Histoehemie 2, 76--86 (1960)

Aus dem Botanisehen Institut der Universitat Heidelberg (Direktor: Prof. Dr. A. S~:BOLD)

DAS E I N D R I N GEBI VON 0 SMIUMTETROXYD-, KALIUMPERMAN GANAT- UND F O R M A L D E H Y D L O S U N G E N I N P F L A N Z E N G E W E B E

Von

PETER SITTE

Mit 15 Textabbildungen

(Eingegangen am 2. Juni 1960)

Gute Fixierung ist die erste Voraussetzung ffir erfolgreiche Untersuchung yon Gewebszellen im Elektronenmikroskop. W~hrend es ffir Warmblfitergewebe schon detaillierte und wohlbegriinde~e Fixierungsvorschri~ten gibt, gelingt die Fixierung yon Pflanzengewebe in maneher Hinsieht nut unbefriedigend, wie sehon die st£ndigen Versuehe zeigen, die Methodik zu verbessern (vgl. zuletzt McLEA~r 1960). Aus den eigenen Untersuchungen zu diesem Problem sollen durch die vor- liegende Mitteilung jene bekannt gemaeh~ werden, die das Eindringen der Fixan- tien in P[lanzengewebe betreffen.

Fiir die Elektronenmikroskopie hat vor allem R~ODIN (1954) auf die Bedeutung dieser Frage hingewiesen; er benutzte dabei die Ergebnisse der grfindliehen Untersuchung yon U N D E ~ L (1932), der eine entsprechende yon v. T~LL:~ES~IC~:Y (1926) vorausgegangen war. Sehou dieser h~tte gefunden, dab 2%ige OsOt-L6sung wesen%lich sehneller eindringt, als 0,5%ige, d~B ferner die Eindringgesehwindigkeiten naeh Objekt (Leber, Mflz, :Niere, Him) versehieden sein k6nnen, und dab das weitere Vordrhlgen sieh mit zunehmender :Fixierungs- dauer immer mehr verl~ngsamt. - - Kiirzlich hat Wt~STENFET.D (1955, 1956) mit der Methode yon I~E~EIS (1955) das Eindringen versehiedener Fixantien in Warmbliitergewebe erneut untersucht. 1

Entsprechende Untersuehungen an Pflanzengewebe sind bisher nieht bekannt geworden.

In den eigenen Untersuchungen wurden die in der Elektronenmikroskopie ~m h£ufigsten angewende~en Fixantien geprfift: Osmiumtetroxyd, Formol und Kal~umpermanganat. Als besonders giinstiges Objekt erwiesen sieh Coni]eren- Nadeln im Winterzustand: In sie kSnnen Fix~ntien nut dureh frische Schnitt- fl£ehen eintreten, weil die Epidermen ihrem Eindringen einen so hohen Widerstand entgegensetzen, dab sie aueh naeh Tagen noch nieht dutch sie in das Mesophyll gelangt sind; die Stomata sind geschlossen, ihre Vorh6fe zus~tzlieh durch diehte Pfropfen gesperr~ (WUL~F 1898; neuerdings ttXRTEL und PxeEsc~ 1955). Das Vordringen yon den Sehnit~flachen aus verlauft sehr gleiehmiiBig; es ist sogar ohne wesentliehen Belang, ob es basi- oder acropetal effolgt. Zum Vergleieh wurde (auBer bei Formol) das Vordringen der Fixan%ien aueh im wasserreichen Speicher- parenehym der Karto//ellcnolle untersucht.

Versuehe mit Osmiumtetroxyd NIethode. Die TS~ung einer Coniferen.N[esophyllzelle durch OsO~ ffihrt f~st augenblick-

lich zu einer vollst~ndigen Sehwarzung der Vacuole, die so dieht ist, dab der Zellsaft im

1 Anmerkung bei der Korrektur: Auf die wiihrend des Druekes erschienene Studie yon HA~ST~6~ und Bxm~ (Histochemie 2, 1--4, 1960) fiber das Eindringen van OsO4-L5sung in Lebergewebe der Ratte sei verwiesen.

Eindringen yon Fixantien in ~lanzengewebe 77

Lichtmikroskop undurchsichtig erscheint; im Elektronenmikroskop zeigt sich ein flockiger Niedersehlag. Das Eindringen yon OsO~ in vorne und hinten quer abgesehnittene Nadeln l~I~t sich nun sehr genau am Vordringen der Mesophyllsehw~rzung dureh die durchsiehtige Epidermis hindurch verfolgen (Abb. 1); dab die noch ,,grfinen" Zellen in unmittelbarer Naehbarschaft der getSteten ,,sehwarzen" leben, konnte dureh Plasmolyse bewiesen werden.

