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Aus der Abteilung für
Pathologie
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Morgenroth
Die Bedeutung d es Plasminog en-Aktivatorsystems für die
Progno se des k leinzelli gen Bronchialkarzinoms
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Eva Barteck
aus Bochum
1999
Seite 1
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. H. Hildmann
Korreferent: Prof. Dr. med. K.M. Müller
Tag der mündlichen Prüfung: 6. Juni 2000
Seite 2
Inhaltsverzeichnis
1 INHALTSVERZEICHNIS................................................................................. 2
2 EINLEITUNG................................................................................................... 4
2.1 Das Bronchialkarzinom .......................................................................................................................4
2.2 Pr inzipien von Invasion und Metastasierung ..................................................................................13
2.3 Die Interaktionen der Proteine des Plasminogen-Aktivator -System .............................................14
2.3.1 Das Plasminogen Aktivator Systems unter physiologischen und pathologischen Bedingungen... 17
2.4 Histopathologische Untersuchungsmethoden ..................................................................................21
2.4.1 Die Immunhistochemische Untersuchung .................................................................................... 22
2.4.2 Die ABC-Methode........................................................................................................................ 22
2.5 Problemstellung.................................................................................................................................. 22
3 MATERIAL UND METHODEN...................................................................... 24
3.1 Untersuchungsmaterial ......................................................................................................................24
3.2 Geräte..................................................................................................................................................24
3.3 Chemiekalien ......................................................................................................................................25
3.4 Antikörper ..........................................................................................................................................25
3.5 Untersuchungsmethode......................................................................................................................28
3.6 Statistische Methoden ........................................................................................................................30
4 ERGEBNISSE............................................................................................... 31
5 DISKUSSION................................................................................................ 38
5.1 Diskussion der Ergebnisse.................................................................................................................38
5.2 Diskussion der Fehlermöglichkeiten ................................................................................................. 44
6 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 46
Seite 3
7 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................... 47
Einleitung
Seite 4
1 Einleitung
Die malignen Tumoren des unteren Respirationstraktes haben in ihrer
Häufigkeit in den letzten Jahrzehnten erheblich zugenommen und die Tendenz
ist ansteigend. In den Krebsstatistiken ist das Bronchialkarzinom heute das
häufigste Karzinom beim Mann, Frauen erkranken bislang seltener. Der Tumor
manifestiert sich in der Regel in der 6. Lebensdekade. Die Entstehung des
Bronchialkarzinoms ist vor allem auf inhalative Noxen zurückzuführen.
Unter den vier Haupt-Subtypen der Bronchialkarzinome besitzt das kleinzellige
Bronchialkarzinom die ungünstigste Prognose. In der Häufigkeit des Auftretens
befindet es sich an zweiter Stelle. Es handelt sich um einen hochgradig
malignen epithelialen Tumor mit charakteristischen zytologischen
Eigenschaften. Der klinische Verlauf ist sehr aggressiv und häufig mit
weitverbreiteter lymphogener und hämatogener Metastasierung verbunden.
Invasives, destruierendes Wachstum und Metastasierung erfordern die
Fähigkeit der Tumorzellen mit den Komponenten der subepithelialen
Basalmembran zu interagieren und die Bestandteile der extrazellulären Matrix
zu degradieren (Colby T. et al.; 1994).
Zu den Basismechanismen dieser Vorgänge gehört die tumorassoziierte
Proteolyse. Das bösartige Verhalten der Tumorzellen und die schlechte
Prognose scheinen von der Synthese und Aktivität Matrix-abbauender
proteolytischer Enzyme abhängig zu sein. In diesem Zusammenhang hat die
Expression von Serinproteasen und deren Inhibitoren innerhalb des
Plasminogen-Aktivator-Systems Bedeutung erlangt (Heiss MM.; 1995).
1.1 Das Bronchialkarzinom
Bronchialkarzinome sind hochmaligne Lungentumoren, die sich überwiegend
vom Oberflächenepithel der Bronchien und Bronchiolen ableiten. Nach ihrer
Lokalisation werden zentrale hilusnahe (ca. 70%), intermediäre und periphere
Bronchialkarzinome (ca. 25%) unterschieden. Histologisch lassen sich vier
Einleitung
Seite 5
Subtypen abgrenzen: Plattenepithelkarzinome, kleinzellige Karzinome,
Adenokarzinome und großzellige Karzinome. Diese Reihenfolge entspricht der
Häufigkeit ihres Auftretens.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem kleinzelligen Bronchialkarzinom.
Die Inzidenz des kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist in den letzten Jahren
angestiegen. Diese Form macht etwa 20% aller Lungenkrebse aus. In den
USA gibt es schätzungsweise 34 000 Neuerkrankungen pro Jahr. Das mittlere
Manifestationsalter wird mit 60 Jahren angegeben (Reichweite 32-79 Jahre).
Männer erkranken bevorzugt, der Prozentsatz der betroffenen Frauen stieg
jedoch kontinuierlich in den letzten Jahren an. Betrug die Fallzahl beim
männlichen Geschlecht anfangs das Zehnfache, so wird neuerdings von einem
Verhältnis von 2: 1 berichtet (Colby T. et al.; 1994). Einige Autoren berichten
auch von einem ausgeglichenen Verhältnis. In Bezug auf die Gesamtheit der
Bronchialkarzinome haben Männer ein fünffach erhöhtes Risiko zu erkranken
(Thurlbeck, WM.; 1988).
Die Hauptursache für Lungenkrebs sind inhalative Noxen, insbesondere der
Tabakrauch. Das kleinzellige Bronchialkarzinom und das
Plattenepithelkarzinom sind am stärksten mit dem Rauchen assoziiert. Des
weiteren begünstigen zu einem sehr geringen Prozentsatz die Exposition
gegenüber ionisierender Strahlung (Uran), Asbest, Arsen, Chromdämpfen,
Nickeldämpfen und Kokereirohgasen die Entstehung von Lungentumoren
(Colby T. et al.; 1994).
Das histologische Bild des kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist durch eine in
soliden Arealen angeordnete Wucherung kleiner Epithelzellen charakterisiert
(Morgenroth, K. und Nolte, D.; 1981). Die Zellen weisen durch die extrem
verschobene Kern-Plasma-Relation wenig Zytoplasma auf und die Zellgrenzen
sind undeutlich (Thurlbeck, WM.; 1988). In den Zellkernen findet sich eine
dichte feine Chromatingranula, so daß Nukleolen fehlen oder unauffällig sind
(Colby T. et al.; 1994).
Einleitung
Seite 6
Abbildung 1 HE-Färbung, Originalvergrößerung 200 fach, rundliche bis spindelförmigeZellen mit spärlichem Zytoplasmasaum
Abbildung 2 HE-Färbung, Originalvergrößerung 20 fach, regressive Veränderungen in Formvon Nekrosezonen zwischen soliden kleinzelligen Tumorzellverbänden.
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Abbildung 3 HE-Färbung, Originalvergrößerung 50 fach, kleine zytoplasmaarmelymphozytenähnliche Tumorzellen als kennzeichnendes Merkmal kleinzelligerBronchialkarzinome.
Abbildung 4 HE-Färbung, Originalvergrößerung 200 fach, deutlich zu erkennen ist dieextrem verschobene Kern-Plasma-Relation der Tumorzellen
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Abbildung 5 EvG-Färbung, Originalvergrößerung 50 fach, Die Tumorzellenmasse grenzt aneine ausgeprägte Nekrosezone.
Die Zellen weisen Reste einer neuroendokrinen Differenzierung auf. Sie stehen
histogenetisch zum Kultschitzky-Typ des Apud-Systems in der
Bronchialschleimhaut und zu den Karzinoidtumoren des Bronchus in
Beziehung. Paraneoplastische Syndrome mit endokrinen und neurologischen
Symptomen können häufiger auftreten (Morgenroth, K. und Nolte, D.; 1981;
Colby et al.; 1994). In 75% der Fälle exprimieren die Zellen
neuronenspezifische Enolase sowie die embryonale Form des neuralen
Zelladhäsionsmoleküls. Dies erklärt die schlechte Zellkohäsivität und leichte
Quetschbarkeit des Gewebes bei der Entnahme (Thurlbeck, WM.; 1988).
Der Tumor zeigt häufig ausgedehnte Nekrosen (Abbildung 2). Makroskopisch
weist er eine weiße bis gelbliche Farbe und eine weiche krümelige Konsistenz
auf. In ungefähr 70% der Fälle zeigen sich perihiläre Tumormassen. Der Tumor
ist typischerweise peribronchial lokalisiert. Infiltrationen in die Submucosa und
die Peripherie können vorkommen. Frühe kleinzellige Bronchialkarzinome
können als submuköses Infiltrat mit normaler darüberliegender Mukosa oder
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Seite 9
als Plaque-ähnliche Läsionen auftreten. Mit fortschreitender Erkrankung kann
das Bronchiallumen durch Kompression von außen verschlossen werden.
Endobronchiale Läsionen sind ungewöhnlich, aber schon berichtet worden. Das
Kleinzellige Karzinom entwickelt sich nicht nach dem Muster eines Carcinoma
in situ (Colby T. et al.; 1994).
Aufgrund des schnellen Wachstums und der weitverbreiteten Metastasen sind
die meisten Patienten (über 80%) symptomatisch. Die Dauer der Symptome
beträgt weniger als drei Monate. Da die meisten Tumoren proximal lokalisiert
sind zählen Husten, Dyspnoe, Hämoptysen, thorakaler Schmerz und
postobstruktive Pneumonie zu den gemeinsamen Symptomen. Bei
Einbeziehung des Mediastinums treten das Vena-Cava-superior-Syndrom,
Paralyse des N. laryngeus recurrens und Dysphagie auf. Klinisch
kennzeichnend sind außerdem die überschießende ADH-Produktion, das
ektope Cushing Syndrom und das Eaton-Lambert-Syndrom. Ferner können
Symptome vom Befall des Zentralnervensystems, der Knochen und der Leber
resultieren (Colby T. et al.; 1994).
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Abbildung 6 Makroskopischer Aspekt eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms
Abbildung 7 Detailaufnahme aus Abbildung 6, zentrale hilusnahe Topographie
Einleitung
Seite 11
Die histologische Klassifikation des kleinzelligen Brochialkarzinoms hat sich im
wesentlichen während der letzten drei Jahrzehnte entwickelt. Die Einteilung der
WHO von 1967 sah eine Unterscheidung von vier morphologischen Typen vor.
