Der Transkriptionsfaktor FKHR interagiert mit STAT

Der Transkriptionsfaktor FKHR interagiert mit STAT-Faktoren und

verstärkt die IL-6-Signaltransduktion

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Florian Feld aus

Wuppertal

Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Peter Claus Heinrich Herr Universitätsprofessor Dr. med. Günther Schmalzing Tag der mündlichen Prüfung: 11. Mai 2004 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Veröffentlichungen wesentliche Teile der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht in: Kortylewski, M.*, Feld, F.*, Krüger, K. D., Bahrenberg, G., Roth, R. A., Joost, H. G., Heinrich, P. C., Behrmann, I., Barthel, A. (2003) Akt modulates STAT3-mediated gene expression through a FKHR (FOXO1a)- dependent mechanism Journal of Biological Chemistry 278, 5242-5249 PMID: 12456685 * Both authors contributed equally to this publication. Heinrich, P.C., A. Barthel, I. Behrmann, F. Feld, J. Grötzinger, C. Haan, H. M. Hermanns, H.-G. Joost, I. M. Kerr, M. Kortylewski, U. Lehmann, G. Müller-Newen, S. Radtke, R. Roth, F. Schaper, and A. Timmermann. (2002) Regulation of interleukin-6-type cytokine signalling Cytokines in liver injury and repair: Falk Symposium 125 (A. M. Gressner, P. C. Heinrich, S. Matern) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, pp. 221-237, ISBN: 0792387759

I

INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis I

Verzeichnis der Abkürzungen V

1 Einleitung..............................................................................1

1.1 Zytokine ..................................................................................................................1

1.2 Interleukin-6 ............................................................................................................2

1.2.1 IL-6-Typ-Zytokine....................................................................................................2

1.2.2 Struktur, biologische Funktion und Nomenklatur von IL-6 ......................................3

1.2.3 Der Jak/STAT-Signaltransduktionsweg ..................................................................5

1.2.4 Regulation der IL-6-Signaltransduktion ..................................................................7

1.2.4.1 Die Tyrosinphosphatase SHP2...............................................................................7

1.2.4.2 SOCS-Proteine .......................................................................................................8

1.2.4.3 PIAS-Proteine .........................................................................................................9

1.2.4.4 Rezeptorvermittelte-Endozytose.............................................................................9

1.3 Die Ras / Raf / MAPK-Kaskade ............................................................................10

1.4 Forkhead box o (foxo) Transkriptionsfaktoren ......................................................11

1.4.1 Biologische Funktion und Nomenklatur ................................................................11

1.4.2 Regulation der foxo-Familienmitglieder ................................................................13

1.5 Zielsetzung der Arbeit...........................................................................................16

2 Material und Methoden ..................................................... 17

2.1 Verwendete Materialien ........................................................................................17

2.1.1 Chemikalien und Enzyme.....................................................................................17

2.1.2 Puffer und Medien ................................................................................................17

2.1.3 Verbrauchsmaterialien..........................................................................................17

2.2 Stimulanzien und Inhibitoren ................................................................................18

2.3 Antikörper .............................................................................................................19

2.4 Plasmide...............................................................................................................20

2.5 Eukaryontische Zellen und deren Kultivierung .....................................................23

II

2.6 Prokaryontische Zellen und deren Kultivierung ....................................................24

2.7 Herstellung kompetenter Bakterien ......................................................................24

2.8 Präparation, Modifikation und Analyse von Plasmid-DNA....................................25

2.8.1 Transformation von Bakterien...............................................................................25

2.8.2 Plasmid-Präparationen .........................................................................................25

2.8.3 Quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren.......................................................25

2.8.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen ..............................................26

2.8.5 Dephosphorylierung linearisierter DNA ................................................................26

2.8.6 Phenolextraktion...................................................................................................26

2.8.7 Elektrophoretische Analyse von Plasmid-DNA.....................................................27

2.8.8 Isolierung von DNA-Fragmenten ..........................................................................27

2.8.9 DNA-Ligation ........................................................................................................28

2.9 Transiente Transfektion von HepG2-Zellen..........................................................28

2.10 Proteinbestimmung nach Bradford .......................................................................29

2.11 Herstellung von Zell-Lysaten ................................................................................29

2.12 Immunpräzipitation ...............................................................................................29

2.13 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ................................................................30

2.14 Proteintransfer auf eine PVDF-Membran durch das

„Western-Blot-semidry“-Verfahren........................................................................31

2.15 Detektion präzipitierter Proteine mit Hilfe eines Immunblots ................................33

2.16 Reportergen-Versuche .........................................................................................34

2.17 Ernte transfizierter Zellen für Reportergenuntersuchungen..................................34

2.17.1 Luziferase-Messung .............................................................................................35

2.17.2 β-Galaktosidase-Messung ....................................................................................35

2.18 Zellproliferationstest (XTT-Test) ...........................................................................36

2.19 Zellfärbungen für die Immunfluoreszenz ..............................................................36

2.20 Fluoreszenzmikroskopie .......................................................................................37

2.20.1 Geräte...................................................................................................................37

2.20.2 Bildaufnahme am LSM 510 ..................................................................................38

III

3 Ergebnisse......................................................................... 39

3.1 Hemmung der IL-6-Signaltransduktion in Hepatozyten

durch Wachstumsfaktoren ....................................................................................39

3.2 Nachweis einer funktionellen Interaktion zwischen STAT-Faktoren und FKHR ...44

3.2.1 Der Transkriptionsfaktor FKHR verstärkt

STAT3-abhängige Reportergenaktivität ...............................................................44

3.2.2 Die durch FKHR bewirkte transkriptionelle Steigerung ist STAT3-abhängig........48

3.2.3 Die funktionelle Interaktion mit FKHR ist spezifisch für STAT3 und STAT1.........49

3.2.4 FKHR vermindert die PIAS3-vermittelte STAT3-Inhibition ...................................53

3.2.5 Nachweis einer physikalischen Interaktion zwischen STAT3 und FKHR .............55

3.3 Auswirkungen von FKHR-modulierenden Effektoren

auf die IL-6-Signaltransduktion ............................................................................57

3.4 Die subzelluläre Lokalisation von FKHR und STAT3

in Abhängigkeit verschiedener Stimuli..................................................................62

3.5 Herstellung und erste Charakterisierung von HepG2-Transfektanten,

die stabil fluoreszierendes FKHR exprimieren......................................................64

4 Diskussion ......................................................................... 69

4.1 Interaktion zwischen FKHR und STAT-Faktoren..................................................69

4.2 Mögliche Mechanismen der Interaktion ................................................................70

4.2.1 FKHR könnte die Kernlokalisation der STAT-Faktoren begünstigen....................71

4.2.2 FKHR könnte als Vermittler zwischen STAT3

und weiteren Transkriptionsfaktoren fungieren.....................................................73

4.2.3 FKHR könnte die Aktivierung von STAT-Faktoren verstärken

oder deren Inaktivierung hemmen........................................................................74

4.2.4 FKHR könnte das STAT3-Dimer stabilisieren ......................................................74

4.3 Das IL-6-Signal scheint die hemmende Wirkung

von FKHR auf die Stoffwechselaktivität zu unterdrücken .....................................75

IV

5 Ausblick ............................................................................. 79

5.1 Generierung FKHR-defizienter Zellen ..................................................................79

5.2 Identifizierung der interagierenden Bereiche ........................................................80

5.3 Auswirkungen auf die Interaktion mit weiteren Proteinen.....................................81

5.4 in-vivo-Versuchsansätze.......................................................................................81

5.5 Studien zur DNA-Bindung von FKHR...................................................................82

5.6 Untersuchungen mit FKHR responsiven Promotoren...........................................83

6 Zusammenfassung ........................................................... 85

7 Literaturverzeichnis .......................................................... 87

8 Anhang ............................................................................. 103

V

Verzeichnis der Abkürzungen

Abb. Abbildung

AFX ALL1-fused-gene-from-chromosome-X

Ak Antikörper

APP Akut-Phase-Protein

APS Ammoniumperoxodisulfat

AS Aminosäure

ASV-16 avian sarcoma virus-16

ATP Adenosintriphosphat

Bad Bcl2/Bcl-XL-associated death promoter

Bcl2 B cell survival regulated by phospholipase Cγ2

Bim Bcl2-interacting mediator of cell death

bp Basenpaare

BSA bovines Serum Albumin

CBP CREB-binding-protein

CNTF ciliary neurotrophic factor

CREB cAMP response element binding protein

CT-1 Cardiotrophin-1

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonuleic acid

DTT 1,4-Dithio-DL-threitol (Cleland´s Reagenz)

E Extinktion

E. coli Escherichia coli

ECL enhanced chemoluminescence

EDTA ethylenediamine-tetraacetic acid

EGF epidermal growth factor

EMSA electrophoretic mobility shift assay

Epo Erythropoetin

ERK extracellular signal-regulated kinase

FCS fetal calf serum

FKHR forkhead related transcription factor

VI

FKHRL1 FKHR-like-1

foxo forkhead box o

FRET fluorescence resonance energy-transfer

G6P-ase Glukose-6-Phosphatase

GFP green fluorescent protein

GSK Glycogen-Synthase-Kinase-3

GST Glutathion S-Transferase

gp Glykoprotein

h Stunde

HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazin-N´-2-Ethansulfonsäure

HGF hepatocyte growth factor

HNF hepatocyte nuclear factor

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IGFBP insulin-like growth factor binding protein

IL Interleukin

IRS Insulin-Rezeptor-Substrat

IRU / IRE insulin response unit / element

Jak Janus-Kinase

JH Jak homology

kDa Kilodalton

KIR kinase inhibitory region

LB Luria-Bertani

min Minute

Mr molare Masse

MAKK mitogen-activated protein kinase kinase

MAPK mitogen-activated protein kinase

NES nuclear export signal

NGF nerve growth factor

OD optical density

OSM Oncostatin M

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

VII

PBS phosphate buffered saline

PCR polymerase chain reaction

PEPCK Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase

PDK 3-phosphoinositidedependent protein kinase

PI3,4P2 Phosphatidylinositol-3,4-diphosphat

PI3,4,5P3 Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat

PI3-Kinase Phosphatidylinositolphosphat-3-Kinase

PI4,5P2 Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat

PI4P Phosphatidylinositol-4-phosphat

PIAS protein inhibitor of activated STAT

PKB Proteinkinase B

PTEN phosphatase and tension homology deleted on

chromosome ten

PVDF Polyvinylidendifluorid

pY Phosphotyrosin

R Rezeptor

RNA ribonucleic acid

sIL-6Rα soluble IL-6 receptor α

SDS sodium-dodecylsulfate

SGK serum-and-glucocorticoid-inducible-kinases

SH src homology

SHP SH2-domain-containing tyrosine phosphatase

SOCS suppressor of cytokine signalling

STAT signal transducer and activator of transcription

Tab. Tabelle

TCL total cell lysates

TEMED N, N, N´, N´- Tetramethyl-Ethylen-Diamin

TGF transforming growth factor

Tris Tris(hydroxy)aminomethan

U unit

Upm Umdrehungen pro Minute

YFP yellow fluorescent protein

VIII

1

1 Einleitung

1.1 Zytokine

Um die Integrität eines Individuums bei den unterschiedlichsten Um-

gebungsvariablen zu wahren, bedarf es eines hochkomplizierten Netz-

werks. Zum einen muss ein reger Informationsaustausch, zum anderen

eine optimale Steuerung von einzelnen Zellen sowie Zellverbänden ge-

währleistet sein. Der Körper bedient sich unterschiedlicher Mechanismen,

um diesen Aufgaben gerecht zu werden. Als bekanntestes Beispiel kann

man die bewusste Innervation von quergestreifter Muskulatur betrachten,

bei der ein Gedanke innerhalb von Bruchteilen einer Sekunde in eine aktive

Bewegung mündet.

Um solche leicht nachvollziehbaren Aktionen überhaupt durchführen zu

können, muss jedoch eine Vielzahl an Regelgrößen stimmen. Genannt

seien nur die notwendige Energiebereitstellung, ein adäquates Sauerstoff-

angebot und ein Abtransport anfallender Metabolite. Diese nicht bewusst

steuerbaren, vegetativen Funktionen erfüllt der Körper mittels spezieller

Transmitter. Diese Stoffe können von spezifischen Drüsen endokrin - über

die Blutbahn - abgegeben werden, wie bei der Glukagonfreisetzung zur

Glukoseutilisation. Auch parakrine – auf benachbarte Zellen zielende -

Wirkungsweisen wie die Stickstoffmonoxid (NO)-Synthese zur Arteriolen-

dilatation und damit vermehrter Sauerstoffbereitstellung sind unter-

stützende Mechanismen. Bei autokriner Stimulation ist die sezernierende

Zelle zugleich auch der Zielort.

Als eines der kompliziertesten und wichtigsten Systeme des menschlichen

Körpers kann man das Immunsystem ansehen. Dieses muss einerseits alle

eindringenden fremden Organismen vollständig beseitigen, andererseits

darf es sich keinen Fehler erlauben und eine Reaktion gegen körpereigene

Stoffe zulassen. Dafür ist ein besonders kompliziertes System an Signal-

übertragung notwendig, bei dem Zytokine die wichtigste Rolle spielen. So

sind sie in der Lage, die Proliferation und Entwicklung spezifischer Zell-

populationen zu fördern, die Sekretion unterschiedlicher von B-Lympho-

2

zyten gebildeter Antikörper zu steuern, aber auch bestimmte immuno-

logische Antworten zu unterdrücken.

Zytokine zählen zu den Gewebshormonen und wirken außer auf Leuko-

zyten auch auf viele andere Zellarten wie Fibroblasten, Hepatozyten und

Melanozyten. Zu den Zytokinen rechnet man Wachstumsfaktoren, Inter-

leukine, Interferone und Chemokine. Ihre Wirkung entfalten die Zytokine

über spezifische Rezeptoren, welche nach Rezeptor-Oligomerisierung eine

Signaltransduktionskaskade in Gang setzen. Zytokine können sowohl

autokrin wirken als auch para- und endokrin Effektorzellen ansprechen.

1.2 Interleukin-6

1.2.1 IL-6-Typ-Zytokine

Wie LIF (leukemia inhibitory factor), OSM (Oncostatin M), IL-11, CNTF

(ciliary neurotrophic factor), CLC (cardiotrophin-like cytokine), und CT-1

(Cardiotrophin-1) zählt IL-6 zu den langkettigen 4α−helix-bundle-Zytokinen

mit etwa 25 Aminosäuren in den α−Helices 1,2. Diese Zytokine weisen eine

ähnliche dreidimensionale Struktur auf. Außerdem haben alle Rezeptoren

dieser Botenstoffe die signaltransduzierende Rezeptoruntereinheit gp130

(ein Glykoprotein von 130 Kilodalton) gemeinsam. Auf Grund dieser

Ähnlichkeiten werden die genannten Zytokine auch als IL-6-Typ-Zytokine

bezeichnet.

Neben gp130 können die IL-6-Typ-Zytokin-Rezeptor-Komplexe eine

kürzere α-Rezeptor-Untereinheit (IL-6R, IL-11R, CNTFR) und/oder eine

zusätzliche signaltransduzierende Untereinheit (LIFR, OSMR) enthalten

(Abb. 1.2.1) 2,3. Eventuell sind noch weitere Proteine am Rezeptorkomplex

beteiligt, was durch den Balken mit dem Fragezeichen dargestellt wird.

Der IL-6Rα (gp80, ein 80 Kilodalton großes Glykoprotein) kommt physio-

logisch sowohl membrangebunden als auch löslich vor. Die lösliche Form

kann einerseits durch alternatives Spleißen der Prä-m-RNA als auch durch

limitierte Proteolyse (Shedding) entstehen.

3

gp130 / gp130 LIFR / gp130 OSMR / gp130

OSM CLC OSMCT-1LIF CNTFIL-11

?

gp130

gp130

gp130

gp130

gp130

gp130

gp130

gp130

LIFR

LIFR

LIFR

LIFR

LIFR

OSM

R

IL-6

gp130

gp130

IL-6R

IL-6R

IL-11R CN

TFR

CN

TFR

Abbildung 1.2.1: Die IL-6-Typ-Zytokine und ihre Rezeptorkomplexe.

1.2.2 Struktur, biologische Funktion und

Nomenklatur von IL-6

IL-6 besteht aus 184 Aminosäuren und weist ein Molekulargewicht von 26

kDa auf 4. Es wird posttranslational N- oder O-glykosyliert, wobei es etwa

dreifach aktiver als unglykosyliertes IL-6 ist 5. Zur Aufrechterhaltung der

Struktur sind zwei Cysteinbrücken wichtig.

Interleukin-6 ist eines der wichtigsten Zytokine bei der physiologischen

Antwort auf das Eindringen pathogener Organismen. Es wird auf Stimuli

wie Lipopolysaccharide (LPS), IL-1, TNFα und virale Nukleinsäuren von

einer Vielzahl von Zellen gebildet und induziert in der Leber Akut-Phase-

Proteine (APP) wie beispielsweise Serumamyloid A (SAA), C-reaktives

Protein (CRP) und α2-Makroglobulin 6-11.

IL-6 wirkt auf eine Vielzahl von Zellen mit zum Teil antagonistischer Funk-

tion (Tabelle 1.1). Dem proinflammatorischen Effekt auf B- und T-Zellen

steht die antiinflammatorisch wirkende verminderte IL-1- und

TNFα−Sekretion gegenüber 12. Auf einige Zelllinien wirkt IL-6 antiproli-

ferativ 13,14, auf andere wachstumssteigernd 15,16 oder antiapoptotisch 17-20.

Bei einer Vielzahl von Krankheiten des menschlichen Organismus spielt IL-

6 eine wichtige Rolle. Sowohl bei Autoimmunerkrankungen wie der

4

rheumatoiden Arthritis, als auch bei HIV-Infektionen, Osteoporose und

Leukämieformen lässt sich ein Zusammenhang mit dem IL-6-System

erkennen 21.

Tab. 1.1: Die pleiotropen Wirkungen von IL-6

Wirkung auf: Funktion/Reaktion: B-Zellen - Immunglobulin (IgM, IgG, IgA)-Produktion

T-Zellen - Proliferation und Differenzierung

- Induktion der IL-2R-Expression und IL-2-

Produktion

- Aktivitätssteigerung von natürlichen

Killerzellen

- Differenzierung zu Killerzellen

Hämatopoetische

Stammzellen

- Verstärkung der hämatopoetischen

Kolonienbildung

Megakaryozyten - Reifung

Makrophagen - Reifung zu aktivierten Makrophagen

(erhöhte Phagozytose; Expression von

Fcγ-Rezeptoren, MHC-I und Adhäsions-

molekülen

- Verminderte Ausschüttung von IL-1 und

TNF durch Makrophagen

- führt zusammen mit APP zur Expression

von IL-1-Rezeptor-Antagonisten und

löslichen TNF-Rezeptoren

Hepatozyten - Synthese und Sekretion von APP vom

Typ2 und Synergismus mit IL-1 bei der

Synthese und Sekretion von Typ1-APP

Knochen-Stoffwechsel - Osteoklastenbildung, Induktion der

Knochenresorption

Blutgefäße - Proliferation vaskulärer glatter Muskel-

zellen durch Induktion der PDGF-

Produktion

Herz - negative inotrope Wirkung

5

Zentrales Nervensystem - Auslösen von Fieber durch die Induktion

von Prostaglandin E2 (PGE2)

- Neuronale Differenzierung

- Induktion der adrenocorticotropen

Hormonsynthese

Plazenta - Sekretion von chorionischem

Gonadotropin aus Trophoblasten

1.2.3 Der Jak/STAT-Signaltransduktionsweg

Nach Bindung von IL-6 an seinen α-Rezeptor (IL-6Rα, gp80) kommt es zur

Assoziation mit gp130. Zwei dieser Heterotrimere lagern sich zusammen

und bilden ein Heterohexamer, wie eine kürzlich erschienene Veröffent-

lichung zeigen konnte 22. Im Gegensatz zu Rezeptortyrosinkinasen besitzt

gp130 keine eigene Kinase-Domäne 1. Dafür sind sogenannte Janus-

Kinasen an die zytoplasmatische Domäne von gp130 assoziiert, von denen

vier bekannt sind: Jak1, Jak2, Jak3 und Tyk2. Eine besonders wichtige

Rolle für die gp130-Signaltransduktion kommt dabei Jak1 zu 23, was mit

Hilfe von Jak1-knock-out-Mäusen bestätigt werden konnte 24.

Janus-Kinasen interagieren mit den konservierten Membran-proximalen

Box1/Box2-Regionen der Zytokin-Rezeptoren 25-27. Dabei ist die Prolin-

reiche Box1 wie auch der Bereich zwischen Box1 und Box2 wichtig für die

Rezeptorbindung der Jaks 26,28. Die an hydrophoben Aminosäuren reiche

Box2 erhöht die Affinität der Bindungspartner zueinander 29.

Auf der Grundlage von Sequenzhomologien wurden die Janus-Kinasen in

sieben Jak-Homologie(JH)-Domänen unterteilt 30. Die C-terminal gelegene

JH1-Domäne ist eine Kinase-Domäne. Die hierzu homologe JH2-Domäne

wird wegen fehlender enzymatischer Aktivität als kinase-like-Domäne

bezeichnet und scheint an der Regulation der Kinase-Aktivität beteiligt zu

sein 31,32.

