Der Einfluss des antimikrobiellen

Peptides LL-37 auf Candida albicans

und den Infektionsprozess in vitro

Von der Fakultät für Lebenswissenschaften

der Technischen Universität Carolina-Wilhelmina

zu Braunschweig

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

genehmigte

D i s s e r t a t i o n

von Daniela Evers

aus Berlin

1. Referentin: Professorin Dr. Ursula M. Bilitewski

2. Referent: Professor Dr. Michael Steinert

eingereicht am: 02.10.2012

mündliche Prüfung (Disputation) am: 05.12.2012

Druckjahr 2012

Vorveröffentlichungen der

Dissertation

Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebens-wissenschaften, vertreten durch die Mentorin der Arbeit, in folgenden Beiträgenvorab veröffentlicht:

Tagungsbeiträge:

• Evers, D., Gremmer, K. & Bilitewski, U.: The double life of Candida albicans(Poster). 3rd International PhDSymposium, Braunschweig (2009)

• Hofmann, B., Mangin, S., Müller, D., Suárez-Diez, M., Puchalka, J., Evers, D.,Bilitewski, U. & Martins dos Santos, V.: Turning Dr. Jekyll into Mr. Hyde –A Genome-Scale Model For Predicting C.albicans Metabolic Changes DuringHost Infection (Poster). Conference for Systems Biology of Microorganisms,Paris, Frankreich (2010)

• Evers, D., Gremmer, K., Sokolis, D. & Bilitewski, U.: The double life of Can-dida albicans (Poster). 3. Gemeinsame Tagung der VAAM und DGHM, Han-nover (2010)

• Mangin, S., Suárez-Diez, M., Hofmann, B., Mueller, D., Sandoval, R., May,S., Evers, D., Puchalka, J., Bilitewski, U. & Martins dos Santos, V.: TurningDr. Jekyll into Mr. Hyde - A Genome-Scale Model To Analyse C. albicans andHost Interactions During Host Infection (Poster). 25th German Conference onBioinformatics, Braunschweig (2010)

• Evers, D., Gremmer, K. & Bilitewski, U.: Dr. Jekyll and Mr. Hyde: A com-mensal organism switches to a deadly pathogen - Candida albicans (Poster).4th International PhDSymposium, Braunschweig (2010)

• Evers, D., Mangin, S. & Bilitewski, U.: Dr. Jekyll and Mr. Hyde: A commen-sal organism switches to a deadly pathogen - Candida albicans (Poster). 5thEuropean Conference on Prokaryotic and Fungal Genomics, Göttingen (2011)

• Mangin, S., Hofmann, B., Müller, D., Suárez-Diez, M., May, S., Puchalka,J., Evers, D., Rupp, S., Sohn, K., Grumaz, C., Schaller, M., Schröppel, K.,Wagener, J., Bilitewski, U. & Martins dos Santos, V.: Turning Dr. Jekyll intoMr. Hyde – A Genome-Scale Model to Analyze Candida albicans and HostInteractions During Host Infection (Poster), 12th International Conference onSystems Biology, Heidelberg (2011)

• Evers, D., Mangin, S. & Bilitewski, U.: Dr. Jekyll and Mr. Hyde: A commen-sal organism switches to a deadly pathogen - Candida albicans (Poster). 5thInternational PhDSymposium, Braunschweig (2011)

• Evers, D & Bilitewski, U.: The influence of the antimicrobial peptide LL-37on Candida albicans and the infection process in vitro (Poster). 11th ASMConference on Candida and Candidiasis, San Francisco, CA, USA (2012)

Abstract

Candida albicans is a fungal opportunistic pathogen leading to superficial or systemicinfections. The physical barrier of the skin, cellular components, such as phagocytesand killer cells, but also molecular components, e.g. antimicrobial peptides (AMPs),protect the healthy host against pathogens. However, the underlying molecular me-chanisms are only partly understood. The thesis work focused on the AMP LL-37,which was reported to be of high relevance for the protection against invasion ofepithelial cell layers by C. albicans. Thus, LL37 was added to C. albicans (SC5314)and to vaginal epithelial cells (A431) separately and the respective co-culture systemwas established. LL-37 inhibited growth of C. albicans when concentrations excee-ded inflammation-like ranges of 30µg/mL. Gene expression analysis showed thatLL-37 treatment led to the upregulation of transcription factors, which are involvedin stress response, of genes which are related to glucose uptake and carbon metabo-lism and of genes which are involved in cell wall regulating functions. Genes whichare related to ncRNA- or rRNA-metabolism were downregulated, which is a generalresponse to stress. In nutrient-turnover a slightly decreased rate of glucose consump-tion and reduced biomass yields was observed. Correlating to putative effects on thecell wall of C. albicans a decreased adhesion to plain plastic surfaces in the presenceof LL-37 was observed, but, surprisingly, adhesion to epithelial cells was increased.FACS analysis of the epithelial cells revealed a higher surface abundance of thePattern Recognition Receptors TLR2, Dectin-1 and the receptor CXCR4, when theA431 cells were treated with LL-37. This was confirmed by gene expression analysisvia qRT-PCR. This could point to an active contribution of the epithelial cells tothe interaction with C. albicans. On the other hand treatment of epithelial cells withLL-37 reduced the viability of the cells, in particular under serum-free conditions.

Zusammenfassung

Candida albicans ist ein pathogener Pilz, der oberflächliche oder systemische Infek-tionen auslöst. Die physikalische Barriere der Haut, zelluläre Komponenten, wie Pha-gozyten und NK-Zellen, aber auch molekulare Komponenten, wie z. B. antimikrobi-elle Peptide (AMPs), schützen den gesunden Wirt vor dem Pathogen. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind nur teilweise verstanden. Der Fokus dieserArbeit richtete sich auf das AMP LL-37. Das als wichtige epitheliale Schutzkompo-nente vor C. albicans-Invasionen geltende LL-37 wurde zu C. albicans (SC5314) bzw.zu vaginalen Epithelzellen (A431) sowie zum etablierten Co-Kultivierungssystemsgegeben. LL-37 inhibierte das Wachstum von C. albicans, wenn Konzentrationen ent-zündungsähnliche Bereiche von 30µg/ml erreichten. Genexpressionsanalysen zeigten,dass die LL-37-Behandlung zu einer Hochregulation von Stressanwort-assoziiertenTranskriptionsfaktoren und von Genen, die mit Glucose-Aufnahme und Kohlenstoff-Metabolismus verbunden sind sowie in Zellwand-regulierende Funktionen involviertsind, führte. Gene, die mit ncRNA- oder rRNA-Metabolismus assoziiert sind, wur-den einer generellen Stressantwort entsprechend herunterreguliert. Die Betrachtungdes Nährstoffumsatzes zeigte eine reduzierte Glucoseverbrauchsrate und eine gerin-gere Biomasseproduktion. Korrelierend mit putativen Zellwand-Effekten wurde einereduzierte Adhäsion an Plastikoberflächen in Anwesenheit von LL-37 detektiert.Die Adhäsion an Epithelzellen hingegen war verstärkt. FACS-Analysen zeigten einehöhere Abundanz der Pattern Recognition Rezeptoren TLR2, Dectin-1 und des Re-zeptors CXCR4 an A431-Zellen, die mit LL-37 behandelt wurden. Diese Ergebnissekonnten durch Genexpressionanalysen via qRT-PCR bestätigt werden und spre-chen für eine aktive Beteiligung der Epithelzellen an der Interaktion mit C. albicans.Andererseits bewirkte die Behandlung der Epithelzellen mit LL-37 eine reduzierteViabilität der Zellen, insbesondere unter Serum-freien Bedingungen.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.1 Historische Aspekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.2 Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.3 Klinische Relevanz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.1.4 Virulenzfaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Die Interaktion Candida albicans - Wirt . . . . . . . . . . . . . . . . 131.2.1 Adhärenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141.2.2 Erkennung von C. albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141.2.3 Zytokine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.2.4 Phagozytierende Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181.2.5 Evasionsstrategien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.3 Antimikrobielle Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211.3.1 Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211.3.2 Wirkungsweisen von AMPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221.3.3 Selektivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241.3.4 AMPs als Regulatoren der Immunantwort . . . . . . . . . . . 241.3.5 Resistenzentwicklungen von Pathogenen . . . . . . . . . . . . 251.3.6 AMPs als Therapeutikum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281.3.7 Defensine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291.3.8 Cathelicidin LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.4 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2 Material und Methoden 39

2.1 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.2 Lösungen und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402.3 Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422.4 Kit-Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

vii

2.5 Stämme und Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.5.1 Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.5.2 Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.6 Steriles Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.7 Zellzahlbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.8 Arbeiten mit Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.8.1 Stammhaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.8.2 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.8.3 Hitzeinaktivierung von C. albicans . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.8.4 Wachstumstests in Mikrotiterplatten . . . . . . . . . . . . . . 47

2.8.5 Wachstumstests in Erlenmeyerkolben . . . . . . . . . . . . . . 48

2.8.6 Bestimmung der Trockenmasse . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.8.7 CFU-Bestimmung von C. albicans-Kulturen . . . . . . . . . . 49

2.8.8 Extraktion der intrazellulären Metabolite . . . . . . . . . . . . 49

2.8.9 Analyse der Metabolite per HPLC . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.9 Arbeiten mit humanen Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.9.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.9.2 Toxizitätstests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

2.9.3 Infektion der Epithelzellen mit Candida albicans . . . . . . . . 56

2.9.4 Adhärenzassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

2.9.5 Lebend/Tot-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

2.9.6 Annexin-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

2.9.7 Färbung des Aktin-Zytoskeletts und des Zellkerns . . . . . . . 59

2.9.8 Analyse der Oberflächenrezeptoren der Epithelzellen mit Hilfeder Durchflusszytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

2.9.9 Nachweis des Zytokins IL8 mittels ELISA . . . . . . . . . . . 61

2.10 Genexpressionsanalysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

2.10.1 Isolation von RNA aus humanen Zellen . . . . . . . . . . . . . 62

2.10.2 Isolation von RNA aus Candida albicans . . . . . . . . . . . . 62

2.10.3 Konzentrationsbestimmung und Qualitätskontrolle der RNA . 63

2.10.4 Genexpressionsanalyse von Candida albicans . . . . . . . . . 64

2.10.5 cDNA-Synthese und RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3 Ergebnisse 67

3.1 Methodenetablierung an der HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.1.1 Analytik organischer Säuren und Kohlenhydrate . . . . . . . . 67

viii

3.1.2 Aminosäureanalytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.2 Untersuchungen zum Wachstum und Metabolismus von Candida al-bicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.2.1 Wachstum und Metabolismus von C. albicans in verschiedenenMedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.2.2 Einfluss von LL-37 auf Wachstum und Metabolismus von Can-dida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

3.3 Wachstum von Candida albicans unter Zugabe von LL-37 in Mikro-titerplatten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

3.3.1 Bestimmung der optischen Dichte . . . . . . . . . . . . . . . . 82

3.3.2 CFU-Bestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

3.4 Einfluss von LL-37 auf die Hyphenbildung . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.5 Veränderung der Genexpression von C. albicans bei Wachstum in LL-37-haltigem Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

3.6 Beeinflussung der Adhärenz von Candida albicans durch LL-37 . . . . 99

3.6.1 Adhärenz von C. albicans an Glasoberflächen . . . . . . . . . . 99

3.6.2 Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen . . . . . . . . . . . 100

3.6.3 Untersuchung der Infektion im Adhärenzassay unter dem Ras-terelektronenmikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

3.6.4 F-Aktinfärbung an infizierten Epithelzellen . . . . . . . . . . . 105

3.6.5 Lebend/Tot-Färbung im Adhärenzassay . . . . . . . . . . . . 105

3.6.6 Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen nach vorheriger Be-handlung mit LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

3.7 Adhärenz von Candida albicans Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . 109

3.8 Wirkung des AMP LL-37 auf Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . 111

3.8.1 Toxizität von LL-37 auf Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . 111

3.8.2 Einfluss von LL-37 auf die Pattern Recognition-Rezeptoren derEpithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