Die Beobaehtung und Vermessung der Nadeln erfo]gte in kleinen Glasdosen (15 ml Fassungsraum, mit jeweils 5 ml Fixierungsfliissigkeit und 3 vorne und hinten abgeschnittenen Nadeln, also 6 Me~stellen), die mit planparallelen Sehliffdeekeln gasdieh¢ versehlossen waren; Kontro]len bewiesen, dab unter diesen Bedingungen auch naeh 4 Wochen OsO~-Verluste nieht eingetreten waren. Die Eindringtiefe der Schw&rzung (ET) und damit das Vordringen yon OsOa wurde unter einem Stereomikroskop mit Ocularmikrometer vermessen.

Eine entsprechende, kontinuierliche Beobach- tung ist im Knollenparenchym der Kartoffel selbst- verst~ndlich ausgesehlossen; es wurden daher frisch herausgeschnittene Parenchymwiirfel (7 mm Seiten- lange) in die FixiermlgslSsungen eingelegt, zu jeder Messung 2 davon entnommen und dureh einen vertikalen, zwei gegenfiberliegenden Seitenfl~ehen para]lelen Sehnitt halbiert; ET wurde an den in Abb. 2 eingezeichneten Stellen der entstandenen Schnittfl~ehen gemessen. Die so dutch Einzelmes- sungen an verschiedenen Gewebestficken erhaltenen Werte ffigen sich naturgem~B schlechter in eine Kurve, als die dureh fortlaufende Messung dersel- ben Nade]n gewonnenen.

Ergebnisse mit Nadeln yon Picea excelsa Link (letzter Jahrgang) . Fig. 3 zeigt die Ab- hi~ngigkeit der E T yon Zeit und OsO4-Kon- zentration der Fixierungsfliissigkeit. Erwar- tungsgemiH~ dringen hSher konzentr ier te L5- sungen rascher ein als solche mi t niederem Geh~lt, doch besteht zwischen ET/Zei t und OsOa-Konzentrat ion kein linearer Zusam-

Abb. 1. Vermessen der E T (= Ein- dl~ingtiefe) (m) an zerschni t tenen

Coniferennadeln (Vergr.)

D D Abb. 2. Vermessen der E T (= Ein- dringtiefe) (D) an Pa renchymblScken aus

der t~artoffelknolle (Pfeile: Me2stelle)

menhang (Abb. 4). Da ein mSglichst rasches Vordringen des Os04 n~ch fiberein- s t immendem Urteil ffir die gute Fixierung wichtig ist, empfiehlt sich fiir die Praxis, mi t h6heren OsO4-Konzentrat ionen als bisher zu arbeiten. Es ist allerdings m6g- lich, dab dadurch bisher unbeachtete stSrende Nebenerscheinungen auftreten 1.

Der Eb~luB der yon P~AD]~ (1952) empfohlenen Pu//erung der Fixierungs- flfissigkeit mi t ~Na-Veronalacetatpuffer auf die Geschwindigkeit des Eindringens zeigt Abb. 3; sie verursacht bei unserem 0b jek t eine m&l~ige H e m m u n g des Ein- drh~gens.

Welter wurde gepriift, wie groi~ allenfalls der EinfluB der (Volums-)Molaritiit der Fixierungsflfissigkeit bei kons tan tem Os04-Gehalt (1%) ist; die Ergebnisse der Versuche mi t Rohr- und Traubenzucker , I-Iarnstoff und Kal iumni t ra t zeigen die Diagramme der Abb. 5. Einen hemmenden Effekt ha t die Zugabe yon Rohr- zucker (~¢[G. 342,3), m6glicherweise infolge einer Entquel lung des Gewebes.

1 Verf. verdankt Herrn Dr. P. GIESBREC~T (Berlin) den freundlichen ttinweis, dal~ bei der Fixierung yon Proteinen mit OsOt-LSsungen steigender Konzentration die auftretenden p~-Sehwankungen starker werden; wieweit derartige Erscheinungen die Fixierung yon Ge- weben beeintr~chtigen k5nnen, ist noch zu priifen. - - Zur Fixierung yon zentralem ~ervenge- webe wurden 3 ~ % i g e LSsungen empfohlen (P~LA¥ und PALA])E 1955); P~ADE (1952) hatte durch 2 % ige L5sung statt der normalen 1%igen an der Leber der Maus keine Verbesse- rung gefunden.

78 PETER SITTE:

Glucose (MG. 180,2) beeinilu~t das Eindringen kaum, Harnstoff (MG. 60,1) fiber- haupt nicht; dagegen fSrdert es KRTOa, vielleieht dnrch Quellang des Gewebes.