Es konnte gezeigt werden, dass N-terminal eine four-point-one, ezrin,

radixin, moesin (FERM) – Domäne liegt. Diese Domäne ist etwa 400

Aminosäuren lang und beinhaltet 19 hydrophobe Regionen 33. Sie setzt

6

sich aus drei Subdomänen, die gemeinsam eine Kleeblattform bilden,

zusammen: der Subdomäne F1, wobei die Aminosäuren 36 bis 112 eine

sogenannte Ubiquitin-like ß-grasp Domäne bilden, welche wahrscheinlich

mit ihrem vierten loop an der Rezeptorassoziation beteiligt ist 34, der

Subdomäne F2 mit einer Sekundärstruktur ähnlich dem acyl-coenzyme-A-

binding-protein, und der Subdomäne F3 mit einer Faltung wie phospho-

tyrosine-binding (PTB) oder pleckstrin-homology-Domänen 35.

Abbildung 1.2.2: Schematische Darstellung einer Jak 35.

Nachdem der initiale Schritt der IL-6-Signaltransduktion eine Aktivierung

der Janus-Kinasen durch gegenseitige Phosphorylierung bedingt, phospho-

rylieren diese fünf intrazelluläre Tyrosin-Reste (Y759, Y767, Y814, Y905

und Y915) der signaltransduzierenden Rezeptoruntereinheit gp130. Die

einzelnen Tyrosine scheinen unterschiedliche Signale im Zellinneren zu

generieren und für verschiedene Aufgaben zuständig zu sein 36. Dem

Membran-proximalen Y759 kommt für die Regulation eine besondere

Bedeutung zu (siehe 1.2.4.1 und 1.2.4.2) 37,38.

An die phosphorylierten Tyrosin-Reste können nun Proteine, die eine

passende SH2-Domäne aufweisen, binden 6,39,40. Proteine mit SH2-

Domänen sind unter anderem die STAT-Faktoren, die SOCS (suppressors

of cytokine signaling) feedback-Inhibitoren und die Tyrosinphosphatasen

SHPs (SH2 containing protein-tyrosine phosphatases).

STAT steht als Abkürzung für „signal transducer and activator of trans-

cription„ und beschreibt die Funktion dieser Transkriptionsfaktoren als

Bindeglied in der Zytokin-Signaltransduktion. Sie können mit ihrer SH2-

Domäne an Phosphotyrosin-Reste von gp130 binden. Dabei bindet STAT3

spezifisch an die Phosphotyrosin-Reste Y767 und Y814. Die Phospho-

tyrosin-Reste Y905 und Y915 können sowohl von STAT3, als auch von

STAT1 gebunden werden 40-42. Nach Phosphorylierung von Y701 im

7

STAT1 bzw. Y705 im STAT3 vermittelt die STAT coiled-coil-Domäne die

Bildung von Homo- oder Heterodimeren 43. Diese translozieren in den

Nukleus, wo sie mittels ihrer DNA-bindenden Domäne an spezifische

Basensequenzen der Doppelhelix (Enhancer) binden und über ihre Trans-

aktivierungsdomäne eine vermehrte oder verminderte Transkription IL-6-

induzierbarer Gene bewirken 6,44,45.

Abbildung 1.2.3: Schematische Darstellung eines STAT-Faktors 35.

1.2.4 Regulation der IL-6-Signaltransduktion

Der Jak/STAT-Signaltransduktionsweg wird durch eine Reihe von Faktoren

reguliert:

1.2.4.1 Die Tyrosinphosphatase SHP2

Die SHP2 ist ein ubiquitär exprimiertes Protein, welches bei der

Signaltransduktion von Zytokinen und Wachtumsfaktoren eine wichtige

Rolle spielt. Die SHP2 hat eine Größe von 65 kDa, besteht aus 585 Amino-

säuren und weist strukturell zwei N-terminal gelegene SH2-Domänen,

sowie eine, von Position 273 bis 510 reichende, Phospho-Tyrosin-

Phosphatasedomäne (PTP) auf 2,46,47.

Die SH2-Domänen dienen zum einen der Bindung an Proteine mit

phosphorylierten Tyrosin-Resten. So binden sie an Phosphotyrosine von

Rezeptorkomplexen wie dem gp130 38 oder PDGFR 48,49. Zum anderen

sind die SH2-Domänen an der Regulation der SHP2 beteiligt.

Die SHP2 kann sowohl mit gp130, als auch mit den Januskinasen Jak1 und

Jak2, jedoch nicht mit Jak3, assoziieren 50. Jak1 ist essentiell für die SHP2-

Aktivierung durch gp130 51.

8

Sie dient des weiteren als Adapterprotein zur Aktivierung der Ras / Raf -

Kaskade 47 und kann mit vielen anderen Proteinen wie IRS1 52 und Grb 53,54

interagieren.

Im IL-6-System scheint die SHP2 die Signaltransduktion zu unterdücken 37,

wobei der Assoziation mit dem Y759 der signaltransduzierenden Unter-

einheit gp130 eine besonders wichtige Rolle zukommt 36,37,55,56. Sie soll

unter anderem STAT-Faktoren dephosphorylieren 57. Die SHP1 ist in der

Lage Jak2 zu dephosphorylieren 58.

1.2.4.2 SOCS-Proteine

Eine weitere Familie von Inhibitoren der Signaltransduktion von Zytokinen

sind die suppressors of cytokine signaling (SOCS), Jak-binding protein

(JAB), STAT induced STAT inhibitor (SSI) oder cytokine-inducible SH2-

containing proteins (CIS). Diese Menge an Synonymen resultiert aus der

Tatsache, dass diese Proteine von verschiedenen Forschungsgruppen

relativ zeitgleich entdeckt wurden 59-61.

Bisher sind acht Mitglieder bekannt und kloniert worden (CIS, SOCS1-7).

Allen gemeinsam ist eine N-terminale variable Region, eine zentrale SH2-

Domäne und eine C-terminale, als SOCS-Box bezeichnete Region 62. Wie

schon aus der Nomenklatur hervorgeht, sind die Faktoren durch Zytokine

induzierbar und bilden damit einen negativen feedback-Mechanismus für

die Signaltransduktion von Zytokinen und verschiedenen Wachstums-

faktoren 59,61-63. Sie interagieren sowohl mit den Januskinasen als auch mit

den Rezeptoren 38,64-67.

Dabei hemmen die einzelnen Mitglieder der Familie unterschiedliche

Signaltransduktionswege. Für die Inhibierung des IL-6-Signals scheinen vor

allem SOCS1 und SOCS3 wichtig zu sein.

Die Jak1, Jak3 und Tyk2 werden durch SOCS1 gehemmt 60,61,65,67. Dem

Y759 der signaltransduzierenden Untereinheit gp130 wird in der Inhibierung

durch SOCS3 eine essenzielle Rolle zuteil 37,38.

Eine weitere Abschaltmöglichkeit von Signaltransduktionskaskaden wird in

der Markierung von Proteinen für ihre Degradation gesehen. Die SOCS-

Box interagiert mit Elongin B/C und könnte somit im Abbau über das

Proteasom eine Rolle spielen 68,69.

9

1.2.4.3 PIAS-Proteine

Im Gegensatz zu den bisher genannten Inhibitoren weisen die protein

inhibitors of activated STAT (PIAS) keine SH2-Domänen auf. Bisher

wurden fünf Homologe entdeckt, wobei die Interaktion zwischen PIAS und

STAT-Faktoren hochspezifisch ist und über den N-terminalen Bereich von

PIAS vermittelt wird 70. PIAS binden an phosphorylierte STAT-Faktoren:

PIAS1 nur an STAT1, PIAS3 nur an STAT3 71,72. Der genaue Inhibitions-

mechanismus ist noch nicht geklärt.

1.2.4.4 Rezeptorvermittelte-Endozytose

Ein weiterer Mechanismus das IL-6-Signals zu beenden ist die Rezeptor-

vermittelte Endozytose, die wahrscheinlich durch Clathrin-beschichtete

Vesikel erfolgt 73,74.

10

1.3 Die Ras / Raf / MAPK-Kaskade

Nach der IL-6-vermittelten Dimerisierung der IL-6-Rezeptor-Untereinheit

gp130 bindet die 65kDa große Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP2 mit

einer SH2-Domäne an den Phosphotyrosin-Rest 759. Nach Phosphory-

lierung der SHP2 kann Grb2 (growth factor receptor bound protein)

binden 75. Grb2 ist über SH3-Domänen mit dem Guaninnucleotid-

Austausch-Faktor SOS (son of sevenless) verbunden 76. Dieser Komplex

ist in der Lage, GDP-Ras in die aktive Form GTP-Ras zu überführen 77,78.

Dieser Schritt leitet einerseits die Aktivierung der Ras/Raf/MAPK-Kaskade

ein, andererseits scheint GTP-Ras in vielen Zelllinien die PI3-Kinase

aktivieren zu können 79-82. Für HepG2-Zellen ist dieser Weg noch nicht

nachgewiesen.

Durch die Serin-/Threoninphosphorylierung von Raf wird diese Kinase

aktiviert und bewirkt durch Phosphorylierung von Erks, aus der Familie der

MAPKs, eine Aktivierung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren (c-jun,

c-fos, c-myc, NF-IL-6), was in einer vermehrten Transkription Ras-induzier-

barer Gene resultiert 2,46,47,83,84.

11

1.4 Forkhead box o (foxo)

Transkriptionsfaktoren

1.4.1 Biologische Funktion und Nomenklatur

Die Familie der forkhead box o (foxo)-Tanskriptionsfaktoren umfasst

verschiedene sogenannte winged-helix-Proteine. Dieser Name ergibt sich

aus der Tertiärstruktur, da die Faktoren mit gewundenen Helices an die

DNA binden.

DNA -Bindungsdomäne Transaktivierungsdomäne

T

C

SSNES

N

Abbildung 1.4.1: Schematische Darstellung eines forkhead-Transkriptionsfaktors

Die einzelnen Mitglieder weisen untereinander und mit ihrem Orthologen

DAF-16 von Caenorhabditis elegans, einem Helminthen aus dem Stamm

der Nematoden, Homologien von 85% in der DNA-Bindungsdomäne auf.

Beim Menschen wurden drei dieser Familie zugehörige Faktoren identi-

fiziert. Sie spielen in der Entwicklung von Neoplasien eine Rolle:

forkhead related transcription factor (FKHR, entspricht foxo1A), FKHR-like1

(FKHRL1, entspricht foxo3A) und ALL1-fused-gene-from-chromosome-X

(AFX, entspricht foxo4).

Allen gemeinsam ist ein konservierter N-Terminus, welcher von der DNA-

Bindungsdomäne gefolgt wird. C-terminal findet sich die Transaktivierungs-

domäne (Abbildung 1.4.1). Des weiteren verfügen alle über drei phosphory-

lierbare Reste, denen bei der Regulation eine essentielle Bedeutung

zukommt. Es handelt sich um einen N-terminal gelegenen Threonin-Rest

sowie zwei Serin-Reste, wobei einer in der DNA-Bindungsdomäne, der

12

andere in der Transaktivierungsdomäne nahe bei einem nuclear export

signal (NES) (Abbildung 1.4.1).

Bei der Entstehung vom alveolären Typ des Rhabdomyosarkoms sowie

beim kindlichen Ewing-Sarkom konnten Fusionsproteine aus der Trans-

aktivierungsdomäne von FKHR mit anderen Transkriptionsfaktoren wie

PAX3 und PAX7 beobachtet werden 85-88. Auch andere maligne Neoplasien

wie bestimmte Leukämieformen lassen sich auf Defekte von Mitgliedern der

Familie zurückführen 89.

In dephosphoryliertem Zustand sind die forkhead-Faktoren im Zellkern

lokalisiert und als Transkriptionsfaktoren aktiv. Dort binden sie an Promo-

toren verschiedener Zielgene und bewirken eine vermehrte Expression.

Sowohl nach Überexpression von AFX 90, als auch von FKHR 91 und

FKHRL1 92 konnte eine Wachstumshemmung durch erhöhte p27Kip-

Konzentrationen nachgewiesen werden. Als weiteres Zellzyklus-suppri-

mierendes Protein ließ sich das proapoptotische Bim aus der Familie der

Bcl2-Proteine bei Anwesenheit von FKHRL1 verstärkt exprimieren 93. Die

Transkription von Cyclinen des D-Typs wird durch FKHR unterdrückt 94.

Auch Schlüsselenzyme im Glukosestoffwechsel unterliegen der Kontrolle

der forkhead-Transkriptionsfaktoren. So binden die foxo-Familienmitglieder

an die insulin response unit / element (IRU /IRE), die in dem Promotor-

bereich der Gene der Glukose-6-Phosphatase 95 sowie der Phosphoenol-

pyruvat-Carboxykinase und des insulin-like growth factor binding protein 1

(IGFBP1) 96 zu finden sind. Dabei ist für DAF-16 eine direkte Interaktion mit

Transkriptionskoaktivatoren nachgewiesen worden. Das Orthologe von

Caenorhabditis elegans ist in der Lage, p300/CREB-binding-protein (CBP)

sowie steroid receptor coactivator (SRC) an den IGFBP-1-Promotor zu

rekrutieren. Dafür ist das C-terminale Ende von DAF-16 essentiell. Es

interagiert mit der sogenannten KIX-Domäne und der E1A-bindenden

Domäne von CBP 97.

13

1.4.2 Regulation der foxo-Familienmitglieder

Das Heterodimer der PI3-Kinase besteht aus einer in fünf Isoformen

vorkommenden regulatorischen und einer in zwei Isoformen ubiquitär

exprimierten katalytischen Untereinheit von 110kDa 98. Die regulatorischen

Untereinheiten kann man nach ihren Molekulargewichten in drei Gruppen

einteilen: p50, p55, p85 98. Sie enthalten eine SH3- und zwei SH2-Domä-

nen 99.

Ein virales Onkogen des ASV-16-Virus bildet eine konstitutiv aktive Form

der katalytischen Untereinheit der PI3-K und führt in kultivierten Hühner-

embryoblasten zu erhöhten Phosphatidylinositol-3,4-diphosphat (PI3,4P2)-,

Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat (PI3,4,5P3)-Spiegeln und aktiviertem

Akt 100.

Verschiedene Tyrosinkinase-Rezeptoren dienen als Signaltransduktoren,

um ein extrazelluläres Signal in ein intrazelluläres umzusetzen. Ein von

vielen Wachstumsfaktoren wie EGF, NGF, HGF, Insulin, aber auch GM-

CSF, Interleukin-3, und -5 101,102,103,104 gemeinsam genutzter Weg führt zur

Aktivierung der heterodimeren Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3-K), die

die Substrate Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P) sowie Phosphatidyl-

inositol-4,5-diphosphat (PI4,5P2) an der dritten Position phosphoryliert und

so Phosphatidylinositol-3,4-diphosphat (PI3,4P2) und Phosphatidylinositol-

3,4,5-triphosphat (PI3,4,5P3) bildet 101,102,103,104 (Abbildung1.4.2).

Die Aktivierung der PI3-Kinase kann auf verschiedenen Wegen erfolgen.

Einerseits besteht die Möglichkeit, durch direkte Tyrosinphosphorylierung

der katalytischen Untereinheit durch Rezeptortyrosinkinasen eine Akti-

vierung zu erzielen 99 105. Andererseits können Adapterproteine wie Insulin-

Rezeptor-Substrat (IRS) zwischengeschaltet sein 106. Auch existiert ein

Weg in Form einer Phosphorylierung der katalytischen Untereinheit bei

Aktivierung von Ras 82. Über diese Wege sind unter anderem verschiedene

Wachstumsfaktoren in der Lage, die PI3-Kinase zu aktivieren.

Ein funktioneller Antagonist der PI3-K ist die Phosphatase PTEN. Sie

katalysiert die Abspaltung des Phosphatrestes an der dritten Position der

Phosphatidylinositole und hat als Tumorsuppressor eine wichtige Funktion.

So konnte gezeigt werden, dass in PTEN-defizienten Mäusen stark er-

14

niedrigte p27Kip-Spiegel vorliegen, und es zu multipler neoplastischer

Tumorbildung kommt 91,107-110.

Die in der Zellmembran verankerten und phosphorylierten Phosphoinositol-

Lipide rekrutieren die in drei Isoformen vorhandene Proteinkinase B (PKB) /

Akt mittels ihrer Plekstrin-homologen Domäne an die Plasmamembran, wo

die Kinase an T308 und S473 phosphoryliert und damit aktiviert wird 111,112

(Abbildung 1.4.2). Diesen Schritt katalysiert für das Threonin die so-

genannte Phosphatidylinositol-(3,4,5)-Phosphate dependent Kinase 1

(PDK1), für das Serin die kürzlich entdeckte PDK2 113,114.

Eine weitere, von PDKs aktivierte Gruppe von Kinasen sind die serum-and-

glucocorticoid-inducible-kinases (SGKs), welche nach Stimulation mit

Glukokortikoiden und Wachstumsfaktoren vermehrt gebildet werden. Auch

sie werden durch eine Plekstrin-homologe Domäne an die Plasmamembran

rekrutiert. Wie bei PKB / Akt sind zwei Phosphorylierungsstellen für ihre

Aktivierung wichtig. Die erste, T256, wird ebenfalls von der PDK1 phospho-

ryliert, für die zweite, S422, konnte die entsprechende Kinase bislang nicht

identifiziert werden 115.

Sowohl die PKB / Akt als auch die SGKs translozieren nach ihrer Akti-

vierung in den Nukleus und fungieren als Serin-/ Threonin-Kinasen. Sie

phosphorylieren die Mitglieder der foxo-Familie an den beschriebenen

Resten. Dabei weist PKB / Akt eine höhere Spezifität für die zweite Stelle

(bei FKHR: S256), SGKs für die dritte (bei FKHR: S315) auf. Das erste

Threonin (bei FKHR: T32) wird von beiden mit gleicher Spezifität phospho-

ryliert 116.

Die PKB / Akt phosphoryliert neben den foxo-Transkriptionfaktoren noch

weitere Proteine wie Glycogen-Synthase-Kinase-3 (GSK-3) und Bad 117,118.

Phosphorylierte foxo-Transkriptionsfaktoren sind inaktiv und werden aus

dem Nukleus transportiert. Im Zytosol werden sie an 14-3-3-Proteine

gebunden. Diese stellen eine große Gruppe konservierter regulatorischer

Proteine dar, die in der Lage sind, verschiedene Proteine wie Enzyme,

Rezeptoren oder Transkriptionsfaktoren zu binden. 14-3-3-Proteine kom-

men in allen eukaryontischen Zellen vor und erfüllen unterschiedliche

Aufgaben. Dephosphorylierte foxo-Transkriptionsfaktoren werden von den

14-3-3-Proteinen nicht gebunden. Für die Bindung an diese Proteine sind

die ersten beiden Phosphorylierungsstellen wichtig, die dritte, welche in der

15

Nähe des nuclear export signal (NES) liegt, scheint für den nukleären

Export verantwortlich zu sein 116.

Mutiert man die beschriebenen Reste zu nicht phosphorylierbaren

Alaninen, so sind die foxo-Familienmitglieder fast ausschließlich im Zellkern

lokalisiert und konstitutiv aktiv. Eine Bindung an 14-3-3-Proteine ist nicht

möglich.

Die Transkriptionsfaktoren können zusätzlich jedoch auf einem bisher

unbekannten weiteren Weg inaktiviert werden, wie Studien mit dem PI3-K-

Inhibitor LY294002 und Wortmannin zeigen. So lässt sich durch Zugabe

von LY294002 zu dem normalen Kulturmedium auch die Aktivität von

mutiertem, nicht phosphorylierungsfähigem, DAF-16 weiter steigern 119.

PTEN

PI3-Kinase-Signaltransduktion

PI3 K

\/\/\

\/\/

PI(4,5)P2PI(3,4,5)P3

PKB / Akt

FKHR

LY 294002

Wortmannin

14 – 3 - 3

FKHRP

P

P

T24

S256

S319

FKHRP

P

P

T24

S256

S319

SGK

PDKs

WachstumsfaktorenIL-3, IL-5und andere Mediatoren

IGFBP

PEPCK

G6P-ase

P27

bim

Glukokortikoide

Abbildung 1.4.2: Schematische Darstellung der Regulation und Funktion von FKHR.

Die einzelnen Proteine, Inhibitoren und durch FKHR regulierten Genprodukte werden im Text unter 1.4.2 näher beschrieben. Aktive Proteine sind in grüner, inaktive oder inhibierende Proteine oder Substanzen in roter Farbe dargestellt.

16

1.5 Zielsetzung der Arbeit

In Folge verschiedener Prozesse, wie einer partiellen Hepatektomie,

Infekten, Traumen oder auch chemischen Noxen, setzen regenerative

Vorgänge in der Leber ein. Durch Proliferation ist die menschliche Leber in

der Lage, einen Substanzdefekt von bis zu 80% wieder auszugleichen 120.

Dafür verantwortlich sind vor allem erhöhte growth hormone-(GH)-Spiegel.

