension (88,5% Argininspaltung) sieh im Sediment findet (85,5 % Argininspaltung).

b) Dialyse gegen flieBendes Leitungswasser (25 Std) und anschlieBend gegen dest. Wasser (5 Std) bewirkt in ~bereinst immung mit Angaben der Literatur keine feststellbare Aktiviti~tsminderung. Das Ferment besitzt also kein abdiMysierbares Co ferment.

e) Die im Bereieh yon p~ 4,5--8,5 untersuchte Aktivit~t des Fermentes besitzt ihr Opt imum bei PH 6,2. Die Angaben der Literatur sehwanken je naeh der Ferment- herkunft zwisehen PH 5,8 nnd 7,01.

d) Das EnzyIn wird durch Hg ++ und Cu ++ stark, dureh Arsenit und Zn ++ bei PE 6,2 m£Big gehemmt.

e) Die Fermentaktiviti~t in Abh~ngigkeit yon der Arginin- bzw. Fermentkonzen- trat ion zeigt innerhalb der untersuchten Bereiche (bis 4 mg Arginin bzw. 0,5 ml Fermentsuspension) linearen Verlauf.

7. K e n n z e i c h n u n g der C i t r u l l i n a s e

a) Die in K~sesuspensionen vorliegende Citrullinase ist kaum aktiv. E s wurde deshalb die aktivierende Wirkung verschiedener in der Literatnr angegebener Effectoren fiberpriift (AMP, ADP, ATP, Mg ++, Phosphat und Arsenat).

0,5 ml CitrullinlSsung (800 mg:%ig) bzw. Wasser im Blindwert und 0,5 ml 20%ige Ferment- suspension wurden mit 0,01 m-LSsungen der Effectoren AMP, ADP, ATP (ulle drei Subst~nzen

1 Vgl. PET~ACX, B., L. SULLrVA~ U. S. RAT~ER: Arch. Biochem. Biophysics 69, 186 (1957).

Beitr/~ge zur Bioehemie der K~sereifung. XXIV 241

ohne und mit Mg++) in Phosphatpuffer p. 6,5, augerdem mit Phosphat -~ Arsenat sowie mit Arsenat allein 15 Std bei 37 ° C bebriitet und ~nsehliegend wie iiblieh das freigesetzte NH3 bestimmt. Die Effeetoren Adenosin-5'-mono, -di- und -triphosphat waren Pr~parate der Fa. C. F. Boehringer & SShne, Marmheim, Arsenat kam als Puffer p. 6,5 zur Verwendung (bestehend aus gleichen Voluminas 0,5 m-Na~HAsOa-LSsung und 0,5 m-HC1).

Den Versuchen zufolge zeigen Kombinationen yon AMP, ADP und ATP mit Mg ++ und Phosphat die st~rkste aktivierende Wirkung. Fast wirkungslos waren Phosphat-Arsenatpuffergemisehe. Die Aktivit/~tssteigerung durch Arsenat allein ist gleiehfalls betr/iehtlich, wie Abb. 3 zeigt. Aus Ersparnisgrfinden wurde deshalb bei den folgenden Versuehen mit 0,5 ml Arsenatpuffer aktiviert.

b) Das pH-Optimum des im Bereieh zwisehen PE 5,0 und 7,6 gepr/iften Fermentes lag bei 6,3 (Aktivierung mit Arsenatpuffer).

e) Wie Tab. 3 zeigt, liegt auch die Citrullinase stark zellgebunden vor. d) Dialyseversuche unter den bei Arginindesimidase besehriebenen Bedingungen

erwiesen, dab Dialyse die Citrullinase nur unwesentlich sch/tdigt.

Tabelle 3. Citrullinaseaktivitgt in Aus- gangssuspension, Zentri/ugat und Sediment

Citrullinspaltung Ansatz %

Ausgangssuspension . . Sediment . . . . . . . ZentrifugatlSsung . . .

