Aus dem Pharmakologischen Institut der Universität Kiel in Kuppeln a. d. Schlei.

Darstellung und Eigenschaften von Verdoglobinen. I I . Mi t te i lung.

Zur Kons t i t u t ion des VerdoglobinNo~.

Von

MANFRED KIESE.

Mit 4 Textabbildungen.

(Eingegan(jen am 3. September 1946.)

:Einige in d e r vor igen Mi t t e i l ung 1 beschr i ebene E igenscha f t en des VerdoglobinNo2, wie seine L i e h t e x t i n k t i o n u n d die R e d u k t i o n zu H ä m o - g lob in l ießen v e r m u t e n , d a ß dieses Verdog l0b in in se iner K o n s t i t u t i o n ab- weich t von de r a n d e r e r Verdog lob ine , bei denen eine 0 x y d a t i o n des H ä m s an e iner M e t h i n g r u p p e er fo lg t ist . Diese Verdoglobine bzw. Verdo- chromogene , das Verdoglob inA, das d u r c h g e k o p p e l t e O x y d a t i o n von H ä m o g l o b i n und A s k o r b i n s ä u r e d u r c h Saue r s to f f e n t s t e h t 2, 3,4,10 u n d das VerdochromogenH, das d u r c h U m s e t z u n g von P y r i d i n h ä m o c h r o m o g e n m i t t t y d r a z i n h y d r a t und Saue r s to f f geb i lde t wird 5, zer fa l len in :Eisessig in Ga l l en fa rbs to f f e, 7, s. Das VerdoglobinNo ' g ib t d iese R e a k t i o n n ich t . Das v o m Globin als Chromogen a b g e t r e n n t e VerdNo ~ i s t in se iner L i c h t - a b s o r p t i o n v i e l m e h r d e m Phäohi~m und S p i r o g r a p h i s h ä m sehr ähnl ich . W i e d iese Hi~me 9 b i l de t das Verd)ro~ m i t P y r i d i n u n d H y d r a z i n h y d r a t Y e r d o c h r o m o g e n e m i t e iner B a n d e bei 585 m/z u n d geh t u n t e r dem Ein- f luß des R e d u k t i o n s m i t t e l s in ein Chromogen über , das nach der Lage se iner B a n d e n zwischen dem P r o t o h ä m o c h r o m o g e n u n d dem D e u t e r o - h ä m o c h r o m o g e n s t eh t . Der nach E n t f e r n u n g des Eisens aus d e m ¥ e r d ~ o ' und V e r e s t e r u n g m i t Me thy l a lkoho l e rha l t ene P o r p h y r i n e s t e r wi rd aus Ä t h e r , nach ]~x t rak t ion des P r o t o p o r p h y r i n e s t e r s m i t 4% Sa lzsäure , ln i t 8% Sa lzsäure e x t r a h i e r t . Die be iden B a n d e n des ]~sters in Salz- säure s ind gegenübe r denen des P r o t o p o r p h y r i n e s t e r s nach R o t verseho-

1KIEsE, M. : Arch. exper. Path. (D.) 204, 385 (1947).--2ANDERSEN, A.B. and P.D'A HA~T: J. Path. a. Bacter. 39, 465 (1934). - - a ED]~LBACltER, S. u. A. v. SEGESSER: Naturw. 25, 461, 557, 667 (1937). - - 4 LEr~VERG, R., J. W. LEGTE and W. H. LOCK- WOOD: Biochem. J. (Brit.) 33, 754 (1939). - - 5 WARBURO, O. U. E. NEOELEI~r: Ber. dtsch, chem. Ges. 63, lS16 (1930). - - 6 LEMBERG, R.: Biochem. J. (Brit.) 29, 1322 (1935). - - 7 E)rGEL, M.: Z. physiol. Chem. 266, 135 (1940). - - s L~MBER(L R., W. H. LOCKWOOD and J. W. L~GG]~: Biochem. J. (Brit.) 35, 363 (1941). - - 9 WARBURC, O. U. E. N~G]~LEIN: Biochem. Z. 244, 9 (1932). - - x0 L~MB~RG, l~., B. CORTIS JONES and M. NORRIE: Biochem. J. (Brit.) 32, 149, 171 (1938).

