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BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM
2021
für Studierende der Humanmedizin und Zahnmedizin
der Universität des Saarlandes
Fachrichtung
MEDIZINISCHE BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE
SKRIPT ZU DEN PRÄSENZPRAKTIKA 1 UND 2
Bitte drucken Sie dieses Skript aus und bringen Sie es zu den
jeweiligen Terminen mit. Bitte beantworten Sie vorab schriftlich die
jeweiligen Vorbereitungsfragen.
2
Liebe Studierende der Human- und Zahnmedizin!
Nachdem im Sommersemester 2020 coronabedingt kein Präsenzpraktikum stattfinden konnte,
freuen wir uns, Ihnen in diesem Sommersemester eine reduzierte Version anbieten zu können.
Unter Beachtung der derzeit gültigen Abstands- und Hygieneregeln haben wir für Sie eine
kleine Auswahl praktischer Übungen zusammengestellt, die einige wichtige Methoden im
biochemischen Labor abbilden. Maßgeblich für die Auswahl der angebotenen Präsenz-
Versuche waren folgende Punkte:
- Orientierung an dem bis zum Zeitpunkt des Praktikums präsentierten Vorlesungsstoff
- die im gesetzten zeitlichen Rahmen mögliche Durchführbarkeit durch einen einzelnen
Studenten (Vermeidung von Gruppenarbeit)
- Durchführbarkeit des Versuchs am Laborplatz (Vermeidung von Laufwegen)
Dieses Skript ist in 3 Blöcke eingeteilt:
I. Voraussetzung
Hier finden Sie Regeln zum experimentellen Arbeiten im Labor. Sie müssen diese vor
Beginn der praktischen Arbeiten lesen und mit Ihrer Unterschrift bestätigen, dass
Sie die darin enthaltene Sicherheitsunterweisung verstanden haben und sich daran
halten werden.
II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2
Im eigentlichen Praktikumsskript finden Sie immer folgende Kapitel:
➔ Theoretische Vorbereitung
Hier finden Sie Empfehlungen zur Vorbereitung und Fragen zur Theorie. Die
Beantwortung der Fragen sind ihre „Hausaufgaben“, die vor Beginn der
Veranstaltung gemacht werden müssen.
➔ Versuchsanleitung
Die Versuchsanleitung sollten sie vor Beginn der praktischen Arbeiten
vollständig durchlesen. Hier finden sie eine Schilderung des Versuchsprinzips, das
„Rezept“ für die Durchführung des Versuches und Vorgaben zur Auswertung der
im Experiment erhaltenen Rohdaten.
Blockpfeile an der linken Seite sollen Ihnen in diesem Teil helfen, die erforderlichen
Arbeitsaufträge zum jeweiligen Praktikum zu finden.
III. Anhang
Hier finden Sie eine Zusammenstellung von Einheiten, Gesetzmäßigkeiten und
Rechenwegen, die Sie zur erfolgreichen Durchführung des Praktikums benötigen und
die Ihnen die Auswertung erleichtern sollen. Dieses Kapitel enthält sowohl
Anleitungen für die Auswertung der Präsenzpraktika als auch der online –
Praktika.
3
Sie werden in diesem Praktikum Methoden durchführen, die für die Analytik von Proteinen
eingesetzt werden bzw. Proteine als Werkzeug für den Nachweis bestimmter Parameter
nutzen; die Auswahl der Versuche orientiert sich an der Relevanz für das medizinisch-
diagnostische Labor. Sie lernen einen Teil der Reaktionen kennen, die hinter den Werten eines
Laborberichts stehen und die mittlerweile in automatisierten Abläufen gewonnen werden. Wir
wollen Ihnen mit dieser Auswahl einen Eindruck vom Arbeiten im biochemischen Labor
vermitteln und darüber hinaus die dazugehörige Theorie etwas anschaulicher gestalten.
Konkret lernen sie eine Methode der Proteinbestimmung kennen wie sie für die Bestimmung
des Gesamtproteingehalts im Serum herangezogen werden kann und die Aussagen über eine
Dysproteinämie zulässt (Praktikum 1). Diese quantitative Bestimmung wird im Praktikum 2
ergänzt durch die Auftrennung des Gesamtserumproteins in seine verschiedenen
Untergruppen, eine gängige Labormethode, um z.B. Hinweise auf entzündliche Prozesse,
Funktionstüchtigkeit der Leber, Defekte im Immunsystem oder Tumoren zu erhalten. Eine
wichtige Gruppe der Proteine unseres Organismus sind die Enzyme, die katalytische Aktivität
entfalten und Stoffwechsel überhaupt erst ermöglichen. Im Praktikum 1 wird die alkalische
Phosphatase im Mittelpunkt stehen, ein Enzym, das bei Erkrankungen der Leber und der
Gallenwege sowie für Veränderungen des Knochenstoffwechsels als Marker dient. Sie lernen
mit diesem Enzym grundlegende Charakteristika einer enzymatischen Reaktion kennen.
Enzyme werden in der medizinischen Diagnostik auch zum sensitiven und spezifischen
Nachweis ihrer Substrate benutzt. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität erfolgt in
photometrischen Messungen, die unter geeigneten Bedingungen mit Hilfe des Lambert-
Beerschen Gesetzes eine Berechnung einer unbekannten Konzentration erlauben. Sie
werden solche enzymatischen Verfahren anhand der Bestimmung der Glucose- und
Cholesterinkonzentration des Serums im Praktikum 2 kennenlernen.
Wir freuen uns auf eine angenehme Zusammenarbeit und wünschen Ihnen viel Erfolg!
Die Dozent*innen der Medizinischen Biochemie und Molekularbiologie
4
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
I. Voraussetzung 4
1. Experimentelles Arbeiten im biochemischen Labor 4
1.1. Sicherheitsunterweisung 4
1.2. Erforderliche Materialien 6
1.3. Weitere Regeln für das Arbeiten im Labor 6
1.4. Handhabungshinweise für Pipetten 7
1.5. Vor Beginn des Praktikums 8
II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2 9
1. Praktikum 1 9
1.1. Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode 10
1.2. Enzyme als Biokatalysatoren – Alkalische Phosphatase 18
2. Praktikum 2 25
2.1. Elektrophoretische Trennung der Serumproteine 26
2.2. Bestimmung von Cholesterin im Serum 33
2.3. Bestimmung von Glucose im Serum 38
III. Anhang 44
1. Rechnen im Biochemischem Praktikum 44
1.1. Physikalische Größen und Einheiten 44
1.2. Stoffmengen und Konzentrationen 46
1.3. Mischen von Lösungen, das Mischungskreuz 49
1.4. Grundlegende statistische Verfahren 51
1.5. Lineare Regression und Korrelationskoeffizient 53
1.6. Wichtige Gleichungen, Herleitungen und Umformung von
Gleichungen
57
1.6.1. Massenwirkungsgesetz und Henderson-Hasselbalch-Gleichung 57
1.6.2. Das Lambert-Beersche Gesetz 60
5
I. Voraussetzung
1. EXPERIMENTELLES ARBEITEN IM BIOCHEMISCHEN LABOR
Dieses Kapitel ist vor der Durchführung des ersten Praktikums zu lesen. Sie müssen
mit Ihrer Unterschrift bestätigen, dass Sie die Sicherheitsunterweisung verstanden
haben und sich daran halten werden.
1.1. Sicherheitsunterweisung (Laborordnung)
1. Den Anweisungen der Lehrkräfte ist unbedingt Folge zu leisten.
2. Während der praktischen Übungen sind Arbeitsmäntel und geschlossene Schuhe zu
tragen.
3. Während der praktischen Übung nicht getragene Kleidungsstücke sind außerhalb des
Praktikumssaals aufzubewahren.
4. Es ist verboten, im Praktikumssaal zu rauchen, zu essen und zu trinken.
5. Die Versuche sind so durchzuführen, dass niemand gefährdet wird.
6. Beim Arbeiten mit konzentrierten Säuren, konzentrierten Laugen und anderen
ätzenden Substanzen ist - auch von Brillenträgern - eine Schutzbrille zu tragen.
7. Vor der Benutzung von leicht brennbaren Flüssigkeiten sind - auch auf benachbarten
Arbeitsplätzen - die Flammen zu löschen.
8. Allgemein zugängliche Geräte wie Photometer, pH-Elektroden, O2-Elektroden,
Zentrifugen, Waagen, Elektrophoresegeräte, Homogenisatoren und Trockenschränke,
sind mit besonderer Sorgfalt zu benutzen.
9. Die Arbeitsplätze, die Arbeitsgeräte und die Ablaufbecken sind nach jeder praktischen
Übung zu reinigen. Benutzte Glaswaren sind in Spülkörbe einzuräumen.
10. Es ist darauf zu achten, dass Wasser, Gas und elektrischer Strom nicht verschwendet
werden.
6
11. Nicht mehr gebrauchte Chemikalien und Chemikaliengemische, die nicht in das
Abwasser gelangen dürfen, sind in bereitstehende Sammelgefäße zu bringen (siehe
Entsorgungshinweise).
12. Unfälle sind der zuständigen Lehrkraft sofort zu melden.
13. Praktikumsteilnehmer haften für die durch sie beschädigten oder zerstörten Geräte.
14. Den Maßnahmen des aktuellen Hygienekonzepts ist unbedingt Folge zu leisten.
Dieses wird in der Sicherheitsbelehrung vorgestellt und liegt in Schriftform im
Praktikumsraum aus.
15. Zuwiderhandlungen gegen diese Ordnung haben den Ausschluss aus der betreffenden
praktischen Übung zur Folge. Das entsprechende Testat wird in diesem Falle nicht
erteilt.
7
1.2. Erforderliche Materialien
Zu den Präsenzpraktika sollten die Praktikumsteilnehmer mitbringen:
1. Schutzkleidung (Kittel)
2. Schutzbrille
3. Schreibzeug, Lineal
4. Taschenrechner
5. 1 wasserfester Folienschreiber
6. Schere und Pinzette
7. Klebestift
Ohne Schutzbrille und Schutzkleidung (Kittel) kann nicht an der Praktikumsveranstaltung
teilgenommen werden.
1.3. Weitere Regeln für das Arbeiten im Labor
Unter Berücksichtigung des Hygienekonzeptes sind alle Laufwege innerhalb des
Praktikumsraumes zu vermeiden. Sie finden alles, was sie für die Durchführung der
Versuche benötigen, an Ihrem zugewiesenen Arbeitsplatz. Sollte dies nicht der Fall sein,
melden sie sich bei Ihrem Betreuer.
- „Richtiges Pipettieren“ beachten (siehe folgende Seite).
- Infektiöse Materialien bitte direkt entsorgen!!!!!! Gelbe Behälter
- Anweisung zur Entsorgung von Chemikalien beachten!!!!
- Reaktionsgefäße (Eppendorfgefäße oder „Eppis“), Reagenzgläser immer beschriften.
- Beschriftung von Materialien, die gespült werden, bitte entfernen!!! An jedem Platz
stehen Behälter für die zu spülenden Waren.
- Abfallbeutel finden Sie an Ihrem Platz.
- Für Glasabfall steht ein gesonderter Sammelbehälter zur Verfügung.
8
1.4. Handhabungshinweise für Pipetten
Eine wichtige Voraussetzung für gutes Gelingen aller Versuche:
Richtiges Pipettieren
Sehr häufig müssen kleine Volumina im Bereich weniger Mikroliter (µl) abgemessen werden.
Dies gelingt am sichersten mit mechanischen Pipettierhilfen, z.B. sogenannten Gilson-
Pipetten, wie hier im Praktikum verwendet.
Beachten Sie die folgenden Regeln und üben Sie den Umgang mit den Pipetten vor dem
Versuch.
1. Niemals das Aufsetzen der Pipettenspitze vergessen!
Druckknopf außerhalb der Flüssigkeit bis zum ersten Druckpunkt niederdrücken.
Pipettenspitze einige Millimeter in die Flüssigkeit eintauchen.
