Botanisches Institut, WestHilische Wilhelms-Universitat Munster, Munster, Bundesrepublik Deutschland

Der EinfluB von Indolyl(3)essigsaure (IES) auf die Verteilung der intramembranosen Partikel des Plasmalemmas isolierter SproBkallusprotoplasten von Skimmia japonica THUNB.

The Effect of Indoleacetic Acid on the Distribution of the Intramembranous Particles of the Plasmalemma in Isolated Callus Protoplasts of Skimmia japonica THUNB.

HORST ROBENEK

Mit 5 Abbildungen

Eingegangen am 22. Dezember 1978 . Angenommen am 24. Januar 1979

Summary

Freeze-fracture technique has been employed to investigate the supramolecular structure of the plasma membrane of isolated stem callus protoplasts of Skimmia japonica after lEA treatment. Freeze-fracturing splits the plasmalemma :llong a central hydrophobic plane pro­ducing twO fracture faces known as the protoplasmic face (PF) and the exoplasmic face (EF), revealing the protein or lipoprotein molecules inserted in the lipid region in the form of intramembranous particles (IMP). The P f:lce contained more IMP per unit are:l than the E face of the same membrane. In special regions on both of the fracture faces the den­sity of IMP was reduced after lEA treatment compared to the plasmalemma of intact callus cells, freshJ.y isolated and control protoplasts. Upon progression of lEA treatment patches of IMP are formed on the P face and large areas of the lipid bilayer which lacked IMP were exposed.

These findings suggest that lEA induces alterations in the lipid fluidity and the distribu­tion pattern of IMP of the plasmalemma.

Key words: fAA, protoplasts, plasmalemma, intramembranous particles, Skimmia japonica.

Einleitung

Es ist bekannt, da~ die 1ES ma~geblich an der Regulation vieler Differenzierungs­vorgange in der Zelle beteiligt ist (ZENK, 1970; MASADA und YAMAMOTO, 1972; BAYER, 1973; SHEN-MILLER, 1973; LEOPOLD et aI., 1973; JUNIPER, 1976; SHEN­

MILLER und GAWLIK, 1977). Weitgehend unbekannt ist dagegen die Primarwirkung

der 1ES. Zwei Hypothesen tiber eine mogliche Primarwirkung stehen gegenwartig

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zur Diskussion: Die Aktivierung von Genen und die Anderung der Eigenschaften der Plasmamembran.

Urn Anhaltspunkte fiir die Giiltigkeit der 2. Alternative zu gewinnen, wurde in dieser Arbeit der EinfluB von IES auf die supramolekulare Struktur des Plasmalem­mas isolierter SproBkallusprotoplasten von Skimmia japonica mit Hilfe der Gefrier­atztechnik untersucht.

Material und Methoden

a) Anzucht des SproPkallus

An 1-2 cm langen, sterilen SproBstucken wurde auf einem Agarnahrboden (modifiziert nach GAUTHERET, 1959), dem 15 OfoKokosnuBmilch und2 mg!l 2,4-Dichlor-phenoxyessigsaure zugesetzt war, das Wachs tum von SproBkalli induziert. Die Anzucht erfolgte in 100 ml Er­lenmeyerkolben bei 27°C ± 1 °C und einer Beleuchtung von 500 Lux in einem Hell-Dunkel­Wechsel von 12 : 12 Stunden.

b) Isolation von Protoplast en

Die Isolation von Protoplasten erfolgte aus 6 Wochen alten KalluskuLturen. Es wurde eine Zwei-Phasen-Isolierung angewandt (ROBENEK und PEVELING, 1977). Enzymlosungen: 1. 0,7 M Mannitol in Aqua dest., 3 % Pectinase (Serva), pH 5,5, Inkubationsdauer 1 Stun de

bei 25°C. 2. 0,7 M Mannitol in Aqua dest., 3 Ufo Cellulase (Cellulase Onozuka P 1500 und RIO, Kinki

Yakult Manuf. Co., Nishinomiya, Japan), pH 5,5, Inkubationsdauer 3 Stunden bei 27°C. Die Protoplasten wurden in 0,7 M Mannitol in Aqua dest. gewaschen und durch Zentri­

fugieren angereichert. Fur die Durchfuhrung des Versuchs wurden die ProtopLasten in 0,7 M Mannitol in 0,1 M

Phosphatpuffer, pH 6,8, und verschiedenen IES-Konzentrationen inkubiert. Als Kontrolle dienten Protoplasten, die in einem 0,7 M Mannitolmedium, pH 6,8, ohne IES (Serva) ge­halten wurden.

c) Gefrieratzung

Kallusstucke und Protoplasten wurden durch Zugeben von Glutaraldehyd (ungepuffert, Endkonzentration 5 Ufo) fur zwei Stunden bei Zimmertemperatur fixiert. Nach dreimaligem Waschen in Phosphatpuffer wurden die Objekte fur 12 Stunden in 25 Ufoiges Glycerin (+ Phosphatpuffer) gegeben.