4 4 0 MANFRED KIES~ :

ben. In Äther, Pyridin und Dioxan hat der Ester ein Absorptions- spektrum vom Rhodotyp mit Banden bei den gleichen Wellenl~ngen

wie Spirographisporphyrinester, n~mlich bei 640, 580, 555 und 512 m#.

Auf Zusatz von Hydroxylaminhydrochlor id und wasserfreiem Na- t r iumkarbonat zur Lösung des Esters in Pyridin t r i t t Blauverschiebung der Banden und Änderung des Spektral typs vom Rhodotyp zum Ätiotyp ein, eine Reaktion, die auch beim Spirographisporphyrin und Phäo- porphyrin beobachtet wird unter Bildung des Oxims. Behandlung des Oxims mit Essigsaureanhydrid stellt den Rhodotyp des Spektrums wieder her unter Rotverschiebung einer Bande, wohl durch Umwandlung des 0xims ins Nitri.1. Eine ähnliche Yeränderung des Spektrums wie bei der Behandlung mit .Hydroxylamin tr i t t , allerdings etwas langsamer, nach Zusatz von Hydraz inhydra t zum Porphyrinester in Pyridin ein.

Die 0ximbildung zeigt die Anwesenheit einer Karbonylgruppe auf und der Rhõdotyp des Spektrums weist darauf hin, daß sie sich nicht an einer l~lethinbrüeke befindet, da solche Porphyrine keinen l~hodotyp des Spektrums zeigen 11.

Behandlung mit Benzoylchlorid in Pyridin ändert weder die Lage der Banden noch den Typ des Spektrums. Demnach sind reaktionsfähige t Iydroxylgruppen nicht vorhanden. Einwirkung von Sauerstoff auf die Lösung des Yerdoehromogens in Pyridin bei 600 war ebenfalls ohne Einfluß. Hydroxy]gruppen an den Methinbrücken, die durch Oxydation von Hämochromogen mit Wasserstoffperoxyd eingeführt werden können 12,18, werden durch Sauerstoff in Pyridin zu Ketõnen oxy- diert 14

Reinigung des Porphyrinesters bis zur Krystallisation und Elementar- analyse konnten noch nicht durchgeführt werden. Der Mangel an Chemi- kalien ließ nur die Aufarbeitung kleiner Ansätze zu, die für spektro- photometrisehe Untersuchungen aüsreichten. Die vorgebrachten Daten, die mit denen von WARBURO und F~SCHER für das Spirographishäm an- gegebenen übereinst immen, dürften jedoch den Schluß rechtfertigen, daß das Verd~o ~ mit dem Spirographishi~m identisch ist, zumal Ver- bindungen wie das Phäoporphyrin entsprechend der Herkunf t des Yerd~o~ aus Hämoglobin nicht zu erwarten sind.

FISCHER und DEILMANN 15 haben Protoporphyr indimethyles ter mit Osmiumtetroxyd und Wasserstoffperoxyd zu Spirographisporphyrin- dimethylester oxydieren können. Da wir den Ester noch nicht reinigen konnten, ist nicht zu übersehen, ob die Gewinnung aus dem Verd~o~ einfacher ist.

~~ S~ERN, A. u.H. WE~D~.RLEI~ : Z. physik. Chem. A 175, 405 (1936). - - ~~ FIsC~rR, H. u. I-I. LIBOWITZKY: Z. physiol. Chem. 251, 198 (1938). - - 1~ LIBOWITZK¥, H.: Z. physiol. Chem. 265, 191 (1940). - - ~4 STIER, E.: Z. physiol. Chem. 272, 239 (1942); 273, 47 (1942). - - 1» FISCI~ER, H. u. K. O. DEILM~NN: Z. physiol. Chem. 280, (1944).

