Institut für Zoologie

KERNFORSCHUNGSANLAGE JOLICH

des Landes Nordrhein-Wes1falen-e.V.

Besseres Fixierungsverfahren zur Darstellung des

Grundplasmas von Protozoen und Vertebratenzellen

von

Silvia Danneel und Norbert Weissenfels

Jül - 341 - ZO Oktober 1965

Berichte der Kernforschungsanlage Jülich - Nr. 341

Zu beziehen durch:

Institut fOr Zoologie - JOI - 341 - ZO

:. : Electron Microscopy Sample Preparation Cytoplasm Microscopy

OK.: 621.385.833(086.3).002.2 : 576.311

ZENTRALBIBLIOTHEK der Kernforschungsanlage Jülich JOlich, Bundesrepublik Deutschland

Sonderdruck aus: »MIKROSKOPIE« ZENTRALBLATT FÜR MIKROSKOPISCHE FORSCHUNG UND METHODIK

Hauptschriftleitung Prof. Dr. Alf red Grabner und Prof. Dr. ]otef Kisser

Verlag Georg Fromme & Co.

Wien V, Spengergasse 39 · München 7, 8oossrraße 15 Rg.

Band 20 / Heft 3 / 4 1965 Seiten 89-93

Aus dem Zentrallaboratorium für angewandte Übermikroskopie (Leiter: Prof. Dr. K. E. WoHL­F"ARTH-BorrEnMANNJ und der Arbeitsgruppe Zoologie der Kernforschungsanlage Jülich (Arbeits­

gruppenleiter: Prof. Dr. R. DANNEEL) am Zoologischen Institut der Universität Bonn

Besseres Fixierungsverfahren zur Darstellung des Grundplasmas von Protozoen und Vertebratenzellen1

)

Von SILVIA DANNEEL und NORBERT WEISSENFELS

Mit 2 Abbildungen

Überreicht vom Verfasser

MIKROSKOPIE ZENTRALBLATT FÜR MIKROSKOPISCHE

FORSCHUNG UND METHODIK Begründet 1946 unter Mitwirkung von Dr. Fritz Bräutigam (f)

Hauptschriftleitung Prof. Dr. A Grabner und Hochschulprofessor Dr. ]. Kisser

Band 20 ( 1965) Heft 3/4 (Oktober 1965) Seiten 69-116

Nachdruck. auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des Verlages unter genauer Quellenangabe gestattet

INHALT DIESES DOPPELHEFTES

Artikel

1-IuBE:t P., Aldehydthionin-Phloxin-Färbung im Dunkelfeld. Beitrag zur Morphologie des Glomerulus und Tubularapparates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

vVEISSEm"ELS N. und DANNEEL S., Nachkontrastierung elektronenmikroskopischer Präparate im Vestopalblock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

KA1T1.sowA P., Vergl'eichende elektronenmikroskopische Analyse der Viren von sechs Karto:Ielsorten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

DANNEEL S. und vVEISSENFELS N., Besseres Fixierungsverfahren zur Darstellung des Grundplasmas von Protozoen und Vertebratenzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

RAu R., Das Panorama-Abdruckverfahren, eine modifizierte Methode zur Darstellung von Feinstrukturen im licht-, polarisations- und elektronenmikroskopischen Bild . . . . . . . . . 94

IVloacENROTH K. jun. und THEMANN H., Elektronenmikroskopische Untersuchungen zum fcinstrukturellen Aufbau des L'eberläppchens unter Zuhilfenahme gerichteter Ein-bettung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

Referate

Buchbesprechungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 :vlikroskope und Zusatzgeräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Ultramikrotomie uild Elektronenmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 I-listochemie und Histophys·k ...................................................... 109 ~likroskopische Untersuchungs- und Präparationsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Nicdc>w Organismen:

pflanzliche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Eotanik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Zoologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Histologie und Pathologie des Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 l\.linera!ogie, Geologie und Bodenuntersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Metallographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Ang·cwandte Mikroskopie und Technologie .......................................... 115 Neue Listen .................................................................... 116 Mitteilungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

VERLAG GEORG FROMME & CO. WIEN V, SPENGERGASSE 39 MÜNCHEN 7, BOOSSTRASSE 15 Rg

Aus dem Zentrallaboratorium für angewandte Übermikroskopie (Leiter: Prof. Dr. K. E. WoHL­FARTH-BOTTERMANN) und der Arbeitsgruppe Zoologie der Kernforschungsanlage Jülich (Arbeits­

gruppenleiter: Prof. Dr. R. DANNEEL) am Zoologischen Institut der Universität Bonn