Druckknopf immer langsam in die Ausgangsstellung zurückkommen lassen. Während
dieses „Ansaugens“ der Flüssigkeit die Pipettenspitze immer in der Flüssigkeit belassen.
– Bei größeren Volumina (z.B. 1 ml) muss die Pipettenspitze dem sinkenden
Flüssigkeitsspiegel nachgeführt werden.
Auf der Außenfläche der Pipettenspitze evtl. haftende Flüssigkeitstropfen abwischen!
2. Zum Entleeren der Pipette die Spitze an der Innenwand des Aufnahmegefäßes
Anlegen und den Druckknopf über den ersten Druckpunkt hinaus langsam bis zum
Anschlag niederdrücken.
Pipette nach vollständiger Entleerung zurückziehen und Druckknopf erst loslassen, wenn
sich die Pipettenspitze wieder in der Luft befindet!
3. Pipettenspitze abwerfen!
Achtung!! Neue Spitze für jedes Reagenz!!
Ebenso nach Berührung unterschiedlicher Lösungen mit der Spitze.
4. Niemals Pipetten mit gefüllter Spitze waagerecht halten oder hinlegen!
Pipetten nicht werfen oder fallen lassen, da das Innere aus Glas besteht und deshalb leicht
zerbrechlich ist
9
1.5. Vor Beginn des Praktikums
Checkliste
Sicherheitsunterweisung gelesen und verstanden
Mitzubringende Materialien (siehe S. 6) eingepackt
Regeln für das Arbeiten im Labor und Handhabungsweise für Pipetten gelesen
Komplette Anleitung für das aktuelle Präsenzpraktikum durchgearbeitet
Theoretische Fragen zum aktuellen Praktikum schriftlich beantwortet
Notwendige Vorarbeiten für die Durchführung (z.B. Ausfüllen von Pipettierschemata) erledigt
10
II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2
1. PRAKTIKUM 1
09.04.2021 (Zahnmediziner); 12.04.2021-23.04.2021 (Humanmediziner)
1.1. PROTEINBESTIMMUNG NACH DER BIURET-METHODE
1.2. ENZYME ALS BIOKATALYSATOREN – ALKALISCHE PHOSPHATASE
Ablaufplan:
Inhalt Aufgaben
Vorbesprechung Sicherheitsbelehrung
Theorie des Versuchs
Einweisung zum
Gebrauch von Pipetten
und Photometer durch
die Assistenten
Einstellen von vorgegebenen Volumina durch die
Studenten; Kontrolle der Einstellung durch
Assistenten
Proteinbestimmung Pipettieren von Standards und bereitgestellten
Proben unbekannter Konzentration
Messung der Extinktion
Erstellen der Eichgerade
Enzymkinetik Pipettieren der Ansätze mit 5 zur Verfügung
gestellten Substratlösungen unterschiedlicher
Konzentration; Aufnahme der Enzymkinetik am
Photometer
Nachbesprechung Besprechung der Auswertung
Blockpfeile kennzeichnen Arbeitsaufträge. Die Fragen zu den theoretischen Grundlagen sind
vor Praktikumsbeginn zu beantworten.
11
1.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH DER BIURET-METHODE
Theoretische Vorbereitung
Löffler/Petrides/Heinrich 9. Auflage: Kapitel 1, 3, 4, 5
Vorlesung: Funktionelle Biochemie
Fragen zu den theoretischen Grundlagen:
1. Erklären Sie den Aufbau eines Proteins (Grundbausteine, Peptidbindung, Hierarchie
der Proteinstruktur).
2. Welche Aufgaben haben Proteine?
Wieso? - Weshalb? - Warum?
Im Praktikum 1.1. geht es darum einen wichtigen klinischen Laborparameter zu
bestimmen, die Protein- oder Eiweißkonzentration, wie sie z.B. im klinischen Labor
routinemäßig für Serum oder Plasma ermittelt wird und in Kombination mit der Serum- bzw.
Plasmaelektrophorese (Präsenzpraktikum 2) die Diagnose von Dysproteinämien
ermöglicht.
Im Rahmen dieses Versuches erhalten Sie eine Einführung in die Photometrie als eine
einfache, sehr empfindliche und sehr genaue Messmethode, die in allen klinischen und
biochemischen Laboratorien für zahlreiche Bestimmungen angewendet wird
12
3. Erläutern Sie den Begriff „optischer Test“
4. Nennen Sie das Lambert-Beersche Gesetz, definieren Sie die Größen und ordnen Sie
diesen die passenden Dimensionen (Einheiten) zu.
5. Erläutern Sie die Bedeutung der Protein- oder Eiweißbestimmung in der klinischen
Chemie. Wie hoch ist der Normwert für den Serumproteingehalt und durch welche
Erkrankungen kann er beeinflusst werden?
13
Versuchsanleitung
Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!
Versuchsprinzip
Zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen wird die Biuret-Reaktion
verwendet. Sie hat ihren Namen von der Reaktion zwischen Biuret (bildet sich beim Erhitzen
von festem Harnstoff unter NH3-Abspaltung) und Cu
2+-Ionen in alkalischer Lösung. Dabei
entsteht eine anionische, violette Komplexverbindung. Entsprechende violette Cu2+-Komplexe
werden von allen Substanzen mit mindestens 2 Peptidbindungen gebildet (Abb. 1). Ammoniak,
Harnstoff, Harnsäure, Kreatinin, Aminosäuren und Dipeptide geben keine Biuret-Reaktion.
Abb.1: Cu(II)-Protein-Komplex
Die Farbintensität ist der Zahl der Peptid-Bindungen und damit auch der Proteinkonzentration
proportional. Das Lambert-Beersche Gesetz
E = .c.d
(E = Extinktion, = molarer Extinktionskoeffizient, c = Konzentration, d = Schichtdicke der
Küvette) ist somit anwendbar. Die Biuret - Methode ist wegen ihrer Einfachheit und hohen
Spezifität von besonderer Bedeutung für quantitative Bestimmungen von Proteinen. In diesem
Versuch bestimmen sie die Proteinkonzentration einer zur Verfügung gestellten Serumprobe
mit Hilfe von Eichlösungen bekannter Konzentration.
Zur Bedeutung und zum Umgang mit dem Lambert-Beerschen Gesetz lesen Sie bitte
den Absatz „Das Lambert-Beersche Gesetz“ im Anhang.
Cu2+
14
Vorbereitung:
Üben Sie das Pipettieren mit den am Platz stehenden Pipetten. Stellen Sie nach Vorgabe
unterschiedliche Volumina ein und pipettieren Sie unterschiedliche Mengen einer Flüssigkeit
(Wasser) in unterschiedliche Behältnisse („Eppis“, Reagenzgläser).
Vervollständigen Sie das Pipettierschema für die praktische Durchführung.
Proteinstandardlösung und NaCl Lösung sollen zusammen jeweils 1 ml ergeben!
Ansatz
Nr.
Proteinmenge
[mg]
Probe
[ml]
Proteinstandard
5 mg/ml
[ml]
NaCl
[ml]
Biuret-
Reagenz
[ml]
Extinktion
E546nm
Für die Eichwerte:
1
Leerwert
0 - 2.5
2 1 - 2.5
3 2 - 2.5
4 3 - 2.5
5 4 - 2.5
6 5 - 2.5
Für die Analyse der Serumprobe mit unbekannter Konzentration (Dreifachansatz):
7 ? 1 - - 2.5
8 ? 1 - - 2.5
9 ? 1 - - 2.5
Praktische Durchführung:
Die Proteinkonzentration einer Serumprobe mit unbekannter Konzentration soll bestimmt
werden. Die Serumprobe wurde vorab 20fach verdünnt. Bedenken Sie dies bei der
Berechnung der Konzentration.
1. Pipettieren Sie nach obigem Pipettierschema die Proteinstandardlösungen sowie den
Dreifachansatz der Probe unbekannter Konzentration in Plastikröhrchen zusammen.
Mischen Sie zunächst für alle Proben NaCl- und Proteinlösung. Zuletzt fügen Sie allen
15
Proben das Biuretreagenz mit Hilfe einer Stabpipette hinzu. Verschließen sie das
Röhrchen mit Parafilm und mischen Sie den Ansatz sorgfältig!!
2. Nach dem Pipettieren in Röhrchen und Mischen wird die Reaktionszeit von 15 min
abgewartet.
3. Pipettieren Sie 1 ml des gesamten Ansatzes in Küvetten
4. Mit der ersten (Leerwert)-Probe (Ansatz 1) wird am Photometer der Nullwert eingestellt.
Dann werden sukzessiv die Extinktionen der Ansätze bei 546 nm gemessen. Nicht
vergessen: Deckel des Photometers vor jedem Ablesen schließen!
5. Die genaue Anleitung zur Durchführung der photometrischen Messung befindet
sich an Ihrem Platz!
6. Die Extinktion (Absorption) wird im Display angezeigt. Ablesen und in die obige Tabelle
übertragen.
Entsorgung:
Die Küvetteninhalte sind in an Ihrem Platz bereitstehende Gefäße zu gießen, die
entleerten Küvetten in Abfallbeutel zu entsorgen.
Auswertung:
Tipps zur Auswertung und Beispiel im Anhang, S. 56 („Rechnen im
Biochemischen Praktikum“).
1. Erstellen Sie die Eichkurve für 0, 1, 2, 3, 4 und 5 mg Protein; nutzen Sie das unten
eingefügte Millimeterpapier (formatfüllende Auftragung!). Auf der X-Achse wird die
Konzentration der Lösungen abgetragen, auf der Y-Achse die Extinktion bei 546 nm.
16
2. Legen Sie eine Bestgerade durch die Punkteschar; diese muss auf jeden Fall durch
den Nullpunkt gehen. Die Proteinkonzentration der Serumprobe soll einerseits aus der
Eichkurve abgelesen werden, andererseits mit Hilfe der Geradengleichung
rechnerisch bestimmt werden.
Vorgehensweise zum Erstellen eines aussagekräftigen Diagramms:
- Beschriftung der x-Achse und der y-Achse mit entsprechendem Achsentitel und
passenden Einheiten
- Bestimmen Sie den jeweils kleinsten und größten x- bzw. y-Wert.
- Nutzen sie zur Auftragung der Werte das gesamte Millimeterpapier (formatfüllende
Auftragung), d.h. Null liegt im Schnittpunkt von x- und y-Achse, der größte x- bzw. y-
Wert wird so weit entfernt wie möglich vom Nullpunkt an der entsprechenden Achse
abgetragen.
- Teilen sie die Werte dazwischen entsprechend ein.
17
Die Geradengleichung zur Berechnung der Konzentration der unbekannten Probe lautet:
y = m ∙ x + b
y = E (Extinktion); x = c (Konzentration); b = 0;
m = Steigung =
12
12
cc
EE
x
y
-
-
D
D=
18
3. Wie hoch ist die Proteinkonzentration in mg/ml in der verdünnten Serumprobe? Geben
Sie den Wert in mg/ml und mmol/ml an.
(Legen Sie die Molmasse von Albumin (= 65 000 Dalton) zugrunde.)
abgelesen:
errechnet:
4. Stimmt der Wert mit der Normproteinkonzentration im Serum überein? Bedenken Sie
bei der Berechnung dieser Konzentration, dass die Serumprobe für die Messung
20fach verdünnt wurde.
5. Berechnen Sie, wie viel Gramm Albumin in einem ml einer 0,25 µM Lösung enthalten
sind (Molmasse von Albumin: 65 000 Dalton) (siehe auch: III. Anhang, 1.2.
Stoffmengen und Konzentrationen).
