Die Erzielung übermikroskopischer Elektronenbilder von Gewebeschnitten

(Aus dem Laboratorium fiir Strukturuntersuehungen der Gewerkschaft Mathias Stinnes und dem Forschungsinstitut der AEG.)

Die Erzielung iibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten.

Das Dachschnittverfahren, das Ultraschallmikrotom und das Gewebeoberfl~ichenabdruckverfahren*.

Von Frit'drich Krause, Berlin-Lichterfelde-We~t.

Mit 26 Abbildungen im Text.

(Eingegangen am 1. J.tt.n{ 1943.)

Einleitnn~. Das magnetische und alas elektrost~tische Elektronenmikroskop haben

an AuflSsungsvermSgen das Lichtmikroskop um mehr als ct~s 50fache fibertroffen und damit auch der Medizin die ~[Sglichkeit gegeben, die seit den Tagen Abbes durch das gegebene ErkenntnisvermSgen des mit dem Lichtmikroskop gesch~trften Auges in der , ,Ebene" sich entwickelnden Forschung nunmehr in die bisher unsichtbare ,,Tiefe" des , , invisiblen" Virus 1,~."- des Kolloids 3 und der groBen Molekiile 4 auszudehnen.

Nachdem Mar ton 5 und d~nach Driest und z'[[iiller 6 sich mi~ der elektronenoptischen Aufnahme yon organischen Objekten befaBt ha t ten , ge- lang mir naeh erstmaliger Erreiehung 7 und danach (~'berschreitung der ]iehtmikroskopischen AuflSsungsgrenze durch Verbesserung des Elek- tronenmikroskopes s der N~chweis, dab das neue Ger~t aueh fiir die Forschungsaufg~tben der Biologie 9 und insbesondere ffir die .~[edizin _~nwendung linden kann! ]Die nachfolgenden Entwicklungsarbeiten, die durch alas Forschurtgslabor tier AEG und das Labor fiir ~"bermikroskopie der Siemens & ttalske AG. inzwischen ausgefiihrt wurden, haben der Medizin bereits neue wertvolle Erkenntnisse vermit tel t ! Bei diesen Arbeiten handelt es sich um die elektronenoptische Aufnahme frei- liegender Einzelstrukturen 1~ yon Mikroorganismen, und allerdings nur bei sehr dtinnen Bakterienleibern und ithnlichen Objekten konnten auch Innenst rukturen ~1 zur D~rstellung gebracht werden.

So eindrucksvoll und so wichtig diese morphologischen Erkenntnisse ffir die Bakteriologie auch zweife]sohne sind, so geben sie uns doch keinen AufschluB fiber deren Wirken im Org~nismus, in der k ranken Zelle. Erst die elektronenfibermikroskopische Aufnahme yon Gewebe- schnitten wird uns Einb]ick in den kol]oiden Feinb~tu der gesunden und

* D l l .

Die Erzielung fibermikroskopiseher Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. a47

der kranken Zelle oder z. ]3. Kenntnis fiber den Angriffsort eines be- stimmten bisher invisiblen Erregers im Zelleib geben kSnnen. - - Ich denke hierbei insbesondere auch an den morphologischen Aufbau der Krebszelle, den man bis heute noch nicht kennt, so dab man in der Diagnostik einer Geschwulst auf gr6bere Zeichen, wie Zellvermehrung, infiltrierendes Wachstum usw. angewiesen ist. Die Kenntnis der Krebs- zellenfeinstruktur wird uns ferner morphologische ]3eziehungen zum Chemismus der entarteten Geschwulstzelle geben kSnnen, dessen Unter- schiede gegenfiber der normalen Zelle uns im pathologisch-anatomischen Sinn bisher wegen der Unzul/~nglichkeit der Leistungsfiihigkeit des Licht- mikroskopes verborgen blieb.

Aber nicht nur die Zellforschung wird Vorteile aus dieser Methode ziehen. Auch die Klinik wird hinsichtlich der Diagnosestellung und der folgenden Therapie unschi~tzbaren Gewinn haben. Durch Verfeinerung der pathologischen Anatomie, wie sie die elektronenfibermikroskopische Methode mSglich macht, wird es gelingen, Gewebeverhnderungen schon vor Ausbruch der groben Krankheitserscheinungen zu erkennen und zu behandeln, ehe es zu schweren irreversiblen Erscheinungen kommt. Ich denke z. ]3. an die prSskorbutische Phase bei Vitamin C-Avitaminose.

Wenn es bisher nut wenigen ~' ,t N. ii ~. ~, gelungen ist, Gewebe mit dem Elektronenmikroskop aufzunehmen, so liegt es daran, dab das zur ]3ildentstehung fiihrende Zusammenwirken yon Strahlung, Objekt und Abbildungsmechanisnms weir schwieriger zu erffillende Bedingungen an die Beschaffenheit des Objekts stellt, als das beim Lichtrnikroskop der Fall ist.

Wghrend in der Lichtmikroskopie die Dicke des Schnittes keine ausschlaggebende Rolle spielt trod wit in der Regel mit Schnittdicken yon 2 -10 -a bis 5 . 1 0 -a mm optimale Bedingungen haben, sind diese Schnittdicken ffir die elektronenoptische Untersuchung g~nzlich unge- eignet. In der elektronenfibermikroskopischen Forschung mfissen ~-ir die selbst ffir die besten Mikrotome nieht unterschreitbare Schnittdieke von 1 �9 10 -a mm schon als zu dick bezeichnen, und es gilt hier allgemein der S~tz, dab die diinnste lVolie das beste Elektronenbild erreichen lgBt.

Im Rahmen der noch nieht verSffentliehten Entwicldungsarbeiten des von mir geleiteten Labors ftir Strukturuntersuehungen, Berlin W 35, die zum Ban eines neuen magnetischen Elektronenfibermikroskops ffihrten, befaBte ich mieh unter anderem eingehend mit der LSsung dieses Problems.

Die vorliegende Arbeit m~cht es sich zur Aufgabe, die Vorggnge bei der Elektronendurehstrahlung yon organischen Gewebeschichten zu untersuchen, um ein klares Bild fiber die aus den theoretischen {)berle~mgen zu erwartenden M6glichkeiten zu gex~qmnen. Ferner werden neue Methoden er6rtert und entwickelt, die zur Gewinnung ffir die elektronenmikroskopische Untersuchung geeigneter Schnitte ffihren. Das

348 Friedrieh Krause:

nach der 5'Iethode des Keilschnittverfahrens yon M. v. Ardenne vorgeschlagene Dachschnittverfahren, das Ultrasehallmikrotom des Ver- fassers und das Abdruckverfahren yon Gewebeoberflis nach Mahl in Verbindung mit dem Ultrasehallmikrotom werden besprochen.

Der Ein/ luf l des Ob]ektes au] d e n Strahlengang.

Vergegenw'Xrtigen wir uns den Weg yon Elektronenstrahlen bei Ab- bildung eines in einer homogenen Plasmaschicht Z befindlichen Zell- kerns K nach der Abb. 1, so kSnnen wir folgende auf den Elektronenstrahl

wirkonde Einfliisse erkennen:

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Al)b. 1.

1. Die Absorption. 2. Die ehromatische Streuung. 3. Die rgumliche Streuung. 4. Die elektrostatischen:Kr'Mte. Um die Gr613e der genannten

KrSfte.in Beziehung zur Aufl6sung zu setzen, mug man sieh vergegen- wSrtigen, dab die Herabsetzung der Bfldgtite, der AuflSsung zwei Ursachen haben kann. Es ist einmal die Intensi t5tsmodulat ion und das andere Mal die Veruntreuung des geometrischen Laufes der abbildenden Elektronen. Ffir die Intensi t~tsmodulat ion ~ l t , dab nur dann ein Kontras t als Schwiir- zungsunterschied auf der photo- graphischen Plat te erzielt werden

kann, wenn die ~-~nderung des du,'eh die genannten Krgfte hervorge- rufenen Stromanteils im Bride etwa 10% betritgt.

Zu den naehstehenden {)berlegungen, Yormeln trod Kurv-endar- stellungen sei gesagt, dab sie sieh an die schon 1925 yon Lenard 12 fest- gelegten Werte halten. In den naehfolgenden Jahren his heute sind tiber das zur Debat te stehende Thema keine riehtungsgebenden Versuche gemaeht worden, die man mit gleieher Bereehtigung zu {Jberlegungen heranziehen k6nnte wie die exakten Arbeiten Lenards! - - Trotzdem sind die Ansehauungen Lenards erg/tnzt und erweitert worden und die Auffassungen haben z. B. gewisse 2knderungen erfahren.

So stellt man sieh heute den Vorgang der Absorption nichl~ mehr allein dadureh vor, dall die Absorption eines Elektrons sieh im wesentlichen in einem Atomkern abspielt, sondern 1/igt ebenso die Auifassung gelten, dag ein langsames Bremsen der Elektronengesehwindigkeit bis zum Werte Null eintritt.

Die Erzielung tibermikroskopischer Elektronenbflder von Gewebeschnitten. 349

Es war jedoch nieht die Aufgabe dieser Arbeit, diese dureh Versuche noch wenig erh'~rteten Auffassungen zu besprechen, sondern es soll eine ungefShre Vorstellung fiber die bei der Aufn~hme yon org~nischen Schichten ~uftretenden M6glichkeiten und Bedingungen erSrtert werden. Die ~ul3erst genauen Arbeiten Lenards sind hierftir die einzigen und besten Grundl~gen.

Die Absorption. Wenn die Absorption also t'tir die Abbildung eines Zellkerns eine

Rolle spielen soll, mul~ die Stromminderung der Elektronenstr~hlen a~ im Zellkern K um 10% h6her oder niedriger sein als in der g]eich dicken Schieht b der homogen ged~chten fibrigen Zelle! Ftir die Absorption gilt nun folgende Beziehung:

a ,~_~l _ konst -- .oAf

und ffir die durehgehende Stromst'Srke: JDurchg = Jo" e~u (12it),

wobei e die Grundz~hl der natfirlichen Log~rithmen '2, ~, is, ~ der Ab- sorptionskoeffizient (Lenard) in mm -1, d x die Schichtdicke in mm, 9 die Dichte des verwandten Stoffes, ~ou die Dichte ffir Aluminium und A x u die Schichtdicke ffir A1 bedeutet. Nehmen wit ffir die Dichte des Kernes die oberste Grenze k6rpereigener organischer Verbindungen mit 1,3 und ffir die homogen gedachte Plasm~sehicht die unterste Grenze mit 1,0 an, so ergibt sich fiir eine Spannung yon 6 �9 ]04 Volt eine Sehicht- dieke des Zellkernes K yon 1 .10 -a mm und einen Strahlstrom J0 ----- 1 ein Durchgangsstrom ftir den Zellkern yon

JDurchgg = 0 ,95

fiir die homogene Zellschicht yon JDurchg = 0,96.

Da~ Intensitgtsverhgltnis JDurehgK

JDurchg Z hat den Wert 0,99.

Die Stromabsorption fiir den Zellkern K und f/ir die homogene Zell- sehieht sind also nieht um 10% different, sondern etwa um 1,18%, so dab ein merklieher Schwgrzungsuntersehied nieht auftritt.

Das in Abb. 2 gezeigte Diagramm gibt uns einen Uberbliek fiber die Intensit/ttsmodulation durch Absorption in Abh/tngigkeit yon der Sehiehtdieke. Zur besseren Ubersieht ist die Modulation der Intensitgt in Prozenten des Untersehieds der Absorption des diehteren Mediums (z. B. des Zellkerns) gegenfiber der Sehicht aus leiehterem Material (z. B. der homogenen Zellschieht) aufgezeiehnet. Die Formel der Ordinaten- werte ist :

JDurcl~g K . 100 y -~ 1 0 0 - - JDurchg z

350 Friedrich Krause:

wobei JDurchg K der Strom ist, der durch den Zellkern durchgeht und

JDurchg Z den Durchgangsstrom nach Passieren der Plasmaschicht dar-

stellt. Als Beispiel wurde ffir die Zellschicht aus leichterem Material die homogene Zellschicht nach Abb. 1 mit einer Dichte yon 1,0 gewShlt, far das Objektelement aus dem spezifisch schwereren Material tier Zell- kern K nach Abb. 1, der einmal die Dichte yon 1,3 haben soll, das andere Mal entsprechend der gestrichelten Kurve mit Silber der Dichte ~ = 10,5

gefSrbt sein soll. Selbstver- too %

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10-6 10-5 10 -a "/0 -3 10 -~" 10-* lm,~l,

A b b . 2. I n t e n s i t S t s m o d u l a t i o n d u r c h A b s o r p t i o n a l s F u n k t i o n d e r D i c k e des a b z u b i l d e n d e n O b j e k t c s f t i r

z w e i v e r s e h i e d e n c D i c h t e n . S p a n n u n g 61 ,2 e K V . Z e l l k e r n u n g c f h i ' b t q = 1,3, -- - - - - Z e l l k c r n m i t

S i l b e r g e f h r b t o = 10,5 . J D u r c h g = J ' e - a d x "

B e m e r k u n g : D i e F o r m e l f i i r (lie A b s o r p t i o n J D u r c h g =

J o " e - ~ A x g i l t w i e d ie d a n a c h b e r e c h n c t e K u r v e f i i r d e n N o r m a l l a n f u n d v e r l i c r t g e g e n S c h i c h t d i c k e n y o n 10 -~ b i s 10 -s m m u n d d a r u n t e r f i i r (Lea B e r e i c h d e r

V i e l f a c h s t r e u u n g i h r e G c n a u i g k e i t !

st'~ndlich nimmt nach der FSrbung die Dichte des Xernes nicht den ~Vert von 10,5 an, sondern bleibt darunter. Da dieses resultierende spezifische Ge- wicht sich nicht ermitteln ]~Bt und es iiberdies nicht auf die Aufnahme des gesamten Kernes, sondern nur auf Strukturen desselben ankommt, die sich maximal mit dem FSrbe- metall Silber anreichern, wurde auf eine Korrektur des Wertes o = 10,5 ver- zichtet und dieser zur Be- rechnung der Kurve verwandt. - - Als Strahl- spannung wurde der Wert 61,2 KV herangezogen, ftir den der Absorptionskoeffi- zient vorlag 12. Auch li~gt sich sowohl mit dem magnetischen als auch mit

dem elektrostatischen Elektronenmikroskop mit der genannten Spannung arbeiten, w~hrend das elektrostatische E) [ fiir h6here Spannungen yon 70 bis 100 KV beim augenblicklichen Entwicklungsstande ausf'~]lt. Fiir den prim~ren Strahlstrom wurde der Wert 1 gew~hlt.

.~Ian kann also mit wachsender Schichtdicke bei beiden Kurven ein Steigen der Absorptionsdifferenz beobachten. Bei dem ungef~rbten Zell- kern sinkt die Absorptionsdifferenz bei Schnittdicken yon 6---7 ,u schon unter den Wert yon 10% und hat z .B. bei einer ftir die elektronenmikroskopische Methode anzustrebenden Schichtdicke yon 10 - * m m den Wert yon 0,0012%. ~'[an erkennt, dab die Absorption bei nattirlichen

Die Erzielung iibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. 351

VerhSltnissen auf d~s elektronenoptische Bild keinen Einflul3 ausiibt. Anders ist es bei FSrbung eines Ob]ektelementes. tiler, bei FSrbung des Zellkerns z. B. mit Silber, kann die Absorption bei der Untersuchung yon Schichten einer Dicke zwisehen 10 -3 und 10 -4 mm eine Rolle bei der elektronenoptischen Bildentstehung spielen. Die Absorptionsdifferenz zwischen gefSrbtem Zellkern und Zellplasm~ betrSgt z. B. bei 10 -4 mm Schichtdicke noch 3,62% und bei 5 . 1 0 - 4 m m Schichtdicke ]7,3%.

Bei w~chsender Schiehtdicke nimrnt die Absorptionsdifferenz zu; doch ist dies mit einer schnellen Abn~hme der Bildhelligkeit verbunden. Die durchgelassenen StrSme JDurchg K und JDurchg z betragen z. B. bei un- gefSrbtem Kern und einer Sehichtdicke yon 10 -~ mm nur 0,0055 bzw. 0,01S des Ausgangsstrahlstromes Jo- Ffir iibermikroskopische Vergr613e- rungen shad also solche Schichtdicken nicht zu verwenden.

Die Streuung.