Man findet nach Leberresektionen einen Anstieg der Plasmakonzentration

von IL-6, TNF, EGF, IGF und HGF 121-125. Es kommt neben einer Zunahme

der Mitoserate jedoch auch zu einer Abnahme der Sekretion von IL-6-

induzierbaren Proteinen, wie den Akut-Phase-Proteinen (APP). Es konnte

gezeigt werden, dass die APP-Produktion von Hepatozyten nach Stimu-

lation mit Wachstumsfaktoren vermindert ist 126-129.

Eine mögliche Erklärung hierfür ist eine Hemmung der IL-6-Signaltrans-

duktion nach Induktion von SOCS3 durch verschiedene Wachstums-

faktoren und Zytokine 63,64,130. Neben den Wachstumsfaktoren ist jedoch

auch Cortisol in der Lage, die APP-Synthese negativ zu beeinflussen 12.

Welche intrazellulären Vorgänge für die beschriebenen Phänomene

Verantwortung tragen, wurde bisher jedoch nicht hinreichend geklärt.

Zielsetzung dieser Arbeit war es deshalb zu untersuchen, welche Mecha-

nismen der verminderten APP-Produktion unter Stimulation mit Wachs-

tumsfaktoren und Cortisol zu Grunde liegen.

17

2 Material und Methoden

2.1 Verwendete Materialien

2.1.1 Chemikalien und Enzyme

Alle Chemikalien wurden in p. a. -Qualität eingesetzt und von den Firmen

AGS (Heidelberg), BioRad (München), Roche (Mannheim), Fluka (Neu-

Ulm), Merck (Darmstadt), New England Biolabs (Schwalbach), Amersham

(Freiburg), Qiagen (Hilden), Sigma (Deisenhofen) und Whatman

(Maidstone, England) bezogen. In der Methodenbeschreibung wird näher

auf die verwendeten Chemikalien eingegangen. Alle Enzyme wurden, falls

im Text nicht anders angegeben, von der Firma Roche bezogen.

2.1.2 Puffer und Medien

Alle Puffer und Medien wurden in wässriger Lösung angesetzt.

Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Medien wird in der

Methodenbeschreibung näher erläutert.

2.1.3 Verbrauchsmaterialien

Die eingesetzten Verbrauchsmaterialien stammten von den Firmen DuPont

(Dreireich), Eppendorf (Hamburg), Millipore (Eschborn), Sartorius

(Göttingen), Serva (Heidelberg), Sigma (Deisenhofen) und Whatman

(Maidstone, England).

18

2.2 Stimulanzien und Inhibitoren

IL-6 rekombinantes humanes IL-6 wurde nach der Methode von

Arcone et al. 131 hergestellt und freundlicherweise von A.

Küster zur Verfügung gestellt; die spezifische Aktivität be-

trug 2 x 106 BSF2 (B-cell stimulatory factor-2) U/mg Pro-

tein.

sIL-6Rα rekombinanter humaner sIL-6Rα wurde nach der Methode

von Weiergräber et al. 132 von A. Küster produziert.

Insulin rekombinantes Insulin wurde von der Firma Roche

(Penzberg) bezogen und in 1 µM Konzentration eingesetzt.

TGFß R&D Systems (Wiesbaden) lieferte TGFß. 10 Einheiten /

ml wurden dem Zellkulturmedium zugesetzt.

IFN γ Interferon γ lieferte das Unternehmen PeproTech

(Montreal, Quebec). 1000 Einheiten / ml wurden dem Zell-

kulturmedium zugesetzt.

Epo Erythropoetin wurde von J. Burg und K.-H. Sellinger (Firma

Roche, Penzberg) zur Verfügung gestellt. Bei der Stimu-

lation wurden 5 Einheiten / ml verwendet.

EGF epidermal growth factor wurde von M. Kortylewski

(Aachen) zur Verfügung gestellt und in einer Konzentration

von 50 ng/ml dem Medium zugesetzt.

HGF hepatocyte growth factor wurde von W. Birchmeier (Berlin)

zur Verfügung gestellt und in einer Konzentration von 3300

Einheiten / ml Medium eingesetzt.

NGF nerve groth factor wurde von Boehringer (Ingelheim am

Rhein) zur Verfügung gestellt. Bei der Stimulation kamen

50 ng/ml Medium zum Einsatz.

Dexamethason wurde von der Firma Merck (Darmstadt) bezogen und in 2

µM Konzentration verwendet.

19

Wortmannin Das von dem Unternehmen Calbiochem (San Diego,

Californien) gelieferte Wortmannin kam als 1 µM Lösung

zum Einsatz.

LY294002 Ebenfalls von Calbiochem (San Diego, Kalifornien)

bezogenes LY294002 wurde in 50 µM Konzentration ver-

wendet.

Zellkulturmaterialien:

DMEM; Flüssigmedium mit 4,5 g Glukose und

Glutamax Gibco, Eggenstein

DMEM/NUT-MIX-F12 Flüssigmedium Gibco, Eggenstein

Penicillin/Streptomycin Gibco, Eggenstein

Trypsin / EDTA-Lösung:

0,05 % Trypsin / 0,02 % EDTA Biochrom, Berlin

FCS: mykoplasmenfreies fetal-calf-serum Cytogen, Berlin

2.3 Antikörper

polyklonales anti-STAT3 Kaninchenserum

(C20, Santa Cruz Biotechnology, Kalifornien)

monoklonales anti-STAT3 IgG1 der Maus

(610189, Transduction Laboratory, NJ, USA)

polyklonales anti-FKHR Kaninchenserum

(H128 Santa Cruz Biotechnology, Kalifornien)

polyklonales anti-FKHR Kaninchenserum

(wurde von A. Barthel durch GST-FKHR gereinigt)

TRITC-konjugierter Schwein-anti-Kaninchen-Antikörper

(R0156, Dako, Glostrup, Dänemark)

FITC-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper

(F0479, Dako, Glostrup, Dänemark)

20

2.4 Plasmide

pSVL eukaryontischer Expressionsvektor, enthält den

späten SV40 Promoter, AmpR (Pharmacia, Freiburg)

pCAGGS eukaryontischer Expressionsvektor, enthält den

Promoter des cytomegalo-Virus, AmpR (zur Ver-

fügung gestellt von K. Nakajima und T. Hirano,

Osaka in Japan)

pRC/CMV eukaryontischer Expressionsvektor, enthält den

Promoter des cytomegalo-Virus, AmpR (Pharmacia,

Freiburg)

pCDNA3.1 eukaryontischer Expressionsvektor, enthält den PCMV

Promoter, AmpR (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien)

pEF-GFP-C1 eukaryontischer Expressionsvektor, enthält den PCMV

Promoter, KanR und die kodierende Sequenz für das

green fluorescent protein (GFP) (Clontech, Palo Alto)

pEF-YFP eukaryontischer Expressionsvektor, enthält den PCMV

Promoter, AmpR und die kodierende Sequenz für das

yellow fluorescent protein (YFP) (zur Verfügung ge-

stellt von U. Sommer und S. Haan, RWTH-Aachen)

pSVL-STAT3 enthält die murine STAT3-cDNA (zur Verfügung

gestellt von J. Sasse, RWTH-Aachen)

pCAGGS-STAT1 enthält die kodierende Sequenz der humanen

STAT1-cDNA (zur Verfügung gestellt von T. Hirano,

Osaka in Japan)

pECE-STAT5b trägt die für STAT5b kodierende cDNA, enthält den

späten SV40 Promoter, AmpR

21

pSVL∆EcoRI-Epo-gp130

enthält die Erbinformation einer Rezeptorchimäre,

welche extrazellulär aus einem Teil des Erythro-

poetinrezeptors, transmembranär und intrazellulär

aus Box1/Box2 des gp130 und einer STAT5 Bin-

dungsstelle besteht. AmpR. (kloniert von Petra May

und Claudia Gerhartz) 133

pCAGGS-STAT3D enthält eine mutierte murine STAT3-cDNA, die für

ein Protein kodiert, das nicht in der Lage ist, an die

DNA zu binden (zur Verfügung gestellt von K.

Nakajima und T. Hirano, Osaka in Japan)

pCAGGS-STAT3F enthält eine mutierte murine STAT3-cDNA, die für

ein Protein kodiert, das nicht in der Lage ist, zu di-

merisieren (zur Verfügung gestellt von K. Nakajima

und T. Hirano, Osaka in Japan)

pCDNA-FKHR enthält die kodierende Sequenz des humanen FKHR

(kloniert von A. Barthel, RWTH-Aachen)

pEF-GFP-FKHR enthält 5’ vom GFP die kodierende Sequenz von

FKHR (kloniert von A. Barthel, RWTH-Aachen)

pEF-GFP-FKHR 1A enthält die kodierende Sequenz des humanen

FKHR, wobei T24 gegen Alanin ausgetauscht wurde

(kloniert von A. Barthel, RWTH-Aachen)


FKHR, wobei T24 und S256 gegen Alanin ausge-

tauscht wurden (kloniert von A. Barthel, RWTH-

Aachen)


FKHR, wobei T24, S256 und S319 gegen Alanin

ausgetauscht wurden (kloniert von A. Barthel,

RWTH-Aachen)

pEF-YFP-FKHR enthält 5’ vom YFP die kodierende Sequenz von

FKHR (wurde im Rahmen dieser Dissertation klo-

niert)

22

pCMV-PIAS3 enthält die kodierende Sequenz von PIAS3 (zur

Verfügung gestellt von K. Shuai, K.C.L.A., Los

Angeles)

pGl3α2M-215Luc enthält den Promotorbereich –215 bis +8 vom α2-

Macroglobulin-Gen fusioniert mit der kodierenden

Sequenz der Luziferase

pGl3hACT-359Luc enthält den Promotorbereich –359 bis +25 vom

humanen α1-Anitchymotrypsin-Gen fusioniert mit

der kodierenden Sequenz der Luziferase

pGL3-IRE-tk-Luc STAT1-responsives Element des IRF-1-Promotors

mit nachgeschaltetem Luziferase-Gen, enthält den

späten SV40-Promotor, AmpR (kloniert von P. May)

pGL3-ß-Casein-tk-Luc STAT5-Bindungselement des ß-Casein-Promotors

mit nachgeschaltetem Luziferase-Gen, enthält den

späten SV40-Promotor, AmpR (kloniert von P. May)

pUC19-SIE-tk-Luc drei identische, STAT1 und STAT3 responsive

Elemente in Serie mit nachgeschaltetem Luziferase-

Gen, AmpR (zur Verfügung gestellt von H. Gascan,

Angers, Frankreich)

pCH110 Expressionsvektor für die β-Galaktosidase

(Pharmacia, Freiburg)

23

2.5 Eukaryontische Zellen und deren

Kultivierung

Es wurde ausschließlich mit adhärent wachsenden humanen Heptomzellen

HepG2 (ATCC, CRL 1651) gearbeitet.

Die Zellen wurden bei 37°C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5%

CO2 kultiviert. Die Medien enthielten, falls nicht anders angegeben, 10%

fötales Kälberserum, 60 mg/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin. Zur

Weiterkultivierung wurden die adhärent wachsenden HepG2-Zellen auf

einer konfluent bewachsenen Petrischale zweimal mit PBS gewaschen und

mit Trypsin/EDTA abgelöst. Die Zellen wurden in einer 1:2- bis 1:20-

Verdünnung in neuem Medium aufgenommen.

Für die Langzeitaufbewahrung wurden die von der Platte gelösten Zellen

mit 10% DMSO-haltigem Medium versetzt und in Kryoröhrchen aliquotiert.

Zur langsamen Abkühlung der Zellen erfolgte eine Lagerung für 24 h bei

-80°C, bevor die Zellen zur längeren Aufbewahrung in flüssigen Stickstoff

gestellt wurden. Zum schnellen Auftauen wurden die Zellen bei 37°C

inkubiert und das DMSO-haltige Medium mit 10 ml kaltem Medium ver-

dünnt. Die Zellen wurden bei 950 Upm bei 4°C abzentrifugiert, in neuem

Medium aufgenommen und in einer Petrischale ausgesät.

Die Kultivierung der von den permanenten Zelllinien abgeleiteten tran-

sienten Transfektanten erfolgte in gleicher Weise.

PBS:

0,2 M NaCl

2,5 mM KCl

8 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2PO4

pH 7,4

24

2.6 Prokaryontische Zellen und deren

Kultivierung

Zur Transformation mit rekombinanten Plasmiden wurde der E. coli-Stamm

JM-83 verwendet. Die mit den verschiedenen Plasmiden transformierten

Bakterien wurden in LB-Medium unter Zugabe von Ampicillin: 100 µg/ml

bzw. Kanamycin: 40 µg/ml oder Neomycin 0,6 mg/ml entsprechend der

plasmidvermittelten Antibiotikaresistenz bei 37°C in einem Schüttelkolben

(bei 200 Upm) kultiviert. Die Stammhaltung erfolgte in Form eines Gefrier-

vorrates in LB-Medium mit 20% Glycerin bei -80°C.

LB-Medium:

1 0 g/l NaCl

1 0 g/l Bactotrypton (Difco)

5 g/l Yeast Extract (Difco)

stationäre Kultur:

1 5 g/l Agar (in LB-Medium)

2.7 Herstellung kompetenter Bakterien

500 ml LB-Medium wurden mit Bakterien aus einer 50 ml Übernachtkultur

zu einer OD600 von 0,02 angeimpft und unter Schütteln bei 37°C inkubiert.

Nach Erreichen einer OD600 von 0,3 musste die Kultur in einem

Eis/Wasserbad schnell abgekühlt, die Bakterien bei 4°C abzentrifugiert

(6000 Upm, 10 min) und das Sediment in 125 ml einer eiskalten 50 mM

CaCl2-Lösung resuspendiert werden. Nach erneutem Zentrifugieren wurde

das Sediment in 25 ml 50 mM CaCl2/10%-Glyzerin-Lösung aufgenommen

und in Aliquots von je 500µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei

-80°C gelagert. Auf diese Weise vorbehandelte Zellen konnten über

mehrere Monate zur Transformation verwendet werden.

25

2.8 Präparation, Modifikation und Analyse

von Plasmid-DNA

2.8.1 Transformation von Bakterien

10 µl eines Ligationsansatzes oder 10 ng einer Plasmid-DNA wurden mit

100 µl einer Suspension kompetenter Bakterien für 10 min auf Eis inkubiert

und danach für 90 sec auf 42°C erwärmt. Nach kurzer Abkühlung auf Eis

und Zugabe von 800 µl LB-Medium erfolgte eine Inkubation der Bakterien

für 1 h bei 37°C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (2 min bei 10000

Upm) sedimentiert, das Medium bis auf 100 µl abgenommen und die

Bakterien auf Agarplatten, denen das entsprechende Antibiotikum zu-

gesetzt wurde, ausgestrichen. Nach einer Inkubation bei 37°C für 12-16

Stunden konnten die gewachsenen Kolonien gezählt und analysiert wer-

den.

2.8.2 Plasmid-Präparationen

Plasmid-Präparationen erfolgten nach den Herstellerangaben der Firma

QIAGEN (Hilden).

2.8.3 Quantitative Bestimmung von

Nukleinsäuren

Die quantitative Bestimmung der DNA erfolgte photometrisch in einem

UV/Vis-Spektrophotometer (Pharmacia, Freiburg) über die optical density

OD260. Eine Extinktion E260 = 1,0 entspricht 50 µg doppelsträngiger (ds)

DNA bzw. 20 µg einzelsträngiger (ss) DNA. Die Reinheit der Nukleinsäure-

präparationen wurde mit Hilfe des OD260 / OD280 Quotienten ermittelt.

Dieser sollte bei 1,8-2,0 liegen 134.

26

2.8.4 Spaltung von DNA mit

Restriktionsendonukleasen

Die Restriktion von Plasmid-DNA erfolgte nach Standardvorschrift 134. Die

Restriktionsbedingungen wurden entsprechend den Empfehlungen der

Hersteller gewählt. In der Regel betrug die Inkubationszeit 1-3 h. Die

vollständige Restriktion der DNA wurde mit Hilfe analytischer Agarosegele

überprüft.

2.8.5 Dephosphorylierung linearisierter DNA

Um die Wahrscheinlichkeit der Religation eines linearisierten Plasmids zu

verringern und so die Effizienz der gewünschten Insertion einer Fremd-

DNA zu erhöhen, wurde die endständige 5’-Phosphatgruppe des line-

arisierten Vektors entfernt. 100-200 ng DNA wurden mit einer Einheit

alkalischer Phosphatase 30 min bei 37°C inkubiert. Zum Entfernen des

Enzyms erfolgte anschließend die Aufreinigung über ein Agarosegel oder

mittels Phenolextraktion.

2.8.6 Phenolextraktion

Der zu reinigende Ansatz wurde mit H2O auf 400 µl aufgefüllt, es wurden

20 µl 2 M Tris-Base und 400 µl Wasser-gesättigtes Phenol zugegeben.

Nach gründlichem Mischen und 2 minütiger Zentrifugation bei 14000 Upm,

wurde die obere wässrige Phase abgenommen und in ein frisches Eppen-

dorfreaktionsgefäß überführt.

Nun erfolgte die Zugabe von je 400 µl Phenol/Chloroform bzw. Chloroform,

und es wurde jeweils wie oben beschrieben verfahren.

Zum Fällen der DNA wurde schließlich die wässrige Lösung mit 2 µl

Glycogen, 10 µl 8 M LiCl und 400 µl Isopropanol versetzt, gemischt und

eine Stunde bei -20°C inkubiert. Nach 10 minütiger Zenrifugation bei 14000

Upm wurde der Überstand verworfen, der Bodensatz zweimal mit 70%igem

Ethanol gewaschen, bei 37°C getrocknet und schließlich in 40 µl H2O

resuspendiert.

27

2.8.7 Elektrophoretische Analyse von Plasmid-

DNA

Nach Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen erfolgte die

Analyse der DNA-Fragmente mittels Elektrophorese. Dazu wurde die DNA-

Lösung mit 0,1 Volumen eines 10-fach DNA-Probenpuffers vermischt. Im

Agarosegel aufgetragen, konnten die DNA-Fragmente im elektrischen Feld

nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Dieses Gelsystem wurde benutzt,

um DNA-Fragmente von 300-8000 bp aufzutrennen. Die Gelmatrix bestand

aus 1% Agarose in 1xTAE und 0,1 ng/ml Ethidiumbromid. Der Einsatz von

Ethidiumbromid ermöglichte es, die DNA-Banden im UV-Licht sichtbar zu

machen.

10 x DNA Probenpuffer:

2 5 % Ficoll’sche Lösung

0,4 % Bromphenolblau

0,4 % Xylencyanolblau

50 x TAE:

2 M Tris-Base

1 M Eisessig

50 mM EDTA pH 8,0

Laufpuffer:

1 x TAE

2.8.8 Isolierung von DNA-Fragmenten

Die durch den Verdau der Plasmide entstandenen DNA-Fragmente wurden

auf Agarosegelen aufgetrennt, das gewünschte Fragment ausgeschnitten

und mit Hilfe des „Gel-Extraktion-Kit“ der Firma Qiagen (Hilden) isoliert. Die

Konzentration des isolierten Fragments konnte durch Abschätzung der

Helligkeit der Bande auf einem analytischen Agarosegel ermittelt werden.

28

2.8.9 DNA-Ligation

Die Ligation doppelsträngiger DNA-Moleküle erfolgte mit dem Enzym T4-

DNA-Ligase. In der Regel wurden 10 ng des geschnittenen Vektors und ein

5-facher molarer Überschuß an gereinigtem Fragment für den Ligations-

ansatz eingesetzt. Die Inkubationszeit lag bei 14-16 Stunden bei 14°C im

Wasserbad.

2.9 Transiente Transfektion von HepG2-

Zellen

Für Reportergen-Assays wurden HepG2-Zellen transient mit der Calcium-

Phosphat-Methode transfiziert. Dazu wurden 24 h vor der Transfektion die

konfluent bewachsenen Schalen 1 zu 8 bis 1 zu 10 gesplittet. Das

DMEM/NUT-MIX-F12 Medium wurde 30 min vor der Transfektion durch

DMEM ersetzt. Die zur Transfektion verwendete Calcium-Phosphat-DNA-

Lösung setzte sich aus 25 µg DNA, 75 µl 2 M CaCl2 und 600 µl 2 x HBS in

12 ml DMEM zusammen. Die Zellen wurden nach einer Inkubationszeit von

18 h in DMEM/NUT-MIX-F12 weiterkultiviert.

2 x HBS:

1 0 g/l HEPES

1 6 g/l NaCl

0,74 g/l KCl

0,25 g/l NaH2PO4xH2O

2 g/l Glukose

Der pH-Wert der Lösung wurde mit NaOH auf exakt 7,05 eingestellt.

29

2.10 Proteinbestimmung nach Bradford

Zum quantitativen Nachweis gelöster Proteine wurde ein Test der Firma

BioRad (München) verwendet. Das Prinzip der Bestimmung basiert auf der

von Bradford 135 beschriebenen Methode. Für die Kalibrationsgerade bzw.

zur Probenbestimmung wurde eine Verdünnung von 0-12 µg BSA bzw. 5 µl

der Testlösung in 800 µl Wasser und 200 µl der BioRad-Gebrauchslösung

hergestellt. Die Proben wurden gemischt und 5 min bei RT inkubiert. Die

Proteinkonzentration konnte mit Hilfe der OD595-Messung bestimmt werden.