Chemikalien und Lösungen:
1. Biuret-Reagenz: 0.3% (w/v) CuSO4, 0.9% (w/v) K-Na-Tartrat + 0.2% (w/v) KI in 0.2 M
NaOH
2. Standard-Proteinlösung: 5 mg Rinderserumalbumin/ml 0.9% (w/v) NaCl-Lösung
3. Serumprobe mit unbekannter Konzentration zur Proteinbestimmung
4. NaCl-Lösung 0.9% (w/v)
19
1.2 ENZYME ALS BIOKATALYSATOREN – ALKALISCHE PHOSPHATASE
Theoretische Vorbereitung
Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 7 - 9, S. 101 –
129
Vorlesung: Funktionelle Biochemie
Fragen zu den theoretischen Grundlagen:
Was ist ein Enzym, wie ist es aufgebaut (typische funktionelle Einheiten) und welche Wirkung
hat es auf Stoffwechselreaktionen?
Wieso? – Weshalb? – Warum?
Enzyme sind wichtige Werkzeuge des Stoffwechsels. Ohne sie ist Leben – so wie wir es
kennen – nicht denkbar. Das teilweise oder vollständige Fehlen eines Enzyms führt häufig
zu mehr oder minder schweren Defekten, die sogar tödlich verlaufen können. Enzyme sind
ebenfalls wichtige Werkzeuge der Forschung und der medizinischen Diagnostik. Sie
sind dort selbst Gegenstand der Analytik (z.B. Nachweis von Enzymen bei der
Leberfunktions- oder Herzinfarktdiagnostik) oder ermöglichen den sensitiven und
spezifischen Nachweis von Stoffwechselmetaboliten (z.B. Nachweis von Glucose in Serum
und Urin, Nachweis von Cholesterin, siehe Praktikum 2). Um Enzyme sinnvoll und effizient
in der Diagnostik einsetzen zu können, müssen optimale Versuchsbedingungen (z.B.
optimaler pH-Wert, optimale Substratkonzentrationen) geschaffen werden. Dies soll
beispielhaft an der Bestimmung der Abhängigkeit der Umsatzgeschwindigkeit von der
Substratkonzentration (Kinetik) für die alkalische Phosphatase erarbeitet werden.
20
Was versteht man unter einer Enzymkinetik und beschreiben sie zwei Arten der Darstellung
(mathematische Formel, graphische Darstellungen). Was besagen die beiden Kenngrößen
vmax und km? Welche Einheiten haben diese und wo in der o.g. graphischen Darstellung kann
man sie ablesen?
Welche Arten der Hemmung eines Enzyms gibt es (nennen sie mindestens 2)? Wie verändern
sich vmax und km?
Nennen sie Hemmstoffe von Enzymen, die klinisch z.B. zur Krebsbehandlung oder
zur Schmerzbehandlung eingesetzt werden. (2 Beispiele)
21
In welche Hauptgruppe der Enzyme gehört die im Praktikum benutzte alkalische
Phosphatase? Warum spielt dieses Enzym in der medizinischen Diagnostik eine Rolle?
Versuchsanleitung
Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!
Versuchsprinzip
Proteinkinasen und ihre Gegenspieler die Phosphatasen sind an der Regulation zahlreicher
biochemischer Vorgänge beteiligt. Sie übertragen in aller Regel eine Phosphatgruppe von
einem ATP Molekül auf ein Substrat (Proteinkinasen) oder entfernen ein Phosphat von einem
Substrat (Phosphatasen). Die meisten Phosphatasen sind sehr unspezifische Enzyme, welche
die Hydrolyse von Phosphorsäureestern katalysieren (Gleichung (1)).
(1) R-O-PO3H2 + H2O R-OH + H3PO4
Die im Versuch benutzte alkalische Phosphatase ist ein Zink-haltiges Enzym. Sie katalysiert
die Übertragung der Phosphatgruppe des Substrats auf Wasser oder auch auf andere
Substrate. Im Versuch dient p-Nitrophenyl-phosphat (p-NPP) als synthetisches Substrat, das
entsprechend Gleichung (2) gespalten wird.
(2)
22
Das dabei entstehende p-Nitrophenol hat in alkalischer Lösung ein Absorptionsmaximum bei
405 nm, dessen Zunahme photometrisch verfolgt werden kann. Die Bildung des gelb
gefärbten Substrats ist zu Beginn der Reaktion proportional der Geschwindigkeit und damit
der Aktivität des Enzyms.
Da die Reaktionsgeschwindigkeit in der Regel nicht über längere Zeit konstant ist, extrapoliert
man die in den ersten Minuten nach dem Start der Reaktion gemessenen Werte auf die
Anfangs- oder Initialgeschwindigkeit. Nur in diesem Bereich ist eine Anwendung des
Lambert-Beerschen Gesetzes zulässig (siehe unten).
Der Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Lambert-Beerschen
Gesetz ist in Gleichungen (3) und (4) dargestellt:
(3) E = ∙ c ∙ d
(4)
𝒗 =𝜟𝑺
𝜟𝒕=
𝟏
𝜺 ⋅ 𝒅⋅𝜟𝑬
𝜟𝒕
Aus der Bestimmung von E/t (Extinktionsänderung pro Zeit) lässt sich daher über das
Lambert-Beersche Gesetz leicht der Umsatz/Zeit (S/t in [µmol/min]) und damit die
Geschwindigkeit v oder Aktivität des Enzyms berechnen.( und d sind feste Größen).
Als Substrat für die alkalische Phosphatase wird p-Nitrophenylphosphat (NPP) verwendet, bei
dessen Hydrolyse p-Nitrophenol entsteht. Zur Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit wird
die photometrische Messung des entstehenden p-Nitrophenolat-Anions bei 405 nm
herangezogen. Zur Aufnahme der Kinetik werden Messungen mit Substratlösungen mit 5
unterschiedlichen Konzentrationen an NPP durchgeführt.
Vorbereitung:
Pipettierschema zur Herstellung der unterschiedlich konzentrierten Enzym-Substratlösungen:
Vervollständigen Sie das untenstehende Pipettierschema. Gehen Sie bei der Herstellung der
unterschiedlich konzentrierten Substrat-Puffer-Gemische von 1 ml Gesamtvolumen aus! Die
Substratstammlösung ist 0,05 mM.
0,005 mM 0,01 mM 0,015 mM 0,03 mM 0,05 mM
NPP-
Substratlsg.
[ml]
Pufferlsg.
[ml]
23
Praktische Durchführung - Aufnahme einer Enzymkinetik
1. Setzen Sie nach dem obigen Pipettierschema die jeweilige Substrat-Puffer-
Gemische (1 ml) in Reaktionsgefäßen an.
2. Überführen Sie davon 990 µl in Halbmikroküvetten.
3. Stellen Sie mit Hilfe der ausgelegten Bedienungsanleitung für das Photometer das
passende Kinetikprogramm für die Messung ein.
4. Führen sie die Messung durch wie in der ausgelegten Anleitung beschrieben.
5. Führen Sie die Messung mit allen Ansätzen durch. Die Umsatzgeschwindigkeiten
werden ausgehend von der niedrigsten bis zur höchsten Substratkonzentration
bestimmt.
6. Tragen sie die Extinktionsänderung/Zeit (E/min) in die untenstehende Tabelle ein
Tragen sie hier die gemessenen Extinktionsänderungen ein:
[NPP] 0,005 mM 0,01 mM 0,015 mM 0,03 mM 0,05 mM
E/min
24
Auswertung
Berechnen Sie aus den gefundenen Extinktionsänderungen die Aktivität bzw. Geschwindigkeit
des Enzyms. Berechnen Sie 1/v und 1/[S] (mM
für p-Nitrophenol bei 405 nm: 18.5 µmol-1
∙cm2).
(Formel ist im Tabellenkopf angegeben.)
Rechnen Sie die jeweiligen Substratkonzentrationen für die graphische Darstellung in
µM um.
[S]
[µM]
1/[S]
[1/µM]
E/min
Aktivität v
E/min
18.5 x 1
[µmol/min]
1/v
[min/µmol]
25
Bestimmen Sie den vmax und den KM-Wert durch Auftragung der errechneten Werte nach
Lineweaver-Burk.
Denken sie bei der Darstellung des Diagramms an die Tipps von Seite 15!
Chemikalien und Lösungen:
1. Pufferlösung pH 8
2. Substratlösung 0,05 mM
3. Alkalische Phosphatase
26
PRAKTIKUM 2
10.05.2021 (Zahnmediziner); 15.04.2021-07.05.2021 (Humanmediziner)
2.1. ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG DER SERUMPROTEINE
2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM SERUM
2.3. BESTIMMUNG VON GLUCOSE IM SERUM
Ablaufplan:
Inhalt Aufgaben
Vorbesprechung Theorie des Versuchs
Serumelektrophorese 1 Vorbereitung der Elektrophorese; Überführung
bereitgestellter Seren auf die
Celluloseacetatfolie; Starten der Elektrophorese
durch die Assistenten
Cholesterinbestimmung
im Serum
Pipettieren von Standards und bereitgestellten
Serumproben
Messung der Extinktion
Berechnen der unbekannten Konzentration
Serumelektrophorese 2 Entnahme der Celluloseacetatfolie aus der
Elektrophoresekammer; Anfärbung der
getrennten Proteine; Elution des an die Proteine
gebundenen Farbstoffs und Bestimmung der
Konzentration durch photometrische Messung
Glucosebestimmung im
Serum
Pipettieren von Standards und bereitgestellten
Serumproben
Messung der Extinktion
Berechnen der unbekannten Konzentration
Nachbesprechung Besprechung der Auswertung
Blockpfeile kennzeichnen Arbeitsaufträge. Die Fragen zu den theoretischen Grundlagen sind
vor Praktikumsbeginn zu beantworten.
27
2.1. ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG DER SERUMPROTEINE
Wieso? - Weshalb? - Warum?
Das Blutplasma (das ist der nicht korpuskuläre Anteil des Blutes) enthält 7 bis 8.5 Gewicht%
Eiweiß, das ein Gemisch von ca. 90 verschiedenen Proteinen von unterschiedlicher
Konzentration und Funktion darstellt. Einige wichtige Proteine oder Proteingruppen und einige
wichtige Funktionen sind: Albumin (Transport, Osmose), Immunglobuline (Abwehr),
Lipoproteine (Transport), Fibrinogen (Vorstufe eines Gerüstproteins für die Blutgerinnung),
Transferrin (Transport), Antitrypsin (Protease-Hemmstoff), Enzyme und Vorstufen für Enzyme
(Katalyse), Hormone (Regulation). Für die Diagnostik ist die Bestimmung der Konzentration
einzelner Proteine oder Proteingruppen von Bedeutung. Die Konzentration der Serum- und
Plasmaproteine gibt einen ersten Hinweis auf vorliegende Erkrankungen. Bei der Vielzahl
und der Ähnlichkeit der physikalischen und chemischen Eigenschaften verbietet sich wegen
des großen Aufwands die Reindarstellung (Isolierung) und meist auch der spezifische
Nachweis. In solchen Fällen wird ein Trennverfahren (hier die Elektrophorese) mit einem
Gruppennachweis (hier ein Färbereagenz für alle Proteine) kombiniert.
Theoretische Vorbereitung
Löffler/Petrides/Heinrich 9. Auflage: Kapitel 67
Vorlesung: Funktionelle Biochemie
Video zur Serumelektrophorese: https://www.youtube.com/watch?v=z2D7ZkT3aOo
Fragen zu den theoretischen Grundlagen:
Erläutern Sie das Prinzip der Elektrophorese. Welche Faktoren beeinflussen die
Auftrennung von Proteinen?
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Welche Aufgaben haben die Plasmaproteine? Nennen sie von jeder Fraktion mindestens
2 Vertreter mit ihren Funktionen. Wie unterscheiden sich Serum und Plasma?
Erläutern Sie die Begriffe „Dysproteinämie, Hyperproteinämie, Hypoproteinämie,
Paraproteinämie“. Welchen Parameter benötigt die Ärztin/der Arzt zusätzlich zum Ergebnis
der Plasma- bzw. Serumelektrophorese zwingend für die Diagnose einer Dysproteinämie?
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Wie ändert sich die Zusammensetzung der Plasmaproteine bei
1. akuter Entzündung, 2. chronischer Entzündung, 3. Leberzirrhose?
Skizzieren Sie schematisch die zu erwartenden Elektropherogramme im Vergleich zum Serum
eines gesunden Menschen.
