Zei~schrift ftir Krebsforschung, Bd. 58, S. 56--64 (1951).

Aus dom Institut ffir experimentelle Pathologic der Farbenf~briken ,,B~yer" Wuppertal-Elberfeld (Leiter: Prof. Dr. med. GEI~HAI~D DOMAGK).

B6itrag zur Kenntnis der cancerogenen Wirkung des Beta-Naphtylamins.

Vom CRy,. HACXC~A~N.

Mit 9 Text~bbildungen.

(Eingegangen am 22. Oktober 1951.)

W~hrend bisher noch kein sicherer experimente]ler Beweis daffir vor- liegt, dab das AnilJn bei der Entstehung des sog. Anilin-Blasenkrebses eine wesentliche l~olle spielt, kann es als erwiesen gelten, da~ dem Beta- Naphtylamin (fl-NA.) eine groBe Bedeutung a]s urs/ichliche l~oxe zu- kommt.

1930 gelang es erstma]s W. SCHXR, mit dieser Substanz bei Kaninchen dutch Inhalat ion Epithelwucherungen, Papillome und Carcinome in der Harnblase hervorzurufen. Als weitere Sch~digungen tr~ten in diesem Versuchen Bronchitis, Pneumonie, Lungenabscesse, chronische inter. stitielle Nephritis bei den behande]ten Tieren ~nf. Die Beobachtnngen von ScHXR konnten in der Folgezeit yon verschiedenen Untersuchern bestgtigt und erweitert werden.

S. PEgLMA~ und W. STAEnLER (1932, 1933) fanden ebenfalls Tu- moren in der Harnb]ase bei Kaninchen, die subcutane Injektionen yon fl-NA, erhalten hatten. Des weiteren beobachteten W. C. ttCEPE~ und ]-I. D. WOLFE (1937) Blasengeschwiilste (Papillome und Carcinome) bei Hunden, welchen /~-NA. peroral zugeffihrt worden war.

W. C. HUEPER, F, H. WILEY nnd H . D . WOLFE (1938) injizierten t tunden in ]gngere Zeit fortgesetzten Versuchen das t tydrochlorid des fi-NA, subcutan, gleichzeitig wurde die freie Base peroral gegeben. Bei 14 yon 16 Tieren t ra ten Blasengeschwfilste auf, wobei die Autoren aller- dings in erster Linie die perorale Applikation als ffir die Tumorentstehung mal]geblich ansehen.

Besonders bemerkenswert sind die Ergebnisse yon G.M. BONSE~, welche bei Verffitterung yon ehemiseh reinem fi-NA, an Hunde ebenf~lls Tumoren der tIarnb]ase erzielen konnte. Es darf somit ~ngenommen werden, dab die blasencarcinogene Wirkung ta.ts~chlich dem fl-NA, zu- kommt, nicht aber anhaftenden Verunreinigungen und Begleitstoffen.

l~icht unerw~hnt soll bleiben, dab verschiedene Untersueher fiber negative Resultate bei der Einwirkung yon fl-NA, auf Tiere berichtet haben. So beob~chtete H. H~XTH~VSE~q (1916) bei Verffitterung an

Beitrag zur Kenntnis der cancerogenen Wirkung des Be~-N~phgylamins. 57

Rat ten und bei Anwetldung in Form einer Salbe auf der I-Iaut des Ka- ~linehens keine Tun~orbildung. I-I. MARUJA, der ebenfalls Ffitterungs- versuche an Rat ten durehffihrte, sowie I. 13EX~E~CBLU~ und G. M.13ozcsEx, die w~Brige Suspensionen yon /LNA. Kaninchen ill die BauehhShle injizierten, sahen danach keine Tumorbildung. Die subcutane Injektion des Hydrochlorids bei Hunden und l%atten sowie die intravenTse und ini~raperitoneale Injektion bei t-Iunden urtd Kaninchen Iiihrte in Ver- suchen yon W. C. HV~PE~, F. A. 13RIGGS und H. D. WOLF~ (1938) eben- falls nicht zur Tumorentstehung.