24,5 23,6 6,5

26

o~

7 J J

o,7 o,2 ~3 o,¢ rnl O,~ Arsenatpoffer pro Ansatz

Abb. 3. AbMingig~eit der Gitrullinaseaktiviffit yon tier A rsenatkonzentration

e) Die AbMngigkeit der Enzymaktiviti~t yon der Citrullinkonzentration (0,4 ml LSsung mit 0,8 g/100 ml) bzw. yon der Fermentkonzentration (0--0,5 ml K~se- suspension) zeigte innerhalb der genannten Bereiche linearen Verlauf.

Zusammenfassend ergibt sich ffir die nnter 6 und 7 gekennzeichneten Enzyme, dab Citrullinase, nieht aber Arginindesimidase der Aktivierung bedarf. Dadurch war es mSglich, im nichtaktivierten Ansatz die Arginindesimidase zu bestimmen und nach Aktivierung zus/~tzlieh die Citrullinaseaktivit/it zu ermitteln. Beide Fermenttypen sind ausgesprochen zellgebunden und werden dureh Dialyse nicht oder nur unwesentlich gesch/idigt; sie bedfirfen also keines dialysablen Cofaktors.

8. Arg in indes imidase- und Citrul l inaseakt ivi t i i t i m Rei /ungsablau]

Um die Enzymver£nderungen im Laufe der Reifung verfolgen zu kSnnen, wurden folgende Ans~tze untersucht:

Je 1 ml einer 30°/oigen Suspension yon Sauermilchk~se zunehmenden Reffungsgrades in 0,5 m-Phosphatpuffer PH 6,2 bzw. 0,5 ml Arsenatpuffer p. 6,3 wurden mit 0,5 ml Arginin- bzw. CitrullinlSsung (jeweils 0,8 g/100 ml) 7 Std bei 37 ° C bebriitet, ansehlieltend zur Fermentsistierung mit 1 ml ges~ttigter K2CO3-LSsung versetzt und NIt a wie iiblich nach Co~w~,¥ bestimmt. Als Mal~ der Enzymaktivit~t diente auch hier der prozentuale Aminos~urespaltungsgrad. ParMleL versuchen zufolge erleiden die einzelnen K~sech~rgen w~hrend der Reifung nur geringe Troeken- substanz~nderungen, so dab auf die Beriicksichtigung des Wassergehaltes verzichtet werden konnte. Abb. 4 zeigt den Aktivit~tsverlauf beider Enzyme.

Den Versuchen zufolge erreicht die Arginindesimidase erst in fibcrreifem (22 Tage altem) K~se ihr Aktivit~tsmaximum. ]:)as der Citrullinase wird frfiher (etwa nach t5 Tagen) fiberschritten. Beide Fermente zeigen aueh im weiteren Reifungsverlauf noch betriichtliche Enzymwirkung. Die hier gebrachten Kurven entsprechen der

242 J. SeHoa~i~LLEn und H. TXNZLE~: Beitr/~ge zur Biochemie der K~sereifung. XXIV

¢t

in frfiheren Arbeiten ausffihrlieh er6rterten ,,potentiellen" Aktivit/it. Der tats/~eh- lich eintretende Abbau yon Arginin und Citrullin (,,effektive" Aktivit~tt) differiert dadurch, dal~ mit fortsehreitender Reifung die p~-Lage ins Mkalisehe Gebiet gleitet

0 "--~ I I I I I .- 0 5 /0 75 zOTa#e z5

Reifangsalter A b b . 4. Die Aktivit~ten der A~gini~clesimi- dase und Citrullinttse im Verlaul der Reifung.

A r g i n i n d e s i m i d a s e , C i t ru l l i nase - - -

und d a m i t sieh yore p~-Optimum dieser Fermente (6,2 bzw. 6,3) -- wenn auch wenig ausgepr/~gt --

entfernt. DaB der Argininabbau fiber den ge- samten l~eifungsablauf durehaus zureichend dutch das entsprechende Ferment bewirkt wird, geht aus eingangs er6rterten Befunden zahlreicher Au- toren und auch aus unseren Feststellungen hervor, wonach freies Arginin nicht oder nur sehr gering- ffigig in reifem K~se fM3bar ist.