Ebenso wie die Lichtstrahlen irn Objekt eine Streuung erfahren, so erfahren die Elektronenstr~hlen eine Beeinflussung im Objekt, die fiir die Bildentstehung im Elektronenmikroskop eine grundsiLtzlich andere Bedeutung als fi~r das Lichtmikroskop h~ben. Da wir im Lichtmikroskop durch die Beriicksichtigung der yon Helmholtz und Abbe gefundenen Beziehung ffir das AuflSsungsvermSgen

d,~ -- A '

wobei ~ die WellenlSnge der Str~hlen und A die nunlerische Apertur ist, bestrebt shad, ~ngesichts der gegebenen grol~en Wellenl'~tnge des Lichtes ulle d~s Objekt verl~ssenden ~bgebeugten Str~hlen durch eine mSglichst hohe Apertur fiir die Bildentstehung nutzbar zu m~chen, fSllt die Beugung fiir die Bildentstehung als Mittel zur Hebung des Kontrastes bei voller Offnung der ]31ende des lichtmikroskopischen 0bjektivs weg, da such die extrem gebeugten Str~hlen durch die korrigierten Gl~slinsen grol]er ()ffnung eingef~ngen werden. Der Lichtmikroskopiker ist fiberdies bestrebt, im Objekt vorh~ndene Unterschiede der Brechungsindiees der Objektstrukturen durch Ehabettung und TrSnkung der Objekte mit hochbrechenden Medien wie Kan~d~-B~ls~m und ZedernS1 zu beseitigen. Absorptionsunterschiede und d~mit Kontr~ste erreicht er allein durch die F~rbung der Pr~par~te. ~ D~s Ph~senkontrastverfuhren yon F. Zernicke ist eine Ausnahme. Es wird jedoeh noch wenig ~ngew~ndt.

W~hrend also die Absorption fiJr die Entstehung des Elektronenbildes eine sehr untergeordnete Rolle spielt und aueh aus nuchstehend ge- sehilderten Griinden der Bildg~ite spielen mul3, gibt sie ffir die licht- mikroskopische Abbildung den H~upt~ussehl~g. D~ nun sowohl die m~gnetisehe als ~uch die elektrost~tische Linse nieht korrigiert sind und duher mit sehr kleinen Aperturen yon 0,02 uad darunter geurbeitet wird,

352 l~riedrich K_rause :

spielt die Streuung ffir die Entstehung des Elektronenbildes und seiner Kontras te eine ausschlaggebende Rolle.

Wir miissen zwischen einer elastischen und einer unelastischen Streuung der Elektronenstrahlen an den Atomkernen unterscheiden. Die elastische Streuung bedeutet den Abprall der Elektronenstrahlen an dem Atomkernen ohne Geschwindigkeitsverlust und die unel~stische Streuung die Ablenkung aus der ]3ahn mit zus'/ttzlichem Geschwindig- keitsverlust. Beide Erscheinungen tiberlagern sich; sollen zur Kl5rung abet als getrennte Erscheinungen besprochen wcrden.

Die chromatische Streuung.

Die chromatische Streuung ist ein unelastischer Vorgang im Atom- kern, mit dem gleichzeitig eine Ablenkung aus der Bahn verbunden is~. Zum besseren Verst~indnis dieses Vorganges soll hier vorerst die Ablenkung aus der Bahn vernachlSssigt werden. 3Jan kann daher in ers ter An- n'iiherung annehmen, da{~ alle das Objekt mit verschiedener Geschwin- digkeit verlassenden Strahlen in das Objektiv gelangen kSnnen. I m 0bjek t selbst finder demnach keine IntensitStsmodulation und keine Veruntreuung des Verlaufes der Elektronenstrahlen statt . Die Ver- untreuung des Verlaufs der Elektronenstrahlen geschieht in den chromatischen Feldern der ]Elektronenlinsen, wodurch im Bilde eine Inten- sit~ttsmodulation das sekundSre Erzeugnis ist. Die langsameren Strt~hlen erfahren nStmlich (lurch die chromatischen Felder der Linsen des EM eine stSrkere Ablenkung als die unbeeinfluBten Elektronenstrahlen, die die Geschwindigkeit der homogenen Strahlen vor Durchlaufen der Ob- jektschicht beibeh~lten haben. Die Folge ist die Verwischung der Kon- turen der Elektronenbilder. Es entstehen breite SSume und Scho~ttenhSfe um das Bild eines Gegenstandes; oder anders formuliert, fSllt die Inten- sitStskurve zwischen SchwSrzungsmaximum und -minimum auf dem Bild nicht steil, sondern flach uus. Solche S~tume zweier nebeneinander- liegender, die chromatische Streuung hervorrufender Objekts t rukturen in der Zelle kSnnen nun im Bride ineinander tiberf]iel3en u n d ftihren zur vollst~tndigen AuslSschung des Kontrastes, wenn sich die Liicke z~-ischen den Objekten nicht als Schw/irzungsmaximum auf der Plat te manifestiert, welches die beiden Minim~ um 10% an Elekt ronenst rom- dichte tiberragt.

Die chromatische Streuung verursacht also eine Verminderung des Kontrastes und damit eine I-terabsetzung des AuflSsungsvermSgens im Elektronenbild. In unserem Beispiel der Abb. 1 haben die Elekt ronen strahlen a 1 n~ch DurchlauIen der homogenen Plasmaschicht ihren Weg durch den Kern K der Zelle und wieder durch die Plasmaschicht zu nehmen. Gegeniiber den Strahlen a 2 erleiden sie im Kern K mit der h6heren Dichte einen grSl]eren Geschwindigkeitsverlust. ]:)as f i ihrt dazu, dab die l%~nder des Kernes unscharf werden, da die Konturen durch die


oben geschilderte Geschwindigkeitsstreuung verwischt wiedergegeben werden und ineinander iiberlaufen. Je dicker der Schnitt ist, um so gr51~er wird die Geschwindigkeitsitnderung und um so geringer die Bild- schSrfe, das AuflSsungsverm6gen.

Eine Darstellung des Geschwindigkeitsverlustes in organisehen Schichten ist in Abb. 3 wiedergegeben. Hierbei stellt die nicht gestrichelte Linie den Geschwindigkeitsverlust in der homogenen Plasmaschicht der Dichte o ~ 1 dar, die punk- tiert gestrichelte Linie den Ge- schwindigkeitsverlust im Zellkern der Dichte ~o ~ 1,3 dar. Fiir die gestrichelte Gerade ist die An- nahme der FSrbung des Zellkernes mit Silber gemacht worden, wobei

= 10,5 ist. ~ Ferner ist bei der Berechnung der Kurve der

Geschwindigkeitsverlust zJ U0 gleich der t talbwertsbreite der Ge- schwindigkeit svert eilung gesetzt worden. Dies konnte auf Grund vieler Verteilungskurven ermittelt werden t3a. Da der Umwegfaktor organischer Substanzen noch nicht genau untersucht wurde, aber mit steigendem Atomge- wicht und auch ~olekularge- wicht 12c anws wurde den hohen Molekulargewichten der organischen Verbindungen in der Zelle Rechnung getragen und derselbe auch zur Vereinfachung der Aufgabe gleich dem des Silbers B ~ 4,0 gesetzt. Uber

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~ b b . 3. G e s c h w i n d i g k e i t s v e r l u s t A Uo a ls F u n k - t i o n de r d u r c h s t r a h l t e n D icke f i i r S c h i c h t e n o r g a n i s c h e r P r ~ p a r ~ t e v e r s c h i e d e n e r D i c h t e (12b) . S p a n n u n g = 61,2 e KV. U S p a n n u n g i n IKV, v als F a k t o r de r L i c h t g e s c h w i n d i g k e i t

dv zu r e c h n e n d e G e s c h w i n d i g k e i t , Tx x Mai l des

Ver tu s t e s , Ax g e o m e t r i s c h e S c h i c h t d i c k e , B U m w e g f a k t o r ( = ~ ) , o D ich t e .

Z e l l s c h i c h t o = 1, - - - - - Z e t l k e r n m i t S i l b e r g e f S r b t o = 10,5. Z e l l k e r n

u n g e f h r b t o = 1.3. B e m e r k u n g : Die F o r m e l g i l t f~ir V i e l f a c h - s t r e u u n g . D i e W c r t e o b e r h a l b 10- ' h is 1 0 - ~ m m

wer l ie ren f~ r den N o r m a l l a u f d a h e r a n G e n a u i g k e i t !

die m6g]iche Bedeutung des Umwegfaktors B bei org~nischen Verbin- dungen wird welter unten noch berichtet werden.

Aus der Kurve Abb. 3, deren Werte logarithmisch abzulesen sind, erkennt man, dab bei einer Schichtdicke von 10 -a mm eines ungef/~rbten Gewebes die Geschwindigkeitsstreuung bei 61,2 KV-Elektronenstrahlen fiir den Zellkern der Dichte ~o ~ 1,3 59 eVolt, fiir die Zellschicht der Dichte o = 1,0 45 eVolt betri~gt. Das Aufl6sungsverm6gen d ist nach der Gleichung

d D A U0 - - 2 u ( 1 3 b . )

Virchows Archiv. Bd. 312. 23


bestimmbar, wobei D die ~)ffnung der kleinsten Linsenblende der Elek- tronenlinse darstellt. Bei der Beschleunigungsspannung U = 60 K V und einer Blendenbohrung D ---- 0,1 mm wird die AuflSsung auf einen Wert yon d = 2 ,4 .10 -4 mm begrenzt; liegt also noch etwas unter der Auf- 15sung des Lichtmikroskops. Bei 10 -4 mm diinnen Schichten wird die Geschwindigkeitsstreuung A U 0 auf 4,53 eVolt in unserem Falle herabgesetzt, und die AuflSsung erreicht mit einem Betrage yon d = 2,4. 10 -5 mm nahezu den 10fachen Wert des Leistungsverm6gens des Liehtmikroskopes.

Die Fitrbung des Zellkernes mit Silber erh6ht die Geschwindigkeits- streuung im Zellkern um das 10fache, so dab selbst bei 10 -4 m m dtinnen Schnitten noch Spannungsdifferenzen z] U 0 yon 47,6 eVolt zu erwarten sind. Das AuflSsungsverm6gen des E~[ ffir solche extrem diinne mit Metallen gefSrbte Kerne wdrd also nicht hSher als das des Liehtmikro- skops sein.

Die F'~rbung organischer Objekte mit Metallsalzen, wie sie yon M a r t o n 5 erstmals fiir die elektronenmikroskopische Untersuchung ausgeffihrt wurde, wird man allein aus diesem Grunde mit gewisser Skepsis entgegentreten miissen. Es wird zudem nie gelingen, eine FSrbung mit Metallsalzen bei organischen Objekten fiir elektronenoptische Zwecke so durchzuftihren, dal~ eine 100%ige Absorption in den angefSrbten Objektteilen erreicht werden kann. Da die Absorption direkt proport ional der Massendieke des durchstrahlten Objektes ist, so werden besonders die RSnder der gefSrbten Strukturen mit dem Abfall der Dicke bis zum Werte Null ein Fallen der Absorption und ein quanti tat ives Ansteigen der chromatischen Streuung aufzeigen, was sich stets als Herabsetzung der Bildsch~rfe, des Aufl6sungsvermSgens, auswirkt. I s t dagegen die Dichte der angefarbten StI~kturen nur wenig different, so be t rag t die Differenz zwischen den an sich sehr geringen Geschwindigkeitsverlusten, wie Abb. 3 zeigt, bei kleinen Schichtdicken nur wenige eVolt oder Bruch- teile davon, so dal3 auch die Grenzflachen der Strukturen scharf abgebildet werden.

Uberdies ist jede Fgrbung im fibermikroskopisehen Sinne eine Ver- unstaltung des kolloiden Feinbaues der Zelle, dessen Studium j a gerade die Aufgabe des EM sein soil. Besonders grit das fiir die FSrbung mit Metallen, die doch nut eine tJberdeckung der Feinstrukturen der Zelle durch Auflagerung yon Metallstitubchen nach sich zieht. Diese Aus- fiihrungen sollen jedoch keine grunds/itzliche Ablehnung jeglieher F~rbung fiir elektronenmikroskopisehe Zwecke sein, sondern lediglich eine Warnung fiir den, der die physikalischen Grundlagen der Bfld- entstehung im EM zugunsten histologischer Belange und Ziele vernach- l~issigt.

Bei den vorstehenden Betrachtungen der Abb. 3 ist nicht beachte t worden, dal3 aueh eine Abhangigkeit des Gesch~4ndigkeitsverlustes yon

Die Erzielung tibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. 355

der Austrit tsrichtung der gebeugten Elektronenstrahlen aus der Objekt- schicht vorhanden ist. Wenn man sich vergegenw~trtigt, dM~ die gebeugten Strahlen a 1' und ao' der Abb. 1 einen 1/~ngeren Weg durch die Objekt- schicht zuriickzulegen haben Ms die unabgelenkten Elektronen, so wird kl~r, da die gebeugten Strahlen einen merkbar st~trkeren Gesehwindig- keitsverlust erleiden Ms die ungebeugten Str,~hlen. Je dicker Mlerdings die Folien werden, um so mehr tr i t t durch wiederholte Streuungen eine Verwischung dieser VerhSltnisse zutage, so dal~ alle d~s 0b jek t verlassenden Strahlen eine gleich hohe chromatische Streuung erfahren. - - Da nun die kleinen Aperturen der elektronenoptischen 0bjekt ive nur die Strahlen kleinster Winkelstreuung eintreten lassen, so wird der chromatische Fehler bei Aufnahme diinnster Folien giinstiger. Eine zahlen- bzw. formelm'Sl~ige Erfassung dieser Beziehung ist augenblicklich noch nicht m6glich, da die Unterlagen sich teilweise widersprechen TM ~, ~

Allgemein 15Bt sich sagen, dM~ bei Betrachtung des chromatischen Fehlers die SchSrfe des Elektronenbfldes von organischen Schichten von Geweben um so gr61~er wird, je diinner der Schnitt ist, wobei Ms oberste noch zulitssige Schnittdicke der Wert yon 10 -S mm zu gelten hat.

Die riiumliche Elektronenstreuung.

Auch die r~iumliche Elektronenstreuung an den Atomkernen im Objekt setzt das Aufl6sungsverm6gen herab. Diese Herabsetzung der Aufl6sung kann nun einmal durch die IntensitStsmodulation allein, das andere Mal mit dieser durch Veruntreuung des Weges der Elektronenstrahlen in der organischen Gewebeschicht zustande kommen.

Die Abb. 4 zeigt uns Werte der Intensithtsmodulation in der Ordinate als Verhiiltnis yon durchgelassener Stromst~trke JDurchg zur Anfangs- stromdichte J0, ffir die der Weft 1 angesetzt wurde. Zur Vereinfachung der Rechnung ist die Annahme eines scharf begrenzten Streukegels zugrunde gelegt 13 c.

Es l~13t sich aus der I (urve ablesen, da~ die IntensitStsmodulation dutch Streuung im Gegensatz zu den kleinen Absorptionswerten sehr grol~e Werte zeitigt und damit den t tauptausschlag fiir die Ents tehung des Kontrastes im Elektronenbilde gibt.

Das Verh:~tltnis zwischen den durchgelassenen StrahlstrSmen der ungef:~trbten Kernschicht und der Plasmaschicht (vgl. Abb. 1) ist 0,771 und damit der in Proz~nt ausgedriickte Intensits 22,9%, wobei die Intensit~tt des die homogene Zellschicht der Dichte ~ ~ I verlassenden Strahls ~ 100% gesetzt wurde. Fiir das Verh/~ltnis der mit Silber gef~rbten Kernschicht zu der homogenen Plasmaschicht (~ ~ 1) ergibt sich der Wert 0,014 und fiir den in Prozenten der durch die homogene Zellschicht durchgelassenen Strahlintensitiit ausgedriickten Intensits der Wert yon 98,6 %. Man erkennt also, dM3 auch ohne

23*


Fgrbung mit MetMlen die Wiederg~be mit ~usreichenden Kontrasten yon organischen Strukturen mit geringen Dichteunterschieden im Elektronenbild yon Gewebeschnitten m6glich ist.

Die Anfgrbung der Strukturen mit MetallsMzen ftihrt zu tibergrol~er Streuung in den gef'arbten Punkten, und in unserem Beispiel tritt bei einer Schichtdicke yon 10 -a mm nur der 1,15 �9 10-~te Teil der Anfangs-

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A b b . 4. I n t c n s i t i t t s m o d u h t t i o n d u t c h r S u m l i c h e E l e k t r o n e n s t r e u u n r be i v c r s c h i e d c n d i e h t e n M e , l i e n

n.ls F u n k t i o n d c r S e h i c h t d i e k c .

J D u r c h ~ 1 ( ~ ) ; g . =

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D O f f n u n g s v e r h i t l t n i s d x S c h i e h t i e k e in I0 -a r a m . f -

dos O b j e k t i v s = 10 -~ Z O r d n u n g s z a h l . ~ D i e h t c , U S p a n n u n g in K V (60 e K V ) , A A t o m g e w i c h t .