2.11 Herstellung von Zell-Lysaten

Zu lysierende HepG2-Zellen wurden zunächst zweimal mit kaltem

PBS/1mM Vanadat gewaschen und mit einem Gummischaber von der

Platte gelöst. Die Zellen wurden abzentrifugiert (2 min, 1200 Upm) und in

300 µl IP-Puffer (Brij-Lysispuffer: 20 mM Tris/HCl pH 7,4; 150 mM NaCl; 10

mM NaF; 1% Brij’97; 1 mM Na-Orthovanadat; 0,5 mM EDTA; 5 mg/ml

Aprotinin; 1 mg/ml Leupeptin) aufgenommen. Nach einer Inkubation von 30

min auf Eis wurde 1 min geschüttelt und zentrifugiert (5 min, 10000 Upm).

Die Überstände wurden in neue Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt.

2.12 Immunpräzipitation

Zelllysate wurden auf gleiche Proteinmengen und Flüssigkeitsvolumina

eingestellt und mit 1 µg Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Zur

Immunpräzipitation von STAT3 wurde der polyclonale C20-Antikörper

(Santa Cruz Biotech.) und zur Immunpräzipitation von FKHR FKHR-

Antiserum, welches von A. Barthel zur Verfügung gestellt wurde, verwen-

det. Anschließend wurden die Immunkomplexe mit Hilfe von Protein-A-

Sepharose (Pharmacia) präzipitiert. Nach dreimaligem Waschen wurden

die Immunkomplexe mit Lämmli-Puffer 136 von der Sepharose gelöst, mit

Hilfe einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Masse nach auf-

getrennt und anschließend durch Western-blotting auf eine PVDF-Membran

30

übertragen. Kopräzipitierte Proteine konnten durch Immundetektion nach-

gewiesen werden.

2.13 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zur Auftrennung von Proteinen wurde, wenn nicht anders angegeben, eine

diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (7,5% PPA) nach

Laemmli durchgeführt 136.

Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden

und reduzierenden Bedingungen erfolgt proportional zur Masse. Mer-

captoethanol bewirkt die Reduktion von Disulfidbrücken zu den ent-

sprechenden Thiolen. Die hier angewendete Methode der diskontinuier-

lichen Elektrophorese nach Laemmli erfolgte in einer vertikalen Flach-

gelkammer von Biometra nach Herstellerangaben.

Trenngel:

7 ml aqua dest.

3,5 ml Acrylamidlösung

3,5 ml 4-fach Trenngelpuffer

1 8 0 µl 20% APS

4,5 µl TEMED

Sammelgel:

4 ml aqua dest.

0,6 ml Acrylamidlösung

1,5 ml 4-fach Sammelgelpuffer

5 0 µl 20% APS

3 µl TEMED

Acrylamidlösung:

3 0 % Acrylamid

0,8 % Bisacrylamid

31

4-fach Trenngelpuffer:

1,5 M Tris/HCl, pH8,8

0,4 % SDS

4-fach Sammelgelpuffer:

0,5 M Tris/HCl, pH6,8

0,4 % SDS

Elektrodenpuffer:

2 5 mM Tris-Base

1 9 2 mM Glycin

0,1 % SDS

Die Elektrophorese erfolgte für 16 h bei konstanter Spannung von 60 V

oder 2 h bei konstanter Stromstärke von 35 mA.

2.14 Proteintransfer auf eine PVDF-

Membran durch das

„Western-Blot-semidry“-Verfahren

Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden zur Detektion auf eine

PVDF-Membran übertragen. Dazu diente das „Western-Blot-semidry“-

Verfahren. Es wurden insgesamt 15 3MM Whatman-Papiere und die

PVDF-Membran genau auf die Gelgröße zugeschnitten. Die PVDF-Memb-

ran musste für 5-7 sec in 100% Methanol getaucht, weitere 5 min gewäs-

sert und dann für 15 min in Anoden-Puffer-II äquilibriert werden. Das Gel

wurde für mindestens 5 min in Kathoden-Puffer äquilibriert. Nach kurzem

Tränken der Whatman-Filter mit den unten angegebenen Puffern erfolgte

der Aufbau des Blots:

32

1. Graphitplatte, bildet Anode

2. 6 Whatman-Filter getränkt mit Anoden-Puffer-I

3. 3 Whatman-Filter getränkt mit Anoden-Puffer-II

4. PVDF-Membran äquilibriert in Anoden-Puffer-II

5. Polyacrylamidgel äquilibriert in Kathoden-Puffer

6. 6 Whatman-Filter getränkt mit Kathoden-Puffer

7. Graphitplatte, bildet Kathode

Die oben aufgeführten Komponenten wurden luftblasenfrei aufeinander-

gelegt. Die Übertragung der Proteine auf die Membran erfolgte bei 0,8

mA/cm2 für 1h bei einem Andruckgewicht von 1 kg.

Anodenpuffer-I:

0,3 M Tris-Base

2 0 % Methanol

Anodenpuffer-II:

0,025 M Tris-Base

2 0 % Methanol

Kathodenpuffer:

0,04 M E-Aminocapronsäure

2 0 % Methanol

33

2.15 Detektion präzipitierter Proteine mit

Hilfe eines Immunblots

Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran wurden die

freien Bindungsstellen 10 min mit 10% BSA in TBS-N blockiert, die Memb-

ran zweimal für 15 min mit TBS-N gespült und 1 h bei RT mit einer 1:1000

Verdünnung eines entsprechenden Antikörpers in TBS-N inkubiert. Nach

zwei kurzen Spülschritten und dreimaligem Waschen für 1x15 min und

2x10 min erfolgte die Inkubation mit dem Peroxidase-konjugierten Anti-

körper in einer Verdünnung von 1:1000 in TBS-N für 30 min bei RT. Das

überschüssige Antiserum wurde durch zweimaliges Spülen und erneute

Waschschritte für 2 x 15 min mit TBS-N entfernt. Die Proteine konnten in

einer anschließenden ECL-Reaktion (Amersham, Braunschweig) detektiert

werden.

TBS-N:

2,42 g / l Tris-Base

8 g / l NaCl

3,81 ml / l 1 M HCl, pH 7,6

0,1 %v/ v Nonidet P-40

34

2.16 Reportergen-Versuche

Zur Analyse genregulatorischer Eigenschaften von Proteinen wurden

Reportergenexperimente durchgeführt. Ein Reportergen-Konstrukt enthält

neben einer Promotorsequenz das kodierende Gen für das Reporter-

protein. Humane Hepatomzellen (HepG2) wurden mit dem entsprechenden

Expressionskonstrukt transient transfiziert. Indirekt konnte dann über die

Messung der Reporterenzym-Aktivität die Expressionstärke des Reporter-

gens bestimmt werden. Die Genauigkeit der in Reportergensystemen

gemessenen Aktivitäten wird durch verschiedene Faktoren, wie z.B.

Unterschiede von Zellkulturschale zu Zellkulturschale, Anzahl und Zustand

der kultivierten Zellen, Transfektionseffizienz, Zell-Lyse und Pipettier-

ungenauigkeiten bestimmt. Deshalb wurde neben dem experimentellen

Reportergenplasmid noch ein weiteres Kontrollexpressionskonstrukt, das

eine konstitutive Expression der β-Galaktosidase (pCH110, Phamacia)

bewirkt, kotransfiziert.

2.17 Ernte transfizierter Zellen für

Reportergenuntersuchungen

Mit der Calcium-Phosphat-Methode transifizierte HepG2-Zellen wurden

einen Tag nach der Transfektion für weitere 16 h mit (stimulierte Zellen)

oder ohne (unstimulierte Zellen) Zytokin bzw. Wachstumsfaktoren weiter-

kultiviert. Anschließend wurde das Kulturmedium entfernt, und die Zellen

wurden mit PBS gewaschen und lysiert. Zur Zelllyse wurde der Reporter

Lysis Buffer der Firma Promega (Madison, USA), der für Luziferase- und β-

Galaktosidase-Reporterenzym-Versuche geeignet ist, nach

Herstellervorschriften verwendet.

35

2.17.1 Luziferase-Messung

Die Zell-Lyse der HepG2-Zellen wurde mit einem Kit (Luciferase Assay

System with Reporter Lysis Buffer) der Firma Promega nach modifizierten

Herstellervorschriften durchgeführt. 10 µl der aus der Zell-Lyse erhaltenen

Zellextrakte wurden in einer lichtundurchlässigen 96er-Lochplatte mit 50 µl

Assay Reagent des Kits versetzt, woduch die von der Luziferase kata-

lysierte Reaktion gestartet wurde. Die Luziferase des Leuchtkäfers,

Photinus pyralis (firefly luciferase) oxidiert ihr Substrat Luciferin zu

Oxyluciferin, und bei dieser Reaktion wird Licht emittiert. Normalerweise

verläuft die Reaktion über das Enzymintermediat Luciferyl-AMP und klingt

recht schnell ab. Wird jedoch Coenzym A (CoA) zugegeben, so entsteht

anstatt Luciferyl-AMP Luciferyl-CoA, die Reaktion erreicht nach wenigen

Sekunden ihr Maximum und bleibt über einen Zeitraum von 60 Sekunden

stabil. Mit dem Gerät „Microlumat 96 P“ der Firma EG&G Berthold (Bad

Wildbad) wurde die Lumineszenz gemessen. Die erhaltenen Werte wurden

mit den Werten für die Transfektionseffizienz (β-Galaktosidase-Aktivität)

korrigiert. Aus mindestens dreifach unabhängig voneinander durchge-

führten Versuchen wurden die Mittelwerte und Standartabweichungen

berechnet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Messwerte und

Standartabweichungen durch den ersten basalen Wert geteilt und dieser so

auf eins normiert.

2.17.2 β-Galaktosidase-Messung

Um die Transfektionseffizienz zu überprüfen, wurde das Kontrollreporter-

plasmid pCH 110 (Pharmacia) stets kotransfiziert. Die β-Galaktosidase-

Aktivität wurde bestimmt, indem 50 µl der Zell-Lysate mit 500 µl β-Galakto-

sidase-Puffer und 100 µl ONPG (1 mg/ml o-Nitrophenylgalactosid), chro-

mogenes Substrat der β-Galaktosidase, bei

37 °C inkubiert wurde. Sobald eine leichte Gelbfärbung der Proben fest-

zustellen war, wurde die Reaktion mit 250 µl 1M Na2CO3 gestoppt und die

OD der Proben bei 420 nm bestimmt.

36

Die β-Galaktosidase-Aktivität errechnet sich dann wie folgt:

Aktivität=(OD420 x 6000) / (Inkubationszeit in min)

β-Galaktosidase-Puffer:

6 0 mM Na2HPO4

4 0 mM NaH2PO4

1 mM KCl

1 mM MgCl2

3 8 6 µl β-Mercaptoethanol pro 100 ml Lösung

2.18 Zellproliferationstest (XTT-Test)

Stabil transfizierte HepG2-Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und

in DMEM/NUT-MIX-F12 aufgenommen. Je 2x104 Zellen in 100 µl Medium

wurden in eine 96er-Lochplatte ausgesät. Zum Stimulieren wurden die

Zellen mit Konzentrationen von 800 bis 0 Einheiten IL-6/ml und sIL-6Rα der

gleichen Konzentration inkubiert. Nach drei Tagen erfolgte die kolori-

metrische Quantifizierung der metabolisch aktiven Zellen mit Hilfe des Cell

Proliferaiton Kit II (XTT) (Boehringer Mannheim, Mannheim). Die Um-

setzung von Tetrazoliumsalz XTT wurde nach 4-12 h Inkubation der

HepG2-Zellen mit dem XTT-Reaktiongemisch spektralphotometrisch bei

450 nm (Referenzwellenlänge 650 nm) im Mikrotiterplatten-Reader gemes-

sen.

2.19 Zellfärbungen für die Immunfluoreszenz

Um endogene Proteine im Mikroskop sichtbar zu machen, wurden die

HepG2-Zellen über Nacht auf 12 mm cover slips kultiviert. Darauf folgte

eine Inkubation in Medium ohne FCS für sechs Stunden. Nach der sich

anschließenden Stimulation von 15 min mit IL-6 und sIL-6Rα bzw. Insulin

wurden die Zellen mit PBS2+ gewaschen und mittels 2% Paraformaldehyd

20 min fixiert. Da intrazelluläre Proteine im Zentrum des Interesses stan-

37

den, musste die Zellmembran permeabilisiert werden, damit die Antikörper

ins Zytosol gelangen konnten. Dieses erfolgte durch eine fünf-minütige

Inkubation in PBS2+T. Nach Einbringen der Zellen für fünf Minuten in 50mM

NH4Cl, folgte ein weiterer Waschschritt und eine 30-minütige Absättigung

der unspezifischen Bindungen durch 1% BSA, welches in PBS2+T gelöst

war. Anschließend gab man für die gleiche Zeit den Primärantikörper, in

PBS2+T 0,1% BSA gelöst und 1:100 verdünnt, hinzu. Zur Anwendung kam

der monoklonale Maus anti-STAT3 Antikörper (610189, Transduction) und

polyklonales anti-FKHR (H-128, Santa Cruz Biotechnology) Kaninchen-

serum. Nach den folgenden drei Waschschritten mit PBS2+T 0,1% BSA

wurde mit dem Sekundärantikörper, in PBS2+T 0,1% BSA gelöst und 1:100

verdünnt, für 30 Minuten inkubiert. Dabei richtete sich ein TRITC-makierter

Antikörper gegen ein Epitop von Kaninchen-Antikörpern (R0156, Dako,

Glostrup, Dänemark) und ein an FITC gebundener Antikörper gegen ein

Epitop von Mausantikörpern (F0479, Dako, Glostrup, Dänemark). Nach

weiteren Waschvorgängen wurden die Cover Slips mit der bewachsenen

Seite auf einem Objektträger mit Moviol fixiert.

2.20 Fluoreszenzmikroskopie

Fluorochrome zeichnen sich insofern aus, als dass man sie mittels eines

engen Wellenlängenspektrums anregen kann, und sie dann langwelligeres

Licht emittieren.

2.20.1 Geräte

Die mikroskopische Untersuchung der Zellpräparate erfolgte an einem

konfokalen Laser Scanning Mikroskop Typ LSM 510 der Firma Carl Zeiss

Mikroskopie, Jena.

Eine spektrometrische Auswertung einzelner Zellbereiche wurde durch ein

direkt mit dem LSM 510 gekoppeltes modulares Dioden-Array-Spektro-

meter Typ MCS 521vis der Firma Carl Zeiss Mikroskopie, Jena, ermöglicht.

38

2.20.2 Bildaufnahme am LSM 510

Durch Anregung im Wellenlängenbereich zwischen 450 bis 490 nm (Filter-

satz ”FITC”) und im Bereich zwischen 540 und 552 nm (Filtersatz ”TRITC”)

mittels einer Quecksilberdampflampe konnten im okularvisuellen Arbeits-

modus Zellen ausgewählt werden, welche die gewünschte Fluoreszenz-

markierung aufwiesen.

Im konfokalen Arbeitsmodus wird die Probe mit Laserlicht angeregt. Es

kamen die Wellenlängen 488 nm (Argon-Laser) und 543 nm (Helium-Neon-

Laser) zum Einsatz. Dabei wurden das Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) mit

488 nm und das tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) mit 543 nm

angeregt.

Verschiedene Filterkombinationen ermöglichten die selektive Detektion des

Emissionslichtes der verschiedenen Fluorophore. Für FITC kam der

Bandpassfilter Typ BP 505-530 (Bandbreite 505 bis 530 nm) zum Einsatz.

Die TRITC-Fluoreszenz wurde mit einem Langpassfilter Typ LP 560

(Durchlaß >560 nm) abgenommen. Die konfokalen Lochblenden ließen sich

auf jede Emmissionswellenlänge der Probe einstellen und sicherten somit

einen möglichst hohen Grad an Auflösung und geringer optischer

Schnittdicke.

Die Handhabung des konfokalen Mikroskops erfolgte gemäß den Vor-

schriften im Operating Manual (Release 2.5) der Firma Carl Zeiss.

Für die Bildaufnahmen wurde die Laserleistung des Argon-Lasers im

Bereich zwischen 25% und 55% variiert. Die Laserblende wurde im Bereich

4% bis 90% eingestellt. Die Auflösung betrug entweder 512x512 Bildpunkte

oder 1024x1024 Bildpunkte. Die Tiefenschärfe der Bilder wurde konstant im

12 Bit-Modus belassen. Die Aufnahmegeschwindigkeit wurde in Abhängig-

keit von der Aufnahmeart jeweils einem optimalen Signal zu Rausch-

Verhältnis angepasst.

39

3 Ergebnisse

3.1 Hemmung der IL-6-Signaltransduktion

in Hepatozyten durch

Wachstumsfaktoren

Wie in der Einleitung (siehe 1.5) beschrieben, kommt es bei HepG2-Zellen

unter Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Cortisol zu einer ver-

minderten Produktion IL-6-induzierbarer Proteine.

FCS (fetal calf serum) ist, wie der Name schon sagt, das von fetalen

Kälbern gewonnene Serum. Da in der fetalen Phase das Organwachstum

im Vordergrund steht, werden in dieser Zeit eine Fülle von Wachstums-

faktoren benötigt. Das in den Versuchen verwendete FCS stellt somit ein

nicht genau definiertes Gemisch verschiedenster löslicher, nicht korpus-

kulärer Blutbestandteile da.

Um die Auswirkung von FCS auf die IL-6-Signaltransduktion und damit die

Produktion von Akut-Phase-Proteinen (APP) nachzuvollziehen, wurden

verschiedene Versuchsreihen durchgeführt.

In dem ersten Experiment wurden humane HepG2-Hepatom-Zellen mit

einem Plasmid transfiziert, das den Promotor des Gens für alpha-2-

Makroglobulin, einem APP der Ratte, mit nachgeschaltetem Luziferase-

Gen, enthält. Zur Transfektionskontrolle wurde ein die ß-Galaktosidase

kodierendes Plasmid kotransfiziert. Diese beiden Konstrukte wurden auch,

sofern nicht anders angegeben, in den folgenden Versuchen eingesetzt.

40

0123456789

10 %

FCS

7,5 %

FCS

5 % FCS

2,5 %

FCS

1,25 %

FCS

0 % FCS

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne IL-6/sIL-6Rmit IL-6/sIL-6R

Abbildung 3.1.1: Abnehmende Mengen von FCS im Kulturmedium bewirken eine steigende IL-6-induzierbare Luziferase Aktivität.

HepG2-Zellen wurden mit insgesamt 25 µg Plasmid mittels Calciumphosphat-Methode transfiziert. Dabei wurden je 5 µg Plasmid, welches für die β-Galaktosidase kodiert, sowie ein Expressionskonstrukt mit dem alpha-2-Makroglobulin Promotor mit nachgeschaltetem Luziferase-Gen kotransfiziert. Für die verbleibenden 15 µg wurden Leervektoren verwendet. Das Medium, in dem die Transfektion durchgeführt wurde, war DMEM und enthielt 5% FCS. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen DMEM-F12 ausgetauscht und die Zellen für 16 Stunden wie angegeben stimuliert. Die weißen Balken geben die Aktivität ohne, die schwarzen die Aktivität mit IL-6-Stimulus wieder (160 Einheiten IL-6 und 1µg löslicher IL-6 Rezeptor pro ml). Als Abgleich für unterschiedliche Transfektionseffizienzen wurden alle gemessenen Luziferasewerte durch die zugehörigen ß-Galaktosidasewerte geteilt. Alle Versuche wurden unabhängig voneinander mindestens dreifach durchgeführt, der Mittelwert berechnet und die Standardabweichung gebildet. Alle Mittelwerte und Standardabweichungen wurden durch den, in der Reihe ersten basalen Mittelwert geteilt, und dieser so auf eins normiert.

Bei dem Versuch (Abbildung 3.1.1) konnte gezeigt werden, dass mit

sinkender FCS-Konzentration die gemessene Luziferase Aktivität stieg.

Dies gilt vor allem für die Inkubation mit IL-6. Zehnprozentiges FCS im

Medium bewirkt eine Halbierung der Luziferase Aktivität nach Stimulation

im Vergleich zu FCS-freiem Medium. In Abwesenheit von IL-6 betrug die

Abnahme nur etwa 15%. Somit ergibt sich bei Zugabe von FCS eine

deutliche Abnahme der Induzierbarkeit dieses IL-6-responsiven Genes,

was bedeutet, dass FCS hemmend auf die Signaltransduktion des IL-6

wirkt.

Die Tatsache, dass der Effekt bei unstimulierten Zellen gering ist und auch

die ß-Galaktosidaseaktivität nicht signifikant vermindert wurde (Daten nicht

gezeigt), macht eine generelle Hemmung der RNA-, beziehungsweise

Proteinbiosynthese unwahrscheinlich.

