Die Bedeutung der Defensinein der perioperativen Medizin

Malte Book, Frank Stüber

Klinik und Poliklinikfür Anästhesiologie und Schmerztherapie

Inselspital, Bern

Eine Sepsis liegt dann vor, wenn sich innerhalb

des Körpers ein Herd gebildet hat, von dem

kontinuierlich oder periodisch pathogene

Bakterien in den Kreislauf gelangen und zwar

derart, daß durch diese Invasion subjektive und

objektive Krankheitserscheinungen ausgelöst

werden

Schottmüller H. Verhandl dt Kongress Inn Med 1914; 31:257-80

Sepsis ist die Gesamtheit der lebensbedrohlichen

klinischen Krankheitserscheinungen und

pathophysiologischen Veränderungen als Reaktion

auf die Aktion pathogener Keime und ihrer

Produkte, die aus einem Infektionsherd in den

Blutstrom eindringen, die großen biologischen

Kaskadensysteme und spezielle Zellsysteme

aktivieren und die Bildung und Freisetzung

humoraler und zellulärer Mediatoren auslösen.

Schuster HP und Müller-Werdan U: Definition und Diagnose von Sepsis

und Multiorganversagen in Sepsis und MODS, Springer Berlin

Heidelberg (2005)

SIRS nach Trauma

Hoover L, Bochicchio GV, Napolitano LM, Joshi M, Bochicchio K, Meyer W, Scalea TMJ Trauma. 2006 Aug;61(2):310-6

N: 1277 Trauma Patienten, 91% zeigen systemische Inflammation

ISS Mittelwert: 18

Infektion nach SIRS

Hoover L, Bochicchio GV, Napolitano LM, Joshi M, Bochicchio K, Meyer W, Scalea TMJ Trauma. 2006 Aug;61(2):310-6

580 (45%) der Patienten hatten mindestens eine nosokomiale Infektion

Inzidenz: 3 von 1.000 Menschen/Jahr

2 von 100 Krankenhauspatienten/Jahr

715.000 Patienten/Jahr

Letalität: 29%

mehr Tote als durch akuten Myokardinfarkt

Kosten: 17.000.000.000 US$/Jahr

Angus DC, Crit Care Med 2001; 29:1303-1310

Herausforderung des Gesundheitssystems

• Körpertemperatur >38 °C oder <36 °C

• Tachykardie: Herzfrequenz >90/min

• Tachypnoe: Atemfrequenz >20 oder Hyperventilation (PaCO2

<4.3 kPa bzw. 33 mmHg)

• Leukozytose (>12.000 weiße Blutkörperchen/mm3) oder

Leukopenie (<4000/mm3) oder >10 % unreife neutrophile

Granulozyten im Differentialblutbild

Sepsis

Entzündung

SIRS Kriterien+

American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: definitions for sepsisand organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis (1992) Crit Care Med

2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis DefinitionsConference Crit Care Med (2003) Vol. 31, No. 4

Zeichen der systemischen Inflammationals Antwort auf eine Infektion

[….] these terms do not allow precise

characterization and staging of patients

with this condition.

2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis DefinitionsConference Crit Care Med (2003) Vol. 31, No. 4

Limitationen

PIROPIRO

P redisposition

I nfection

R esponse

O rgan dysfunction

Zwillingsuntersuchungen bei Volkskrankheiten

Konkordanzraten

MZ DZ

Diabetes mellitus Typ 2 0,80 0,35

Herzinfarkt (Frauen) 0,44 0,14

Herzinfarkt (Männer) 0,39 0,26

Prostata-Karzinom 0,27 0,07

Epilepsie (idiopathische) 0,69 0,14

Multiple Sklerose 0,28 0,03

Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte 0,38 0,08

Schizophrenie 0,50 0,12

Manische Depression 0,60 0,10

Tuberkulose 0,37 0,15

Warum können einige kritisch kranke Patienten der Keim

beladenen Umwelt widerstehen

während

Andere infektiologische Komplikationen entwickeln?

Warum können einige kritisch kranke Patienten der Keim

beladenen Umwelt widerstehen

während

Andere infektiologische Komplikationen entwickeln?