3.8.3 LL-37-induzierte Bildung von IL8 . . . . . . . . . . . . . . . . 113

3.8.4 Einfluss von LL-37 auf die Expression der PRR und des Zy-tokins IL8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

4 Diskussion 117

4.1 Metabolische Analysen liefern molekulare Ziele . . . . . . . . . . . . . 118

4.2 Wirkung von LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

4.2.1 Wirkung von LL-37 auf C. albicans . . . . . . . . . . . . . . . 120

ix

4.2.2 Wirkung von LL-37 auf Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . 1234.2.3 Wirkung von LL-37 auf die Infektion . . . . . . . . . . . . . . 125

4.3 Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

Literaturverzeichnis 133

A Abkürzungsverzeichnis 155

B verwendete Geräte 161

C Verbrauchsmaterialien 164

D Chemikalien 167

E Inhaltsverzeichnis des digitalen Anhangs 170

Danksagung 171

x

Abbildungsverzeichnis

1.1 Zentraler Metabolismus in der Abwesenheit von Glucose . . . . . . . 4

1.2 Citronensäure- und Glyoxylat-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3 Parasexueller Zyklus von Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . 7

1.4 Morphologische Wachstumsformen von C. albicans . . . . . . . . . . 9

1.5 Signaltransduktionswege, die zu der Expression hyphenspezifischerGene führen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.6 Übersicht der wichtigsten PRRs (Pattern Recognition Receptors) beider Erkennung von C. albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.7 Schematische Darstellung der Interaktion zwischen C. albicans undangeborenem Immunsystem des Wirts an mukosalen Oberflächen . . . 20

1.8 Modelle, die die Membranzerstörung durch antimikrobielle Peptidebeschreiben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

1.9 Bindungsverhalten antimikrobieller Peptide an Membranen eukaryo-tischer und prokaryotischer Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

1.10 Übersicht der Funktionen antimikrobieller Peptide in der Verteidi-gung des Wirts gegenüber Pathogenen . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

1.11 Schematische Darstellung der Prozessierung von Cathelicidin hCAP18 30

2.1 Zählgitter einer Neubauer improved Zählkammer . . . . . . . . . . . . 46

2.2 Schematischer Aufbau der verwendeten HPLC-Anlage . . . . . . . . . 50

2.3 OPA-Derivatisierung von primären Aminosäuren . . . . . . . . . . . . 51

2.4 Reduktion von CFDA-SE zu CFSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

2.5 Reduktion von Resazurin zu Resorufin . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

2.6 Umwandlung des membrangängigen CalceinAM zu dem fluoreszie-renden Calcein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

2.7 Elektropherogramm einer RNA-Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . 63

3.1 Chromatogramme der getesteten Standards in der Analyse der orga-nischen Säuren und Kohlenhydraten mittels HPLC . . . . . . . . . . 69

xi

3.2 Chromatogramm der Analyse eines Aminosäurestandardgemischesmittels HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.3 Überprüfung der Stabilität des OPA-Derivates . . . . . . . . . . . . . 70

3.4 Wachstumskurven von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦C . . 72

3.5 Konzentrationen der extrazellulären organischen Säuren und Glucosebei Wachstum von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦C . . . . . 74

3.6 Konzentrationen der extrazellulären Aminosäuren bei Wachstum vonSC5314 in RPMI-MOPS pH7,4 bei 37◦C . . . . . . . . . . . . . . . . 75

3.7 Glucosekonzentrationen und gebildete Biomasse bei der Kultivierungvon SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦C . . . . . . . . . . . . . 76

3.8 Konzentrationen der intrazellulären Aminosäuren bei Wachstum vonSC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦C . . . . . . . . . . . . . . . 77

3.9 Wachstumskurve nach OD-Messung und Trockenmasse in RPMI-MOPS pH7,4 mit und ohne LL-37 bei 37◦C . . . . . . . . . . . . . . 78

3.10 Konzentrationen der extrazellulären organischen Säuren und Glucosebei Wachstum von C. albicans SC5314 in RPMI-MOPS pH7,4 ohneund mit LL-37 bei 37◦C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

3.11 Glucosekonzentrationen bei der Kultivierung von SC5314 in RPMI-MOPS pH7,4 mit und ohne LL-37-Behandlung bei 37◦C . . . . . . . 80

3.12 Zusammensetzung der extrazellulären Aminosäuren bei Wachstumvon C. albicans SC5314 in RPMI-MOPS pH7,4 ohne und mit LL-37 bei 37◦C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

3.13 Wachstum von C. albicans SC5314 bei 30◦C unter LL-37-Behandlungin YPD-Medium und YNBpH5,6-Medium . . . . . . . . . . . . . . . 83

3.14 Veränderung der Zellgröße von C. albicans bei Kultivierung inYNBpH5,6 nach 1 h und 6 h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

3.15 Wachstum von C. albicans SC5314 bei 37◦C unter LL-37-Behandlungin YNBpH5,6-Medium und RPMI-MOPSpH7,4 . . . . . . . . . . . . 84

3.16 Einfluss von LL-37 auf das Wachstum von C. albicans SC5314 inYNBpH5,6 und in RPMI-MOPSpH7,4 bei 37◦C . . . . . . . . . . . 85

3.17 Einfluss von LL-37 auf die Hypheninduktion (Reporterassay) . . . . . 86

3.18 Einfluss von LL-37 auf das Hyphenwachstum (Hyphenlängenmessung) 87

3.19 Principal Component Analyse der Datensets 1-3 der Ganzgenom-Untersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

3.20 Heatmap mit 73 Genen, die in C. albicans SC5314 bei Behandlungmit 30µg/ml LL-37 differenziell exprimiert wurden . . . . . . . . . . 89

xii

3.21 Venn-Diagramm der differentiell exprimierten Gene LL-37-behandelter C. albicans SC5314 im Vergleich zu unbehandeltenZellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

3.22 Zuordnung der signifikant regulierten Gene (Datenset 1-3, lfc1, p-Value

3.40 Expression der Gene CLEC7A, CXCR4, IL8, TLR2, TLR4 und desHousekeepers GAPDH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

xiv

Tabellenverzeichnis

1.1 Humane antimikrobielle Peptide: Defensine und Cathelicidin . . . . . 341.2 Veränderte Expression von LL-37 in immunvermittelten inflammato-

rischen Krankheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.4 verwendete Candida albicans-Stämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.5 Übersicht der angewendeten HPLC-Methoden . . . . . . . . . . . . . 522.6 Verwendete Kulturgefäße und Mediumvolumina in der Zellkultur . . . 542.7 Verwendete Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 612.8 Übersicht der in der RT-PCR verwendeten Primer . . . . . . . . . . . 66

3.1 Detektionslimits der Analyse der organischen Säuren und Kohlenhy-drate mittels der Rezex-ROA-Säule in der HPLC . . . . . . . . . . . 68

3.2 Detektionslimits der Analyse OPA-markierter primärer Aminosäurenmittels der Zorbax EclipseC18plus-Säule in der HPLC . . . . . . . . . 70

3.3 Glucoseaufnahmeraten der C. albicans-Kulturen in verschiedenen Me-dien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

3.4 Glucoseaufnahmeraten der C. albicans-Kulturen mit oder ohne LL-37-Behandlung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

3.5 Liste der positiv regulierten Gene in C. albicans SC5314 bei Behand-lung mit 30µg/ml LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

3.6 Liste der negativ regulierten Gene in C. albicans SC5314 bei Behand-lung mit 30µg/ml LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

xv

xvi

Kapitel 1

Einleitung

1.1 Candida albicans

1.1.1 Historische Aspekte

Die ersten beschriebenen Krankheitsbilder, die auf eine Infektion mit Candida albi-cans schließen lassen, führen zu Hippokrates ins vierte Jahrhundert v. Ch. zurück.Die heute als Soor bezeichnete Krankheit galt damals und noch bis ins frühe 20.Jahrhundert hinein als Defekt des Erkrankten und wurde beispielsweise 1920 vonAldo Castellani als krankhafte „Sekretion der Mundschleimhaut“ bezeichnet. ImJahr 1839 konnte der Erreger C. albicans von Langenbeck erstmalig isoliert werdenund 8 Jahre später wurde er von Charles-Philippe Robin als Oidium albicans be-zeichnet. 1923 wurde der Erreger aufgrund neuer taxonomischer Erkenntnisse vonChristine M. Berkhout der Gattung Candida zugeordnet. 21 Jahre später erfolgte dieoffizielle Festlegung des taxonomischen Namens Candida albicans [1]. Somit gehörtder Pilz zur Ordnung der Saccharomycetales im Stamm der Schlauchpilze (Asco-mycota), dem das Reich der Pilze übergeordnet ist. Die Gruppe der Pilze umfasst1,5 Millionen Arten mit einer nahezu ubiquitinären Verbreitung. Nur 150 bis 200Arten können den Menschen infizieren. Zu diesen gehören neben Candida albicansauch Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidiis undCryptococcus neoformans [2].

1.1.2 Eigenschaften

Die eukaryotische Hefe C. albicans ist diploid und verfügt über 8 Chromosomen. DieGenomgröße umfasst ca. 13,4Mb, die 6200 Gene kodieren [3]. Eine Besonderheit,

1

2 Einleitung

die C. albicans mit den Spezies C. paropsilosis und C. tropicalis gemeinsam hat, liegtin der Kodierung der Aminosäuren. Das Triplet CUG wird seltener in Leucin als inSerin translatiert [4].

Die Zellwand von C. albicans ist in zwei Hauptschichten gegliedert. Das Ske-lett der inneren Schicht wird aus β-1,3-Glucanen gebildet, die kovalent an β-1,6-Glucanen und Chitin gebunden sind. Durch Wasserstoffbrückenbindungen zu be-nachbarten Polysaccharidketten kommt es zu der Ausbildung eines dreidimensiona-len Netzwerks von Mikrofibrillen.

Die äußere Schicht der Zellwand besteht hauptsächlich aus Glycosylphosphati-dylinositol (GPI)-Anker-abhängigen Zellwandproteinen (GPI-CWPs). Diese Prote-ine sind mit Mannose-enthaltenden Polysacchariden, den sogenannten Mannanen,stark glycolysiert. Eine Verbindung der äußeren Schicht mit der inneren Schichterfolgt für die GPI-CWPs über GPI-Reste, die an β-1,6-Glucane binden. Die Man-noproteine (Pir-CWP), die interne Repeat-Domänen aufweisen, gehen eine Bindungmit β-1,3-Glucanen oder Chitin ein [5].

1.1.3 Klinische Relevanz

C. albicans ist ein opportunistisches Pathogen der menschlichen Mikroflora. Er be-siedelt meist asymptomatisch den Gastrointestinal- und Vaginaltrakt sowie dieSchleimhäute der Mundhöhle bei 30 - 60% der Menschen [6]. Eine leichte Beeinträch-tigung des Immunsystems oder eine Veränderung der Zusammensetzung der Mikro-flora können jedoch ausreichend für einen Übergang in die pathogene Form sein.Oberflächliche Infektionen der Haut und der Schleimhäute sind sehr weit verbreitet.So durchleben 75% der Frauen mindestens einmal in ihrem Leben eine vulvovagi-nale Kandidose [2]. C. albicans-Infektionen können aber auch invasiv (systemisch)sein. Aufgrund einer Verletzung der Haut oder der Schleimhäute kann C. albicans indie Blutbahn eindringen und dort Infektionen, sogenannte Kandidämien, auslösen.Eine weitere Verbreitung zu inneren Organen wie Niere, Milz, Leber, Herz sowieLunge und eine Besiedlung dieser ist dann möglich. Im gesunden Menschen tre-ten diese schwerwiegenden Formen von Candida-Infektionen nicht auf. Eine Reiheprädisponierender Faktoren unterschiedlichen Ursprungs spielen hierbei eine Rolle.Dazu zählen physiologische (Alter, Schwangerschaft) oder traumatische (Verletzung,Verbrennung) Faktoren. Ebenso haben Personen mit Vorerkrankungen wie Diabetesmellitus, AIDS, Leukämie und anderen Krebserkrankungen, aber auch organtrans-plantierte Menschen und Patienten auf Intensivstationen ein erhöhtes Risiko, an

Einleitung 3

einer invasiven Kandidose zu erkranken. Die mit diesen Erkrankungen verbundenenTherapien, wie Chemotherapie oder die Gabe von Breitbandantibiotika, künstli-cher Ernährung und Dauerkatheter, begünstigen die Entwicklung von Kandidosen[7]. Bei der Betrachtung der Sterberaten wird die Schwere dieser Erkrankung deut-lich. Je nach Fall und Risikofaktoren liegt diese bei 50 - 75% [8]. Die Symptomeeiner systemischen Kandidose ähneln denen einer bakteriellen Sepsis. Eine Behand-lung nach erfolgter Diagnose führt meist nicht zur Heilung, da die Infektion schonzu weit fortgeschritten ist. Daher erfolgt in den oben genannten Indikationsfälleneine prophylaktische Behandlung mit antifungischen Präparaten. Trotz aller medi-zinischer Fortschritte haben in den letzten 10 Jahren die Fälle invasiver Kandido-sen um das 10-fache zugenommen. Candida ssp., darunter C. albicans, C. glabrata,C. parapsilosis und C. tropicalis, sind derzeit die dritthäufigste Ursache nosokomialerBlutbahninfektionen und die zweithäufigste Todesursache von Infektionen dieser Artin den USA [8]. Eine wichtige Ursache hierfür ist die Entwicklung von Resistenzen.