Darstellung und Eigenschaften von Verdoglobinen. II. 441

W~thrend das abgetrennte Verd~o: offenbar mit dem Spirographis- hämin identisch ist, weichen Verdoglobin~o ~ und Spirographis-Hämo- globin, das WA~BURC und ~~GELEIN 9 aus Spirographishäm und Globin synthetisiert haben, in ihren Extinktionskurven etwas ab. DieVerände- rungen des Hämoglobins durch die Einwirkung von Nitrit und Wasser- stoffoxyd sind wahrscheinlich nicht auf die Oxydation einer Vinylgruppe des Protohäms beschränkt. Vielleicht betreffen sie auch die Bindung der prosthetischen Gruppe an das Protein. Auf solche Möglichkeiten scheint ein Unterschied in der Extinktion von Chromogenen hinzudeuten. Während das abgetrennte Verd mit Pyridin ein Verdochromogen mit einer Bande bei 585 m# bildet, entsteht aus Verdoglobin~o ~ in Pyridin- wasser durch Reduktion mit Dithionit eine Verbindung mit einer Bande bei 610 m#. Beide Verbindungen gehen in das ttämoehromogen mit der Bande bei 552 m# über.

Versuche.

1. Beständig/seit des Verd~ro~ in Eisessig. Wurde nach dem Vorgang LEMBS~RGs s eine Lösung von Hämoglobin,

die VerdoglobinA enthielt, in die doppelte Menge ]~isessig gegossen, so färbte sieh die Lösung blaugrün durch da~ gebildete Bi]iverdiu, das aus Äther mit 5%iger Salzsäure extrahiert werden konnte. Mach Eingießen einer Lösung von VerdoglobirNo~, das in der früher beschriebenen Weise 1 hergestellt war, in die doppelte Menge Eisessig trat nicht Blau-Grün- Färbung, sondern Rotfärbung ein. Wurde die Lösung nach einer Stunde in Äther gegossen und der Äther nach Waschen mit Natriumazetat und Wasser mit 5%iger Salzsäure extrahiert, so konnte im Gegensatz zu dem entsprechenden Ansatz mit Verdoglobin A kein Biliverdin entzogen werden, wohl aber unverändertes ¥erd~o «

2. Abtrennung der prosthetischen Gruppe des Verdo«lobin~o « Wurde VerdoglobinNo ~ in chloridhaltigen heißen Eisessig gegossen und

die Lösung abgekühlt, so erfolgte keine Krystallisation entsprechend der von Hämin bei Behandlung von Hämoglobin in der gleichen Weise. Es kam auch nicht zum nichtkrystallinen Ausfall von Verd, so daß auf diesem Wege eine Abtrennung der prosthetischen Gruppe nicht mög- lich war.

Die Abtrennung erfolgte viehnehr nach drei Verfahren, die neben- einander angewandt werden mußten, da häufig die für das eine oder das andere erforderlichen Chemikalien nicht vorhanden waren. Bevorzugt wurde die Abtrennungmit Pyridin-Eisessig-Chloro]orm. 100 ccm der Lösung des Verdoglobin~o ~ die nach der Dialyse der Ansätze von Hämoglobin mit Nitrit und Wasserstoffperoxyd erhalten wurde, wurden mit 50 ccm Pyridin und 50 ccm Eisessig versetzt. Mach 12--24 Stunden wurde mit

442 MANFRED KIESE :

50--100 ccm Chloroform kräftig durchgeschüttel t und das Gemisch an- schließend zentrifugiert. Die wenig gefärbte wäßrige Schichte und das denaturier te Protein wurden verworfen, die Chloroformlösung nochmal filtriert und im Vakuum bei Zimmertemperatur eingetrocknet. Das so erhaltene, mit H~m verunreinigte Verd wurde nicht weiter fraktioniert . ]~ür spektrophotometrische Untersuchungen wurde es in Pyridin-Wasser- oder t tydrazinhydrat-Wasser-Gemischen gelöst.