Hypothese

Die Funktion des Innaten Immunsystems

wir durch genetische Varianten moduliert

Genom Mutationen

Chromosomen Mutation

Deletion Insertion Inversion

Tandem Repeats

ATGGCAGG AAACGGCT

1 – 6 bp, 10 – 100 x wiederholt

ATGGCAGG AAACGGCT

6 – 100 bp, bis 20 kb Länge

ATGGCAGG AAACGGCT

Mindestens 100 bp, mehrere Megabasen Länge

Mikrosatelliten

Minisatelliten

Satelliten

Single Nucleotide Polymorphisms

• Frequenz ca. 1/1000 Bp

• ca. 10.000.000 SNPs/Individuum

Gene Polymorphism(rs number)

Location (functionalRelevance)

AlleleFrequency %

Disease association

TLR1 A→Grs5743551

-7202Essential splice site

7.5 Allele G caused higher NF-kB activation and higher cell surface TLR1 expression. In sepsis patients predicted organ dysfunction and death [Wurfel et al. (2008) Am J Respir Crit Care Med 178(7):710-720]

TLR2 G→Ars5743708

Exon(753 Arg→Gln)

1.5 Heterozygous patients showed elevated TNF and decreased IFN- and IL-8 blood concentrations in response to candida sepsis [Woehrle et al. (2008) Cytokine 41(3):322-329]

G→Ars5743708

Exon(753 Arg→Gln)

1.5 Heterozygous patients with inflammatory bowel diseases showed increased risk for pancolitis [Pierik et al. (2006) Inflamm Bowel Dis 12(1):1-8]

A→Grs1898830

Intron 35 Allele is associated with increased shedding and lesional rates in patients with genital Herpes Simplex virus typ 2 infections

TLR4 A→Grs4986790

Exon(299 Asp→Gly)

3 Interruption of TLR4 mediated LPS signalling [Arbour et al (2000) Nat Genet 25(2):187-191]

LBP T→Crs2232571

CAAT box 11 Association with gram negative bacteremia related mortality after hematopoietic cell transplantation [Chien et al (2008) Blood 111(4):2462-2469]

IL-6 G→Crs1800795

Promoter-174

40 Decreased gene transcription after LPS stimulation [Fishman et al (1998) J Clin Invest 102(7):1369-1376]

TNF G→Ars 1800629

Promoter-308

21 Increase in transcriptional activity following LPS stimulation [Wilson et al (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):3195-3199]. Association with death from meningococcal disease [Nadel et al (1996) J Infect Dis 174(4):878-880]. Increased susceptibility to septic shock and associated with death due to septic shock [Mira et al (1999). JAMA 282(6):561-568]

G→Ars361525

Promoter-238

7.4 Development of pneumonia in systemic lupus erythematosus is associated with allele A [Kinder et al (2007). Arthritis Rheum 56(8):2679-2686]

IRAK 1 C→Trs1059703

Exon 12(532 Ser→Leu)

18 Increased incidence of shock in septic patients [Arcaroli et al (2006) Am J Respir Crit Care Med 173(12):1335-1341]

MIF C→Grs755622

Promoter-173

16 Increased MIF plasma levels in patients post CABG surgery [Lehmann et al (2006) Eur J Cardiothorac Surg 30(1):59-63]

eNOS G→Trs1799983

Exon 8(Glu→Asp)

34.2 Risk factor for hypotension in patients with E. coli bacteremia [Huttunen et al (2008) Shock]

TLR1 A→G

rs5743551

Allele G caused higher NF-kB activation and higher

cell surface TLR1 expression. In sepsis patients

predicted organ dysfunction and death [Wurfel et al.

(2008) Am J Respir Crit Care Med 178(7):710-720]

TNF G→A

rs 1800629

Promoter

-308

Allele TNF2 showed increased

susceptibility to septic shock and

associated with death due to septic

shock [Mira et al (1999). JAMA

282(6):561-568]

Kandidatengene (SNPs)

Gen ROT

Gen GRÜN

Gen BLAU

Copy Number Variation (CNV)

homologe Chromosomen

(2 Gen Kopien pro diploidem

Chromosomensatz)

Redon et al. Nature. 2006 Nov 23;444(7118):444-54

A total of 1,447 copy number variable regions (CNVRs), which can encompass overlapping or adjacent gains or losses, covering 360 megabases (12% of the genome) were identified in these populations.