1.1.4 Virulenzfaktoren

Als Pathogenität bezeichnet man die Fähigkeit eines Organismus ein anderes Le-bewesen zu schädigen. Das Ausmaß der Pathogenität, die Virulenz, und somit dasPotential imWirt eine Krankheit auszulösen, wird durch Virulenzfaktoren bestimmt.Die große Flexibilität und Anpassungsfähigkeit, die C. albicans dazu befähigt, ver-schiedenste Bereiche des Wirts zu infizieren und verschiedene Formen der Infektionauszulösen, spricht für eine starke genomische Spezialisierung. Im Folgenden wer-den einzelne Virulenzfaktoren des weit gefächerten Spektrums von Candida albicansnäher erläutert.

1.1.4.1 Metabolische Flexibilität

Ein Organismus kann nur wachsen, wenn er Nährstoffe assimilieren kann. DaC. albicans ein breites Spektrum unterschiedlicher Nischen im menschlichen Körperbesiedelt (siehe Kapitel 1.1.3), muss der Mikroorganismus ein hohes Maß metaboli-scher Flexibiliät besitzen, Nährstoffe aufnehmen und verwerten zu können. Zu denwichtigsten und am besten untersuchten Substanzen im Bezug auf den Metabolismusvon C. albicans sind Kohlenstoff, Stickstoff und Eisen [9].

Die bevorzugte Kohlenstoffquelle von Candida albicans sind Zucker, insbesonde-re Glucose. Des weiteren kann C. albicans auch sogenannte alternative Kohlenstoff-quellen verwerten. Zu diesen gehören neben Ethanol und Acetat auch Aminosäuren,

4 Einleitung

Abbildung 1.1: Zentraler Metabolismus in der Abwesenheit von Glucose. Biochemische

Wege sind in Boxen dargestellt. Schlüsselgene, die infolge von limitierenden Bedingungen

induziert werden, sind im grau hinterlegten Teil der Boxen beschrieben. Die ovalen Elemen-

te stellen Zwischenprodukte dar. Alternative Kohlenstoffquellen sind links (weiße Pfeile),

katabolische Produkte sind rechts genannt (graue Pfeile). CSZ - Citroenensäurezyklus,

nach [10]

Glycerin und Fettsäuren. Diese Substanzen werden, wie in Abbildung 1.1 gezeigt,über die drei Hauptwege β-Oxidation von Fettsäuren, Glyoxylatzyklus und Gluco-neogenese metabolisiert [10].

Wird das Pathogen beispielsweise während des Infektionsprozesses durch Makro-phagen phagozytiert, zeigt der Metabolismus einen Wechsel in einen Zustand, derkohlenstofflimitierenden Bedingungen gleicht. Es werden glycolytische Gene herun-terreguliert, während Gene des Glyoxylatzyklusses (Isocitratlyase - ICL1, Malatsyn-thase - MLS1, Malatdehydrogenase - MDH1) und der Gluconeogenese (Phosphoe-nolpyruvatkinase - PCK1, Fructose-1,6-bisphosphatase - FBP1) aktiviert werden[11]. Dass dieser metabolische Wechsel für den eigentlichen Infektionsprozess vonBedeutung ist, zeigen Untersuchungen von Deletionsmutanten. So konnte gezeigtwerden, dass Deletionen der Gene ICL1, MDH1 und PCK1 eine geringere Virulenzim Mausmodell bewirken [12, 13].

Die primäre Funktion des Glyoxylatzyklusses ist es, ein Wachstum nur auf derBasis verfügbarer C2-Komponenten, wie z.B. Ethanol und Acetat, zu vermitteln.Der Zitronensäurezyklus (siehe Abbildung 1.2), der ebenso über C2-Komponentengespeist wird, ermöglicht dem Organismus aufgrund von zwei Decarboxylierungs-

Einleitung 5

Abbildung 1.2: Citronensäure- und Glyoxylat-Zyklus: Das Schema zeigt die grundlegenden

enzymatischen Schritte des Citronensäure-Zyklus (schwarze Linien), der in allen Organis-

men vorkommt. Der für Mikroorganismen und Pflanzen spezifische Glyoxylat-Zyklus ist in

gestrichelten Linie dargestellt. Schritte, die von beiden Wegen genutzt werden, sind durch

dicke Linien gekennzeichnet. PEP - Phosphoenolpyruvat, nach [14]

schritten keine Kohlenstoffassimilierung. Der als Bypass zu sehende Glyoxylatwegarbeitet ohne Decarboxylierung. Somit können die C2-Komponenten als Kohlenstoff-quellen in die Gluconeogenese eingespeist werden (siehe Abbildung 1.2). In diesemWeg erfolgt die Synthese von Glucose, die dann für die Herstellung von Aminosäu-ren, DNA und RNA verwendet werden kann [14].

Ebenso essentiell für das Wachstum ist Stickstoff. Mögliche wirtseigene Stick-stoffquellen für C. albicans sind Aminosäuren, Peptide und Proteine. Das Candi-da-Genom kodiert 20 Aminosäure-Permeasen, die die aktive Aminosäureaufnahmevermitteln. Des weiteren können zwei Ammonium-Permeasen gebildet werden, diedurch die Gene MEP2 und MEP3 kodiert werden. Die Familie der sekretiertenAspartyl-Proteinasen (SAPs, siehe Kapitel 1.1.4.4 ) ermöglichen den Aufschluss ex-trazellulärer Wirtsproteine. Die dadurch entstehenden Oligopeptide, werden durchOligopeptid-Transporter (OPT1-OPT8) in die Zelle transportiert. Es konnte gezeigtwerden, dass diese Proteine induziert werden, wenn C. albicans mit Neutrophilen co-

6 Einleitung

kultiviert oder durch Makrophagen phagozytiert wird [15, 13, 16].

Nahezu alle Mikroorganismen benötigen Eisen (Fe3+) für ihr Wachstum. Eben-so ist Eisen für verschiedene wirtseigene metabolische Prozesse unverzichtbar. Umdieses limitierte Ion zu sichern, hat der Wirt Verteidigungsstrategien entwickelt.So liegt Eisen nicht frei vor, sondern wird an Eisenspeicherproteinen gebunden.Man spricht hier von Nahrungsmittel-Immunität (Nutritional Immunity). Zu diesenSpeicherproteinen zählen Hämoglobin, Transferrin, Lactoferrin, Ferritin. Mikroorga-nismen haben wirksame Gegenmechanismen entwickelt. C. albicans nutzt beispiels-weise drei hochaffine Aufnahmesysteme. Das erste System umfasst ein Reduktase-Permease-System, das sich aus den Eisenpermeasen Ftr1 und Fet3 sowie dem Kup-fertransporter Ccc2 zusammensetzt. Das Siderophor-Aufnahmesystem besteht ausdem Transportern Arn1/Sit1 und das Hämoglobin-Aufnahmesystem aus dem Hä-moglobinrezeptor Rbt5 und der Hämoxygenase Hmx1 [17, 18, 9].

C. albicans besitzt nicht nur die Fähigkeit, sich an einzelne sich ändernde Nähr-stoffbedingungen anzupassen, sondern auch schnell auf sogenannte Stressbedingun-gen zu reagieren. Zu den Stressoren zählen hierbei unter anderem Temperatur- oderpH-Wert-Wechsel der Umgebung, aber auch hohe Mengen an Sauerstoff oder CO2sowie die Größe des osmotischen Drucks. Eine Kombination aus mehreren Stressorenist möglich. Im folgenden sollen zwei Beispiele näher erläutert werden:

C. albicans kann im Magen bei pH 2, aber auch im leicht alkalischen Blut (pH4-7,6) überleben. Ebenso kann Candida im aziden Milieu der Vagina (pH4,4) dieSchleimhäute besiedeln. Die Detektion des pH-Wertes erfolgt über Oberflächensen-soren (z.B. DFG16), die Regulation über das Rim101-Signalsystem [19, 20, 9].

Im Laufe des Infektionsprozesses ist C. albicans unterschiedlichen Sauerstoffbe-dingungen ausgesetzt und muss demzufolge den Metabolismus diesen Bedingungenanpassen. Auf der Haut und in der Mundhöhle beispielsweise liegen aerobe und semi-aerobe Bedingungen vor, im Darm anaerobe Bedingungen. So hat C. albicans Wege,reaktive Sauerstoffspezies (ROS) über die Atmungskette zu entgiften [21] und durchFermentation gebildete Säuren und Ethanol metabolisch zu nutzen (siehe Abbildung1.1).

1.1.4.2 White-Opaque Switching

Trotz fehlendem oder noch nicht vollständig gezeigtem Sexualzyklus zeigt das Ge-nom von C. albicans eine sehr starke Anpassungsfähigkeit an seine Umwelt. Nahezujedes Gewebe kann in Anhängigkeit vom Immunstatus des Wirts angegriffen wer-

Einleitung 7

den. Mit Hilfe des Multi-Locus Sequence Typing (MLST) konnten C. albicans-Isolatein 17 Gruppen unterteilt werden. Diese Untergruppen korrelieren mit dem geogra-phischen Gebiet ihrer Isolation und zeigen Unterschiede hinsichtlich der Resistenzgegenüber antifungischen Substanzen und der Struktur von Adhäsionsproteinen inder Zellwand [22]. Der komplizierte Mechanismus des Matings ist ein Grund für die-se Diversität. Ein wesentlicher Teil des Matings ist das sogenannte „White-Opaque-Switching“ [23]. Hierbei handelt es sich um einen spontanen und reversiblen Wechsel(Frequenz 1:1000) zwischen zwei Erscheinungsformen von Candida albicans auf fes-tem Medium: der „weißen“ und der „opaken“ Form. Während die weißen Kolonieneine rund, hemisphärische Form aufweisen und aus runden bis ovalen Zellen beste-hen, sind die Kolonien der opaken Form flach und grau und ihre Zellen langgezogenbis bohnenförmig. Nur opake Zellen können den Prozess des Matings vollziehen.

Kontrolliert wird dieser Mechanismus durch den Mating-Typ Locus (MTL). Die-ser besteht aus zwei Allelen (siehe Abb. 1.3). Weiße Zellen sind normalerweise he-terozygot im MTL (Mat a/α). Ein Wechsel zu der opaken Form ist nur möglich,wenn die Zellen homozygot im MTL sind (Mat a/a bzw. Matα/α). Das Mating istwiederum nur unter den beiden verschiedenen homozygoten opaken Formen mög-lich. Reguliert wird dieser Wechsel durch den Transkriptionsfaktor Wor1, der die

Abbildung 1.3: Parasexueller Zyklus von Candida albicans . (A) Die diploide Hefeform, die

homozygot (a/a oder α/α) im MTL ist, kann einen phenotypischen Wechsel von dem wei-

ßen in den Mating-kompetenten opaken Zustand vollziehen. Ein Mating opaker Zellen des

gegensätzlichen Mating-Typs führt zur Bildung einer tetraploiden aa/αα Zygote, die durch

Chromosomenverlust in den diploiden Zustand zurückkehrt. (B) Der Transkriptionsfaktor

Wor1 verstärkt seine eigene Transkription und die der Gene der opaken Phase. In Zellen,

die heterozygot im Matingtyp sind, wird die Expression von Wor1 durch den heterodime-

ren Genregulator a1/α2 reprimiert, so dass die Zellen in der weißen Form verbleiben und

somit kein Mating vollziehen können nach [24].