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Versuchsanleitung
Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!
Versuchsprinzip:
Die elektrophoretische Auftrennung der Serum- bzw. Plasmaproteine wird routinemäßig für
diagnostische Zwecke herangezogen.
Die Tatsache, dass sich geladene Teilchen in einem elektrischen Feld in Richtung auf die
entgegengesetzt geladene Elektrode bewegen (Elektrophorese), wird zur Charakterisierung
und Trennung von Proteinen verwendet. Wanderungsrichtung und -geschwindigkeit hängen
von der elektrischen Ladung, der Größe der Proteinteilchen sowie von äußeren Bedingungen
wie pH-Wert, Ionenstärke, Art des Puffers und Temperatur ab.
Die hier durchgeführte Elektrophorese auf Celluloseacetatfolie wird auch im Kliniklaboratorium
bei der Untersuchung der Protein-Muster von Plasma, Serum, Liquor und Biopsieproben
eingesetzt. Sie ist vielseitig anwendbar und kann in Kombination mit enzymatischen
Untersuchungen auch zur Erfassung des Isoenzymmusters verwendet werden. Die
routinemäßig durchgeführte elektrophoretische Auftrennung des Blutserums Gesunder ergibt
mindestens 5 Fraktionen: Albumine, 1-Globuline,
2-Globuline, ß-Globuline und -Globuline
(siehe untenstehende Abbildung).
Zur Sichtbarmachung der getrennten Proteinfraktionen (Proteinbanden) mit proteinfärbenden
Farbstoffen dienen in der Regel Amidoschwarz, Bromphenolblau, Coomassie-Blau oder
Ponceaurot. Für die quantitative Auswertung müssen die Farbstoffgehalte proportional dem
Proteingehalt einer Bande sein. Die quantitative Auswertung der angefärbten Proteinbanden
erfolgt meistens durch eine direkte photometrische Analyse. Man erhält dann die relativen
Konzentrationen. Man kann auch, wie in unserem Fall, die relativen Konzentrationen der
angefärbten Proteinfraktionen durch separate Extinktionsmessungen der aus den einzelnen
Proteinbanden erhaltenen Eluate ermitteln.
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Abb.: Elektrophoretische Trennung der Serumproteine
In diesem Praktikum sollen die elektrophoretische Auftrennung in Proteingruppen und deren
prozentualer Anteil am Gesamtserumprotein eines gesunden oder kranken Probanden
bestimmt werden. Das Gesamtprotein wurde im Praktikum 1 quantitativ mit der Biuretmethode
bestimmt und ist integraler Bestandteil der klinischen Bewertung der Plasma- bzw.
Serumelektrophorese.
Praktische Durchführung:
1. Die Celluloseacetatfolie finden sie im Pufferbad. Bitte nehmen sie diese mit Hilfe einer
Pinzette aus dem Puffer und legen Sie den Streifen auf ein Papierhandtuch; streifen
sie die überschüssige Flüssigkeit leicht mit einem Papierhandtuch ab (Achtung: matte
Seite des Streifens muss sichtbar sein (=Trägermaterial), d.h. die abgeschnittene
Ecke rechts oben positionieren (siehe Abbildung unten)). Beschriften Sie den Streifen
mit einem Bleistift (Initialen ihres Namens) am rechten Rand.
Die Streifen dürfen nicht austrocknen!
2. Mit einer Pipette bringt man einen Tropfen (ca. 10 µl) des bereit gestellten Serums
(Bezeichnung notieren!) auf ein Stück Parafilm (Wachsfolie). Nun wird die Doppel-
Lamelle eines Auftragstempels vorsichtig in das Serum eingetaucht und dann zwischen
den Ausstanzungen/Faltkanten (nahe der Ausstanzung/Faltkante auf der rechten
Seite) der Folie leicht aufgedrückt (siehe Abbildung).
Auftragstelle →
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3. Die Folie wird jetzt mit der Auftragstelle des Serums zum Minuspol in die
Trennkammer eingelegt, beide Enden der Folie müssen im Pufferbad liegen.
Den Deckel der Kammer auflegen und anschließend die Elektroden mit der
Stromquelle (200 V Gleichstrom) verbinden. (60 min Laufzeit).
Unfallverhütungsvorschrift: Das Ein- und Ausschalten des Stroms darf nur von
der Lehrkraft vorgenommen werden.
4. Während der Laufzeit der Elektrophorese führen Sie den Versuch zur
Cholesterinbestimmung (2.2) durch.
5. Bereiten Sie die Röhrchen für die Elution vor (siehe Schritt 8.)
6. Nach 60 min wird der Strom ausgeschaltet, die Folie aus der Kammer
herausgenommen und 3 min in der Färbelösung langsam hin und her bewegt.
7. Dann wird die Folie 3 min im Entfärbebad langsam hin und her bewegt bis nur noch die
rote Farbe der Protein-Fraktionen zu sehen ist.
8. Die angefärbten Protein-Fraktionen werden von dem am besten auswertbaren Streifen
(diese Folie darf nicht austrocknen) direkt sorgfältig ausgeschnitten und jeweils
getrennt in ein vorher beschriftetes Röhrchen gebracht.
9. Man gibt 3 ml Elutionslösung zu.
10. Nach 10minütigem gelegentlichem Schwenken misst man nach Überführen von 1 ml
Eluat in eine Halbmikroküvette die Extinktion der Eluate bei 546 nm gegen die
Elutionslösung (Leerwert). Bitte darauf achten, dass die Folienreste nicht in die Küvette
gelangen.
Richten sie sich bei der photometrischen Messung nach der an ihrem
Platz ausliegenden Anleitung!
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Auswertung
Ermitteln Sie die Anzahl, die Wanderungsrichtung und die relativen prozentualen Anteile der
elektrophoretisch aufgetrennten Plasma-Proteinfraktionen. Ordnen Sie die getrennten
Proteinbanden nach fallenden Wanderungsgeschwindigkeiten den aus der Literatur
bekannten Fraktionen zu. Bewerten Sie das Ergebnis. Handelt es sich um das Serum einer
gesunden oder kranken Person? Woran könnte diese Person gegebenenfalls leiden?
Chemikalien und Lösungen:
1. Spezialfolie für Elektrophorese
2. Pufferbad
3. Färbelösung: Ponceaurot in 3% (w/v) Trichloressigsäure (TCA)
4. Entfärbelösung: 5% (v/v) Essigsäure
5. Elutionslösung (NaOH)
6. bereitgestelltes Serum eines gesunden oder kranken Probanden
(es handelt sich nicht um das Serum aus Versuch 1!)
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2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM SERUM
Wieso? - Weshalb? - Warum?
Cholesterin gehört chemisch gesehen zu den Isoprenlipiden und wird in allen Zellen unseres
Körpers benötigt; es spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung von Gehirnzellen, Nervenzellen
und bestimmten Hormonen. Ein zu hoher Cholesteringehalt im Blut (Hypercholesterinämie) ist
einer der Hauptrisikofaktoren für Erkrankungen der Herzkranzgefäße, in deren Folge es zu
einem Herzinfarkt oder einem Schlaganfall kommen kann. Zusammen stellen diese
Krankheiten die Haupttodesursache in Europa dar. Die Bestimmung des Cholesteringehalts
im Serum, entweder als Gesamtcholesterin wie im folgenden Versuch oder differenziert nach
dem an die Trägerlipoproteine LDL und HDL gebundenen Cholesterin, stellt ein
Standardverfahren im medizinisch-diagnostischen Labor dar.
Theoretische Vorbereitung
Vorlesung: Energiestoffwechsel Lipide
Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage, Kapitel 23
Fragen zu den theoretischen Grundlagen:
Wie hoch sind die Normwerte für den Cholesteringehalt des Serums? Ab welchem Wert spricht
man von einer Hypercholesterinämie?
Schildern Sie die Biosynthese des Cholesterins bis zum aktiven Isopren (danach nur noch
Prinzipien erläutern). Welches ist das regulatorische Enzym der Cholesterinbiosynthese? Wie
erfolgt die Regulation?
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Wie wird Cholesterin im Blut transportiert? Welche Bedeutung hat in diesem Zusammenhang
das Enzym Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT).
Versuchsanleitung
Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!
Versuchsprinzip
Etwa 70% des Cholesterins liegen im Serum als Ester höherer Fettsäuren (überwiegend
Linolsäure) vor. Die Bestimmung des Cholesterins erfolgt mit Hilfe der Cholesterinoxidase (Gl.
(2)) nach Freisetzung des Cholesterins aus seinen Estern mittels der Cholesterinesterase (Gl.
(1)). Wasserstoffperoxid bildet mit Phenol und 4-Amino-phenazon einen roten Farbstoff (Gl.
(3)), der photometrisch erfasst wird.
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Cholesterinesterase
(1) Cholesterinester + H2O Cholesterin + Fettsäure
z.B.:
Palmitoyl-Cholesterin Cholesterin Palmitinsäure
Cholesterinoxidase
(2) Cholesterin + O2 4-Cholestenon + H2O2
Peroxidase
(3) 2 H2O2 + 4-Aminophenazon + Phenol 4-(p-Benzochinon-
monoimino)-phenazon + 4 H2O
Praktische Durchführung
Das Gesamtcholesterin des Serums wird mit Hilfe nachfolgender Vorschrift bestimmt:
1. Verwenden Sie die Serumproben (A, B), die für Sie am Arbeitsplatz bereitstehen.
2. Pipettieren sie die Proben nach folgendem Schema. Vergessen Sie nicht die Ansätze
gut zu durchmischen!
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Angaben pro Reaktion; insgesamt 4 Reaktionen (1 Leerwert, 2 Serumproben,
1 Standard) ansetzen:
Leerwert
Probe
Standard
Serumprobe (A, B) − 0,01 ml −
Reagenzlösung zur
Cholesterinbestimmung 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml
Standard − − 0,01 ml
3. Gut mischen; die Ansätze 20 min bei 25°C (Raumtemperatur) inkubieren. Direkt nach
der Inkubation oder spätestens nach 40 min Extinktion der Analyse und des Standards
gegen den Leerwert bei 546 nm messen.
4. Lesen sie die Extinktion ab, nachdem sie mit Hilfe des Leerwerts den Nullabgleich
durchgeführt haben.
Richten sie sich bei der photometrischen Messung nach der an ihrem Platz
ausliegenden Anleitung!
Extinktion Standard:
Probe A:
Probe B:
Auswertung
Die Bildung des roten Farbstoffs ist direkt proportional zur eingesetzten
Cholesterinkonzentration. Die Konzentration könnte daher mit Kenntnis des
Extinktionskoeffizienten für den gebildeten Farbstoff mit Hilfe des Lambert-Beerschen
Gesetzes berechnet werden. Zur einfacheren Auswertung im Laboralltag wird bei dieser
Messung jedoch die Extinktion eines Standards mit bekannter Konzentration gemessen und
dieser ins Verhältnis zur Extinktion der unbekannten Probe gesetzt. Zur Berücksichtigung der
eingesetzten Verdünnung und Umrechnung in die jeweiligen Einheiten mg/dl bzw. mmol/l wird
der Wert noch mit einem Faktor F multipliziert (siehe Formel in der untenstehenden Tabelle)
(weitere Erklärung zum Faktor F siehe auch III. Anhang, 1.6.2. Das Lambert-Beersche
Gesetz).
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Die Konzentration des Cholesterins in den Proben wird wie folgt berechnet:
mg / 100 ml mmol / l
Cholesterin-Konzentration 200 x Ext. Probe /
Ext. Standard
Standard
5,3 x Ext. Probe /
Ext. Standard
Standard
Wie hoch sind die Cholesterinwerte (mg / 100 ml und mmol / l) in den beiden Proben?
Probe A:
Probe B:
Wie beurteilen Sie die gemessenen Werte? Welche sind als pathologisch zu betrachten?