Die Gefrierfixation erfolgte in Freon 22. Die Gefrieratzpraparation wurde in der Gefrier­atzanlage BAF 360 der Fa. Balzers nach den Methoden von MOOR und MUHLETHALER (1963) durchgefuhrt. Die Repliken wurden in kaltem Wasser abgelost und in 400f0iger Chromsaure gereinigt. Nach dem Was chen in Wasser und Aceton wurden die Repliken auf unbefilmte Cu-Netze aufgenommen und im Siemens Elmiskop IA untersucht.

d) Messung der Partikeldichte und -grope

Zur Zahlung und Messung der Partikel wurden die Mikrophotographien auf 100 000 ver­groBert. Die Zahlung der Partikel erfolgte in der Regel auf 0,25 flm 2 groBen Testflachen beider Plasmalemmabruchflachen. Insgesamt wurden ausgezahlt:

KalLuszellen: PF: je 3 X 0,25 flm2 in 7 verschiedenen Zellen EF: je 3 X 0,25 flm 2 in 10 verschiedenen Zellen

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Frisch isolierte Protoplasten:

PF: je 3 X 0,25 ,um2 in 9 verschiedenen Zellen EF: je 3 X 0,25 ,um2 in 7 verschiedenen Zellen

Protoplasten, die 24 Stunden in 0,7 M Mannitol ohne IES kultiviert wurden (Kontrolle):

PF und EF: je 3 X 0,25 ,um2 in 5 verschiedenen Zellen

Speziell.e Regionen des Plasmalemmas der Protoplasten nach 12 Stunden in 0,7 M Mannitol + 0,1 mg/ml IES:

PF: je 3 X 0,25 ,um2 in 3 verschiedenen Zellen je 2 X 0,1 ,um2 in 4 verschiedenen Zellen

EF: je 3 X 0,25 ,um2 in 2 verschiedenen Zellen je 1 X 0,1 ,um2 in 5 verschiedenen Zellen

Auf den Bruchflachen der Protoplasten nach 24 Stun den Kultur war eine Zahlung der Partikel nicht mehr moglich. Die Dichte der Partikel wird in Anzahl pro ,llm2 angegeben.

Die Durchschnittswerte der angegebenen PartikeigroBen wurden durch die Messung fol­gender Partikelanzahl ermittelt:

Kalluszellen: PF: 238 IMP EF: 125 IMP

Protoplasten, die 24 Stunden in 0,7 M Mannitol ohne IES kultiviert wurden (KontroLle):

PP: 90 IMP EF: 180 IMP

Spezielle Regionen des Plasmalemmas der Protoplasten nach 12 Stun den in 0,7 M Manni­tol + 0,1 mg/ml IES:

PF: 125 IMP EF: 135 IMP

Ergebnisse

Das Plasmalemma der untersuchten Zellen wird durch den Verlauf des Gefrier­bruchs entlang der hydrophoben Zone auseinandergebrochen (BRANTON, 1969) und es entstehen zwei Bruchflachen, die nach der Nomenklatur von BRANTON et al. (1975) mit PF (Plasmalemmabruchhalfte, die dem Cytoplasma anliegt) und EF (komplemen­tare auBere Plasmalemmabruchhalfte) bezeichnet werden. Auf diesen Bruchflachen sind die in die Lipiddoppelschicht inkorporierten Protein- oder Lipoproteinmoleklile in Form von Partikeln (IMP) sichtbar. Die beiden Bruchflachen einer Membran kan­nen aufgrund ihres Partikelbesatzes voneinander unterschieden werden. Auf der PF­Seite befinden sich in der Regel wesentlich mehr IMP als auf der EF-Seite.

Die PF-Seite intakter KaIluszellen enthalt im Durchschnitt 1650 IMP l.um2, die EF-Seite 180 IMP/,um2

•

Auf den Plasmalemmabruchflachen frisch isolierter Protoplasten ist ihre Anzahl infolge der durch die Plasmolyse hervorgerufenen Umfangsverkleinerung haher (PF: 2080 IMPI.um2, EF: 210 IMPI.um2). AIle Partikel sind gleichmaBig tiber die gesamte Bruchflache verteilt. Nur gelegentlich lassen sich auf der PF-BruchWiche frisch iso-

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lierter Protoplasten aus drei bis vier IMP bestehende Reihen beobachten (Abb. 1). Beide Bruchflachen wei sen groBe Schwankungen hinsichtlich der PartikelgroBen auf. Auf der PF-Seite von Kalluszellen liegen sie in dem Bereich von 4-22 nm (mit einem Maximum zwischen 10-14 nm), auf der EF-Seite zwischen 4-18 nm (mit einem Maximum zwischen 8-10 nm).

Die Analyse der Partikelanzahl des Plasmalemmas von Kontrollprotoplasten, die 24 Stunden in 0,7 M Mannitol ohne IES kultiviert wurden, zeigt auf beiden Bruch­Wichen verglichen mit frisch isolierten Protoplast en eine geringe, aber nicht signifi­kante Abnahme der IMP pro Flacheneinheit. Die Verteilung und GroBe (verglichen mit intakten Kalluszellen) der IMP bleibt unveriindert.