Diese wurden 1981 auf drei Typen reduziert:
1. Haferkorntyp
2. intermediärer Zelltyp
3. kombinierter Zelltyp.
Die Problematik dieser Einteilung besteht allerdings in der schweren
Reproduzierbarkeit der Begriffe für unterschiedliche Pathologen. Von einigen
wird der Haferkornzelltyp als nekrose-oder bearbeitungsbedingter Artefakt
angesehen.
Die IASLC (International Association for the Study of Lung Cancer) teilte das
kleinzellige Bronchialkarzinom in folgende Kategorien:
1. Kleinzelliges Bronchialkarzinom
2. gemischtes klein-und großzelliges Karzinom
3. kombinierter Typ (mit Bestandteilen des Plattenepithel- und des
Adenokarzinoms).
Bei Lichtmikroskopie zeigt das kleinzellige Karzinom häufig ausgedehnte
Nekrosen. Manche Tumoren haben ein prominentes desmoplastisches Stroma.
Sie wachsen nicht nach einem bestimmten Muster, können sich aber in
Nestern Bändern, tubulären und duktalen Strukturen und gelegentlich in
Pseudorosetten formieren. Die Mitoseraten sind charakteristischerweise hoch.
Sie erreichen bis zu 10 Mitosen pro Gesichtsfeld (Colby T. et al.; 1994).
Die Differentialdiagnose des Kleinzelligen Karzinoms nimmt eine wichtige Rolle
bei der Wahl der Therapie ein. Der Tumor reagiert äußerst sensibel auf
Chemotherapie. Diese Eigenschaft unterscheidet ihn von Nicht-kleinzelligen
Karzinomen. Weitere wichtige Differentialdiagnosen schließen das maligne
Lymphom, die chronische Entzündung und Fernmetastasen anderer
Primärtumoren ein. Im Einzelfall kann die Diagnosestellung kompliziert sein. Als
Anhaltspunkt für die Größe einer Tumorzelle kann der Vergleich mit dem
Durchmesser von 2-3 Lymphozyten hilfreich sein. Es wurde auch von einer
Einleitung
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Größe zwischen 35 und 45 µm berichtet (Colby T. et al.; 1994). Faktoren, die
zu einer schlechten pathologischen Beurteilbarkeit des Gewebes führen sind:
zu geringe Größe der Biopsieproben, Quetschungsartefakte, ischämische
Veränderungen, ungenügende Fixation und mangelhafte Qualität der
histologischen Schnitte.
Das kleinzellige Bronchialkarzinom wird als Systemerkrankung angesehen, da
fast alle Patienten zum Zeitpunkt der Entdeckung der Erkrankung regionale und
extrathorakal gelegene Lymphknotenmetastasen aufweisen. Die hämatogene
Aussaat des Tumors ist ebenfalls extrem häufig. Er metastasiert bevorzugt in
die Leber, das Gehirn, die Nebennieren und die Knochen (Colby T. et al.;
1994). Die chirurgische Resektion steht als einzige Heilungschance des
Bronchialkarzinoms zur Verfügung. Sie ist jedoch nur selten möglich. In etwa
5% der Fälle ist das kleinzellige Karzinom einer operativen Therapie zugänglich
und kann unter der primären Diagnose eines unklaren Rundherdes chirurgisch
reseziert werden. Dies gilt für 20% der Nicht-kleinzelligen Karzinome. Die
Frage, ob ein Patient ein Kandidat für die Resektion ist oder nicht, hängt vom
„Staging“ ab. Es ist der wichtigste prognostische Parameter. Es dient zur
Feststellung der anatomischen Ausbreitung der Krankheit und beruht auf
klinischen, radiologischen und pathologischen Beweisen.
Das übliche Staging-System für Lungentumoren wurde 1986 von Mountain
vorgeschlagen und basiert auf der TNM-Klassifikation. Darin bezieht sich „T“
auf die Größe und das Ausmaß des Tumors, „N“ auf die Anwesenheit und das
Ausmaß von Lymphknotenmetastasen und „M“ auf das Vorhandensein von
Fernmetastasen. Ein Tumorstadium bis IIIA kann reseziert werden, während
IIIB und IV als inoperabel gelten. Diese TNM-Einteilung läßt sich nicht gut auf
das kleinzellige Bronchialkarzinom anwenden. Daher entwickelte man ein
2-Stadien-System (Colby T. et al.; 1994).
Man unterscheidet das Stadium einer „limitierten Erkrankung“ (limited disease)
von einer „ausgedehnten Erkrankung“ (extensive disease). Um eine limitierte
Erkrankung handelt es sich bei Befall eines Hemithorax mit oder ohne Befall
Einleitung
Seite 13
der ipsilateralen bzw. kontralateralen mediastinalen und supraklavikulären
Lymphknoten und Vorkommen eines Pleuraergusses. Das ausgedehnte
Stadium wird definiert als fortgeschrittener und schließt den Befall entfernter
Lymphknoten und anderer Organe ein. Zum Zeitpunkt der Vorstellung befinden
sich 30% der Patienten in einem limitierten Stadium der Erkrankung und 70% in
einem fortgeschrittenen Stadium. Die 5-Jahresüberlebensrate für ein limitiertes
Stadium beträgt etwa 10%, für das fortgeschrittene Stadium liegt sie zwischen
0 und 2%. Laut Statistik des „American National Cancer Institute“ liegt die
5-Jahresüberlebensrate für alle Stadien bei 13% für Weiße und bei 11% für
Schwarze. Die Ergebnisse einer Studie über Langzeitüberlebende von
Mountain 1988 machen die besondere biologische Aggressivität und schlechte
Prognose des kleinzelligen Bronchialkarzinoms deutlich. Bei einem Vergleich
der Daten von 50000 Patienten über den Zeitraum von 1978-1986 hat das
kleinzellige Karzinom die kürzeste relative Überlebensrate unter allen
histologischen Typen.
Patienten mit der Vorgeschichte eines resezierten Bronchialkarzinoms haben
ein merkliches Risiko eines sekundären Bronchialkarzinoms. Das Risiko der
Langzeitüberlebenden (> 5 Jahre) liegt bei 2% pro Jahr. Bei Patienten mit
kleinzelligem Karzinom liegt das Rezidivrisiko bei 5,6% pro Jahr (Colby T. et al.;
1994).
1.2 Prinzipien von Invas ion und Metastasierung
Die extrazelluläre Matrix, zu der die Basalmembranen und das interstitielle
Stroma zählen, fungiert im gesunden Organismus als Barriere zwischen den
Gewebskompartimenten. Sie ist aus Makromolekülen wie Kollagen,
Fibronektin, Laminin, Vitronektin, Proteoglykanen, Glykoproteinen u.a.
zusammengesetzt (Kath R. und Schmidt CG.; 1990), (Liotta LA. et al.; 1991).
Unkontrolliert wachsende Tumorzellen sind in der Lage, die epitheliale
Basalmembran zu penetrieren und in das darunterliegende interstitielle Stroma
und in Lymph- oder Blutgefäße zu gelangen. Dieser Intravasation folgt die
Einleitung
Seite 14
Zirkulation der Tumorzellen im Blutstrom. In den Arteriolen des Zielorgans
binden die Tumorzellen an die endotheliale luminale Oberfläche, proliferieren
und durchbrechen die Gefäßwand. In Kapillaren und postkapillären Venolen
verursachen sie eine Retraktion des Endothels mit dem Ziel, der
Basalmembran anzuhaften. Durch deren lokale Zerstörung kommt es zur
Extravasation. Im Zielorgan durchwandern einzelne Tumorzellen das
perivaskuläre interstitielle Stroma (Liotta LA. et al. 1991). In vivo findet die
Invasion seltener in den Arterien und Arteriolen statt, da deren elastische
Fasern schwerer zu durchdringen sind (Kath R. und Schmidt CG.; 1990). Liotta
et al. beschreiben die Invasion als einen Prozeß, der in drei Schritten abläuft.
Erstens kommt es zur Anheftung der Tumorzellen an die Basalmembran,
zweitens zu lokaler Proteolyse durch Sekretion von Enzymen und drittens zur
Migration der Tumorzellen in die Region (Liotta LA. et al. 1991). Beispiele für
proteolytische Enzyme sind Metalloproteinasen, Serinproteasen und
Cysteinproteasen (Colby T. et al.; 1994). Diese Arbeit beschäftigt sich
ausschließlich mit den Serinproteasen und ihren Inhibitoren.
1.3 Die Interaktionen der Proteine des Plasminog en-Aktivator-System
Solide Tumoren benötigen für ein invasives Wachstum und die Fähigkeit zur
Metastasierung die Wirkung Tumor-assoziierter Proteasen, welche die
Auflösung der umgebenden Tumormatrix und Basalmembran vorantreiben
(Dano K. et al.; 1985), (Pollanen J. et al.; 1991). Der Rezeptorgebundene
Plasminogen Aktivator vom Urokinase-Typ (uPA) scheint bei diesen
Ereignissen eine Schlüsselrolle zu spielen (Chucholowski N. et al.; 1992), (Del
Vecchio S. et al.; 1993). Ein weiteres Plasminogen aktivierendes Enzym ist tPA
(tissue-type plasminogen activator). Dieses ist nicht an der Tumorausbreitung
beteiligt, denn es bindet nicht an die Tumorzelloberfläche und kann daher nicht
die perizelluläre Proteolyse vorantreiben (Schmitt M. et al.; 1995), (Constantini
V. et al.; 1996). tPA ist ein zentrales Enzym der Thrombolyse (Pyke C. et al.;
1991).
Einleitung
Seite 15
uPA wird von Zellen als inaktives Proenzym, pro-uPA freigesetzt. Pro-uPA
besteht aus einer Einzel-Polypeptidkette und wird unter limitierter Proteolyse in
aktives uPA umgewandelt. Dieses besitzt zwei miteinander durch eine
Disulfitbrücke verbundene Polypeptidketten. Die Umwandlung in die aktive
Form wird von Plasmin katalysiert. Pro-uPA und uPA binden mit hoher Affinität
an den spezifischen Zelloberflächenrezeptor uPAR. Rezeptorgebundenes uPA
aktiviert Plasmin, indem es Plasminogen in die aktive Form, Plasmin
umwandelt. Die Ergebnisse immunhistochemischer und funktioneller Studien
stellen klar heraus, daß uPA primär für die Generation von Plasmin
verantwortlich ist. Plasmin ist eine Serinprotease, welche die Kaskade der
proteolytischen Schritte aktiviert, die zum Abbau von Fibronektin, Laminin und
Kollagen führen (Andreasen PA. et al; 1990), (Dano K. et al.; 1985), (Pollanen
J. et al.; 1991). Plasmin scheint außerdem bei der Aktivierung und Freisetzung
von Wachstumsfaktoren eine Rolle zu spielen (Dano K, et al,; 1994). Somit ist
es verantwortlich für Fibrinolyse und Thrombolyse und beteiligt an biologischen
Prozessen wie zum Beispiel des Matrixabbaus, der Zellmigration, der Invasion,
dem Wiederaufbau von Geweben und deren Zerstörung (Andreasen PA. et al;
1990).