Entsprechend der Hämindarstel lung nach MöRN~R I« wurde die Ab- trennung des VerdNo~ mit Alkohol-Schwe/elsäure vom denaturier ten Verdoglobi~~o 2 durchgeführt . 300 ccm dialysierte Verdoglobinlösnng wur- den mit 500 ccm Wasser verdünnt, mit 5 ccm l%iger Schwefelsäure angesäuert und bis zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde filtriert, der Rückstand erst mit Wasser, dann mit Alkohol angerieben und filtriert. Der trockene Rückstand wurde dann mit 300 ccm Alkohol, dem 3 ecm konzentrierte Schwefels/~ure'zugesetzt waren, behandelt und nach 2--3 Stunden abfiltriert. Die Lösung enthielt nur einen Bruchteil des gesamten ¥erd . Wurde das Fi l t rat nach Zusatz von 2 ccm 37%iger Salzsäure aufgekocht, so fiel nach dem Erkal ten meist nur wenig Verd aus. Darum wurde die gesamte Lösung ohne Zusatz von Salzsäure und Aufkochen aufgearbeitet, indem entweder nach der l~eutralisation der Schwefelsi~ure mit Ammoniak im Vakuum eingetrocknet oder die Lösung mit einem Überschuß von Kalziumkarbonat versetzt wurde. Das Verd wurde an das Kalziumkarbonat adsorbiert und nach Abfiltrieren des Alkohols mit Pyridin herausgelöst. Das Pyridin wurde im Vakuum ab- gedampft. Da Äthylalkohol-Schwefelsäure nur einen kleinen Teil des Verds aus dem denaturierten Verdoglobin extrahierte, wurde wiederholt der Rückstand noch im Soxhlet-Apparat mit Äthylalkohol oder Methyl- alkohol, die etwa 10% Chlorwasserstoff enthielten, extrahiert . Die stark gef~rbten Ext rak te enthielten kein Verd, sondern den daraus erhältlichen Porphyrinester . Jedoch war die Ausbeute ebenfalls gering.

Schließlich wurde die Abtrennung des Verd~-oo in salzsaurem Azeton durchgeführt . 100 ccm der dialysierten Verdoglobiulösung wurden mit 10 ccm normaler Salzsäure versetzt und in 2 Liter Azeton, die 20 ccm normale Salzsäure enthielten, gegossen. Vom ausgefallenen Protein wurde abfiltriert und die Azetonlösung nach l~eutralisation mit Am. moniak im Vakuum zur Trockne gebracht.

3. Pyridinverdochromogen~o« In Pyridinwasser löste sich das Verd~o, als Verdichromogen das

keine charakteristische Extinkt ion aufwies. Durch Zusatz von sehr wenig Dithionit (Na2S20«) wurde es zu Pyridinverdochromogen reduziert, das

1« M ö R ~ n R : Z. physiol. Chem. 29, 187 (1908).

Darstellung und Eigenschaften :ton Verdoglobinen. I[. 443

eine Bande bei 585 m/z hat. Unmittelbar nach Zusatz des Dithionits beginnt die Umwandlung des Verdochromogen~o~ in ein I~ämochromogen mit einer c-Bande bei ~0 552 m# (Abb. 1). z,» - ~ - -

Wurde Verd~o ~ in Py- i / / ~ / I ~ ridin bei 600 1~2 Stunden .~lh ~ - ' mit Luft geschüttelt' s° " 1 " J I I trat keine Änderung des 7,~ Absorptionsspektrums des ~» - - l -

Verdoehromogen~o ~ ein. In t /

Eisessig gebracht erwies Htg/enl~nge sich die Verbindung so be- ständig wie vorher.