Copy number variations

Richard Redon et al. Nature 444, 444-454 (23 November 2006)

Innate Immunität

• Angeboren

• Unterscheidung selbst/fremd

durch molekulare Muster

• Sehr schnell, bzw. sofort einsatzbereit

• In der Evolution konserviert

•Protein Barrieren

- Komplement

- Lysozym

- Defensine

Innate Immunität

•Physikalische Barrieren

- Epidermis

- Mucosa

•Zelluläre Barrieren

- Neutrophile

- Makrophagen

- NK-Zellen

Rezeptoren/Mediatoren-TLRs-TNF

-Interleukine

Over the past several years my laboratory has utilized the Xenopus laevis oocyte system to study RNA expression in eukaryotes (1-5). Ovaries used in these studies were removed surgically from anesthetized adult females. Incisions were made through both the skin and the nonadherent muscular layer of the abdomen into the peritoneum. After removal of the ovaries, the muscular wall and the skin were separately repaired with sutures. Despite the nonsterile surgical procedure and the microbially contaminated water-filled tanks to which the animals were returned immediately after surgery, it was extremely rare for these surgical wounds to develop infection. Indeed, sutures dissolved after several weeks, and normal healing of the scar almost always occurred. Infections were not seen on the cut margins of the wound, at the sites of suture placement, or within the communicating subdermal space or peritoneum. Healing occurred with little gross evidence of inflammation or cellular reaction at the wound sites. The absence of infection under these conditions was medically remarkable.

Zasloff M. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Aug;84(15):5449-53

Antimicrobial Peptides

• Defensin, Cathelicidin, Hepcidin

• 15-45 Aminosäuren lang

• Positiv geladen

• In der Evolution hoch-konservierte Gene

• Vorkommen in vielen Geweben

• Antimikrobielle Wirkung gegen Bakterien,

Pilze und Viren

• Beta–Defensine 2, 3 und 4 mit sehr hoher

antimikrobieller Aktivität

• Immunmodulatorische Wirkung

Defensine

Alpha (Helix) Beta (Faltblatt)

Gene 11 (Pseudogene) 49 (Pseudogene)

Expression meist konstitutiv meist induzierbar

Vorkommen Neutrophile, T-

Zellen, NK-Zellen,

GIT, Knochenmark

epitheliale Organe,

monozytäre Zellen,

Testis

-Defensine: Effektormoleküle der Innaten Immunität

• Milner SM et al Reduced antimicrobial peptide expression in human burn wounds

Burns. 1999 Aug;25(5):411-3

• Book M, Stuber F et al. Inducibility of the endogenous antibiotic peptide beta-defensin

2 is impaired in patients with severe sepsis. Crit Care. 2007;11(1):R19

• Chen QX et al Genomic variations within DEFB1 are associated with the susceptibility

to and the fatal outcome of severe sepsis in Chinese Han population. Genes Immun

2007 Jul;8(5):439-43

• Kota S et al. Role of human beta-defensin-2 during tumor necrosis factor-alpha/NF-

kappaB-mediated innate antiviral response against human respiratory syncytial virus. J

Biol Chem. 2008 Aug 15;283(33):22417-29

• Soto E et al. Human beta-defensin-2: a natural antimicrobial peptide present in

amniotic fluid participates in the host response to microbial invasion of the amniotic

cavity. J Matern Fetal Neonatal Med. 2007 Jan;20(1):15-22

critic

ally i

ll

healt

hy co

ntro

ls

Sever

e se

psis

0

2

4

6

10

20

30

40

50

60

70

80

Nornalized Ratio ofhBD2 mRNA expression

*

* p<0.05, Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparison test

Book M, Chen Q, Stuber F Crit Care. 2007 Feb 15;11(1)

Leukozytäre Defensin-2 Induzierbarkeit inPatienten mit schwerer Sepsis verringert

healt

hy co

ntro

ls

critic

ally i

ll non

-sep

tic

surv

ivor s

. s.