Besseres Fixierungsverfahren zur Darstellung des Grundplasmas von Protozoen und Vertebratenzellen1

)

Von SILVIA DANNEEL und NORBERT WEISSENFELS

Mit 2 Abbildungen

Bei der elektronenmikroskopischen Darstellung biologischer Objekte fallen in erster Linie die Membranstrukturen auf. Sie sind auf das Cytoplasma der Zelle beschränkt und stellen wesentliche Bauelemente der einzelnen Plasmadifferenzierungen dar. In Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen weisen die membranösen Anteile des Cytoplasmas zwar gewisse Schwankungen auf (KoMNICK und WoHLFARTH-BOTTER­MANN 1964) und unterliegen auch manchen modifizierenden Einflüssen der Präparations­technik, doch haben insbesondere MooR und MüHLETHALER (1963) an lebend einge­frorenen Objekten nachgewiesen, daß die Darstellung der cytoplasmatischen Membranen durch Osmiumtetroxyd- und Kaliumpermanganat-Fixation lebensgetreu ist.

Größere Schwierigkeiten bereitet die Analyse der cytoplasmatischen Grund­substanz. Nach den bisherigen Erfahrungen ist das Strukturgefüge des Grundplasmas labiler als die Membrananteile der Zelle und infolge der Cytoplasmaströmung und der Sol-Gel-Transformation (WoHLFARTH-BOTTERMANN und SCHNEIDER 1958) stärkeren und schnelleren Umwandlungen unterworfen.

Die Grundplasmastrukturen der Os/Cr-fixierten Amöbe Hyalodiscus simplex zeigen z.B. insofern funktionsbedingte Dichteunterschiede (WoHLFARTH-BOTTERMANN 1960), als das ektoplasmatische Strukturgefüge kleiner, in Bildung oder Rückbildung begrif­fener Pseudopodien stets lockerer strukturiert ist als das übrige Ektoplasma. Das Gefüge des fixierten Grundplasmas hängt also u. a. von seiner dynamischen Aktivität bzw. Viskosität im Augenblick der Fixierung ab. Eine vergleichende Darstellung der granulären und fädigen Grundformen des Cytoplasmas nach Os/Cr- und Permanganat­Fixierung zeigt außerdem, daß zuverlässige Angaben über die Dimension dieser Fein­strukturen zur Zeit noch nicht möglich sind. Ihre Existenz ist jedoch auf Grund eingehender Versuche mit verschiedenen anderen Fixierungsmitteln gesichert (WOHLFARTH-BOTTERMANN 1961).

Die eben erwähnten Untersuchungen beziehen sich vorwiegend auf die ekto­plasmatischen Bereiche der kleinen Amöbe Hyalodiscus. Die Fixierung der großen Amöben, wie Amoeba proteus und Chaos Chaos, war bisher immer noch unbefrie­digend, da sich die Grundplasmakomponenten fast nie darstellen ließen.

Bei Amoeba proteus gelang es uns nun, sowohl durch schnelles Abkühlen der Objekte vor der üblichen Os/Cr-Fixation als auch durch eine kombinierte Osmium­tetroxyd-Glutaraldehyd-Behandlung das Grundplasma in allen Bereichen der Zelle gleich gut zu stabilisieren. Die Abb. 1 a-d läßt an vergleichbaren Cytoplasmabereichen den verschieden guten Erhaltungszustand des Grundplasmas nach dem alten (Abb. 1 a) und den neuen Fixierungsverfahren (Abb. 1 b-d) erkennen. Die abgebildeten Amöben sind wie folgt behandelt worden:

a) Fixierung zimmerwarmer Amöben (20° C) mit einem Gemisch von 1°/oigem Osmiumtetroxyd und 1°/oigem Kaliumbichromat (WoHLFARTH-BOTTERMANN 1957)_ Die Lösung wurde mit 2,5 n KOH auf pH 7,2 eingestellt und auf 4° C gebracht.

1) Herrn Professor Dr. K. E. WoHLFARTH-BOTTERMANN danken wir für beratende Hilfe.

Danneel-Weissenfels 89'

b) Schnelles Abkühlen der Amöben bis nahe 0° C durch Einbringen in eine Kühl­truhe von - 25° C für 30 Sek. und anschließende Fixierung nach a).

c) Fixierung zimmerwarmer Amöben (20° C) mit einem Gemisch von 20/o Osmium­tetroxyd, 6,25 o / o Glutaraldehyd und 1 ° / o Phosphorwolframsäure.