Abb. 1. Pyr id in -Verdochromogen l~o~ (Bande bei 58~ m~z) in U m w a n d l u n g zu Py r id inh /~mochromogen (Bande bei

552 mp) begr i f fen.

4. Porphyrinmethylester aus Verd~To.

Zur Darstellung cles Porphyrinesters wurde .das aus 200 ccm Verdo- globinlösung erhaltene Verd in 30 ccm Methylalkohol gegeben, der mit Chlorwasserstoff gesättigt war. Das Gemisch wurde eine Stunde unter Rückfluß gekocht. Dabei wurde aus dem größten Teil des Verds das Eisen abgespalten und die Propions~uren verestert. Nach dem Erkälten wurde das Gemisch in 50---100 ccm Äther gegossen und 5-normale Kalilauge bis zur alkalischen Reaktion zugegeben. Die w~ßerige Lösung wurde abgetrennt und derÄther zweimal mit Wasser gewaschen. Dann wurden die Prophyrinester fraktioniert mit Salzsäure extrahiert. Zunächst wurde mit dreimal 10 ccn~4 %iger Salzsäure Protoporphyrin- estcr entfernt. Mit drei-

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We//e/JdBge Abb. 2. P o r p h y r i n e s t e r aus V e r d N o ,, ans Ä t h e r m i t

8 % Sa lzsäure e x t r a h i e r t , in sa l z saure r Lösung .

mal 10 ccm 8%iger Salzsäure wurde dann der Porphyrinester des Verd~-o.. entzogen, der im Gegensatz zum roten Protoporphyrinester in Salzsäure rotviolettc Farbe hatte. Der Ester wurde sogleich wieder mit Kalflauge in Äther getrieben und nach nochmaliger Abtrennung von Protoporphyrin- ester mit 4% Salzsäure wieder mit 8%iger Salzsi~ure extrahiert und aber- mals in Äther getrieben. Der Mutteräther wurde anschließend noch mit 12%iger und 16%iger Salzsäure extrahiert.

Der mit 4 % Salzsäure extrahierbare Porphyrinester entsprach nach sei- nen Extinktionskurven in Salzsäure und Dioxan dem Protopo.rphyrinester.

Der mit 8% Salzsäure extrahierbare Ester hatte in Salzsäure zwei Banden bei 557 und 605 m/z, die also gegenüber denen des Protoporphyrin- esters (550 und 590 m/z) nach Rot verschoben waren (Abb. 2).

444 MANFRED KIESE :

Nach Verjagen des Äthers im Vakuum wurde der :Ester in Pyridin auf- genommen. Er wies dann ein 4-bandiges Spektrum vom I~hodotyp auf mit Absorptionsmaxima bei 640, 580, 555 und 510 reif. Die Banden waren also gegenüber denen des Protoporphyrinesters nach Rot versehoben.

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Wurden zu 10 ccm der Esterlösung 20 mg Hy- droxylaminhydroehlorid und 20 mg wasserfreies Natr iumkarbonat zuge- setzt, so t ra t sehr schnell eine Farbänderung zu

- einem helleren Rot ein. °'~1 , ' ~ ~ J l I , , Das Absorptionsspek-

t~//en/onge trum hatte sich erheb- A b b . 3 A. P o r p h y r i n e s t e r a u s V e r d N o ~, in P y r i d i n . lich geändert. Alle Ban,

B. Gle iche L ö s u n g n a c h Z u s a t z v o n H y d r o x y l a m i n h y d r o - c h ] o r i d u n d N a t r i u m k a r b o n a t ( O x i m b i l d u n g ) . d e n w a r e n nach Blau

verschoben worden und hatten jetzt ihre Maxima bei 627, 576, 536 und 503 reif. Außerdem hatte das Spektrum Ätiotyp angenommen (Abb. 3).