~Telehe Umst~tnde diese negativen Ergebnisse verursacht haben kTnn- ten. sei hier nicht weiter erSrtert; es liegt in der Natur der Sache, dab die 13eweiskraR der vorliegenden posRiven ResuRate dadureh nicht erns~lich erschiittert werden kann. Die tats~chliehe blaseneancerogene Wirksamkeit des fl-NA, ist nieht mehr ernstlich aDzuzweifeln. Weniger leicht ist die weitere Frage zu beantworten, ob das fl-NA, unver~ndert in die 131ase gelangt und als solehes deft die Tumorbildung hervorruR, oder ob erst, Umwandlungsprodukte in der Blase wirksam werden. Ffir die lefztere Auffassung lassen sieh mancherlei Hinweise anfiihren. Schon allein der Umstand, dab sowohl beim Menschen wie aueh in den bisher durchgeffihrten Tierversuchen nahezu ausschlieBlich Geschwiilste der I-Iarnblase beobaehtet wurden, tegt die Vermutung nahe, dab die eigent- liehe Noxe ein Stoff sein k6nnte, der im tierisehen Organismus gebildet wird und erst in der Blase bei geniigender Konzentration, genfigend ]anger Einwirkungszeit und unter sonstigen taugliehen Bedingungell (z. ]3. pn des Urins) Gelegenheit finder, zur Wirkung zu gelangen.

In einer neueren Arbeit beriehten nun G. M. Bo~sE~, D. B. CLAYSON und J. W. JULL (1951) iiber weitere erfolgreich verlaufene Versuehe, 131aserttumoren bei Hunden, Kaninehen, 1Ratten und lVIgusen dutch Ver- fiitterung yon fi-NA, zu erzeugen. Diese Autoren konnten bei den ver- sehiedenen Tierarten naeh peroraler Gabe im Urin 2-Amino-l-Naphtol naehweisen und ~ugern die Ansieht, dab diese Substanz ffir die Bla,sert- krebsentstehung verantwortlieh zu maehen sei. 13ei der Einfiihrung yon Paraffinwaehspillen mit 2-Amino-1-Naphtol in die Harnblase yon Mi~usen nach der yon J. W. JULn angegebenell Methode zeigte sieh das 2-Amino- 1-Naphtol in gleiehem Ausmage eancerogen wie Methyleholanthren. Das AuRreten yon 2-Amino-l-Naphtol im H a m yon Hunden, welehe fl-NA. perorM erhalten hatten, wurde bereits 1924 yon H. ESGEL festgestelR. Diese 13eobaehtung ist weiterhin aueh yon F. H. WILEY 1938) bestgtigt worden, der land, dab bei I-Iunden naeh der Verfiitterung yon fi-NA. 2-Amino-l-Naphtol, und zwar an Sehwefelsgure gebunden, im I-Iarrt auf~ra~.

K. DOB~X~E~, K. I - Ios~A~ und C. P. RXOADS (1941) injizierten Affen, Kaninehen und 1%atten fl-NA, in OlivenS1 gelTst und konnten im

58 C~mHAe~MA~:

Urin sowohl die Base selbst wie aueh das N-Aeetylderivat, das N-Aeetyl- amino-6-Naphtol und ferner ein nieht n/~her identffiziertes Dihydroxy- Amino-Naph~alin naehweisen.

Die untersehiedliehe Empf/~ngliehkeig der versehiedenen Tierarten fiir experimentellen Blasenkrebs k6nnte naeh G. M. Bo~s],:~, D. B. CLAY- SON und J. W. JULL dureh die yon ihnen beobaehteten Untersehiede

in der Konzentrat ion des 2-Amino-I-

A b b . 1. K 10 M ~ u s 8.

Naphtols im Urin dieser Tiere bedingt sein.

A b b . 2. X 10 IvIa•s 8. V e r g r . 1 : 250 (41~ ve rk l e ine r t , ) .