41

Da FCS eine nicht genau definierte Zusammensetzung verschiedener

Faktoren darstellt, sollte untersucht werden, ob sich ein bestimmter

Wachstumsfaktor identifizieren lässt, welcher für die Hemmung des IL-6-

Signals verantwortlich ist. Die Zellen wurden mit den oben genannten

Konstrukten transfiziert und mit verschiedenen Wachstumsfaktoren stimu-

liert. Dabei kamen EGF (epidermal growth factor), HGF (hepatocyte growth

factor), NGF (nerve growth factor), Insulin sowie das synthetische Gluco-

corticoid Dexamethason zum Einsatz.

02468

101214

Kontrolle EGF

HGFNGF

Insulin

Dexam

ethas

on

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


relative Induzierbarkeit

1,00

0,410,59

0,76 0,75 0,73

0,00,20,40,60,81,01,2

Kontrolle EGF

HGFNGF

Insulin

Dexam

ethas

on

Abbildung 3.1.2: EGF, HGF, NGF, Insulin sowie Dexamethason hemmen die Re-portergenaktivität unter der Kontrolle des alpha-2-Makroglobulin-Promotors.

HepG2-Zellen wurden, wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert. Die IL-6-Stimulation erfolgte in Anwesenheit von 50 ng/ml EGF, 3300 Einheiten/ml HGF, 50 ng/ml NGF, 1 µM Insulin und 2 µM Dexamethason in FCS-freiem Medium. Die relative Induzierbarkeit ergibt sich, indem die Messwerte in Gegenwart von IL-6- durch die jeweiligen Werte in Abwesenheit geteilt wurden. Alle resultierenden Werte wurden durch den der Kontrolle dividiert und dieser so auf eins normiert.

42

Wie in Abbildung 3.1.2 gezeigt, stellte sich bei allen getesteten Substanzen

eine leichte Abnahme der IL-6-induzierten Luziferase Aktivität ein. Die

basale Aktivität nahm in Gegenwart der Wachtumsfaktoren deutlich zu.

Stellt man ein Verhältnis zwischen den jeweiligen mit IL-6 stimulierten und

unstimulierten Proben auf, so ergibt sich wie beim vorangegangenen

Versuch (Abbildung 3.1.1) ebenfalls eine Verringerung der Induzierbarkeit

um durchschnittlich etwa 30% (Abbildung 3.1.2).

Für Insulin wurde bereits eine Hemmung der IL-6-Signaltransduktion

beschrieben 127. Insulin, wie auch sein Rezeptor, besitzt große Ähnlichkeit

mit anderen Wachstumsfaktoren beziehungsweise ihren Rezeptoren,

woraus für einige auch der Name insulin-like-growth-factor (IGF) resultiert.

Außerdem handelt es sich bei Insulin um ein anaboles Hormon, welches

die Glukose-Utilisation der Zelle fördert und somit wichtig für Wachstum

und Proliferation ist.

Wie in der Einleitung beschrieben, transduziert Insulin, wie auch viele

andere Wachstumsfaktoren, sein Signal über eine Rezeptortyrosinkinase.

Insulin-Bindung bedingt eine Tyrosin-Phosphorylierung des Rezeptors und

in der Folge eine Aktivierung der PI3-Kinase, welche über Zwischenstufen

zur Phosphorylierung und Aktivierung einer weiteren Kinase, der Protein-

kinaseB führt. Ein synthetischer Inhibitor der PI3-Kinase ist Wortmannin.

Von Interesse war nun, ob die Hemmung der IL-6-Signaltransduktion durch

Insulin durch eine Inhibierung der PI3-Kinase mittels Wortmannin aufzu-

heben ist. Dabei wurden die Zellen analog zu den vorangegangenen

Versuchen transfiziert und entweder gar nicht, nur mit Insulin oder mit

Insulin und Wortmannin stimuliert (Abbildung 3.1.3).

43

0

5

10

15

20

25

Kontrolle Insulin Insulin +Wortmannin

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne IL-6/sIL-6R

mit IL-6/sIL-6R

Abbildung 3.1.3: Der inhibitorische Effekt von Insulin auf die IL-6-Signaltransduktion lässt sich mit Hilfe von Wortmannin komplett unterdrücken.

HepG2-Zellen wurden, wie in Abbilung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R stimuliert. Insulin lag 1 µM und Wortmannin 100 nM im Kulturmedium vor.

Dabei stellte sich bei Insulin-Inkubation die auch aus den Vorversuchen zu

erwartende Minderung der Luziferase Aktivität ein (Abbildung 3.1.2 und

3.1.3). Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass aus einer Behandlung mit

Insulin und Wortmannin im Vergleich zu normalem Kulturmedium unter IL-

6-Stimulation sogar eine höhere Luziferase Aktivität resultiert. Die PI3-

Kinase soll in vielen Zelllinien über die Ras/Raf/MAPK-Kaskade ebenfalls

bei einem IL-6-Stimulus aktiviert werden 79-82,137. Da Wortmannin die PI3-

Kinase inhibiert, wäre eine Erklärungsmöglichkeit, dass die PI3-Kinase

direkt oder indirekt für den hemmenden Effekt von Insulin auf die IL-6-

Signaltransduktion verantwortlich sein könnte.

Die PI3-Kinase phosphoryliert Phosphatidylinositole der Zellmembran.

Davon abhängige Kinasen, die phosphatidylinositolphoshate-dependent-

kinases (PDK), spielen in der weiteren Signaltransduktions-Kaskade der

PI3-Kinase eine wesentliche Rolle. Ein Effektorprotein, welches der PDK1

als Substrat dient, ist PKB/Akt. Es wird in phosphorylierter Form aktiv,

transloziert in den Zellkern und phosphoryliert bestimmte Proteine.

In weiteren Versuchen konnte PKB/Akt als eine Kinase, deren Phospho-

rylierung und Aktivierung für die Unterdrückung des IL-6-Signals ausreicht,

identifiziert werden (Daten nicht gezeigt, vgl. 138).

44

Es galt herauszufinden, wie Akt die IL-6-Signaltransduktion zu hemmen

vermag. Insulin und anderen Wachstumsfaktoren ist gemeinsam, dass sie

über eine Aktivierung der PI3-Kinase PKB/Akt phosphorylieren. In Ab-

bildung 3.1.2 wurde gezeigt, dass auch Dexamethason zu einer Unter-

drückung des IL-6-Signals und damit zu einer Synthesehemmung von

APPs befähigt ist. Cortisol wirkt über verschiedene Mechanismen auf

zelluläre Funktionen. Eine Möglichkeit ist die Aktivierung von serum- and

glucocorticoid-inducible kinases (SGK), welche in ihren Kinasedomänen

starke Homologien zu PKB/Akt aufweisen. Für Akt sind als bekannte

Substrate die Glykogen-Synthase-Kinase-3 (GSK3), Bad sowie FKHR zu

nennen. Eines dieser Proteine könnte möglicherweise mit Proteinen der IL-

6-Signaltransduktions-Kaskade interagieren und so die APP-Produktion

beeinflussen.

Ein Protein, welches einer regulatorischen Kontrolle sowohl der Protein-

kinase B, als auch der SGK untersteht 115, ist der forkhead transcription

factor (FKHR). So konzentrierte sich die Aufmerksamkeit zunächst auf

dieses Protein, ein Familienmitglied der forkhead box, class O (foxo)

Transkriptionsfaktoren.

3.2 Nachweis einer funktionellen Interaktion

zwischen STAT-Faktoren und FKHR

3.2.1 Der Transkriptionsfaktor FKHR verstärkt

STAT3-abhängige Reportergenaktivität

Um herauszufinden, ob ein Zusammenhang zwischen der beobachteten

PKB/Akt-Phosphorylierung und der Abnahme des IL-6-Signals auf eine

Interaktion von STAT3 mit FKHR zurückzuführen ist, wurde eine Versuchs-

reihe mit Konstrukten des Wildtyps dieses Transkriptionsfaktors durch-

geführt.

Dabei wurden neben den für die Reportergene kodierenden Vektoren

steigende Mengen von FKHR-cDNA transfiziert. Falls die Signaltrans-

duktionshemmung des IL-6 durch aktiviertes Akt auf eine Phosphorylierung

45

und damit Inaktivierung von FKHR zurückzuführen ist, so sollte bei Über-

expression von FKHR die STAT3-abhängige Luziferaseproduktion steigen.

0

10

20

30

40

50

Leer FKHR 1 FKHR 2,5 FKHR 10

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


Menge FKHR-Plasmid

Abbildung 3.2.1: Die transfizierte µg-Menge an FKHR-Plasmid steht in direktem

Zusammenhang mit der resultierenden Luziferasemenge, deren Bildung unter der Kontrolle des alpha-2-Makroglobulin-Promotors steht.

Die HepG2-Zellen wurden, wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R in FCS-freiem Medium stimuliert. Um in allen Versuchen dieselbe Gesamtmenge an Plasmid zu erreichen, wurde entsprechend Leervektor kotransfiziert.

Tatsächlich ließ sich die IL-6-induzierte Transkription des Luziferase-Gens

durch Transfektion von FKHR-cDNA deutlich steigern (Abbildung 3.2.1).

Dies legte den Schluss nahe, dass die foxo-Familienmitglieder bei der IL-6-

Signalvermittlung mit den Signalmolekülen des Jak/STAT-Weges auf

irgendeine Weise interagieren müssen.

Physiologisch wird das IL-6-Signal über den Jak/STAT-Weg in der Zelle

weitergeleitet und führt zur Transkription von IL-6-Ziel-Genen, für Proteine

wie beispielsweise das alpha-2-Makroglobulin (Ratte), Serumamyloid A

(SAA) und C-reaktives Protein (CRP). Dabei kommt dem STAT3 eine

essentielle Bedeutung zu. Um zu untersuchen, ob sich bei Transfektion von

STAT3 und FKHR synergistische Effekte einstellen, wurden beide koexpri-

miert.

46

02468

10121416

Leer STAT 3 FKHR STAT 3FKHR

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


Abbildung 3.2.2: Synergistischer Effekt bei Kotransfektion von STAT3 und FKHR auf die IL-6-induzierbare alpha-2-Makroglobulin-Promotoraktivität.

HepG2-Zellen wurden wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R in FCS-freiem Medium stimuliert. Bei diesem Versuch wurden je 5 µg der Plasmide, die für ß-Galaktosidase, STAT3 und Luziferase unter Kontrolle des alpha-2-Makroglobulin-Promotors kodieren, kotransfiziert. 10 µg des Expressionskonstruktes für FKHR kamen zum Einsatz. Alle Mittelwerte und Standardabweichungen wurden bei dieser Abbildung durch den in der Abbildung ersten, mit IL-6 stimulierten Messwert geteilt und dieser so auf eins normiert.

Dabei zeigte sich, dass die Luziferase Aktivität bei Transfektion von STAT3

um den Faktor drei, bei Transfektion von FKHR um den Faktor fünf stieg.

Wurden beide Vektoren in die Zellen eingebracht, so ergab sich eine

transkriptionelle Steigerung um den Faktor 14 (Abbildung 3.2.2). Dieses

deutliche Ergebnis machte es unwahrscheinlich, dass ein rein additiver

Effekt zur Erklärung genügt.

Um zu überprüfen, ob FKHR auch in der Lage ist, die Transkription weiterer

STAT3-induzierbarer Gene zu steigern, wurden auch andere IL-6-respon-

sive Promotoren mit nachgeschaltetem Luziferase-Gen untersucht. Bei

Überexpression von FKHR konnte sowohl für den alpha-1-Anti-

chymotrypsin-, als auch für den SIE-tk-Promotor eine deutliche Zunahme

der Luziferasemenge nachgewiesen werden (Abbildung 3.2.3).

47

Abbildung 3.2.3: FKHR erhöht die IL-6-induzierbare Luziferase über die Promotoren

für α1-Antichymotrypsin sowie für SIE-tk.

HepG2-Zellen wurden, wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R in FCS-freiem Medium inkubiert. Analog zu den vorangegangenen Versuchen wurde mit 5 µg Promotor-Luziferasekonstrukt gearbeitet.

Da bisher nur gezeigt wurde, dass FKHR auf eine unbekannte Art und

Weise eine Steigerung der Transkription IL-6-responsiver Gene bewirkt,

galt es nun, den zugrunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Zum einen

wäre eine Interaktion von FKHR mit Proteinen des Jak/STAT-Weg denkbar,

zum anderen könnte FKHR zu einer generell vermehrten Transkriptions-

aktivität führen.

Es wäre möglich, dass FKHR selbst an STAT-Bindungsstellen rekrutiert

wird, oder dass FKHR die transkriptionelle Maschinerie stimuliert, indem es

basale Transkriptionsfaktoren aktiviert. Weiterhin wäre denkbar, dass

FKHR die Expression von Proteinen induziert, die positiv auf die IL-6-

Signaltransduktion wirken. Diese könnten beispielsweise die Translokation

in den Zellkern fördern, oder Antagonisten wie PIAS3 oder SOCS3 hem-

men. Um diese Möglichkeiten einzugrenzen, wurden weitere Luziferase-

versuche durchgeführt.

SIE-tk-Luziferase

0123456789

10

Leer FKHR

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne IL-6/sIL-6R

mit IL-6/sIL-6R

α 1-Antichymotrypsin-Luziferase

0

10

20

30

40

50

60

Leer FKHR

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne IL-6/sIL-6R

mit IL-6/sIL-6R

48

3.2.2 Die durch FKHR bewirkte transkriptionelle

Steigerung ist STAT3-abhängig

Falls FKHR STAT3-unabhängig an den alpha-2-Makroglobulin-Promotor

binden würde und in der Lage wäre zu transaktivieren, so sollte, bei

Ausschaltung des STAT3-Signals und Überexpression von FKHR, immer

noch ein deutliches Signal resultieren. Um dieses zu kontrollieren, wurden

dominant negative Mutanten von STAT3 exprimiert. Dabei wurden zwei

verschiedene Konstrukte verwendet: STAT3D ist nicht in der Lage an die

DNA zu binden, STAT3F kann nicht dimerisieren 139. Beide STAT3-Mutan-

ten sind nicht fähig, das IL-6-Signal fortzuleiten und zu transaktivieren.

Deshalb wurden sie mit FKHR koexprimiert, und die IL-6-induzierbare

Luziferase Aktivität wurde gemessen.

02468

1012141618

Leer FKHR FKHR STAT 3D

FKHR STAT 3F

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


Abbildung 3.2.4: Dominant negatives STAT3 hemmt die IL-6-abhängige Induktion des alpha-2-Makroglobulin-Promotors auch bei Koexpression von FKHR.

HepG2-Zellen wurden wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R in FCS-freiem Medium inkubiert. Analog zu den vorangegangenen Versuchen wurde mit 5 µg DNA der STAT3-Mutanten gearbeitet.

Beide Mutanten waren in der Lage, die IL-6-vermittelte Geninduktion nahe-

zu gänzlich zu unterdrücken (Abbildung 3.2.4). Dies zeigt, dass die IL-6-

abhängige Induktion des alpha-2-Makroglobulin-Promotors sehr stark von

der Verfügbarkeit funktioneller STAT-Faktoren abhängig ist.

Die verbleibende Aktivität lässt sich damit erklären, dass noch endogenes

STAT3 vorhanden ist. Da der Hemmung mit dominant negativen Proteinen

49

ein kompetitiver Mechanismus zu Grunde liegt, bleibt immer eine Rest-

aktivität erhalten.

3.2.3 Die funktionelle Interaktion mit FKHR ist

spezifisch für STAT3 und STAT1

Es bestand weiterhin die Möglichkeit, dass FKHR nur als Kofaktor dient, um

den basalen Transkriptionsapparat zu aktivieren.

Da für DAF-16 gezeigt wurde, dass es in der Lage ist, CBP/p300 an den

IGFBP1-Promotor zu rekrutieren 97, wäre es möglich, dass die verstärkte

Bildung von Luziferase unter Kontrolle des alpha-2-Makroglobulin-Pro-

motors bei Überexpression von FKHR auf einer unspezifischen Steigerung

der Transkriptionsmaschinerie beruht.

Smad7 ist ein Protein, welches Moleküle der Signaltransduktions-Kaskade

von TGFβ hemmt. Da es nach TGFβ Stimulus vermehrt synthetisiert wird,

stellt Smad7 einen feedback-Inhibitor dar. Falls FKHR eine generelle

transkriptionelle Steigerung bewirkt, sollten auch andere Proteine vermehrt

gebildet werden. Um dieses zu überprüfen wurde der Versuch statt mit den

APP- mit dem Smad7-Promotor durchgeführt.

Smad7-Luziferase

0

1

2

3

Leer FKHR

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne TGFßmit TGFß

Abbildung 3.2.5: FKHR ist nicht in der Lage, die Bildung der Luziferase zu fördern, wenn sie unter der Kontrolle des Smad7-Promotors exprimiert wird.

Die HepG2-Zellen wurden, wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit 10 Einheiten/ml TGFß in FCS-freiem Medium inkubiert. Analog zu den vorangegangenen Versuchen wurde mit 5 µg Promotor-Luziferasekonstrukt gearbeitet.

50

Dabei bewirkte FKHR keine Steigerung der transkriptionellen Aktivität

(Abbildung 3.2.5). So konnte gezeigt werden, dass es sich nicht etwa um

eine unspezifische Interaktion mit basalen Transkriptionsfaktoren, sondern

um einen STAT-spezifischen Mechanismus handelt.

Da STAT3 und STAT1 zum einen starke strukturelle Homologien auf-

weisen, zum anderen als Heterodimer transaktivieren können, sollte in

orientierenden Versuchen untersucht werden, inwiefern FKHR auch

Einfluss auf die STAT1-abhängige Signaltransduktion nehmen kann.

Interferon γ, welches beispielsweise von aktivierten T-Zellen sezerniert

wird, ist ein Botenstoff, dessen Signal in erster Linie durch den Jak/STAT1-

Weg in der Zelle fortgeleitet wird. Dabei spielen sowohl Jak1 als auch Jak2

eine wichtige Rolle 140.

Im Gegensatz zu den oben dargestellten Versuchen wurde nun mit einem

STAT1-responsiven Promotor (interferon responsive element) gearbeitet.

Hinter diesen war als Reportergen die für die Luziferase kodierende DNA

kloniert (IRE-Luz).

IRE-Luziferase

05

101520253035

Leer STAT 1 FKHR STAT1FKHR

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne IFN gammamit IFN gamma

Abbildung 3.2.6: Die STAT1-abhängige Interferon-γ-Signaltransduktion konnte durch

Koexpression von FKHR stark gesteigert werden.

HepG2-Zellen wurden, wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit 1000 Einheiten Interferon-γ pro ml in FCS-freiem Medium inkubiert. Es wurden 5 µg Promotor-Luziferasekonstrukt, 5 µg ß-Galaktosidase, 5 µg STAT1 und 10 µg FKHR kodierendes Plasmid kotransfiziert.

51

Nach Transfektion von FKHR war ein deutlicher Anstieg der Luziferase zu

verzeichnen (Abbildung 3.2.6). Im Verhältnis zu den Kontrolltransfektionen

mit Leervektoren, wurde unstimuliert etwa zweieinhalb mal mehr, nach

IFNγ-Gabe das achtfache an Luziferase gebildet.

Wurden STAT1 und FKHR kotransfiziert, war die Luziferasebildung in

unstimuliertem Zustand um den Faktor drei angestiegen im Vergleich zu

nur mit Leervektor transfizierten Zellen. Nach Stimulation war eine zehn-

fach höhere Luziferase Aktivität zu messen.

So zeigte sich, ähnlich zu den Ergebnissen mit STAT3 nach IL-6-Stimu-

lation (Abbildung 3.2.2), ein additiver Effekt der Transkriptionsfaktoren

FKHR und STAT1 nach IFNγ-Stimulation.

Es sollte im folgenden untersucht werden, ob auch weitere STAT-Faktoren

wie STAT5 mit FKHR interagieren, und FKHR auch in der Lage ist, die

vermehrte Transkription STAT5-responsiver Gene zu bewirken.

Prolaktin, ein Peptidhormon, bindet extrazellulär an seinen Rezeptor.

Daraufhin kommt es zur Rezeptordimerisierung, Aktivierung von Jak2 und

einer Phosphorylierung von Tyrosin-Resten des Rezeptors. An diese lagert

sich STAT5 an, dimerisiert, transloziert in den Zellkern und aktiviert STAT5-

responsive Gene wie beispielsweise das β–Casein-Gen 141-144.

In Analogie zu den vorangegangenen Versuchen kam nun ein Konstrukt

zum Einsatz, bei dem das Reportergen der Luziferase unter den Einfluss

des β–Casein-Promotors gestellt war.

HepG2-Zellen exprimieren nur sehr wenig Prolaktinrezeptoren.

Um die Bedingungen zu den vorangegangenen Versuchen möglichst

konstant zu halten und HepG2-Zellen verwenden zu können, wurde

deshalb zusätzlich mit einem Expressionskonstrukt gearbeitet, welches für

eine Rezeptorchimäre codiert, die extrazellulär aus dem Erythropoetin-

Rezeptor, transmembranär und intrazellulär aus einem Teil des gp130 mit

einer zusätzlichen STAT5 Bindungsstelle besteht.

