1973 W. Miiller, H. Gaedtke und P. Conradt 993 Liebigs Ann. Chem. 1973, 993 - 1003

Darstellung und Eigenschaften einiger Acridinfarbstoffe von biologischem Interesse Werner Miiller *), Hartwig Gaedtke und Peter Conradt

Gesellschaft fur Molekularbiologische Forschung mbH, D-3301 Stockheim, Mascheroder Weg 1

Eingegangen am 30. November 1972

Die Synthesen und die Eigenschaften von folgenden neuen Acridinderivaten werden beschrie- ben: 3,6-Diamino-2,7-di-tert.-butylacridin (,,Di-tert.-butyl-proflavin“, l), 3,6,9-Triaminoacridin (2), 10-Allyl-3,6-diaminoacridiniumbromid (3) und 3,6-Bis(dimethylamino)-9-[3,5-bis-(2- hydroxyathoxy)phenyl]acridin (4). Die Verbindungen 1-3 dienten dem Studium der Acridin- Komplexe mit Desoxyribonucleinsaure (DNA) ; 4 wurde als Komplexbildner fur doppel- strangige Ribonucleinsaure (RNA) eingesetzt.

Preparation and Properties of Some Biologically Interesting Acridine Dyes The synthesis and properties of the following four acridine derivatives are described : 3,6-di- amino-2,7-di-tert-butylacridine (“di-tert-butyl-proflavine”, 1); 3,6,9-triaminoacridine (2); l0-allyl-3,6-diaminoacridinium bromide (3); and 3,6-bis(dimethylamino)-9-[3,5-bis-(2-hydr- oxyethoxy)phenyl]acridine (4). Compounds 1 to 3 have been prepared for studies on the inter- action of acridines with DNA, and 4 as complexing agent for double stranded RNA.

Das seit langem bekannte grol3e pharmakologische Wirkungsspektrum der Acri- dine 1) beruht zum grol3en Teil auf der Fahigkeit dieser Verbindungen, Nucleinsauren der Zelle zu komplexieren. Diese Komplexbildungen, die sich je nach Art der in Wech- selwirkung tretenden Nucleinsauren durch unterschiedliche Absorptions- und Emis- sionsspektren zu erkennen geben, sind schon 1954 von Krieg2) zu analytischen Zwek- ken herangezogen worden. Eingehender studiert wurden die Desoxyribonucleinsaure- (DNA)-Komplexe des 3,6-Diaminoacridins (Proflavin) und des 3,6-Bis(dimethyl- amino)acridins (Acridinorange) von Peacocke und Skerret 3) sowie Lerman4).

Das Strukturmodell von Lerman4) fur den Proflavin-DNA-Komplex sieht einen Einschub (intercalation) des planaren Acridinsystems zwischen die Basenpaare der DNA vor. Die lange Achse des Chromophors liegt dabei etwa parallel zur Richtung der Wasserstoffbrucken der DNA-Doppelhelix. Dieses Modell konnte spater durch viel- faltige Untersuchungstechniken gestiitzt werden und war fur die Molekulargenetiker von besonderem Interesse, da es zwanglos die Fahigkeit der Acridine zur Auslosung von Deletionsmutationen bei Bakteriophagen erklarte und damit einen wesentlichen Bei- trag zur Aufklarung des genetischen Codes lieferte (Crick und Mitarbeiters)).

*) Korrespondenz bitte an diesen Autor richten. 1) A. Alberts in The Acridines, S. 403, Arnold Ltd., London 1966. 2) Krieg, Experientia 10, 172 (1954). 3) A. R. Peacocke und J. N. Skerett, Trans. Faraday SOC. 52, 261 (1956). 4) L. Lerman, J. Mol. Biol. 3, 18 (1961). 5 ) F. H. C. Crick, L. Barnett, S . Brenner und R . J . Watts-Tobin, Nature (London) 192, 1227

(1 96 1).

994 W. Muller, H. Gaedtke und P. Conradt 1973

1965 schlugen Blake und Peacockes) ein modifiziertes Modell fur die Bindung der Acridine an die DNA vor, welches sich von dem Lermanschen Modell nur durch eine veranderte Anordnung des Acridinsystems zwischen den Basen der DNA unterschei- det.

Zur weiteren Sicherung des Einschubmodells und zur Entscheidung zwischen den beiden Strukturvorschlagen haben wir die bisher nicht bekannten Acridinfarbstoffe 1 bis 3 hergestellt, deren DNA-Komplexe zur Zeit untersucht werden.

Auf der Basis des Lermanschen Modells und nach Betrachtungen am Kalotten- model1 war zu fordern, da13 passendsubstituierte Daivate von 9-Phenyl-acridinorange nach dem Einschub in eine RNA-Doppelhelix uber den Substituenten in Kontakt mit den 2’-Hydroxygruppen der Ribosereste kommen miifiten und somit eine gewisse Spezifitat fur RNA entfalten konnten. Dies veranlaI3te uns zur Synthese der Verbin- dung 4.