IT g000

A

1,406

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",/? " i f

ET 7 000

750

500

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~' 2000

ET ~' ~ 500

7 000

I

500

I I T I d00 f~g0 rain a 7 3 3 ~

Abb. 3 Abb.

Abb. 3. A b h ~ n g ~ k e i t des Eindi4ngens yon O s O : L S s u n g e n in Fiohtennadeln yon E:onzentrat ion und Fix ierdauer

Abb. 4. Eindr ingen yon OsO:LSs tmgen in F ich tennade ln in Abhi~ngigkeit yon der ]~:onzentratiou

Sooth. 6"/uc. #tea ~03

75o ~ ~so ~ zo

500 $00 5"00

ZSO gSO 8

0 I I I I O I I I I 0 1 1 r I o ~,5~,oI,5 o 451,o7,5 o u,5~07,5 o 457,0s,5

molar Abb. 5. Einflu~ yon 1Vfol~ritiitserhShung 1 Toiger OsO:LSsun- gen du tch Rohrzucker , Glucose, Harnstof£ und K a l i u m n i t r a t a~f alas Eindrin~en in Fiehtennadein. Un te r s t e E:~rve jeweils

60 rain, mi t t l e re 120 mia , oberste 250 rain naeh Fixierungsb egin~

Uberraschende Ergebnisse brachte die Untersuehung des Eindringens yon 1%igen 0s0a- LSsangen bei versehiedenen Temperaturen: Entgegen der Erwartang ist bei dem hier verwendeten 0bjekt dureh hohe Temperatur das Ein- dringen nicht gefSrdert and bei niederer nut unerheblieh gehemmt (Abb. 6). Fixierung bei 4 o C (RHoDIN 1954) be- deutet darer nicht yon vorn- herein, da$ der Nachteil we- sentlich langsameren Eindrin- gens in Kauf genommen wet- den mu$, wie RHoI)IN (1954, S. 42) unter Berufnng auf L. W. 0~oL~ vermutet. Dagegen bedeutet die ErhShung der Temperatur bei Picea-Nadeln nieht eine FSrderung, sondera IIemmung, wohl bedingt durch die Abnahme der OsO~-Kon- zentration tefls durch Zerset- znng in der Fixierungsflfissig- keit, teils durch gesteigerte Bindung im Gewebe sclbst (vgl. dazu R~oDI~ 1954, S. 40). DaB fibrigens hier dieVanthoff- sche Regel ,,kaum odor aueh nicht einmal ann/~hernd zu- trifft", hatte sehon v. TEL- L~ES~ICK¥ (1926, S. 761) an tierischen Geweben festge- stellt.

SehlieBlich wurde noch ffir 3 Proben ein Langzeitenversuch fiber 30 Std angestellt (Ab- bildung 7); die dabei erhalte-

hen Kurven erlauben eine mathematische Behandiung, deren Ergebnisse ffir die Theorie des Eindringvorganges nicht uninteressant sin&

Unter der Annahme, da$ die OsO~-Konzentration der Fixierungsflfissigkeit (co) w/~hrend der Fixierung konstant bleibt, last sich prfifen, ob ihr Eindringen den

Eindringen yon Fixantien in Pflanzengewebe 79

Diffusionsgesetzen gehorcht. Aus den Fickschen Diffusionsgesetzen li~lTt sich fiir den erwahnten Fall folgende spczielle LSsung ableiten (H. ]7oP~i):

c(x,t)~-Co [ 1 - - ¢ ( ~ t- )] (1)

tIierin bedeuten : C(x ' t) jene 0sQ-Konzentrat ion, die jeweils znr TStung und Schw~rzung einer Mesophyllzelte gerade ausreicht; also jene Konzentrationsstu~e, deren Vordringen gemessen wurde und in den Abb. 3 und 5--7 dargestellt ist;

x entspricht der ET . ~ = ~ (z): Gaul3sches Fehlerintegral, in dem t

die Zeit und D die Diffusionskonstante bedeuten. Wenn c(~, o u n d c o konstant sind, gilt

c(~, t) __ constant = 1 -- ~b (z) (2) co

Da also (z) konstant ist, gilt schliel31ich:

E T =- k V-[ (3)

Die Kurven der Abb. 3, 6 und 7 sollten demnach Parabeln entsprechcn und bei Auftragen der Werte nach Logarithmen Gerade ergeben, was jedoch nicht zutrifft.

