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Ortrud WernerBFAV Insel Riems

Der Weg zur DiagnoseGeflügelpest am Beispiel des

Seuchenausbruchs 2003in Deutschland

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• Besonderheiten des Influenzavirus• Labordiagnose der Geflügelpest• Geflügelpestausbrüche 2003• Eigenschaften des Seuchenvirus und

Probleme bei der Diagnosestellung• Schlussfolgerungen für die Diagnostik

Gliederung

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InfluenzavirusFamilie Orthomyxoviridae umhüllte RNA-Viren 8 RNA-Segmente Hüllproteine Hämagglutinin (HA),Neuraminidase (NA) Nach Antigenstruktur unterteiltMatrixprotein (M)Nukleoprotein (NP)  

Typ A pathogen für Mensch und Tier 15 HA-Subtypen 9 NA-Subtypen Bei Vögeln alle Antigen-Subtypen

Typ A, B, C

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Genetisches Reassortment vonInfluenzaviren

(Antigenshift)

In einer gleichzeitig mit 2 verschiedenen Viren infiziertenZelle werden die neu synthetisierten Virusgene beliebigkombiniert.(nach Rott, 1997)

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Methoden zur Typisierung und Subtypisierung

Typ-A-spezifischMatrixprotein M-PCRNukleoprotein Antigen-ELISA

Ak-ELISAAGPTIFT

H-Subtyp-spezifischHämagglutinin HA-PCR

HAHT

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Vorkommen der H-Subtypen des Influenza-A-Virusbei Mensch und Tier

H-Subtyp Vogel Mensch Schwein Pferd Seehund Wal Nerz

123456789

101112131415

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Influenzavirus - Hämagglutinin

• Glykoprotein auf der Virushülle mit Rezeptorbindungsstelle– vermittelt Beginn der Virusinfektion

– agglutiniert Erythrozyten

• Träger des Antigens, gegen das die schützende Immunantwort gerichtet ist– Immunität H-Subtypspezifisch

– Mutationen bewirken Antigendrift

• Pathogenitätsdeterminante– Fusion mit Zellwand erfordert begrenzte enzymatische Spaltung durch Proteasen der

Wirtszelle

– Meist nur durch Trypsin-ähnliche Proteasen möglich → geringe Pathogenität lokaleInfektion des Atmungs- und Verdauungstraktes

– Sind mehrere basische Aminosäuren an der Spaltstelle, kann diese von ubiquitär inallen Zellen vorkommenden Subtilisin-ähnlichen (Furin) Proteasen gespalten werden

→ hohe Pathogenität → generalisierte Infektion

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Aminosäure – Sequenz der Spaltstelle desHämagglutinins unterschiedlich pathogener

Influenzaviren

A/ch/Germany/79 (H7N7) hp PEIPKKKKR * GLF

A/ch/NL/03 (H7N7) hp PEIPKRRRR * GLF

A/tk/Italy/99 (H7N1) lp PEIPKG R * GLFA/tk/Italy/00 (H7N1) hp PEIPKGSRVRR * GLF

  A/ch/Mexico/94 (H5N2) lp VPQ RETR * GLFA/ch/Puebla/94 (H5N2) hp VPQRKRKTR * GLF 

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Geflügelinfluenza – Geflügelpest

LPAIVH1 – H15Respirator.Erkrankung, oft mit

SekundärinfektionenPuten u.a.Wirtschaftliche Verluste durch

Minderzunahmen und schlechteKlassifizierung bei Masttieren

Legeleistungsabfall bei ZuchttierenBekämpfung nicht gesetzlich

vorgeschriebenVakzination

• HPAIV• H5, H7• Allgemeinerkrankung mit bis

100% Mortalität• Hühner, Puten u.a.• Anzeigepflichtige Tierseuche• Liste A des OIE• Bekämpfung nach Geflügelpest-

VO / 92/40/EWGStamping out

• Handelsrestriktionen• Vakzination verboten

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Definition der Klassischen Geflügelpestgemäß Richtlinie 92/40/EWG

Die Geflügelpest

ist eine Infektionskrankheit, verursacht durch einInfluenza-A-Virus mit einem intravenösen Patho-genitätsindex in sechs Wochen alten Hühnern von1.2 oder mehr

oder

eine Infektion mit einem Influenza-A-Virus derSubtypen H5 oder H7, bei dem im Rahmen einerNukleotid-Sequenzanalyse multiple basische Ami-nosäuren im Spaltbereich des Hämagglutininsnachgewiesen wurden.