1 ( C I I I ) I ~ / J Q J ~ ~ ( C H ~ ) ~

H2N ’ NH2 H2N

Synthesen und Eigenschaften 3,6-Diamino-2,7-di-tert.-butylacridin (1)

Fur die Darstellung von 1 haben wir den klassischen Syntheseweg fur 3,6-Diamino- acridine beschritten7), indem wir 2-tert.-Butyl-l,5-phenylendiamin mit Oxalsaure in einer Zinkchlorid-Glycerin-Schmelze kondensierten. Das Diamin erhielten wir durch katalytische Hydrierung der entsprechenden, relativ leicht zuganglichen Nitrover- bindung.

Bei der Kondensationsreaktion beeinflul3t die Temperatur die Ausbeute von 1 und die Anzahl und Menge der Nebenprodukte. Am giinstigsten erwies es sich, zunachst das Diamin mit dem Zinkchlorid bei 110-130°C unter Ruhren zu einer moglichst homo- genen Masse zu verschmelzen, anschlieoend die Oxalsaure zuzufugen und danach die Temperatur rasch fur eine kurze Zeit auf 180°C zu steigern, wobei die Kondensations- reaktion unter starker Schaumbildung sturmisch einsetzt. Nach weiteren 70 min bei 145-150°C ist die Reaktion beendet. Die Schmelze wird durch Losen in Wasser und Behandlung mit Ammoniak aufgearbeitet. Das gelbe Rohprodukt, welches in rund 60proz. Ausbeute entsteht, wird chromatographisch an Polyamid rnit BenzolIMetha- no1 gereinigt.

6) A. Blake und A. R. Peacocke, Nature (London) 206, 1009 (1965). 7) Vgl. LitJ), dort S.-112.

1973 Acridinfarbstoffe von biologischem Interesse 995

Die freie Base 1 kristallisiert aus Benzol in goldgelben Nadeln, die sich ab 290°C zersetzen. Die Loslichkeit von 1 in organischen Losungsmitteln, aul3er Cyclohexan und Petrolather, ist erwartungsgemaD gut, in waDrigen Medien ist sie wesentlich geringer als die des Proflavins. Die Stabilitat der freien Base oder ihrer Losung ist relativ gering; in protonierter Form ist der Farbstoff im Dunklen nach unseren bis- herigen Erfahrungen ebenso haltbar, wie die nicht butylierte Verbindung. Dies gilt auch fur waDrige Losungen mit pH-Werten unter 8.

Das Elektronenspektrum ist dem des Proflavins sehr ahnlich : Das langwellige Maxi- mum der protonierten Form liegt in wal3riger Losung (pH 7) bei 453 nm und ist gegen- uber dem des Proflavins um rund 10 nm bathochrom verschoben (Abb. 1). Im UV- Bereich tritt eine ahnliche Verschiebung auf.

Das NMR-Spektrum ist erwartungsgemaD einfach, da keine Kopplungen auftreten konnen. Das Signal der beiden tert.-Butylgruppen liegt bei 8 = 1.42 ppm, das der bei- den Protonen in 1- und 8-Stellung bei 8 = 7.75 ppm, das der Protonen in 4- und 5-Stellung bei 8 = 6.98 ppm und das des Protons in 9-Stellung bei 6 = 8.79 ppm, was der Sonderstellung dieses Protons (bedingt durch die geringe Elektronendichte an C-9) Rechnung tragt 8).

Der pK,-Wert der Verbindung wurde in Boratpuffer (0.1 M Nae) unter Ausnutzung der verschiedenen Absorptionsbanden fur die protonierte und nicht protonierte Form gemessen. Der fur 25°C gefundene Wert von pK, = 9.5 0.1 liegt um rund 0.4 Ein- heiten hoher als der f i i r das Proflavins), was als Folge der Alkylsubstitution verstand- lich ist.

Interessant ist, daD das Proflavinderivat in waDrigen Losungen (p bis 0.2) keine An- zeichen von Aggregation zeigt. Das Lambert-Beersche Gesetz ist bis zur Loslichkeits- grenze (ca. 5.10-5 M), exakt erfullt ; bei dieser Konzentration ist beispielsweise Acridin- orange schon weitgehend dimerisiert. Offenbar verhindern die beiden tert.-Butylgrup- pen die fur eine x-Elektronen-Wechselwirkung richtige Aufeinanderlagerung der Ringsysteme. Stark ausgepragt ist jedoch die Tendenz zur Assoziation auf Glas- und Plastikoberflachen sowie zur Bildung von Oberflachenfilmen auf wal3rigen Losungen. Aus 2.10-6 M Losungen 1aDt sich beispielsweise der Farbstoff durch Schutteln zum grol3en Teil an der Oberflache sammeln.

3,6,9-Triaminoacridm (2)

Zur Darstellung von 2 wurde zunachst 2,4,2’,4’-Tetranitrobenzophenon nach Re- duktion der Nitrogruppen mit Zinn(I1)-chlorid in konzentrierter Salzsaure in 3,6- Diaminoacridon ubergefuhrt 1% 11). Danach hat man die beiden Aminogruppen durch khoxycarbonylreste geschutzt 12), anschlieI3end die Sauerstoffunktion am C-9 mit Phosphoroxychlorid gegen Chlor ausgetauscht und dieses schlieI3lich mit Ammonium- carbaminat in Phenol durch die Aminogruppe ersetzt. Die Schutzgruppen wurden

8) H. Lung und G. Lober, Tetrahedron Lett. 46,4043 (1969). 9) G. Lober und G. Achtert, Biopolymers 8, 595 (1969). 10) M. Schopff, Ber. Deut. Chem. Ges. 27, 2316 (1894). 11) K. Mutsurnuru, J. Amer. Chem. SOC. 51, 816 (1929). 12) Vgl. Lit.l), dort S. 32.