Z e l l s c h i c h t q = 1,0, - - - - - Z c l l k c r n u n g e - f~krbt o = 1,3, - - - - - - Z e t l k e r n m i t S i l b c r g e f i i r b t

t~ = 10,5 . B e m e r k u n g : D i e F o r m c l f f i r d i e I n t e n s i t / ~ t s m o d u - l a t i o n g i l t w i e d ie d ~ t m c h b e r e c h n e t e K_urve A b b . 3 f i i r d e n FM1 d e r V i e l f ~ c h s t r e u u n g . O b e r h t f l b des XVertes 10 . ~ m m f i i r d e n N o r m ~ l l a u f u n d u n t e r h a l b y o n 10 . ~ m m ff i r E i n z e l s t r e u u n g v e r l i c r e n (He

XVcI'tC i h r e G c n a u i g k c i t '

stromstgrke nach Passieren der so gefSrbten Kernschicht durch die Blende des Ob- jektivs, wShrend bei der Zellschicht der Dichte o = 1 8,42 - 10 -4 Stronmnteile zur

Bildentstehung beitragen. Die Kontn~ste in solehen Elektronenbildern werden zu kr~fl~, die erh~dtenen Photo- pl~tten zu hart gr~duiert und ohne die n6tige Bildnmmcie- rung.

Welter erkennt man ~ms der Kurve, d~d~ nfit sinkender Schichtdicke die Bildhellig- keit steigt. Durch d~s Ver- hiiltnis yon durehgelassenem Strom JD,m.hg zum Anf~ngs- strom J0 in der Kurve ist dies wiedergegeben. Es sinkt Mso die Belichtungszeit 'und d~mit die Bel~stung des zu unter- suchenden Materials. Fiir die Aufnahme besonders emp- findlicher organischer 0bjek- re, bei der m~n zur Vermei- dung jeglicher Elektronen-

strahlenzerst6rungen der Feinstrukturen, z .B. die Scharfeinstellung an einem unempfindliehen Testobjekt vornimmt, ist die Herabsetzung der Belichtungszeiten yon entscheidendem Wert. Dabei bleibt die Intensit/its- verteilung, der in Prozent ausgedrtickte IntensitStsunterschied zwischen den Strukturen nahezu gleich, und erst bei extrem diinnen Schichten yon 10 -5 bis 10 -7 mm und darunter im FMle der Einzelstreuung miissen wir ein stetes Einmiinden der Kurven der Abb. 4 in den gemeinsamen Weft 1 annehmen. Die Notwendigkeit, mOglichst dfinne Schnitte zu erzielen, wird fiir die elektronenoptische Untersuchung yon Geweben ~mch hier eindeutig herausgestellt.

Die Erzielung ilbermikroskopiseher Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. 357

Was die Veruntreuung des Weges der Elektronenstrahlen durch ri~umliche Elektronenstreuung im organisehen 0bjekt anbetrifft, so kann man sich an Untersuchungen M . von Ardennes 17 hMten.

Danach erfShrt z. B. ein 50 eKV-Elektronenstrahlenbfindel in einer homogenen Plasmasehicht eine derartige Verbreiterung, dab man mit einem Anfl6sungsvermSgen yon 10 -5 mm nur 10 -4 mm fief in organisehe Prgparate hineinsehen kunn. Denkt man dar~n, dab man jedes Pri%parat yon zwei Seiten ansehauen kann, so kSnnte man nut 2 �9 10 -4 mm dicke organische PrSparate untersuchen, wenn man ein Auflbsungsvermbgen yon 10 -~ nun des E3[ erwartet. Je dicker die Schnitte werden, um so breiter wird der Streukegel der Elektronen, die yon einer sichtbar zu machenden Struktur ausgehen. Anders gesagt, wird aus der einen Punkt ,~bbildenden Elektronensonde ein breites Strahlenbiindel beinl weiteren Verlauf dutch die homogene Schicht. Sollen z.B. zwei in einer Folie in der denl AuflSsungsverm6gen gleichen Entfernung yon 10 -~ mm be- findliche Punkte ~bgebildet werden, so werden die abbildenden feinen Elektronensonden in ihrem weiteren Lauf dutch die Schicht verbreitert nnd laufen schlieI~lieh ineimmder, ohne d~tB die Objektivlinse eine Trennung dieses verschmolzenen Streukegels noch vornehmen kann. Ffir Sehnitte von 1/~ wird man bestenfMls ein AuflbsungsvermOgen yon 0,5 �9 10 -3 mm erw~rten kSnnen, so dab die maximale Leistung des Licht- mikroskops nIit 0 ,16.10-3ram ftir violettes Licht bei schrSger Be- leuehtung noeh nicht einmM erreicht ist. WShrend sich also der chromatische Fehler durch die magnetische bzw. elektrostatische Linse da- dutch verringern 1.stir, daft man nur kleinste Aperturen w~ihlt, nm die st~Lrker chromatisch gestreuten Randstrahlen auszusehalten und in der Zukunft auch sicher achromatische Elektronenlinsen entwickelt werden, so ist die Herabsetzung der rSumlichen Streuung zur Erzielung iibermikroskopischer Aufl6sung allein durch Verringerung der Schiehtdicke, durch Ge~innung diinnster Mikrotomschnitte der GrbBenordnung yon lO -~ mm und darunter zu erreichen.

Die Au[ladz,ng.

Als letzter Faktor der ]3eeinflussung der abbildenden Elektronen- strahlen durch das Objekt haben wir die elektrostatischen Kr'Mte zu nennen. Diese kommen in der Objektschicht durehdie negative Aufladung durch absorbierte Elektronen zustande. Die negative Aufladung ist direkt proportional der Absorption von Elektronen im organischen Objekt und umgekehrt proportional dem Leitvermbgen der Substanz. Fiir Gewebeschnitte aus organisehem Material sinkt im Kochvakuum yon lO -~ bis 10 -~ m m Hg bei nahezu vSlligem Entzug auch des kolloidal gebundenen Wassers die an sieh schon geringe Leitf'~higkeit des organischen Materials sehr schnell, da jeder LadungsabfluB dureh die Ioni- sierung der Sa]ze bzw. I(olloide ausfi~llt.


Die Aufladung kann deshalb be~chtliche, die Bildgiite verschlechternde Werte erreichen. Die Aufladung haben wir an den Grenzen der Objekt-

)

strukturen und an den Ober- flSchen der Gewebeschnitte zu erwarten. I m Beispiel der Abb. 5 haben wir Aufladungs- erscheinungen einmal an der Oberfls des Schnittes, das andere Mal im Innern desselben an dem Zellkern K angenommen. D,~ die Absorp- tion und damit dieAufladung proportional der Schichtdicke ist, ist bei dickeren Schnit ten die Aufladung grSBer als bei diinnen Schnitten. I s t die Oberflti, che des Schnittes eben und sind die SchnittflSchen wie in Abb. 1 parallel, so be-

wirkt die AufhLdung der Schnittoberfl'ache keine Streuung der Elek- tronen, und damit keine Bildverschlechterung. Is t die Oberfl~iche d~- gegen aufgerissen, uneben, so wSchst mit der Aufladung die Bilduntreue,

\ \ \ \ \ \ \

Abb . 5.

Abb. 6.

da die an den Erhebungen der SchnittflSchen entstehen- den Potentialgebirge eine Ab-

lenkung der abbildenden Elektronenstrahlen hervorru- fen. Die abstoBende Kraf t solcher Potentialgebirge ge- geneinander kann so groB sein, dab es zum ZerreiBen, ja zur vollst'~ndigen Aufl5- sung der sprSden, t rockenen Schnitte w~ihrend der Beob- achtung im EM k o m m e n kann.

Zu der Forderung nach tterstellung diinnster Ge-

webeschnitte ftir die elektroneniibermikroskopische Untersuchung tr i t t hier noch die, mSglichst ph~nparallele Schnitte zu erzielen. Ferner t r i t t im Innern des Schnittes zwischen Zellkern K und Zelleib Z eine Potent ia l - differenz auf, die durch die verschieden hohe Absorption der beiden )[edien hervorgerufen wird. Dieses PotentialgefSlle bewirkt ebenfalls eine zusatz- liche Winkelstreuung der Elektronenstrahlen. Da diese Potentialgebirge


parallel zu den Grenzen der jeweiligen Objektstruktur ver]aufen, ist die zusStzliehe Ablenkung der Elektronenstrahlen in diinnen Folien winkel- treu und die Verzerrung und AuflSsungsmindernng im Elektronenbild zu vernachl~tssigen.

Liegen ]edoeh mehrere Objektstrukturen mit Potentialgef'~llen iibereinander, so trit t , wie in Abb. 6 gezei~, eine Mehrfaehstreuung ein, die nun eine merkbare Verzerrung und Scharfeminderung zur Folge haben kann. Liegen also, wie in Abb. 6, mehrere Kerne iibereinander, so wird der Elektronenstrahl mehrfach gebeugt. Die Giite des elektroneniibermikroskopischen Bildes bei der Aufl6sung innerer 0bjektstrukturen im Hinblick auf die Aufladung ist also auch hier um so besser, je diinner der Gewebeschnitt ist.

Parallel zur Ladungsaufnahme geht die Erwarmung des organischen Objektes durch die Elektronenstrahlen. Sie ist proportional dem Energie- verlust der Strahlung in der Schicht und setzt sich zusammen aus der Absorption und dem Geschwindigkeitsverlust der Elektronen im 0bjekt. Sie ist damit direkt proportional der Dicke des Gewebeschnittes.

Aufladung und ErwSrmung der Objekte lassen sich auBer durch Her- stellung diinnster Gewebeschnitte auch durch andere yon ran" zum Tefl erst- malig beschriebene oder erstmals angewendete Verfahren 9 ~ herabsetzen. Solche Methoden sind z. B. die intermittierende Bestrahlung der organischen Objekte durch pendelnde Elektronenstrahlen is, die Kiihlung der Objekte mit fliissiger Luft ~b, die Anwendung einer Objektkammer mit ionisierender Luft !) a, und ferner die Aufbrin~cmng des Obj ektes auf Metall- folien oder die Xathodenbestaubung der Gewebeschnitte mit gut leitenden Met allen ~s.

Die genannten Verfahren beschrSnken sich in ihrer Wirkung jedoch lediglich auf die tIerabsetzung der Erwarmung und AufladungsstSrung im Objekt, w5hrend die Minderung der Schnittdicke alle Faktoren gleich- m'~l~ig herabsetzt, so dal~ auf die genannten Methoden hier nicht eingegangen werden soll.

Die elektronenoptische Bildentstehung. Wie wit aus den vorhergehenden ErSrterungen sahen, ist die Gr51~e

der jeweiligen Beeinflussung der Elektronenstrahlen in der organischen Ob]ektschicht abh~tngig yon der Dicke und yon der Dichte des Materials; nach Lenard kurz yon der Massendicke des Objektes. Zwei neben- einanderliegende Ob]ekte gleieher Dichte und gleicher Dicke zeigen demnach die gleiche elektronenoptische Beugung und sind im Bride des E~I demnach nicht sichtbar. Vergegenw~rtigen wir uns, dab das spezifische Gewicht der in Frage kommenden organischen Verbindungen nur wenig in den Zellen schwankt und selten die in den Beispielen angegebene maximale Differenz yon 1,0--1,3 hat, so miilRen die Elektronenbilder yon Gewebeschnitten ziemlich kontrast- und strukturlos ausfallen. Das

360 Friedrich Krause :

Gegenteil ist der Fall ! Wie ich bereits an mehreren Beispielen beobachten konnte, zeigen die Aufnahmen yon Zellen im E~[ ohne FSrbung erstaun- lich gute Kontraste, so dal3 wir auf eine AnfSrbung der gewiinschten 0bjekts trukturen dutch Hebung des spezifischen Gewichts mittels Metall- salzen und dgl. bisher g~tnzlich verzichten konnten. Den Grund zu diesem Kontrastreichtum habea wir nicht allein in der iiberaus kleinen 0ffnung der elektronenmikroskopischen Objektive in Verbindung mit der rSumlichen Streuung der Elektronenstrahlung zu suchen. Meiner Meinung nach hSngt der Kontrastreichtum yon anderen Faktoren mit ab. Die elektronenoptische Abb. 7 yon in Gelatine eingebetteten Bakterien ist ein gutes Beispiel ffir diese Erscheinung. Die Aufnahme ist mi t einem relativ grol3en 0ffnungsverh~ltnis D / F = 0,1 der magnetischen Linse gemacht worden, so da6 die in Abb. 4 berechnete IntensitStsmodulation zwischen Zellschicht und ungefSrbtem Zellkern um das 100fache sinkt.

Es ist nun bekannt, dal3 Wasser- und Wasserstoffverbindungen erhShte AbsorptionsfShigkeit ffir Elektronenstrahlen haben; hSher als ihrer Dichte zukomrat I'-'''.

Bei der Feststellung des Urnwegfaktors B fiir organische Stoffe bei Berechnung der chromatischen Streuung haben wit bereits nach den Angaben L e n a r d s r ' c die AbhSngigkeit vom Molekulargewicht bei organischen Verbindungen kennengelernt. Da nun der Umwegfaktor B das VerhSltnis der LSnge des wirklichen Elektronenweges im Material zum Elektronenweg in Strahlrichtung bedeutet, ist die Beziehung des Umweg- faktors zur rSumlichen Elektronenstreuung und zur IntensitStsmodulation gegeben. Berechnungen, Versuche und dgl. fiir den Umwegfaktor B fiir organische Verbindungen und seine Einbeziehung in die Formeln ffir die rSumliche Elektronenstreuung usw. liegen meines Wissens noch nicht vor. Dagegen gibt es verschiedene Beobachtungen. So konnte ich z. B. feststellen, dal3 organische H~iutchen (z. B. Gelatinemembranen) um so dunkler im elektronenoptischen Bilde erscheinea, j e kfirzer sie im Vakuum dem Wasserentzug ausgesetzt waren. Die gleiche Beobachtung wurde auch nach Mitteilung im Forschungsinstitut der AEG bei elektronen- optischer Betrachtung yon Fliegenfliigeln gemacht, wie mir kiirzlich mit- geteilt w u r d e . - Auch ffir die Haltbarkeit der Gewebe gegenfiber der Elektronenstrahlung ist der Wassergehalt der Substanz von entscheiden- der Bedeutung. Es stehen ~Vassergehalt und Haltbarkeit nach rneinen Beobachtungen nicht in einfacher Proportion, sondern die Hal tbarkei t der Gewebeschnitte und Folien wSchst zunehmend mit dem Entzug auch des letzten schon kolloidal gebundenen Wassers. Tagelang evakuierte organische Folien zeigen z. B. eine ausgesprochen grol3e Resistenz gegenfiber allen Einflfissen der Elektronenstrahlung. Da diese Beobachtungen einer theoretischen und versuchsm~13igen Untermauerung noch ent- behren, soll diese Beeinflussung der Elektronenstrahlen durch ~u oder wasserstoffhaltige organische Verbindungen nur deshalb erw~hnt

Die Erzielung iibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. 36[

werden, well sie die Perspektive einer iiberaus grol~en VariationsmSglich- keit der Methoden der elektroneniibermikroskopischen Untersuchung erSffnet. Best~tigt es sich nSmlich, dM~ die Beeinflussung der Elektronen- strahlen nicht nur yon den Krhften der Atome abhSngt, sondern ebenso yon den Eigenarten des Molekfilbaues, so bietet sich die MSglichkeit ffir die elektronenmikroskopische Forschung, gewiinschte Obj ekt- strukturen, die nieht im Elektronenbild sichtbar sind, mit organischen Stoffen zu f~rben. Dies gibt uns eine ungleieh hShere Auswahl yon FSrbemitteln ffir die Elektronenmikroskopie in die Hand als die Dichte- fSrbung mit MetallsMzen, wobei man auf die Vermeidung yon Artefakten im 0bjekt ungleieh besser aehten kann.

Die Tie]enschdr]e der elektronenoptischen Objelstive. Hat nun die voranstehende ErSrterung der Absorption, der chro-

matischen Streuung, der r~tumlichen Streuung und der elektrostatischen Kri~fte im Objekt die ~Notwendigkeit der Erzielung besonders dtinner Gewebeschnitte aufgezeigt, so fordert ferner die groBe Tiefensch:~trfe des elektronentibermikroskopischen Objektive gebieterisch die tterstellung dtinnster Schnitte. W~ihrend die Tiefenscb'~trfe des Lichtmikroskops ~u~erst gering ist und ein Zerlegen, ein Durehsuchen der Gewebeschnitte in der Tiefe mit kleinsten Abstgnden zulSBt, ist die TiefenschSrfe des ES~I wegen der Kleinheit der wirksamen Apertur auBerordentlich hoch.