9. Uitrullin im Rei/ungsverlau] Each Aufkl/~rung des enzymatischen Abbau-

weges yon Arginin im Sauermilchk/~se sollte ab- sehlieBend der Frage nachgegangen werden, ob Citrullin w/~hrend der geifung in nennenswerter Menge auftritt.

Der Citrullinbesthnmung lag das yon ARCHIBALI) 1 entwickelte Verfahren zu- grunde, das wir in der Modifikation yon EL6DI 9' benutzten. (Eiehkurve an Citrullin- standard 0,5--4,0 ml, Farbmessung ira ELKO II , Filter S 49, Cuvette 5 ram.) Da naeh A~OHIB~LLD Peptide gleichfalls F~rbungen liefern, haben wir nach der von dem genannten Autor beschriebenen Differenzmethode s/~ulenchromatographiseh gearbeitet (15 cm/1 em-S/~ule yon Dowex 50, H-Form, Elution mit 0,2 n-NaOH bis zur alka- lischen l~eaktion der Eluate). Orientierende Vorversuche hatten ergeben, dab der Citrullingehalt des Kases gegen geifungsende deutlieh ansteigt. Da in diesem Stadium unseren Befunden zufolge im K/tse kein Harnstoff mehr vorliegt, kann auf die Ent- fernung dieser gleiehfalls mit Diaeetylmonoxim unter Farbbildung reagierenden Substanz dureh vorhergehende Bebrfitung mit Urease verzichtet werden.

40 g eines iiberreifen (27 Tage allen) K/~ses wurden mit 300 ml 20~oigcr Trichloressigs~ure verriihrt, das Filtrat zur Verkochung der Triehloressigsaure im Vakuum auf 200 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde in gleiche Volumina geteilt und ein Teil mit 0,875 mg Citrullin versetzt. Von beiden Ans~tzen wurden je 50 ml auf die Dowex-S/~ulen gegeben. DurehfluB und Wasch- wasser wurden vereinigt (Fraktion I), anschlieBend wurde eluiert (Fraktion II). Beide Fraktionen wurden auf 50 ml eingeengt und in 2 ml der Konzentrate der Farbkhrper mit Diacetylmonoxim entwickelt.

Auswertung der Ergebnisse nach der yon A~CHI]~ALD besehriebenen Methode ergab, dab hochgereifter Kase in der asehefreien Troekensubstanz (38 %) einen Citrullin- gehMt yon 20 rag/100 g aufwies.

])as Auftreten derart geringer Citrullinmengen in Kgse ist verst/£ndlieh. Casein enth/~lt kein Citrullin, so dab diese Substanz hier nur fiber die oben besehriebene Argininspaltung oder aber dutch Synthese aus anderen Stoffen entstehen kann. Solche Synthesemhgliehkeiten haben u. a. GI~ISOLIA u. Mitarb. a in einer l~eihe yon

1 A I ~ e I t I B A L D , l~ . ~ . 1 J . biol. Chem. 156, 121 (1944). ELODI, P. : Acta physiol. (Budapest) 6, 225 (1954) ; identisch mit E. BAJvsz: Xrztl. Laborat.

1, 155 (1955); vgl. auch LE1VfAI~, R. I~., u. D. BOOTZIN: Analytic. Chem., 29, 1233 (1957). GI~ISOLIA, N., u. P. P. CO~EN: J. biol. Chem. ~04, 753 (1953). - - Ko~ITZ, S. B.,

u. P. P. CO~EN: J. biol. Chem. ~00, 551 (1953) und frtiher. - - Vgl. aueh P~EIOI-IAI~D, P.: Acta, c h e m . s t a n d . 1 1 , 5 2 3 ( 1 9 5 7 ) . - - D E L L A I : r I E T R A , G . , E . I ~ O G L I A N I , S . P R O C A C C I N I U. 1~. I : ~ O G L I A N I :

Boll. Soe. ital. Biol. sperim. 83, 771 (1956).