996 W. Muller, H . Gaedtke und P. Conradt 1973

mit konzentrierter Bromwasserstoffsaure entfernt und so das 3,6,9-Triaminoacridin (2) in rund 26proz. Ausbeute (iiber alle Stufen) gewonnen. Die Base 2 kristallisiert aus wal3rigen Losungen mit 2 Molen Wasser in grunbraunen Nadeln, die oberhalb 350°C schmelzen und nur schwer verbrennbar sind.

1

Abbildung 1. UV-Spektren von - 3,fj-Diarninoacridin (Proflavin),

.-. - lO-Allyl-3,6-diarninoacridin (Base von 3), . . . . . a 9-Aminoacridin,

o - o - 3,6,9-Triaminoacridin (2) und o o o o 3,6-Diamino-9-acridon

in 0.18 M NaC1, 0.01 M Natriumphosphat und 0.001 M Athylendiamin- tetraacetat (BPES-Puffer; pH 7.1) bei 23°C

--- 3,6-Diarnino-2,7-di-tert.-butylacridin (Di-tert.-butylproflavin, l),

Bei der Isolierung der Base nach der letzten Umsetzung zeigte sich eine Besonder- heit. Wahrend sich Proflavin und dessen Di-tert.-butyl-Derivat aus waiRrigen Medien leicht durch Ammoniak als freie Basen ausfallen lassen, gelingt die Fallung des freien 3,6,9-Triaminoacridins nur durch uberschiissige Natronlauge. Dieses Verhalten deu- tete auf eine ungewohnlich hohe Basizitat von 2 hin, die sich auch optisch messen lien, da die freie Base und das Kation unterschiedliche Spektren zeigen. Der bei 25°C in 1 M Na@ ermittelte pK,-Wert liegt zwischen 12 und 12.5. Verstandlich wird diese unge- wohnlich hohe Basizitat, wenn man die Moglichkeit zur Formulierung der drei meso- meren Grenzstrukturen A-C fur die protonierte Verbindung berucksichtigt.

1973 Acridinfarbstoffe von biologischem Interesse 997

Bei diesen Grenzstrukturen handelt es sich formal um die gleichen, die man zur Erklarung der hohen Basizitat des Guanidins heranzieht. Offensichtlich ist das Acri- dinsystem damit in der Lage, die Rolle des C-Atoms im Guanidin zu ubernehmen.

Wie aus Abbildung 1 hervorgeht, ahnelt das Elektronenspektrum der protonierten Form von 2 weder dem des 3,6-Diaminoacridins noch dem des 9-Aminoacridins son- dern dem des 3,6-Diamino-9-acridons.

Die NMR-Signale (TMS als interner Standard) der durch scharfes Trocknen erhal- tenen wasserfreien Verbindung 2 sind folgendermaBen zuzuordnen : Die aromatischen Protonen in 1- und 8-Stellung absorbieren bei 8 = 8.15 ppm, die in 2- und 7-Stellung bei 8 = 6.70 ppm und die in 4- und 5-Stellung bei 8 = 6.63 ppm. Samtliche Signale zeigen die durch ortho- und meta-Kopplungen zu erwartenden Aufspaltungen. Die Aminogruppen in 3- und 6-Stellung geben Signale bei 8 = 6.17 ppm und die 9-Amino- funktion liefert eines bei 8 = 7.98 ppm. - Beim Dihydrat zeigen die Signale nur wenig veranderte Lagen; lediglich das der 9-Aminogruppe wandert nach 8 = 5.4, d. h. um fast 3 ppm zu hoherem Feld.

Die Tendenz von 2 zur Assoziation in waBrigen Medien ist etwas starker als die des 3,6-Diaminoacridins.

10-Ally1-3,6-diaminoacridiniumbromid (3)

Zur Herstellung dieser Verbindung sind wir vom 3,6-Diaminoacridin (Proflavin) ausgegangen, das nach Uberfiihrung ins Diacetat 13), mit Allylbromid im Einschmelz- rohr bei 80°C in ca. 70proz. Ausbeute das Allylderivat des Diacetaminoproflavins lieferte, welches sich an Polyamid mit Wasser von unumgesetztem Diacetat abtrennen und durch sein NMR-Spektrum sowie durch Elementaranalyse identifizieren lieB. - Die Verbindung ist in Losung besonders bei Lichteinwirkung oxidationsempfindlich.

Die Abspaltung der beiden Acetylgruppen gelang in 20proz. Bromwasserstoffsaure in der Siedehitze. Nach chromatographischer Reinigung des Rohprodukts an Cellu- lose mit Methanol/Chloroform erhielten wir 3 als rotes, kristallines Material vom Schmelzpunkt 327°C (Zers.) in ca. 55proz. Ausbeute.

Das UV-Spektrum von 2 in Wasser ist dem des Proflavins sehr ahnlich (Abb. 1); nur die langwellige Absorptionsbande zeigt eine nennenswerte bathochrome Verschie- bung (um ca. 12 nm). Hinsichtlich der Eigenassoziation zeigt 3 keine auffalligen Unter- schiede zum Proflavin.