ET o.-I-' 7%,goc ET 7 + ~ ~-- -- 1000 " " "" + ~ / %, 20 o 2x

1000 - - - -

750 Op 5 %, dO o

500

505 ~

0 500 7000 15o0 min ZOO0 A b b . 7

Z56 Abb. 7. L a n g z e i t e n v e r s u c h : E i n d r i n g e n y o n OsOa-L6sungen in F i c h t e n n a d e l n

0 Z00 #00 rain Abb. 8

Abb . 6. Einflufl der T e m p e r a t u r au f das E i n d r i n g e n 1 % i g e r £d0 OsO4-LSsung in F i ch t ennadeba

Man kann nun aber Kurven des experimentell gefundenen Charakters erhalten, wenn man clio E T - ( = x-)Werbe im Koordinatensystem nicht nach linearem, son- dern nach quadratischem MaBstab auftrag~, die t-(----y-)WerCe linear b e l ~ t (Abb. 8); man sieht leicht, dab die so entstehende Kurve zuni~chst Parabeln mit hohem /c folgL dann aber Parabeln mit mehr nnd mehr abnehmenden k-Werten. Zur entsprcchenden Deutung der experimentell gefundenen Kurven sind nun vor

8 0 PETER SITTE :

allem zwei der gemaehten Annahmen zu prfifen: Die Konstanz yon co und die Konstanz yon D; beide GrS$en kSnnten wahrend des Versuches abnehmen, c o

dutch den in seiner GrSf3e unbekannten OsO4-Verbraueh wahrend der Fixierung, D infolge einer zunehmenden Verdichtung des Gewebes bei der Fixierung. In beiden Fallen wiirden sich in den Diagrammen nicht Parabeln, sondern Kurven des gefundenen Charakters ergeben. Denn bei einer Abnahme yon c o wahrend der Fixierung miiSte naeh (1) 1 - - ¢ (z) und damit das Gaul~sehe Fehlerintegral

x grSSer werden; bei konstantem D wiirde also der Weft von k ~ w/~hrend der

Fixierung zu --=, k daher abnehmen. - - Wird andererseits c(x, % als konstant ange- Co

sehen, gilt (3) ; ein Faktor in k ist V D-, so da$ k mit abnehmendem D absinkt. Die Entscheidung zwischen diesen beiden mSglichen Fallen ist experimentell

leieht zu treffen. Aus den bisher behandelten Ergebnissen ist bereits zu ersehen,

Y

0 5 /# 75

Abb. 8. Parabeln ?4 =kV~ (Ic jeweils vermerkt, Ordin~tenmaBstab rcchts der Ordinate) und ET/ Zeitkurve (stark ausgezogen, OrdinatenmaBstab

links der Ordinate). YgL Text

dal~ die Kurvenform nur unter An- nahme sehr wesentlicher OsO4-Ver- luste wahrend der Fixierung erklart werden kann, wenn die Verringerung yon c o entseheidend ist; nach Abb. 3 etwa mfil~te die Konzentration der 4%igen OsO~-LSsung schon naeh 25 rain auf 0,5 % gesunken sein und bald noch wesentlich darunter ab- sinken - - und dies in der gesamten FixierlSsung, da w/£hrend der Ver- suehe zum Ausgleich lokaler Konzen- trationsuntersehiede gelegentlieh ge- schfittelt wurde. Eine derart starke

Abnahme yon Co ist leicht me$bar und kann ebenso leicht unterbunden wer- den, wobei sieh dann andere Kurven ergeben mfil~ten. Beide Wege der Prfifung wurden beschritten.

Fiir die co-Messung wnrde unter Beibehaltung der MengenverhaltrSsse der Standardversueh (Fixierung yon P i c e a - N a d e l n in 1%iger, w/~f~riger, ungepufferter OsO~-LSsnng) in gasdicht verschlossenen Quarzkiivetten unter einem UV- Spektro- photometer (SP 500 der Unlearn Instr. Ltd., Cambridge) wiederholt. Die Trans- parenz (T) yon OsOa in H20 hat im siehtbaren Bereich ein wenig charakteristi- sehes Maximum bei etwa 650 nm und sinkt im langwelligen UV rapid auf Null ab. Da bis zu einer Wellenl/~nge yon 120 nm keine Zunahme yon T mehr auftritt , wurde die co-Bestimmung durch Ermittlnng der Wellenl/~nge bei T ~-40% aus- geffihrt; Konzentrations~nderungen yon 1% kSnnen so noeh erfaSt werden. Bei der Messung wurde T der Kontrolle (l%ige, reine OsO4-LSsung ) mit der Probe (gleiehe LSsung mit P i c e a - N a d e l n ) bezogen auf Twass~r zwischen denWellen- langen 370 400 nm bestimmt, daraus die Wellenlange ffir T = 40 % graphiseh er- mittelt, sehlie$1ich-- ebenfalls graphiseh fiber eiue Eichgerade - - c~. Diese Konzen- tration sehien nun wahrend der Fixierung sehwach anzusteigen (Tabelle 1), weft eine zus~tzliehe Absorption dutch Stoffe auftritt, die aus den Nadeln diffundieren 1.