Der Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ wurde ursprünglich aus Urin
gewonnen. Er befindet sich auch in geringer Konzentration im Plasma. Er wird
sowohl von Tumorzellen als auch von normalen Zellen exprimiert, wie z:B.
Nierentubuluszellen, phagozytierenden Zellen, Pneumozyten, Keratinozyten
und Fibroblasten (Schmitt M. et al.; 1995).
Seit den späten 70er Jahren sind die schnell wirksamen Plasminogen Aktivator
Inhibitoren identifiziert worden, welche zur Familie der Serpins (engl. Serine
Protease Inhibitors) gehören. Sie regulieren die Plasminogenaktivierung, indem
sie stabile äquimolare Komplexe mit tPA und uPA bilden. Es existieren zwei
Formen. PAI-1, wurde zuerst als Endothel-Typ bekannt, PAI-2 nannte man
Plazenta-Typ. Die heute verwendeten Namen wurden 1986 vom International
Committee on Thrombosis and Haemostasis übernommen (Krischnamurti C. et
al.; 1992), (Andreasen PA. et al; 1990), (Dano K. et al.; 1985). Beide Moleküle
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Seite 16
inhibieren freies und rezeptorgebundenes aktives uPA (Andreasen PA. et al.;
1986), indem sie mit uPA einen Komplex bilden und diesen gleichzeitig durch
intrazelluläre Aufnahme inaktivieren (Alitalo R. et al.; 1989), (Sier CFM. et al.;
1995). Diese erstmals von Cubellis et al. 1990 gemachte Beobachtung
bestätigten Chucholowski et al. (1992) in ihren Untersuchungen an
U397-Zellen.
PAI-1, wird von Plättchen, Endothelzellen, Granulosazellen und Tumorzellen
produziert. 90% der Gesamtmenge des im Blut vorhandenen Proteins befinden
sich in den α-Granula der Blutplättchen (Torr-Brown SR. und Sobel BE.; 1993).
Simpson et al. beobachten eine Färbung von PAI-1 in Kupfferzellen der Leber,
Makrophagen der Milz und Lungen und Neurogliazellen (Simpson AJ. et al.;
1991). In vitro Studien haben gezeigt, daß die PAI-1 Expression von
verschiedenen Hormonen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, wie
Glukokortikoiden, TNF-a, Interleukin 1, transforming growth factor ß und
epidermal growth factor reguliert wird (Andreasen PA. et al; 1990),
(Krischnamurti C. et al.; 1992). Obwohl PAI-1 die Aktivität von uPA hemmt und
daraus eine protektive Funktion resultiert, gibt es bislang keinen Bericht über
hohe PAI-1-Spiegel, die mit guter Prognose des Patienten assoziiert sind
(Pedersen H. et al.; 1994 (2)), (Dano K, et al,; 1994).
PAI-2 wird von Tumorzellen, phagozytierenden Zellen und Throphoblasten
produziert. Es ist daher in hoher Konzentration im Plasma schwangerer Frauen
und in humaner Plazenta vorhanden (Pyke C. et al.; 1991, Schmitt M. et al.;
1995).
Zwischen pro-uPA und dem jeweiligen Inhibitor gibt es keine Reaktion, obwohl
beide extrazellulär gleichzeitig vorhanden sind. Erst bei Umwandlung des
Proenzyms in aktives uPA kommt es zur sofortigen Hemmung. Ein PAI kann
außerdem tPA hemmen, jedoch nicht Plasmin (Andreasen PA. et al.; 1986).
Der Rezeptor uPAR ist ein cysteinreiches Glykoprotein und wurde zuerst 1985
von Vasalli et al. beschrieben. Seine Struktur besteht aus drei homologen
repetitiven Sequenzen (Domänen I-III). Für die kovalente Bindung von uPA an
Einleitung
Seite 17
den Rezeptor ist das aminoterminale Ende des Moleküls, die Domäne I,
verantwortlich. uPAR beschränkt die uPA-Aktivität auf die Zelloberfläche (Dano
K, et al,; 1994). Auf diese Weise wird ein effektives proteolytisches
Enzymsystem geschaffen (Schmitt M. et al.; 1995). Bastholm et al. zeigen mit
Immunelektronenmikroskopie in einer Zellkultur des Mammakarzinoms, daß
uPAR an der Zelloberfläche hauptsächlich an Zell-Zell-verbindungen lokalisiert
ist. Zytoplasmatisches uPAR befindet sich in großen Vesikeln und in
Golgi-Apparaten. Das Vorkommen des Rezeptors im Golgi-Apparat weist
darauf hin, daß die tumorösen Zellen uPAR synthetisieren (Bastholm I. et al.;
1994).
1.3.1 Das Plasminogen Aktivator Systems unter physiologischen und
pathologischen Bedingungen
Unter normalen und pathologischen Bedingungen scheint uPA am Abbau
extrazellulärer Matrixproteine bei der Wiederherstellung von Geweben beteiligt
zu sein (Dano K. et al.; 1985; Pollanen J. et al.;1991).
Entlang des Gastrointestinaltraktes wird zum Beispiel uPAR in den luminalen
Epithelzellen gebildet, die nahe den uPA-produzierenden Zellen der Lamina
propria liegen. Hier dient die Lokalisation der Bestandteile des Plasminogen
Aktivator Systems dem physiologischen Prozeß des kontinuierlichen
Abschilferns der Epithelzellen (Dano K, et al,; 1994). In Kolonkarzinomen sind
diese Moleküle unter anderem im neoplastisch veränderten Epithel exprimiert
(Naitoh H. et al.; 1995), (Pyke C. et al.; 1991), (Pyke C. et al.; 1991(2) ).
Während der Wundheilung in der Haut wird uPAR von den Keratinozyten auf
der Oberfläche der Epithelschicht gebildet, die unter die Wunde wandert. Bei
pathologischen Veränderungen der Haut wie z.B. dem Plattenepithelkarzinom
der Haut exprimieren die tumorös veränderten Keratinozyten alle drei Moleküle
(Dano K, et al,; 1994). Die Ähnlichkeit der verschiedenen Expressionsmuster
weist darauf hin, daß es sich unter physiologischen und pathologischen
Bedingungen um dieselben Mechanismen handelt. Der Hauptunterschied
Einleitung
Seite 18
scheint in der Regulation der Prozesse zu liegen. In verschieden Tumoren
werden uPA und uPAR, aber auch die Inhibitoren entweder von Tumorzellen
oder von umgebenden Stromazellen in unterschiedlicher Art und Stärke
exprimiert (Dano K, et al,; 1994).
Abbildung 8 Plasminogen-Aktivator Kaskade modifiziert nach Verspaget et al.; 1995
Weiter klinische Ereignisse, bei denen eine erhöhte PAI-1 Aktivität zu finden ist,
sind Sepsis, Schwangerschaft, Thrombose, akuter Myokardinfarkt, u.a.
(Krischnamurti C. et al.; 1992), (Andreasen PA. et al; 1990).
Bei einigen Tumorarten ähnelt die Expression von uPAR derjenigen unter
nicht-neoplastischen Bedingungen. So enthalten zirkulierende neutrophile
Granulozyten und Monozyten uPA-und uPAR-Protein. Diese Zellen benutzen
die beiden Moleküle für ihre aktive Wanderung ins Gewebe (Dano K, et al,;
1994).
Die Mitwirkung des Plasminogen Aktivator Systems an der Invasivität solider
Tumoren wurde sowohl in histologischen Untersuchungen verschiedener
Tumoren als auch an künstlichen Basalmembranen in Zellkulturen für das
kleinzellige Bronchialkarzinom nachgewiesen (Liu G. et al.;1995). Unter den
Karzinomen, an deren invasiven Foci uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 exprimiert
Hemmstoffe:
PAI-1 & PAI-2
UPA-R
u-PA
t-PA
Aktivatoren
Plasminogen
Plasmin
Prokollagenase Kollagenase
Spaltung von:
Fibrin
Fibronectin
Laminin
Kollagenen
Tumorzelle
Einleitung
Seite 19
werden sind zum Beispiel Magenkarzinome, Mammakarzinome,
Kolonkarzinome, verschiedenen Typen von Brochialkarzinomen und
Nierenzellkarzinome (Heiss MM.; 1995), (Bianci E. et al.; 1995), (Naitoh H. et
al.; 1995), (Pedersen H. et al.; 1994), (Pedersen H. et al.; 1994 (2)), (Del
Vecchio S. et al.; 1993), (Hofmann R. et al.; 1996).
Einige Autoren schreiben dem Plasminogen Aktivator System klinische
Bedeutung zu, da seine Parameter vereinzelt oder in ihrer Gesamtheit in
einigen Karzinomen einen prognostischen Wert zu haben scheinen. Im Hinblick
auf die damit verbundene klinische Relevanz ihrer Resultate erhoffen sich die
Verfasser einiger Studien die Entwicklung neuer adjuvanter oder
intervenierender Therapiemöglichkeiten (Verspaget HW. et al.; 1995). Zur Zeit
sind Mammakarzinome die am intensivsten untersuchten soliden Tumoren in
Bezug auf die prognostische Bedeutung von uPA und PAI-1 (Schmitt M. et al.;
1995).
Bei der immunhistochemischen Anfärbung von Mammakarzinomen ist die
Färbung der Tumorzellen Membran-und Zytoplasma-assoziiert. Bei einigen
Schnitten kann eine schwache Reaktivität stromaler Zellen (Makrophagen oder
fibroblasten-ähnliche Zellen) festgestellt werden (Del Vecchio S. et al.;
1993),(Constantini V. et al.; 1996). Die Ermittlung der Antigenspiegel mittels
ELISA beim Mammakarzinom ergibt für hohe uPAR-Spiegel die Verbindung mit
einer schlechten Prognose, ein insgesamt noch stärkerer prognostischer Faktor
ist jedoch uPA (Duggan C. et al.; 1995).