8 Einleitung

Transkription von Genen der opaken Form initiiert und sich selbst positiv reguliert.Der im heterozygoten Zustand des MTL gebildete heterodimere Repressor a1/α2inhibiert Wor1. Somit wird der weiße Zustand stabilisiert. Unter seltenen Umstän-den können die Konzentrationen des Transkriptionsfaktors jedoch ansteigen. DieSelbstverstärkung und somit die Transkription der opaken Gene beginnt. Alle Vor-aussetzungen für den Wechsel zur opaken Wachstumsform und somit zum Matingsind gegeben. Nach dem Entstehen der tetraploiden Zygote kommt es jedoch nichtzur Meiose. Hierfür fehlen C. albicans essentielle Regulatoren. Der diploide Statuswird durch Chromosomenverlust wiederhergestellt, so dass man bei dieser Art ge-netischer Rekombination eher von einem parasexuellen als von einem sexuellen Wegsprechen kann [25, 24].

1.1.4.3 Dimorphismus

Dass C. albicans ein großes Spektrum morphologischer Veränderungen als Anpas-sung an die verschiedenen Begebenheiten im Wirt besitzt, soll auch das folgendeCharakteristikum zeigen, das sich C. albicans in der Gruppe der Candida-Spezies nurmit C. dubliniensis teilt. C. albicans kann zwischen vier verschiedenen Wachstums-morphologien wechseln (siehe Abbildung 1.4). Man spricht von Dimorphismus undunterscheidet hauptsächlich zwischen Hefeform (Blastoconidien) und echten Hyphenund den Wachstumsformen der Pseudohyphen und Clamydosporen [26]. Die letztereForm der Clamydosporen ist bisher am wenigsten in ihrer Funktion aufgeklärt. Eshandelt sich hierbei um große, runde Zellen, die eine auffällige dicke Zellwand aufwei-sen. Gebildet werden sie in bestimmten nährstoffarmen Medien [27]. Das Wachstumin der runden bis ovalen Hefeform erfolgt hauptsächlich bei 30◦C und azidem pH-Wert durch Zellteilung. Die echten Hyphen werden bei einer Umgebungstemperaturvon 37◦C und neutralem pH-Wert sowie Anwesenheit von Serum und hohem CO2Gehalt gebildet. Sie erscheinen 30 - 60min nach Induktion als langgestreckte, polari-sierte Ausläufer ohne Septum an der Knospungsstelle. Innerhalb der langgestrecktenHyphe, jedoch nicht an der Knospungsstelle, können durch Zellteilung entstandeneSepten erkennbar sein. Ein Wachstum in dieser Morphologie erscheint nach 24 h alsMyzel.

Die in ihrer Länge sehr variablen Pseudohyphen entstehen durch Teilung. Eskommt hierbei aber nicht zu einer vollständigen Trennung von der Mutterzelle. Diein die Länge wachsenden Knospen behalten eine Einschnürungen an der Knospungs-stelle. Die äußeren Bedingungen, die die Ausbildung von Pseudohyphen induzieren,

Einleitung 9

Abbildung 1.4: Morphologische Wachstumsformen von Calbicans. Hefe und Hyphenform

treten während der Infektion hauptsächlich auf. Tochterzellen und ihr Entstehungsort sind

durch gepunktete Linien dargestellt. nach [28]

nehmen eine Zwischenstellung zwischen denen der Hefen- und Hyphenbildung ein.Es wird vermutet, dass auch die Morphologie einem Zwischenstatus entspricht.

C. albicans kann, wie in Abbildung 1.4 gezeigt, zwischen den Wachstumsformenwechseln. Diesem Wechsel liegt ein verzweigtes regulatorisches Netzwerk zugrunde.Infolge verschiedener äußerer Signale wie z.B. Temperatur, CO2-Gehalt, pH-Wert,Verfügbarkeit von Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen werden unterschiedliche Si-gnalkaskaden angeschaltet (für eine genaue Beschreibung der Signalwege siehe Ab-bildungstext zu Abbildung 1.5). Als Beispiel für ein wachstumsformregulierendesSignal sei hier das Quorum-Sensing Molekül Farnesol genannt. Quorum-Sensing istein Prozess, der der Kommunikation zwischen Zellen dient. Extrazelluläre Signalmo-leküle ermöglichen die Interaktion zwischen Mikroorganismen. Unter Prokaryontenist dies lang bekannt und gut untersucht, für Candida ssp. ein sehr neu beschriebenesPhänomen. In Kulturen mit hoher Zelldichte setzt C. albicans unter anderem Far-nesol frei, das das Hyphenwachstum inhibiert und das Wachstum in der Hefeforminduziert [29].

Bisher konnte nicht gezeigt werden, dass eine bestimmte Wachstumsform im di-rekten Zusammenhang mit der Entwicklung von Krankheiten steht oder bestimmend

10 Einleitung

Abbildung 1.5: Signaltransduktionswege, die zu der Expression hyphenspezifischer Ge-

ne führen. Umgebungsparameter aktivieren verschiedene Signalwege, die zu der Aktivie-

rung unterschiedlicher Transkriptionsfaktoren (TF) führen. Der cAMP-abhängige Signal-

weg zielt auf einen der Schlüsselfunktions-tragenden TF Efg1 (enhanced filamentous grow-

th protein 1 ). Hier vereinen Adenylylzyklasen verschiedene Signale in Ras-abhängige und

Ras-unabhängige Wege. Durch den TF Tup1, dessen Ziel Promotoren hyphenspezifischer

Gene sind, wird durch die DNA-bindenden Proteine Nrg1 und Rfg1 (Rox1p-like regulator

of filamentous growth) eine negative Regulation hergestellt. Die Eigenschaften der Prote-

ine ist wie folgt farblich kodiert: MAPK(mitogen-activated protein kinase)-Wege (grün),

cAMP-Weg (türkis), TF (orange), negative Regulatoren (gelb), Matrix-einschließender Weg

(hellblau), pH-regulierter Weg (braun), weitere involvierte Faktoren (lila). [30]

für das Ausmaß der Infektion ist. Vielmehr scheint das Zusammenspiel beider For-men, also der mögliche Wechsel zwischen den Morphologien, wichtig zu sein [31].So wird vermutet, dass die Hefeform für die Verbreitung von C. albicans in derBlutbahn notwendig ist, wohingegen die filamentöse Wachstumsform für das Durch-

Einleitung 11

brechen von Barrieren unverzichtbar ist. Deutlich wird auch, dass die Expressionvon Zellwandproteinen, wie z.B. von Adhäsinen und extrazellulären Proteasen (sie-he Kapitel 1.1.4.4), zwischen den Wachstumsformen sehr stark variiert [32].

1.1.4.4 Adhärenzproteine

Der erste wichtige und initiale Schritt in der kommensalen Beziehung und im Infek-tionsprozess ist die Adhärenz des Pathogens an den Wirt. Dies wird durch biomole-kulare Adhäsine vermittelt, die eine Bindung zwischen C. albicans und Wirtszellenoder Wirtszellliganden herstellen [31]. Eine Auswahl dieser Adhäsine soll im Folgen-den näher beschrieben werden. Eine Vielzahl weiterer interessanter Proteine ist ander Adhärenz von C. albicans an Wirtszellen beteiligt, wie z.B. Mannan-, Lectin-und Fimbrien-Adhäsine. Jedoch konnten für diese die kodierenden Gene noch nichtisoliert werden.

Als-Proteine (agglutinin-like sequence proteins) sind eine Proteinfamilie, die achtGlycoproteine, Als1-7 und Als9, umfasst. Diese binden eine Reihe von Wirtszel-len und Proteinen der Extrazellulären Matrix (ECM). Sie weisen typische Merk-male sekretierter Proteine auf. Ihr hydrophober Carboxyl-Terminus ähnelt einemGlycosylphophatidylinositol(GPI)-Anker. Die Als-Proteine gehen eine Bindung mitden Aminotermini von Wirtsproteinen ein. Insbesondere Als1p und Als5p(Ala1p)scheinen adhäsive Funktionen zu erfüllen. So ist das Protein Als1p für die Infektionim Mausmodell essentiell. Die Expression der Als-Proteine erfolgt nicht simultansondern abhängig von äußeren Bedingungen und der Morphologie von C. albicans[33].

Hwp1p (hyphae wall protein) ist ein Hyphen- und Keimschlauch-spezifisches Man-noprotein, das an der Oberfläche lokalisiert ist. Der Carboxyterminus ist kovalentin der Zellwand an β-Glucane gebunden. Die exponierte aminoterminale Domä-ne weist eine aminoterminale Sequenz auf, die als Substrat für Transglutaminasen(TGasen) fungiert. Daher können kovalente stabile Bindungen zu Wirtszellen ent-stehen. C. albicans imitiert auf diese Weise Wirtsproteine. Man spricht hierbei vonmolekularem Mimikry. Mutanten, die für das Gen hwp1 deletiert sind, zeigen einereduzierte Virulenz im Mausmodell [34].

Eap1p (enhanced adherence to polystyrene protein 1 ) ähnelt in seiner Strukturdem Adhäsin Als3. So weist es am Aminoterminus eine Substratbindungsdomäne

12 Einleitung

und am Carboxyterminus einen GPI-Anker auf. Es konnte gezeigt werden, dass Eap1die Adhärenz an Plastikoberflächen (Polysteren) verstärkt und wichtige Funktionenin der Adhärenz von C. albicans an die Nierenepithelzelllinie HEK293 sowie in derBildung von Biofilmen hat [35].

Iff4p ist ein oberflächenexprimiertes Protein, dass wie 11 weiter Proteine zur Iff-Familie gezählt wird. Auch dieses Protein besitzt eine GPI-Ankersequenz. Überex-pressionsanalysen mit Iff4 zeigten eine verstärkte Adhärenz von C. albicans an oraleEpithelzellen und eine erhöhte Virulenz im Mausmodell, aber auch eine stärkereEmpfindlichkeit gegenüber der Tötung durch Neutrophile [36].

Int1p ist ein putativ Integrin-ähnliches Protein. Es zeigt Ähnlichkeit zu humanenIntegrin-Domänen und zum Fibrinogen-bindenden Protein ClfAp von Staphylococcusaureus. Deletionsmutanten weisen reduzierte Adhärenz und Virulenz an Epithelzel-len auf und einen Defekt in der Hyphenbildung [37].

Mnt1p, eine α-1, 2-Mannosyltransferase, ist essentiell für die Synthese von Man-noproteinen. Deletionsmutanten zeigen eine gestörte Bindung untereinander und zuverschiedenen Epithelzellen. sowie eine reduzierte Virulenz im Mausmodell. Diesläst vermuten, dass die Mnt1p-vermittelte Mannosylierung für die Adhäsion undVirulenz von C. albicans wichtig ist [38].

1.1.4.5 Invasion-vermittelnde Enzyme

Die erfolgreiche Invasion von Wirtszellen setzt die Penetration und die Zerstörungder Zellhülle voraus. Dieser als Transmigration bezeichnete Prozess wird haupt-sächlich durch physikalische und/oder enzymatische Mittel bewirkt. Die häufigstenchemischen Bestandteile der Oberfläche von Wirtszellen sind Phospholipide undProteine. C. albicans hat ein reiches Spektrum an Enzymen entwickelt, die eine Zer-störung der Zellmembranbestandteile und somit eine Invasion ermöglichen [39]. Zudiesen Enzymen zählen Phospholipasen und Proteinasen, die im Folgenden näherbeschrieben werden:

SAP Bei der Familie der sekretierten Aspartyl-Proteinasen (SAP) handelt es sichum eine Gruppe von 10 Proteinasen, die es C. albicans ermöglichen, Proteine alsalleinige Stickstoff-Quelle zu nutzen [40]. Die Proteinasen Sap1-8 werden sekretiert,

Einleitung 13

Sap9 und 10 sind membranverankerte GPI-Proteine [41]. Die Expression der SAP-Proteine ist abhängig von der Wachstumsphase und den umgebenden Bedingungen.Ihre genaueren Funktionen sind noch unklar [42]. Untersuchungen weisen jedoch dar-auf hin, dass im Vergleich zur oberflächenzerstörenden Funktion der SAP-Proteinedie Proteolyse intrazellulärer Verbindungen eine größere Rolle spielt [43].