Das NMR-Spektrum weist neben den ublichen Signalen fur die aromatischen Ring- protonen die Resonanzen fur die Allylgruppe als wenig aufgeloste Multipletts auf.

13) L. Benda, Chem. Ber. 45, 1787 (1912).

998 W. Miiller, H. Gaedtke und P . Conradt 1973

Wahrend die Allyl-CH-Gruppe bei 8 = 6.1 ppm absorbiert, uberlagern sich die Reso- nanzen der Methylengruppen und der Allyl-CHz-Gruppe zu einem Multiplett zwischen 8 = 5 und 5.5 ppm.

3,6-Bis(dimethylamino)-9-[3,5-bis-(2-hydroxyathoxy)phenyl]acridin (4)

Fur die Synthese von 4 boten sich zwei Wege an: 1) Direkte Arylierung des Acridinringsystems in 9-Stellung uber metallorganische

Verbindungen unter Ausnutzung der geringen Elektronendichte an diesem C-Atom, 2) Aufbau des 9-Phenylacridinringsystems auf klassischem Wege durch Konden-

sation eines entsprechend substituierten Benzaldehydderivates mit m-Phenylendiamin- abkommlingen.

Wir haben zunachst versucht, 4 auf dem ersten Wege herzustellen, indem das 3,6- Bis(dimethy1amino)acridin (Acridinorange) mit der Grignardverbindung des 33- Bis-(2-benzyloxy-athoxy)brombenzols zum Dibenzylather von 4 umgesetzt werden sollte. Dieser Syntheseweg interessierte besonders, weil er es ermoglicht hatte, auf einfachem Wege die entsprechenden Derivate der Xanthen- und Thioxanthenreihe aufzubauen. Leider scheiterte diese Synthese daran, daB die Herstellung der Grignard- verbindung aus dem substituierten Brombenzol trotz weitgehender Variationen der Reaktionsbedingungen nicht gelang. 'Auch die Uberfiihrung der Phenylhalogenidver- bindung in ein Lithiumderivat mislang. Wir sahen uns dehalb gezwungen, die Syn- these von 4 aufidem zweiten Wege zu versuchen.

Dazu wurde die 3,5-Dihydroxybenzoesaure zunachst mit Methanol verestert und dann der Ester mit dem Tosylat des Glykolmonobenzylathers in Dimethylsulfoxid nach Zusatz stochiometrischer Mengen von Natriumhydroxid verathert. Anschlie- Bende Behandlung mit Alkali ergab die 3,5-Bis-(2-benzyloxy-athoxy)benzoesaure in 60proz. Ausbeute.

Diese Saure lies sich durch Thionylchlorid glatt in das entsprechende Saurechlorid uberfiihren, welches mit partiell inaktivierten Palladium-Bariumsulfat als Katalysa- tor14) in Xylol bei 140°C zum Aldehyd hydriert wurde. Dabei zeigte sich, daB diese Reduktion gegeniiber Feuchtigkeit Buserst empfindlich ist. Trotz sorgfaltigster Trock- nung der Ausgangsverbindung, des Losungsmittels und des verwendeten Wasserstoffs lieBen sich befriedigende Ausbeuten nur erzielen, wenn nach einigen Stunden Reak- tionsdauer die eingedrungene Feuchtigkeit mit einem Teil des Losungsmittels azeotrop abdestilliert worden war. Auf diese Weise lieB sich der 3,5-Bis-(2-benzyloxy-athoxy)- benzaldehyd in 75proz. Ausbeute aus der Saure darstellen. Der so gewonnene Aldehyd reagierte mit m-Dimethylaminoanilin-dihydrochlorid in siedendem Athanol in 25- proz. Ausbeute zum Phenylacridinderivat, welches nach Abspaltung der Benzylreste mit methanolischer Salzsaure die gewiinschte Verbindung 4 ergab.

Das UV-Spektrum von 4 stimmt hinsichtlich Lage und Intensitat der Absorptions- banden nahezu vollig mit dem des 9-Phenyl-acridinoranges uberein.

Die Signale des in Deuterodimethylsulfoxid gemessenen NMR-Spektrums lassen sich weitgehend zuordnen : Die Dimethylaminogruppe liefert ein Singulett bei 8 =

3.1 ppm (Intensitat 12), die vier Athylengruppen geben je zwei Tripletts bei 6 = 3.74 14) Otto Bayer in Methoden der organischen Chemie (Houben- Weyl-Muller), 4. A d . , Bd:

VII/l, S. 489, Thieme, Stuttgart 1962.

1973 Acridinfarbstoffe yon biologischem Interesse 999

und 4.05 ppm mit den Intensitaten 4. Das aromatische Proton in #-Stellung absor- biert bei 8 = 6.72 (Intensitat 1; Triplettaufspaltung); die Protonen in 2'- und 6'-Stel- lung ergeben ein Doublett bei 8 = 6.92 ppm (Intensitat 2). Vom Acridinsystem absor- bieren die Protonen in 4- und 5-Stellung bei 8 = 6.52 ppm (Dublettfeinstruktur, Intensitat 2), die in 2- und 7-Stellung bei 6 = 7.08 und 7.18 ppm (Doublettfeinstruk- tur, Intensitat 2) und die in 1- und 8-Stellung bei 8 = 7.36 und 7.46 ppm (Intensitat 2).