Über die Signifikanz von uPAR-Spiegeln in Tumorgewebe in Bezug auf die
individuelle Prognose des Patienten wurde erstmals bei der Untersuchung von
Plattenepithelkarzinomen der Lungen mittels ELISA berichtet (Pedersen H. et
al.; 1994 (2)).
Heiss et al. beurteilen PAI-1, uPA und uPAR als neue funktionelle
Risikofaktoren in Magenkarzinomen. Besonders PAI-1 wird in ihren
immunhistochemischen Untersuchungen als ein neuer unabhängiger Marker
zur Erkennung von Hochrisikopatienten nach Tumorresektion verstanden. Es
fand sich allerdings keine signifikante Assoziation zwischen PAI-2 und einer
schlechten klinischen Prognose (Heiss MM.; 1995).
Einleitung
Seite 20
Bei einem Vergleich zwischen der tPA-und der uPA-Expression in
Magenkarzinomen stellte sich ein niedriger tPA-Spiegel als unabhängiger
prognostischer Marker heraus, der mit einer kürzeren Überlebenszeit der
Patienten assoziiert ist. Bei der Erfassung von uPA weist dagegen ein erhöhter
Antigenspiegel auf eine schlechte Prognose des Patienten hin (Ganesh S. et
al.; 1996).
In Kolonkarzinomen wird uPA im Zytoplasma der Tumorzellen produziert
(Naitoh H. et al.; 1995). uPA mRNA wird auch in Fibroblastenähnlichen
Strukturen des Tumorstromas gefunden. In den invasiv wachsenden
Tumordrüsen ist uPAR-mRNA in einigen Epithelzellen nachweisbar (Pyke C. et
al.; 1991(2) ). UPAR ist in wenigen neutrophilen Granulozyten und
Makrophagen vorhanden (Pyke C. et al.; 1991(2) ). PAI-1 ist in den
umgebenden Fibroblasten und Gefäßendothelzellen lokalisiert und PAI-2
ebenfalls in den Tumorzellen (Naitoh H. et al.; 1995), (Pyke C. et al.; 1991).
In Kolorektalen Karzinomen sind hohe uPA und hohe PAI-2-Spiegel ein
Hinweis auf ein kurzes Überleben. Außerdem ist das Verhältnis von uPA zu tPA
erhöht (Verspaget HW. et al.; 1995). Das Vorkommen der Parameter des
Plasminogen Aktivator Systems in malignen Tumoren des unteren
Respirationstraktes fällt unterschiedlich aus.
In den normalen Zellen der Bronchialschleimhaut wiesen Gris et al. tPA, uPA,
PAI-1 und PAI-2 nach. Die Anwesenheit von Aktivator und Inhibitor unter
nicht-malignen Bedingungen deutet die Notwendigkeit eines molekularen
Äquilibriums der beiden Stoffe an für die Regulation des fibrinolytischen
Systems. Im Gegensatz zu den Ergebnissen in der normalen Schleimhaut sind
die bronchogenen Tumoren charakterisiert durch einen allmählichen Verlust
ihrer spezifischen Anfärbbarkeit für PAI-1 und -2. Während Adenokarzinome
und Plattenepithelkarzinome der Lunge anfärbbar sind, werden die beiden
Inhibitoren in Kleinzellern, den Tumoren mit der schlechtesten Prognose, nicht
entdeckt (Gris JC. et al.; 1993).
Nagayama et al. fanden uPA, PAI-1 und PAI-2-Spiegel signifikant höher im
Tumorgewebe von nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen als im gesunden
Einleitung
Seite 21
Gewebe. Immunhistochemische Untersuchungen am transplantierbaren
Lewis-Lungen Karzinom haben gezeigt, daß uPA in Gebieten invasiven
Wachstums exprimiert wird und die uPA-vermittelte Proteolyse von den
Tumorzellen selbst reguliert wird. Sie fanden in der Peripherie des Tumors, das
heißt an Stellen stark destruktiven Wachstums eine hohe uPA und eine
niedrige PAI-1-Immunreaktivität (Kristensen et al., 1990). Bei der Bestimmung
des uPA-Spiegel im pulmonalen Adenokarzinom mit ELISA fand sich dagegen
keine Assoziation zur Prognose. PAI-1 erweist sich als unabhängiger
prognostischer Faktor, denn hohe Antigenspiegel bedeuten für den Patienten
ein kurzes Überleben (Pedersen H. et al.; 1994). Die Bestimmung hoher
uPAR-Spiegel in Plattenepithelkarzinomen der Lunge mittels ELISA korreliert
jedoch signifikant mit kurzer Überlebenszeit der Patienten, während die
uPA-und PAI-1-Spiegel keinen prognostischen Wert in dieser Patientengruppe
hatt. Allerdings ist die Kombination von hohen uPAR-mit hohen PAI-1-Spiegeln
mit kurzem Überleben assoziiert (Pedersen H. et al.; 1994 (2)). Im
Nierenzellkarzinom wird PAI-1 in Tumorzellen und Endothelzellen angefärbt
und sowohl der mRNA-Gehalt als auch der Proteinspiegel im ELISA sind
signifikant höher als in normalem Gewebe (Wagner SN. et al.; 1996).
In fortgeschrittenen Ovarialkarzinomen färben sich bei der
immunhistochemischen Anfärbung mit den auch in dieser Arbeit verwendeten
Antikörpern gegen uPA, PAI-1 und PAI-2 die Tumorzellen stark an und ebenso
einige Stromazellen. In den benignen Tumoren des Ovars reagieren nur einige
Stromazellen (Schmalfeldt B. et al.; 1995).
1.4 Histopathologische Untersuchung smethod en
Die Mehrzahl der Proben aus Lungentumoren, die der Pathologischen
Bewertung unterzogen werden stammen aus Sputum, Aspiraten und Biopsien.
Die spezifische Diagnose wird in der Routine des Pathologen anhand
histologischer und zytologischer Präparate gestellt. Ergänzend können unter
anderen labortechnischen Möglichkeiten immunhistochemische
Untersuchungen sinnvoll sein.
Einleitung
Seite 22
1.4.1 Die Immunhistochemische Untersuchung
Immunhistochemische Techniken haben den Vorteil, daß sie die
mikroanatomische Verteilung der Proteine aufdecken, die sowohl von normalen
als auch von Tumorzellen exprimiert werden (Constantini V. et al.; 1996).
1.4.2 Die ABC-Methode
Diese Technik basiert auf der Fähigkeit des Eiweißglykoproteins Avidin, 4
Moleküle des Vitamins Biotin physikalisch zu binden. Als Reagenz wird erstens
ein spezifisch gegen das zu bestimmende Antigen gerichteter Primärantikörper
benötigt. Zweitens ist ein mit Biotin konjugierter Sekundärantikörper notwendig,
der als „Brücke“ zwischen dem enzymgekoppelten Avidin und dem
Primärantikörper fungiert. Dabei bindet das Avidin mit seinen freien Stellen an
das Biotin. Das Enzym Peroxidase reagiert mit dem Chromogen
(3-Amino-9-Ethylcarbazol), welches an der Stelle des gesuchten Antigens
präzipitiert. Um falsch positive Ergebnisse zu verhindern muß die endogene
Peroxidase des Schnittes vor Beginn der eigentlichen Färbung mit 0,3% H2O2
blockiert werden. Dabei bildet die Hämguppe als Aktivitätszentrum dieses
Enzyms einen Komplex mit Wasserstoffperoxid, der unter Abspaltung von
Wasser und atomarem Sauerstoff zerfällt. Das Prinzip der Unterdrückung der
Peroxidase besteht somit im Vorhandensein eines Substratüberschusses bei
gleichzeitigem Fehlen eines Elektronendonors (z.B. chromogene Substanz).
Zellen und Zellkomponenten, die kein Antigen enthalten, werden durch die
Gegenfärbung im Kontrast dargestellt (Bourne, JA.; 1990).
1.5 Problemstellung
Die Rolle des Plasminogen-Aktivator-System bei der tumorassoziierten
Proteolyse wurde in den letzten Jahren in einer Reihe von Studien mit Hilfe
verschiedener histologischer Methoden und Beobachtungen in Zellkulturen
untersucht. Dabei wurden die Parameter dieses Enzymsystems auf ihre
klinische Relevanz in Bezug auf die Prognose der Patienten getestet. In der
Literatur finden sich Publikationen zu Karzinomen der Mamma, des
Gastrointestinaltraktes, der Nieren, der Ovarien und der Lungen. In dieser
Arbeit wurde die immunhistochemische Bewertung der zellulären Verteilung
von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 in formalinfixierten und in Paraffin
Einleitung
Seite 23
eingebetteten Gewebeschnitten von kleinzelligen Bronchialkarzinomen
durchgeführt, um das Muster der Koexpression von Aktivatoren und Inhibitoren
aufzuklären. Das Ziel der Untersuchungen war, den Grad der Expression der
vier Moleküle mit dem biologischen Verhalten des Tumors zu korrelieren und
die Bedeutung des Plasminogen-Aktivator-System für diese histologischen
Gruppe von Lungentumoren festzustellen. Bislang gibt es nur eine Studie, die
einen Überblick über die immunhistochemischen Reaktionen aller vier Proteine
im kleinzelligen Bronchialkarzinom im Vergleich zu drei anderen Subtypen
liefert.
Material und Methoden
Seite 24
2 Material und Method en
2.1 Untersuchung smaterial
Die in dieser Arbeit untersuchten Lungentumoren stammten aus
Lungenresektaten aus den Jahren 1992 bis 1994 aus der Abteilung für
Thoraxchirurgie der Ruhrlandklinik Essen. Die Proben wurden zur
histologischen Diagnosestellung, Einteilung des Differenzierungsgrades und
Bewertung des Lymphknotenstatus sowie zur Durchführung spezieller
Untersuchungstechniken an die Abteilung für Pathologie der Ruhr-Universität
Bochum weitergeleitet.