Nach Stimulation mit Erythropoetin resultiert so intrazellulär eine STAT5

Aktivierung, wie sonst nach Prolaktinstimulation.

52

ß-Casein-Luziferase

02468

1012

Leer FKHR STAT5 FKHR STAT5

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne Epomit Epo

Abbildung 3.2.7: Auf die STAT5-abhängige Signaltransduktion hat FKHR keinen Einfluß.

HepG2-Zellen wurden, wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit 5 Einheiten Erythropoetin/ml in FCS-freiem Medium inkubiert. In Analogie zu den vorangegangenen Versuchen wurden 5 µg Promotor-Luziferasekonstrukt, 5 µg ß-Galaktosidase und 5 µg STAT5-kodierendes Plasmid kotransfiziert. Zusätzlich wurde mit 5 µg Rezeptorchimären und 5 µg FKHR-Expressionskonstrukt gearbeitet.

In diesem Versuch ergab sich ein völlig anderes Ergebnis als in den

vorangegangenen Untersuchungen mit den anderen beiden STAT-

Faktoren (Abbildungen 3.2.2, 3.2.6, 3.2.7). FKHR war nicht in der Lage, die

STAT5-abhängige Luziferaseproduktion zu steigern. Allerdings kam es

nach Transfektion von STAT5 zu einer deutlichen Zunahme der Luzi-

ferasebildung.

Eine Erklärungsmöglichkeit hierfür ist, dass in HepG2-Zellen längst nicht so

viel endogenes STAT5 wie STAT3 vorhanden ist. Deshalb kommt es trotz

Epo-Stimulation zu keiner Zunahme der Luziferase Aktivität bei den

Kontrollen. Bringt man allerdings Expressionsvektoren für STAT5 in die

Zellen ein, so resultiert nach Stimulation eine Steigerung der Luziferase

Aktivität um den Faktor 10.

Im Gegensatz zu STAT1 und STAT3 bewirkt FKHR jedoch auch bei

Kotransfektion mit STAT5 keinerlei Signalverstärkung. Es kommt eher zu

einer Abnahme des Signals. Dieses Ergebnis lässt weiter darauf schließen,

dass der beobachteten Interaktion von FKHR mit STAT3 bzw. STAT1 ein

selektiver und spezifischer Mechanismus zu Grunde liegt, welcher nicht für

alle STAT-Familienmitglieder gilt.

53

3.2.4 FKHR vermindert die PIAS3-vermittelte

STAT3-Inhibition

Wenn FKHR eine transkriptionelle Steigerung bewirkt, indem es mögliche

Bindungsstellen für Inhibitoren wie PIAS3 maskiert oder kompetitiv besetzt,

müsste man den inhibitorischen Effekt dieses Proteins durch steigende

Mengen von FKHR antagonisieren können. Um dies zu überprüfen, wurden

in einem Vorversuch Zellen mit steigenden Konzentrationen von PIAS3-

cDNA transfiziert (nicht gezeigt). Dadurch konnte die zur Unterdrückung

des IL-6-Signals minimal benötigte DNA-Menge an Inhibitorplasmid be-

stimmt werden. Bereits durch Transfektion von einem µg des Expressions-

konstruktes für PIAS3 ließ sich die Luziferasebildung stark hemmen. In

einem weiteren Versuch wurde nun diese Menge an Inhibitorplasmid mit

steigenden Konzentrationen von FKHR-kodierender DNA kotransfiziert, und

der inhibitorische Effekt wurde so versucht zu antagonisieren.

05

1015202530

Leer FKHR PIAS3 PIAS3FKHR

PIAS3FKHR

PIAS3FKHR

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

ohne IL-6/sIL-6R

mit IL-6/sIL-6R

1052,5-10-µg

FKHR-cDNA

Abbildung 3.2.8: Zunehmende Mengen an kotransfiziertem FKHR vermindern die PIAS3-vermittelte Inhibition des IL-6-Signals.

Die HepG2-Zellen wurden, wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben, transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R in FCS-freiem Medium inkubiert. Neben den 5 µg Promotor-Luziferasekonstrukt und 5 µg ß-Galaktosidase wurde 1 µg PIAS3- und steigende Mengen von FKHR-kodierendem Plasmid kotransfiziert.

54

Bei dem Versuch war mit zunehmender Menge an kotransfiziertem FKHR-

kodierendem Plasmid eine gewisse transkriptionelle Steigerung zu be-

obachten (Abbildung 3.2.8). Es konnte bei Kotransfektion von 10 µg FKHR

kodierender DNA die annähernd gleiche Luziferase Aktivität wie bei den

Kontrollen beobachtet werden, wobei die Menge an Expressionsvektor für

FKHR um den Faktor zehn größer war als die von PIAS3. Mit diesen

Ergebnissen lässt sich ein Antagonismus von FKHR und PIAS3 weder

beweisen, noch sicher ausschließen.

55

3.2.5 Nachweis einer physikalischen Interaktion

zwischen STAT3 und FKHR

Um nun zu beweisen, dass eine physikalische Interaktion zwischen STAT3

und FKHR der vermehrten Geninduktion zu Grunde liegt, mussten Ko-

immunpräzipitationen durchgeführt werden. Wenn beide Proteine mitein-

ander assoziiert sind, sollte man mit Antikörpern das eine präzipitieren und

in der Lage sein, das andere im Western Blot detektieren zu können. Diese

Versuche fanden in Zusammenarbeit mit Marcin Kortylewski statt.

Abbildung 3.2.9: FKHR und STAT3 lassen sich kopräzipitieren.

Bei diesen Koimmunpräzipitationen wurde mit Antikörpern gegen FKHR (links) bzw. STAT3 (rechts) präzipitiert, und es konnte STAT3 (links) bzw. FKHR (rechts) im Western Blot detektiert werden. In der mit TCL (total cell lysates) beschrifteten Spur wurden 30 µg Zelllysat ohne Präzipitation aufgetragen. HepG2-Zellen wurden 24 Stunden in FCS-freiem Medium inkubiert. Nach einer Stunde in Medium, welches den PI3-Kinase-Inhibitor LY294002 in 100 µmolarer Konzentration enthielt, erfolgte eine 10-minütige Stimulation mit 200 Einheiten IL-6 pro ml. Darauf wurden die Zellen, wie in Material und Methoden beschrieben, lysiert, und die Koimmunpräzipitation durch-geführt. Nach einer Auftrennung mittels SDS-PAGE erfolgte die Fixierung auf einer PVDF-Membran und anschließend die Detektion mit Antikörpern. Für die beiden unteren Abbil-dungen wurden die Antikörper wieder abgelöst und die präzipitierten Proteine detektiert. Sie stellen eine Kontrolle für die erfolgreiche Präzipitation dar. Als Antikörper wurden sowohl für die Kopräzipitation, als auch für den Western Blot anti-STAT3 (C-20, Santa Cruz) und anti-FKHR (von Andreas Barthel mittels gereinigtem GST-FKHR aus Kaninchenserum gewonnen) verwendet.

56

Sowohl bei der Koimmunpräzipitation mit Antikörpern gegen STAT3 als

auch im analogen Versuch mit anti-FKHR ließ sich das jeweils andere

Protein im Western Blot detektieren. Die Kontrollen mit ProteinA-Sepharose

und irrelevanten Antikörpern waren negativ (nicht gezeigt).

Dies beweist, dass STAT3 und FKHR physikalisch miteinander interagieren

können. Ob sie direkt oder unter Vermittlung anderer Faktoren miteinander

assoziiert sind, konnte mit diesem Versuch allerdings nicht gezeigt werden.

Überraschenderweise resultierte aus diesem Experiment ebenfalls, dass

sie auch ohne IL-6-Stimulation miteinander im Komplex vorliegen (nicht

gezeigt). Dieses könnte eine mögliche Begründung dafür sein könnte, dass

überexprimiertes FKHR auch in unstimulierten HepG2-Zellen die Luziferase

Aktivität unter der Kontrolle des alpha-2-Makroglobulin-Promotors erhöht

(Abbildung 3.2.1).

57

3.3 Auswirkungen von FKHR-

modulierenden Effektoren auf die

IL-6-Signaltransduktion

Für die Regulation von FKHR spielt die PI3-Kinase eine sehr wichtige

Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass FKHR mit STAT3 interagiert und die

Transkription IL-6-induzierbarer Gene fördert.

Wie bereits in der Einleitung (siehe 1.3) erwähnt, kommt es nach IL-6-

Stimulus über den Komplex aus SHP2/Grb2/SOS zu einer Aktivierung von

Ras. In vielen Zelllinien soll GTP-Ras in der Lage sein, die PI3-Kinase zu

aktivieren 79-82,137.

Der Literatur nach könnte das unter normalen Bedingungen gemessene

IL-6-Signal somit einen Zustand von zumindest partieller PI3-Kinase-Akti-

vierung und somit einer teilweisen Inaktivierung von FKHR darstellen.

Um die Auswirkung der PI3-Kinase und ihren untergeordneten Effektoren

auf die IL-6-Signaltransduktion weiter untersuchen zu können, musste

ausgeschlossen werden, dass das endogene FKHR einen limitierenden

Faktor darstellen kann. So wäre es denkbar, dass bereits bei geringer PI3-

Kinase-Aktivierung der größte Teil des endogenen FKHRs inaktiviert wird

und gemessene Effekte nicht mehr auf die Interaktion von STAT3 und

FKHR zurückzuführen sind.

Deshalb wurde in den folgenden Versuchen die FKHR-Konzentration durch

Überexpression von FKHR angehoben und verschiedene Aktivatoren und

Inhibitoren der PI3-Kinase untersucht. Dadurch sollten sich auch die

Unterschiede der Luziferasewerte nach den verschiedenen Stimulationen

besser erkennen lassen.

Falls die IL-6-Signaltransduktion von dephosphoryliertem FKHR-abhängig

ist, sollte sich eine deutliche Abnahme der unter der Kontrolle des alpha-2-

Makroglobulin-Promotors stehenden Luziferase Aktivität bei Aktivierung der

PI3-Kinase verzeichnen lassen.

58

Als Aktivatoren der PI3-Kinase kommen verschiedene Wachstumsfaktoren,

FCS, sowie Insulin in Frage.

05

1015202530354045

FKHR

FKHR + Insu

lin

FKHR + Wortm

annin

FKHR + Insu

lin + W

ortman

nin

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


Abbildung 3.3.1: Wortmannin, als Inhibitor der PI3-Kinase, ist in der Lage, den inhibitorischen Effekt von Insulin auf die IL-6-Signaltransduktion zu unterdrücken.

HepG2-Zellen wurden mit insgesamt 25 µg Plasmid mittels Calciumphosphat-Methode transfiziert. Dabei wurden je 5 µg Plasmid, welches die β-Galaktosidase kodiert, sowie ein Expressionskonstrukt mit dem Promotor von alpha-2-Makroglobulin mit nachgeschalteter Luziferase kotransfiziert. Die verbleibenden 15 µg entfielen auf FKHR-kodierendes Plasmid. Das Medium, in dem die Transfektion durchgeführt wurde, war DMEM und enthielt 5% FCS. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen DMEM-F12 gewechselt, und die Zellen wurden für 16 Stunden wie angegeben stimuliert. Die weißen Balken geben die Aktivität ohne, die schwarzen die Aktivität mit IL-6-Stimulus wieder (160 Einheiten IL-6 und 1µg sIL-6R pro ml). Insulin lag 1 µM, Wortmannin 100 nM im Medium vor. Als Transfektionskontrolle wurden alle gemessenen Luziferasewerte durch die zugehörigen ß-Galaktosidasewerte geteilt. Alle Versuche wurden unabhängig voneinander mindestens dreifach durchgeführt, der Mittelwert wurde berechnet und die Standardabweichung gebildet. Alle Mittelwerte und Standard-abweichungen wurden durch den in der Reihe ersten basalen Mittelwert geteilt, der so auf eins normiert wurde.

Erwartungsgemäß sinkt bei Anwesenheit von Insulin die Induzierbarkeit

IL-6-responsiver Gene wie alpha-2-Makroglobulin (Abbildung 3.3.1).

Wortmannin als Inhibitor der PI3-Kinase 145-147 ist in der Lage, in Ab-

wesenheit von Insulin den IL-6-Effekt um etwa 80% zu verstärken. Bei

Stimulierung mit Insulin und Wortmannin stellt sich in Relation zu nur mit IL-

6-behandelten Zellen eine leichte Zunahme der Luziferase Aktivität ein.

59

Ähnliche Ergebnisse lieferte ein Versuch, in dem statt Wortmannin ein

anderer Inhibitor der PI3-Kinase, LY294002 148,149 zum Einsatz kam

(Abbildung 3.3.2).

0102030405060708090

FKHR

FKHR + In

sulin

FKHR + LY

FKHR + Insu

lin +

LY

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


Abbildung 3.3.2: Der PI3-Kinase-Inhibitor LY294002 ist in der Lage, den inhibi-torischen Effekt von Insulin auf die IL-6-Signaltransduktion zu unterdrücken.

HepG2-Zellen wurden wie in Abbildung 3.3.1 beschrieben transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R in FCS-freiem Medium inkubiert. Insulin lag in 1 µmolarer, LY294002 in 50 µmolarer Konzen-tration vor.

Eine Erklärungsmöglichkeit für die 80%-ige transkriptionelle Steigerung

unter alleiniger Wortmanningabe ist, dass auch in Abwesenheit von Insulin

ein Teil der endogenen PI3-Kinase aktiviert ist. Wird dies durch

Wortmannin verhindert, kommt es zu einem verstärkten Ansprechen IL-6-

responsiver Gene auf einen IL-6-Stimulus.

Um nun zu bestimmen, inwieweit diese Beobachtung auf die Phospho-

rylierung und damit Inaktivierung von FKHR zurückzuführen ist, wurden

weitere Versuche unternommen. Dabei wurden zuerst FCS-Konzen-

trationen bestimmt, bei denen es zu einer deutlichen Abnahme der

Signaltransduktion kam.

60

0123456789

Luzi

fera

se A

ktiv

ität

FKHR + + + + + +

FCS [%] 10 7,5 5 2,5 1,25 0

Abbildung 3.3.3: Bei Transfektion von FKHR konnte die IL-6-Signaltransduktion mit steigender FCS-Konzentration stark inhibiert werden. Die Induzierbarkeit ist in FCS-freiem um etwa den Faktor drei größer als in 10%-FCS-haltigem Medium.

HepG2-Zellen wurden wie in Abbildung 3.3.1 beschrieben transfiziert und FCS dem Medium in angegebener Konzentration zugesetzt. Stimuliert wurde mit 160 Einheiten IL-6 und 1µg löslichem IL-6 Rezeptor pro ml. Die einzelnen Messwerte wurden durch den in 10%-FCS-haltigen Kulturmedium gewonnenen geteilt und dieser so auf eins normiert.

Dabei zeigte sich, dass in FCS-freiem Medium die Induzierbarkeit um etwa

den Faktor drei höher ist als bei Verwendung einer Lösung von zehn-

prozentigem FCS (Abbildung 3.3.3).

Wenn nun die Inkubation in zehn-Prozent-FCS-haltigem Kulturmedium nur

ein Drittel der STAT3-vermittelten Signaltransduktion in Relation zu Kultur-

medium ohne FCS zulässt, stellt sich die Frage, ob die Phosphorylierung

und damit Inaktivierung von FKHR dafür verantwortlich ist.

Um dies herauszufinden, wurden nicht phosphorylierungsfähige FKHR-

Mutanten verwendet und mit dem Wildtyp verglichen. Aufgrund der Be-

funde aus Abbildung 3.3.3 wurde der Versuch in zehn-prozentigem FCS

durchgeführt.

61

Bei den FKHR-Mutanten sind die phosphorylierbaren Reste gegen nicht

phosphorylierbare Alanine (A) ausgetauscht:

Threonin 32 (1A-Mutante),

Threonin 32 und Serin 256 (2A-Mutante),

Threonin 32, Serin 256 und Serin 315 (3A-Mutante).

In Gegenwart von Wachstumsfaktoren oder FCS kann FKHR deshalb nicht

durch PKB/Akt phosphoryliert, damit inaktiviert und seine Verteilung zu

Gunsten des Zytoplasmas verschoben werden 150. Für spätere Versuche

(Kapitel 3.5) waren die Mutanten in Expressionskonstrukte kloniert worden,

die ein Fusions-Protein aus GFP (green fluorescent protein) und Mutante

kodieren. Um die Ergebnisse vergleichen zu können wurde der ent-

sprechende Leer- (Leer GFP) und Wildtyp-Vektor (FKHR wt GFP) verwen-

det.

0,0

1,0

2,03,0

4,0

5,0

Leer G

FP

FKHR wt G

FP

FKHR 1A G

FP

FKHR 2A G

FP

FKHR 3A G

FP

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


Abbildung 3.3.4: Nicht phosphorylierungsfähige FKHR-Mutanten bewirken in 10%-FCS-haltigem Kulturmedium eine Zunahme der Luziferase Aktivität im Vergleich zum Wildtyp.

HepG2-Zellen wurden wie in Abbildung 3.3.1 beschrieben transfiziert und mit IL-6 und sIL-6R in 10%-FCS-haltigem Medium inkubiert.

Dabei war zu erkennen, dass die Transaktivierung am Promotor beim

Wildtyp nur etwa 50% im Vergleich zu den Mutanten betrug. Schon die

Mutation des Threonin 32 (1A-Mutante) bewirkt eine Steigerung der

Luziferasemenge um fast 100%. Wenn auch die anderen Reste aus-

getauscht werden, steigt vor allem die unstimulierte transkriptionelle

Aktivität des Reportergenkonstrukts (Abbildung 3.3.4).

62

So konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von FKHR für die

IL-6-Signaltransduktion eine wichtige Rolle spielt. Die in Abbildung 3.3.1 bis

3.3.3 dargestellte Abnahme des IL-6-induzierten Signals in Anwesenheit

von FCS oder Insulin könnte auf eine Phosphorylierung und damit Inakti-

vierung von FKHR zurückzuführen sein.

3.4 Die subzelluläre Lokalisation von FKHR

und STAT3 in Abhängigkeit

verschiedener Stimuli

Um nachvollziehen zu können, wie die Transkriptionsfaktoren STAT3 und

FKHR in Abhängigkeit verschiedener Stimuli innerhalb der Zelle verteilt

sind, wurden Immunfluoreszenzstudien durchgeführt. Dabei wird ein gegen

das anzufärbende Protein gerichteter Antikörper mit permeabilisierten und

fixierten Zellen inkubiert. Ein zweiter Antikörper richtet sich gegen den

ersten und trägt einen Farbstoff, welcher bei Anregung durch eine definierte

Wellenlänge ein spezifisches Lichtspektrum emittiert. Dieses wird registriert

und ermöglicht so, die zelluläre Lokalisation des Proteins zu bestimmen.

Durch unterschiedliche Absorptions- und Emissionsmaxima der ver-

schiedenen Fluoreszenzstoffe können mehrere Proteine gleichzeitig

angefärbt und detektiert werden.

In diesem Versuch kamen Antikörper gegen STAT3 und FKHR zum

Einsatz. Es sollte die subzelluläre Lokalisation beider Proteine nach

verschiedenen Stimuli untersucht werden. In diesen Versuchen wurden

ausschließlich native, nicht transfizierte Zellen verwendet, um Artefakte zu

minimieren.

Bei den hier gezeigten Färbungen wird FKHR in roter und STAT3 in grüner

Farbe wiedergegeben.

63

Abbildung 3.4.1: Subzelluläre Lokalisation von STAT3 und FKHR nach Stimulation mit verschiedenen Kombinationen von Insulin und IL-6.

HepG2-Zellen wurden auf Deckgläschen ausgesät und am folgenden Tag für 10 Minuten wie angegeben stimuliert. Das Medium zur Stimulation war DMEM-F12. Insulin lag in 1 µmolarer Konzentration vor, IL-6 in 160 Einheiten/ml. Danach wurden die Zellen, wie in Material und Methoden beschrieben, fixiert, permeabilisiert und mit Antikörpern inkubiert. In diesem Versuch wurde mit anti-STAT3 (610189, Transduction Laboratory) sowie anti-FKHR (H128, Santa Cruz) gearbeitet. Die mit fluoreszierenden Proteinen markierten Antikörper waren Schwein TRITC-anti-Kaninchen (R0156, Dako, Dänemark) und Ziege FITC-anti-Maus (F0479, Dako, Dänemark). Die mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentativ für mehrfache und unabhängig voneinander durchgeführte Versuchsreihen.

64

In unstimuliertem Zustand liegt STAT3 relativ diffus in der Zelle vor, jedoch

findet sich tendenziell eher eine Anhäufung im Zytoplasma. FKHR stellt

sich deutlich im Nukleus dar (Abbildung 3.4.1 a).

Bei einem Stimulus mit IL-6 transloziert STAT3 in den Zellkern, wo sich

auch FKHR befindet (Abbildung 3.4.1 b). Dabei weisen intranukleäre

Strukturen Helligkeitsmaxima-Übereinstimmungen für beide Proteine auf.