Hinsichtlich der Basizitat treten im Vergleich zum 9-Phenyl-acridinorange keine Unterschiede auf ; d. h. der pK,-Wert liegt bei ca. 10. - Deutlich erhoht gegenuber 9-Phenyl-acridinorange ist dagegen die Loslichkeit von 4 in waorigen Medien, was aufgrund der Seitenketten des Phenylrings nicht verwunderlich ist. Die Tendenz zur Eigenassoziation ist mit der von Acridinorange vergleichbar; bei 25"C, pH 7.05 und 0.2 M Na@ betragt die Dimerisierungskonstante KD = 2.4.104 Liter .mol-1.

Wechselwirkung der Verbindungen 1-4 rnit Nucleinsauren Die bisherigen Ergebnisse uber die Wechselwirkung der neuen Acridine 1-4 wer-

den, soweit sie von allgemeinem Interesse sein konnen, im folgenden kurz dargelegt. Das 3,6-Diamino-2,7-di-tert.-butylacridin (1) entspricht in seinem Verhalten inso-

fern unseren Erwartungen als dieses Acridinderivat (offensichtlich aufgrund seiner sperrigen Reste) nicht zur Einschubreaktion zwischen die Basenpaare der DNA befa- higt ist. Dies lieD sich durch hydrodynamische und kinetische Messungen sicherstel- len15). Die trotzdem stattfindende Wechselwirkung rnit der DNA zeichnet sich durch eine hohe Adenin-Thymin-Spezifitat aus, wobei zwei Basenpaare dieser Art, die von einem beliebigen dritten Basenpaar getrennt sein durfen, einen Bindungspunkt abge- benls). Gleichzeitig zeigt 1 eine ungewohnlich hohe Spezifitat fur DNA; Ribonuclein- saure (RNA) bindet den Farbstoff urn wenigstens 2 GroDenordnungen schlechter. Diese Spezifitaten fehlen bei der nicht butylierten Verbindung.

Das 3,6,9-Triaminoacridin (2) unterscheidet sich in seiner DNA-Wechselwirkung vom 3,6-Diaminoderivat (Proflavin) einmal in der ca. 3 ma1 hoheren thermodynami- schen Komplexstabilitat, was sicherlich rnit der erhohten Basizitat von 2 zusammen- hangt, zum anderen in der hohen Einheitlichkeit der Wechselwirkung. Die Bindungs- isotherme zeigt im gesamten mel3baren Bereich praktisch ideales Verhalten, wodurch hohe Basen- oder Sequenzspezifitaten sehr unwahrscheinlich sind.

Die DNA-Wechselwirkung des Nlo-Allylproflavins 3 ist der des Proflavins sehr ahnlich. Eine schwache Spezifitat fur Guanin-Cytosin-Basenpaare, die beim Proflavin fehlt, bildet den einzigen bisher bekannten Unterschied.

Das 9-Phenylacridinderivat 4 zeigt hauptsachlich die erhoffte RNA-Spezifitat. Von Polyadenyl-Polyuridylsaure wird 4 deutlich starker als von DNA gebunden. Die Wechselwirkung mit dem Ribopolynucleotid wird z. Zt. eingehender untersucht.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir fur die finanzielle Forderung unserer Arbeiten, von denen ein Teil im Sonderforschungsbereich 75 (Molekulare Biologie, Biochemie und Biophysik), Braunschweig, entstanden ist.

15) W. Miiller, D . M. Crothers und M . Waring, Eur. J. Biochem., im Druck.

lo00 W. Muller, H. Gaedtke und P . Conradt 1973

Experimenteller Teil

Die Schmelzpunkte sind im Berlblock bestimmt und nicht korrigiert. Die UV-Spektren wurden rnit einem Gerat Zeiss DMR 21, die NMR-Spektren (Tetramethylsilan als interner Standard) rnit einem Gerat Varian HA 100 und die Massenspektren mit einem Gerat Atlas CH 4 aufgenommen.

3,6-Diamino-2,7-di-tert.-butylacridin (1). - 10 g 2,4-Dinitro-tert.-butylbenzol wurden in 70 ml Methanol unter Zusatz von Pd/Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Hz-Auf- nahme gab man Celite zu, filtrierte den Katalysator ab und dampfte das sich rasch dunkel farbende Filtrat in einem 100-ml-Spitzkolben bei 50°C Badtemperatur ein. Das zuriickblei- bende braune 0 1 vermischte man im gleichen GefaD mit einer Losung von 8.2 g wasserfreiem Zinkchlorid in 16.2 g Glycerin (p. a.) und riihrte die Mischung 30 min rnit einem Spiralriihrer bei 110- 130°C (blbad). Die rotlich-violette Masse versetzte man rnit 5.6 g Oxalsaure-dihydrat (p. a.) und erhohte die Temperatur auf 140°C, wobei das Reaktionsgemisch unter mal3iger COz-Entwicklung diinnfliissiger und homogen wurde. Nach 10 rnin erhitzte man rasch auf 180°C und hob nach ca. 1 rnin die Schmelze soweit aus dem Olbad, daI3 die stiirmisch ein- setzende Gasentwicklung bei kraftigem Riihren kontrollierbar blieb. Bei nachlassender Reak- tion erhitzte man das Gemisch weitere 70 rnin auf 145-l5O0C, nahm nach dem Erkalten in 200 ml Wasser auf, versetzte rnit 200 ml konz. Ammoniak und zentrifugierte den Nieder- schlag bei 4500 g ab. Das Sediment wurde rnit 15proz. Ammoniak bei Raumtemperatur digeriert, erneut abzentrifugiert und die rohe gelbe Base von 1 iiber konz. Schwefelsaure i. Vak. getrocknet. Ausbeute 3.5 g (50%).