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Epidemiologie der Aviären Influenza• Wildvögel

– Genreservoir– Entstehung neuer Viren– Vogelzug

• Geflügel in Freilandhaltung– Adaptation an Hausgeflügel– Infektion anderer

Geflügelarten

• Intensivhaltung– große Tierzahl, enger Raum– schnelle Tierpassagen– Gefahr von Mutationen

gering hoch pathogen– Virusanreicherung in Stall

und UmgebungBFAV Insel Riems

Tierkontakte, Kot

Mensch,unbelebte Vektoren

Menschunbelebte VektorenTiertransporte

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Seit 1959 vom Geflügel isolierte hochpathogeneInfluenzaviren

• A/chicken/Scotland/59 (H5N1)• A/turkey/England/63 (H7N3)• A/turkey/Ontario/7732/66 (H5N9)• A/chicken/Victoria/76 (H7N7)• A/chicken/Germany/79 (H7N7)• A/turkey/England/199/79 (H7N7)• A/chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2)• A/turkey/Ireland/1378/83 (H5N8)• A/chicken/Victoria/85 (H7N7)• A/turkey/England/50-92/91 (H5N1)• A/chicken/Victoria/1/92 (H7N3)• A/chicken/Queensland/667-6/94 (H7N3)• A/chicken/Mexico/8623-607/94 (H5N2)• A/chicken/Pakistan/447/94 (H7N3)• A/chicken/NSW/97 (H7N4)• A/chicken/Hong Kong/97 (H5N1)• A/chicken/Italy/330/97 (H5N2)• A/turkey/Italy/99 (H7N1)• A/chicken/03 (H7N7)

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Labordiagnose und Differentialdiagnoseder ND und AI

• Regionale Laboratorien der Bundesländer– Primärdiagnose → AIV H5, H7 → Seuchenverdacht

• NRL– Bestätigung der Diagnose

→ HPAIV → Seuchenfeststellung

• Bei Erstverdacht auf Geflügelpest Proben parallel zumRegionallabor und zum NRL schicken

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Labordiagnose der Geflügelpest- Regionales Untersuchungsamt -

• Virusisolierung im Brutei• HAH mit NDV-Serum

(Ausschluss ND)• HAH mit H5-, H7 – Serum

• Immunfluoreszenztest (Organ, Zellkultur)• Elmi

• M-PCR (Influenza-A-spezifisch)

• NDV-PCR (Ausschluss NDV)

→ AIV vom Subtyp H5 oder H7→ Verdacht auf Geflügelpest

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Labordiagnose der Geflügelpest- Nationales Referenzlabor -

• Anzucht/Vermehrung imBrutei

• HAH mit NDV-Serum• HAH mit Seren gegen H1 bis

H13• Intravenöser

Pathogenitätsindex

• M-PCR• NDV-PCR• Subtypspezifische H7- und H5-

PCR• Sequenzierung der Spaltstelle

des HAo

→ Hochpathogenes AIV vom Subtyp H5 oder H7→ Geflügelpest

• Neuraminidase-Subtypisierung (N1 bis N9)• weitere Charakterisierung

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Serologische Untersuchung auf AviäreInfluenza

• Überwachungsuntersuchung– ELISA (Typ A spezifisch)– AGPT (Typ A spezifisch)– (HAH auf H5 und H7)

• Subtypisierung positiver Seren– HAH gegen Antigene H1 bis

H13

Regionales Labor

NRL

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Geflügelpestausbrüchein den Niederlanden,