Extrazelluläre Phospholipasen sind eine heterogene Gruppe von Enzymen, diealle die Fähigkeit besitzen, Esterverbindungen in Glycerolphospholipiden zu hydro-lysieren. Bisher wurden 4 Phopholipasen-kodierende Gene in C. albicans identifiziert:PLA, PLB, PLC, PLCD [31]. Die Funktionen sind im einzelnen nicht bekannt. Ver-suche zeigen jedoch, dass sie wichtig sind für die Penetration von Wirtszellen unddie Adhäsion an Epithelzellen [41]. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass dieDeletionsmutante ∆PLB1 eine geringere Virulenz im Tiermodell aufweist [39].

Extrazelluläre Lipasen ermöglichen es C. albicans durch die Spaltung von Es-terbindungen Lipide als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Bisher wurden 10 Lipasen-kodierende Gene (LIP1-10) identifiziert, die eine Homologie von bis zu 80% in ihrerAminosäuresequenz aufweisen. Die genaue Funktion der Lipasen ist im einzelnennoch nicht geklärt [41].

1.2 Die Interaktion Candida albicans - Wirt

Allein die Tatsache, dass Candida albicans als kommensaler Mikroorganismus beivielen Menschen Teil der normalen Mikroflora in verschiedensten Bereichen des Kör-pers ist, wie zum Beispiel der Haut, der Schleimhäute oder des Gastrointestinaltrak-tes [2], lässt vermuten, dass bereits die „gesunde Interaktion“ zwischen Wirt undC. albicans einen äußerst komplexen Gleichgewichtszustand darstellt. Die vielfälti-gen Möglichkeiten die einen Wechsel in eine pathogene Besiedlung des Wirts herbei-führen, vergrößern die Komplexität des Interaktionssystems und sind das Ergebniseiner langen Co-Evolution des Pilzes und des Menschen. Dabei kam es nicht nur zueiner Anpassung des menschlichen Immunsystems in Bezug auf Mechanismen derErkennung und der Wachstumskontrolle des Pilzes. Ebenso entwickelte C. albicansMechanismen, Veränderungen der Wirtsumgebung zu detektieren und darauf zu rea-gieren [44]. Im Folgenden sollen die Systeme, die diese Interaktion vermitteln, nähererläutert werden. Dabei spielen die beschriebenen spezifischen Virulenzfaktoren, die

14 Einleitung

ebenso variieren wie die Antwort der Wirtszellen, eine Rolle und bestimmen überdas Ausmaß der Infektion.

1.2.1 Adhärenz

Unabhängig davon, ob C. albicans einen Wirt als Kommensale besiedelt oder alsPathogen schwerwiegende Krankheiten hervorruft, initial ist die Adhärenz des Mi-kroorganismus an Epithelzellen. Dabei korreliert die Virulenz des Pathogens direktmit seiner Fähigkeit an den Wirtszellen zu adhärieren [45]. Zu den hierfür wichtigs-ten molekularen Elementen zählen die in Kapitel 1.1.4.4 beschriebenen Adhäsinevon Candida albicans. Diese vermitteln zum Teil eine kovalente Bindung des Patho-gens an die humanen Zellen. Außerdem spielt die Hydrophobizität von C. albicanseine Rolle. Diese ist durch physikalische Eigenschaften der Pilzzellwand bestimmtund wird durch die Morphologie und Kultivierungsmethode von C. albicans beein-flusst. Hydrophobe Zellen adhärieren einfacher an Wirtszellen und sind resistentergegenüber der Tötung durch Phagozytose als hydrophile Zellen, da sie weniger Phos-phomannanketten besitzen, die als Erkennungsmotiv für die Immunzellen dienen[46, 47].

1.2.2 Erkennung von C. albicans

Die wichtigste Eigenschaft des angeborenen Immunsystem eines Lebewesens istdie Fähigkeit „eigen“ und „fremd“ unterscheiden zu können. Dies erfolgt durchKeimbahn-kodierte, oberflächenexprimierte Rezeptoren, die aufgrund ihrer Fähig-keit fremdartige Strukturen zu erkennen, pattern recognition receptors (PRRs) ge-nannt werden [48]. Sie werden auf verschiedensten humanen Zellen exprimiert, wiez.B. Zellen der oralen Schleimhaut, primären neutrophilen Granulozyten (PMNs),Dendritischen Zellen, Monozyten, Makrophagen, B-Zellen und Epithelzellen. Zuden PRRs zählen unter anderem die membrangebundenen Toll-like Rezeptoren(TLRs), C-Typ Lectin Rezeptoren (CLRs), die zytoplasmatischen NOD-like Rezep-toren (NLRs) und RIG-I-like Rezeptoren (RLRs). Nicht alle PRRs werden in jedemZelltypen und in allen Regionen des Wirtes gleich exprimiert.

Jedes Ligand-Rezeptor System aktiviert spezifische intrazelluläre Signalwege.Durch diese kommt es wiederum zur Aktivierung verschiedener Komponenten derImmunantwort des Wirts. So werden antimikrobielle Peptide, Zytokine, Chemokineund co-stimulierende Moleküle verstärkt exprimiert, die ihrerseits ein breites Wir-kungsspektrum haben. Somit vermitteln PRRs zwischen angeborener und adaptiver

Einleitung 15

Immunantwort.

Die PRRs erkennen typische oberflächenexprimierte, mikrobielle Strukturen, diezusamengefasst werden als PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) [49]. ImFall von C. albicans zählen zu der Gruppe der PAMPs die Zellwandbestandteile Chi-tine, Mannane, Phospholipomannane und Glucane [50]. Im Folgenden sollen einzelneVertreter der PRRs, die in der Erkennung von Candida albicans eine bedeutendeRolle spielen, näher beschrieben werden. Die Abbildung 1.6 zeigt eine Übersicht dergenannten Rezeptoren.

1.2.2.1 Toll-like Rezeptoren

Die TLRs sind die bisher am ausführlichsten analysierten Rezeptoren in der Gruppeder PRRs. Sie sind evolutionär konserviert und reagieren auf bakterielle, virale undfungische Antigene oder endogene Faktoren, die infolge von Zellverletzung freigesetztwerden. Bisher wurden dreizehn TLRs identifiziert, wovon zehn funktionell im Men-schen sind. Die Rezeptoren TLR1, TLR2 und TLR4-6 sind plasmamembranassozi-iert, TLR3 bzw. TLR7-9 sind an den Lysosomen oder den Endosomen lokalisiert [52].TLRs besitzen N-terminale Leucin-reiche Repeats (LRRs), die für die Erkennung dermikrobiellen Strukturen verantwortlich sind. Sie haben außerdem eine transmem-brane Region, sowie eine zytoplasmatische TIR-Domäne (Toll-/Interleukin-1(IL-1)-Rezeptor). Durch Ligandenbindung erfolgt die Bindung von Adaptermolekülen undsomit die Anregung der Signalwege, die zur Aktivierung von Transkriptionsfaktorenführen. Es kommt zu der verstärkten Transkription von antimikrobiellen Peptiden,Zytokinen und Chemokinen. Somit beeinflusst die Anregung der TLRs die Aktivitätanderer Zellen des Immunsystems [49, 52].

Bei der Erkennung von C. albicans spielen vor allem TLR2 und TLR4 eineRolle. Phospholipomannane und β-Glucane sind die Liganden des TLR2 und O-verbundene Mannane die des TLR4. Diese Rezeptoren werden vor allem in myeloi-den Zellen exprimiert. Aber auch Epithelzellen weisen, wenn auch für TLR4 nur insehr geringen Mengen, diese beiden Rezeptoren an ihrer Oberfläche auf. Des weiterenkonnte gezeigt werden, dass TLR9 C. albicans-DNA erkennt und die Zytokinproduk-tion in Dendritischen Zellen induziert [51, 53, 50, 54]

1.2.2.2 CLRs

Bei den C-Typ Lectin-Rezeptoren handelt es sich hauptsächlich um membranas-soziierte Rezeptoren, die mindestens eine Kohlenhydraterkennungsdomäne (carbo-

16 Einleitung

Abbildung 1.6: Übersicht der wichtigsten PRRs (Pattern Recognition Receptors) bei der

Erkennung von Candida albicans. Der lösliche Lectinrezeptor (Mannose-binding lectin -

MBL) bindet Mannose-reiche Strukturen von C. albicans. Der membranassoziierte C-Typ

Lectin Rezeptor (macrophage mannose receptor 1 - MMR), der für Dendritische Zellen spe-

zifische DC-SIGN (ICAM3-grabbing non-integrin) und der Makrophagen-induzierbare Re-

zeptor MINCLE erkennen ebenso Mannose-reiche Strukturen. Dectin-1 bindet β-Glucane

und Dectin-2 erkennt in Kombination mit dem Fcγ-Rezeptor (FcγR) Mannane (Manno-

sepolymere). Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) kann O-linked Mannane, TLR2 kann Phospho-

lipomannane oder zusammen mit Galectin-3 β-Mannoside erkennen. TLR9 ist im Zytosol

lokalisiert und bindet fungische DNA. Der NOD-like Rezeptor NLRP3 (NOD-, LRR- and

pyrin domain-containing 3 ) bildet zusammen mit Apoptose-assoziierten Speck-like Pro-

teinen einen Inflammasom-Komplex, der eine Caspase-rekrutierende Domäne (ASC) und

das Enzyme Caspase 1 einschließt. Die Liganden, die das NLRP3-Inflammasome aktivieren

sind bisher unbekannt. CARD9 - caspase recruitment domain-containing protein 9 ; IFNs -

Interferone; IL-1β - Interleukin-1β; NF-κB - nuclear factor-κ B (nach [51])

hydrate recognition domain - CRD) besitzen und Kohlenhydrate Calcium-abhängigbinden. Sie können somit Polysaccharidstrukturen von Mikroorganismen detektie-ren [52]. Es handelt sich hierbei um eine sehr große Gruppe von Rezeptoren, dieeine wichtige Rolle in der Erkennung von Pilzen spielt. Diese Rezeptoren induzierendie Produktion von Zytokinen und beeinflussen somit die angeborene und adapti-

Einleitung 17

ve Immunantwort. Darüber hinaus vermitteln sie die Aufnahme von C. albicans indie Zellen z. B. durch Phagozytose. Einige der CLRs werden im Folgenden näherbeschrieben:

Die Rezeptoren Dectin-1 (CLEC7A) und Dectin-2 (CLEC6A) sind auf der Ober-fläche von Dendritischen Zellen, Makrophagen und Neutrophilen zu finden. Dectin-1konnte auch auf Ephitelzellen nachgewiesen werde [54]. Dieser Rezeptor detektiertβ-1,3-Glucane, Dectin-2 erkennt α-Mannose [55, 56].

Der Mannose-Rezeptor (MR) (auch Macrophage Mannose Receptor 1 - MMR)bindet verzweigte N -gebundene Mannane und wird hauptsächlich von Makrophagenund Dendritischen Zellen exprimiert [57].

DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM-3-grab-bing non-integrin) wird wie derMR von Makrophagen und Dendritischen Zellen exprimiert und erkennt α-verknüpfte Mannanosestrukturen [58]. Der hauptsächlich auf Makrophagen expri-mierte Rezeptor Galectin-3 bindet β-1,2 Mannoside [59].