Es wurden die Gewebeproben von 26 Patienten ausgewählt, die sich im
Zeitraum von Juli 1992 bis Februar 1994 der Resektion eines Lungenflügels
oder Lungenlappens unterzogen hatten. Der histopathologische Bericht ergab
für 26 Patienten die Diagnose eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms. Das Alter
der Patienten lag zwischen 46 und 76 Jahren, das Durchschnittsalter somit bei
60 Jahren. Die Geschlechterverteilung betrug 20 : 6 zugunsten der männlichen
Patienten. Dies entspricht einem Anteil von 77 % für das männliche
Patientengut und einem Anteil von 23 % für das weibliche. Nach der
modifizierten WHO-Klassifikation von 1981 wiesen 17 Patienten mit
kleinzelligem Bronchialkarzinom den intermediären Zelltyp auf, 6 Patienten den
Haferkorntyp und 3 konnten keinem Subtyp zugeordnet werden.
2.2 Geräte
• Mikrotom
• Feuchte Kammern
• Lichtmikroskop (Olympus, Japan)
• Objektiv (40x)
• Okular (10x) mit Zählraster
Material und Methoden
Seite 25
2.3 Chemiekalien
• Paraffin
• Formalin
• Xylol
• Alkohol (100%, 95%, 70%, 50%, 30%)
• Pufferbad aus gebrauchsfertigem PBS-Pulver (Sigma Diagnostics, St. Louis,
USA) gelöst in 1l Aqua dest.
• Aqua dest.
• 0,3% H2O2 (routinemäßig im Labor des Institutes hergestellt aus 970 ml PBS
und 60 ml H2O2)
• gebrauchsfertiges Normalserum/ Blocking Solution (10% Non-immune Goat
Serum), Flasche Nr. 1A des Histostain SP Kit/ Broad Spectrum von Zymed,
San Francisco, Kalifornien, USA
• Monoklonaler Antikörper gegen humane Urokinase/ uPA (Produkt #3689 von
American Diagnostica Inc.)
• Monoklonaler Antikörper gegen humanen u PA Rezeptor/ CD 87 (Produkt
#3936 von American Diagnostica Inc.)
• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
Typ 1/ PAI-1 (Produkt #3785 von American Diagnostica Inc.)
• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
Typ 2/ PAI-2 (Produkt #3750 von American Diagnostica Inc.)
• gebrauchsfertiger biotinylierter Sekundärantikörper/ IgG (Goat anti-mouse,
Rabbit, Guinea Pig & Rat), Flasche Nr. 1B des Histostain SP Kit
• gebrauchsfertiges Streptavidin-Peroxidase-Konjugat, Flasche Nr. 1C
• AEC-Substrate Kit von Zymed, San Francisco, USA (bestehend aus
Reagenz A: Substratpuffer, 20x; Reagenz B: AEC-Chromogen, 20x und
Reagenz C: 0,6% Wasserstoffperoxid, 20x)
• Hämalaun
2.4 Antikörper
• Monoklonaler Antikörper gegen humane Urokinase/ uPA (Produkt #3689 von
American Diagnostica Inc.): Es handelt sich um einen monoklonalen
Material und Methoden
Seite 26
Anti-Maus-Antikörper der Subklasse IgG1. Der Antikörper ist gegen ein
Epitop auf der ß-Kette von uPA in der Nähe des enzymatischen Zentrums
gerichtet. Er reagiert sowohl mit freiem als auch rezeptorgebundenem
pro-uPA und uPA (Kobayashi H. et al.; 1991). Das Produkt #3689 färbt
nachweisbar Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Schnitte von
tumorösem und normalem Mamma-bzw. Kolongewebe, in dem Urokinase
vorhanden ist (Sier CFM. et al.; 1991), (Jankun J. et al.; 1993). Gemäß
Anleitung des Herstellers wurde das in lyophilisierter (pulverisierter) Form
gelieferte Produkt mit Aqua dest. zu einer Lösung wiederaufbereitet. Diese
wurde dann mit 0.02% NaN3 versetzt, um eine längere Haltbarkeit zu
erzielen. Das Produkt wurde bei +2° bis +8° C gelagert. Für die
immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper mit PBS auf 1: 100
verdünnt. Zuvor war eine Testreihe mit den Verdünnungen 1: 100, 1: 500
und 1: 1000 durchgeführt worden.
• Monoklonaler Antikörper gegen humanen u PA Rezeptor/ CD 87 (Produkt
#3936 von American Diagnostica Inc.): Es handelt sich um einen
monoklonalen Anti-Maus-Antikörper der Subklasse IgG2a. Dieser erkennt
den humanen Urokinase-Rezeptor (uPAR) (Mohanam S, et al.; 1993). Die
uPA-Rezeptoren können sowohl an Oberflächen gebundene, als auch
intrazelluläre als auch lösliche Formen sein (Chucholowski N. et al.; 1992).
Das Produkt #3936 färbt nachweisbar formalinfixierte und in Paraffin
eingebettete Schnitte von Mammakarzinomen (Jankun J. et al.; 1993), (Del
Vecchio S. et al.; 1993). #3936 färbt uPAR auf der Plasmamembran und im
Zytoplasma (Chucholowski N. et al.; 1992). Bei der Aufbereitung und
Lagerung des Produktes wurde wie bei dem Antikörper gegen uPA
verfahren. Für die immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper
gegen uPAR mit PBS auf 1: 25 verdünnt, nachdem zuvor eine Testreihe mit
den Verdünnungen 1: 25, 1: 50 und 1: 100 durchgeführt worden war.
• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
Typ 1/ PAI-1 (Produkt #3785 von American Diagnostica Inc.): Es handelt
sich um einen monoklonalen Anti-Maus- Antikörper der Subklasse IgG1.
Material und Methoden
Seite 27
Dieser entdeckt freies und komplexiertes PAI-1 (Heiss MM.; 1995) und wird
vom Hersteller ebenfalls zur Färbung von paraffineingebetteten Schnitten
empfohlen (Jankun J. et al.; 1993),(Nielsen LS. et al.; 1986). Das Produkt
wurde zu einer Lösung aufbereitet, mit NaN3 versetzt und in kleinen
Portionen zu jeweils 25 µl eingefroren. Zum Zeitpunkt der Färbung wurden
einzelne Portionen vorsichtig aufgetaut, um häufige Einfrier-Auftau-Zyklen
zu vermeiden. Für die immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper
mit PBS auf 1: 50 verdünnt. Ausgetestet worden waren zuvor die
Verdünnungen 1: 10, 1: 25 und 1: 50.
• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
Typ 2/ PAI-2 (Produkt #3750 von American Diagnostica Inc.): Es handelt
sich um einen monoklonalen Anti-Maus-Antikörper der Subklasse IgG2a.
Dieser ist gegen humanes PAI-2 gerichtet (Heiss MM.; 1995), (Astedt B. et
al.; 1985). Die Wiederaufbereitung und Lagerung erfolgten wie bei PAI-1.
Für die immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper gegen PAI-2
mit PBS auf 1: 20 verdünnt. Die Testreihe war mit den Verdünnungen 1: 10,
1: 25 und 1: 50 durchgeführt worden. Dabei hatte sich die Verdünnung 1: 10
als optimal erwiesen, war jedoch in Hinblick auf die für diese
Antikörperkonzentration benötigte Menge des Produktes nicht zu realisieren
gewesen.
Material und Methoden
Seite 28
2.5 Untersuchung smethod e
Einbettung des Gewebes und Herstellung der Schnitte
Es wurden Gewebestücke aus Resektaten in Formalin fixiert, dehydriert und in
Paraffin eingebettet. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden
die Paraffinblöcke, bei denen in der H.E.-Färbung Tumorgewebe nachgewiesen
worden war, mit einem Mikrotom in 4µm dicke Schichten geschnitten und im
40° C warmen Wasser auf beschichtete Objektträger aufgezogen. Die
präparierten Objektträger wurden mit dem entsprechenden Antikörper
beschriftet und über 24 h im Brutschrank bei 37° C getrocknet.
Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte
Zunächst erfolgte die Fixierung des Gewebes in einem Formalinbad für 10
Minuten. Hierauf wurden die Schnitte zur Entparaffinierung für 30 Minuten in
ein frisches Xylolbad eingelegt. Nach vollständiger Entfernung des
Einbettungsmediums wurden die Gewebeproben in einer absteigenden
Alkoholreihe, beginnend mit absolutem Alkohol, über 95%igen, 70%igen,
50%igen bis zu 30%igem Alkohol für jeweils 10 Minuten rehydriert. Schließlich
wurden die Objektträger für 5 Minuten in einem Pufferbad gespült.
Immunhistochemische Färbung der Schnitte
Die immunhistochemische Färbung wurde mit der im Labor des Institutes
routinemäßig angewandten Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC)
durchgeführt.
Die Präparate wurden mit 0,3%iger H2O2 für 15 Minuten vorbehandelt, um die
endogene peroxidatische Aktivität der Peroxidase zu blockieren. Der letzte
Schritt vor Beginn der eigentlichen Immunhistochemischen Färbung bestand in
einer weiteren Spülung in PBS für 5 Minuten. Die Objektträger wurden aus dem
Bad herausgenommen und um die Gewebeproben herum kreisförmig mit
Material und Methoden
Seite 29
einem Fettstift markiert. Nach Abtupfen überschüssiger Flüssigkeit mit
absorbierendem Zellstoff um die Präparate herum folgte die Ablage der
Objektträger in eine feuchte Kammer. Die Schnitte wurden sofort mit 1-2
Tropfen des gebrauchsfertigen Normalserums für 10 Minuten bei
Raumtemperatur vorinkubiert. Dies geschah zur Unterdrückung einer
unspezifischen Hintergrundfärbung, die sich aufgrund von Bindungen an stark
geladene Bindegewebskomponenten hätte ergeben können. Nach dieser
Einwirkzeit wurden die Schnitte nicht gespült, sondern die überschüssige
Flüssigkeit wurde nur abgegossen. Es wurde nun jedes Präparat mit ca. 200 µl
des jeweiligen Primärantikörpers bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Inkubationszeit betrug für uPA 60 Minuten, für uPAR 90 Minuten und für PAI-1
und PAI-2 jeweils 110 Minuten. Danach kamen die Objektträger für 5 Minuten
in das Pufferbad, wurden wieder um die Proben herum abgetupft und für 10
Minuten mit dem gebrauchsfertigen biotinylierten Sekundärantikörper benetzt.