Die Verbindung, die das Oxim des Esters sein dürfte, wurde im Vakuum zur Trockne gebracht und dann in wenigen Kubikzentimeter Essigsäure- anhydrid aufgenommen und zum Sieden erwärmt. Nach Abdampfen des

%0

i

Y

6'50 600 550 Wellenlonge

K 500 ~ «50

A b b . 4. O x i m des P o r p h y r i n e s t e r s a u s V, e rd lgo t (s. A b b . 3, K u r v e B), m i t E s s i g s ä u r e a n h y d r i d b e h a n d e l t u n d i n P y r i d i n

g e l ö s t ( N i t r i l b i l d u n g ) .

Anhydrids im Vakuum wurde wieder in Pyridin aufgenommen. Die Lö- sung hatte jetzt eh1 ver-

waschenes S p e k t r u m vom Rhodotyp, dessen Banden zum Teil wie- der r~aeh Rot verlagert waren. Die Absorptions- maxima befanden sich bei 630, 576, 547, 508reif (Abb. 4).

:Eine ähnliche Veränderung des Spektrums des ]~sters in lPyridin wie nach Behandlung mit Hydroxylamin t ra t nach Zusatz von 1--2 ecm Itydrazinhydrat zu 19 ccm Pyridinlösung ein; allerdings brauchte der Ablauf der Reaktion eine viel längere Zeit als mit I-Iydroxylamin.

Wurden 10 ccm der Lösung des Porphyrinesters in Pyridin mit 1 Tropfen Benzoylehlorid versetzt, so t ra t keine Änderung des Spektrums ein. Auch Erwärmung im siedenden Wasserbade oder Vermehrung des Benzoyl- chlorids konnte keine Reaktion auslösen.

Darstellung und Eigenschaften yon Verdoglobinen. II. 445

5. Weitere Eater aus Verd~o2.

Das aus dem VerdoglobinNo ~ abgetrennte Verd ist kein einheitliches Ausgangsmaterial zur Darstellung yon Porphyrinestern, wie schon die An- wesenheit yon Protoporphyrinester zeigt. Aus der J~therlSsung wurde mit 8%iger Salzs~ure noch nicht der gesamte Porphyrinester extrahiert, viel- mehr waren darin noeh Verbindungen enthalten, die dem ~ther erst mit hSheren Salzsgurekonzentrationen enzogen wurden. So wurde mit 12 %iger Salzsi~ure ein grfiner Farbstoff extrahiert, tier in Pyridin aufgenommen ein 4bandiges Spektrum yon Xtiotyp zeigt mit Maxima bei 650, 580, 550 und 510 m/~. Behandlung mit Hydroxylamin in Pyridin versehob nur die Banden bei 550 und 510 um wenige m# nach Blau. Mit Benzoylchlorid keine Reaktion. Wahrscheinlich handelt es sich um ein Gemisch, da die rote Bande zu den iibrigen bei den verschiedenen Pri~paraten nicht in einem konstanten YerhiMtnis stand. Hinsichtlieh ihrer Menge traten diese Verbindungen gegeniiber dem Spirographisporphyrin sehr zurfick, voraus- gesetzt, dab man die spezifische Extinktion der versehiedenen Porphyrine in ihren entsprechenden Maxima als Khnlich annehmen daft. DaB in dieser Fraktion Diformylporphyrinester in erheblieher ~enge vorhanden ~-ar, ist nicht anzunehmen, da die Banden dieses Porphyrins noch weiter nach Rot verlagert sind als die des Spirographisporphyrins (FISCHER und D]~IL- MANN 15).

Zusammenlassung.

Vom VerdoglobinNo ~ wurde die prosthetisehe Gruppe abgetrennt. Aus dem YerdNo ~ wurde ein Porphyrinester erhalten, der durch seine S~ure-

lSslichkeit, Lichtabsorption und einige Reaktionen als Spirographis- porphyrinester identifiziert wurde. Demnaeh ist Spirographisham als prosthetische Gruppe des Verdxo~ anzunehmen.