Nach dem Vorstehenden lgBt sich somit die Frage, ob das fl-NA. als solches auf das Gewebe canceroge~ wirkt, nieht Mar beantworten. Die meisten der vorliegenden Tierversuche wurden in der Absich~ durehgeffihrt, die beim Menschen als Berufserkrankung bekannte Blasenkrebsbildung zu reproduzieren. So erklgr~ sich die bevorzugte Verwendung yon Tierarten (Hund, Kaninehen), welehe naeh den sonstigen Erfahrungen mit eaneerogenen Stoffen keineswegs besonders empfindliehe Indikatoren fiir eaneerogene ehemisehe Effekte dar- stellen.

Wir haben nun an Inzuehtmgusen sowie Hamstern, deren Empfgng- liehkeit ffir Sarkomentstehung naeh subeutaner Injektion eaneerogener Stoffe uns aus vorausgegangenen Versuehen bekannt ist, Untersuehungea fiber die lokale eaneerogene Wirksamkeit des fi-NA, im Vergleieh zu anderen eaneerogenen Stoffen durehgefiihrt.

Beitrag zur Kennm~s der cancerogenen Wirkung des Bet~-N~phtylamins. 59

Material und YIethodik.

1. Versuche mit M~iusen.

Wir verwendeten minn l iche und weibliche Tiere des Stbmmes SW, der bei uns seit 1940 in Geschwisterinzucht gehalten wird. Die Spontan tumorra te bei diesen Tieren ist sehr niedrig und lieg~ f/it die erwa, chsenen ~ i n n c h e n unter 0,01%, ~ttr die erwachsenen Weibchen bei 0,5 % (bile Ar ten yon Tumoren zusammengefal3t).

Die Tiere erhielten ein Mischfutter, be- s tehend bus 60% Gerste, 25% Mais, 5% Sonnenblumenkernen, 10 % Fischabf&llen, dazu Grfinfut~er (Salat) und ~Vasser. Die

Abb. 3. K 9 Maus 3. Abb. 4. 1~2 9 5'Ibus'3. Vergr. 1:250 (4/5 vorkleinert).

Tiere wurden in Versuchsgruppen zu je 20 M/~usen (10 minnl iche und 10 weib- liche) eingeteilt und erhielten eine einmalige subcut~ne In jekt ion des in Oliven61 gel6sten Pr/~parates. D~s verwendete 01 wurde in Xontrol lversuchen auf etwaige cancerogene Eigenschaften gepriift und ha t unter gleichen Bedingungen bisher in keinem Falle zur Tumorbi ldung gefiihr~. Die Tiere wurden bis zu dem spon*an ein- getretenen Tode beobachtet . Eingegangene Tiere wurden obduziert und die Organe nach Formogixierung in Paraff inschni t ten untersucht . Da.s verwendete ~echnisshe Pr ipara~ enthielL an organischer Substanz 99,1% fi-N.A, und 0,79% fi-Naphtol.

Versuchsgruppe 1. Je 10 weiblichen und 10 mgnnlichen Inzuchtm~usen wurde ~m 19 .7 .50 1real 0,5 cm 3 einer 0,4%igen L6sung yon fi-NA, in Oliven61 ( = 2 rag) unter die Hau* des l~tickens injiziert. Eine weitere Behandlung erfolgte nieht . Die Tiere wurden yon der 9. Woche ab lma l w6ehentlich auf das Vorhandensein yon Tumoren untersucht . Bei einigen Tieren bildete sich im Anschlufl ~n die In- jekt ion eine en~ztindliche Schwellung im Bereich des injizierten M~terials, die im Laufe der folgenden Wochen sich bei den meisLen Tieren wieder zuriickbildete. Bei 2 Tieren jedoch entwickelte sich aus diesem Herd hergus eirt yon einer be- s t immten Zeit bb rbpide au Gr6t3e zunehmender Tumor. So war bei der weibliohen

60 CuR. H ~ c K ~ A ~ :

Maus Mr. 8 zungehst ein kleines Kn6gehen an der Injektionsstelle aufgetreten, welches bis zur 23. Woehe in der Gr6Be konstant blieb und yon da an rasch wnchs. Das Tier wurde sehlieBlieh getStet, als der Tumor etwa 15 mm Durehmesser er- reieht ha*te (s. Abb. 1). Die histologisehe Untersuehung ergab ein Spindelzellen- sarkom (Abb. 2).