Nach einer 5 minütigen Spülung in PBS wurde das gebrauchsfertige
Streptavidin-Peroxidase-Konjugat aufgetropft, welches für 10 Minuten einwirken
mußte. Der Spülung in PBS folgte das Auftragen des AEC-Chromogens als
Substratlösung, welche zuvor angesetzt worden war. Hierzu benötigte man für
jeweils 10 Schnitte je 1 Tropfen der Reagenzien A, B und C gemischt mit 1 ml
Aqua dest. Die Einwirkzeit des Chromogens betrug ebenfalls 10 Minuten.
Anschließend wurden die Schnitte mehrmals in verschiedenen PBS-Behältern
gespült und zur Gegenfärbung für 3 Sekunden in Hämalaun eingetaucht.
Darauf wurden die Objektträger nacheinander in 4 kleine Küvetten mit
Leitungswasser gehalten und zum Bläuen schließlich für 10 Minuten in der
letzten Küvette belassen. Die Präparate wurden mit jeweils 2 Tropfen
erwärmter d.h. flüssiger Glycerin-Gelatine und Aqua dest. eingedeckelt.
Mikroskopie der gefärbten Schnitte
In der Übersicht wurde ein geeigneter Bereich für die Beurteilung der
angefärbten Tumorzellen aufgesucht. Dabei war zu beachten, daß die Dicke
der Zellagen möglichst gering war und die Anfärbung der Tumorzellen
gleichmäßig war. Im Falle einer fleckförmigen Anfärbung wurde sowohl in dem
Material und Methoden
Seite 30
Fleck als auch in der Peripherie gezählt. Es wurden 10 Gesichtsfelder bei
höchster Vergrößerung (400x) unter Zuhilfenahme eines Zählrasters
ausgezählt. Die Zählung wurde von einem erfahrenen Pathologen wiederholt
und das Ergebnis bestätigt.
Bei einigen Schnitten wurde zusätzlich zur prozentualen Verteilung der
Anfärbung die Intensität bewertet. Die Intensität wurde in vier Kategorien, von
nicht angefärbt bis stark angefärbt, eingeteilt.
2.6 Statistische Method en
Die bei den immunhistochemischen Methoden und deren Auswertung
gewonnenen Ergebnisse wurden mit Hilfe statistischer Methoden ausgewertet.
Von jedem ermittelten Wert wurde ein arithmetisches Mittel errechnet und wenn
es sich um eine Normalverteilung handelte auch die Standardabweichung. Dies
war nur bei der Auswertung der Altersverteilung möglich.
Die Auswertung der Abhängigkeiten der einzelnen Antikörper untereinander
und der Vergleich der Anfärbungen mit dem durchschnittlichem Überleben der
Patienten erfolgte mit dem Korrelationskoeffizienten nach Bravais-Pearson.
Auch der statistische Vergleich zwischen Anfärbehäufigkeit und Färbeintensität
wurde mit Hilfe dieses Korrelationskoeffizienten ermittelt. Werte die nicht in
einer Intervallskala vorlagen konnten mit dieser statistischen Methode
allerdings nicht ausgewertet werden.
Bei der Auswertung wurden die Ergebnisse auf Abhängigkeiten der Antikörper
untereinander und in Hinblick auf ihre Prognose untersucht. Kombinationen der
Antigenexpression und deren Abhängigkeit zur Prognose der Erkrankung
wurden nicht auf eine statistische Abhängigkeit hin untersucht, da für einen
solchen Vergleich die Anzahl der getesteten Personen zu gering war.
Ergebnisse
Seite 31
3 Ergebnisse
Bei den Untersuchungen wurden die histologischen Präparate von 26 Patienten
mit einem kleinzelligem Bronchialkarzinom immunhistochemisch untersucht.
20 der Patienten waren Männer und 6 waren weiblich. Das entspricht einer
Geschlechterverteilung von 77% zugunsten der Männer und 23 % Frauen.
Das Alter der Patienten reichte von 46 bis 76 Jahren. Das durchschnittliche
Alter der Untersuchungsgruppe betrug 60 Jahre. Die Alterswerte streuen mit
einer Standardabweichung von 9 Jahren um den Mittelwert. Zwischen den
erkrankten Männern und Frauen ist kein signifikanter Altersunterschied
erkennbar.
Von den 26 Patienten hatten 17 ein zentral oder zentral bis intermediär
lokalisiertes Bronchialkarzinom. Bei den übrigen 9 Patienten befand sich die
Tumormasse in peripheren Segmenten oder intermediär bis peripher lokalisiert.
Von den 26 Patienten waren 24 dokumentiert. Der Krankheitsverlauf von zwei
Patienten war nicht mehr zu eruieren. Von diesen 24 verbliebenen Patienten
waren zum Zeitpunkt der Erhebung 15 verstorben. Es gab 9
Langzeitüberlebende. Das entspricht einem Verhältnis von 62,5% Verstorbener
zu 37,5% Überlebender.
Bei den lichtmikroskopischen Auswertungen wurden von jedem Präparat der
prozentuale Anteil der angefärbten Zellen an der Gesamtzellzahl ermittelt.
Der Antikörper uPA zeigte im Durchschnitt eine 25,2 prozentige Anfärbung der
Zellen. Der maximale, diesem Antikörper zuzuordnende Wert betrug 96%. Eins
der Präparate zeigte keine Reaktion. Dieser Antikörper zeigte in insgesamt vier
der 26 Präparaten eine deutliche stärkere Anfärbung in fleckiger Anordnung.
Diese wurde besonders berücksichtigt und ausgewertet. Dabei fand sich in den
Ergebnisse
Seite 32
fleckförmigen Arealen eine zwischen 1,4 und 11,4 mal stärkere Anfärbung der
Zellen als in anderen Bezirken des Tumors. Eine signifikante Korrelation
zwischen einer fleckförmigen Anfärbung und anderen Parametern der
Untersuchung ist nicht zu erkennen.
Bei elf der mit Antikörper gegen uPA untersuchten Tumoren wurde nicht nur
der Anteil der angefärbten Zellen ermittelt, sondern auch deren Farbintensität.
Für den Antikörper gegen uPA läßt sich feststellen, daß eine schwache
Beziehung zwischen der Anfärbung und deren Intensität besteht. Dies ergibt
sich aus dem Koeffizienten nach Bravais-Pearson von 0,64.
Bei einem Vergleich von uPA-Spiegeln über 60% mit der Überlebenszeit der
Patienten ist zu erkennen, daß 3 von vier Patienten bereits verstorben waren.
Der Langzeitüberlebende zeigte keine Hinweise auf Rezidive oder Metastasen.
Abbildung 9 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxyilin, Originalvergrößerung 400 fach,
starke Anfärbung des Zytoplasmas der Tumorzellen mit Antikörper gegen uPA
Bei der Untersuchung auf die Reaktivität von uPAR war eine durchschnittliche
Anfärbung von 43,2 % festzustellen mit einem Maximum von 86 %. Auch in
dieser Gruppe war einer der 26 Patienten als negativ einzustufen. Ebenso
wurde in dieser Gruppe nicht nur die prozentuale Anfärbung, sondern in 16
Ergebnisse
Seite 33
Fällen deren Intensität ermittelt. Aus dem Vergleich der beiden Parameter
ergibt sich ein Bravis-Pearson Wert von 0,75. Dieser Wert bedeutet das
Vorhandensein einer starken Abhängigkeit zwischen den Parametern
prozentuale Anfärbung und Färbeintensität.
8 der Patienten dieser Gruppe hatten einen uPAR Spiegel über 60%. Von
denen waren zum Untersuchungszeitpunkt die Hälfte verstorben.
Abbildung 10 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxyilin, Originalvergrößerung 400 fach,
starke Zytoplasmaanfärbung mit Antikörper gegen uPAR/ CD 87
Präparate der Gruppe mit PAI-1-Reaktion zeigten eine durchschnittliche
Anfärbung von 41,5%. Der maximale Wert betrug 86% und der kleinste
gemessene Wert lag bei 11%. Alle Gewebeschnitte dieser Gruppe zeigten eine
positive Reaktion. Bei 24 der 26 Patienten wurde auch die Färbeintensität
ermittelt. Bei der Berechnung des Korrelationskoeffizienten nach Bravais-
Pearson ergab sich ein Wert von 0,6 was einer nur schwachen Abhängigkeit
entspricht. Ebenso wie in der Gruppe der mit dem Antikörper gegen uPAR
untersuchten Proben waren zum Untersuchungszeitpunkt bereits 50% der
Patienten verstorben, die eine erhöhten Meßwert mit über 60% Anfärbung
zeigten.
Ergebnisse
Seite 34
Abbildung 11 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 50 fach,
homogene Anfärbung der Tumorzellverbände mit Antikörpern gegen PAI-1
Abbildung 12 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 400 fach,
deutliche Anfärbung des Zytoplasmas einzelner Tumorzellen mit Antikörper gegen PAI-1
Ergebnisse
Seite 35
Abbildung 13 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 400 fach,
starke Reaktion einzelner Zellen mit Antikörper gegen PAI-2
Abbildung 14 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 400 fach,
regelmäßige geringergradig ausgeprägte Reaktion des Tumors mit Antikörper gegen PAI-2
Ergebnisse
Seite 36
Die Untersuchungen mit dem Antikörper gegen PAI-2 zeigten eine maximale
Anfärbung von 77% der Zellen, aber auch in 2 Fällen eine negative Reaktion.
Die durchschnittliche Anfärbung lag bei 24 % der Gesamtzellzahl. Die
Aufzeichnung der Färbeintensität bei 16 Patienten dieser Gruppe ergab keine
Abhängigkeit für diesen Antikörper. Auffallend war, daß alle Patienten mit einer
hohen Anfärbung über 60% verstorben waren.
Insgesamt war die Spannbreite in der prozentualen Anfärbung bei allen
Kollektiven und Parametern außerordentlich hoch und schwankte zwischen 0
und 96%.
Bei keiner der negativen Proben zeigte sich gleichzeitig eine zweite negative
Reaktion mit einem anderen Antikörper.
Die Beobachtungen über einen Zeitraum von 3 Jahren ergaben 9
Langzeitüberlebende. Bei 2 Patienten ist der Verbleib nicht mehr zurück zu
verfolgen. Die längste Überlebenszeit zum Zeitpunkt der Untersuchungen
betrug 60 Monate bei den Langzeitüberlebenden und die kürzeste ermittelte
Überlebenszeit lag bei 41 Monaten. Die 15 bereits verstorbenen Patienten
hatten eine maximale Überlebenszeit von 42 Monaten und ein Minimum bei 2
Monaten.