nons

urviv

or s.

s.0

500

1000

15003000

5000

pg/ml hBD2 plasma level

Defensin-2 Plasmaspiegel inPatienten mit schwerer Sepsis erhöht

Book M, Chen Q, Stuber F Crit Care. 2007 Feb 15;11(1)

* p<0.05, Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparison test

**

Exon 1

CAATTATA

-72T/C-233G/C-876C/T-992G/A

NF-B NF-IL-6AP-1

4 Varianten (SNPs) im

hBD2 Gene Promotor

hBD2 Promotor Aktivität: Effekt der SNPs

0

5

10

15

• Wildtype and variant indicate no significant differences in inducible promoter activity

Endotoxin response

Chromosomale Duplikation auf Chromosom 8

Hollox et al. Am J Hum Genet. 2003 Sep;73(3):591-600

DEFB103

DEFB4 DEFB4

DEFB103

SPAG11 SPAG11

DEFB104 DEFB104

DEFB106 DEFB106

DEFB105 DEFB105

DEFB107 DEFB107

7250k 7350k 7700k 7800k

Beta Defensin Copy Number Variation

CYP2D6 Gen Kopie Anzahl Variation

CYP2D6 Gen Kopie Anzahl Variation beeinflusst den antiemetischen Effekt und die Plasma Spiegel von Topisetron

Kaiser et al. J Clin Oncol. 2002 Jun 15;20(12):2805-11

Anzahl der CYP2D6 Gene

To

pis

etr

on

Se

rum

Ko

nze

ntr

atio

n,

µg

/l

Ep

iso

de

n d

es

Erb

rech

en

s (M

ea

n)

Relative DNA Gen Kopie Anzahl Quantifizierung mit PCR

Referenz Gen Ziel Gen

Prinzip

• Ein Kalibrator mit je 2 Kopien Referenz- und Ziel-Gen läuft in jedem Lauf

• Relative Ratio von Ziel- zu Referenz-Gen wird durch den „crossing point“ berechnet

• PCR Effizienz korrigierte Quantifizierung

• Ziel-/Referenz-Gen Ratio von jeder Probe wird geteilt durch Ziel-/Referenz-Gen Ratio des Kalibrators

Effizienz Berechnung

Slope: -3,609E=10(-1/slope)=1.8927

Slope: -3,575E=10(-1/slope)=1.9042

Quantifizierung der Defensin CNPs

Chen Q, Book M, Stuber F J Immunol Methods. 2006 Jan 20;308(1-2):231-40

Proben Quantifizierung

Quantifizierung der Defensin CNPs

Chen Q, Book M, Stuber F J Immunol Methods. 2006 Jan 20;308(1-2):231-40

Funktionelle Bedeutung der hBD2 CNVs

1 2 3 4 5 61.5

2.5

3.5

4.5

Gen Kopien

rela

tive

hBD

2 m

RN

A M

enge

R2 0,8149, p < 0,05 R2=0,9643, p < 0,05

1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

Gen KopienhB

D2

Pro

tein

(pg

/ml)

Ausblick Defensin CNVs• Assoziation mit Inflammation, Infektion, Sepsis bei

kritisch kranken perioperativen Patienten?

• Quantitative Modulation der Genexpression bei unterschiedlichen

Patienten (z.B. HLM OP, Blood Stream Infection, Peritonitis, Pneumonie)?

• Quantitative Modulation der Proteinspiegel?

• Zuordnung zu SNP und CNV Haplotypen?

Hiratsuka et al.Thorax. 2003 May;58(5):425-30

Gen Kopie Anzahl Polymorphismus

Wildtyp

Homozygoter Wildtyp mit 2 Gen Kopien

Homozygote Variante

Mutation

Heterozygote Variante

TLR1 A→Grs5743551

Allele G caused higher NF-kB activation and higher cell surface TLR1 expression. In sepsis patients predicted organ dysfunction and death [Wurfel et al. (2008) Am J Respir Crit Care Med 178(7):710-720]

TNF G→Ars 1800629

Promoter-308

Allele TNF2 showed increased susceptibility to septic shock and associated with death due to septic shock [Mira et al (1999). JAMA 282(6):561-568]