Versteht man unter Tiefensch'~rfe diejenige Strecke in Millimeter, um die das Objekt in Riehtung der optischen Achse verschoben werden kgnn, bis die Unsch~%rfe des Brides gleich dem AuflSsungsverm6gen wird, so findet man z. B. fiir eine Apertur yon 0,005 des Objektivs und ein AuflSsungsvermSgen yon 10 -5 ram eine Tiefensch~trfe des Elektronen- objektivs yon 4 .10 -a tom oder , anders gesagt, dab Mle Strukturen eines 4 ~-starken Gewebeschnittes z .B. im Elektronenbild abgebildet werden, wShrend z. B. das Lichtmikroskop in der Lage ist, Ebenen yon 0,2/t getrennt zu beobachten. Das l~terale AuflSsungsverm6gen der Siehtbarmachung kleinster 0bjektteilehen in der Ebene und d~s vertikMe Auflbsungsvermbgen zur Trennung der Strukturen in der Tiefe hat also beim Lichtmikroskop das giinstige VerhSltnis yon 1 :I, w~thrend es ffir das Elektronenmikroskop im genannten Beispiel das sehr nngiinstige Verh~Itnis yon 1:400 annimmt.

Selbst wenn die vorher gesehilderte Beeinflussung der ]~lektronen- strahlen im 0bjekt wegfiele, miil~te man zur Vermeidung der Uber- deekung der Strukturen ins Elektronenbilde dgrauf bedacht sein, mbgliehst dfinne Sehnitte weir nnter 1 ,u Dicke herzustellen.

Die elektronenoptische Abb. 7 yon in Gelatine eingebetteten Bakterien g4bt uns einen anschaulichen Einblick tiber die Grbi~e der gesebilderten Beeinflussung der Elektronenstr~hlen durch das 0bjekt bzw. ~uch tiber die Tiefensch-~rfe des Objektivs. }Vie die zugehSrige schemutische

362 Friedrieh Krause :

Zeichnung zeigt, spannt sich das Gelatinehitutchen zwischen den Drght- chen eines engmaschigen Drahtnetzes. Das Hgutchen wird in der Weise hvrgestellt, dab man ein tiuBerst engmaschiges Drahtnetz in eine 1%ige GelatinelSsung eintaucht, diese leicht abtupf t und dann abtrocknen l~ltt. In der Mitre der Netzmaschen ist die Membran so dtinn, dal] sie Interferenzfarben zeigt, wiihrend sie zum Rande des Netzes hin an Dicke zunimmt und die Bakterien inmitten der Gelatineschicht liegen. W'Shrend

.~bb. 7. B~tk te r ien in G e h t t i n e e i n g e b e t t e t . A b b i l d u n g s m a B s t a b :2500 : l . _&blaah~]e d e r A u f l S s u n g all d e n Ir des ~Netzes, E n t n o n l m e n a u s : [ffra'use: ] ) a s m a g n e t i s e h e E,'vl u n d ,~cinc A n w e ~ l d u n g in t ier B ioh)g ic , K o l l o i d c h t m i c u n d 31ediz in . 1Radiologiea g , I t . 3 - - 4 ,

132 (1!)38).

nun die in der Mitte liegenden ]~akterien scharf abgebildet sind, sind die am Rande in der dicken Schicht ]iegenden unscharf, verschwommen abgebildet, eben well die Absorption, die chromatische und die r~iumliche Streuung, die elektrostatischen Krgfte an den Grenzfl~ichen die Elek- tronenstrah]en in der Gelatinefolie beeinflussen und iiberdies die groBe Tiefenschgrfe des Objektivs alle iibereinanderliegenden Strnkturen zur Abbildung kommen ltiBt und es zur (J'berdeckung verschiedener Objekt- teile im Elektronenbilde koInmt.

Die theoretischen Grundlagen der Herstellung di2nner Schnitte. Nach den vorstehenden Ausfiihrungen haben wir gesehen, dab fiir

die elektroneniibermikroskopische Untersuchung yon Geweben die Sehnitte zwei Eigenschaften besitzen m/issen:

Die Erzielung fibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. 363

1. Die Schnitte mfissen weniger als 10 -~ mm dick sein. 2. Die Schichten mfissen ebene, pl~npurallele Oberfl~iehen aufweisen. In gewissem Mai3e besteht ftir die liehtmikroskopische Forschung

diese Forderung nach Erreichung ebenm~tl~iger, dtinner Scbnitte auch. Die mit Erfolg angewendeten Verfahren sind aus der Praxis entwickelt, worden, und man kam mit verschiedenen Einbettungsmethoden und den zur Verfiigung stehenden Mikrotomen zum Ziel, ohne sich fiber die theoretischen Grundlagen des Schneidevorganges allzu viele Kopf- schnlerzen zu machen. Anders muB man vorgehen ffir die Schnitt- gewinnung bei der Untersuchung yon Geweben mit dem Elektronen- mikroskop, bei der es gilt, das Allerletzte herauszuholen. Hier mul~ man alle Faktoren, die beim Sehneiden yon organisehen Geweben in Betracht kommen, in ihrer Gr61~en- ordnung bestimmen und in Beziehung setzen.

VergegenwSrtigen wir uns die beim Schneiden auftretenden Kr'Sfte nach der Abb. 8, so ergibt sich ffir die Sehubkraft Pt, die in ~ichtung der MesseroberflSche wirkt, die Beziehung

Pt : .V tg c~, wobei N die Kraft ist, die senkrecht zur Messeroberfl:~tehe wirkt und die n6tig ist, um den Schnitt S yon der Block B abzuheben und ~ der Winkel

\

A b b . 8.

zwischen oberer MesserflSche und der Oberflhche des Blockes B ist! Der Winkel ~. setzt sieh zusammen aus dem Facettenwinkel des Messers ~, und dem ~,Vinkel ~ 0, der ~eigung des Messers gegen die Bloekoberflhche. Obige Gleichung zeigt, d~B wit zur Gewinnung der Schnitte urn so geringere Kraft aufwenden mfissen, je kleiner der Winkel z ist. Je kleiner also derFacettenwinkel des Messers ~' und der Krfimmungsradius an der Schneide bei kleinster noch mSglicher Neigung ~0 gegen die Block- oberfiSche ist, um so geringer wird der Druck P ~ P t - cos ~ in der Schnittrichtung gegen die organische Substanz. Dieser Druek bewirkt erstens ein Zusammenpressen, St~uchen der organischen Substanz vor dem Messer her und zweitens eine ~:nickung des schon abgehobenen Schnittes S. Im ersten Falle wird der Schnitt dicker ~]s eingestellt wurde, und im zweiten Falle wird eine Verformung und Aufsplittern des gesamten Schnittes verursacht. Der Schnitt wird in p~r~llel zur Messerschneide hegende B~lkchen aufgefasert, so dai~ eine Verwendung ftir die Unter- suchung unmSglich wird. Sowohl der Facettenwinkel als auch der Krfimmungsradius der Messerschneide kbnnen nun nicht beliebig herabgesetzt werden, d~ durch d~s Messerm~terial und dessen Abnutzung Grenzen gesetzt sind. So entstehen um so mehr Seharten im Messer,


je kleiner die beiden Werte gehalten werdeu. Die Scharten ents tehen dadurch, dab beim Schleifprozeg Metallkrystalle aus der Schneide gerissen werden. Je diinner die Schneide, je kleiner der Facet tenwinkel ist, um so tiefer werden die Scharten. Die Oberfl~tche der Schnitte wird also nicht mehr eben, sondern ist schrundig und zeffurcht. Solche Schnit te sind fiir die elektronenoptische Abbildung wegen der oben beschriebenen elektrostatischen Aufladungserscheinungen aber unbrauchbar . Das Elektronenbild der Schneide einer Rasierklinge (Abb. 9), eines Messers mit denkbar kleinsten Facettenwinkel und kleinstem Krt immungsradius der Schneide zeigt uns eindringlich diese ffir die Schnit tgewinnung so nachteilige Schartenbildung.

Versuche, die M. v. Ardenne Edelsteimnesser, mit kleinstem

A b b . 9. F l c k t r o n c n b i h [ e i n e r ungc- b r a u c h t e n R a s i c r k l i n g c n s e h n e i d e . Ab- b i l d u n g s m a l l s t a b 1000 : 1. Mittler(." S e h a r t e n b r e i t e 0 ,0 l ram. A u f g e n o m - m e n m i t den t y o n F , l l l ld ~fs ls

g c b a u t c n m a g n c t i s e h e n EM.

zur Herstellung diinnster Messer, z. ]3. Facettenwinkel unter Benutzung be- sonderer Schieifverfahren ausffihrte, hat ten keine befriedigenden Ergebnisse.

Diese Folgerung aus diesen theoretischen t3berle~mgen ist die, da~ zur Gewinnung dtinnster ebener Schnit te fiir die elektronenoptische Untersuchung nicht Mikrotommesser allerkleinsten Facettenwinkels verwendet werden kSnnen, sondern stabilere Messer grS- Beren Facettenwinke]s, die an der Schneide allerkleinste Schartenbildung

aufweisen. Der groBe Facettenwinkel solcher Messer ebener Schnitt- kante fiihrt jedoch zum Anwachsen des AnpreBdruckes und dami t zur Stauchung und I(nickung der Schnitte, wie sie oben beschrieben wurde.

Als weiteren Faktor, der die Verunstaltung der Gewebeschnitte bewirkt, miissen wir die Reibungskraft T pro Zentimeter Schnittl/inge ansehen, fiir die die Beziehung

T ~-~ It �9 N" COS gilt, wobei/ t die Reibungsziffer und IV der senkrecht zur Bloekoberflache an der Schneide ansetzende Druck ist, der sich aus dem Gewicht des Schnittes und dem Widerstand des Schnittes gegen FormverSnderung zusammensetzt. Die Reibung nimmt mit zunehmender Fl'SchengrSge des Schnittes zu. Die Reibung mu[3 zum Anprel3druck addiert werden und erh6ht so die stauchende ~Virkung.

"Wie schon erw~hnt, wird der Gewebeschnitt im wesentlichen auch auf Knickung beansprucht. Da der Schnitt an dem einen Ende mit dem Gewebeblock zusammenh~tngt und mit dem anderen Ende auf der Messeroberfl'~che aufliegt, wird man zur Erfassung der Gr5ge der Knik- kung die Eulersche Formel verwenden kSnnen. Die Knickkraf t 19a ist:

~"- j K = ~-- E . i" .C,

Die Erzielung fibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. 365

wobei E der ElastizitStsmodul, J das Tr~gheitsmoment und 1 die L~nge des freischwebenden Schnittes zwischen seinem Ursprung am Gewebe- block und dem Sehubpunkt der Messeroberfl~che. C ist eine yon der Befestigung der Stabenden abh~ngige Konstante. Ffir das Trhgheits- moment 2~ des rechteckigen Querschnittes gilt

b. h 3 1 - - 12 '

wobei b die L'~nge des Schnittes in Schnittrichtung und h die Dieke des Schnittes ist[ W'~hrend also der Druek auf den Block und damit auch die Stauchung des Schnittes unvermindert bleibt, sinkt die Knick- festigkeit des Sehnittes mit der dritten Potenz der Schnittdicke h. Eine Senkung der Schnittdicke yon 10 -3 auf 10 -4 mm wfirde also eine 1000fache Senkung der Knickfestigkeit mit sich bringen. Da die Knickfestigkeit eines 10 -3 mm dicken Schnittes an sich schon ungeheuer gering ist und es nur sehr selten gelingt, solche Schnitte mit den bisherigen Mikrotomen zu erzielen, wird es ganz klar, da[~ die bisherigen Schneideverfahren ffir die Gewinnung d~innerer Schnitte for elektronenfibermikroskopische Zwecke unbrauchbar sind.

Das Dachschnittver[ahren ~'~. M. v. Ardenne, der sich aueh mit der Theorie und Praxis des Schneidens

ffir elektronenoptische Zwecke befaBte, umgeht diese Schwierigkeiten durch seine Keilsehnittmethode"I. Er gewinnt Mikrotomschnitte d~innster Schiehtdicke d~durch, dab er nieht plunparallele Schnitte, sondern keil- fSrmige Schnitte schneidet und die dfinnsten Stellen des Keils fiir die elektronenmikroskopische Untersuchung verwendet. Praktisch geht er so vor, dal~ er zuerst das Objekt plan vorschneidet, dann eine Deckschicht gleicher H'Srte (z. B. Paraffin auf den in Paraffin eingebetteten Gewebe- tell) aufpinse]t und zuletzt das Objekt um einen kleinen Winkel schwenkt und somit Keilschnitte erzeugt, die nach AuflSsen der Deckschicht schon erstaunliche dfinne Gewebsschichten an der Keilspitze als Resultat zeitigten. Dennoch sind keine elektronenmikroskopischen Bilder von solchen Keilschnitten bekanntgeworden 2".

Das yon mir vorgeschlagene Dachschnittverfahren lehnt sich un diese Methode an und hat ebenfal]s keilfSrmige Schnitte als Ergebnis. Es unterseheidet sieh yon dem Prinzip der Keilschnittmethode darin grund- s~tzlich, dal] man zuerst naeh der Abb. 10 den prismatischen Block a aus Paraffin oder dgl. wie ein Dach zurechtschneidet. Das geschieht in der Weise, dal3 man entweder den Block a einmal in der Richtung der Kan te EF, das andere Mal in Richtung der Kan te FD neigt und die Lage des Messers unver'~ndert l~Bt oder aber, indem man das Messer schwenkt und den Block lest l'~{]t. Beide Arbeitsweisen sind von gleicher Wirkung und sind abh~ngig yore Bau des j eweils benutzten Mikrotoms.

Die Keilsti~cke b und b~ werden hierdurch abgeschnitten und es bleibt ein dachartiges Gebilde F D E = c, an dem der endgfiltige Schnitt derart


angesetzt wird, dal3 das :VIesser in g ich tung der GrundflSche parallel zum Dachfirst geschnitten wird. Die in der NShe der Punkte D und E liegenden Teile des Schnittes werden ffir die Untersuchungen im Mikro- skop verwendet, da hier besonders dtinne M~terialschichten entstehen. In der Zeichnung ist ein solcher Ausschnitt des 0bjektes dutch das Dreieck DHG dargestellt.

Das Dachschnittverfahren, bei dem auch die Aufbringung einer Deck- schicht nach M. v. Ardenne angewandt werden kann, hat einen Vorteil insofern, als durch das dachartige Zuschneiden ein versteifendes Profil entsteht, wodurch die Stauchung und Knickung der zu schneidenden

/ / /

1 / 1 /

71 f /I"

Abb. I0.

Substanz herabgesetzt wird. Inwieweit nun die prakti-

sche Arbeit mit dem Dach- schnittverfahren Vorteile gegeniiber der Keilschnit tme- rhode zeitigt, kann noch nicht gesagt werden, da mir Versuche aus Kriegsgrfinden versagt waren.

Beide Verhthren haben nun den grol]en Nachteil, dab nut sehr kleine SchnittflSchen, n~tmlich die Keilspitzen, der

elektronenmikroskopischen Untersuchung zur Verftigung stehen. Trotz- dem Schnittformate yon 0,1 �9 0,1 mm bereits ffir die elektronenmikroskopischen Arbeitsmethoden ausreichen, wird der Gewebeforscher und besonders der Pathologe den M~ngel an Objektiibersicht vermissen. Es ist irnmer wiinschenswert, ein grSl~eres Objektgebiet erst bei kleinerer VergrSl~erung zu betrachten, ehe man die fibermikrosk0pische VergrSBe- rung einstellt.

Ein zweiter Nachteil ist der, d~l~ in der Praxis der Schnitt nicht im idealen Sinne, wie in der Abb. 8 dargestellt, durch den Schnit t der 3[esserschneide yon der Unterlage getrennt wird, sondern es l~uft immer und besonders bei sprSdem Material wie Paraffin der 3[esserschneide ein Spalt voraus (Abb. 15). Die LSnge dieses Spaltes 1 ist identisch rnit der in der Eulerschen Formel ffir die Knickfestigkeit des einseitig gespannten Stabes genannte L~nge 1 des freischwebenden Schnittes zwischen seinem Ursprung am Gewebeblock und dem Punkt des Schnittes, wo die Schub- kraft Pt des Messers ansetzt. Der Schnitt wird also dutch die Kei lkraf t N yon seiner Unter]age abgesprengt, und somit wird die Unterfl~iche des Schnittes im iibermikroskopischen Sinne ebenso uneben, wie w i r e s im makroskopischen yon der Spaltfl';iche eines mit dem ]3eil gespaltenen Holzklotzes oder yon dem zerfransten Rand eines zerrissenen Tuches oder P~piers kennen. Die L./inge des Spaltes 1 ist ~bh'~ngig yon der t{~rte


und der Elastizitat des Materials. Bei in hartem und sprSdem Material eingebetteten Gewebe werden wir stets einen Spalt erwarten miissen (Abb. 15).