Zur chromatographischen Reinigung loste man 500 mg Rohprodukt in ca. 50 ml Benzol/ Methanol (9:l) und chromatographierte die Losung im gleichen System iiber eine Saule (3.5 x 70 cm) von Polyamid (Fa. Macherey, Nagel; SC 6, G0.07 mm) unter Vermeidung starker Lichteinwirkung. Der Inhaltsstoff der rasch wandernden Hauptzone hinterlief3 beim Verdampfen des Losungsmittels 1 als hellgelbes, aus Benzol kristallisierendes Material. - Fur die Elementaranalyse fiihrte man 1 ins Perchlorat iiber, indem man 20 mg der Base in ca. 3 ml Methanol rnit 0.5 ml 2 N HC104 und 5 ml 1 M NaC104 versetzte. Das abgesaugte hell- gelbe kristalline Salz trocknete man iiber KOH bei 95"C/10-3 - 10-4 Torr. - UV-Spektrum (Phosphatpuffer rnit 0.2 M NaQ, pH 7.0) : Amax (log E) = 453 (4.543), 268 (4.71 1) - NMR- Spektrum: siehe allgemeinen Teil.

C21H28ClN304 (421.9) Ber. C 59.78 H 6.69 N 9.96 C1 8.40 Gef. C 60.01 H 6.39 N 10.02 C1 8.35

3,6-Diaminoacridon. - Die Darstellung erfolgte im wesentlichen nach dem Verfahren von Sch6pfllo) in der Modifikation von Matsurnurall) ; lediglich zur Isolierung des Produktes aus dem Zinn(1V)-Doppelsalz wurde abgeandert verfahren: Das Zinn(1V)-Doppelsalz von 12 g Tetranitrobenzophenon wurde in 100 ml Wasser gelost und rnit 20 g Weinsaure versetzt. AnschlieBend wurde rnit konz. Ammoniak gefallt, der orangefarbene Niederschlag abfiltriert, getrocknet und mit wal3rigem Pyridin extrahiert. Aus dem Auszug kristallisierte 3,6-Diamino- acridon in schwach graubraunen Nadeln. Ausbeute 3.0 g (41 %).

3,6-Bis(athoxycarbonylarnino)-Pacridon. -2.25 g 3,6-Diaminoacridon erhitzte man 25 rnin in 9.1 g Diathylanilin und 5.5 g Chlorameisensaure-athylester nach Zusatz von 0.3 g Athanol auf 90°C, wobei sich das Reaktionsgemisch rotviolett farbte. Nach dem Abkiihlen nahm man in Methanol auf und goR in 50 ml 2 N HCl. Nach dem Verdampfen des Methanols i. Vak. wurde die verbleibende waDrige Suspension filtriert und das rotliche Rohprodukt aus waDri-

1973 Acridinfarbstoffe von biologischem Interesse 1001

gem Methanol umkristallisiert. Ausbeute 3.0 g (81 %) schwach gelbliche Nadeln, die sich ab 270°C zersetzen.

C19H19N305 (369.4) Ber. C 61.78 H 5.19 N 11.38 Gef. C 61.89 H 5.20 N 11.17

3,6-Bis(athoxycarbonylamino)-9-chloracridin. - 370 mg 3,6-Bis(athoxycarbonylamino)-9- acridon erhitzte man 1 h in 2.5 ml Phosphoroxychlorid im Einschmelzrohr auf 120°C. Nach dem Abkiihlen tropfte man das dunkelbraune Reaktionsgemisch unter starkem Riihren in eine Mischung aus 67 g Eis und 24 ml konz. Ammoniak. Die gelbe Fallung wurde abfiltriert, getrocknet und aus Benzol umkristallisiert. Ausbeute 380 mg (98 %) leuchtend gelbe Kristalle, die sich ab 175°C rot farben und bei 213°C zersetzen.

C19H18CIN304 (378.8) Ber. C 58.84 H 4.68 C1 9.14 N 10.84 Gef. C 58.79 H 4.81 C1 9.13 N 10.97

3,6-Bis(athoxycarbonylamino)-9-aminoacridin. - Zu einer Losung von 1.55 g 3,6-Bis- (athoxycarbonylamino)-9-chloracridin in 6 g Phenol fugte man bei 70°C unter Ruhren inner- halb von 3 min 0.8 g Ammoniumcarbaminat und erhitzte 45 min auf 120°C. Nach dem Ab- kuhlen go8 man in 80 ml 2 N NaOH, filtrierte den gelben Niederschlag ab, wusch mit Wasser, trocknete und kristallisierte aus Athanol urn. Ausbeute 1.45 g (98 %) gelbe Nadeln, die sich ab 230°C zersetzen.