Auf den Bruchflachen des Plasmalemmas von Protoplasten, die 12 Stunden in ei­nem Mannitolmedium suspendiert waren, dem 0,1 mg/ml IES zugesetzt wurde, ist in speziellen Regionen sowohl der PF-Seite (Abb. 2) als auch in komplementaren Bereichen der EF-Seite (Abb.3) eine Reduktion der Partikelanzahl festzustellen. Auf der PF-Seite wurden im Durchschnitt 850 IMP / /-lm2 und auf der EF-Seite 120 IMP / /-lm2 gezahlt. Verglichen mit Kontrollprotoplasten entspricht das einer Abnahme der IMP von ca. 60 % auf der PF-Seite und 40 Ufo auf der EF-Seite. Am Rande dieser Areale treten auf der PF-Seite ferner Vorwolbungen, auf der EF-Seite komplemen­tare Einwolbungen auf, die vollig frei von IMP sind. Die GroBe der IMP andert sich nicht.

Bei Protoplasten, die 24 Stunden 0,1 mg/ml IES ausgesetzt sind, kommt es auf der PF-Seite zu einer Aggregation der IMP, wodurch ausgedehnte Lipidflachen ohne IMP entstehen (Abb. 4). Auf der EF-Seite sind keine Unterschiede gegeniiber 12 Stun­den kultivierten Protoplasten zu beobachten.

Werden die Protoplasten 24 Stunden bei 0,2 mg/ml IES kultiviert, tritt auf der PF-Seite neben einer starken Reduktion eine Verklumpung der IMP ein, wobei eben­falls groBe Lipidbereiche ohne IMP gebildet werden (Abb.5). Die Individualitiit der einzelnen IMP geht verloren, so daB eine genaue Charakterisierung nicht mehr moglich ist.

Diskussion

Die "Repliken, die mit Hilfe der Gefrieriitzmethode von den untersuchten Zellen gewonnen wurden, zeigten ausgedehnte Bruchflachen von Plasmamembranen. Die Information der Gefrieratzbilder iiber die Membranstruktur ist in Obereinstimmung

Fig. 1: PF face of the plasmalemma of freshly isolated protoplasts. Occasionally rows of three to four IMP's can be observed. Fig. 2: PF face of the plasmalemma of protoplasts after 12 hrs in a culture medium con­taining 0.7 M mannitol and 0.1 mg/ml lEA. Fig. 3: EF face of the plasmalemma of protoplasts after 12 hrs in a culture medium con­taining 0.7 M mannitol and 0.1 mg/ml lEA

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mit dem fluid mosaic model von SINGER und NICOLSON (1972). Nach diesem Modell bestehen biologische Membranen aus einer doppelten Lipidschicht, in die Proteine eingelagert sind und in der sie sich frei bewegen konnen. Dur,ch den Verlauf des Gefrierbruchs wird die Membran zwischen den beiden Lipidschichten in die soge­nannte PF- und EF-Bruchflache gespalten (BRANTON et aI., 1975) und die Proteine werden zahlreich auf der PF-Seite und in geringerer Anzahl auf der EF-Seite in Form partikularer Untereinheiten (IMP) sichtbar (BRANTON, 1966; BRANTON und PARK, 1967; PINTO DA SILVA und BRANTON, 1970; TILLACK et aI., 1972; MARCHESI et aI., 1973, Yu und BRANTON, 1976). Es ist anzunehmen, dag diese Proteine enzy­matische Funktion ausiiben (ASHRAF, 1978). Die vorliegende Untersuchung hat ge­zeigt, dag durch den Einflug von IES morphologische Veranderungen in dem Plasma­lemma isolierter Sprogkallusprotoplasten auftreten. Nach 12 Stun den Kultur der Pro­toplasten bei 0,1 mg/ml IES tritt stellenweise eine Reduktion der IMP ein, die ver­mutlich mit einer erhohten Permeabilitat verbunden sein diirfte. Die Morphologie des Plasmalemmas nach 24 Stunden Kultur in 0,1 mg/ml IES und besonders in 0,2 mg/ml IES hat sich so stark verandert, dag die Funktion der Membran offen­sichtlich zerstort ist.

Obwohl die Art der Interaktion zwischen IES und Membranlipiden und Protei­nen nicht geklart werden konnte, mug angenommen werden, dag durch den Einflug der IES sowohl die enzymatischen Eigenschaften der Proteine als auch ihre Ver­haltnis zu den Membranlipiden modifiziert wird.

Literatur

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Fig. 4: PF face of the plasmalemma of protoplasts after 24 hrs in a culture medium con­taining 0.7 M mannitol and 0.1 mg/ml lEA.

Fig. 5: PF face of the plasmalemma of protoplasts after 24 hrs in :1 culture medium con­taining 0.7 M mannitol and 0.2 mg/ml lEA.

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