Herstellung des Gemisches: Lösung A: 40/o Osmiumtetroxyd + 1°/o Phosphorwolframsäure, mit n KOH auf

auf pH 7,0, 1° C. Lösung B: 12,5 O/o Glutaraldehyd + 1 O/o Phosphorwolframsäure, mit n KOH auf

pH 7,0, 1° C. Gleiche Teile der Lösungen A und B ergeben zusammen das gebrauchsfertige Gemisch; es ist in kühlem Zustand bis zu pH 7 ,0 begrenzt haltbar, nicht aber in alkalischem Milieu. Der Zusatz von 1° / o Phosphorwolframsäure zu den ionen­armen Lösungen ermöglicht das Einstellen des gewünschten pH-Wertes, stabili­siert das Osmiumtetroxyd im Lösungsgemisch und bewirkt zusätzlich eine Kon­traststeigerung der Präparate.

d) Schnelles Abkühlen der Amöben wie unter b) und anschließende Fixierung nach c).

Die Fixierungsdauer betrug jeweils eine Stunde. Nach kurzer Wässerung erfolgte die Entwässerung in der steigenden Aceton-Reihe über acht Stufen und dann die Überführung und Einbettung in Vestopal W.

Außer in Abb. 1 a sind die Elemente des Grundplasmas so dicht gelagert, daß sich die Mitochondrien (M) darin als strukturärmere Bereiche abheben (Abb. 1 b-d). Während die übliche Os/Cr-Fixation zimmerwarmer Amöben zu einer Verarmung der Grundplasmaanteile führt (Abb. 1 a), wird das Cytoplasma durch Kühlung der Objekte vor der Anwendung des gleichen Fixierungsgemisches weit weniger geschädigt und ausgewaschen (Abb. 1 b). Die Möglichkeit kann nicht außer acht gelassen werden, daß mit der Abkühlung der Zellen eine Viskositätsänderung des Plasmas verbunden ist, die sich bei nachfolgender Fixierung in einem veränderten Strukturbild ausprägt. Einen ähnlich guten Effekt wie die Vorkühlung der Amöben hat das Osmiumtetroxyd­Glutaraldehyd-Gemisch (Abb. 1 c). Bei seiner Verwendung erübrigt sich jedoch die Objektvorkühlung, weil sie keine förderliche Wirkung mehr zeigt (Abb. 1 d).

Das neue Fixierungsgemisch ist dem alten vermutlich deshalb überlegen, weil es in sich die guten Eigenschaften des Osmiumtetroxyds und des Glutaraldehyds (SABATINI, BENSCH und BARRNETT 1962) vereinigt. Die Strukturen des Grundplasmas werden dabei allerdings in so dichter Anordnung erhalten, daß man sie im Elektronen­mikroskop manchmal nur schwer voneinander unterscheiden und fokussieren kann. In diesem Falle empfiehlt sich eine Nachkontrastierung der Präparate im Vestopalblocl< (WEISSENFELS und DANNEEL 1965).

BHOWMICK und WoHLFARTH-BOTTERMANN (1965) erreichten kürzlich ebenfalls eine bessere Erhaltung, des Grundplasmas von Amoeba proteus und Chaos Chaos, und zwar durch Konzentrationssteigerung des Os/Cr-Gemisches bis auf 9,5 O/o Osmiumtetroxyd und 4,50/o Kaliumbichromat. Die weitgehende Übereinstimmung der Bilder mit unseren Ergebnissen spricht dafür, daß die Strukturen des Grundplasmas mit den herkömmlichen Fixierungsverfahren bisher wirklich nur unzureichend dargestellt werden konnten.

Nach den guten Erfahrungen an Amöben interessierte uns natürlich noch die Wirkung des Osmiumtetroxyd-Glutaraldehyd-Gemisches auf Vertebratenzellen. Als Versuchsobjekte dienten in diesem Falle Kulturen von Herzmyoblasten 9 Tage alter Hühnerembryonen.

90 Danneel-Welssenfel~

Abb. 1 a-d. Vier vergleidib,are Cytoplasmaaussdinitte von Amoeba proteus nadi folgenden Fixierungsverfahren: a) Gekühltes Os/Cr-Gemisdi auf normale, b) auf vorge­kühlte Amöben, c) gekühltes Omiumtetroxyd-Glutaraldehyd-Gemisdi auf nor­male, d) auf vorgekühlte Amöben. M = Mitodwndrium. Vergrößerung 30.000: 1.