Chemikalien und Lösungen:
1. Reagenzien zur Cholesterinbestimmung
2. Cholesterinstandard
3. 2 verschiedene Seren zur Analyse (A, B)
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2.3. BESTIMMUNG VON GLUCOSE IM SERUM
Wieso? – Weshalb? – Warum?
Die Einhaltung einer Glucosehomöostase - also das Einstellen eines in engen Grenzen
schwankenden Blutzuckerwertes - ist wichtig für das Überleben obligat Glucose-abhängiger
Gewebe auch in Zeiten der Nahrungskarenz. Durch konzertierte Aktion des
blutzuckersenkenden Hormons Insulin und seiner blutzuckersteigernden Antagonisten
(Glucagon, Adrenalin, Cortisol) wird im gesunden Menschen ein konstanter Blutzuckerwert
von ca. 5 mM Glucose (90 mg/dl) erreicht. Für den Nachweis von Glucose in Serum oder Urin
werden enzymatische Verfahren angewendet, die einen höchst sensitiven und spezifischen
Nachweis erlauben. Sie lernen als Beispiel in diesem Praktikum den Nachweis von Glucose
mit Hilfe der Glucose-Dehydrogenase-Methode kennen. Im online-Praktikum wird Ihnen dieser
Test im Zusammenhang mit dem oralen Glucosetoleranztest wieder begegnen. Der orale
Glucosetoleranztest (Zuckerbelastungstest, kurz auch oGTT) dient dem Nachweis einer
gestörten Glucoseverwertung wie sie z.B. im Diabetes mellitus vorliegt.
Theoretische Vorbereitung
Vorlesung: Energiestoffwechsel Kohlenhydrate
Vorlesung: Funktionelle Biochemie
Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 7, Kapitel 9
Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 14 + 15
Fragen zu den theoretischen Grundlagen:
Glucose ist ein für den Menschen wichtiges Kohlenhydrat. Charakterisieren Sie dieses
wichtige Kohlenhydrat (funktionelle Gruppen, systematische Einordnung, mögliche
Reaktionen). Nennen Sie die Summenformel und schreiben die Strukturformel der -D-
Glucose in der Fischer-Projektion und der Haworth-Schreibweise auf.
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Erklären Sie den Begriff „Glucosehomöostase“. In welchem Bereich sollten sich in einem
gesunden Menschen die Blutzuckerwerte (mg/dl und mmol/l) einpendeln? Warum ist
Glucosehomöostase wichtig?
Welche 2 weiteren (neben der hier verwendeten: Glucose-Dehydrogenase-Bestimmung)
Bestimmungsmethoden der Glucose im Serum/Urin kennen Sie?
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Versuchsanleitung
Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!
Versuchsprinzip
In zur Verfügung gestelltem Serum wird der Glucosegehalt mit Hilfe der Glucose-
Dehydrogenase-Methode bestimmt.
Glucosedehydrogenase (Glc-DH.) katalysiert die Oxidation von Glucose:
Glc-DH
β-D-Glucose + NAD+ D-Gluconolacton + NADH + H+
Sie führen damit einen sog. optischen Test nach Warburg durch. Der Nachweis stützt sich auf
die Enzymaktivität NAD+/NADH oder NADP+/NADPH-abhängiger Oxidoreduktasen. Im Verlauf
der Reaktion bilden oder verbrauchen sich die reduzierten Reduktionsäquivalente NADH oder
NADPH. Im vorliegenden Fall ist sicher gestellt, dass die Reaktion vollständig von links nach
rechts, also zugunsten des D-Gluconolacton und NADH abläuft. Da sich die optischen
Eigenschaften von NADH und NADPH durch eine spezifische Lichtabsorption bei einer
Wellenlänge von 340 nm (Absorptionsmaximum) von denen des NAD+ und NADP+
unterscheiden, lassen sich Änderungen der Konzentrationen der oxidierten bzw. reduzierten
Formen dieser Cosubstrate photometrisch leicht ermitteln. Die Abnahme bzw. Zunahme der
Extinktion ist dem Verbrauch bzw. der Bildung von NADH proportional und spiegelt damit den
zeitlichen Verlauf oder die Kinetik der enzymkatalysierten Reaktion wider. Das Messprinzip
wird daher auch als kinetisch-optischer Test bezeichnet. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen
Gesetzes und Kenntnis des Extinktionskoeffizienten für NADH lässt sich nach Messung der
Extinktion auch auf eine unbekannte Konzentration (hier: Glucose) rückrechnen. Da pro Mol
oxidierter Glucose 1 Mol reduziertes NADH gebildet werden, entspricht die Konzentration an
NADH derjenigen von Glucose. Wie im Versuch 2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM
SERUM wird auch hier ein Referenzwert (Standard) mitgeführt, mit dessen Hilfe über
Dreisatzrechnung die unbekannte Konzentration in der Serumprobe ermittelt werden kann.
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Praktische Durchführung
Wichtig:
Nicht alle Proben gleichzeitig ansetzen, da die Reaktion direkt startet!
Sondern: Einen Ansatz zusammen pipettieren (nach dem Schema in der
untenstehenden Tabelle), Inkubationszeit abwarten, messen und dann mit der nächsten
Probe beginnen!!!
1. Pipettieren Sie nach folgendem Pipettierschema unmittelbar vor der Messung die
Reaktionsansätze in einer Halbmikroküvette zusammen. Gut mischen! Beginnen
Sie mit dem Standard!
Probe Standard
Reagenzlösung 1000 µl 1000 µl
Serum 10µl -
Standardlösung 100mg/dl - 10 µl
2. Gemessen wird bei 340 nm. Stellen sie eine Stoppuhr auf 4 Minuten ein. Stellen Sie
die Küvette ins Photometer. Warten Sie 2 Minuten Inkubationszeit ab und lesen
Sie die Extinktion ab, ebenso nach jeder weiteren Minute bis die 4 Minuten beendet
sind. Mit dieser Vorgehensweise erhalten Sie mehrere Werte aus dem Bereich der
Initialgeschwindigkeit dieser enzymatischen Reaktion. Nur in diesem Bereich
ermöglicht die Anwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes, das der vereinfachten
Auswertung (siehe „Auswertung“) zugrunde liegt, die zuverlässige Bestimmung der
Glucosekonzentration.
3. Tragen sie die jeweiligen Extinktionen in die untenstehende Tabelle ein.
E340 nm
nach 2 min
E340 nm
nach 3 min
E340 nm
nach 4 min
Standard
Probe A
Probe B
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Auswertung
Bilden Sie die Differenz der Extinktionen zwischen 3 und 2 Minuten und die Differenz zwischen
4 und 3 Minuten. Aus diesen 2 Differenzen bilden sie bitte den Mittelwert, dies ist ihr ΔE
(genauer: E/min). Tragen Sie die Werte in die folgende Tabelle ein:
Differenz 1
Extinktion
nach 3 min –
Extinktion
nach 2 min
Differenz 2
Extinktion
nach 4 min –
Extinktion
nach 3 min
Mittelwert
aus Differenz 1
und Differenz 2
E
Standard
Probe A
Probe B
Die Glucosekonzentration in der Blutprobe ergibt sich aus folgendem Dreisatz, der die
gemessene Extinktionsdifferenz einer Probe mit bekannter Konzentration ins Verhältnis setzt
zur gemessenen Extinktionsdifferenz der unbekannten Konzentration der Blutprobe.
Glucose-Konzentration (Blutprobe): Standardkonzentration x ΔE Probe [mg/dl]
ΔE Standard
Tragen Sie die Extinktionsdifferenzen und die daraus berechneten Glucosekonzentrationen
[mg/dl] ein.
Glucosekonzentration
[mg/dl]
Probe A
Probe B
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Bewerten Sie die gemessenen Glucosekonzentrationen in den verschiedenen Seren.
Chemikalien und Lösungen:
1. Reagenz zur Glucosebestimmung
2. Glucose-Standard 100 mg/dl
3. verschiedene Seren zur Analyse (A, B)
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III. Anhang
Im Folgenden finden Sie eine Zusammenstellung von Einheiten, Gesetzmäßigkeiten und
Rechenwegen, die Sie zur erfolgreichen Durchführung des Praktikums benötigen und die
Ihnen die Auswertung erleichtern sollen. Dieses Kapitel enthält sowohl Anleitungen für die
Auswertung der Präsenzpraktika als auch der online – Praktika.
1. RECHNEN IM BIOCHEMISCHEN PRAKTIKUM
Im Verlauf des Praktikums werden oftmals Konzentrationen von Massen (z.B. in µg Protein
pro ml) oder Molaritäten (z.B. in mmol einer Säure pro Liter) experimentell bestimmt. Die
tatsächlich gesuchte Größe ist dann aber nicht das primäre Ergebnis selbst, sondern bei einem
Protein z.B. die Serumkonzentration, so dass die gefundene Masse noch in Bezug zum
jeweiligen Volumen gesetzt werden muss. Da die Einheiten in der Regel vorgegeben sind, um
sinnvolle Vergleichswerte zu erhalten, müssen die zunächst erhaltenen Einheiten noch
umgerechnet oder Verdünnungsfaktoren berücksichtigt werden. Hierzu ist es notwendig zu
wissen, wie man verschiedene Einheiten ineinander überführen kann. In manchen Versuchen
werden auch grundlegende statistische Verfahren wie die Bildung von Mittelwerten und
Standardabweichungen oder die lineare Regression benötigt. Das Ziel dieses Praktikums ist
es, die Zusammenhänge zwischen verschiedenen physikalischen Größen zu erklären und das
für das Praktikum notwendige "Rechenrüstzeug" mit auf den Weg zu geben.
1.1 Physikalische Größen und Einheiten
In der Physik gelten zur Beschreibung unterschiedlicher Basisgrößen wie Länge, Masse etc.
Internationale Einheiten (Systeme International d'Unites, abgek.: SI) mit standardisierten
Symbolen und Basiseinheiten. Die wichtigsten SI-Einheiten sind in Tabelle 1
zusammengefasst.
Basisgrößen Symbole Basiseinheiten (Zeichen)
Länge l Meter (m)
Masse M Kilogramm (kg)
Zeit t Sekunde (s)
Elektr. Stromstärke I Ampere (A)
Stoffmenge n Mol (mol)
Tabelle 1: SI-Einheiten (aus Hellenthal, Physik für Mediziner, 5. Auflage 1997)
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Um Bruchteile oder Vielfache dieser Basisgrößen anzugeben, werden Vorsilben verwendet
und der jeweiligen Basiseinheit eine Kurzbezeichnung vorangestellt.
Vorsilbe Kurzbezeichnung Zehnerpotenz Beispiele
Piko p 10-12 Pikofarad
Nano n 10-9 Nanometer
Mikro µ 10-6 Mikromol
Milli m 10-3 Milligramm
Zenti c 10-2 Zentimeter
Dezi d 10-1 Deziliter
Hekto h 102 Hektopascal
Kilo k 103 Kilometer
Mega M 106 Megahertz
Giga G 109 Gigahertz
Tabelle 2: Bruchteile und Vielfache von Einheiten
Von den Grundeinheiten werden abgeleitete Größen und Einheiten gebildet. So wird das
Volumen in m3 angegeben, also von der SI-Einheit m abgeleitet, die Geschwindigkeit wird in
m*s-1 angegeben, also von den SI-Einheiten m und s abgeleitet. Umgangssprachlich werden
aber oft auch andere Einheiten wie km*h-1 statt m*s-1 verwendet, da diese Größen schon lange
in Verwendung sind und somit besser mit anderen Angaben verglichen werden können. Dies
trifft insbesondere auch auf die medizinische Labordiagnostik zu, wo Angaben z.B. in g*dl-1
statt in kg*m-3 gemacht werden. Durch die Verwendung solcher nicht-SI-Einheiten wird oft
auch der Umgang mit besonders großen oder besonders kleinen Zahlen vermieden. Um die
unterschiedlichen Einheiten ineinander umzurechnen, reicht in der Regel die Kenntnis der in
Tabelle 1 und 2 aufgeführten Größen und Vorsilben aus.