Wird das Einbettungsmittel dagegen weich und elastiseh, z.B. Celloidin, so w~rden wir mehr an ein plastisches FlieBen beim Schneiden denken mfissen, wie es die Abb. 16 darstellt.

Bei der Entstehung der Schnitte k6nnen wir uns tthnliche Vorgange vorstellen, wie sie der Ingenieur bei der spanabhebenden Bearbei- tung yon metallisehen Werkstficken in der Drehbank z. B. genau untersueht hat 2a. Man unterscheidet hier den Scher- oder den FlieBspan. ]~eide sind yon den Sehervorgt~ngen und KnickvorgSngen beim Schneiden abh~ngig und entstehen bei (i'berwindung der im Material auftretenden Spannungen. ]~eim Scherspan treten bei gelegentlicher erheblicher Scherung Scherbrfiche auf, die wir auch yon Mikrotomschnitten kennen, wenn wir besonders spr6de Einbettungsmittel (z. B. hartes Paraffin) wShlen. Der Mikrotomschnitt wird dann in feine Bi~Ikchen parallel zur Messersehneide aufgespalten. I)er ideale Schnitt ist auch fiir uns der Fliegspan, der entsteht, wenn in jedem Zeitpunkt kleinste I~rSfte kon- tinuierlich einwirken.

Der Reil~span, eine vSllige I)eformierung des Schnittes, hat ein explosionsartiges Vorreil~en des Materials zur Voraussetzung und kann nur bei sprSdestem Werkstoff bzw. bei ruckartigem Anschnitt beobachtet werden.

Der entstehende Spalt 1 der Lange fiillt sich in Wirklichkeit beim Schneidevorgang mit SpSnehen und Schtirfteilehen des Gewebeblockes. Es bildet sich ein ,,Schneidenansatz"~ Die GrSBe und Lange des Spaltes ist nieht allein yon der SprSdigkeit des Materials, sondern auch yon der I-I~irte und anderen Eigenschaften und yon der Schnittgeschwindigkeit abhSn~g. Bei Zunahme der Schnittgeschwindigkeit n immt der Schneiden- ansatz und damit die SpaltlSnge 1 ab.

Die besprochenen elektrostatischen Ablenkkritfte an den unebenen Begrenzungsfl:~tchen dieser selbst fiir die Elektronenmikroskopie dtinnen Schnitte nach der Keilschnittmethode und dem Dachschnit tverfahren werden die Bildgtite ganz wesentlich beeinflussen. ~Vir miissen also andere Wege gehen und andere MSglichkeiten suchen.

Das Ultraschallmikrotom 2s.

Solche Wege zur Vermeidung der geschilderten Schwierigkeiten sind gegeben in der Erfahrungstatsache, dab man beim Schneiden mit dem Mikrotom durch die Schriigstellung des Messers die SchSrfe erhSht. Man setzt dadurch den Winkel zwischen Schnittrichtung und Messerschneide, den man die Deklination beim Mikrotom nennt, yon 90 o auf kleinere Werte bis z. ]3. 300 herab. AuBer yore Schneiden- oder Facettenwinkel ist die Sch~trfe des Messers yon der L'~nge des Weges abh~ngig, auf dem


die Steigung des gegebenen Schneidenwinkels fiberwunden werden muB. Ist die Deklination bei Querstellung 90 ~ so ist der Steigungswinkel gleich dem Facettenwinkel. Je schr~ger man das Messer einstellt, um so l~nger ist der Steigungsweg, und um so besser schneider es. ])as ttin- und tterbewegen des Messers, wie es z. B. jeder beim Schneiden yon Wurst iibt, kann man sich als die Verl~ngerung des Steigxmgsweges bzw. die Verkleinerung des Steigungswinkels veranschaulichen, und zwar um wesentlich gr6Bere Faktoren, als es die blol]e Neigung des Messers gegen die Schnittrichtung vermag.

Die Bewegung des Mikrotommessers mfiBte demnach die LSsung des Problems bringen, da mit dem Sinken des Winkels die Knickfestigkeit

A b b . 11. U l t r a s c h a l l m i k r o t o m be i s c h w i n g e n d c m M e s s e r .

steigt und mit dem Wert ~r ---- 0 den theoretischen Wert K ~ 0 annimmt ! Desgleichen sinkt der AnpreBdruck, die aufzuwendende Schubkraft des Messers und damit die Stauchung des Objektes vor dem Messer her. Dies bewirkt wiederum, dab der vor der Messerschneide herlaufende Spalt und seine L~nge 1 immer kleiner, im Grenzfall 1 = 0 wird und das SpleiBen und Spalten des Gewebeblockes durch ein ideelles Schneiden ersetzt wird !

Die Ausffihrung dieser theoretischen Uberlegung scheitert aber bereits im ersten Anl~uf an der mechanischen Pr/izision. Es ist unmSglich, ein Messer mechanische Schneidebewegungen ausffihren zu lassen, die in der Horizontalen geringere Differenzen als 10 -4 ram, die ffir die elektronenmikroskopische Untersuchung erwfinschte Schnittdicke, aufweisen. So- wohl was den planen Schlfff als auch die Lagerung des bewegten Messers anbetrifft, mfissen wir Toleranzen von mindestens 10 -2 bis 10 -3 mm bei pr~zisester Feinmechanikerarbeit einkalkulieren. Hinzu kommt die Reibung der auf der Messeroberfl~che aufliegenden Schnittunterfl~che, die zum Reifien, zum Aufsplittern des hauchdfinnen Schnittes durch den Zug des bewegten Messers f~hrt.

Die Erzielung iibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnittem 369

Die LSsung dieser mechanischen Schwierigkeiten bringt nun d~s Uttraschallmikrotom, d~s ich ~uf Grund der vor~ngestellten Gedanken-

Abb. I2. UILt'~sch&ltmikrotoln bei s chwingendem Objek t und a r r e t i e r t em ~Iesser.

Abb. 13. U l t r a scha l imik ro tom bei s chwingcndem Messer un4 schwingendem Objekt .

g:~tnge iiber den Schneidevorgang entwiekelte und bei dem das Mikrotom- messer dureh Ultraschall in Schwin~oamgen parallel der 5Iesserschneide versetzt wird.

Die Abb. 1t, 12 und 13 zeigen verschiedene AusfiShrungsformen des Ultrasehallmikrotoms, die naeh meinen Angaben in den Atlaswerken,

Virehows Arehiv. :Bd. 312. 2~


Bremen, gebaut wurden. Auf einem 5 em dieken Brett aus Kiefernholz ist ein Leitz-Grundschlittenmikrotom aufgeschraubt. Auf einem massiven Holzsoekel, der fest mit dem Brett verbunden ist, ruht in einem aus- gearbeiteten Bett ein aus Niekelbleehen hergestellter Magnetostriktions- sehwinger, der auf dem ttolzsoekel festgeklemmt ist. Das eine freie Ende des Sehwingers ist plangesehliffen und wird fest an die ebenfalls plangesehliffene rechtwinklig zur Sehneide stehende Flitehe des Mikro- tommessers gedrtickt, so dab kein Luftspalt zwischen Schwinger und Messer besteht. Der in Abb. 11 in einer halben WellenlSnge sehwingende Sehallsender und das in einer WellenlSnge schwingende Mikrotommesser bilden ein gekoppeltes Sch~ng~ngsgebilde. Die gr6gte Amplitude der

cp senkreeht zur Sehnittriehtung verlaufen-

~ tZ

@

j j ~ tt

d A b b . 1 $.

den Sehwingbewegung des Messers tritt in dessen Mitte auf. Die Bef'estigungsstellen des Messers sind so gewShlt, dab sie mit den Knotenpunkten der stehenden Sehwin- gung des Messers tibereinstimmen. - - A n der Sehnittstelle fiihrt das Messer also sehr sehnelle hin- und hei'gehende Be- wegungen aus, deren Amplituden sich zwisehen 10 -~ und 10 -4 mm variieren lassen. Die Bewegungen des Mikrotom- messers laufen streng parallel zur Messer- sehneide, und die vertikale Abweiehung liegt bei fester Einspannung des sehwin-

genden Messers in den Knotenpunkten ffir die Messersehneide welt unter 10 -5 ram, so dal] bei entspreehender Dimensionierung des Querschnitts des Messers die Gewinnung ebener Gewebssehnitte einer Dieke yon 10 -4 mm hinreiehender Fl'Sehengr6Be gesichert ist. Die Gr61]e der t terabsetzung der Kniekung und St~uchung durch die schwingende Bewegung ergibt sieh aus den folgenden Ableitungen. In der Abb. 14 ist die p~rallel der _~[esser- sehneide l~ufende Bewegung mit cp, die sehneidende Bewegung mit c~

bezeiehnet. Im rechtwinkeligen Vektorendreieek gilt ffir die I)iagonale d 2 = c~, ~- c~ oder d = cp -~ c.;.,

fiir die Steigung der Funktion der Bewegung ergibt sich ffir 6~

tg cr -- cs

ffir

t g y - - ~ --l/,C; ~+c~, wobei a die Messerdieke ist. Ein Einsetzen yon a = c s �9 tg :r ergibt sieh fiir den resultierenden Steigungswinkel

cs �9 tg a Cs tg )r ----- ]/c;j+ c?:: ~ --% . tg cr fiir c, >> %


Aus der Gleichung erkennt man, dab rnit wachsender Geschwindigkeit cp parallel zur Messerschneide der Steigungswinkel 7 kleiner wird, wie er ebenso mit dem Schwinden der Sehubgeschwindigkeit c.~ gegen 0 sehr kleine Werte annimmt.

Ffir das Ultraschallmikrotom soll folgendes BeispieI gewShlt werden:

Die Geschwindigkeitsamplitude eines Punktes der schwingenden Messerschneide am Schwingungsbauch ergibt sich aus der Amplitude d 1 und der Sehwingungszahl N, als cp ~ d 1 �9 N. - - Die Amplitude bei magnetostr ikt iver Erregung in der Grundschwingung liegt in der Gr6Ben-

ordnung d 1 = 1 ' 10-4ram und die Sehwin~,mangszahl N = 2l 32 '

wobei E der ElastizitStsmodul und 9 die Diehte des Messermaterials ist. Ffir ein Mikrotommesser yon l = 20 cm LSnge ergibt sieh eine Grund- sehwingungszahl yon etwa 12,75 KHZ. Die Amplitude dl bei maximaler Erregung ergibt sieh zu 2- 10 -'~ ram, so dag die Gesehwindigkeit eines bewegten Punktes in der Mitre der Sehneide Cp = 250 mm/Sek, ist.

Bei der Dimensionierung des Faeettenwinkels des im Ultr~sehall sehwingenden Messers miissen wir die 12ispersicn yon Metallen im Ultrasehallfeld berfieksiehtigen, die sieh in einer Sehartenbildung der Messersehneide auswirkt. Wie vorstehend erlSutert wurde, steht die Sehartenbildung beim Sehleifen in enger Beziehung zum Faeettenwinkel, da bei kleinstem Winkel ~' leichter Metallkrystalle aus der dfinnen Sehneide herausgerissen werden kSnnen, als aus der kom- pakten Masse einer Schneide grS~eren Faeettenwinkels. Analog gilt das ~fir die dispergierende Wirkung des Ultraschalls an der Schneide ~4, so dal~ wit zweekmitl~igerweise zur Vermeidung allzu h~tufigen ~ach- sehleifens Faeettenwinkel yon z. B. 10--200 benutzen werden.

~Vir nehmen an, dal~ der Facettenwinkel ~' des Mikrotommessers 10 ~ betrSgt. Die Messerbewe~mg in der Schnittrichtung, die Sehnitt- geschwindigkeit, sol[ die Geschwindigkeit von 1 mm/Sek, haben.

Wir haben bereits vorher gesehen, dal~ die Bildung eines Fliel~spans das Ziel des Schneidens ist, und daft mit zunehmender Schnittgeschwin- digkeit das Auftreten von Seherbrtiehen vermieden wird, so dal~ ein idealer Fliel~span gewonnen wird. Diese Untersuchungen yon E. Schwerd ~a beziehen sich jedoeh auf den Fall des stillstehenden Messers ! In unserem Falle, bei sehwingendem Messer, wird diese Forderung nahezu auf- gehoben, wenn die langsame Beweg~ng in der Schnittrichtung konti- nuierlich vonstat ten geht. Eine nahezu ideale, stetige Vorw~trtsbewegung des Mikrotomschlittens mit der Geschwindigkeit 1 mm/Sek, ist technisch ausftihrbar.

In unserem Beispiel ist tg y ~ 0,000693. Da die Geschwindigkeit c s gegenfiber der grol~en Geschwindigkeit des im Ultraschallfeld schwingenden Punktes der Schneidenmitte in der Rechnung vernachl~ssigt werden

24*


kann, ergibt sich das VerhtLltnis des n6tigea AnpreBdruckes Pt0 ohne Sehallsehwingung zum AnpreBdruck Pt.~ mit Schallschwingung zu

Pto : P t s ~ cs: %. Die resultierende Komponente des AnpreBdruckes erf5hrt in unserem Beispiel die Verkleinerung um das 250fache. Bei Senkung der Schnitt- dicke um das 10fache sahen wir a b e l dab die Knickfestigkeit um d~s

\ \ , ,,,,\,,~\\ \ \ \ \ \ \ ,~ \,~\ '-, , \ \ \ , \ , , \

XI)b. 15. S c h c n l ~ t i s c h e l ) ~ t r s t e l l u n g b c i m ~ c h n e i l [ e n y o u h a r t e m :~[a tcr ia l . B i h h l n g

e i n e s S p a l t c s v o r (let' Nchn(~ide.

1000fache abnimmt. Die durch Ultraschall erreichte Verkleine- rung des AnpreBdruckes Pts wSre demnach um den Fak to r 4 noch zu klein.

I-tier bringt die Senkung der ge ibung dureh Ultraselaall die LSsung. Bei Verwendung der Eulerschen Formel ftir den auf Kniekung beanspruehten Stab haben wir vorausgesetzt, dab die die Kniekung des Sehnittes be- wirkende Kraf t in der Mitte, in

der Ebene der neutralen Faser des Schnittes angreift. Wie Abb. 15 zeigt, ist dies nicht der Fall, da die Schnittunterfl5che fiber die Messer- oberflitehe wegrutseht und die kniekende Kraf t nieht inl Punk te M, sondern im Punkte G ansetzt und ferner yon der ge ibung abhttngig ist.

\ , \\• ,\\\~<\~,, , \ :~\~\ ,~ \ \ \ \ \ \ \ \ ~

A b b . 16. S c h e m a t i s c h c D ~ r s t e l l u n g des S c h n e i d e n s v o n w e i e h e m e l a s t i s c h e m M a t e r i a l . F l ie l~en des M a t e r i t H s v o r d e r S c h n e i d e h e r .

Wir wissen, dab bei Anregung mit Ultraschall die g e i b u n g eines schwingenden Stabes sbbnimmt und sich dieser wie geSlt anfafit. Die gerabse tzung der ]~eibung erklSrt sich im wesentlichen dadurch, dab die Oberfl5che des schwingenden Stabes geg]t~ttet wird, weft jeder Punkt der Ober- flitche eine schwingende Bewegung ausfiihrt und mikroskopische Rillen, scharfe Ri~nder und Er- hebungen durch die Schwingungen hohe Frequenz verebnet werden.

Die Gr6ge der Reibungsminderung* durch Ultraschall, fiber die es bisher keine Literatur gibt, kSnnen wir formelm'~gig ~ e die Verkleinerung des Steigungswinkels des Messers in unserem Falle yon der Bewegung ableiten, die das Messer senkrecht zur Schnittfl~che ausffihrt 19 Die Abb. 17 zeigt in der Aufsicht einen auf waagerechter Unterlage in gleich-

* Herrn Dr. Kallmeyer, Atlas-Werke, Bremen, danke ich fitr wertvolle An- regungen.


nr~Biger Bewegung mit der Gesehwindigkeit v~ = eonst, gehMtenen KSrper C, der durch Befestigung an einem sehr l~ngen Faden der x- Richtung pt~rMlel geftihrt sei. Bewegt sich nun gleichzeitig die Unterlage in y-Richtung mit der Gesehwindigkeit %, so entsteht eine resultierende l~elativbewegung mit der Geseh~_ndigkeit v. Diese best immt die ~ichtung der auf C wirkenden geibungskraf t /~, deren GrSge stets gleieh dem Produkt aus dem Gewicht des KSrpers C und dem t~eibungsindex ist. Der in y-Richtung fallende Anteil ' dieser Reibungskraft ist

~'y . . . . l . . . .