Belgienund Deutschland 2003

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Niederlande28.02. - 23.05.03255 Ausbrüche,Provinzen Gelderland Utrecht

Noord Braband Limburgetwa 30 Millionen Tiere270 Mio € Bekämpfung500 –600 Mio € Wirtschaftszweig

Belgien15.04. - 30.04.038 AusbrücheProvinzen Limburg Antwerpenetwa 3 Millionen Tiere

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Lokalisation des Geflügelpest-Ausbruches im KreisViersen, NRW, 13.05.2003

NRL

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Geflügelpestausbruch in Schwalmtal, Kreis Viersen, NRW,Mai 2003Chronologie

• 32 000 Masthähnchen• Ab 6.05. leichter Anstieg der Tierverluste• 7.05. Tiere zur Untersuchung ins StVUA Krefeld• 8.05. amtliche Feststellung des Verdachts auf Geflügelpest

– path-anat Verdacht auf GP, AIV-M-PCR positiv (Krefeld)– Sperrzonen 1 km, 3 km, 10 km eingerichtet

• 9.05. Stand still für Geflügel in NRW, Tötung 1 km-Zone, Proben zum NRL• 10.05. Kontaktbestände und 3 km-Zone geräumt• 13.05. Bestätigung der Diagnose durch NRL, Seuchenfeststellung• 30.05. Einstallung 400 Sentinels, nach 3 Wo Klinik, Serologie, PCR• 24.06. Aufhebung aller Restriktionen

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Geflügelpestausbruch in Schwalmtal, Kreis Viersen, NRW, Mai 2003

Bestätigung der Diagnose in der BFAV

• 08. Mai im StVUA Krefeld M-PCR positiv• 09. Mai abends, Probenanlieferung per Hubschrauber

– Organe von 15 Hähnchen (Anreiben, Verimpfen, PCRs)• 10. Mai: AIV-M-PCR positiv, H7-PCR positiv, NDV-PCR negativ• 11. Mai: Virusisolierung positiv, Isolat als AIV H7 identifiziert• 13. Mai: Spaltstelle sequenziert PEIPKRRRR*GLF Diagnose: AIV H7 mit pathogener Spaltstelle

= Erreger der Klassischen Geflügelpest19. Mai: Neuraminidasesubtyp, IVPI

AIV H7N7IVPI 2,93

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Erfolgreiche SeuchenbekämpfungTilgung des Erstausbruches ohne Weiterverbreitung

• Tierhalter und Veterinärwesen in Alarmbereitschaft wegenSeuchenausbrüchen in Nachbarländern

• Sehr früher Seuchenverdacht trotz schwacher Klinik und relativgeringer Tierverluste, nur auf Basis der M-PCR

• sofortige intensive Bekämpfungsmaßnahmen• 200 Personen ständig im Einsatz (500 in Schichten)

– Tierärzte, Kreisordnungsamt, Feuerwehr, Polizei, Kommunen,THW, DRK u.a.

• günstige epidemiologische Gegebenheiten– Broilermast– Gebiet mit geringer Geflügeldichte

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Probleme bei der Diagnosestellung

• Keine plötzliche hohe Mortalität, sondern allmähliches Ansteigender Verluste (am 4. Krankheitstag ca 5%).Grund: geringer Viruseintrag, Übertragung durch direktenKontakt, Kot, Tröpfchen.

• Kein schlagartiger Rückgang von Futter und Wasserverbrauch• Klinik: meist nur Apathie, selten Oedeme am Kopf, wäßriger

Durchfall, Zyanose von Kamm und Kehllappen• Relativ selten Blutungen auf serösen Häuten, aber Blutstau in

allen Organen• Pankreasveränderungen !!! Bei LH Dotterperitonitis !!!

• Beimpfte Eier sterben schnell ab, aber nicht immer HAnachweisbar.