1 Es handelt sich dabei wohl vorwiegend um Vacuolenstoffe, da auch eine Vers~uerung der FixierlSsung eintritt.

Eindringen yon Fixantien in Pflanzengewebe ~1

Die Aufnahme yon Dif ferenzspekt ren Kon t ro l l e /P robe vor und nach der Ent fer - hung des O s Q du tch Verf lf ieht igung naeh dem 0f fnen der K i i v e t t e n bewies das und zeigte, dab es gegeniiber der Kont ro l l e aueh zu ke iner merkl iehen A b n a h m e yon Co w~hrend der F ix i e rung gekommen war.

co i s t demnaeh p rak t i seh k o n s t a n t ; dab an- dererse i ts D w/thrend der F ix i e rung im f ix ier ten Teil des Gewebes s t a rk a b n i m m t , war eben- falls le icht zu zeigen. Zun~ehst wurde das Vor- dr ingen 2%iger , ungepuffe r te r OsO4-L6sung in F i e h t e n n a d e l n in 2 ge t r enn ten P roben ver- messen, bei deren einer Co du tch s t t indl iehe E rneue rung der Fixierungsf l f i ss igkei t k o n s t a n t geha l ten wurde (Punk te in Abb. 9), w~thrend die Nade ln der anderen Probe wie bei den oben ge-

Tabelle 1

Fixierungs- dauer in Minuten

8 27 68

120 240 350

% OsO4

Kontrolle I. Probe

1,00 0,95 1,02 0,96 1,01 0,97 0,94 0,98 0,93 0,98 0,93 0,99

seh i lder ten Versuehen in der bei Versuehsbeginn eingefi i l l ten L6sung verb l ieben (Kreise in Abb. 9) ; die beiden K u r v e n s ind erwartungsgemiiB ident isch. 225 ra in naeh Versuehsbegi lm (Pfeil in Abb. 9) wurde nun yon jeder Nade l am einen Ende

J#O0

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700 200 Abb. 9

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700 ZOO JO0 400 0 JO0 600 300 min gO0 min

Abb. 10 Abb. 9. Vgl. Text

Abb. 10. Eindl'ingen 1%iger OsO~-LSsung in Nadeln (e Pinus, jiingere Nadeln; © Pinus, ~ltere Nadeln; A Picea, jtingere Nadeln; A Picea, ~ltere Nadeln) and Kartoffelknollenparenehy~l +

das berei ts f ixierte, geschwgrzte Gewebe entfernt , d ie andere Seite als Kont ro l le u n v e r g n d e r t belassen. An diesem Ende ha t t e das wel ter vordr ingende OsO 4 den Di f fns ionswiders tand der sehon f ix ie r ten Sehichten zu f iberwinden, auf der an- deren Seite n ieh t ; das wei tere Vordr ingen i s t nun ta t s~ehl ieh an den versebie- denen E n d e n sehr untersehiedl ieh (Gabelung der K u r v e n in Abb. 9); an den

82 PETER SITTE :

, ,dekapitierten" Enden dringt O s Q ebenso rasch ein, wie bei Versuchs- beginn 1.

Es ergibt sich also, dal3 im ET/Zei t -Diagramm deswegen keine Parabeln aufseheinen, weil sieh die Diffusions- , ,Konstante" dureh die Ver~tnderungen des Gewebes w/~hrend der Fixierung gndert. So best~tigt sich die Vermutung vieler Praktiker, die v. TELLYESNICK¥ mit folgenden Wor ten ausgedrfiekt ha t (1926, S. 758) : , , tIieraus lernen wir aueh jenen Umstand , dal~ die Fixierungsfliissigkeiten mit der dureh sie selbst hervorgerufenen Niederschlagskruste die Schnelligkeit ihrer Diffusion selbst verr ingern".

Untersuchung anderer Ob]ekte. Bisher wurde fiber Versuche an Fichtennadeln des jfingsten Jahrganges im Winterzus tand berichtet ; es erhebt sich die Frage, wieweit die Ergebnisse auf andere pilanzliehe 0b jek te i ibertragbar sind.