Beispiele:
(1) 50 km*h-1 = 50 000 m*h-1 = 50 000 m * (3600 s)-1 = 13.89 m*s-1
(2) 50 m*s-1 = 0.05 km*s-1 = 0.05 km * (0.000278 h)-1 = 180 km*h-1
(3) 180 g*dl-1 = 0.180 kg*dl-1 = 0.180 kg*(0.1 l)-1 = 0.180 kg*(0.1 dm3)-1 =
0.180 kg * (0.0001 m3)-1 = 0.180 kg * 0.0001 m-3 = 1 800 kg*m-3 (oder 1 800 g/l)
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1.2. Stoffmengen und Konzentrationen
Weiter ist es oft notwendig, aus Konzentrationsangaben Stoffmengen zu berechnen oder
umgekehrt aus Stoffmengen und Volumen eine Konzentration zu ermitteln. Die
Konzentrationen werden in der Regel in "molar" angegeben und mit "M" abgekürzt, wobei eine
1 molare Lösung einer Substanz 1 mol*l-1 enthält.
Beispiele:
(1) Wie viel mol (mmol, µmol) NaOH sind in 100 ml einer 0.05 molaren Lösung enthalten?
0.05 molar = 0.05 mol*l-1
100 ml = 0.1 l
0.05 mol*l-1 * 0.1 l = (0.05*0.1) mol*l-1 * l = 0.005 mol (= 5 mmol = 5 000 µmol)
In 100 ml einer 0.05 molaren NaOH-Lösung sind 0.005 mol (5 mmol, 5 000 µmol)
NaOH enthalten.
(2) Wieviel g NaCl muss man in 300 ml Wasser lösen, um eine 0.5 M Lösung zu erhalten,
wenn 1 mol NaCl eine Masse von 58.44 g haben (58.44 g*mol-1)?
eine 0.5 M Lösung NaCl enthält 0.5 mol*l-1
300 ml = 0.3 l
0.5 mol*l-1 * 0.3 l = (0.5*0.3) mol*l-1 * l = 0.15 mol
→ 300 ml einer 0.5 M NaCl-Lösung enthalten 0.15 mol NaCl
58.44 g*mol-1 * 0.15 mol = (58.44*0.15) g*mol-1*mol = 8.766 g
Man muss 8.766 g NaCl einwiegen und auf 300 ml mit Wasser auffüllen, um eine 0.5 M
Lösung zu erhalten.
In der zweiten Aufgabe ist die Angabe aufgetaucht, welche Masse 1 mol einer Substanz hat.
Diese Angabe wird als molare Masse bezeichnet und mit Mr abgekürzt. Die Einheit für die
molare Masse ist Dalton (Da), dabei gilt 1 Dalton = 1 g*mol-1. Die molare Masse eines
Moleküls setzt sich aus den molaren Massen der im Molekül vertretenen Atome zusammen.
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Beispiel:
(1) Wie ist die molare Masse von MgCl2?
Atomgewicht Mg: 24.305 g*mol-1, Atomgewicht Cl: 35.453 g*mol-1
molare Masse von MgCl2 = 24.305 + (2*35.453) = 95.211 g*mol-1
Kennt man die molare Masse einer Substanz und ihre molare Konzentration, so kann man von
der molaren Konzentration (= Stoffmengenkonzentration) in eine Massenkonzentration
umrechnen.
Beispiel:
(1) Wieviel mg*dl-1 Creatinin enthält eine 80 µM Lösung (Mr Creatinin = 113 Da)?
eine 80 µM Lösung Creatinin enthält 80 µmol*l-1 = 0.08 mmol*l-1 = 0.00008 mol*l-1
0.00008 mol*l-1 * 113 Da (g*mol-1) = (0.00008 * 113) mol*l-1*g*mol-1
= 0.00904 g*l-1
0.00904 g*l-1 = 9.04 mg*l-1
→ in einem Liter der Lösung sind 9.04 mg Creatinin enthalten
1dl = 0.1 l
→ in einem dl der Lösung sind 0.904 mg Creatinin enthalten.
Die Massenkonzentration der Lösung beträgt 0.904 mg*dl-1.
Neben Stoffmengenkonzentrationen und Massenkonzentrationen wird die Konzentration -
insbesondere, aber nicht ausschließlich von Flüssigkeiten in Flüssigkeiten - oft auch in Prozent
angegeben. Dabei muss zwischen Volumenprozent und Massenprozenten unterschieden
werden. So besagt die Angabe "Dieser Wein beinhaltet 10 Vol-% Alkohol", dass in 100 ml des
Weines 10 ml reiner Alkohol enthalten sind, was aber nicht gleichbedeutend ist mit 10 g reinen
Alkohols. Die Angabe Vol-% und Gew-% stimmt nur dann überein, wenn die gelöste Substanz
und das Lösungsmittel die gleiche Dichte haben. Die Dichte einer Substanz gibt das Verhältnis
zwischen Masse und Volumen an.
Dichte = Masse * Volumen-1 [kg*m-3]
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Neben der Dichte wird oft auch die relative Dichte im Bezug auf die Dichte von Wasser im
Normalzustand (bei 3.98°C) angegeben. Die relative Dichte stellt daher ein Verhältnis zweier
Größen der gleichen Einheit dar und ist somit selbst ohne Einheit. Die Dichte einiger
Flüssigkeiten ist in der folgenden Tabelle exemplarisch dargestellt.
Tabelle 3: Dichte und relative Dichte einiger Flüssigkeiten
Material Dichte
[kg*m-3]
Formel rel. Dichte
[bez. auf Wasser bei
3.98°C]
Ethanol 789 C2H5OH 0.789
Aceton 791 C3H6O 0.791
Methanol 793 CH3OH 0.793
Wasser (3.98°C) 999.975 H2O 1.000
Meerwasser 1025 - 1.025
Milch 1030 - 1.030
Essigsäure 1049 C2H4O2 1.049
Schwefelsäure 1834 H2SO4 1.834
Quecksilber 13546 Hg 13.546
Bei Kenntnis der Dichte oder der relativen Dichte können nun Volumen- in Gewichtsprozente
umgerechnet werden bzw. der absolute Massengehalt aus der Angabe der Volumenprozente
berechnet werden.
Beispiele:
(1) Wie viel Gramm reiner Alkohol sind in 330 ml einer alkoholischen Lösung mit 4.7 Vol%
Alkohol (Ethanol) enthalten?
330 ml * 4.7 % = 330 ml * 0.047 = 15.51 ml
15.51 ml = 15.51 cm3 (= 0.01551 dm3 = 0.00001551 m3)
789 kg*m-3 = 789 g*dm-3 = 0.789 g*cm-3 = 0.789 g*ml-1
15.51 ml * 0.789 g*ml-1 = 12.237
In 330 ml einer alkoholischen Lösung mit 4.7 Vol-% sind 12.237 g reiner Alkohol enthalten.
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Exkurs: Blutalkoholkonzentration (BAK)
Zur Bestimmung der Blutalkoholkonzentration gibt es verschiedene Formeln. Die einfachste
ist wohl die Formel von Widmark, mit der die theoretische maximale Blutalkoholkonzentration
berechnet werden kann. Die Formel lautet:
c = A * (m*r)-1
Dabei ist c die Blutalkoholkonzentration, A die aufgenommene Masse des Alkohols in g, m die
Masse der Person in g und r ein Verteilungsfaktor, der für Männer 0.68 bis 0.70, für Frauen
0.55 bis 0.60 und für Säuglinge/Kleinkinder 0.75 bis 0.80 beträgt. Die maximale
Blutalkoholkonzentration (BAK) nach dem Genuss von 12.237 g Ethanol beträgt demnach
(1) bei einem 75 kg schweren Mann: 12.237 g * (75 000 g * 0.68)-1 = 0.24‰
(2) bei einer 50 kg schweren Frau: 12.237 g * (50 000 g * 0.55)-1 = 0.44‰
(3) bei einem 15 kg schweren Kleinkind: 12.237 g * (15 000 g * 0.75)-1 = 1.09‰
Neben der genannten Formel gibt es noch weitere wesentlich genauere
Berechnungsmethoden, die neben der Verteilung des Alkohols im Körper auch noch die
Resorption und den Abbau berücksichtigen. Die hier gezeigte Berechnung gibt daher nicht den
tatsächlichen Blutalkoholgehalt an, sondern einen Richtwert für die maximal erreichbare BAK
mit einer bestimmten Masse Alkohol.
1.3. Mischen von Lösungen, das Mischungskreuz
Ein häufig vorkommendes Problem beim Umgang mit Lösungen unterschiedlicher
Konzentration ist das Mischen vorhandener Lösungen, um eine Lösung mit einer gewünschten
Zielkonzentration zu erhalten. Zur Bestimmung des Verhältnisses, in dem solche Lösungen
gemischt werden müssen, kann das sogenannte Mischungskreuz verwendet werden. Dieses
ist wie folgt aufgebaut:
51
Abbildung: Mischungskreuz, beachte: Konzentration a < Konzentration c
a und c sind die Ausgangskonzentrationen, b ist die Zielkonzentration, weiter
ist die Differenz c-a der Ausgangskonzentrationen auf der linken Seite gleich
der Summe der Anteile (c-b) + (b-a) auf der rechten Seite!
Beispiele:
(1)Sie sollen 500 ml einer 10 Vol-%igen EtOH-Lösung herstellen. Wieviel ml 50 Vol-%ige
Lösung müssen Sie mit wieviel ml 5 Vol-%iger Lösung mischen?
Schritt 1: Ermitteln des Mischungsverhältnisses von a und c
Konz. a = 5 Vol-%; Konz. c = 50 Vol-%; Konz. b = 10 Vol-%
c - b = 50 - 10 = 40 => 40 Anteile Lösung mit Konz. a
b - a = 10 - 5 = 5 => 5 Anteile Lösung mit Konz. c
Schritt 2: Ermitteln der Volumenanteile von a und c
Gesamtvolumen = 500 ml; Gesamtanteile = 45
500 ml * 45-1 = 11.11 ml pro Anteil
5 Anteile entsprechen 5 * 11.11 ml = 55.55 ml
40 Anteile entsprechen 40 * 11.11 ml = 444.45 ml
Es müssen 444.45 ml 5 Vol-%ige Lösung mit 55.55 ml 50 Vol-%iger Lösung gemischt
werden, um 500 ml 10 Vol-%ige Lösung zu erhalten.
(2) Sie mischen 5 Teile einer 50 mM NaCl-Lösung mit 3 Teilen einer 500 mM NaCl-
Lösung. Welche Konzentration erhalten Sie?
Schritt 1: Ermitteln der Differenz der beiden gegebenen Konzentrationen a und c
c-a = 500 mM - 50 mM = 450 mM
52
Schritt 2: Aufteilen von 450 im Verhältnis 5:3
450 : 8 = 56.25
56.25* 5 = 281.25 = Anteile Lösung 1 = c - b Anteile
56.25* 3 = 168.75 = Anteile Lösung 2 = b - a Anteile
Schritt 3: Ermitteln der Zielkonzentration
c - b = 500 - b = 281.25 <=> b = 500 – 281.25 = 218.75 oder
b - a = b - 50 = 168.75 <=> b = 168.75 + 50 = 218.75
Man erhält eine Lösung mit einer NaCl-Konzentration von 218.75 mM.
1.4 Grundlegende statistische Verfahren (Mittelwert, Varianz, Signifikanztest)
Wissenschaftliche Taschenrechner bieten in der Regel diese Funktionen; das folgende Kapitel
soll Ihnen die Hintergründe und Grundlagen zu den verschiedenen statistischen
Berechnungen erklären (und sie in die Lage versetzen, diese Rechnungen notfalls auch von
„Hand zu Fuß“ durchzuführen 😊).