Ein wciterer Tumor an der Injektionsstelle t ra t bei der m/innliehen Maus Mr. 3 auf. Aueh in diesem Falle en~wiekelte sieh der Tumor aus einem XnStehen im Be- reich des injizierten Materials, welches kurz naeh der Injektion entstanden und his zur 32. Woehe in der Gr6Be konstant gcblieben war. Von da an erfolgte pro- gressives Waehstum; das Tier wurde naeh 41 Woehen get6tet. Histologiseh handelte es sieh ebenfalls um ein Sarkom (Abb. 3 und 4).

Abb. 5. K 9 5Iaus 8. Abb. 6. J$2 9 5Iaus 8. Vergr. 1:250 (4/5 ~-erkleinert).

Noch bei einem weiteren m/tnnliehen Tier (~faus Nr. 8) t ra t yon der 69. Woche an ein Sarkom an der Injcktionsstelle auf. Aueh bei diesem Tier hat te sieh zun~ehst im Ansehlug an die Injektion ein lokaler Entzfindungsherd entwiekelt, der jedoeh im Laufe der folgenden Woehen vSllig ausheilte. Das Tier blieb dann bis zur 4:9. Woehe frei yon jeder makroskopiseh feststellbaren Vergnderung. Dann t ra t erneut an dersslben 8telle ein Kn6tehen auf, welches sieh sehlieglieh zu einem Tumor yon etwa 20 mm Durehmesser entwiekelte (Abb. 5). Naeh dem Ergebnis der histologisehen Untersuehung handelte es sieh um ein Sarkom (Abb. 6).

Von der ganzen Versuehsgruppe yon 20 M~usen lebten zum Zeitpunkt des Auf- gretens des 1. Tumors (23Woehen) noeh i1 Tiere, davon entwiekelten somit 3 Mguse Tumoren an der Injektionsstelle. 9 Mguse lebten fiber 14 Monate nach Versuehsbeginn.

Bei einer 2. Versuchsgruppe yon ebenfalls 20 Mgusen wurden 0,5 cm a einer 0,1%igen 51igen LSsung von fl-NA. (=0,5 rag) lmal unter die I~fickenhaut injiziert, In dieser Versuehsgruppe konnten 10 Mause fiber 6 Monate and 8 Mguse fiber 14: Monate nach Versuehsbeginn beobachtet werden. Es t ra t nur bei einem weib- lichen Tier eine Gesehwulst auf, jedoeh nieht unmittelbar an der Injektionsstelle, sondern am Hals (Abb. 7). tIistologiseh handelte es sieh um einen eystiseh-hgmor- rhagisehen Tumor aus stellenweise soliden, stellenweise mehr drtisenartig ange-

Beitrag zur Kenntnis der cancerogenen Wirkung des Beta-NaphtylamiIxs. 61

ordne ten Massen yon kleinen rundl ichen oder ovalen Zellen (Abb. 8). Der Tumor en tsprach im Aussehen weitgehend den bekannben eyst iseh-hamorrhagischen Adenocarcinomen der Maus. Es ist daher zweife]haft, ob er in irgendeiner Be- ziehung zu der Behandlung mi t fl-NA, gebracht werden kann.

Wir haben somit mi t einer Dosierung yon lma l 0,5 mg subcutan je Maus keine Tumoren an der Injektionsstelle erzielen k6nnen.

In einer 3. Versuchsgruppe yon ebenfalls 20 Inzuehtmausen erhielten die Tiere gleiehzeitig subeutane In jekt ionen yon 4 verschiedenen cancerogenen Substanzen,

und zwar je 0 ,125cm 3, einer 0,1%igen 51igen L6sung ( _ 0,125 rag). Die L5sungen wurden an verschiedenen Stellen des I46rpers injiziert,

Abb. 7. ]~ 20 Maus 6. Abb. 8. Jr 20 Maus 6. Verge. 1:400 (4/5 verkleinert).

und zwar in die Axillargegend links: Benzpyren, in die Axillargegend rechts: 9 ,10-Dimethyl- l ,2-Benzanthracen, in die Leistengegend links: Methylcholanthren und in die Leistengegend rechfs: ~-Naphtylamin.