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Verzögerte Diagnose bei Erstausbruch in den Niederlanden

• Index case in Gelderland auffällig ab 23/24.02.– Legehennen Auslaufhaltung– Wasser- und Futteraufnahme reduziert– Sektion: Dotterperitonitis; Verdacht auf Salmonellen, Antibiotikaeinsatz– Ab 26.02. Mortalitätsanstieg– Klinische Probleme in 5 weiteren Betrieben– Am 28.02 DIFT Organschnitt positiv, Proben zum NRL– Am 01.03. Diagnose – schon 20 Bestände befallen

• Index case in Limburg, Putenbestand– Reduzierter Futter- und Wasserverbrauch ab Samstag– Nervale Symptome → Verdacht ND– Erst Do/Fr Untersuchung im NRL → PCR+

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Schlußfolgerung für die Diagnostik:

Entscheidend für die erfolgreicheBekämpfung ist die frühestmöglicheFeststellung der Seuche bzw. desSeuchenverdachts!

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Aber: Wer denkt denn gleich an Geflügelpest, wenn sie

– so selten vorkommt und– nicht immer wie im Lehrbuch aussieht?

Wer wagt die Feststellung eines Seuchenverdachtsohne ausreichende Absicherung, wenn dieserdrakonische Bekämpfungsmaßnahmen auslöst?

Schlußfolgerung:Auch bei gering erhöhten Verlusten und ungeklärtenTodesfällen ist nicht nur ND abzuklären, sondern immerauch auf AI zu untersuchen !!!

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Geflügelpest 2003

EIGENSCHAFTEN DES SEUCHENVIRUS

• A/Chicken/2003 (H7N7)• IVPI = 2,94• Sequenz der Spaltstelle: P E I P K R R R R . G L F• Alle Gene sind aviären Ursprungs• Keine zusätzlichen Glykosylierungsstellen (vermutlich erst kürzlich von Wildvögeln auf Hausgeflügel

übertragen)• H7 eng verwandt mit A/mallard/12/00 (H7N3)

– Anas plathyrhynchos, Stockente– P E I P K G R . G L F

• N7 eng verwandt mit A/shoveler/18/99 (H11N7)– Anas clypeata, Löffelente

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Geflügelpest H7N7 in den Niederlanden 2003

Erkrankungen von Menschen

• 266 Fälle von Konjunktivitis– Davon bei 78 Fällen (34 %) Virusnachweis positiv– Bei 40 Fällen (12 %) zusätzlich grippeähnliche Symptome

• Davon 6/32 viruspositiv

• 23 Menschen nur grippeähnliche Symptome– Davon 2/17 viruspositiv, einer davon verstorben

• 3 Kontaktpersonen von Menschen mit Konjunktivitiserkrankt

• Keine Doppelinfektionen von humanem H1 oder H3mit aviärem H7-Virus

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Empfehlungen zum Infektionsschutzvon gefährdeten Personen

• Mund- und Nasenschutz, Schutzbrille, Schutzkleidung,Handschuhe

• antivirale Prophylaxe mit Neuraminidase-Hemmern z. B. Oseltamivir, Präparat „Tamiflu“• Grippe-Schutzimpfung mit dem aktuellen humanen Impfstoff, um

Doppelinfektionen mit Human- und Geflügelvirus zu vermeiden

Erarbeitet von Robert-Koch-Institut (RKI) Ausschuss für biologische Arbeitsstoffe (ABAS) Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere (BFAV) Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)

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Zusammenfassung

• Entscheidend für die erfolgreiche Bekämpfung der Geflügelpest ist diefrühestmögliche Feststellung der Seuche

• Beim Erstausbruch müssen nicht immer extrem hohe Tierverlusteauftreten. In Abhängigkeit von der Infektionsdosis und von der Tierart undder Haltungsform kann sich die Krankheit zunächst auch langsamausbreiten.