R~ ~ R �9 ~'-g- fiir v~ << 1,

so hinge v~ klein gegen v~ ist, ist also aueh die Komponente der Reibungs- kraf t in der y-giehtung klein. Setzen wir ftir v,j die Geschwindigkeit in Sehnittriehtung G und ftir G. Amplitude parallel zur Messersehneide sehwin- gendcn Punktes der Messermitte % ein und ist der K6rper C die ~, Messersehneide S, so haben wir fiir die in Sehnittriehtung resultierende Reibung

fiir unser Beispiel w6rde die t~eibung R s und

die Geschwindigkeit des mit grSgter

C

,@~-ZJdez gx V~

A b b . 17 .

damit die knickende Kraft um das 250faehe verkleinert werden. Der Gesamtwert der Verkleiaerung der Knickkraf t ergibt sieh ~us

dem Produkt der resultierenden Schubkraft und der Reibung und ist

p,.,=_Pt.R. c;, In unserem Beispiel wiirde die Kniekkraft um das etwa 65000faehe sinken.

Gehen wir davon aug dab Schnitte yon 10 -3 ran1 die untere Grenze fiir das iibliehe Mikrotom darstellen, so miigte es naeh dieser Rechnung gelingen, noch Schnitte yon etwa 40nlal dtinnerer Sehnittdicke herzustellen, yon 2,5 �9 10 -~ ram. Diese Sehnitte wfiren nun ffir die elektroneniibermikroskopische Untersuehung als weitgehend ideal zu bezeichnen, und die eingangs erSrterten Fehler der Absorption, der ehromatisehen und der rSumliehen Streuuna riebst der Aufladung wiirden nahezu zu vernachlSssigen sein.

Y i r c h o w s A r c h i v . B d . 312 . 2 4 a


Da nun bisher Untersuchungen fiber die Herabsetzung der Reibung durch Ultraschall fehlen, kann auch die Gr6Be der Herabsetzung des Anpre]druckes Pt.~ nicht exakt festgelegt werden. Um die Gr6i~e der Reibung festzulegen, mfil~te man Versuche z. B. nach Abb. 18 ausffihren, wobei zwei ParaffinklStzchen durch eine Feder gegen die Oberfl '~che eines Mikrotommessers geprel3t werden. Schwingt die Stahlschneide in senkrechter Richtung zur Papierebene, so mfissen bei wesentlicher Herab- setzung der F15chenreibung die Paraffinkl6tzchen herabfallen. Man k6nnte die genaue GrSBe der Herabsetzung der Reibung exak t untersuchen, indem man die K15tzchen fest einspannt und die Schneide nun senkrecht nach unten drfickt und die Druckminderung beim Schneiden

mil]t. Da noch andere Faktoren die GrS3e der Re ibung )~i~ beeinflussen, erhiilt man so el'st die wahre Gr6~e der Rei-

bungsminderung. Solche Faktoren, die die Reibung beeinflussen, sind z. B.

der Schallwiderstand des Schnittmaterials (z. B. des Paraf- fins) und die Adh'~sion des Schnittes an die Messerober- fl~tche.

Bei dent geringen Schallwiderstand des Paraff ins WSl'e es z. B. im Grenzfall m6glich, dal~ die angedrfickte Schneide das ParaffinhSutchen bei ihren Schwin~ngen mitnimnl t , s<) dag in der Schneidlinie selbst keine gegenseitige Bewe- gung zustande kommt. In diesem Falle wSre es also nStig,

~l,i,. is. fiir die Schnittgeschwindigkeit mit dem Ultraschal lmikrotom yon dem bisher fiblichen Einbettungsverfahren abzugehen

und neue Einbettungssubstanzen zu suchen, die einen hSheren Schall- widerstand aufweisen, bzw. mug unter den bekannten Stoffen das geeignetste Material ausgesucht werden. Hierzu sind lange Versuchs- reihen nStig, die mir aus Griinden des Krieges verwehrt waren.

Als weitere GrSl~e, die die Reibung beeinflul~t, ist die Adhii, sion zu nennen, die den Schnitt an der Messeroberfl~che haften li~l~t. Sie ist direkt proportional zur Reibung und wie diese indirekt proport ional zur Spaltst~irke 5, Und man kann die Newtonsche Gleichung fiir den Reibungswiderstand T einsetzen t:~,):

V T = ~l. / . - ,~ ,

wobei ~] die Z'~higkeit in kg/m ~, / die Fl~che in m", v die Geschwindigkeit in m/Sek, und ~ die Spaltst~rke in m bedeutet. Es handelt sich hier Uln den Spalt, der zwischen Messeroberfl~che und Schnittunterfli~che entsteht. Mit dem Spalt der L'~nge 1, der vor der Messerschneide herl~tuft, hat der hier besprochene Spalt nichts zu tun. Wie die Abb. 19 veran- schaulicht, wird bei einem Schwingen des Messers rnit hoher Frequenz, wie sie beim Ultraschall auftritt , die rauhe Oberfl~iche gegli~ttet und damit die Spaltst~rke 6 auf die resultierende Spaltst~irke ~ verkleinerL

Die Erzielung tibermikroskopischer Elektronenbilder von Gewebeschnitten. 375

wodurch der Reibungswiderstand T vergr6~ert wird. Man erkennt aus der Newtonschen Formel welter, dM~ man die Z~higkeit des Schmier- mittels ~ mSglichst klein zu halten hat. Da Luft die kleinste Z'~higkeit hat, mul~ man mit dem Ultraschallmikrotom stets trocken schneiden. Die Benetzung der Messeroberfl'~che mit Wasser, Alkohol usw., wie sie in der Technik des Schneidens mit den fiblichen Mikrotomen oft gefibt wird, um das Verhaken der Schnitte an der rauhen MesseroberfF~tche zu vermeiden, ist beim Schneiden mit dem Ultraschallmikrotom wegen der starken Erh6hung der l~eibung also fehl am Paltze. Die G15ttung der MesseroberflSche erfolgt hier durch die Schwingung des Messers, wodurch der Schnitt auch gewis erma~en auf der MesseroberflSche , schwimmt" , ohne sich an Rauhigkeiten des Materials zu verhaken. Die Abh~ngigkeit der Reibung bzw. der Adh'~sion yon der Spaltst 'Srke bietet uns die I-I~ndhabe zur Herabsetzung der Reibung durch Vet- grSi~erung der Spaltst~rke.

Die Vergr61~erung der Spalt- stSrke kann man in der Praxis dutch die Aufladung des ~[essers erreichen. Isoliert man den Ultra- schallsch~Qnger und das Messer, was sich teehnisch ~uBerst einfach

Abb. 19.

erreichen l~tl~t und l~dt beide mit einer gewissen Spannung auf, so werden die hauchdiinnen Gewebeh'~utchen aus isolierenden organisehen Stoffen yon der MesseroberflSehe abgestol~en und schweben fiber der Messeroberflitche. Der entstehende Sp~lt wird dadurch erheblich verbreitert und die Reibung proportional der Sp~ltverg61]erung her~bgesetzt.

Die vorstehenden t~berlegungen grfinden sich auf die Annahme, dab das .~[esser in einer Wellenl~inge schwingt.

Nehmen wit an, dal] es in h6heren Oberwellen schwingt, so haben x~qr die ~[esserlSnge in mehrere Schwingungsb~uche und Knoten unterteilt . Die Amplitude eines uuf dem Schwingungsbauch befindlichen Punktes sinkt, wShrend die Frequenz der Schwingung steigt. Die Geschwindigkeit % bleibt als Produkt beider Faktoren konstant, so dal~ die Herabsetzung des Anprel~druckes durch }[inderung des Steigungs~qnkels und der Reibung die gleiehe bleibt. Ffir die dicht neben dem Schwingungsbauche ]iegenden Punkte der Schneide sinkt die Geschx~dndigkeit % und wird im Schwingtmgsknoten = Null. Die Strecke G des Geschwindigkeits- nbfalls vom ~Iaximum bis Null betr'~gt ein Viertel der Wellenl~inge ~ g/4. Je l<leiner also die Wellenl~nge ist, um so steiler ist der Abfall der maxi- m~len Punktgeschwindigkeit der Schneide zu Null. Da man ~ber mi t grol~en Geschwindigkeiten sehneiden muB und die Schnittbreite in Rich- tung der Messerschneide aueh eine gewisse Gr6i~e haben muB, wird man die besten Resultate in erster Ni~herung dann erzielen, wenn Bauch und Xnoten welt auseinanderliegen, was beim Schwingen des -~.[essers


2. l yon der L'Snge l ~n seiner Grundschwingung auftritt , wobei G - -- 4 4 ist. Wird die Strecke G gleich der Schnittbreite, so tr i t t die Wirkung des in Ultraschall schwingenden Messers nur in der Mitte des Schnittes auf, w~Lhrend die lZ~nder ~n den Knoten der Schwingung liegen und die Ultraschallschneide~4rkung ---- Null wird. Der Schnitt wird unregel- mSl3ig, zerfasert, gestaucht und geknickt in L';inge und Breite.

I)iese erste Uberlegalng, die besagt, dal3 die 1/~ngste Wellenl~tnge bzw. das l~ngste im Ultraschall schwingende Messer die besten und gleichm~l~igsten Schnitte liefern wird, gilt nicht uneingeschr~tnkt, wenn man sich folgendes vergegenw~rtigt

Die ]3ewegung der 3[assenpunkte der schwingenden Schneide ist eine longitudinkle Schwingung. Ein .~[assenpunkt des Schwing-ungsbauches macht ~lso eine gegenlSufige Bewegung durch, deren einfache Strecke gleich der Amplitude der Schwingung ist. Je 6fret dieser Ausschlag bei der H.in- und Herbewegung durchlaufen wird, je gr61~er also die Schwingungszahl o, ist, um so grSl~er ist die Beschleunigung de~ 3Iassen- punktes in der Zeiteinheit. Nach dem Gesetz der Sinusschwingung ist die Beschleunigung

b=-o, -~ oder b = r . w ,

wobei o~ die Kreisfrequenz und A der Au,schlag, die Amplitude der Schwingung, und v die Geschwindigkeits~mlplitude ist. Bei konst,~nter Geschwindigkeit v, wie in unserem F~lle, wSchst die Beschleunigung mit dem Produkte aus Frequenz und Geschwindigkeit v. Fiir den auf der )[esseroberfl~che liegenden Schnitt S bedeutet die Zun~hme der Be- schleunigamg der unter ihm und mit der SchnittunterflSche in Reibung befindlichen 3[esserpunkte die Zunahme der gegen die Verfornmng l~tngs der Messerschneide wirkenden Kraft , die nach dem Energiegesetz gleich dem Produkt aus M~sse des Schnittes und der Beschleunigung der schwingenden M~ssenpunkte angesetzt werden kann. Diese t~'berlegung kann man sich veranschaulichen, wenn man sich die schwingende Be- we~oalng der Schneide dutch eine gerichtete Bewegung ersetzt denkt: z .B. durch eine rotierende Messerscheibe, bei der die Beschleunigung = Null ist. Hier erfi~hrt der hauchdtinne Schnitt sofort eine Zerst6rung in Schnittrichtung, d~ die gegen die Verformung gerichtete Kra f t wie das Produkt aus Beschleunigung und Masse----Null wird.

3Iit hSherer Frequenz haben wir ~lso eine geringere Verformung des Schnittes zu erwarten. Auch das Ankleben des Schnittes an die Messer- oberfl~che, das Mitschwingen desselben, welches wir ~mch ~ls yon dem Schallwiderstand des zu schneidenden Mediums abh~ingig sahen, sinkt mit zunehmender l~requenz der Ultrasch~llschwingung. Beriicksichtigt man da.s VerhSltnis der Strecke G zum Schnittforma.t und die Beschleuni- gung, so wird man eine optima]e Frequenz w~thlen, bei der 2~/4 noeh hin- reiehend grol3 gegen die Schnittbreite ist und eine Verformung des


Schnittes durch die geniigend hohe Beschleunigung der schwingenden Massenpunkte der Messerschneide ausgeschaltet wird.

Sdigewirkung des schwingenden Messers.

Das Elektronenbild Abb. 9 einer Rasierklinge zeigt, d~l~ die Schnitt- kante des Messers wie elne S/ige aussieht und das Ultraschallmikrotom daher auch ~[e eine S~ige wirken kann.

Diese SSgewirkung ist unerwfinscht, d~ die scharfen Spitzen Materie- teilchen losrei~en, die sich dann vor der Schneide ans~mmeln und einen Schneidenans~tz ~-3 bilden, d .h . die L:~tnge des vor dem ~[esser her- laufenden Spaltes 1 vergrSl~ern.

Die S/tgewirkung wird herabgesetzt, wenn d~s Messer , , v e r e b n e t wird. Bei gegebenem Messer ist daher die Forderung zu erheben, d~[t die Schwingungsamplitude grOBer ~ls die Schartenbreite sein mul3 und die Geschwindigkeit eines schwingenden M~ssenpunktes ein Mehrfaches der Schnittgeschwindigkeit betmgen mul~. Als Schartenbreite ist deK' mittlere Abstand der hSchsten Zacken der Metallteilchen der Mes~-er- ~chneide (der S/~gezShne) einzusetzen. ]~r betrSgt bei der elektronen- optisch ~mfgenommenen l~sierklinge erd Abb. 9 = 4 �9 1() -~ ram. Die Schartentiefe spielt beim Ultraschallschneiden keine Rolle. Ist die Am- plitude der UltraschMlschwingungen kleiner als die Schartenbreite, dann werden die nicht durch die Schwingung eingeebneten Spitzen breite Furchen und Vertiefungen in die Oberfl~che des Gewebeblockes ein- graben und d~tdurch die Oberfl~tche der Schnitte uneben gestalten.

Erg/s zu den vorstehenden theoretischen Ausffihrungen mScbte ich darauf hinweisen, da, ft diese keine~wegs erschSpfend die VorgSnge und Vorteile des ziehenden Schnittes des schwingenden Messers behandeln. Es bleiben noch eine Menge yon Fr~gen und Problemen offen, die einer grfindlichen theoretischen und versuchlichen Untermauerung bedi~rfen. Solche Fr~gen w:~ren u. ~.: Wie h/~ngt der Fortschrit t des Schnittes mit dem angew~mdten Druck und dem Weg bzw. der Ge- schwindigkeit des Messers p~r~llel zur Schneide zus~mmen ? Wie groft ist der Einflul~ des Messerm~terials, der Schneide ? Wie verh~lten sich verschiedene Stoffe hinsichtlich der Vorteile der Ziehbewe~mg ? W~nn wird ein Flie~span gebfldet ? Die bier in einer Rechnung der Anschaulich- kei~ zuliebe erl~tuterte optim~lste Schnittdicke des Ultraschallmikrotoms wird a]so mehrere Faktoren noch .beehdlu~t werden. Unberiicksichtigt blieb ferner der Kriimmungsradius der Schneide, der die kleinstmSgliche Spandicke auch beim ziehenden Schnitt beeinfluBt und dessert Mal3e durch die Be~rbeitung und das verwendete Material begrenzt werden.

Erst die Kenntnis und Einbeziehung alier dieser F~ktoren wird dem Ultrascha]lmikrotom zu seinem vollen Erfolg bei seiner Verwendung in der l)bermikroskopie verhelfen.

378 F r i e d r i e h K r a u s e :

A us]iihrungs/ormen des Ultraschallmikrotoms.

Die bisherigen tJ'berlegungen galten fiir die Ausfiihrungsform des Ultraschallmikrotoms, bei der der Magnetostriktionsschwinger und, d a s Messer ein gekoppeltes Schwingungsgebilde darstellen. Es l~tl~t sich nun technisch leicht verwirklichen, das Messer selbst zum Schwinger aus- zubilden, indem man durch den Messerriicken LScher zur Aufnahme der Drahtwindungen bohrt und damit das ganze Messer zur Schwingung bringt. Als Nachteil mul3 man die starke Erwgrmung des Messers in Kauf nehmen, die durch die Wirbelstr6me im Messer auftritt , weil man das Messer nicht aus einzelnen Blechen herstellen kann, wie man es bei den Magnetostriktionsschwingern im allgemeinen tut. Eine Kiihlung des Messers wgre unerl~tBlich. Die im erster~ Falle erSrterten GrSBen und Faktoren der Herabsetzung des AnpreBdruckes und der Reibung bleiben die gleichen.

Wesentlich andere Verhgltnisse ergeben sich, wenn man nicht das Messer, sondern das Objekt schwingen l~iBt.

Technisch 1'513t sich das so durchfiihren, dab man z. B. am Ort der gr68ten Amplitude, am Schwingungsbauch eines in Ultraschallfrequenz sch~dngenden Stabes oder Sch~ingers, den Objekttisch mit dem Gewebe- block anbringt, wobeidie Schwingungsrichtung parallel zur Schneide liegt. Das .~[esser selbst ist fest eingespannt.

Die Abb. 12 zeigt eine S[Sglichkeit, diesen Gedanken technisch zu verwirklichen.