Werden die Zellen nur mit Insulin behandelt, so resultiert eine andere

intrazelluläre Verteilung der Proteine: Sowohl STAT3, als auch FKHR sind

im Zytoplasma und sind nicht mehr im Zellkern anzutreffen (Abbildung 3.4.1

c). Dabei liegt STAT3 längst nicht mehr so diffus wie in unstimulierten

Zellen (Abbildung 3.4.1 a), sondern deutlich abgegrenzt im Zytoplasma vor.

Bei Inkubation mit Insulin und IL-6 ist STAT3 im Nukleus lokalisiert. FKHR

weist eine diffuse, jedoch eher zytoplasmatische Lokalisation auf (Ab-

bildung 3.4.1 d).

Diese mikroskopischen Befunde zeigen also, dass nach IL-6-Stimualtion

eine deutliche Kolokalisation beider Transkriptionsfaktoren im Zellkern

nachzuweisen ist.

3.5 Herstellung und erste Charakterisierung

von HepG2-Transfektanten, die stabil

fluoreszierendes FKHR exprimieren

In den bisher im Rahmen dieser Dissertationsarbeit gezeigten Versuchen

wurde der verstärkende Effekt von FKHR auf den IL-6 / gp130 / Jak /

STAT3-Weg entdeckt. Um orientierend zu untersuchen, ob sich ebenfalls

synergistische oder gar antagonistische Effekte auf die FKHR-vermittelte

Proteinbiosynthese unter IL-6-Einfluss einstellen, wurden stabil transfizierte

HepG2-Zellen generiert. Dabei wurde ein Konstrukt verwendet, welches für

ein Fusionsprotein aus FKHR und einem fluoreszierenden Protein kodiert.

Dieses diente zum einen als Transfektionskontrolle, zum anderen sollten

spätere Versuche ermöglichen, die intrazelluläre Lokalisation und Be-

wegung in Reaktion auf verschiedene Stimuli in vivo zu untersuchen.

65

FKHR-GFP wurde von A.Barthel zur Verfügung gestellt. Um höhere

Leuchtintensitäten zu erreichen und später eventuell auch die FRET-

Technik verwenden zu können, wurde FKHR-YFP neu kloniert.

Um nachzuweisen, dass die Fusions-Proteine trotz des fluoreszierenden

Proteins (GFP, YFP) biologisch funktionell waren, wurden Luziferase-

Versuche unternommen, die dieses bestätigen konnten (Abbildung 3.5.1).

05

101520

2530

Leer

FKHR

FKHR-YFP

FKHR-GFP

Luzi

fera

se A

ktiv

ität


Abbildung 3.5.1: Die Fusionsproteine FKHR-YFP und FKHR-GFP können wie FKHR die IL-6-vermittelte Induktion eines Reportergens verstärken.

Die Transfektion und Stimulation der verwendeten HepG2-Zellen erfolgte wie in Abbildung 3.1.1 beschrieben in Abwesenheit von FCS. Es wurden 15 µg an FKHR- beziehungsweise Fusionsprotein-kodierendem Plasmid kotransfiziert.

Danach wurden HepG2-Zellen stabil mit FKHR-GFP beziehungsweise

einem Leervektor, der nur GFP kodiert, transfiziert, weiter in der Zellkultur

gehalten und die positiven Klone selektioniert. Dabei war deutlich zu

erkennen, dass die mit Leervektoren transfizierten Zelllinien wesentlich

schneller wuchsen als die Zellen, die das FKHR-GFP Konstrukt enthielten

(Daten nicht gezeigt). Morphologisch sahen die Leervektor tragenden

Zellen aus wie normale HepG2-Zellen. Die Klone, die das Fusionsprotein

enthielten, wiesen mikroskopisch deutliche Veränderungen auf. So konnte

eine Abrundung beobachtet werden, wie sie bei sich ablösenden, ster-

benden Hepatomzellen typisch ist (Daten nicht gezeigt).

66

Um diese Ergebnisse quantifizieren zu können, wurden XTT-Versuche

durchgeführt. Bei diesem Test wird das Tetrazoliumsalz XTT von lebenden

und wachstumsfähigen Zellen zu Formazan umgesetzt. Apoptotische oder

stoffwechselinaktive Zellen sind nicht in der Lage diese Reaktion zu

katalysieren.

FKHR-GFP Klon 1

FKHR-GFP Klon 2

Leervektor GFP

0

20

40

60

80

100

120

rela

tive

Stof

fwec

hsel

aktiv

ität

[%]

Abbildung 3.5.2: FKHR-GFP produzierende Zellenlinien, zeigen ein vermindertes Wachstum im Vergleich zu Zellen, die nur GFP bilden.

Je 20.000 stabil transfizierte HepG2-Zellen wurden pro Kammer in 96-Loch-Platten ausgesät und ohne Stimulation 48 Stunden inkubiert. Danach wurde ein XTT-Test wie in Material und Methoden beschrieben durchgeführt. Dieser gibt die relative Stoffwechselaktivität in Bezug auf Kontrollvektor-transfizierte Zellen wieder. Dazu wurden alle Messwerte und Standard-abweichungen durch den Mittelwert der Stoffwechselaktivität des Leervektorklons bei Inkubation ohne Stimulation geteilt.

Wie aus verschiedenen Veröffentlichungen bekannt ist, greift FKHR

hemmend in den Zellzyklus ein. Dafür verantwortlich ist unter anderem die

vermehrte Proteinbiosynthese von p27Kip und dem proapoptotischen

Protein Bim aus der Familie der Bcl2-Proteine 90-93. Des weiteren wird die

Transkription von Cyclinen des D-Typs durch FKHR unterdrückt 94.

Bei dem Versuch (Abbildung 3.5.2) zeigte sich, dass die mit FKHR-GFP

transfizierten Klone erwartungsgemäß weniger Stoffwechselaktivität

aufwiesen und schlechter wuchsen als mit Leervektor transfizierte Zellen.

Ihre Stoffwechselaktivität war in unstimuliertem Zustand um etwa 70%

vermindert.

67

Um orientierend einen möglichen Synergismus zwischen FKHR und STAT3

zu untersuchen, sollte STAT3 durch ein IL-6-Signal aktiviert werden. Falls

aktiviertes STAT3 FKHR in seinen zellzyklushemmenden Funktionen

unterstützt, sollte bei aktiviertem, intranukleär lokalisiertem STAT3 eine

stärkere Proliferationshemmung als in unstimulierten Zellen resultieren.

Dazu wurden die schon oben verwendeten Klone (Abbildung 3.5.2) mit

steigenden Mengen von IL-6 stimuliert.

0

20

40

60

80

100

120

ohne IL6 0,1 0,6 3,7 22

,213

3,3 800

Einheiten IL-6 pro ml

rela

tive

Stof

fwec

hsel

aktiv

ität [

%]

Leervektor GFPFKHR-GFP Klon 1FKHR-GFP Klon 2

Abbildung 3.5.3: Relative Stoffwechselaktivität der stabil transfizierten Klone bei unterschiedlichen IL-6-Konzentrationen.

Je 20.000 stabil transfizierte HepG2-Zellen wurden pro Kammer in 96-Loch-Platten ausgesät und mit steigenden Konzentrationen von IL-6 48 Stunden inkubiert. Danach wurde ein XTT-Test, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Dieser gibt die relative Stoffwechselaktivität in Bezug auf Kontrollvektor-transfizierte wieder. Dazu wurden alle Messwerte und Standardabweichungen durch den Mittelwert der Stoffwechselaktivität des Leervektorklons bei Inkubation ohne Stimulation geteilt.

Interessanterweise ließ sich erkennen, dass IL-6 das Wachstum der FKHR-

GFP exprimierenden Klone stimuliert. Bei IL-6-Stimulation von 800 Ein-

heiten pro ml war eine um lediglich etwa 20%, in IL-6-freiem-Medium eine

um 70% verminderte Stoffwechselaktivität im Vergleich zum Kontroll-Klon

zu verzeichnen (Abbildung 3.5.3). In der Zelllinie, die stabil mit dem Kon-

trollplasmid transfiziert war, hatte IL-6 keinen erkennbaren Effekt auf die

Stoffwechselaktivität.

68

Dieser Versuch konnte keinen bilateralen Synergismus zwischen STAT3

und FKHR nachweisen. So scheint aktiviertes STAT3 nicht in der Lage zu

sein, die FKHR-vermittelte Wachstumshemmung in HepG2-Zellen zu

unterstützen. Allerdings wirft dieses Experiment auch einige Fragen auf, die

in der Diskussion weiter thematisiert werden (siehe Kapitel 4.3).

69

4 Diskussion

4.1 Interaktion zwischen FKHR und STAT-

Faktoren

Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals nachgewiesen werden, dass

FKHR, ein Protein aus der Familie der foxo-Transkriptionsfaktoren, mit

STAT-Faktoren interagiert.

In Abbildung 3.2.2 ist der deutliche Synergismus zwischen FKHR und

STAT3 bezüglich der IL-6-Signaltransduktion dargestellt. Dabei bewirkt die

Koexpression von FKHR und STAT3 eine Transkriptions-Steigerung um

den Faktor 14 im Vergleich zu Zellen, die nur mit Leervektor transfiziert

worden waren. Gemessen wurde dies mit einem alpha-2-Makroglobulin-

Promotor-Luziferase-Konstrukt. Die alleinige Überexpression von STAT3

erhöhte die Luziferase Aktivität nur um den Faktor 3, die von FKHR um den

Faktor 5. FKHR und STAT3 interagieren bei ihrem Zusammenspiel physi-

kalisch miteinander, was mit Koimmunpräzipitationen nachgewiesen wurde

(Abbbildung 3.2.9).

Analog zu STAT3 zeigt Abbildung 3.2.6 die Interaktion mit STAT1, wohin-

gegen für STAT5 kein Effekt gemessen werden konnte (Abbildung 3.2.7).

Bei der TGFß-Signaltransduktion konnte durch Überexpression von FKHR

keine gesteigerte Smad7-Promotor-Aktivierung beobachtet werden (Ab-

bildung 3.2.5). Auch die gemessenen ß-Galaktosidasewerte waren bei

Versuchsreihen mit und ohne FKHR-Transfektion ähnlich, was eine gene-

relle Steigerung der Transkriptionsmaschinerie durch FKHR noch unwahr-

scheinlicher macht.

Dem beobachteten Zusammenspiel von FKHR und STAT3 beziehungs-

weise STAT1 liegt also ein spezifischer Mechanismus zu Grunde, welcher

nur für einige STAT-Familienmitglieder zu gelten scheint.

Dass foxo-Familienmitglieder mit anderen Transkriptionsfaktoren inter-

agieren und auch selbst in der Lage sind zu transaktivieren, konnte bereits

in verschiedenen Veröffentlichungen gezeigt werden 90,92,93,95,96,97,151.

70

In jüngster Zeit ließ sich außerdem eine Inhibition von hepatocyte nuclear

factor 4 (HNF-4), ein Mitglied der Steroid- und Thyroidrezeptoren, durch

aktives, also dephosphoryliertes FKHR nachweisen 152. Auch dieser

Interaktion liegt eine direkte Assoziation beider Proteine zugrunde.

Für verschiedene STAT-Faktoren wurde ebenfalls ein Zusammenspiel mit

anderen DNA-bindenden Proteinen beschrieben. So ist eine Kooperation

zwischen STAT1 und Sp1 bekannt 153. STAT5 soll mit dem Glucokortikoid-

rezeptor interagieren können 154. Für STAT3 wurde für eine Vielzahl von

Genen eine Assoziation mit dem Transkriptionsfaktor c-Jun beobachtet 2,35.

Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass für die Leberregeneration nach

Verletzung ein Komplex aus hepatocyte nuclear factor 1 (HNF-1), STAT3

und AP-1 (c-Fos/c-Jun) verantwortlich ist. Dabei verstärken die IL-6-

aktivierten STAT3-Faktoren die Transkription HNF-1-abhängiger Gene, wie

beispielsweise das insulin-like growth factor binding protein 1(IGFBP-1) 155.

4.2 Mögliche Mechanismen der Interaktion

Ursprünglich entdeckt wurde FKHR in dem alveolären Typ des Rhabdo-

myosarkoms. Dort liegt es als Fusionsprotein mit PAX3 vor 85.

Es konnte gezeigt werden, dass das C-terminale Ende des FKHR für die

stark gesteigerte transkriptionelle Aktivität der Chimäre verantwortlich

ist 156,157,158. Durch den Einsatz von Deletionsmutanten wurde bewiesen,

dass auch für den Synergismus mit STAT3 der C-terminale Anteil von

FKHR essentiell ist 138.

Wie die dargestellte Koimmunpräzipitation (Abbildung 3.2.9) belegt, liegt

eine Assoziation der Proteine STAT3 und FKHR vor. Der Nachweis, ob

beide Transkriptionsfaktoren direkt oder unter Vermittlung weiterer Proteine

miteinander assoziiert sind, steht noch aus.

Über den genauen Mechanismus, wie FKHR die IL-6-abhängige, STAT3

vermittelte transkriptionelle Steigerung bewirkt, lässt sich zur Zeit noch

keine Aussage treffen. Es sind verschiedene Möglichkeiten zu diskutieren.

71

4.2.1 FKHR könnte die Kernlokalisation der

STAT-Faktoren begünstigen

Eine Möglichkeit, wie FKHR die STAT3-vermittelte, IL-6-induzierte

Transkription responsiver Gene steigern könnte, wäre eine Förderung der

Kernlokalisation von STAT3. Um dies zu erreichen, existieren zwei Mög-

lichkeiten. Es könnte einerseits der nukleäre Export gehemmt werden,

indem beispielsweise das STAT3-Dimer durch anwesendes FKHR ver-

mehrt intranukleär lokalisiert bleibt. Andererseits könnte FKHR zytoplas-

matisch mit STAT3 assoziieren und auf dem Weg in den Zellkern, bei-

spielsweise durch Interaktion mit Transportproteinen, unterstützend wirken

und so den Import fördern.

Vermehrt intranukleär lokalisierte STAT-Faktoren wären so in der Lage zu

transaktivieren und den beobachteten Luziferaseanstieg zu bewirken.

Abbildung 3.4.1 gibt Aufschluss über die Lokalisationen der beiden Prote-

ine in Abhängigkeit verschiedener Stimuli.

In unstimuliertem Zustand liegt STAT3 relativ diffus in der Zelle vor, jedoch

findet sich tendenziell eher eine Anhäufung im Zytoplasma. FKHR stellt

sich deutlich im Zellkern dar (Abbildung 3.4.1 a). In den Luziferasepro-

motorstudien zeigte sich bei unstimulierten, mit FKHR transfizierten Zellen

eine Zunahme der basalen Luziferasemenge (Abbildung 3.2.1 und 3.2.2).

Auch bei der Koimmunpräzipitation waren beide Proteine in unstimuliertem

Zustand bereits assoziiert. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass das

nukleär lokalisiertes FKHR in der Lage ist, STAT3 dort zu stabilisieren und

vor dem Export zu bewahren.

Bei einem Stimulus mit IL-6 transloziert der größte Teil des STAT3 in den

Nukleus, wo es sich zusammen mit FKHR darstellen lässt (Abbildung 3.4.1

b). Dabei weisen intranukleäre Strukturen Helligkeitsmaxima-Überein-

stimmungen für beide Proteine auf. In den Reportergenversuchen ließ sich

bei Anwesenheit von FKHR eine deutliche Transkriptions-Steigerung

beobachten (Abbildungen 3.2.1 und 3.2.2). Auch in der Koimmun-

präzipitation waren nach IL-6-Stimulation die präzipitierten Proteinmengen

erheblich größer, wie der Western Blot nachweisen konnte (nicht gezeigt).

72

Zusammengenommen wäre eine Interpretationsmöglichkeit eine vermehrte

intranukleäre Assoziation der beiden Transkriptionsfaktoren nach IL-6-

Stimulation.

Werden die Zellen nur mit Insulin behandelt, so findet sich eine andere

intrazelluläre Verteilung der Proteine: Sowohl STAT3 als auch FKHR

befinden sich im Zytoplasma und sind nicht mehr im Zellkern anzutreffen

(Abbildung 3.4.1 c). Dabei stellt sich STAT3 längst nicht mehr so diffus wie

in unstimulierten Zellen (Abbildung 3.4.1 a), sondern deutlich im Zyto-

plasma dar. In den Luziferaseversuchen resultiert nach Insulinstimulation

eine Abnahme der transkriptionellen Aktivität am alpha-2-Makroglobulin-

Promotor um etwa 25% bei Abwesenheit von IL-6 (Abbildung 3.1.2 und

3.1.3). Als Erklärungsmodell könnte dienen, dass FKHR nicht mehr intra-

nukleär lokalisiert ist und dadurch auch nicht mehr die Lokalisation von

STAT3 im Zellkern unterstützen kann.

Bei Inkubation mit Insulin und IL-6 resultiert für STAT3 eine intranukleäre

Lokalisation. FKHR weist eine diffuse, jedoch eher zytoplasmatische

Lokalisation auf (Abbildung 3.4.1 d). In den Luziferaseversuchen zeigte sich

eine deutliche Verringerung der Luziferase Aktivität im Vergleich zu nur

IL-6-behandelten Zellen (Abbildung 3.1.3). In Analogie zu den schon

erwähnten Erklärungsansätzen lassen auch diese Ergebnisse auf eine, für

die transkriptionelle Aktivität essentielle intranukleäre Interaktion schließen.

Ob beide Proteine schon vor der Stimulation zytoplasmatisch assoziiert

sind, kann nicht eindeutig beurteilt werden. Im Vergleich IL-6-stimulierter

Zellen mit und ohne Insulin kommt es durch Inkubation mit Insulin zum

nukleären Export von einem großen Teil des FKHR, und die Assoziation mit

STAT3 scheint weitgehend verloren zu gehen. Die mikroskopischen

Befunde zeigen weiterhin, dass nach IL-6-Stimualtion in Abwesenheit von

Insulin eine deutliche Kolokalisation beider Transkriptionsfaktoren im

Zellkern nachzuweisen ist.

Eine klare Aussage lassen diese Ergebnisse nicht zu. Allerdings scheint in

Abwesenheit von IL-6 durch einen Insulinstimulus sowohl FKHR als auch

STAT3 vermehrt im Zytoplasma lokalisiert zu sein. Dies spricht für die

73

These, dass FKHR die Kernlokalisation von STAT3 fördert, da andernfalls

FKHR im Zytoplasma und STAT3 - wie bei unstimulierten Zellen - weiterhin

diffus in der Zelle vorliegen würde.

4.2.2 FKHR könnte als Vermittler zwischen

STAT3 und weiteren Transkriptionsfaktoren

fungieren

Dass FKHR unabhängig von STAT3 eine vermehrte Transkription IL-6-

responsiver Gene bewirken kann, konnte ausgeschlossen werden, da

dominant negative STAT3-Faktoren dann die IL-6-Signaltransduktion nicht

nahezu vollständig unterdrücken könnten (Abbildung 3.2.4). Außerdem hat

FKHR auch einen verstärkenden Effekt auf die Transkription von Genen

unter Kontrolle des SIE-Promotors (Abbildung 3.2.3). Dort finden sich aber

keine potentiellen FKHR-Bindungsstellen, was eine STAT3-abhängige

Promotorbindung wahrscheinlich macht.

Des Weiteren handelt es sich nicht um eine unselektive Steigerung der

Aktivität der Transkriptionsmaschinerie, da dann auch andere Proteine

vermehrt gebildet würden. Für die Smad7- und ß-Caseinpromotoren wurde

gezeigt, dass FKHR keine Luziferase Aktivitätserhöhung bewirkt (Ab-

bildungen 3.2.5 und 3.2.7).

Als offene Frage bleibt jedoch, ob FKHR eventuell nur als Vermittler

zwischen den STAT-Faktoren einerseits und weiteren Transkriptions-

koaktivatoren andererseits fungiert.

Sowohl für DAF16, dem Orthologen aus Caenorhabditis elegans 97, als

auch für STAT3 und STAT1 159 wurde beschrieben, dass sie in der Lage

sind, p300/CREP-binding-protein (CBP) an Promotorbereiche zu rekru-

tieren.

Dabei wäre es möglich, dass auch FKHR weitere Transkriptionskoaktiva-

toren verstärkt zum STAT3 bringt oder einmal gebundene stabilisiert. In der

Vergangenheit wurde beispielsweise eine Assoziation von STAT3 und c-

Jun beschrieben 160.

74

4.2.3 FKHR könnte die Aktivierung von STAT-

Faktoren verstärken oder deren

Inaktivierung hemmen

Eine Hemmung von Inhibitoren der STAT3-Signaltransduktion, wie PIAS3

oder SOCS3, wäre ein denkbarer Mechanismus, wie FKHR die IL-6-

Signaltransduktion positiv beeinflussen könnte. Es wäre möglich, dass

FKHR am STAT3 Bindungsstellen für inhibitorische Proteine kompetitiv

blockiert und so in der Lage ist, die STAT-Aktivierung zu verlängern.

Wie in Abbildung 3.2.8 zu erkennen ist, stellt sich bei einer Koexpression

von PIAS3 und FKHR eine Steigerung der Transkriptions-Aktivität ein.

Diese ist umso größer je mehr FKHR kotransfiziert wird.