C19H20N404 (368.3) Ber. C 61.96 H 5.46 N 15.20 Gef. 61.82 H 5.37 N 15.12

3,6,9-Triaminoacridin (2). - Man erhitzte 0.45 g 3,6-Bis(athoxycarbonylamino)-9-amino- acridin in 16.7 ml48proz. HBr 150 min unter RiickfluB, dampftei.Vak. zur Trockene ein und nahm den Riickstand in 50 ml Wasser auf. Nach Zusatz von verd. NH3 filtrierte man von braunen Flocken ab und versetzte mit 2 N NaOH bis zur stark alkalischen Reaktion. Das gelbe Rohprodukt von 2 wurde abfiltriert, rnit Wasser gewaschen und aus Wasser umkristalli- siert. Das Dihydrat kristallisiert in gelbgriinen Nadeln, die unterhalb 350°C weder schmelzen noch Zersetzung zeigen. Ausbeute 0.27 g (85 %). C13H12N4.2H20 (260.3) Ber. C 59.99 H 6.20 N 21.53 Gef. C 60.43 H 6.15 N 20.05

3,6-Bis(acetamino)-I0-allylacridiniumbromid. - 0.5 g 3.6-Bis(acetamino)acridin erhitzte man rnit I ml Allylbromid 4 h auf 80°C. Das Reaktionsgemisch wusch man rnit Ather, nahm es in Wasser auf und filtrierte iiber Poylyamid, wobei nicht umgesetztes Ausgangsprodukt aufgrund seiner geringen Wanderungsgeschwindigkeit abgetrennt wurde. Aus dem Eluat lie8 sich 3,6-Bis(acetamino)-lO-allylacridiniumbromid durch KBr ausfallen und lag nach dem Waschen mit Eiswasser und Trocknen als hellrotes, feinkristallines Material vor, das sich ab 270°C zersetzte. Ausbeute 0.5 g (71 %).

C20H20BrN302 (414.3) Ber. C 57.98 H 4.87 Br 19.29 N 10.14 Gef. C 57.17 H 5.35 Br 18.90 N 10.23

IO-AIlyl-3,6-diaminoacridiniumbromid (3). - Eine Losung von 500 mg 3,6-Bis(acetamino)- 10-allylacridiniumbromid in 4 ml Wasser und 3 ml48proz. HBr erhitzte man 1 h unter Riick- f lub Beim anschlie8enden Kiihlen in Eis/Kochsalz schied sich der gro8te Teil von 3 in dunkel- roten Kristallen aus. Nach Einengen der Mutterlauge fie1 eine weitere Fraktion an, die zusam- men rnit der Hauptfraktion iiber eine Saule (3 x 50 cm) von Cellulose mit Methanol/Chloro- form (7 : 3) chromatographiert wurde. Das Eluat der am schnellsten wandernden Haupt- zone dampfte man i. Vak. ein und kristallisierte den Riickstand aus Methanol urn. Aus- beute 220 mg (55%) rote Nadeln, die sich ab 327°C zersetzen.

C16H16BTN3 (330.2) Ber. c 58.19 H 4.88 c1 0.00 Br 24.20 N 12.72 Gef. C 58.09 H 5.06 C10.50 Br 23.3 N 12.79

(Der geringe Chloridgehalt lie8 sich auf Verunreinigungendes verwendeten HBr zuriickfiihren; nach dem Chlorgehalt liegen ca. 4 % des erhaltenen 3 als Chlorid vor.)

1002 W. Muller, H. Caedtke und P. Conradt 1973

3,5-Bis-(2-benzyloxy-athoxy) benzoesaure. - 4.2 g 3,5-Dihydroxybenzoesaure-methylester loste man in 50 ml DMSO, versetzte rnit 2 g NaOH, dann rnit 16.2 g Benzyloxyathyl-p- toluolsulfonat und erhitzte das Gemisch 8 h auf 80°C. Nach dem Abdestillieren des DMSO bei ca. 1 Torr/60"C (Badtemperatur) erhitzte man den Riickstand in 50 ml Wasser rnit 20 g NaOH zum Sieden (2h), sauerte rnit verd. HCIan, filtrierte die Saure ab und chromatographierte das Rohprodukt iiber eine Saule (5 x 100 cm) von Kieselgel rnit Benzol/Methanol/Eisessig (88 : 8 : 4). Der Inhaltsstoff der am schnellsten wandernden Hauptzone lieferte nach dem Ver- dampfen des Losungsmittels und Umkristallisation des Riickstandes aus Cyclohexan/Me- thanol 6.95 g (59 %) vom Schmp. 101 "C.

C25H2606 (422.5) Ber. C 71.07 H 6.20 Gef. C 70.86 H 6.45 Mo1.-Masse 422 (massenspektrometr.)