Um eine Aussage über die Verteilung einer Messgröße innerhalb einer Population zu erhalten
oder um verschiedene Populationen bezüglich einer Messgröße miteinander zu vergleichen,
sind die Parameter Standardabweichung und Mittelwert wichtige Hilfsmittel. Mit der
allgemeinen Bezeichnung Mittelwert wird oft - auch im biochemischen Praktikum -
stillschweigend impliziert, dass es sich um das arithmetische Mittel handelt. Der Vollständigkeit
halber sei aber auch das gewichtete arithmetische Mittel, der Median und der Modalwert
erwähnt.
Definitionen:
arithmetisches Mittel: =
=n
i
ixn
x1
1, d.h. man addiert alle Werte und teilt sie durch die Anzahl
der Werte;
gewichtetes arithmetisches Mittel:
=
==n
i
i
n
i
ii
w
xw
x
1
1, d.h. man multipliziert alle Werte mit einem
Gewichtungsfaktor und teilt die Summe der Produkte durch die Summe der
Gewichtungsfaktoren;
53
Median: derjenige Wert, der in der Mitte steht, wenn alle Werte nach der Größe sortiert
aufgeschrieben werden;
Modalwert: diejenige Merkmalsausprägung, die am häufigsten vorkommt.
Das gewichtete arithmetische Mittel wird verwendet, wenn ein Mittelwert aus unterschiedlich
stark zu bewertenden Einzelwerten gebildet werden soll (z.B. Schulnoten), den Median kann
man wählen, wenn Ausreißerwerte den Mittelwert nicht beeinflussen sollen und den Modalwert
wählt man, wenn keine numerische Größe erfasst wird (z.B. Haarfarbe). Im Praktikum werden
aber numerische Größen gleicher Gewichtung erfasst, so dass hier die Betrachtung des
arithmetischen Mittels am sinnvollsten ist.
Zur Beurteilung, wie aussagekräftig ein solcher Mittelwert ist, ist es notwendig zu wissen, wie
stark die Messwerte um den Mittelwert streuen. Ein Maß für diese Streuung ist die Varianz
bzw. die Standardabweichung. Um die Varianz zu erhalten, muss man die Differenz jedes
einzelnen Wertes vom Mittelwert ermitteln, diese Differenzen werden dann quadriert und über
die quadrierten Differenzen wird wieder ein Mittelwert gebildet. Die Standardabweichung ist
schließlich die Wurzel aus der Varianz.
Definitionen:
Varianz: 2
1
2 )(1
=
−=n
i
ixxn
s
Standardabweichung: 2ss =
Beispiel:
Für zwei Gruppen von je zehn Männern und Frauen wird jeweils die Körpergröße in cm
bestimmt. Für die Gruppe der Männer werden folgende Werte ermittelt: (167, 170, 172,
178, 180, 181, 184, 190, 198, 205), für die Gruppe der Frauen werden folgende Werte
ermittelt: (152, 155, 158, 160, 161, 165, 170, 175, 181, 184). Berechnen Sie jeweils die
Mittelwerte und Standardabweichungen und beurteilen Sie, ob sich die Gruppen bezüglich
der Messgröße signifikant unterscheiden.
Mittelwert Männer = (167+170+172+178+180+181+184+190+198+205) : 10 = 182.5
Mittelwert Frauen = (152+155+158+160+161+165+170+175+181+184) : 10 = 166.1
Varianz Männer = ((167-182.5)2+(170-182.5)2+.......+(205-182.5)2) :10 =
54
= ((-15.5)2+(-12.5)2+(-10.5)2+(-4.5)2+(-2.5)2+(1.5)2+1.52+
+7.52+15.52+22.52) : 10 = 134.05
Varianz Frauen = ((152-166.1)2+(155-166.1)2+.......+(184-166.1)2) :10 =
= ((-14.1)2+(-11.1)2+(-8.1)2+(-6.1)2+(-5.1)2+(-1.1)2+3.92+
+8.92+14.92+17.92) : 10 = 108.89
Standardabweichung Männer = 05,134 = 11.58
Standardabweichung Frauen = 89,108 = 10.43
1.5 Lineare Regression und Korrelationskoeffizient
Wissenschaftliche Taschenrechner bieten in der Regel diese Funktionen; das folgende Kapitel
soll Ihnen die Hintergründe und die Grundlagen zu den verschiedenen statistischen
Berechnungen erklären (und sie in die Lage versetzen, diese Rechnungen notfalls auch von
Hand zu Fuß durchzuführen 😊).
Zur Bestimmung von Messgrößen wird in der Laborpraxis häufig ein Vergleich mit bekannten
Werten herangezogen. So wird man zur Konzentrationsbestimmung i.d.R. ein Verfahren
heranziehen, bei dem ein Messwert in linearer Abhängigkeit vom gegebenen Wert - also z. B.
der Konzentration - steht. Hier ist nun zunächst die Frage zu beantworten, was bedeutet
lineare Abhängigkeit? Der Messwert ist linear abhängig vom gegebenen Wert, wenn die
Messwerte auf einer Geraden liegen.
Im Praktikum bedeutet dies einfach: Wenn eine lineare Abhängigkeit vorliegt, können wir die
Messwerte in ein Koordinatensystem eintragen und dann eine Bestgerade so ermitteln, dass
die Messwerte möglichst wenig um diese Gerade streuen. Das Problem reduziert sich dann
auf die Frage: Wie kommt man zu dieser Gerade? Hierzu gibt es mehrere Möglichkeiten:
1. Die graphische Methode: Hier legt man "nach Augenmaß" eine Bestgerade in die zuvor in
ein Koordinatensystem eingetragenen Punkte. Die Geradengleichung kann man dann über
den y-Achsenabschnitt und die Steigung der Gerade ermitteln. Diese Methode ist sehr schnell
anwendbar und führt vor allem dann zum gewünschten Erfolg, wenn man sicher ist, dass die
Messgröße linear abhängig von der gegebenen Größe ist, denn ein Maß für die Güte der
Bestgeraden erhält man hier nicht.
55
2. Die rechnerische Methode: Um die Bestgerade "von Hand" zu berechnen, bedarf es einer
aufwendigeren Berechnung, bei der eine Gerade ermittelt wird, für die die Summe der
Quadrate der Abweichungen der Messwerte von dieser Gerade minimal ist (i. d. R. nach der
Gauß'schen Methode der kleinsten Fehlerquadrate). Vereinfacht dargestellt erhält man die
Geradengleichung wie folgt:
allgemeine Form: y = m*x + b, zu bestimmen sind somit die Koeffizienten a und b wobei man
a und b erhält aus
=
=
−
−−
=n
i
i
n
i
ii
xxn
yyxxn
m
1
2
1
)(1
))((1
und xmyb −=
Die Gleichungen sehen dabei wesentlich unangenehmer aus, als sie tatsächlich sind, wie man
am nächsten Beispiel gut sehen kann.
Beispiel:
Bei der photometrischen Messung von Proteinproben bekannter Konzentration erhalten Sie
die in der folgenden Tabelle dargestellten Absorptionswerte. Bestimmen Sie die
Geradengleichung der Bestgeraden.
Protein [µg] 0 1 2 3 4 5
Extinktion
(Absorption) 0 0.070 0.130 0.193 0.253 0.318
Berechnung von x und y für die 6 Messwerte (n=6):
5,2)543210(6
1=+++++=x
161,0)318,0253,0193,013,007,00(6
1=+++++=y
Nun müssen nur noch die Werte in obige Gleichung eingesetzt werden und man erhält:
56
222222 )5,25()5,24()5,23()5,22()5,21()5,20(6
1
))161,0318,0(*)5,25()161,0253,0(*)5,24()161,0193,0(*)5,23()161,0130,0(*)5,22()161,007,0(*)5,21()161,00(*)5,20((6
1
−+−+−+−+−+−
−−+−−+−−+−−+−−+−−
=m
ausgerechnet ergibt dies: m = 0.0629 woraus sich a berechnet zu
b = 0.161 – 0.0629*2.5 = 0.00375 und die gesuchte Geradengleichung lautet dann
y = m * x + b = 0.0629 * x + 0.00375.
Man kann nun auch einen Korrelationskoeffizienten r (oder r2) berechnen, der ein Maß für die
tatsächliche Linearität darstellt und damit für die Qualität der errechneten Bestgeraden. Die
Formel hierzu sieht wieder schlimmer aus, als sie tatsächlich ist:
==
=
−−
−−
−−−
=n
i
i
n
i
i
n
i
ii
yyn
xxn
yyxxn
r
1
2
1
2
1
)(1
1*)(
1
1
))((1
1
denn setzt man wieder die Werte aus obigem Beispiel ein, so erhält man r = 0.999777, also
einen Wert, der sehr nahe an 1 liegt. Man kann grob sagen, dass je näher der Wert für r an
+1(oder -1) herankommt, desto weniger weichen die Messwerte von der Geraden ab und desto
besser ist somit das Modell eines positiven (oder negativen) linearen Zusammenhangs. r2 ist
dann das Quadrat des Korrelationskoeffizienten und wird als Determinationskoeffizient
bezeichnet (oftmals wird aber auch r2 zur allgemeinen Verwirrung als Korrelationskoeffizient
bezeichnet) und ist nur noch ein Bestimmtheitsmaß für die Qualität der linearen Abhängigkeit
ohne Angabe ob der Zusammenhang positiv oder negativ ist. Trägt man die Werte aus dem
Beispiel in ein Koordinatensystem ein und ermittelt die Gerade durch die graphische Methode,
so ergibt sich folgendes Bild:
57
Die Steigung m errechnet sich dabei aus 0625,06,1
1,0==
=
x
ym , den y-Achsenabschnitt
würde man hier mit 0 ablesen. Natürlich kann ein beliebiges Δy verwendet und das zugehörige
Δx abgelesen werden, ohne dass sich der Wert verändert. Die Geradengleichung lautet
demnach nach dieser Methode:
y = 0.0625 * x + 0, was den oben errechneten Werten sehr nahe kommt.
Das Beispiel zeigt, dass die kompliziert aussehenden Formeln sich bei näherer Betrachtung
schnell in einfache Subtraktionen, Additionen und Multiplikationen auflösen, sobald man Werte
einsetzt. Was übrig bleibt ist - zugegebenermaßen recht mühsames - Eintippen in den
Taschenrechner. Dies vereinfacht sich natürlich wesentlich, wenn der Rechner direkt über eine
Statistikfunktion verfügt. Trotzdem ist es sinnvoll, die Berechnungen einmal zu hinterfragen
und die Formeln anzusehen, damit man ein besseres Gefühl dafür bekommt, welche
Berechnungen im Hintergrund ablaufen und wie die Ergebnisse zu bewerten sind.
Wozu braucht man nun überhaupt eine solche Geradengleichung, denn im biochemischen
Praktikum wie auch im medizinischen Labor sollen ja Kenngrößen ermittelt werden, die eine
Aussage über biochemische Parameter erlauben und dadurch zu einer Diagnose führen. Wie
eingangs erwähnt, ist es zur Bestimmung solcher Parameter oft notwendig, bekannte Größen
als Vergleichswerte zu bestimmen. So kann man z.B. die Proteinkonzentration einer
unbekannten Probe dadurch bestimmen, dass man - wie im gezeigten Beispiel dargestellt -
verschiedene bekannte Proben vermisst und dann aus dem Absorptionswert der unbekannten
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Protein [µg]
Ab
so
rpti
on
[A
U]
y = 0,2 - 0,1 = 0,1
x = 3,1 - 1,5 = 1,6
58
Probe über die Geradengleichung die Konzentration der gesuchten Probe ermittelt. Das kann
natürlich auch wieder graphisch oder rechnerisch durchgeführt werden. Also zurück zum
Beispiel:
Anhand der oben angegebenen Eichwerte soll die Proteinmasse in einer identisch
angesetzten unbekannten Probe errechnet werden, für die eine Absorption von 0.158
gemessen wurde.
Die Absorptionswerte wurden als y-Werte aufgetragen, somit ergibt sich durch Einsetzten in
die oben errechnete Geradengleichung:
0.158 = 0.0629 * x + 0.00375, wobei x die gesuchte Proteinmasse ist. Durch Umformen der
Gleichung erhält man:
x = (0.158 – 0.00375):0.0629 = 2.45
Die Proteinmasse in der unbekannten Probe entspricht demnach 2.45 µg.