Zwischen der Überlebenszeit und der Antikörperexpression ist kein signifikanter
Unterschied festzustellen. Dies gilt für jeden der verwendeten Antikörper. Die
Bravais-Pearson-Werte lagen dabei zwischen 0,07 und 0,19.
Ergebnisse
Seite 37
Vergleich der Antikörper untereinander:
uPA uPAR PAI-1 PAI-2
uPA - 0,36 0,63 0,06
uPAR 0,36 - 0,51 0,37
PAI-1 0,63 0,51 - 0,09
PAI-2 0,06 0,37 0,09 -
Tabelle 1 Die Tabelle zeigt die Korrelation d er einzelnen Antikörper untereinander.
Aufgeführt sind d ie Bravais-Pearson-Korrelationskoeff izienten:
Mit einem Bravais-Pearson-Korrelationskoeffizienten von 0,63 besteht
zwischen der Anfärbung mit PAI-1 und uPA eine schwache bis mäßige
Abhängigkeit. Der Wert von 0,51 zwischen uPAR und PAI-1 ist ebenfalls als
geringfügige Abhängigkeit der beiden Antikörper voneinander zu bewerten.
Zwischen allen anderen Kombinationen bestehen keine signifikanten
Abhängigkeiten (Tabelle 1).
Bei einem Vergleich zwischen der Tumorgröße und der Expression der
verschieden Antigene ist keine signifikante Abhängigkeit nachzuweisen.
Diskussion
Seite 38
4 Diskuss ion
4.1 Diskuss ion d er Ergebnisse
Von den 26 untersuchten Patienten waren 20 der Patienten Männer und
6 Frauen. Das entspricht einer Geschlechterverteilung von 77% zugunsten der
Männer und 23 % Frauen. Diese Geschlechterverteilung von 2,4: 1 entspricht
der Verteilung in der Klinik. Auch hier finden sich gehäuft männliche Patienten
mit einem kleinzelligen Bronchialkarzinom. Es ist allerdings zu berücksichtigen,
daß die älteste Gewebeprobe aus 1992 stammte und die jüngste aus 1994 und
daher das Geschlechterverhältnis der in diesem Zeitraum üblichen Quote
entspricht.
Das durchschnittliche Alter der untersuchten Personen betrug 60 Jahre. Auch
dieser Wert läßt sich mit dem Manifestationsalter des Patientengutes im
Krankenhaus gut in Übereinstimmung bringen (Colby T. et al.; 1994). Zwischen
den erkrankten Männern und Frauen ist sowohl in der Klinik als auch in dieser
Untersuchung kein signifikanter Altersunterschied erkennbar.
Bei 24 der 26 Patienten war es möglich, deren Krankheitsverlauf weiter zu
verfolgen. Von diesen 24 Patienten waren zum Zeitpunkt der Erhebung 15
verstorben. Das bedeutet, daß bereits innerhalb von 3,5 Jahren 67,5 % der an
einem kleinzelligen Bronchialkarzinom erkrankten Patienten verstorben sind.
Die 5-Jahres-Überlebensrate für Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom
beträgt 2-10% (Colby T. et al.; 1994). Die im Patientengut dieser Arbeit
ermittelte Zahl von 32,5% in 3,5 Jahren ist höher als normalerweise bei diesem
hochmalignen Tumor zu erwarten wäre. Der Grund für diese Diskrepanz liegt
möglicherweise in der zu geringen Zahl verfolgter Erkrankungsfälle.
Andererseits fehlen bis zum Erreichen eines Überlebens von 5 Jahren noch 1,5
Jahre, in denen die Prozentzahl stark sinken könnte.
Bei allen vier Antikörpern war eine Immunreaktivität der Tumorzellen zu
beobachten, deren Spannbreite jedoch stark variierte. Die verwendeten
Diskussion
Seite 39
monoklonalen Antikörper waren zwar in den meisten Fällen in der Lage, die
gesuchten Antigene sichtbar zu machen, es ließ sich allerdings keine
einheitliche Reaktivität erkennen und keine signifikante Abhängigkeit der
Expression von uPA, uPA-R, PAI-1 und PAI-2 von der Überlebensdauer
nachweisen. Folglich konnte in dieser Arbeit keinem der untersuchten
Parameter ein prognostischer Wert für den klinischen Verlauf des kleinzelligen
Bronchialkarzinoms zugeschrieben werden. Aufgrund vieler Experimente an
anderen Tumoren wäre ein Zusammenhang zwischen Antigenexpression und
Prognose zu erwarten gewesen. Dabei ist die Art des Tumors, das
Ausgangsorgan und die Lokalisation zu berücksichtigen.
In Mammakarzinomen lassen hohe uPAR-Spiegel auf einen negativen
Ausgang der Erkrankung schließen (Duggan C. et al.; 1995), insgesamt halten
die Autoren aber uPA für den stärkeren prognostischen Faktor. Del Vecchio et
al. unterstützen die Hypothese, daß uPAR in der Mamma eine zentrale Rolle
beim Erwerb eines malignen Phänotyps spielt, da die stärkste
Immunperoxidasefärbung an invasiven Foci zu erkennen ist. Sie stellen den
Rezeptor als geeigneten prognostischen Faktor für das Mammakarzinom dar.
Weiter Autoren bestätigen uPAR als pathologisches Merkmal und weisen auf
eine gleichzeitige Überexpression des Plasminogenaktivators vom
Urokinase-Typ und PAI-1 in destruktiv wachsenden Tumoren hin (Jankun J. et
al.; 1993), (Constantini V. et al.; 1996). Die tPA-Expression scheint nicht mit
Kennzeichen von Malignität assoziiert zu sein. Bianchi et al. erklären die
Produktion von PAI-1 durch das Tumorstroma in der Mamma als einen
Schutzmechanismus des Tumors selbst vor unkontrollierter Proteolyse.
Weiterhin ist PAI-1 ein unabhängiger neuer Marker in Magenkarzinomen zur
Erkennung von Hochrisikopatienten nach Tumorresektion. PAI-1 wird hier als
aussagekräftiger als uPA beurteilt. (Heiss MM.; 1995), (Ganesh S. et al.; 1996).
In Nierenzellkarzinomen scheint PAI-1 wie im Magen das zuverlässigste
Merkmal für die Vorhersage eines frühen Rezidivs zu sein, denn der
Antigenspiegel korreliert charakteristisch mit der Entwicklung von Metastasen
(Hofmann R. et al.; 1996). Den Zusammenhang zwischen Tumor-assoziierten
Diskussion
Seite 40
Enzymsystemen und Metastasierung bestätigen Schmalfeldt et al. mit ihren
immunhistochemischen Untersuchungen an Ovarialkarzinomen, in denen sie
einen simultanen Anstieg der Aktivator-und Inhibitor-Konzentrationen in
Tumorgewebe und in Metastasen im Omentum majus beobachteten
(Schmalfeldt B. et al.; 1995).
Beim Vergleich dieser Studien fällt die Gewichtung von PAI-1 als unabhängiger
prognostischer Faktor in vielen Karzinomen auf. Es gibt bislang keinen Bericht
über hohe PAI-1-Spiegel, die mit einer guten Prognose des Patienten assoziiert
sind. Die Rolle von PAI-2 in der Tomorprogression bleibt dagegen unklar. Heiss
et al. fanden keine signifikante Assoziation zwischen hohem PAI-2-Gehalt und
malignen Merkmalen. Nagayama et al. fanden dagegen hohe PAI-2-Spiegel
und eine starke Abhängigkeit zwischen PAI-2 und uPA in Fällen ohne
Lymphknotenmetastasen. Daraus schließen sie, daß die Freisetzung von PAI-2
als Antwort auf angestiegenes uPA in Lymphknoten-positiven Fällen gestört ist
und somit ein niedriger PAI-2 Gehalt mit einer Metastasierung in die
Lymphknoten assoziiert ist (Nagayama M.; 1994). Astedt et al. sehen eine
physiologische Signifikanz im Vorkommen des Proteins in der Plazenta zum
Schutz vor Blutungen (Astedt B. et al.; 1985). Diese Untersuchung konnte
ebenfalls keinen signifikanten Beitrag zur Bedeutung von PAI-2 in malignen
Lungentumoren leisten.
Die Lungentumoren verhalten sich hinsichtlich des Gehaltes an uPA, uPAR,
PAI-1 und PAI-2 sehr heterogen. Zu einem ähnlichen Ergebnis wie in dieser
Arbeit kommen Gris et al. aufgrund ihrer immunhistochemischen Anfärbung
von vier Subtypen des Bronchialkarzinoms. Sie untersuchten Schnitte von
Adenokarzinomen, Plattenepithelkarzinomen, großzelligen und kleinzelligen
Karzinomen mit den Antikörpern MUKI gegen uPA, MAI-11 gegen PAI-1 und
MAI-12 gegen PAI-2. Während der Plasminogenaktivator in allen
Karzinomtypen gleichmäßig angefärbt war, fanden sich bei den Inhibitoren
statistisch signifikante Differenzen. Die Reaktion von PAI-1 und PAI-2 in
Adenokarzinomen war am stärksten, verringerte sich in der oben genannten
Reihenfolge der histologischen Typen bis zum Verlust einer Anfärbung von
Diskussion
Seite 41
kleinzelligen Karzinomen. Diese negative Reaktion PAI-1 und PAI-2 in allen
Präparaten stimmt nicht mit den immunhistochemischen Ergebnissen dieser
Arbeit überein. Die Ursache könnte in der Anwendung unterschiedlicher
Antikörper und unterschiedlicher Färbemethoden liegen. Da der histologische
Typ eines Lungentumors mit dem Ausprägungsgrad der Malignität
zusammenhängt und das kleinzellige Bronchialkarzinom die kürzeste
Überlebenszeit aufweist, läßt sich folglich sein invasives Verhalten und seine
schlechte klinische Prognose mit der Expression der Plasminogenaktivatoren
allein nicht erklären. Gris et al. vermuten aus diesem Grund in den PAI-Genen
Tumorsuppressorgene. Auch bei den übrigen histologischen Typen wurde kein
charakteristischer Bezug zum Plasminogen Aktivator System entdeckt.
Auffallend in dieser Studie war überdies die gleich starke Immunreaktivität des
normalen Bronchialepithels im Vergleich zu den bronchogenen Neoplasien. Die
Autoren verstehen das Vorkommen von uPA und PAI-1 in der gesunden
Schleimhaut als molekulares Äquilibrium zwischen Aktivatoren und Inhibitoren,
welches die Aktivierung des fibrinolytischen Systems regulieren könnte (Gris
JC. et al.; 1993).