Derselbe Sehwinger wie in Abb. 12 wurde dabei verwandt ufld auf dem Sehlitten des Mikrotoms derart befestigt, dab eine Stirnflgehe in der Mitre des Schlittens liegt. Diese EndflSche wurde mit einer Kappe aus Isolierstoff (Trolitul) versehen, auf die das in Paraffin eingebettete Objekt geklebt wird. Die ErwSrmung des Objektes durch den nach kurzem Gebrauch bereits heiB werdenden Schwinger wird so vermieden. Der Versuch ergab, dab der Paraffinblock bei Erreg~ng des Schwingers stark mitschwingt. - - Bei der gezeigten Anordnung wird der in halber Wellenlgnge erregte Schwinger in seiner Mitre befestigt, so dab das Ende frei schwebt. Besonders bei starker Erreg-ang ]gBt sich hierbei das Auf- treten unerwfinschter Vertikalschwingung der Schwingerenden und_ damit des Objektes nicht vermeiden. Ein feines Piepsen zeigt beim Betrieb an, da.l~ solche sekundSren Schwingungen auftreten. Diese Vertikalschwin- gungen lassen sieh dadurch beseitigen, dab man den Schwinger in einer Wellenlgnge schwingen 158t, und dann ~ihnlich dem Messer der Abb. 11 in den Knotenpunkten befestigt. Das Objekt mtii3te dann in der Mitte des Schwingers auf einem Tisch aus Isolierstoff befestigt werden. Es ist leicht einzusehen, dal~ bei Arretierung des stabilen Schwingers an zwei Punkten jede Vertikalschwingung ausgeschaltet wird und daher der Schwinger zur Erreichung der grSl3ten Amplituden maximal belastet werden kann,


In erster N~thcrung ist die Herabsetzung yon Anprelldruck tttld Reibung durch das schwingende Objekt der Kerabsetzung beim schwingenden Messer gleich. Es ergeben sich jedoch wesentliche Vorteile daraus, dab erstens die Dispergierung des schwingenden Messers an einev Schneide und die damit verbundene Sch~rtenbildung wesentlich her~b- gesetzt ~ird ~-5.

Zum zweiten braucht man den Gewebebloek nicht direkt auf den schwingenden Stab oder Schwinger zu kitten, sondern k~mn diesen ~mt' dem Objekttisch befestigen, d e r m i t einem Full oder mit einer Platte aus Isolierstoff ~thnlich der Abb. 12 am Orte des Schwingungsbauche.~ befestigt ist, so daft das gese~mte Objekt mit der grSllten Anq)litude schwingt. Im Gegensatz zum schwingenden Messer h~tben wir ~tlso mit kle~nster Frequenz die optimalsten Bedingungen. Man wird bier statt der Magnetostriktionsschwinger auch piezoelektrisehe Schwinger ~ms Qua.rz mit wesentlich hSherer Frequenz wShlen kSnnen. Diese Steigevung der Frequenz ist dureh die Forderung, dab die Amplitude gr6f3er ~ls die Schartenbreite zur Vermeidung de,' Sitgewirkung sein mug, begrenzt und steht in Beziehung zum benutzten Messer und dessen Facettenwinkel.

Zum dritten ist uns bier der geringe SchallwidersUmd dev Ein- bettungssubstanz (z. B. Paraffin) im Gegensatz zum primitt" schwingende~l Messer erwtinseht, da ja der gesamte Gewebeblock, der mOglich~t geringe Mtichtigkeit haben soil, mitsehwingen mull.

Die dritte MSglichkeit einer Ausffihrungsform de~ Ultraschallm[kto- toms ist die Verbindung der beiden vorstehend erSrterten ~ISglichkeiten, indem man sowohl d~rs ~Iesser ~rls auch das Objekt in Ultraschalt- schwingunger~ versetzt.

Dabei kann man so vorgehen, dall man beide sch~-ingende Teile in der gleichen Frequenz mit einer Phasendifferenz yon ~/2 schwingen li~llt, so dab die resultierende Amplitude die doppelte Liinge hat. Auch die Besehleunigung verdoppelt sich hierbei. - - Oder man geht so vor, d~rg man das Objekt in einer sehr hohen Frequenz schwingen lt~llt, um eine hohe Punktbeschleunigung und die damit verbundenen Vorteile zu erzielen und das Messer z. B. in seiner Grundschwingung erregt, um die SSgewirkung der Messerscharten zu verebnen und auszugleichen.

Die Abb. 13 zeigt eine Ausfiihrungsform des Ultrasehallmikrotom,~, bei dev 5lesser und 0bjekt schwingen. Das Messer ist in seiner Mitre befestigt und schwingt in halber Wellenl/tnge. Das Messer schneidet an seinem Ende. Fiir das schwingende Objekt wurde die Anordnung der Abb. 12 genommen. - - Wie aus dem Vergleich der GrSllen der Schwinger hervorgeht, sind die Frequenzen der erzeugten Sehwingangen verschieden. Der grolle, am Messer sitzende Schwinger schwingt mit einer Frequenz yon 10,9 KHz und der kleine Schwinger mit 16,9 K_Hz. Eine stets gegenl~ufige Schwingung der schwingenden Punkte der Messer- schneide und des Objektes ist dadureh gewShrleistet. Allerdings benOtigt

;]8[) Friedrich Krause:

man d~tzu zwei Schallgenerutoren, wodurch die Anlage recht umfangreich und teuer wird.

Die Erfahrurg muB lehren, ob das Ultraschallmikrotom sp'Ster nfit schwingendem Objekt bei lest eingesp.anntem Messer zu bauen ist oder ob sowohl Messer wie Objekt in Schwingungen zu versetzen sind.

Das Keilschnittver/ahren und das Dachschnittver/ahren in Verbindung mit dem Schneidever/ahren des Ultraschallmikrotoms.

Es wird ohne weiteres klar, daI~ die beschriebenen Schnittverfahren nach M. v. Ardenne und nach der Dachschnittmethode des Verfassers in Verbindung mit dem Ultraschallmikrotom ebenso anwendbar sind und in ihrem Wert steigen. Das Schneiden mit dem Ultraschallmikrotom wird sich in der Erzielung ebenerer Schnittoberfl~tchen auswirken, w~hrend die I-Ierabsetzung des Anprel3druckes und der Reibung dutch die yon M. v. Ardenne eingeftihrte Deckschicht geringeren Wert hat. Die Stabi- litiit der keilf5rmigen Schnitte beim PrSparieren derselben zur Unter- ~uchung im E~[ werden wir dann besonders begrti]en, wenn wit auf orSBere Schnittformate keinen Wert zu legen brauchen.

Das Abdruckver/ahren von Oberfldchen nach Mahl in Verbindung mit dem Schneidever/ahren des Ultraschallmikrotoms.

Mah126 hat zur tibermikroskopischen Darstellung yon 0berfl~tchen ein Verfahren entwickelt und in der MetMlurgie ganz erstaunliche Erfolge erzielt, indem er yon der Oberfl~che yon 3[etallen z. B. einen diinnen Abdruckfilm herstellte, den er da.nn mit dem Durchstrahlungsverfahren inl Elektronenmikroskop abbildete. Die Technik ist die, dal~ auf die Oberfl~iche des Objekt~s eine dfinnfliissige Lackschicht (z. B. Zaponlack) oder durch KathodenzerstSubung eine homogene Metallschicht auf- getragen wird, die in die vorhandenen Vertiefungen der Krystall i te ein- dringt. Dtmn wird die diinne I{aut aus homogenem Lack oder 3[etM1 abgelSst und auf einen 0bjekttr~ger ins ~'bermikroskop gebracht.

Diese Methode kann man nun direkt zur Abbildung yon Geweben bentitzen, wie in Zusammenarbeit mit Mahl yon mir in den ~Tersuchen nachstehend gezeigt wird. Die elektronenfibermikroskopische Sichtbar- machung der Feinstruktur der I~nochensubstanz, der Oberfl~iche yon I-Iaut und Schleimhaut, yon Blut oder Zelluusstrichen und sonstiger einzeln liegender Zellen hat hier ein grol~es und vordem noch nicht be- tretenes Anwendungsgebiet.

Die Anwendung dieses Verfahrens auf behebige Gewebe, ~vie es durch die Anwendung des Abdruckverfahrens auf angeschnittene, eingebettete GewebeblScke denkbar w'ire und ffir die fibermikroskopische Sichtbar- machung innerer Zellplasma- oder Kernstrukturen unsch~tzbaren Wert h~itte, 15I~t sich mit dem bisherigen Sckneideverfahren deshalb nicht verwirklichen, well das im fibermikroskopischen Sinne schartige ,-Viesser

Die Erziehmg iibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. 381

Schrunten und l~illen in das Gewebe relict und ferner die Stauchung durch den relativ hohen Anprel~druck eine weitere Verformung der Oberflhche des Gewebeblockes zur Folge hut. Die so hergestellten 0ber- fl~chenfilme w~irden also nicht ein getreues Bild der Gewebestruktur im 5bermikroskopischen Sinne liefern.

D~s Schneiden mit dem Ultraschallmikrotom versetzt uns nun in die Lage, die Oberflhche des Blockes ganz ebenmSBig herzustellen, d~ die schwingende Bewegung des Messers lgngs der Schneide die vorhandenen Seharten des Messers gh~ttet und der Anpre[tdruck um ein Vielfaches gesenkt wird, so dal~ die Stauchung des eingebetteten Gewebes vor dem Messer her nahezu Null wird und welter ein Herausreil~en yon P~rtikel- chert hinter der Schneide nicht in Frage kommt. Abdruckfilme solcher OberflSchen yon Gewebebl6cken wtirden ein weitgehend getreues Abbild der Zellstruktur liefern.

Das Abdruckverfahren naeh Mahl in Verbindung mit dent Ultr~t- schatlmikrotom hat vor der direkten Untersuchung der mit dem Ultra- schallmikrotom hergestellten diinnen Schnitte mehrere Vorziige. Sie werden klar, wenn man sich an die vorstehenden theoretischen ErSrte- rungen der elektronenoptischen Abbildung und des SchneidevoFganges erinnert. Im Hinblick auf erstere gibt uns das Abdmckverfahren nur ein Bild der OberflSche des angeschnittenen Gewebes, und der kolloide Fein- bau der Zellen, die Zellgrenzen, deren ZellzwischenrSume (Vakuolen) werden sich als feinste Erhebungen auf dem Film markieren. Eine L'ber- lagerung der Strukturen, die bei 10 -4 mm dieken Schnitten und einem lateralen Aufl6sungsverm6gen yon 10 -5 mm bei der groBen TiefensehSrfe der Elektronenobjektive schon den Faktor 10 annimmt, kommt bei dem Abdruckverfahren also gSnzlich in Wegfall, so dal~ die Deutung der Bilder wesentlieh einfaeher wird.

AuBerdem ist eine homogene Kollodiumhaut yon etwa 3 �9 l() -9 ram, wie sie sieh mit dem Abdruekverfahren bequem herstellen 15Bt, bedeutend reiBfester als eine gleiehdieke Gewebeschteht. Ja, naeh den Versuehen halte ieh es fiir maglieh, dab die Prgparation der allerfeinsten Sehnitte des Ultrasehallmikrotoms aus loekeren Geweben, die Auftragnng auf die Objekttr{igerblenden, die Einbrin~mg in das Gergt, das Auspumpen und sehlieBlieh die Belasttmg mit der Elektronenstrahlung noeh erheb- liehe Sehwierigkeiten bereiten werden, die unter Umst~tnden uniiberwind- bar sein kSnnen, wghrend die Untersuehung der Abdrueldilme praktiseh leieht durehfiihrbar ist.

Ferner sahen x~4r hinsiehtlieh des Sehneidevorganges in der Abb. 15, dub vor der Sehneide ein sohmaler Spait herl~iuft, ein Spalten und SpleiBen des Gewebes auftritt, wodureh die Oberfl~iehe des Sehnittes und des Bloekes uneben wird. - - Wenn wit beim Ultrasehalhnikrotom aueh sahen, dal~ dureh die starke Kerabsetzung des AnpreBdruekes der Spa.It sieh verkleinert, so versehwindet er sowohl theoretiseh wie praktiseh


nicht ganz. Eine Ausn~hme macht das in Abb. 16 gezeigte FlieBen weichen, elastischen ~[ateriMs vor der Schneide her. Die Unebenheit beschr~inkt sich Mlerdings nur auf die UnterflSche des abgehobenen Schnittes, da die Oberflitche des Blockes dutch die dem Spaltvorgang folgende schwingende ~[esserschneide sekund~tr durch die Hin- und Her- bewegung in UltraschMlfrequenz gegliittet wird. Das Abdruckverfahren m~ch Mahl yon mit dem U]traschallmikrotom hergestellten Anschnit ten yon GewebeoberflSchen wird uns also auch aus diesem Grunde ein ge- treueres Bild der Gewebe geben als die direkte Abbildung der Ultra- schMlmikrotomschnitte selbst.

])as letzte Wort in dieser Frage kSnnen natiirlich nur umfassende vergleichende Versuche und Aufnahmen sprechen.

Versuche.

Das in den Abb. l l , 12 und 13 gezeigte UltraschMlmikrotom wurde 1940--1941 in dem Labor fiir Strukturuntersuchungen m~ch meinen An- gaben entwickelt und in den Atlas Werken, Bremen, unter freundlicher Mitwirkung der I-~erren Dr. Kunze, Dr. Thiede und Dr. Grandjot, Bremen, besonders im ttinblick :mr dessen schalltechnische Funktionen gebaut.

Bereits 1941 zeigten die Vorversuche, da~ sich wesentlich diinnere und gleichmiii~igere Schnitte mit dem UItraschallnfikrotom Ms mit dem fiblichen Schneideverfahren erzielen lassen. - - Wegen meiner Ein- berufung konnte die Arbeit seinerzeit nicht fortgesetzt werden. ~Ieine jetzige milit~trische Kommandierung zum Studium gest~ttete mir nun die auf einige Wochen beschr~tnkte Fortsetzung der Versuche. Da das Labor fiir Strukturuntersuchungen 1941 wegen meiner Einberufung voriibergehend geschlossen wurde, konnte ich die elektronenoptischen Gewebeuntersuchungen nicht mit dem yon meinem Bruder und mir entwickeltem und gebauten magnetischen :E~[ durchfiihren. Ich danke es der freundlichen Unterstiitzung und Genehmigung I-Ierrn Professor Dr. Briiches, dM3 die elektronenoptischen Aufnahmen an den Ger~tten des Forschungsinstitutes der AEG gemacht werden konnten. Die Versuche iiber das Abzugsverfahren yon Geweben wurden in Zusammen~rbeit mit Herrn Dr. Mahl ausgeffihrt. :Ein Tell der UltraschMlschnitte wurde freundlicherweise durch t terrn Dr. Kinder an dessen magnetischen EM ~ufgenommen. Die ultraschMltechnischen Versuche und das Sehneiden mit dem UltraschMhnikrotom wurden mit freundlicher Genehmigung l:[errn Dr. Kunzes in den Atlas-Werken in Bremen ausgeffihrt.

Die Versuche zielten nicht auf den Erhalt spezieller histologischer Forschungsergebnisse hin, sondern sollten lediglich den ~'achweis ffihren, dM~ es mit dem UltraschMlmikrotom gelingt, fiir die e]ektroneniiber- mikroskopische Untersuchungsmethode brauchbare dtinnste Sehnitte zu erzielen. Es wurde deshMb nur ein gerade greifbares Gewebe, n~mlich

Die Erzielung iibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebeschnitten. :~8:~

ein in Paraffin eingebettetes l%ectum-Carcinom zum Sehneiden genommen.

I. ~Ms erste Versuchsanordnung wurde der Aufbau nach Abb. 11 gewii.hlt, wobei nur das }lesser schwingt.

Mit unbewaffnetem Auge lassen sich die einzelnen SehnittvorgSnge bei nicht schwingendem und bei schwingendem Messer kaum vonehmnder unterscheiden. Bei geringster Hebung des Objektes um Teile eines /t werden in beiden FSllen nut Gewebeschnitzel yon wenigen Quadrat- millimetern abgehoben, die sieh grob visuell nicht unterscheiden lassen. Erst beim Serienschneiden fgllt auf, dab bei schwingendem Messer jedesmal das 5:lesser greift und einen Schnitt yon wechselnder F15chengrSf~e abhebt, wghrend bei ruhendem Messer etwa nut jeder zweite und dritte Schnitt bei geringster Diekeneinstel- lung abgehoben wird. In den dazwischenliegenden Schneide- vorgttngen streift das Messer nut die Oberflt%che des Paraf- finblockes bzw. hobelt nut' feinste Geweb.~sp~ne und Split- ter herunter, die ft'~r die Unter- A b b . 20. E l c k t r o n e n b i h [ y o n Z e l [ e n el~te~ Mammt~-

suehung unbrauchbar sind. carcinoms. Gewdhnlichct' ~',[ikrotom.-:chnit, t. Zu- f a l l ~ e r g e b n i s (29 , s. ~kbb. 6). V = 4000 : 1 ; a t l f -

Betraehtet man den Schneide- g e n o m m e n m i t d o r a m a g n e t i s c h e n ~:5I des H o c h - s p a n n u n g s i n s t R u t s t i e r T e c h n i s c h e n I - Iochsehu lc

vorgang mit der Lupe, so fSllt Berlin yore u bei 70 eI,2V. welter ins Auge, dab die mit Ultraschall erzeugten Sehnitte weniger gestaucht werden. Sie rutsehen fSrmlieh fiber die schwingende Messeroberflgehe weg, was ja seine Er- klSrung in der eingangs ausftihrlieh besprochenen Herttbsetzung des An- preBdruckes und der Reibung der vibrierenden Messeroberfhiehe finder. Die Paraffinsehnitte sind beim Ultrasehallschneiden durehsichtige, zusammenh/ingende Filme.