In dieser Versuehsgruppe t r a t en insgesamt bei l0 Tieren Tumoren am Injek- t ionsorte auf. Der 1. Tumor wurde bereits 10 Woehen nach Versuehsbeginn festges~ellt, und zwar handel te es sich um ein Spindelzellensarkom an der mi t Methvlgholanthren behandel ten Stelle. Bei 4 Tieren t r a t en Tumoren an mehreren Injekt ionsstel len auf, so bei der 1Viaus Nr. 4, welche gleichzeitig Tmnoren am Injek~ionsorte yon 1Viethylcholgn~hren, Benzpyren und/~-NA, bekam. Es handel te sieh in allen diesen Fallen u m Spindelzellensarkome.

Insgesamt t r a t en an der mi t Methylcholanthren behandel ten Stelle, 6ram Tmnoren auf, an der mi t Benzpyren behandel ten Stelle 5mal, an des mi~ Limethyl- Benzanthracen behandel~en S~elle lmal und an der mi t fl-NA, behandel ten Stette 2mal.

Bei einer weiteren Versuchsgruppe yon 20 Xnzuch~m/~usen wurden 5 mg Di- naphtgzin ( 2 6 8 ~ 7 0 ~ sublim.) eine chemisch dem Ngphty lamin nahes~ehende Substanz mi t der Formeh

62 CHR. HACKMANN:

Abb. 9.

kVorhen

F

i

m

m

m

I 20 25 00 <75 ~o 45

I 50 55

I I

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�9 Lunyenlumor

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3 ~a

Cancerogene Wirknng yon ~-Naphtylamin und Dinaphtazin in Vergleieh zu Benzpyren und Methyleholanthren.

in O1 gel6st unter die Ri ickenhaut injiziert. Das Pr/~parat wurde uns yon Herrn Dr. SOHWAE~,L, Leverkusen, zwecks Prfifung auf cancerogenG Wirkung fiberlassen. DiG Substanz zeigte ebGnfal]s eine wenn auGh nur mitte]m/~Bige eancGrogene Wir- kung. Bei einem (m/innlichen) Tier t r a t in der 21. Woche Gin SpindelzellGnsgrkom auf, bei einem wGitGren, ebenfalls m/~nnliehen Tier land sich in der 43. Woehe ein Gystisch-hamorrhagischer Tumor am Itals und bGi einem 3. m/innlichen Tier in der 41. Woche ein sehr groBes Sarkom der BrusthShle.

Beitrag zur Kenntnis der caneerogenen Wh'kung des Beta-Naphtylamins. 63

Die Abb. 9 zeigt in vergleiehender Darsgellung die e~neerogene Wirkung des fl-NA., des Dinaphtazins, des 3,4-Benzioyrens und des 20-Methylcholanthrens bei subcutaner Anwendung bei M/~usen des yon uns verwendeten Inzueh~stammes.

2. Versuche mit Goldhamstern. Acht syrische Goldhamster (Mesocricetus auratus) erhielten im Abstand yon

3 Monaten 2 Injektionen yon je 2,0 cm ~ einer 1%igen Aufschwemmung yon fl-NA. in Wasser (Ges~mtdosis = 2real 20mg) unter die Ituut des Rfickens. Die Tiere haften sich bei vorausgegangenen Versuchen Ms hocheml0findlich gegenfiber Benz- pyren gezeigt.

Von den so behandelten Goldhamstern lebten 7 fiber 6 Monate und 2 fiber 12 Monate nach Versnchsbeginn. Bei keinem Tier trat ein Tumor auf. Bei 3 Ham- stern fanden sich hochgradige degenerative Veri~nderungen in den Nieren, die mit Hinblick auf die schon erwiihnten Befunde Sc~X~s bei Kaninchen mit einer gewissen ~Tahrscheinlichkeit der Behandlung zur Last gelegt werden mfissen. An der Blasen- schleimhaut unserer Goldhamster fanden wir keine pathologischen Ver~nderungen. In 2 F~llen beobachteten wit in der Leber grSgere, mit wasserklarem Inhalt ge- ffillte Cysten. Nekrosen in der Leber fanden sich bei 4 Tieren.