Zunachst wurden noch weitere Coni/erennadeln im Winterzus tand nntersucht (Abb. 10); 1%ige OsO~-LSsnng drang in Nadeln yon Pinus silvestris L. etwas rascher vor, als in denen der Fiehte, bei beiden Ar ten abet in den Nadeln des jfingsten Jahrganges raseher als in denen dos vorletzten, die auch jeweils den geringeren Wassergehalt aufwiesen.

I n das Knol lenparenchym der KartoHel dringt l%ige OsO4-LSsung rascher ein, als in Coniferennadeln (Abb. 10).

Eine Erneuerung der FixierlSsung alle Viertelstunden--um c o sicher konstant zu halten - - hatte auch bier nicht den mindesten Einflul~ auf das Vordringen des Os04. - - Die Eignung von Kartoffelknollen selbst der gleiehen Sorte fiir diesen Versuch ist iibrigens unterschiedlich; viele werden in 0sO 4 nicht schwarz, sondern nur hell graubraun. Worauf diese Unterschiede in der l~eaktion mit OsO~ beruhen, wurde nieht untersucht.

Erwartungsgemgl~ dringen also gleieh konzentrierte OsO4-LSsungen in ver- schiedene Objekte verschieden schnell ein; die allgemeinen Gesetzm~l~igkeiten gelten aber offensieht]ieh nieht nur ffir Coniferennadeln, an denen sie zungchst ermit tel t worden sind.

Yersuche mit Formol Methode. Die eben darges~ellten Versuehe an Coniferennadeln mit Formol zu wiederholen,

war mangels sicher und leicht erkennbarer Ver~nderungen bei dieser Fixierung unerwgrtet sehwierig. Es war selbst mit Fluoreseenzmethoden nicht mSglich, die jewefls erreichte ET an den Nudeln laufend zu ermitteln. Auch Versuehe mit Tetrazoliumsalzen br~ehten keine sicheren Ergebnisse.

Die Plasmolysemethode setzt die exakte Zerlegung der Nadeln in Quersehnitte mit geniigend vielen unverletzten Zellen voraus (Sehnittdicke etwa 70 #; L~ingssehnitte sind wegen der Form der Mesophyllzellen noch weniger geeignet) ;sie is~ daher umst~ndlieh, ungenau, und sehlieltt eine kontinuierliehe Beobachtung aus. - - Aueh der Formolnachweis im fixierten Gewebe dutch Schiffsehes Reagens lal~t keine kontinuierliehe Messung zu und liefert keine genauen Ergebnisse. Immerhin konnten mit den beiden letztgenannten Verfahren einigeiibereinstimmende Resul- rate erzielt werden, die freilieh nur eine vorl~tufige Orientierung erlauben.

Ergebnisse. Fiir Picea-Nadeln entspricht der Verlauf der Kurven (Abb. 11) dem mit OsOt ermittel ten (der entsprechende S tandard ist zum Vergleich ein- gezeichnet); auch die Konzentrat ions- und Tempera turabhangigkei t ist deutlich gegeben; TemperaturerhShung bewirkt bei Formol eine erhebliche Besehleunigung

Die Abnahme der euticul~ren Transpiration bei zunehmendem Austroeknen der Cuti- eula, also steigendem Diffusionswiderstand der Epidermisaul~enw~tnde (vgl. SEYBOLD 1930) liefert Kurven, deren Charakter dem bier gefundenen gleicht (PIsEK und BEGGER 1938). Die m~thematische Behandlung der fiir die Cuticulartranspiration gefundenen Kurven dureh Y. FUKUDA (1935, erw~hnt bei PISEX und BERGER 1938) konnte leider nicht eingesehen werden.

E i n d r i n g e n y o n F i x ~ n t i e n in P f l a n z e n g e w e b e 8 3

3 000

[T

3 500

Z 000

7 500

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T ~ • ..... I'~ ;oo

I i

o 700 2oo $00 m~n ~0o o #0 7zo 780 rain ZVO ibb. 11 ibb. 12

J bb. 11, Eindx'ingen yon Formol in F ich tennadeln (1 :3 ,5 % ; I I : 10 % ; I l l : 35 % ; OsO4-St~nd~rd: 1% )

Abb. 12. E indr ingen yon K ~nO4-L6sungen in EZartoffelknollenparenchym in Abh~ngigkei t yon Konzent r~ t ion u n d Fixierungsdauer

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!: . . . . 7-" I p I r 0 1 Z 3 % ~ g## 400 800 #00 7000rain

Abb. 13 Abb. 14 Abb. 13. Ein4r ingen yon KMnO4-L6sungen in ]~r to f fe lknol lenparenehy-m in Abh/ingigkeig yon der

Konzent r~ t ion

Abb. 14. E indr ingen yon KMnO4-LSsungen in Fichtenn~dein (1% KMnO~; ...... ) und in Kartoffelknol len- parenchyrn bei abs inkender co (vgI. Tex t ; $ : 0,5 % KMn04; A 1% ; O 2 %; Ak 4 %)

8 4 PETER SITTE :

des Eindringens. Zusatz yon 1,5 mol. Ihrns tof f oder Saccharose hatte keine klar erkennbare Wirkung. Die normal verwendeten Formaldehydkonzentr&tionen (3,5- und 10% ig) dringen etwas rascher ein als 1% iges OsO 4.