3,5-Bis-(2-benzyloxy-athoxy) benzaldehyd. - Eine Losung von 2 g 3,5-Bis-(2-benzyloxy- ath0xy)benzoesaure in 100 ml trockenem Ather und 0.4 g Pyridin versetzte man tropfenweise unter Eiskiihlung rnit 0.37 ml Thionylchlorid. Nach 1 h dampfte man i. Vak. zur Trockene ein, loste das Saurechlorid in 100 ml trockenem Xylol, versetzte die Losung rnit 400 mg des- aktiviertem Pd/BaS0414), erhitzte auf 140°C und leitete unter gleichzeitigem Riihren durch eine Fritte einen starken Hz-Strom in die Losung. Nach 4 h lieB die HC1-Entwicklung nach, worauf man 10 ml Losungsmittel bei Normaldruck abdestillierte und noch 4 h H2 durch die Suspension leitete. Danach filtrierte man vom Katalysator ab, wusch rnit CHC13, dampfte das Filtrat i. Vak. ein und chromatographierte den Ruckstand an Kieselgel (voranstehend) mit Cyclohexan/Aceton (3 : 1). Die rasch wandernden Hauptzone enthielt 1.43 g (74%) Alde- hyd als farbloses 01. (Aus einer langsamer wandernden Zone konnten 323 mg Ausgangs- substanz zuruckgewonnen werden.)

CzsH2605 (406.5) Ber. C 73.87 H 6.45 Gef. C 73.25 H 6.64 2,4-Dinitrophenylhydrazon: Gelben Nadeln; Schmp. 138°C (aus Methanol).

3,6-Bis(dimethylamino) -9-[3,5-bis-(2-benzyloxy-athoxy)phenyl]acridin. - Eine Losung von 3.77 g 3,5-Bis-(2-benzyloxy-athoxy)benzaldehyd und 3.76 g m-Dimethylaminoanilin-dihy- drochlorid in 150 ml Athanol kochte man 24 h unter RiickfluD. Nach Zusatz von waBrigem NH3 extrahierte man erschopfend rnit Chloroform, verdampfte das Losungsmittel i. Vak. und chromatographierte den Riickstand an Kieselgel (voranstehend) rnit Benzol/Methanol/ Eisessig (79 : 14 : 7). Nach einer schmalen, gelblichen Vorzone, die im wesentlichen nicht umgesetzten Aldehyd enthielt, liel3en sich eine breitere blaue sowie eine schmale rote Zone und danach die tiefgelbe Hauptzone eluieren. Letztere war von grunlichen, langsamer wandernden Produkten nicht vollig abzutrennen. Nach Rechromatographie der Mischzonen an Kieselgel im gleichen System, Entfernen von Kieselgel durch Chloroformextraktion der ammoniakali- schen Losungen der einzelnen Inhaltsstoffe und Abdampfen des Chloroforms i. Vak. chro- matographierte man gemeinsam jene Fraktionen, die laut Diinnschichtchromatogramm [Kieselgel; Benzol/Methanol/Eisessig (79 : 14 :7)] das gewiinschte Produkt enthielten, iiber eine Saule (5 x 75 cm) von Aluminiumoxid rnit Chloroform/Athylacetat/Methanol(78 : 20 : 2). Die gelbe Hauptzone ergab nach dem Umkristallisieren aus Chloroform/Methanol 1.46 g orangefarbene Nadeln, die sich ab 270°C zersetzen.

Cd1H43N304 (641.8) Ber. C 76.73 H 6.75 N 6.50 Gef. C 76.78 H 7.06 N 5.59 (Der N-Wert wurde vom Perchlorat bestimmt.)

3.6-Bis(dimethylamino)-9-[3,5-bis-(2-hydroxyathoxy)phenyllacridin (4) : In einem Gemisch aus 125 ml konz. HCl und 125 ml Methanol erhitzte man 900 mg 3,6-Bis(dimethylamino)-9- [3,5-bis-(2-benzyloxy-athoxy)phenyl]acridin 4 h zum Sieden unter RuckfluD. Nach Zusatz von waBrigem NH3 extrahierte man erschopfend rnit Chloroform, verdampfte das Losungsmittel

1973 Acridinfarbstoffe von biologischem Interesse 1003

i. Vak. und chromatographierte den Riickstand auf praparativen Kieselgelplatten mit Chloro- form/Methanol/Eisessig (90 : 10 : 5). Die Inhaltsstoffe der beiden am intensivsten gelben Zonen chromatographierte man anschliedend an Aluminiumoxid (3.5 x 43 cm) rnit Chloro- form/Methanol (90 : 10). Das Eluat der Hauptzone lieferte nach Verdampfen des Losungs- mittels und Umkristallisieren des Riickstandes aus Methanol/Chloroform 416 mg (61 %) 4 als orangefarbene Nadeln, die sich ab 265°C zersetzen. Mo1.-Masse der Base: 461 (massen- spektrometr.). - Fur die Elementaranalyse iiberfiihrte man eine Probe 4 in das Perchlorat, indem man sie in Methanol/Wasser loste, mit verd. HC104; ansauerte und das Salz rnit 1 M

Natriumperchlorat-Losung fallte. C27H32C1N308 (562.1) Ber. C 57.70 H 5.74 C1 6.31 N 7.48

Gef. C 57.61 H 5.87 C1 6.25 N 7.53

Das Eluat der zweitstarksten Zone ergab nach dem Abdampfen des Losungsmittels und Um- kristallisieren aus Methanol/Chloroform 203 mg orangefarbene Nadeln des Monobenzyl- athers von 4. Mo1.-Masse ber. 551.7, gef. 551 (massenspektrometr.).

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