Zusammen/assung.

Nach subcu tane r I n j e k t i o n yon l m a l 2 mg f i -Naph ty l amin wurden bei e inem M~uses tamm m i t n iedr iger Spon tan tumor f r equenz Sa rkome am In j ek t ionso r t e erziel t . Die Tumoren t r a t e n in der 2 3 , 32. und 49. Woehe nach der Behand lung auf. I n der mi t der k le ineren Dosis yon 0,5 mg /3-NA. behande l t en Versuchsgruppe t r a t kein T u m o r an der In jek t ionss te ] le auf, es ent~4ckel te sich bei e inem Tier ein Tumor a m Hals , der m6glicherweise n ich t auf die Behand lung zurf ickzufi ihren ist.

] )as D i n a p h t a z i n erwies sich bei subcu tane r I n j e k t i o n als Sehwach cancerogen. Bei Go ldhams te rn wurde nach subcu tane r I n j e k t i o n yon fl-NA, keine Tumorb i ldung beobaeh te t .

Die E n t s t e h u n g yon Sarkomen an der In jek t ionss te l l e m a c h t es wahr- scheinlich, dab dem fl-NA, selbst eine unmi t t e l ba r e cancerogene Wir- kung auf das Gewebe zukommt , ohne dab eine ehemische U m w a n d l u n g im Stoffweehsel dazu erforder l ieh ist. Diese A n n a h m e s teh t a l lerdings im Gegensa tz zu den anfangs e rw~hnten Anschauungen yon G. 35. Boz~- s ~ , D. B. CLAYsoz~ und J . W. JVLL fiber den Wi rkungsmechan i smus des fl-NA. Diese Au to ren ve rmuten , dal3 die W i r k m l g dem Stoffwechsel- p r o d u k t 2 - A m i n o - l - N a p h t o l zuzuschre iben ist . Geht m a n yon dieser Annahme aus, so wird man aus unseren Versuehen den Schlu~ ziehen mfissen, dab in dem technischen Produk~ mindestens 2 cancerogene Stoffe enthalten sind, niimlich auger dem erst nach Abwandlung im Stoffwechsel wirksamen fl-NA, noch ein Fakfor unbekannter Art, der lokal cancerogen ist. Dieser Stoff mfiBte ungew6hnlich hoch wirksam sein, da er nach dem Ergebnis der Analyse in einer IVIenge yon nicht mehr als etwa 4 ~ und darunter in der verabreichten Pr~paratdosis ent- h a l t e n sein konnte .

6 4 CHR. HAGKNANN: Cancerogene Wirkung des Be~a-Naphtylamins.

Wir haben eine der als Begleitstoff in Bet racht komme nde n Sub- s tanzen, das Dinaphtaz in , in reiner F o r m ebenfalls un te r sueh t u n d in eitter Dosis yon l m a l 5 mg subeugan lokal m~gig wirksam gefunden. Auch das im teehnischen/~-NA, en tha l t ene /~-Naphto l k o m m t zur Er- kl~rung der lokalen Wirkung nieht in Betraeht , da es ebenfalls n u t in mSA~igem Grade caneerogen ist (s. HA~TWnLL).

Die Ergebnisse unserer Versuehe sprechen somit dafiir, dab dem fi-NA, als solehem durchaus eine eancerogene Wirkung zukommt, die bei geeigneten Ind iv iduen u n d beim Vorliegen sonstiger gtinstiger Be- d ingungen in der E n t s t e h u n g yon bSsart igen Tumoren am Einwirkungs- ort zum Ausdruek kommt . Dal3 beim Mensehen nach/~-NA. E inwi rkung Tumorb i ldung nahezu aussehlieglieh in der Harnblase beobaehtet wird, zwingt n ieht unbed ing t zu der Annahme, dab nur Umwandlungsproduk te des fi-NA, ffir die Tumoren t s t ehung verantwort l ieh zu maehen sind.

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Dr. CHa. HACKMANN, (22a) Wuppertal-Elberfeld, Farbenfabriken ,,Bayer", Institut ftir experimentelle Pathologie.