#rain fg

75

70

5

Versuche mit Permanganat Me&ode. Das Eindringen yon Mn04- l~Bt sich leicht an der Schw&rzung des fixierten Ge-

webes durch 1VinO 2 verfolgen; dal~ fiber die braunsteinhaltigen Schichten hinaus Permanganat- ionen nicht vorgedrungen sind, ist am Fehlen der Ionenfarbe jederzeit sicher feststellbar.

Ergebnisse. In Coni/erennadeln dringt

Y

g 4;' 4z mo] 43 K

Abb . 15. A b h ~ n g i g k e i t der E i n d r i n g g e - s chwind igke i t (EG) y o n der m o l a r e n K o n - z e n t r a t i o n des F i x a n s (K). O Kar to f f e l - k n o l l e n p a r e n c h y m in 0sO4; • 4esgl. in ID/InO4. L F i c h t e n n a d e l n in 0 s 0 4 ; A desgl.

in KlVInO 4

l%ige KMnO4-L6sung (0,063 tool.) auf- f~llig langsam ein (Abb. 14).

In Karto//el]cnollenparenchym erfolgt das Vordringen etwas langsamer als das gleich- prozentiger 0sO~-LSsungen. Die ET/Zeit- Kurven (Abb. 12) zeigen jedoch auch bier den mit OsO~ an Nadeln festgestellten Ver- l ad , so da6 sich analoge Folgerungen erge- ben; ebenso ist ffir beliebige Versuchszeiten die Abh~ngigkeit der E T yon der Kon- zentration des Fixans keine lincare (Abb. 13, vgl. damit Abb. 4). Die Ahnlichkeit der bier erhaltenen Ergebnisse mit den bei Os04 gefundenen ist bemerkenswert, weil die beiden Fixantien in mehrfacher Hinsicht verschieden wirken; besonders auffgllig bei Permanganatfixierung ist die starke

Maceration des Gewebes infolge oxydativer ZerstSrung der Pektine (vgl. F~E¥- WYSSLIN~ 1935, S. 74).

BekanntHch kSnnen PermanganatlSsungen sehr leicht reduziert werden; dies geschieht bei der Fixierung nieht nur im Gewebe, sondern auch in der L6sung dutch Stoffe, die aus dem ]fixiergut austreten; wenn man also die LSsung w&hrend der Fixierung nicht 5fter erneuert (wie dies in den oben dargestellten Versuchen geschehen ist), wird sie vor allem bei gr6Beren ~engenanteilen des Fixierungsgutes raseh zersetzt, womit konstante Endwerte yon ET erreicht werden (Abb. 14). Hier ist also tats&ehlich die Abnahme yon c o entseheidend; die Fixierungsflfissigkeit wird zun~chst dureh ausfallenden Braunstein immer mehr getrfibt, das Filtrat zeigt die Farbe der MnO~-Ionen immer sehw~eher, schliel~lieh 11ieht mehr und an ihrer Stelle die hellgelbe eines MnO2-Sols. So erkl~rt es sich auch, dal~ bei dem in Abb. 14 dargestellten Versuch der ET-Grenzwer~ flit die 2%ige L6sung geringer ist als bei der 1%igen: In der 2 %igen L5sung maehten die Parenehymbl5cke 32 Vol.-% der Fixierungsfifissigkeit aus, in der 1%igen Liisung nur 14,3 Vol.- % (entsprechend: 0,5 % .. 15,4 Vol.- % ; 4 % . .. 10 Vol.- % ).

Diskussion In Abb. 15 ist versucht, die wesentlichen Ergebnisse zusammenzufassen.

Um die Eindringgeschwindigkeiten der verschiedenen Fixantien vergleichbar zu machen, sind die molaren Konzentrationen angegeben; au•erdem wurde jeweils die mittlere Eindringgeschwindigkeit wghrend der ersten Stunde der Fixierung in #/Min. eingetragen (EG).