Andere Untersucher stellten bei der Beobachtung der Interaktionen kultivierter
Zellen eines nicht-kleinzelligen Lungentumors mit einer künstlichen
Basalmembran fest, daß uPA und PAI-1 im Verlauf des Matrixabbaus
miteinander kooperieren. Folglich ist eine kritische Balance zwischen den
beiden Proteasen für die optimale Invasivität eines Tumors zumindest in vitro
erforderlich (Liu G. et al.;1995). Diese Aussage könnte die Forderung eines
Äquilibriums unter physiologischen Bedingungen von Gris et al. widerlegen,
wenn man die Ergebnisse auf die Situation in vivo überträgt.
Eine weitere immunhistochemische Studie beschäftigte sich mit der Expression
von uPA, tPA, PAI-1 und PAI-2 in Adenokarzinomen und
Plattenepithelkarzinomen der Lungen und entdeckte signifikant höhere Spiegel
für alle Parameter im Vergleich zu normaler Schleimhaut. Die Ausnahme
bildete tPA, welches in den Karzinomen noch schwächer reagierte als in
normalen Proben. Da tPA in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht wurde, ist
Diskussion
Seite 42
ein Vergleich mit eigenen Ergebnissen nicht möglich. Trotzdem unterstützen
die Ergebnisse von Nagayama et al. die Feststellung, daß das
Plasminogenaktivator System eine wichtige Rolle in der Ausbreitung von
Tumoren allgemein und speziell von nicht-kleinzelligen Lungentumoren spielt.
Es konnte jedoch ebenfalls keine Korrelation zwischen den Antigenspiegeln
und der primären Tumorklassifikation oder dem klinischen Stadium hergestellt
werden (Nagayama M.; 1994).
In einer anderen Publikation über das pulmonale Adenokarzinom erweist sich
nur PAI-1 als unabhängiger prognostischer Faktor, der signifikant mit einer
kürzeren Dauer des Gesamtüberlebens assoziiert ist. PAI-1 soll das
Tumorgewebe vor dem proteolytischen Abbau schützen, der im umgebenden
Gewebe stattfindet (Pedersen H. et al.; 1994). Dies wurde bereits im
Zusammenhang mit Mammakarzinomen erwähnt und erklärt auch die
Expression von PAI-1 in Stromazellen in nicht-invasiven Arealen von
Lewis-Lungentumoren (Kristensen et al., 1990).
Die Gruppe von Pedersen berichtete als erste von der prognostischen
Bedeutung des uPA-Rezeptors in Plattenepithelkarzinomen der Lungen. Hier
korrelierten hohe Spiegel des Proteins im ELISA in Kombination mit hohen
PAI-1-Spiegeln mit einem kurzen Überleben der Patienten, während uPA und
PAI-1 als einzelne Moleküle nicht relevant waren. Für das großzellige
Bronchialkarzinom fand sich in derselben Studie kein Anhalt für eine
prognostische Aussagekraft für einen der Parameter (Pedersen H. et al.; 1994
(2)).
Die bisherigen Studien über Tumoren der Lunge stellen keinen
Zusammenhang zwischen Aktivatoren oder Inhibitoren und einer schlechten
Prognose fest. Eine Ausnahme bilden das pulmonale Adenokarzinom der
Lunge mit PAI-1 und das Plattenepithelkarzinom mit uPAR als prognostischen
Faktoren. Die vorliegende Arbeit kann ebenfalls keine Abhängigkeitn des
klinischen Verlaufes von Patienten mit einem kleinzelligen Bronchialkarzinom
und den Vorgängen der Tumor-assoziierten Proteolyse herstellen. Somit muß
Diskussion
Seite 43
angenommen werden, daß andere Faktoren für die besondere Malignität des
Tumors von Bedeutung sind. In dieser Arbeit wurde versucht, die Expression
von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 mit der Tumorgröße in Zusammenhang zu
setzen. Es fanden sich keine signifikanten Abhängigkeiten.
Im Vergleich mit immunhistochemischen Untersuchungen an nicht-kleinzelligen
Bronchialkarzinomen zeigten dort die uPA-Spiegel eine signifikante positive
Korrelation mit dem Tumordurchmesser. Daraus schließen die Autoren auf den
Einfluß der Aktivität von uPA auf das Tumorwachstum (Nagayama M.; 1994).
Im Mammakarzinom konnten Del Vecchio et al. keine Relation zwischen uPAR
oder uPA und der Tumorgröße nachweisen. Für das Kolonkarzinom ergab sich
ebenso keine Korrelation zwischen Farbintensität von uPA und Merkmalen wie
Tumordifferenzierung oder Stadium (Sier CFM. et al.; 1991). In neoplastischem
Kolongewebe von Patienten mit familiärer Adenomatosis Coli ändern sich
weder uPA noch PAI-1 parallel zur Adenomgröße. Die einzige Korrelation
besteht zwischen einem sinkenden tPA-Spiegel und zunehmenden
Adenomdurchmessern im Kolon. Die Ursache dafür liegt wahrscheinlich in
einer Änderung der Vaskularisierung (Sier CFM. et al.; 1995). Schließlich gibt
es in Nierenzellkarzinomen keine statistisch signifikante Beziehung zwischen
Urokinase und TNM-Status oder Differenzierungsgrad (Hofmann R. et al.;
1996).
Ein Vergleich der Expression der Antikörper untereinander ergab keine
Abhängigkeit außer einem schwachen Zusammenhang zwischen der
Expression von PAI-1 und uPA. In der Literatur fand sich im pulmonalen
Adenokarzinom keine Korrelation zwischen uPA und PAI-1 (Pedersen H. et al.;
1994). Dagegen wiesen Liu et al. in in vitro Versuchen nach, daß eine optimale
Invasivität ein ausgeglichenes Verhältnis zwischen uPA und PAI-1 erfordert.
Meine Beobachtungen könnten dieses Ergebnis bestätigen.
Die vorliegenden Untersuchungen ergaben schließlich eine geringfügige
Korrelation zwischen PAI-1 und uPAR. Dieses Merkmal findet sich in Berichten
über Plattenepithelkarzinome der Lungen, in denen eine Kombination von
Diskussion
Seite 44
hohen uPAR-mit hohen PAI-1-Spiegeln mit kurzem Überleben assoziiert ist
(Pedersen H. et al.; 1994 (2)). Aus den schwach ausgeprägten Abhängigkeiten
in dieser Arbeit läßt sich trotz einiger Literaturvergleiche keine Schlußfolgerung
für die Korrelation der Antigene ableiten, da das Plasminogen Aktivator System
keine Bedeutung in den immunhistochemischen Untersuchungen hat.
4.2 Diskuss ion d er Fehlermöglichkeiten
In diesen Untersuchungen wurde sehr genau darauf geachtet, alle
Arbeitsschritte, einschließlich des Zählverfahrens, mit einheitlichen Methoden
zu bearbeiten. Dennoch ergeben sich eine Reihe von Fehlermöglichkeiten.
Die verwertbare Patientenanzahl betrug 26. Diese Anzahl ist für
aussagekräftige statistische Auswertung zwar geeignet, aber es besteht die
Möglichkeit von statistischen Fehlern durch zufällige Ereignisse. Diese
Fehlermöglichkeit könnte durch eine größere Anzahl untersuchter Tumoren
verringert werden.
Bei der Auswertung der histologischen Schnitte wurde immer die gleiche
Methodik verwandt. Fehler in der Zählung wurden durch das Auszählen
mehrerer Gesichtsfelder minimiert. Eine nochmalige Erhöhung der
ausgezählten Felder wäre eine weitere Möglichkeit die ohnehin geringe
Fehlerrate nochmals zu verringern.
Die Färbungen der Präparate erfolgte zwar immer mit der gleichen Methode,
aber sie mußten aus technischen Gründen immer in mehreren Sitzungen
durchgeführt werden. Hieraus könnte sich eine mögliche Fehlerquelle ergeben,
da geringfügige Unterschiede in den Zeiten der Inkubationen oder Unterschiede
in den Konzentrationen sich summieren könnten.
Diskussion
Seite 45
Das kleinzellige Bronchialkarzinom zeigte oft viele Nekrosen. Diese wurden im
histologischen Bild als Quetschungsartefakte erkennbar. Diese Stellen waren
nur mit großen Schwierigkeiten auszählbar und somit auch eine potentiell
Fehlerquelle, die aber nicht zu vermeiden ist.
Die Zellen des untersuchten Tumors haben eine geringe Kern-Plasma-Relation.
Damit ähneln sie in ihrer histologischen Morphologie der von Lymphozyten.
Verwechslungen sind nicht immer auszuschließen. Der gemessene Prozentsatz
könnte als falsch zu niedrig ermittelt werden, da Lymphozyten für negativ
reagierende Tumorzellen gehalten werden könnten.
Zusammenfassung
Seite 46
5 Zusammenfassung
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Expression der Antigene für die
Serinproteasen uPA, uPA-R, PAI-1 und PAI-2 beim kleinzelligen
Bronchialkarzinom.
Nach der immunhistochemischen Anfärbung von insgesamt 26
Gewebeschnitten von Patienten mit dieser Erkrankung wurden diese durch
Auszählung und Beurteilung der Färbeintensität ausgewertet. Es wurde jeweils
für jeder einzelne Antikörper mit der Überlebenszeit und der Anzahl der
Langzeitüberlebenden in Beziehung zur Prognose gesetzt. Dabei ergab sich
aber keine signifikante Abhängigkeit zwischen diesen Parametern. Alle
Korrelationskoeffizienten lagen bei 0,1.
Lediglich beim Vergleich der Expression der Antikörper untereinander konnte
ein schwache Abhängigkeit zwischen der Expression von PAI-1 und uPA mit
einem Korrelationskoeffizienten nach Bravais-Pearson von 0,61 nachgewiesen
werden. Auch zwischen der Expression von PAI-1 und uPA-R war ein geringe
Abhängigkeit vorhanden (Bravais-Pearson: 0,51). Zwischen allen anderen
Antikörpern bestehen keine Zusammenhänge.
Auch bei einem Vergleich zwischen der Tumorgröße und der Expression der
verschieden Antigene ist keine signifikante Abhängigkeit nachzuweisen.
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