ACHTUNG: Da im Beispiel die Absorption in Abhängigkeit von der Proteinmasse dargestellt
wurde, erhält man als Ergebnis natürlich auch eine Proteinmasse in µg und keine
Konzentrationsangabe. Um zur Konzentration zu kommen, muss man die Masse noch durch
ein Volumen teilen. Weiter ist es wichtig, dass die unbekannte Probe und die Eichproben für
die photometrische Messung gleich angesetzt wurden. Wenn es notwendig ist, die unbekannte
Probe z.B. verdünnt einzusetzen, dann ist ein solcher Verdünnungsfaktor auch am Ende zu
berücksichtigen! Wäre in obigem Beispiel die unbekannte Probe 1:3 verdünnt eingesetzt
worden, so würde sich ihr Proteingehalt aus 2.45 µg * 3 = 7.35 µg berechnen.
1.6 Wichtige Gleichungen, Herleitungen und Umformung von Gleichungen
1.6.1 Massenwirkungsgesetz und Henderson-Hasselbalch-Gleichung
Während der pH-Wert einer starken Säure direkt von der Konzentration der Säure abhängt
(da eine starke Säure annähernd zu 100% dissoziiert), kann man diese vereinfachende
Annahme für eine schwache Säure nicht machen. Hier ist der pH-Wert im Wesentlichen davon
abhängig, wie stark diese Säure dissoziiert, was durch die Gleichgewichtskonstante der
Dissoziationsgleichung ausgedrückt wird.
59
HA <=> H+ + A- (Dissoziationsgleichung), nach dem Massenwirkungsgesetz gilt:
sKHA
AH=
−+ *
Ks ist die Gleichgewichtskonstante der Dissoziation.
Löst man diese Gleichung nach [H+] auf (durch Multiplikation mit [HA] und Division durch [A-]),
so erhält man:
−
+ =A
HAKH s *
Da i. d. R. jedoch nicht [H+], sondern der pH-Wert, also der negative dekadische Logarithmus
von [H+] interessiert, logarithmiert man beide Seiten und multipliziert die Gleichung noch mit (-
1):
))log(()log(log−
+ −+−=−A
HAKH s
oder vereinfacht geschrieben:
−
−=A
HApKpH s log
(Henderson-Hasselbalch-Gleichung)
Hier wurde nun quasi nebenbei die Henderson-Hasselbalch-Gleichung hergeleitet, die es
einem nicht nur ermöglicht, den pH-Wert der Lösung einer schwachen Säure zu berechnen,
sondern auch im umgekehrten Fall, wenn man den pH-Wert experimentell bestimmt, die
dazugehörige Konzentration der schwachen Säure zu berechnen.
Beispiel:
Gesucht ist zunächst der pH-Wert einer 50 mM Essigsäurelösung (pKs = 4.75), wie ändert
sich dieser pH-Wert, wenn man zu 1 l einer solchen Lösung 100 ml 10 mM HCl gibt?
60
Aus dem Massenwirkungsgesetz folgt:
pKs = 4,75 => Ks = 10-4,75 =
HA
AH −+ *, [HA] = c0 - [H+] ≈ c0 (da eine schwache Säure nur
sehr wenig dissoziiert), da weiter Essigsäure eine einprotonige Säure ist, also CH3COOH <=>
CH3COO- + H+, ist [H+] = [A-] und somit:
)lg(2
1lg2* 000
2
0
2
cpKpHcpKpHcKHc
HK ssss −=−=== +
+
der pH-Wert ist demnach pH = 3.02
HCl ist eine starke Säure, die zu 100% dissoziiert, daher gilt nach Zugabe der HCl:
[H+]ges. = [H+]CH3COOH + [H+]HCl = (0.000942942 mo*l-1)*1l+ (0.01 mol*l-1)*0.1l
= 0.001942942 mol in 1.1 l => 0.00176631 mo*l-1
der pH-Wert ist dann - log (0.00176631) = 2.75
Das Beispiel zeigt, dass der pH-Wert sich bei Zugabe von 100 ml 0.01 M HCl zu 1 l 50 mM
Essigsäure nur um 0.27 Einheiten ändert, während er bei Zugabe der gleichen Menge HCl zu
1 l reinem Wasser von pH 7 auf pH 3 um 4 Einheiten sinken würde. Dies zeigt die
logarithmische Natur des pH-Wertes. Eine Erhöhung der H+-Konzentration um den Faktor
1.8731 bei Zugabe der HCl zur Essigsäure führt zu einer Änderung des pH-Wertes um den
Faktor lg(1.8731) = 0.27. Die gleiche HCl-Zugabe zu Wasser mit pH 7 würde eine Erhöhung
der H+-Konzentration um den Faktor 10 000 von 10-7 auf 10-3 bedeuten und somit eine pH-
Wert Änderung um 4 Einheiten.
Im nächsten Beispiel soll nun bei gegebenen [HX] und pH der Ks-Wert von HX bestimmt
werden.
Beispiel:
Die Lösung einer schwachen Säure HX mit c0[HX] = 0.26 mol*l-1 hat einen pH-Wert von 2.86.
Wie groß ist die Säuredissoziationskonstante Ks?
aus dem pH-Wert kann zunächst [H+] berechnen:
61
pH = - log [H+] => [H+] = 10-pH = 10-2.86 = 0.001380384
nun kann man folgende Annahmen machen:
1. Da [HA] <=> [H+] + [A-] gilt, folgt direkt [H+] = [A-]
2. Da eine schwache Säure nur sehr wenig dissoziiert gilt (näherungsweise) [HA] = c0
nach der Henderson-Hasselbalch-Gleichung gilt nun:
−
−=A
HApKpH s log hier also
001380384,0
26,0log86,2 −= spK <=> 2.86 = pKs – 2.275
oder pKs = 5.135 und Ks = 7.3*10-6.
Wenn mit der Henderson-Hasselbalch-Gleichung gerechnet wird, muß auch mit Logarithmen
umgegangen werden. Daher hier noch einmal eine kurze Übersicht über die Rechenregeln mit
Logarithmen zur Erinnerung:
- Multiplikation: log (u*v) = log u + log v
- Division: log (u/v) = log u - log v
- Sonderfälle: log (1/v) = -log v
log (u/v) = -log (v/u)
- Potenzieren: log (un) = n*log u
- Radizieren: log n u = log (u1/n) = 1/n log u
Aus diesen Gesetzen folgt dann auch, dass die folgenden Darstellungen der Henderson-
Hasselbalch-Gleichung, die beide gebräuchlich sind, identisch sind:
−
−=A
HApKpH s log ist das gleiche wie
HA
ApKpH s
−
+= log
1.6.2. Das Lambert-Beersche Gesetz
Ein sehr wichtiges Analyseinstrument im Praktikum ist das Photometer. Im Photometer wird
die Absorption von Licht durch Lösungen gemessen. Als Transmission wird der Anteil an Licht
bezeichnet, der durch die Probe durchtritt, die Transmission ist daher der Quotient I/I0. Die
Durchlässigkeit einer Probe für Licht hängt von den folgenden Parametern ab:
- Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes
- Schichtdicke der Lösung d
62
- Konzentration der Lösung c
- chemische Eigenschaften der gelösten Substanz, Extinktionskoeffizient
Für nicht zu große Konzentrationen ist die Absorption proportional zur Konzentration des
gelösten Stoffes, woraus das Lambert-Beersche Gesetz folgt:
Transmission: dc
I
I **
0
10 −=
Absorption: dcI
IA **lg 0 ==
Da die Absorption bzw. Transmission selbst keine Einheit hat, müssen sich auf der rechten
Seite der Gleichung alle Einheiten wegkürzen. Die Konzentration wird i.d.R. in mol*l-1
angegeben, die Schichtdicke in cm woraus sich für folgende Einheit ergibt:
mmol
cm
mmol
cm
cmmol
cm
cmmol
dm
cmmol
l 2233
1000
1000
*
1000
**====
Natürlich ist es auch möglich, z.B. eine Massenkonzentration zugrunde zu legen, was dann in
der Rechnung entsprechend zu berücksichtigen ist. Allgemein gilt: Man muss sich die Einheit
des Extinktionskoeffizienten genau ansehen, denn diese bestimmt letztendlich, welche Einheit
das berechnete Ergebnis hat!
Beispiele:
Zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes geben Sie 20 µl Blut in 5 ml Reagenz. Anschließend
messen Sie die Absorption der Lösung in einer Küvette (Dicke 1 cm) und bestimmen einen
Wert von 0,415. Der Extinktionskoeffizient von Hämoglobin (eine Untereinheit) bei der
verwendeten Wellenlänge ist =11000 cm2*mmol-1, das Molekulargewicht ist MW=16144
g*mol-1. Berechnen Sie die Konzentration des Hämoglobins im Blut und geben Sie diese in
g*100 ml-1 und in g*mol-1 an.
Es gilt: A = * c * d
=
=
==== −
l
µmol
l
mol
l
mol
cm
mmol
cmcm
mmol
d
AcKüvette 7,3710*77,3
*1*000.11
415,0
*
5
32
63
Die Konzentration in der gemessenen Probe ist demnach 37.7 µmol*l-1. Zum Messen wurden
jedoch 20 µl Blut in 5 ml = 5 000 µl Reagenz verdünnt, d.h. die Konzentration im Blut ist
demnach:
=
==
l
mmol
l
µmolcBlut 4627,97,9462
20
5020*7,37
Die Massenkonzentration berechnet sich schließlich
=
=
=
=
=
=
ml
g
l
g
l
mg
l
mg
mmoll
mgmmol
moll
gmmolc
1003,157,15283,152765
*
*
*
*16144*4627,9
Während des Praktikums wird gelegentlich zur Vereinfachung der Versuchsauswertung
verlangt, dass bereits vorab ein Faktor F errechnet wird, mit dem man einen im Praktikum
erhaltenen Messwert unmittelbar in das gewünschte Ergebnis überführen soll. Manchmal
handelt es sich dabei lediglich um einen Verdünnungsfaktor, in anderen Fällen müssen aber
auch die im Skript angegebenen Formeln benutzt und umgeformt werden. Einen
Verdünnungsfaktor kann man sehr einfach berechnen. Wenn z.B. für eine photometrische
Messung 1 ml eines Reaktionsgemisches vorgelegt werden und dann 100 µl Probe zugegeben
werden, so ergibt sich ein Endvolumen von 1.1 ml. Diese Verdünnung ist dann zu
berücksichtigen, wenn aus dem Messwert auf die Konzentration einer Substanz in der
zugesetzten Probe rückgerechnet werden soll. Im genannten Fall muss die aus dem Messwert
errechnete Konzentration noch mit dem Faktor 11 multipliziert werden, um die Konzentration
der Probe zu erhalten.
ACHTUNG: Bezieht man sich bei der Messung auf einen Referenzwert, ermittelt man also
eine Konzentration durch Vergleich mit bekannten Konzentrationen und werden diese
Referenzlösung im gleichen Maße verdünnt wie die zu bestimmende Probe, so braucht man
keine Verdünnungsfaktoren zu berücksichtigen!
Wenn man für das oben berechnete Beispiel den Verdünnungsfaktor VF und die Umrechnung
von molarer Konzentration in Massenkonzentration vorab mit dem Extinktionskoeffizienten
zusammenfasst, dann erhält dann:
64
=
=
=
=
==
=
====
==
ml
g
ml
gFV
ml
g
l
g
l
g
moll
gmol
mol
g
l
mol
ml
mmol
cmcm
mmolM
dF
V
F
W
F
10077,36
100110
114,16*251*
100110
114,16
110
14,161
*
*
11000
16144
16144**1*11000
1*
*
1
;25120
5020
2
Die Hb-Konzentration im Blut in g*100 ml-1 berechnet sich dann einfach aus
cHb = VF * F * Absorption = 36.77 * 0.416 = 15.3 g*100 ml-1