• Auch bei gering erhöhten Verlusten und ungeklärten Todesfällen ist nebenND immer auf AI zu untersuchen

• Methoden zur Virusisolierung, der HAHT auf H5 und H7 sowie die M-PCRsollten in jedem Untersuchungsamt etabliert sein

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Danke!M. Kramer, J. Teuffert, B. Pötzsch, BFAV Wusterhausen

E. Starick, J. Teifke, J. Veits BFAV Insel Riems

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Seit 1995 im NRL charakterisierteaviäre Influenzavirus-Isolate aus Wirtschaftsgeflügel

Jahr Anzahl Subtyp Tierart

1995 5 H9N2 Pute, Huhn

1996 6 H9N2 Pute

1997 0 -  

1998 1 H9N2 Huhn

  3 H6N5 Pute

1999 2 H6N2 Pute

  2 H6N1 Pute

2000 0 -  

2001 1 H7N7 Pute

2002

2003

15

1

H6N2

H7N7

Pute

Huhn

 

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Geflügelpestausbruch in Schwalmtal, Kreis Viersen, NRW, Mai 2003

Epidemiologische Ermittlungen

• Tierbewegungen

– Küken aus Portugal und Belgien– Hähnchen zur Schlachtung nach Thüringen

• Personenverkehr– Betreuung durch Besitzer und Sohn– Geflügeltierarzt aus Holland, nur telefonische Konsultation– Tierfänger arbeiten nur in dieser und in der Nachbarfarm

– Hofladen und Katalog-Bestellzentrum• Futtermittel

– Belgische Futtermittelfirma• Lüftungssystem

– Wildvögel

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Geflügelpest H7N7 in den Niederlanden 2003Tödlicher Verlauf einer Infektion

beim Menschen

• 57 Jahre alt, keine Vorkrankheiten

• 2. April: Kontakt mit krankem Geflügel• 4. April: hohes Fieber, Kopfschmerzen• 11. April: Klinikaufnahme, beidseitige Lungenentzündung• 12. April: Intensivstation, künstliche Beatmung• 14. April: Nierenversagen, sehr schlechter Zustand• 15. April: Bronchoalveolare Lavage AIV H7 positiv

• 17. April: Tod• Post mortem: AIV H7 positiv, andere respiratorische Viren und

Bakterien negativ

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Geflügelpest H7N7 in den Niederlanden 2003

Verdacht der Infektion von Schweinen

• Schweine im Seuchensperrgebiet mittels HAH auf Antikörpergegen H7 untersucht

• 5 von 13 untersuchten gemischten Farmen waren positiv– Teilweise hohe Titer– 2 Bestände davon hatten Eier verfüttert

• Keine Virusausscheidung bei Schweinen nachweisbar

• In BFAV im Tierexperiment nach massiver oraler Virusgabe undnasaler Sprayinfektion von Schweinen– keine Erkrankung– Keine Antikörper

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Untersuchung von Wildvögeln

• 2001 begonnen• Zugvögel und Standvögel• Wilde Wasservögel• Probennahme bei der Vogelberingung• Kloakentupfer → Virusisolierung• 2001 wurden 289 Watvögel (Limikolen) untersucht

– 28 Virusisolate– AIV H3N8, H4N6, PMV -1, PMV-4, PMV-6

• 2002/03 verschiedene Fangorte 1092 Vögel– 2 Virusisolate H13N6 (Möwe, Dohle)

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Untersuchung von Wirtschaftgeflügel aufaviäre Influenza 2003

• 180 Legehennenbestände• 162 Broilerbestände• 163 Mastputenbestände• 181 Entenbestände• 159 Gänsebestände

Ergebnis:kein Nachweis von Antikörpern gegen H5 und H7Keine Isolierung von AIV H5 und H7

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Untersuchung von Geflügel in Freilandhaltung aufaviäre Influenza

• 66 Hühnerbestände• 6 Putenbestände• 22 Entenbestände• 45 Gänsebestände• 11 andere

• Ergebnis:• Kein Nachweis von Antikörpern gegen AIV H5 und H7• Keine Isolierung von Influenzavirus