Ebenso soll das lösliche MBL (mannose-binding lectin) erwähnt werden, dassdie Bindung der Mannane sowie die Opsonisierung und Aufnahme von C. albicansvermittelt [60]. Weitere CLRs sind Mincle und SCARF/CD36 (scavenger receptorclass F protein), deren Liganden jedoch noch nicht identifiziert werden konnten [61,62].

1.2.2.3 NLRs

Die zytoplasmatischen NOD-like Rezeptoren (NLRs) erkennen intrazelluläre Patho-gene. Charakteristisch für sie sind eine Nukleotidbindungsdomäne und Leucin-reicheRepeats. Für die Erkennung von C. albicans als wichtig erachtet wird NLR3P, wel-ches sich innerhalb eines Proteinkomplexes, der Inflammasom genannt wird, be-findet. Das durch intrazelluläre mikrobielle Stimuli aktivierte Inflammasom indu-ziert Caspase 1, die wiederum die Freisetzung von Zytokinen der Interleukin 1(IL-1)-Familie bewirkt [63].

1.2.3 Zytokine

Zytokine sind Signalmoleküle, die Differenzierung, Proliferation und Funktion vonSäugerzellen regulieren. Das bei einer Infektion vorliegende Zytokinprofil ist be-zeichnend und spezifisch für den Abwehrprozess eines pathogenen Organismus. Pro-inflammatorische Zytokine regulieren Leukozytentransport sowie -proliferation undaktivieren oxidative und nicht-oxidative metabolische Antworten der Zellen auf die

18 Einleitung

Infektion [64].

Aufgrund der Tatsache, dass Epithelzellen am häufigsten mit C. albicans in Kon-takt treten und in dieser Arbeit insbesondere auf die Interaktion von C. albicansmit Epithelzellen eingegangen wird, soll hier nur die Zytokinantwort dieser Zellenbeschrieben werden.

Epithelzellen schütten eine Vielzahl proinflammatorischer Zytokine als Antwortauf den Kontakt mit C. albicans aus, jedoch zeigen diese keinen direkten antifun-gischen Effekt [65]. Verschiedene Studien an oralen Epithelzellen, die an primärenZellen und an etablierten Zelllinien durchgeführt wurden, zeigten die Freisetzungder proinflammatorischen Zytokine IL-1α, IL-1β, IL-8, IL-18, TNFα und GM-CSFbei Interaktion mit C. albicans [64, 65, 66, 67, 68]. Multizelluläre Systeme aus Epi-thelzellen und Fibroblasten, die artifizielle Gewebekultursysteme darstellen, zeigtenähnliche Zytokinprofile mit Ausnahme von IL-6, das nur in diesen Versuchen nach-gewiesen werden konnte [69, 70, 71, 72]

Die Gruppe um Martin Schaller beschrieb ein Infektionsmodell basierend auf ei-nem kommerziell erhältlichem rekonstruierten humanen oralen Epithelium (reconsti-tuted human oral epithelium - RHE). Dieses dreidimensionale Mukosasystem zeigtebei der Infektion mit C. albicans ein ähnliches Zytokinprofil: IFNγ, TNFα, IL-1α,IL-1β, IL-6 und IL-8. Bei Anwesenheit von PMNs stiegen die Mengen der proin-flammatorischen Zytokine IL-1α, IL-1β, IL-6, GM-CSF und IL-8 an. Dies wurdevon einer Migration der Neutrophilen in das mukosale Epithelium begleitet [73].

Infolge der Expression der oben beschriebenen Zytokine erfolgt der Wechsel vomanti-inflammatorischen zum pro-inflammatorischen Zustand. Es kommt zur Frei-setzung von antimikrobiellen Peptiden (AMPs), wie Defensinen, Cathelicidin undHistatinen durch die Epithelzellen [74]. Diese AMPs kontrollieren das Wachstumvon C. albicans und somit die Infektion, worauf in Kapitel 1.3 näher eingegangenwird.

1.2.4 Phagozytierende Zellen

Phagozyten spielen im Prozess der Kontrolle von Candida-Infektionen eine entschei-dende Rolle. Insbesondere PMNs sind unverzichtbar bei der Bekämpfung von ober-flächlichen aber auch invasiven Kandidosen [75]. Die Rekrutierung der Neutrophilenzum Infektionsherd wird durch die Ausschüttung einer Reihe von Zytokinen stimu-liert.

Monozyten und Makrophagen stellen eine weitere Gruppe der phagozytieren-

Einleitung 19

den Zellen dar. Die Wichtigkeit ihrer Funktionen in der Bekämpfung von Candida-Infektionen wird kontrovers diskutiert [50].

Die sich in der Haut und in Schleimhäuten befindenden und dort patrouillierendenDendritische Zellen (DCs) nehmen eingedrungene C. albicans über die RezeptorenMR und DC-SIGN auf [76, 58]. Dies führt zur Prozessierung und Präsentation vonCandida-spezifischen Antigenen über die Haupthistokompatibilitätskomplex KlasseII (MHCII)-Moleküle.

Hefe- und Hypheform von C. albicans lösen in den DC unterschiedliche Reaktio-nen aus. Während die Hefeform eine T-Helferzellen Typ1(Th1)-Antwort induziert,aktiviert die Hyphenform eher eine Th2-Antwort. Somit bilden die DCs die Brückezwischen angeborener und adaptiver Immunantwort.

Phagozyten töten C. albicans sowohl intrazellulär als auch extrazellulär. Nach derPhagozytose des Pathogens und der Fusion der Lysosomen mit den Phagosomen zuPhagolysosomen erfolgt die Inaktivierung des Pathogens durch hydrolytische Enzy-me, antimikrobielle Peptide und reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species- ROS) [77].

1.2.5 Evasionsstrategien

Candida albicans wäre kein so erfolgreiches Pathogen, wenn es nicht im Laufe derEvolution Mechanismen herausgebildet hätte, um die beschriebenen Verteidigungs-mechanismen des Wirts zu umgehen. Zu diesen zählt unter anderem der Morpho-logiewechsel zwischen der Hefe- und der Hypheform (siehe Kap. 1.1.4.3). Dieser giltals der Hauptvirulenzfaktor. Deletionsmutanten in den Genen efg1 und cph1 sindavirulent bzw. weniger virulent im Mausmodell [78]. Des weiteren zeigen Mutan-ten, die entweder zum Wachstum in der Hyphen- oder der Hefenform befähigt sind,eine deutlich geringere Virulenz als Wildtystämme [32, 79]. Die Fähigkeit der Hy-phenbildung ermöglicht es C. albicans außerdem nach erfolgter Phagozytose aus denMakrophagen herauszuwachsen und diese damit zu töten. Untersuchungen zeigtenauch, dass die Hyphenform die Expression von β-Defensinen inhibiert [80]. Im All-gemeinen gilt die Hyphe als invasive Wachstumsform, die Hefeform ermöglicht diefreie Verteilung bei systemischen Infektionen.

C. albicans kann über zwei Wege in Epithelschichten eindringen. Zum einen er-möglichen die Candida-Adhäsine (siehe Kapitel 1.1.4.4), die bei Kontakt mit denEpithelzellen verstärkt exprimiert werden, eine aktive Penetration. Des weiterenist es C. albicans auch möglich, Endozytose zu induzieren. Dies erfolgt unter an-

20 Einleitung

Abbildung 1.7: Schematische Darstellung der Interaktion zwischen C. albicans und ange-

borenem Immunsystem des Wirts an mukosalen Oberflächen. Schwarze Linien markieren

Wirtsabwehrmechanismen. Rote Linien zeigen Candida Invasions- bzw. Fluchtmechanis-

men. [50]

derem durch das bereits beschriebene Phänomen des Mimikry. So ist das AdhäsinAls3 wirtseigenen Cadherinen sehr ähnlich. Es wurde gezeigt, dass Als3 an Zell-Zellkontakt-vermittelnden E-Cadherinen bindet und dies die Endozytose des Pilzesinduziert [81].

Durch die Beeinflussung der Expression der oberflächenassoziierten PRRs än-dert sich die Empfindlichkeit von Epithelzellen gegenüber der Candida-Infektion. Sokonnte gezeigt werden, dass infolge einer C. albicans-Infektion im oralen RHE-Modelldie Expression des TLR4 herunterreguliert wird [82]. Ebenso wird die Produkti-on von Zytokinen von C. albicans beeinflusst. So wird neben der in Kapitel 1.2.3genannten, durch Epithelzellen freigesetzten Zytokine auch das Hauptzytokin derTh17-Zellen, IL-17, bei einer Infektion mir C. albicans sekretiert [83]. Dieses Zytokinvermittelt eine Vielzahl proinflammatorischer Funktionen wie Neutrophilenrekrutie-rung, Aktivierung von Phagozytose und Induktion von AMP-Freisetzung.

Einleitung 21

Phagozytierte C. albicans inhibieren die Bildung der Phagolysosomen unterbin-den und zudem werden Katalasen und Superoxiddismutasen exprimiert, um die ROSzu inaktivieren [50]. Abbildung 1.7 zeigt eine Übersicht über die genannten Mecha-nismen, die es C. albicans ermöglichen, das Gleichgewicht der Interaktion zu denEpithelzellen zu beeinflussen.

1.3 Antimikrobielle Peptide

Antimikrobielle Peptide (AMP) zählen evolutionär gesehen zu den frühesten Ver-teidigungsmechanismen von Organismen. Als Teil des angeborenen Immunsystemsfinden sie eine weite Verbreitung im Reich der Pflanzen und Tiere. Die große Di-versität dieser Klasse spiegelt sich in den folgenden Zahlen wider: 2015 antimi-krobielle Peptide sind bisher identifiziert und in der Datenbank „The Antimicro-bial Peptide Database“ aufgeführt. Ein Drittel davon zeigt antifungische Aktivität(http://aps.unmc.edu/AP/main.php, Stand Juli 2012).

Alexander Fläming entdeckte 1922 die erste humane lösliche Substanz, die bakte-rizide und bakteriostatische Aktivität besitzt. Es handelte sich hierbei um Lysozym,das er erstmals aus dem Nasensekret eines Patienten mit akuter Rhinitis, später auchaus humanen physiologischen Flüssigkeiten und Geweben sowie Hühnereiweiß iso-lieren konnte [84]. Der außergewöhnlich große Vertreter der AMP ist bekannt durchseine membranzerstörende Aktivität aber auch durch seine nichtenzymatische Tö-tung von Bakterien [85].

1963 konnte durch Zeya und Spitznagel gezeigt werden, dass PMNs ein wichtigerSpeicher für antibakterielle Proteine sind. Sie untersuchten die Granula der PMNvon Kaninchen und Meerschweinchen und konnten zeigen, dass die antibakterielleWirkung auf lysosomale Proteine zurückzuführen ist, die während der Phagozytoseund Degranulierung zu den aufgenommenen Bakterien transferiert werden [86, 87].

1.3.1 Eigenschaften

Die meisten AMP zeigen ähnliche Eigenschaften. Sie sind kleine Peptide (10-50 Ami-nosäuren), tragen eine kationische Ladung und sind von amphipathischer Struktur[88]. Je nach Aminosäurezusammensetzung, Größe und Konformation werden sie inverschiedene Kategorien unterteilt. So gibt es AMPs mit einer α-helikalen Struk-tur, Peptide mit einer durch Disulfidbrücken stabilisierten β-Faltblattstruktur undPeptide mit einer langgestreckten oder ringähnlichen Struktur [89]. Ähnlichkeiten

22 Einleitung

zwischen den einzelnen AMPs zeigen sich auch bei den Aminosäuresequenzen. Sotreten die Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure sehr selten auf, wohinge-gen die kationische Aminosäuren Lysin und Arginin sehr häufig eingebaut werden.Die Aminosäuren Cystein und Tryptophan spielen eine Rolle in der Ausbildungstabilisierender Disulfidbrücken und hydrophober Interaktionen. An den C- und N-terminalen Positionen der Peptide ist Glycin häufig zu finden, da es stabilisierend aufdie Helixstrukturen und schützend vor Amino- und Carboxypeptidasen wirkt [90].Die amphipatische Struktur ermöglicht es den AMPs, mit den negativ geladenenPhopholipidgruppen und hydrophoben Fettsäureketten mikrobieller Membranen zuinteragieren. Dies führt zur Porenformation und der Zerstörung der Zellen innerhalbvon Minuten [91]. Einige Vertreter der AMPs können auch ohne Membranzerstörungin die Zellen gelangen. Ihre intrazellulären Ziele sind z.B. Störung der Bildung vonNukleinsäuren oder Inhibierung der Proteinsynthese. In Pilzen sind auch die Mit-ochondrien Angriffspunkte der AMPs [92]. Bereits durch die Einlagerung von AMPsin die Zellmembran des Pathogens kann eine Störung wichtiger Systeme, wie se-lektive Permeabilität, Aufrechterhaltung von Gradienten, zelluläre Energetik sowieMotilität, erfolgen und damit ein Zelltod ausgelöst werde.