HmTZ~TZE: Ver~nderungen des Reduktionswertes bei Anthocyane enthaltenden Konserven 243

Arbeiten untersueht. Derartige, dort beschriebene Synthesen werden jedoch dureh ein aus Leber gewonnenes Ferment katalysiert, dessen Vorkommen in Mikroorganis- men fraglieh bleibt. Die bis zum Reifungsende gegenfiber Citrullinase weit s tarker entwiekelte Arginindesimidase macht das Vorkommen des Citrullins auch unter diesem Gesichtspunkt wohl verst~ndlich. S c ~ I D 1 land in verschiedenen K~tse- sorten 161--170 #g Citrullin pro g Frischki~se; unseren Befunden zufolge wfirde dies ffir Sauermflchk~se einem Weft yon 125 #g entspreehen. Aueh andere Autoren berichten fiber das Vorkommen dieser Aminosi~ure in vielen K~sesorten 2, w~hrenc~ in einer Reihe yon Arbeiten 3 der Citrullinnachweis nieht geffihrt werden konnte.

Zusammen]assung

In reifendem Sauermilchk~se erreicht die (an sich sehwaehe) Ureaseaktivi t£t naeh 10 Tagen ihr Maximum. Die im Ausgangsquark gefundene Harnstoffmenge yon ¢,7 rag/100 g wird schon in den ersten Reifungstagen vollst~ndig gespalten. Die klassische Arginase kommt im Sauermilehk£se nieht vor. Papierchromatographisch konnte die Argininspaltung fiber Citrullin und Ornithin zu Putrescin naehgewiesen werden. Diese Substanz sowie Agmatin blieben bei langdauernder Bebrfitung unver~ndert. Von den damit sichergestellten Enzymen: Arginindesimidase, Citrul- linase und Ornithindecarboxylase wurden die beiden erstgenannten Fermente nigher gekennzeiehnet. Sie liegen zellgebunden v o r u n d werden dutch Dialyse nicht geschi~digt. Arginindesimidase zeigt ein p . -Opt imum yon 6,2 und wird durch Hg ++, Cu ++ stark, dureh Zn ++ und Arsenit mi~Big gehemmt. Citrullinase wird bei p~ 6,3 durch Adenosinphosphorsi~ureester, Mg ++ + anorganisches Phosphat sowie Arsenat s tark aktiviert. Beide Fermente nehmen im Reifungsverlauf betr~chtlich zu, auch im Stadium der Uberreife weisen sie noch deutliehe Aktivitiit auf. Citrullin findet sieh im normalen l~effungsbereich nur in sehr geringer Menge. In der asehefreien Trocken- substanz fiberreifen (27 Tage alten) Sauermilchk~ses wurde eine Citrul]inmenge yon 20 mg ermittelt.

Veriinderungen des Reduktionswertes bei Anthocyane enthaltenden Konserven

Von

K. HEINTZE

Mitteilung aus der Bundes/orschungsanstalt ]i~r Lebensmittel]rischhaltung, Karlsruhe

(Eingegangen am 25. Juli 1958)

Bei der Untersuehung yon Obst- und Gemfisekonserven auf ihren Vitamin C- Gehalt sind nach einiger Lagerzeit yon nns geduktionswerte gefunden worden, die nicht ohne weiteres erkl£rbar sind, weft sie die im Laufe der Zeit zu erwartenden niedrigeren Werte und zuweilen selbst die Ausgangswerte fibersteigen. Da nich~

1 Scm~ID, A. : Diss. ETH Ziirich 1956, Prom. Nr. 2563; Schweiz. Milchztg., Wiss. Beilage 46, 3 (1957).

S~O~GA~D, T., u. B. LINDQUISW: 1Viilchwiss. 8, 5 (1953). - - SIMO~ARD, P., u. J. MAYAVDO~: Ned. Melk. en Zuiveltijdschr. 6, 1 (1952).

CLEMENS, W. : Mflchwiss. 6, 195 (1954). - - OSWALD, W. : Milchwiss. Ber. Wolfpassing 4, 1 (1954).--lVIABBITT, L. A.: J. Dairy l~es. 22, 224 (1955).- BAERHEIM, S. A., u. A. JERMSTADT: Ned. Melk- en Zuiveltijdschr. 8, 29 (1954).