Nicht auszuschließen ist auch, dass FKHR auf andere inhibitorische

Proteine wie SHP2 oder SOCS3 hemmend wirkt. Ebenso ist denkbar, dass

es durch FKHR zu einer verstärkten Aktivierung von STAT3 kommt. So

könnte FKHR beispielsweise STAT3 vermehrt zum Rezeptor oder den

Januskinasen rekrutieren und so die Phosphorylierung und Dimerisierung

der STAT-Faktoren fördern.

4.2.4 FKHR könnte das STAT3-Dimer

stabilisieren

Eine weitere Möglichkeit, wie FKHR das IL-6-Signal positiv beeinflussen

könnte, wäre eine Stabilisierung der aktivierten STAT-Dimere. So könnten

die STAT3- und STAT1-Faktoren als Homo- oder Heterodimer zusammen-

gehalten werden. Durch eine Oligomerisierung mit FKHR und eventuell

weiteren Proteinen könnten Bindungsstellen für inhibitorische Proteine

besetzt / maskiert werden.

75

4.3 Das IL-6-Signal scheint die hemmende

Wirkung von FKHR auf die

Stoffwechselaktivität zu unterdrücken

Merkwürdigerweise fand sich in der Immunfluoreszenz bei Stimulation mit

Insulin und IL-6 für FKHR eine diffuse Verteilung im Zytoplasma und im

Zellkern, wohingegen die alleinige Gabe von Insulin zu einer klar zyto-

plasmatischen Lokalisation von FKHR führte (Abbildung 3.4.1).

Eine mögliche Begründung hierfür könnte sein, dass nicht nur FKHR die

STAT3-Dimere stabilisiert, sondern dass durch Interaktion von STAT3 und

FKHR auch FKHR vermehrt nukleär lokalisiert bleibt. Durch eine Hetero-

Oligomerisierung von FKHR und STAT-Faktoren könnten Phosphory-

lierungsstellen von FKHR maskiert werden und das Protein so vor dem

nukleären Export bewahrt werden. In diesem Fall sollte eine verstärkte

Transkription FKHR-abhängiger Gene resultieren. Wie schon in der Ein-

leitung erwähnt, wird FKHR für die vermehrte Bildung einer Vielzahl

proapoptotischer / proliferationshemmender Proteine verantwortlich ge-

macht. So konnte nach Überexpression der foxo-Familienmitglieder AFX,

FKHR und FKHRL1 eine Wachstumsinhibition von Hepatozyten durch

erhöhte p27Kip-Konzentrationen nachgewiesen werden 90-92. Als weiteres,

den Zellzyklus unterdrückendes Protein, ließ sich das proapoptotisch

wirkende Bim aus der Familie der Bcl2-Proteine bei Anwesenheit von

FKHRL1 verstärkt exprimieren 93. Die Transkription von Cyclinen des D-

Typs wird durch FKHR unterdrückt 94.

Zellen, die intranukleär erhöhte FKHR-Konzentrationen aufweisen, sollten

deshalb eine geringere Stoffwechselaktivität besitzen als Zellen, in denen

das FKHR zytoplasmatisch lokalisiert ist.

Für IL-6 werden in der Literatur unterschiedliche Funktionen auf die Proli-

feration verschiedener Zelltypen beschrieben. So konnte einerseits gezeigt

werden, dass IL-6 proliferative und antiapoptotische Signale sowohl in

Zelllinien des multiplen Myeloms, wie auch in Hep3B-Hepatomzellen

vermittelt 18,161,162. Ein in jüngster Zeit erschienener Artikel macht dafür die

Phosphorylierung und Inaktivierung von FKHR verantwortlich 163.

76

Andererseits wurde für maligne Melanomzellen eine IL-6-vermittelte

Wachstumsinhibition nachgewiesen 14,164,165.

Im XTT-Test (Abbildung 3.5.3) konnte bei IL-6-Gabe jedoch keine vermin-

derte Proliferation des HepG2-Kontroll-Klons beobachtet werden. Die

Zellen, die fluoreszierendes FKHR exprimieren, wuchsen in Anwesenheit

von IL-6 sogar besser.

Zumindest für die antiproliferativen Eigenschaften von FKHR ließ sich so

kein Synergismus von FKHR und Proteinen des IL-6-induzierten Jak /

STAT-Weges nachweisen. Würde STAT3 das foxo-Familienmitglied

unterstützen, so sollte insbesondere bei hohen Konzentrationen von IL-6

eine stärkere Wachstumsinhibition resultieren.

Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis liefert die in der Einleitung

beschriebene Aktivierung der PI3-Kinase über den SHP2 / Ras / Raf-Weg

(siehe Kapitel 1-3). Nach diesem Modell würde ein IL-6-Stimulus neben der

STAT3-Rekrutierung zu einer Aktivierung der PI3-Kinase führen. Diese

könnte dann über Zwischenschritte Akt aktivieren, welches wiederum in der

Lage wäre, FKHR zu phosphorylieren und damit zu inaktivieren. So könnte

ein IL-6-Stimulus zu einem nukleären Export und zur Hemmung der

Wirkung von FKHR führen 150,166. Dieser Mechanismus wird auch in der

Literatur für den antiapoptotischen Effekt des IL-6 in Zelllinien des multiplen

Myeloms und Hep3B Hepatomzellen angeführt 18,161,162 (s.o.).

Für die in den durchgeführten Versuchen verwendeten HepG2-Zellen ließ

sich diese These jedoch nicht bestätigen. So konnte nach IL-6-Inkubation

weder eine verstärkte Phosphorylierung von PKB/Akt im Western Blot

(nicht gezeigt), noch eine zytoplasmatische Häufung von FKHR in der

Immunfluoreszenz nachgewiesen werden (Abbildung 3.4.1 b). Auch in der

Literatur ist dieser Weg bisher nicht für HepG2-Zellen beschrieben worden.

Demnach muss für die stoffwechselfördernde Wirkung des IL-6 ein anderer

Mechanismus verantwortlich sein, den es weiterhin zu identifizieren gilt.

Denkbar wäre eine Hemmung der Apoptose oder auch eine Förderung der

Proliferation.

77

In HepG2-Zellen wurde gezeigt, dass OnkostatinM und IL-6 eine Zell-

zyklushemmung durch erhöhte p27kip Konzentrationen bewirken 167, was

einen Widerspruch zu den Beobachtungen darstellt (Abbildung 3.5.3). Auf

die Proliferation und Stoffwechselaktivität des nur GFP exprimierenden

Klons schien IL-6 keinen Einfluß zu haben.

In den Immunfluoreszenzstudien (Abbildung 3.4.1) konnte auf einen reinen

IL-6-Stimulus keine deutliche Verhältnisverschiebung des FKHRs vom

Zellkern zu Gunsten des Zytoplasmas beobachtet werden. Ob der hohe

endogene STAT3-Gehalt der HepG2-Zellen und das Postulat, dass akti-

viertes STAT3 eventuell FKHR im Kern halten kann, eine Erklärung bieten,

bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen.

78

79

5 Ausblick Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit konnte erstmals gezeigt werden,

dass die Transkriptionsfaktoren STAT3 und FKHR miteinander inter-

agieren. Den Beweis hierfür brachten Ergebnisse aus Luziferaseversuchen

und Koimmunpräzipitationen. Wie der genaue Mechanismus der Wechsel-

wirkung ist, bleibt jedoch weiterhin ungeklärt.

In Kapitel 4 wurden bereits mehrere Möglichkeiten diskutiert wie FKHR das

STAT3-Signal verstärken könnte. Allerdings haben die aufgezeigten

Ansätze zum heutigen Zeitpunkt rein spekulativen Charakter. Um den

genannten Postulaten nachzugehen und sie zu beweisen oder zu wider-

legen, bedarf es weiterer Experimente.

Im folgenden möchte ich einen Ausblick geben, wie diese Versuche

aussehen könnten und kurz umreißen, auf welche Fragen man sich

Antworten erhoffen kann.

5.1 Generierung FKHR-defizienter Zellen

Experimente mit FKHR-defizienten Zellen sind von großem Interesse, da

mit Hilfe solcher Zelllinien der Einfluss von FKHR auf die IL-6-Signaltrans-

duktion überprüft werden könnte. Da die, in den beschriebenen Versuchen

verwendeten HepG2-Zellen endogenes FKHR enthalten, lässt sich keine

Aussage treffen, ob der foxo-Transkriptionsfaktor FKHR essentiell für die

Induktion STAT3-abhängiger Gene ist. Um die Bedingungen möglichst

konstant zu halten, wäre es optimal, HepG2-Zellen so zu verändern, dass

das vorhandene FKHR nur noch in minimaler Konzentration vorliegt. Um

dieses Ziel zu erreichen, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Einerseits

kann man anti-sense-DNA-Konstrukte verwenden. Die nach Transfektion

daraus gebildete anti-sense-mRNA hybridisiert mit der endogenen FKHR-

mRNA und blockiert die Translation. Andererseits und als neuere Methode

kommt auch eine siRNA Transfektion in Frage. Hier kommt es zur Zer-

störung der FKHR-mRNA.

80

Wenn die Interaktionsbereiche von FKHR und STAT3 besser verstanden

sind, lassen sich dominant negative Transkriptionsfaktoren herstellen. Mit

diesen könnten durch kompetetive Hemmung die Auswirkungen des einen

Partners auf die Signaltransduktion des Anderen weiter untersucht werden.

Auch Studien mit Zellen von FKHR knock-out-Tieren könnten interessante

Resultate liefern. Tiere genetisch so zu manipulierten wäre jedoch mit sehr

hohem Aufwand verbunden.

5.2 Identifizierung der interagierenden

Bereiche

Da für FKHR und STAT3 eine physikalische Assoziation nachgewiesen

werden konnte, wäre es nötig zu analysieren, welche Regionen und

Aminosäure-Reste für die Interaktion verantwortlich sind. Die Lösung der

Tertiärstruktur des Komplexes würde natürlich das beste Verständnis der

Wechselwirkung erlauben. Da dies ein nur mit sehr großem Aufwand zu

erreichendes Ziel ist, könnten zunächst die Aminosäure-Reste identifiziert

werden, welche die Interaktion vermitteln. Durch gezielte Punktmutationen

ließen sich die dabei wichtigen Bereiche ermitteln. In Abschnitt 4.1 der

Diskussion wurde bereits vorgeschlagen, dass die Interaktion am C-

Terminus des FKHR stattfindet.

Auch durch den Einsatz von Chimären ließen sich verantwortliche Bereiche

eingrenzen. Als Beispiel sind Konstrukte zu nennen, die für definierte

Domänen von STAT3 und STAT5 kodieren.

Wenn die Aminosäure-Reste identifiziert sind und Mutanten vorliegen,

welche nicht mehr in der Lage sind zu assoziieren wäre dies ein wichtiger

Schritt zum Verständnis des Interaktions-Mechnismus.

81

5.3 Auswirkungen auf die Interaktion mit

weiteren Proteinen

Auch weitere Koimmunpräzipitationen könnten Aufschluss über einige

interessante Fragestellungen geben. Sowohl für STAT-Faktoren 153,160,168,

als auch für FKHR 90,92,93,95-97,151 konnten Interaktionen mit verschiedenen

Transkriptionskoaktivatoren nachgewiesen werden. Mit solchen Versuchen

ließe sich der gegenseitige Einfluss auf die Bindung dieser Faktoren

studieren. So ist fraglich, in welchem Maße die einzelnen Proteine mitein-

ander assoziieren und sich dabei gegenseitig behindern oder gar ver-

stärken und zu einer Bindung anderer Proteine beitragen können.

Ebenfalls ist von Interesse, ob FKHR schon bei der Rezeptoraktivierung

eine Rolle spielt. Um dies herauszufinden könnte man Koimmunprä-

zipitationen mit Jaks durchführen.

Auch die Frage ob FKHR die STAT-Dimere stabilisiert und vor negativ

wirkenden Regulatoren wie PIAS3 oder SOCS3 schützt, bleibt zu beant-

worten. Versuche bezüglich der Kinetik können hierfür Anhaltspunkte

liefern. Mit solchen Experimenten lässt sich klären, ob bei Anwesenheit von

FKHR die STAT-Faktoren länger aktiv bleiben oder ein höheres Akivitäts-

Maximum erreichen.

5.4 in-vivo-Versuchsansätze

Im Laufe dieser Arbeit wurden bereits stabil transfizierte Zellen generiert,

die ein Fusionsprotein aus FKHR und einem fluoreszierenden Protein

exprimieren. Mit Hilfe dieser Zelllinien lassen sich Studien mit lebenden

Zellen durchführen. Dabei könnte mit Hilfe der konfokalen laser-scanning

Mikroskopie untersucht werden, wie FKHR in nativen Zellen auf ver-

schiedene Stimuli reagiert. Insbesondere wäre dabei auch die zeitliche

Komponente von Interesse.

82

Da auch STAT3 in der Arbeitsgruppe als fluoreszierendes Protein vorliegt,

könnte man zum einen eventuell über die FRET-Technik die Interaktion mit

FKHR weiter spezifizieren, veranschaulichen und verifizieren. Zum anderen

lässt dies ein Verfahren zu, Punktmutanten auf Funktionalität zu überprüfen

und so die interagierenden Bereiche zu identifizieren.

Durch die Generierung von mit beiden Konstrukten stabil transfizierten

Zellen könnten weitere Experimente unbeantwortete Fragen klären. Da

STAT3 und FKHR aber mit dem fluoreszierenden Protein gekoppelt sind

und durch Transfektion auch eine Überexpression vorliegt, handelt es sich

um ein artifizielles System.

Trotzdem lassen Studien mit solchen lebenden Zellen eindeutigerere

Ergebnisse als Versuche mit fixierten Zellen erhoffen. Insbesonders

bezüglich der zeitlichen Lokalisation von Proteinen in Abhängigkeit von

verschiedenen Stimulanzien bieten solche Zelllinien Vorteile. Eine Voraus-

setzung dafür ist, dass beide Proteine funktionell sind, was in Vorversuchen

gezeigt werden muss. Für die Steigerung der Reportergenaktivität unter

Kontrolle des alpha-2-Makroglobulin-Promotors ist dieses für die FKHR-

Expressionskonstrukte bereits geschehen (Abbildung 3.5.1). Im Falle des

STAT3 konnten Ulrike Sommer und Serge Haan eine Funktionalität des

fluoreszierenden Fusionsproteins ebenfalls nachweisen.

5.5 Studien zur DNA-Bindung von FKHR

Ob FKHR an die DNA binden muss, um die transkriptionelle Steigerung zu

bewirken, ist noch nicht hinreichend geklärt und bedarf weiterer Studien.

Hierzu bieten sich Versuche mit mutieren Promotoren von Reportergen-

Expressionsvektoren an.

83

5.6 Untersuchungen mit FKHR responsiven

Promotoren

Wie in Kapitel 3.5 gezeigt, wuchsen stabil mit FKHR transfizierte HepG2-

Zellen erwartungsgemäß schlechter als die Kontrollen. Unter IL-6-Stimu-

lation war jedoch eine höhere Proliferation nachweisbar als bei unstimu-

lierten. Ob durch das IL-6-Signal oder durch aktivierte STAT-Faktoren

eventuell eine Inhibierung von FKHR erfolgt bleibt zu beweisen.

Dafür wären Versuche mit FKHR-abhängigen Promotoren viel ver-

sprechend. Mit Hilfe solcher Studien ließe sich zeigen, ob es zu einer

bilateralen transkriptionellen Steigerung responsiver Gene kommt oder ob

der IL-6-Signaltransduktionsweg FKHR bei der Ausübung seiner bio-

logischen Funktion hemmt. Für FKHR konnte eine verstärkte Transkription

STAT3-induzierbarer Gene nachgewiesen werden. Ob STAT3 in der Lage

ist, die FKHR-abhängige Proteinbiosynthese zu unterstützen oder sie eher

unterdrückt, bleibt bis zur Durchführung dieser Experimente unklar.

So bleiben viele interessante Versuche durchzuführen, die Antworten auf

die verschiedenen Fragen geben können.

84

85

6 Zusammenfassung Die Tatsache, dass Wachstumsfaktoren in der Lage sind, Hepatozyten zur

Proliferation anzuregen, es jedoch gleichzeitig zu einer verminderten

Synthese von Akut-Phase-Proteinen kommt, wurde in verschiedenen

Veröffentlichungen beschrieben 127-129. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit

wird eine mögliche Begründung für diese Beobachtungen aufgezeigt.

Ein wichtiger Signaltransduktionsweg von Wachstumsfaktoren verläuft über

eine Aktivierung der PI3-Kinase und der ProteinkinaseB. Das IL-6-Signal

wird in erster Linie über Januskinasen und STAT-Faktoren innerhalb der

Zelle weitergeleitet.

In dieser Arbeit wurde erstmals der Transkriptionsfaktor FKHR als ein

Bindeglied zwischen dem PI3-Kinase/PKB-Signalweg und der IL-6/gp130/

Jak/STAT-Kaskade identifiziert.

Es konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsfaktoren STAT3 und

FKHR synergistisch zusammen wirken und dass FKHR in der Lage ist, die

STAT3 vermittelte, IL-6-induzierte Transkription responsiver Gene signi-

fikant zu steigern. Eine STAT3-unabhängige Geninduktion am alpha-2-

Makroglobulin-Promotor durch FKHR wurde ausgeschlossen. Es konnte

eine physikalische Interaktion von FKHR und STAT3 nachgewiesen

werden. In Immunfluoreszenzstudien ließ sich insbesondere nach einem

IL-6-Stimulus eine deutliche Kolokalisation beider Proteine im Zellkern

erkennen. Die Wechselwirkung zwischen dem foxo-Transkriptionsfaktor

FKHR und bestimmten Faktoren der STAT Familie ist spezifisch. Neben

STAT3 wurde auch für STAT1, nicht jedoch für STAT5 oder Smad7 ein

synergistischer Effekt beobachtet.

Wachstumsfaktoren aktivieren über die PI3-Kinase die ProteinkinaseB,

welche durch Serin/Threonin Phosphorylierung den nukleären Export von

FKHR einleitet. Es ist gezeigt worden, dass die Stimulation von HepG2-

Zellen mit Insulin oder FCS in einer Abnahme der Akut-Phase-Protein-

Synthese und Sekretion resultiert. Dem Rückschluss Rechnung tragend

bewirkt die Hemmung der PI3-Kinase ebenso wie nicht phospho-

rylierungsfähige Mutanten von FKHR trotz FCS- oder Insulin-haltiger

Medien starke transkriptionelle Induktionen von Akut-Phase-Proteinen.

86

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103

8 Anhang

Danksagung

Bei Herrn Prof. Dr. P. C. Heinrich bedanke ich mich für die freundliche

Aufnahme in seinen Arbeitskreis, sein Interesse am Fortgang dieser Arbeit

und besonders die Zeit, die er sich für persönliche Gespräche und Pro-

bleme nahm.

Ganz besonders danke ich Frau Priv. Doz I. Behrmann, für die hervor-

ragende Betreuung, die guten Ideen, die vielen Diskussionen und die

freundliche Atmosphäre. Ein weiterer großer Verdienst von ihr liegt in der

Durchsicht und Korrektur des Manuskriptes mit vielen hilfreichen Anre-

gungen.

Marlies Kauffmann, Marcin Kortylewski und Andreas Barthel danke ich für

die fachliche Unterstützung.

Jens Greiser danke ich für die vielen Gespräche und die entgegen-

gebrachte Empathie.

Mein außerordentlicher Dank gilt vor allem den Menschen, die mich im

Laufe der Arbeit unterstützt haben und es mir erst ermöglichten, diese

Dissertation anzunehmen. Dabei sind insbesondere meine Eltern und Frau

Jenny Baschke zu nennen.

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Curriculum vitae Name : Florian Feld Geburtsdatum : 31. August 1976 Geburtsort : Wuppertal Wohnort : Roermonder Str. 112 52072 Aachen Telefon : 0241 - 9967537 Eltern : Dr. rer. nat. Hans Feld, Studiendirektor am Städt. Gymnasium Gevelsberg i.R. Ehefrau Inge Feld, geborene Drünkler, Oberstudienrätin am Städt. Gymnasium Ennepetal i.R. Staatsangehörigkeit : deutsch Ausbildung : 8 / 1982 bis 6 / 1986 Städt. Gemeinschaftsgrundschule "Am Strückerberg" 8 / 1986 bis 6 / 1995 Städt. Gymnasium Gevelsberg mit Erlangen der allgemeinen Hochschulreife 8 / 1995 bis 10 / 1996 Zivildienst 10 / 1996 bis 3 / 2000 Sudium der Medizin an der RWTH – Aachen Physikum September 1998 mit der Note befriedigend (2,66) Erstes Staatsexamen April 2000 mit der Note gut (2,0) 4 / 2000 bis 4 / 2001 molekularbiologische Promotionsarbeit am Institut für Biochemie 4 / 2001 bis 11 / 2004 Sudium der Medizin an der RWTH – Aachen Zweites Staatsexamen September 2002 mit der Note gut (1,66) Drittes Staatsexamen am 21. November 2003 mit der Note sehr gut und Abschluss des Studiums mit der Note sehr gut (1,49)

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Der Transkriptionsfaktor FKHR interagiert mit STAT