Es existieren drei verschiedene Modelle, die die Membranzerstörung durch an-timikrobielle Peptide beschreiben. Diese sind in Abb. 1.8 graphisch dargestellt undwerden im folgenden Kapitel näher erläutert.

1.3.2 Wirkungsweisen von AMPs

1.3.2.1 Barrel-Stave Model

Das erste Modell ist das „Barrel-Stave Model “ (Tonne-Planken-Modell). Dieses Mo-dell beruht auf der Annahme, dass sich die hydrophoben Regionen der Peptide ent-lang der Acylketten der Membranlipide anordnen und die hydrophilen Regionen derPeptide die innere Oberfläche der Pore bilden. Nach der Bindung der Peptide an derMembranoberfläche, kommt es zu einer Verdünnung der Membran durch das Ein-dringen der hydrophoben Teile der AMPs und ein damit verbundenes Verschiebender Phospholipidköpfe in der Membran. Die in ihrer Anzahl variierenden kanalbil-denden Peptide formieren sich in einem Ring (barrel) um die entstehende Pore (sieheAbb. 1.8 links). Ist eine bestimmte Schwellenkonzentration des Peptides erreicht, ag-gregieren Peptid-Monomere und dringen tiefer in den hydrophoben Membrankernein. Die transmembranen Peptide und Peptidkomplexe bilden die Planken (stave)der Pore. Durch die Einlagerung weiterer Peptide vergrößert sich die Pore, bis ein

Einleitung 23

vollständiger Kanal ausgebildet wird, durch den die Zellflüssigkeit entweichen kannund das Pathogen getötet wird [93, 94, 90, 85].

1.3.2.2 Toroidal-Model

Ein weiteres Modell beschreibt die als „Toroidal- “ oder „Wormhole Model “(Ringloch-Modell) bezeichnete Theorie. Die an der Membran adhärierten Peptidebewirken ab einer bestimmten lokalen Konzentration durch das Eindringen ihrerhydrophoben Teile eine Krümmung der Membranoberfläche, was zu der Ausbildungeiner Pore führt. Die Peptide assoziieren hierbei über die gesamte transmembraneStrecke mit den Lipidkopfgruppen, so dass sie erst senkrecht zu der Membran ange-ordnet sind und schließlich mit dem inneren Teil des Phospholipidbilayers fusionie-ren. Es kommt zu der Ausbildung eines gekrümmten, aus AMPs und Lipidkopfgrup-pen bestehenden Monolayer, der die gesamte Pore wie ein Rundloch (toroidal hole)auskleidet (siehe Abb. 1.8 mitte). Wie im Barrel-Stave Model beschrieben kommt esauch hier zu einer Kanalbildung durch die die zytoplasmatische Flüssigkeit des Pa-

Abbildung 1.8: Modelle, die die Membranzerstörung durch antimikrobielle Peptide be-

schreiben. Die Peptide liegen unstrukturiert in Lösung vor. Nach der Bindung an Membra-

noberflächen und erfolgter Umstrukturierung dringen sie in den Phopholipidbilayer ein. In

Abhängigkeit der biophysikalischen Eigenschaften der Peptide erfolgt die Membranzerstö-

rung nach dem Barrel-Stave Model, dem Toroidal-Model oder dem Carpet-Model [90].

24 Einleitung

thogens entweichen kann. Diese Art der Poren wird durch eine Vielzahl mikrobiellerPeptide gebildet [85, 90, 94].

1.3.2.3 Carpet-Model

Einige Peptide zeigen eine eher diffuse Wirkung auf die Membranoberfläche undzerstören diese auf eine Art und Weise, die sich mit dem „Carpet-Model “ (Teppich-Modell) beschreiben läßt. Die AMPs binden in paralleler Orientierung an der Mem-bran und bedecken diese wie ein Teppich (carpet). Auch hier kommt es zu Phospho-lipidverschiebung und Änderung der Membranfluidität. Ab einer kritischen Schwel-lenkonzentration kommt es zu der peptidvermittelten Zerstörung der Membran, undsomit der Zelle. Dies erfolgt durch die Bildung von Mizellen (siehe Abb. 1.8 rechts),ähnlich dem Prozess der Membranzerstörung durch Detergenzien [94, 85].

1.3.3 Selektivität

Aufgrund der Unterschiede im Aufbau bakterieller und eukaryotischer Membranenhaben AMPs eine gewisse Selektivität (siehe Abbildung 1.9). Bakterielle Membranenweisen sowohl an der inneren als auch an der äußeren Seite der Phospholipiddop-pelschicht durch den Einbau von Phosphatidylglycerol und Cardiolipin eine starknegative Ladung auf. Zusätzlich ist die äußere Schicht mit negativ geladenen Mole-külen (wie LPS bei gram-negativen Bakterien) oder mit Molekülen mit aziden Ei-genschaften (Teichonsäure bei gram-positiven Bakterien) versehen, die die negativeLadung der Membran verstärken [94]. Eukaryotische Membranen zeigen diese starknegativ geladenen Phospholipide nur im zytosolischen Teil der Membran. Durch denEinbau zwitterionischer Phospholipide wie Phosphatidylcholin, Sphingomyelin oderPhosphatidylethanolamin, deren nach außen gerichteter Teil ungeladen ist, weistdie außere Hälfte der Membran eine neutrale Ladung auf [90]. Zusätzliche Choles-terineinlagerungen verstärken diesen Effekt und bewirken eine höhere Fluidität derLipiddoppelschicht [95].

1.3.4 AMPs als Regulatoren der Immunantwort

AMPs werden im Menschen konstitutiv in nahezu allen Geweben und Zellen expri-miert und durch Entzündung oder Verletzung induziert. Sie werden als „Cocktail“produziert, wobei jedes Gewebe sein eigenes Profil an AMPs aufweist [85]. Neben deraktiven Bekämpfung von Pathogenen haben sie auch immunregulatorische Funktio-

Einleitung 25

Abbildung 1.9: Bindungsverhalten antimikrobieller Peptide an Membranen eukaryotischer

und prokaryotischer Zellen. Aufgrund der stärkeren elektrostatischen und hydrophoben

Interaktionen binden AMPs überwiegend an den Membranen von Prokaryonten. Durch

den heterogenen Aufbau der eukaryotischen Membranen und dem Einbau von Cholesterin

basiert die Interaktionen zu AMPs nur auf hydrophoben Wechselwirkungen. [96]

nen. Sie wirken als Chemokine bzw. induzieren die Chemokinproduktion und spieleneine Rolle in der chemischen Anlockung von Lymphozyten oder Dendritischen Zellensowie T-Zellen. Außerdem haben AMPs Einfluss auf die Regulation des Zellwachs-tums und der Wundheilung. Somit können antimikrobielle Peptide als Verbindungs-element zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem gesehen werden. Eineschematische Übersicht über die Funktionen der AMPs ist in Abb. 1.10 dargestellt.

Als wichtigste Vertreter wird im Folgenden auf die Defensine und das Cathe-licidin, die hauptsächlich von Neutrophilen und Ephithelzellen produziert werden,näher eingegangen. Nennenswert sind außerdem die AMPs, die zur chemischen Haut-barriere gehören: Dermcidin, Psoriasin und RNase 7, sowie das in Speichelsekretenvorkommende Histatin. Für detaillierte Informationen zu diesen AMPs sei auf dassehr ausführliche Review von Wiesner und Vilcinskas verwiesen [85].

1.3.5 Resistenzentwicklungen von Pathogenen

Pathogene entwickeln fortwährend Mechanismen, Abwehrreaktionen des Wirtes zuumgehen. In Bezug auf die antimikrobiellen Peptide und deren Wirkungsweise istdies jedoch nicht trivial. Ihre Angriffsziele sind grundlegende Strukturen, die nur

26 Einleitung

Abbildung 1.10: Übersicht der Funktionen antimikrobieller Peptide in der Verteidigung des

Wirts gegenüber Pathogenen. AMPs induzieren verschiedenste Antworten in wirtseigenen

Immunzellen wie Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen und Epithelzellen. Sie verändern

die Genexpression der Wirtszellen, induzieren die Produktion von Chemokinen und Zytoki-

nen, vermitteln Leukozytentransport zum Infektionsherd, beeinflussen Zelldifferenzierung

und aktivieren bzw. blockieren TLR-Signalwege. Dies führt zum Schutz vor Infektionen,

zur Kontrolle von Entzündungen, vermittelt die Wundheilung und aktiviert die adaptive

Immunantwort. Dendritische Zellen - DC; Lipopolysaccharid - LPS, plasmazytoide dendri-

tische Zellen - pDC [89]

schwer verändert werden können. Die Interaktionen beruhen auf elektrostatischenund hydrophoben Wechselwirkungen mit Membranen und nicht auf spezifischen Pro-teinbindungsstellen, die durch Mutationen modifiziert werden könnten. Erschwerendkommt hinzu, dass Pathogene im Wirt einer Vielzahl von AMPs gleichzeitig ausge-setzt sind. Dennoch ist es einigen Mikroorganismen gelungen, die Anwesenheit vonAMPs zu detektieren und auf diese zu reagieren.

Man kann zwei Entwicklungstrategien für die Ausbildung von Resistenzen unter-scheiden. Zum einen gibt es konstitutive (passive) Eigenschaften, die zu einer re-duzierten Empfindlichkeit führen, aber unabhängig von der Anwesenheit des AMPsexprimiert werden. Im Gegensatz dazu werden die induzierbaren (adaptiven) Resis-tenzmechanismen nur bei Anwesenheit der AMPs induziert [92].

Einleitung 27

So kann eine Veränderung der angeborenen Charakteristik mikrobieller Phos-pholipidmembranen zu Resistenzen gegenüber AMPs führen. Einige Staphylococ-cus aureus-Stämme beispielsweise enthalten in ihrer Membran mehr Lysyl-Phospha-tidylglycerol. Dies ist ein weniger negativ geladenes Derivat des Phosphatidylglyce-rols. Somit wird die Ladung der Membranoberfläche im Vergleich zu anderen Sta-phylokokken reduziert [97, 98].

AMPs können leichter in mikrobielle Membranen eindringen, wenn das energe-tische Membranpotential hoch ist. Die Verringerung des Membranpotentials führtbei einigen Mikroorganismen, wie z.B. S. aureus, zur Resistenz gegenüber AMPs[92]. Ebenso ist für C. albicans gezeigt worden, dass Mutanten mit einem Defekt derRespiration als Folge von Mutationen in der mitochondrialen DNA eine Resistenzgegenüber Histatin-5 aufweisen. Dies hat zwei Gründe: Zum einen kann das AMPnicht in den Zellen akkumulieren und zum anderen benötigt es für seine volle Aktivi-tät ein Minimum an zellulärer Energie, die durch die mitochondriale ATP-Synthesegestellt wird [99]. Dies könnte auch erklären, warum Pilze, die sich im Dormanzzu-stand befinden, Resistenzen gegenüber antimikrobiellen Peptiden zeigen.

Ein weiterer konstitutiver Schutzmechanismus ist der Aufbau einer Kapsel oderGlycokalyx. Diese negativ geladenen Schutzschilde, die beispielsweise bei Gram-negativen Kokken aus Teichonsäure und Teichuronsäure aufgebaut sind, fangen ka-tionische AMPs ab [92]. Ebenso kann das von Pseudomonas aeroginosa produziertestark anionische Exopolysaccharid Alginsäure die positiv geladenen AMPs abfangen[100].