Danneel-Weissenfels 91

Abb. 2 a läßt zunächst erkennen, daß nach der üblichen Os/Cr-Fixierung (WoHLFARTH-BOTTERMANN 1957) alle membranösen Strukturen des Plasmas gut .erhalten und sehr kontrastreich sind, daß die Strukturen des Grundplasmas aber weitgehend fehlen. Bei Verwendung der Osmiumtetroxyd-Glutaraldehyd-Fixierung wird - ähnlich wie bei den Amöben - das granulärfädige Grundplasma deutlich dargestellt (Abb. 2 b), ·während die Membranen der Mitochondrien (M) und des endoplasmatischen Reti­kulums (ER) sowie die Zellmembran (ZM) weniger in Erscheinung treten. Dies ist aber verständlich, weil die Membrananteile des Cytoplasmas gezüchteter Myoblasten

Abb. 2 a und b. Zwei vergleiChbare CytoplasmaaussChnitte von gezüChteten Hühnerherzmyo­blasten: a) NaCh Os/Cr-, b) naCh Osmiumtetroxyd-Glutaraldehyd-Fixierung. M = Mitorizondrium, ER= endoplp,sm.atisChes Retikulum, ZM =Zellmembran. Vergrößerung 30.000: 1.

zur optimalen Darstellung erfahrungsgemäß mit leicht alkalischen Lösungen fixiert werden müssen, eine Forderung, die sich - wie gesagt - beim Osmiumtetröfyd­Glutaraldehyd-Gemisch noch nicht verwirklichen ließ. Auch die Versuche mit Myo­blasten haben also ergeben, daß sich die neue Fixierungsmethode zur Erhaltung des Grundplasmas besonders gut eignet und eine bessere Einsicht in seinen Feinbau ermöglicht.

Zusammenfassung Mit Hilfe eines Osmiurntetroxyd-Glutaraldehyd-Gernisches wird das fädig-granuläre

Grundplasma von Amoeba proteus und von Hühnerherzrnyoblasten in allen Bereichen der Zelle gut fixiert. Mit dem herkömmlichen Os/Cr-Gemisch läßt sich an vorgekühlteirA-möben ein ähnlicher Effekt erzielen. -

Summary The fibrillar and granular groundplasrna of Amoeba proteus as weÜ as of chicken

myoblasts can be w'ell fixed by a rnixture of osmiurntetroxide and glutaraldehyde. When using the conventional Os/Cr-solution the same effect rnay be achieved by precooled amebas.

92 'DanneeJ-Weissenfels

Literatur

Bhowrnick D. K. and Wohlfarth-Botterrnann K. E., An improved method for fixing Amoebae for electron microscopy. Exp. Cell Res. (im Druck). - Kornniek H. und Wohlfarth­Botterrnann K. E., Morphologie des Cytoplasmas. Fortschr. Zoo!. 17 (1964): 1-154. -Moor H. and Mühlethaler K., Fine structure in frozen-etched y'east ceils. J. Cell Bio!. 17 (1963): 609-628. - Sabatini D. D., Bensch K. G. and Barrnett R. 1., New fixatives for cytological and cytochemical studies. In: Electron microscopy. 5. Internat. Congr. Electron Microscopy, Philadelphia, Vol. 2, L-3. New York and London: Academic Press 1962. -Weissenfels N. und Danneel S., Nachkontrastierung elektronenmikroskopischer Präparate im Vestopalblock. Mikroskopie (im Druck). - Wohlfarth-Bottermann K. E., Die Kontrastierung tierischer Zellen und Gewebe im Rahmen ihrer elektronenmikroskopischen Untersuchung an ultradünnen Schnitten. Naturwissenschaften 44 (1957): 287-288. - Derselbe, Protisten­studien X. Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an der Amöbe Hyalodiscus simplex n. sp. Protoplasma 53 (1960): 58-107. - Derselbe, Cytologisclie Studien VII. Strukturaspekte der Grundsubstanz des Cytoplasmas nach Einwirkung verschiedener Fixie­rungsmittel. Untersuchungen am Hyaloplasma von Amöben der Limax- und Proteusgruppe. Protoplasma 53 (1961): 259-290. - Wohlfarth-Botterm,ann K. E. und Schneider L., Fein­strukturveränderungen bei der Sol""' Gel-Transformation des Cytoplasmas. Naturwissen­schaften 45 (1958): 140.

(Manuskript eingelangt am 5. April 1965)

Anschrift der Verfasser: S. Danneel und N. Weissenfels, Zoologisches Institut der Uni­versität, 53, Bonn, Poppelsdorfer Schloß (BRD).

Danneel· Weissenfels 93