Der Unterschied der Objekte tri t t deutlich zutage; auBerdem ergibt sich die vielleicht iiberraschende Tatsache, da~ 0s04 unter vergleichbaren Bedingungen

Eindringen yon Fixantien in PIlanzengewebe 85

rascher in beliebige Gewebe eindringt, als die iibrigen geprfiften Fixantien. Die mit Formaldehydl6sungen an Nadelmesophyll erhaltenen Ergebnisse sind wegen ihrer Unsicherheit nicht eingetragen; es erg'~be sieh bei 3,5%igem (1,17 mol.) Formol ffir EG 16,7, bei 10%igem (3,33 mol.) Formo125,6; dies zeigt bei aller Unsicherheit der Einzelmessungen doch eindeutig - - in 1)bereinstimmung mit den Ergebnissen v. TELLYESNICXYS (1926) - - dal32'ormol verglichen mit /~qui- molaren OsQ- und PermanganatlSsungcn sehr langsam eindringt.

Interessant ist auch ein Vergleich mit v. T~nLY~S- NICKYs an Warmbl/iterge- webe ermittelten EG, fiber die Tabelle 2 informiert (die Werte sind nach v.TE]~- LYESNICKYS graphischer Darstellung berechnet).

Tabelle 2

I mol. I~on- I EG ff ir Fixans zentration Leber I Mflz t Niere ttirn

!~ormaldehydOS04 . . . . I 0,0791 i 12,516,6 ?i 20,0 10,8 [ 0,020 [ 4,2 8,3 13,3 6,7 1,17(?) ~ 9,2 5,0( 15,8 16,7

Trggt man diese Werte in Abb. 15 ein, so wird deutlich, dab die EG bei Pflan- zcngewebe im Streubereich der entspreehenden bei tierischen Geweben liegen, so dab die gelegentlieh zu h6rende Ansieht, tierisches Gewebe wiirde raseher durchdrungen, nicht allgemein gilt.

Die im 2. Absohnitt gegebene Ableitung hat frenndlieherweise Hen" Dr. It. PoPPA aus- gefiihrt; auoh Herrn Dr. R. W]~TTE habe ieh ftir Mithilfe in mathematisehen Fragen sehr zu danken. -- DiG Deutsche Forsehungsgemeinsehaft hat dig Untersuehungen groBziigig unter- stfitz~.

Zusammenfassung Untersucht wurde unter verschiedenen Bedingungen das Eindringen ver-

schieden konzentrierter L6sungen yon OsQ, Formaldehyd und KMnO~ in Pflan- zengewebe (Nadeln der Fichte, Speieherparenehym der Kartoffelknolle). Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

1. Das Eindringen erfolgt um so rascher, je hSher die Konzentration des Fixans ist; zwischen Eindringgeschwindigkeit und Konzentration besteht jedoeh kein linearer Zusammenhang.

2. Im allgemeinen werden wasserreiche Gewebe rascher durchdrungen als wasserarme.

3. Nicht-fixierende Zus/~tze zu OsO4-L6sungen (Puffer, Glucose, Harnstoff) beeinflussen die Eindringgesehwindigkeit nur unbedeutend.

4. OsO~-LSsungen dringen in Fichtennade]n bei 40 C kaum langsamer ein als bei Zimmertemperatur; bei 40 o ist das Eindringen verlangsamt.

5. Das Eindringen der Fixantien ist keine einfache Diffusion. Die Diffusions- ,,Konstante" des Gewebes wird dureh die Fixierung verringert.

6. Bei gleicher molarer Konzentration dringt OsQ am schnellsten ein, M n Q etwas langsamer, Formol am langsamsten.

Summary The penetration of plant tissues (spruce needles and storage parenchyma of

potatoes) by solutions of different concentration of OsQ, formaldehyde and KMnO~ was investigated with the following results:

I. The velocity of penetration increases with the concentration of the fixative, but the dependence is not linear.

His~ochemie. Bd. 2 7

86 PETER SITTE: Eindringen yon Fixautien in Pflanzengewebe

2. The moist tissues are, in general, more quickly penet ra ted than the dryer. 3. The velocity of penetra t ion is only insignificantly affected by the addit ion

of non-fixatives (buffer, glucose, urea) to the OsQ-solut ions. 4. At 40 C the penetrat ion (of spruce needles) of the OsO¢-solution is scarcely

slower than at room temperature . At 400 C i t is pereeptably slower. 5. The penetra t ion of the fixative is no t a simple diffusion. The diffusion

, ,constant" of the tissue is reduced b y the fixative. 6. When the molar concentrat ions are the same, 0sO 4 penetrates the fastest,

KMn04 somewhat slower and formaldehyde slower yet.

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Prof. Dr. PETv.a SIT~, Botanisches Institut der Univ. Heidelberg, Hofmeisterweg 4