P. aeroginosa liefert ein weiteres Beispiel passiver Resistenzmechanismen. Das Pa-thogen ist in der Lage, Gewebe zu infizieren, die hohe Salzkonzentrationen aufweisen.Aufgrund der Tatsachen, dass viele kationische AMPs bei Anwesenheit großer Men-gen mono- und divalenter Kationen nicht ihre volle Wirkung entfalten können, hatP. aeruginosa als salzresistenter Organismus hier eine Nische gefunden, in der er dieWirkung der AMPs umgehen kann [92]. Ein weiteres Beispiel der Nischenbildungstellt die Bildung von Biofilmen dar. Diese Wachstumsform, zu der auch Candidaalbicans befähigt ist, bewirkt eine Ausgrenzung des Immunsystems des Wirts undbietet demzufolge auch Schutz vor antimikrobiellen Peptiden.

Antimikrobielle Peptide sind potentiell tödliche Stressoren, die in einigen Mi-kroorganismen die Herausbildung ausgeklügelter Antwortsysteme induzierten. Sobewirkt in diversen Gram-negativen Stämmen das PhoP/PhoQ Regulon eine um-fassende Veränderungen von Proteinen, Phospholipiden und Lipopolysaccharidenund induziert die Transkription sekretorischer und oberflächenassoziierter Proteine,

28 Einleitung

Enzyme und Peptidasen, die einen Schutz gegen AMPs vermitteln [101, 102, 103].

Die Degradation von AMPs durch Endopeptidasen wurde unter anderemfür Salmonella und Escherichia coli beschrieben [104, 105]. Ebenso sekretierenP. aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteusmirabilis and Streptococcus pyogenesProteasen, die das AMP LL-37 degradieren [106].

Des weiteren wurden von Pathogenen Transportsysteme entwickelt, die den Ab-transport eingedrungener AMPs regeln. So wurde für Neisseria gonorrhoeae dasenergieabhängige Transportsystem mtr [107] und für Yersinia das Transportersys-tem RosA/RosB beschrieben [108].

1.3.6 AMPs als Therapeutikum

In Zeiten des starken Anstiegs von Resistenzen gegenüber Antibiotika und Antimy-kotika ist das Interesse an neuen Wirkstoffen groß. Für den medizinischen Einsatzantimikrobieller Peptide spricht ihr breites Aktivitätsspektrum. So haben sie eineschädigende Wirkung auf viele Gram-negative und Gram-positive Bakterien sowiePilze, darunter auch Arzneimittel-resistente Stämme [109]. Das wissenschaftlicheFeld, das sich mit dem Einsatz antimikrobieller Peptide als Therapeutikum befasst,ist groß und neben den natürlich vorkommenden AMPs werden auch synthetischeDerivate getestet. Viele Substanzen befinden sich in frühen Phasen prae-klinischerUntersuchungen, andere sind bereits in der Phase III klinischer Studien angelangt.Die Kosten der Herstellung solcher Peptide und die Durchführung notwendiger Stu-dien sind hoch. Es stellt sich die Frage, ob in Hinblick auf die oben beschriebenenResistenzmechansismen (siehe Abschnitt 1.3.5) der Nutzen den Kostenfaktor auf-wiegt. Boman [91] liefert für die Verwendung antimikrobieller Peptide in der Medizinprägnante Gründe:

1. Kämen in der Therapie nicht-modifizierte Peptidstrukturen zum Einsatz, dieebenso in Mensch oder Tier gebildet werden, stelle dies keinen neuen Selek-tionsdruck dar. Mögliche Resistenzmechanismen hätten sich im Verlauf derEvolution längst entwickeln können.

2. Meist sind mikrobielle Membranen das Angriffsziel natürlicher aber auch mo-difizierter antimikrobieller Peptide. Experimente zeigten, dass es schwierig ist,Mutanten zu isolieren, die eine geänderte Membranstruktur besitzen. Zwarkonnten solche Mutanten hergestellt werden, aber nach Bomans Meinung be-einflussen die eingefügten Veränderungen die Vitalität der Mutanten in einem

Einleitung 29

Maße, das ein Überleben in der Natur erheblich einschränkt.

3. Sollen die therapeutischen Maßnahmen natürliche Prozesse nachahmen, solltestets mit einer Kombination antimikrobieller Peptide gearbeitet werden. Re-sistente Mutanten müssten dann so verändert sein, dass die Inhibierung derWirkung verschiedener Peptide simultan erfolgt. Dies erscheint sehr unwahr-scheinlich.

1.3.7 Defensine

Die wohl bekannteste Gruppe humaner antimikrobieller Peptide sind die Defensine.Sie sind charakterisiert durch sechs hochkonservierte Cysteinreste, die drei Disul-fidbrücken ausbilden. Aufgrund von Homologie und Lage der Disulfidbrücken unter-scheidet man α- und β- sowie ringförmige θ-Defensine.

Im Menschen wurden sechs α-Defensine (human neutrophil peptide(HNP) 1-4,HD-5 und HD-6), die konstitutiv exprimiert werden, und vier induzierbare β-Defensine (hBD1-4) identifiziert. Die Defensine HNP1 - 3 und in geringeren Men-gen auch HNP4 werden, wie in Tabelle 1.1 dargestellt, in Neutrophilen exprimiertund in ihren Granula gespeichert. HD-5 und HD-6 werden hauptsächlich von denPaneth-Zellen im Dünndarm sekretiert.

Die β-Defensine hBD1-4 werden in Leukozyten sowie in mukosalen und epithe-lialen Zellen produziert [85, 91]. Die Defensine werden aus größeren Vorläuferpro-teinen gebildet und haben umfassende immulatorische Aktivität. Sie modifizierenZellmigration und -reifung, induzieren Zytokine und regeln Histamin- und Prostag-landinD2-Ausschüttung von Mastzellen. β-Defensine sind zudem chemoattraktiv fürunreife DC- und Gedächtnis-T-Zellen [85, 110].

Die sehr kleine Gruppe der θ-Defensine wird in Altweltaffen und Orang-Utansexprimiert jedoch nicht im Menschen. Diese zyklischen AMPs sind aktiv bei hohenSalzkonzentrationen und verhindern die Fusion von HIV-1 mit Wirtszellen. Im Men-schen existieren sechs Pseudogene der θ-Defensine, deren Translation durch ein vor-zeitiges Stoppcodon in der Signalpeptid-Region der mRNA verhindert wird. Eine Re-aktivierung dieser Defensine wird als potentielle neue Therapie für HIV-Infektionendiskutiert [85].

30 Einleitung

1.3.8 Cathelicidin LL-37

Cathelicidine werden von vielen Spezies exprimiert. Im Menschen ist jedoch nur eineinziges Cathelicidin-Gen (CAMP) bekannt, welches das inaktive Precursor-ProteinhCAP18 mit einer molekularen Masse von 18 kDa kodiert [89]. Dieser Precursorbesitzt, wie in Abbildung 1.11 dargestellt, eine N -terminale Cathelin-Domäne undeine C -terminale Domäne, die durch eine Serinproteasen-katalysierte Prozessierungals aktives antimikrobielles Peptid LL-37 (4,5 kDa) abgespalten wird. Eine weitereProzessierung in verschiedene LL-37-Derivate, die ebenso antimikrobielle Aktivitätaufweisen und die Fähigkeit besitzen, immunstimulatorischen Effekte auszuüben,ist möglich [111, 112]. Ebenso zeigt die bei der Prozessierung freigesetzte Cathelin-Domäne antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, S. aureus und S. epidermidis [113].

Abbildung 1.11: Schematische Darstellung der Prozessierung von Cathelicidin hCAP18.

Die proteolytische Spaltung des inaktiven Precursor-Proteins durch die Serinproteinasen

Kallikrein 5 (KLK5) und Proteinase 3, die durch Serinproteinasen inhibiert werden können,

setzt das aktive antimikrobielle Peptid LL-37 frei. Durch die Proteinasen KLK5 und KLK7

kann eine weitere Spaltung von LL-37 in die ebenso antimikrobiell aktiven und immunsti-

mulatorischen Peptide KS-30, KS-22, LL-29, RK-31 und KR-30 erfolgen. (modifiziert nach

[111])

Einleitung 31

1.3.8.1 Expression und Regulation

LL-37 bildet in wässrigen Lösungen eine stabile α-Helix. Es zeigt antimikrobielle Ak-tivität gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien sowie gegen Pilze, unteranderem auch gegen Candida albicans [114]. Es wird konstitutiv in Neutrophilen,Monozyten und Mastzellen sowie NK-, B- und T-Zellen exprimiert. Des weiterenwird LL-37 auch in den Epithelien des repiratorischen Traktes, des Verdauungs-und Fortpflanzungstrakts, sowie in den merokrinen Drüsen und Speicheldrüsen desgesunden Menschen gebildet (siehe auch Tabelle 1.1). Eine induzierte Expressionvon LL-37, infolge von Entzündung, Verletzung oder Infektion, wurde für Keratino-zyten und für intestinale epitheliale Zellen beschrieben [112]. Im gesunden Menschenwurden in Körperflüssigkeiten LL-37-Konzentrationen von 2 bis 5µg/ml nachgewie-sen. Bei Infektionen, Verletzungen oder Entzündungen können die Konzentrationenauf 30µg/ml ansteigen [115]. Induziert werden kann die Bildung von LL-37 nebenden genannten Faktoren wie Verletzung, Infektion oder Entzündung auch durch dieGabe von VitaminD und durch die Stimulation der Zellen mit Wachstumsfaktoren(insulin-like growth factor I und TGF-α) [116, 117].

1.3.8.2 Wirkung

AMPs wirken durch Interaktion mit mikrobiellen Membranen letal auf viele Organis-men. Für das Peptid LL-37 wird ein Wirkmechanismus nach dem Toroidal-Modellbeschrieben [118]. Neben der antimikrobiellen Wirkung erfüllt das Peptid weiterewichtige Funktionen. LL-37 erhöht die Zytokin- und Chemokin-Ausschüttung sowohlin umliegenden Zellen und Leukozyten, als auch in Mastzellen und Keratinozyten.Es hat chemotaktische Effekte auf viele Immunzellen und verstärkt die Proliferationvon Endothelzellen und Monozyten sowie die Wundheilung. Dies geschieht unter an-derem durch die LL-37-vermittelte Induktion der Expression von IL-8 und MCP-1und oberflächenassoziierter Chemokinrezeptoren wie IL-8RB, CXCR-4 und CCR2[119]. Ebenso beeinflusst es die Angiogenese und inhibiert die Apoptose in Neutro-philen, verlängert somit deren Lebensspanne [120].

Neben den genannten pro-inflammatorischen Funktionen wurden auch anti-inflammatorische Wirkungen von LL-37 beschrieben [119]. Scott et al. konnten zei-gen, dass LL-37 die LPS- und LTA-abhängige Aktivierung von Makrophagen neutra-lisiert und die LPS-induzierte Produktion von TNF-α reduziert. Somit fungiert LL-37 in einer Doppelrolle. Einerseits aktiviert es Entzündungsprozesse und rekrutiertPhagozyten zum Infektionsherd. Andererseits zeigt LL-37 anti-inflammatorische

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Wirkung nach Inkubation mit Mikroorganismen oder deren Produkten. Dies re-duziert die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Sepsen.

Es wird beschrieben, dass in die Aktivierung von LL-37 Toll-like Rezeptoren (ins-besondere TLR2, 4 und 9) involviert sind [121] aber auch, dass LL-37 Signalwegeder Toll-like Rezeptoren und des Rezeptors P2X7 beeinflusst [122, 123, 124].

Da die Toll-like Rezeptoren, die einer der Hauptauslöser der angeborenen Immu-nantwort sind (siehe Kapitel 1.2.2), nicht wirklich zwischen konservierten Oberflä-chenmolekülen von pathogenen bzw. kommensalen Organismen unterscheiden kön-nen, bleibt zu klären, in welchem Maße antimikrobielle Peptide an der Balancezwischen Symbiose und Pathogenese eine Rolle spielen [125].

1.3.8.3 Wirkung von LL-37 auf C. albicans