IX. Als zweiter Versuch wurde die Anordnung der Abb. 12 benutzt und das Objekt in Sehwingungen versetzt. Ein grundsgtzlieher Unter- schied konnte beim Sehneiden gegeniiber Versuch I nieht festgestelIt werden. Wegen der Anbringung des Paraffinblockes am Ende des Schwingers und dessen Halterung in seiner Mitte traten bei roller Belasttmg horizontale Nebenschwingungen auf, die nur durch wesentliche gerabse tzung der Intensitgt der Erregung zu beseitigen waren. Der Schall t r i t t dutch die Isolierstoffkappe aus Xunstharz gut auf den Paraffinblock fiber. Eine gute Isolation gegen Wgrme liel~ sieh damit einwandfrei erzielen.

384 Friedrieh Krause :

I I I . Die dritte, sieh aus der Abb. 13 ergebende Versuehsanordnung konnte wegen Mangel yon einem zus/~tzliehen, zweiten Sehallgen?rator nieht durehgeftihrt werden.

IV. Zur ~'berwindung der Adh~tsionserseheinungen der Gewebesehnitte an das Messer ~urde als weiterer Versueh das Messer naeh Anordnung I isoliert eingespannt und mit einem Kurbelinduktor auf eine konstante Gleiehspannung gebraeht. Es zeigte sieh, dab erst yon Spannungen yon 2000--2500 Volt ab ein Effekt derart zu sehen ist, dal3 die Sehnitte noeh regelmitl~iger ausfallen. Sie sehieben sieh an der Sehneide nieht so stark

A b b . 21. E l e k t r o n e n b i h [ won n c k r o t i s c h e n Z e l l e n e ines t i e c t u n l c a r c i n o n l b . U l t r a s c h a l l - s e h n i t t . Die Zcllrf i ,nder s i n d zum Te l l u n s e h a r f u n d f i b e r d e e k c n sich. I n de r 5 I i t t e t i n ze r fa I ]ener K e r n . Die g le i chmi iBigc t I e l l i g k e i t des B i ldes g i b t den Beweis ~ttr (lie aul ]er - o r d e n t l i c h e D f i n n e des U l t r a s e h a l l s c h n i t t e s . V = 4400 : 1; a n f g e n o r n r e e n m i t d e m m a g n e -

t i s e h e n E .M. des A E G - F o r s c h u n g s i n s t i t u t c s (Dr. I(i)lder) m4t 96 e K V .

zusannnen und schweben danaeh fiber der Messeroberfliiehe, wodurch ein naehtri~gliehes Zusammenstauehen vermieden wird. Leider standen hShere Spannungen nieht zur Verffigung. Ieh vernmte aber, dab bei Anwendung yon hSheren Spannungen noeh bessere Erfolge augensehein- lieh werden.

V. Ein letzter Versueh wurde unter Verwendung einer Rasierklinge gemaeht, die an die untere Faeette des naeh Abb. l l sehwingenden Messers mit Siegellaek aufgeklebt wurde. Der Versueh zeigte als Beispiel eines Messers mit extrem kleinem Faeettenwinkel, dab bier ein Fliegen des 2~iaterials ithnlieh der Abb. 16 eintritt. Der Kriimmungsradius der Sehneide ist so gering, dab kein Spalt vor dem Messer herl~uft, sondern die Sehneide f6rmlieh umflossen wird. Die Folge ist, dab die Adhgsion an der Sehneide sieh vergrSgert, was trotz den Ultrasehallsehwingamgen zum teilweise Verbaeken und zum Zusammensehieben des Paraffins mit


der Rasierklingenschneide fiihrte. Es lieBen sich daher nur wenig brauchbare Schnitte gewinnen; zumal auch die Schneide selbst zu elastisch war und mehrfach den Schnitt nicht greifen konnte, weil sie nach oben weggedrfickt wurde.

Ein Nachteil der Versuchseinrichtungen (Abb. l l a , b und e) war, dM] der Vorschub des Objektschlittens mit der Hand vorgenommen werden muBte. Da- durch wurde die Schub- geschwindigkeit c s zu sehnell und zu unregel- raSl~ig. ~Veiterhin lieg sich die Dickeneinstel- lung der Sehnitte genau nur um 1 # variieren.

Die Zwischenwerte mul~ten dureh Inter- polation der gegebenen Str iehmarken abge- sehgtzt und eingestellt werden. Zur umfassenden Klgrung der ge- stellten Aufgabe hgtte ferner eine Reihe yon Versuehen ausgefiihrt werden mtissen, die die Verwendung versehiedener Messermateria- lien und untersehied- lieher Facettenwinkel im Zusammenhang mit verschiedenen Messer-

l':Lngen und damit ge- A b b . 22. E l e k t r o n e n b i l d e ines Z e l l f e t z c h e n s e ines R e c t u m ~ koppelt mit entspre* ca rc inoms . U l t r a s c h a l l s c h n i t t . Die g e s a m t e Zel le h a t m a n chenden Sehallfrequen- sich e t w a 2 - - 4 r a m so g r o g zu d e n k e n . Der K~ernis t n i c h t

ge t ro f f en . M a n b e a c h t e die re iche i i b e r m i k r o s k o p i s c h e z e n einerseits und a n - G l i e d e r u n g der S t r u k t u r des P l a s m a s . V = 7400 : 1,

dererseits die gerwen- a t f f g e n o m m e n m i t d e m m a g n e t i s e h e n ESI des A E G - F o r s e h u n g s i n s t i t u t e s (Dr. Kinder) m i t 96 eKV.

dung yon Einbettungs- materialien versehiedener Hgrte, Elastizit'gt usw. einer genauen Prfifung unterzogen h-~tten. Die Beseitigung jener MgngeI und die Ausfiihrung von umfassenden Versuehen, zu denen mir keine Zeit blieb, wird der Anwendung des Ultrasehalhnikrotoms erst die breite Unterlage sehaffen, die es im Hinbliek auf seine Anwendung und Bedeutung ftir die Elek- troneniibermikroskopie verdient. Doeh sind die Anfangserfolge eindeutig und zeigen, dab die MSgliehkeit der Aufnahme yon Gewebe-

Virehows Archly. Bd..:112. 25


schnitten mit dem E~I prinzipiell gel6st ist und fiberlichtmikroskopische AuflSsungen erzielt werden kSnnen, wie die nachstehend gebraehten Aufnahmen es beweisen.

Wie bereits gesagt, stammen die nachstehend gezeigten Aufnahmen alle nur yon einem Objekt, einem in Paraffin eingebetteten Rectum- Carcinom. Das Gewebe war erst mehrere Tage naeh dem Tode des Patienten fixiert und eingebettet worden und war leider auch ziemlich nekrotisch zerfallen. Bei der PrSparation der hauchdiinnen Paraffin- schnitte hatte das besonders nach I-IerauslSsung des Paraffins mit Xylol den grogen Naehteil, daf~ die HSutehen /~uSerst geringe ReiBfestigkeit

hatten und ferner die Kerne aus dem lockeren Plasma- schaum der Zellschicht aus- geschwemmt wurden und so im Eiektronenbild nur teilweise zu sehen waren.

Das vollstitndige Zu- sammenschnurren und das teilweise Ubereinander- schieben der I-Ittut chert wurde so vermieden, dab die kleinen Schnittchen mit HiKe einer dtinnen Pipette

-\bb. 23 Elektroncnl~iht tines freiliegemlcn Zellkcrncs nach Lbsung des Paraffins yore Rectunlc~rcinom. UItraschallschI~itt. Dic ur- in Xylol mit Alkohol-Ather spr ( ing l i ( c G r e n z e des z c r f a l l e n c n K c r n c s i s t d u t c h U m r a n d u n g n a c h g c z c i c h n c t . 3I~tll l )cachto d ie i ibcr- aufgesogen wurden. Her- m i k r o s k o p i s c h e G [ i c d c r u n g des Ph~stnas. V = 6 0 0 0 : 1 ; n a c h ~alrden diese auf ein :~u fgenommen tn i t 4 c m e l e k t r o s t ~ t i s c h e n E M (Maid)

(lcs A E G - F o r s c h u n g s i n s t i t u t s bc i 50 eK.V. dfinnstes Zaponlaekh~ut- ehen, das auf Wasser

sehwamm, aufgetropft. Die Alkohol-)~therlSsung breitet sich nun rasch fiber dem Zaponlackfilm aus, spannt und glSttet den Gewebeschnitt und diffundiert dureh das Hiiutchen in das Wasser hinein. Auf dem Wege durch die Zaponlt~ckschicht erweicht der Ather diese etwas, wodurch die Unterfl/iche des Sehnittes anhaftet und dieser selbst angeklebt wird. ]~in entsprechender Ausschnitt des Lackfilmes wird mit dem Schnitt dann in das EM eingebracht und untersucht. Ein Zusammenschnurren des Schnittes im Vakuum wird so vermieden. Man kann auch so vorgehen, dab man vor dem Schneiden die 0berflSche des Gewebeblockes mit dfinnem Zaponlack bestreicht. Nach dem Trocknen desselben schneider man und 16st alsdann das Paraffin heraus. Das Zaponlackh/~utchen haftet an dem Gewebeschnitt und dient ihm als Halt.

Die Abb. 20 ist eine Elektronenaufnahme yon Ca-cinomzellen eines Mammacarcino~:s. Sie stammt vcn eine-z~ Schnitt, der mit einem ~e- wShnlichen Mikrotom schon hiiher erzielt wurde. ~ie Gewirmung solcher

Die Erzielung tibermikroskopischer Elektronenbilder yon Gewebesehnitten. ~87

ffir das EM brauchbarer Schnitte ist mit dem bisherigen Mikrotom nahezu unm6glich. Die meisten Schnitte erscheinen wegen ihrer Dicke daher dunkel und undurehstrahlbar bei der Betrachtung im E}[. Nur unter Dutzenden bis I tunder ten mtihsam erzeugter Schnitte finder man einen Schnitt, der den zelligen Aufbau so wiedergibt, wie der in Abb. 20 gezeigte. Die Qualitst des Bildes reieht in seiner Aufl6sung etwa an ein liehtoptisehes Mikrogramm heran. Die Uberstrahlung der Konturen, die bis zur Ver- waschung der Einzelheiten geht, deutet an, dag der Schnitt zu dick ffir elektronenoptisehe Zweeke war und daher die in der vorliegenden Arbeit ausftihrlieh besproehenen vom Objekt erzeugten Abbildungsfehler in Erscheinung traten.

Elektronenmikroskopiseh gesehen bringen die Aufnahmen 21, 22 und 23 yon Ultrasehnitten einen wesentliehen Fortsehritt, obgleieh sic fiir den Histologen noeh wenig auszusagen haben.

Die Abb. 2I ist die 4400faehe Wiedergabe yon nekrotiseh sehr zer- fi~Ilenen Reetum-Ca-Zellen, deren Grenzen als unregelmiigige dunkIe Ritnder mit Doppelkonturen zu sehen sind. Im elektronenoptisehen Sinne beaehtIieh ist der in der Mitte liegende Kern, der eine fiber- mikroskopisehe Gliederung aufweist, die man wahrseheinlieh als Zerfalls- s t rukturen zu deuten hat.

Wesentlieh besser ist die Aufnahme eines Zellfetzehens Abb. 22. Dieses keilf6rmige Sttiek einer Nirebszelle, die man sieh bei der 7400fachen Vergr613erung etwa 2real so grog wie den gczeigten Teil vorzustellen hat, liegt auf einer Zaponlaekfolie, deren Rand man an der breiten SeRe des Keils sehen kann, wie man an der Spitze des Zellstfiekes eine Fal tung der Laekfolie beobaehten kann. - - An der Breitseite des Fragmen- tes ist dieses wesentlieh heller, also aueh dtinner, als an seiner Spitze, und man kann eine tiberaus vielfSltige, weit fiber die liehtmikroskopisehe Auf- 16sung reiehende Feinstruktur des Plasma beobaehten, welches eine regel- reehte Unterteilung und Gliederung erfahren hat. Es ist in feinste, zellartige Gebilde racist spindelf6rmiger Gestalt aufgeteilt, in deren ) l i t te sieh ein diehteres, kompaktes Zentrum yon oft vieleckiger Gestalt befindet. Da das ganze Zellfetzehen gegen seine breite SeRe hin gestaueht erscheint, ist die genaue Gestalt jener Zellfiguren nur ungenau zu beschreiben.

Besonders seharf und reich gegliedert ist das Elektronenbild Abb. 23, das mutmaglieh das gild eines Kernbruehstiiekes ist. Die urspriinglieh ovale Form wurde dutch Umrandung des Brides nachgezeiehnet. Man

s i eh t beim Verlgeich mit der Helligkeit des tragenden Zaponlackfilmes, der einen quer fiber das gild verlaufenden Rig zeigt, dab die Strukturea des Kierneiweiges zum Tell ebenso hell und scharf zu sehen sind wie aueh die kompakteren Gebilde noeh durehstrahlbar sind und Innenstrukturen aufweisen. Gerade die Abb. 23 ist geeignet, die augerordentliehe D~inne der Ultraschallschnitte aufzuzeigen.

25*


Wie schon eingangs gesagt, sollen die wenigen hier gezeigten Elek- tronenbilder keineswegs histologische Ergebnisse und Schliisse hervor- kehren. Die Kiirze der Verftigung stehenden Versuchszeit und die un- glfickliche Wahl des 0bjektes verbieten das gSnzlich. Ich glaube jedoch mit diesen Aufn,~hmen den Beweis erbracht zu haben, dal~ es grund- shtzlich m6glich ist, mit dem Ultraschallmikrotom genfigend diinne, durchstrahlbare Schnitte fiir das Elektronenfibermikroskop herzustellen. ])as w~r Sinn und Aufg~be der vorliegenden Arbeit. Bei intensiver

A b b . 24. E l e k t r m m n b i l d t ier Oberf l~ iche d e r B a u c h h ~ u t e i n e a M c n s c h e n . G e w o n n e n n a e h t i e r A b z u g s m e t h o d e . V = 2000 : 1 ,50 e K V . ( A u f n a h m e e l e k t r o s t a t i s c h y o n D r . Mahl.)

Weiterarbeit kann der Erfolg t~uch in histologischer ttinsicht nicht a us- bleiben.

Die letzten beiden Elektronenbilder Abb. 25 und 26 sind nach dem Abdruckverfahren yon Mahl in Zusammenarbeit mit diesem entstanden. Sie erbringen den Beweis, dal~ ,~uch dieses Verfahren sich erfolg- versprechend fiir die Gewebeuntersuchung einsetzen ]itl~t.

Eine weitgehende Bedeutung des Abzugsverfahrens ffir die Diagnostik k6nnte ich mir sowohl ffir die iibermikroskopische Betrachtung der Ober- fl'~ehe der Haut als auch fiir diejenige der BlutkSrperchen denken. Es ist bekannt und liegt beinahe bewuBt oder unbex~ul]t j eder Diagnose am Krankenbet t zugrunde, dub die Haut VerSnderungen bei der Er- krankung des KSrpers unterliegt, die ihr schon visuell bestimmte Eigen- schaften im nmkroskopischen Sinn verleihen. Es w~ire denkbar und scheint gewil~, dal~ auch fibermikroskopisch das Elektronenbild der Haut- oberfl~,che fiir die betreffende Krankheit charakteristische Vergnderungen aufweist, die zur Differentialdiagnose heranzuziehen wSren. Noch direkter gilt das wahrscheinlich ftir die 0berfl'~che der BlutkSrperchen,


ekbb. 25. E l e k t t ' o n e n a b z n g s b i l t [ dot' ()bergli~ehe y o n tt'n/ixierleu E r y t h r ~ J c y t e n . B l u t ~ u s s t r i c h . V = 2000 : 1; ~ u f g o n o m m e a m i t d e m e l e k t r o s t a t i s e h e n E M (~Uahl) des A E ( { - F o r s e h u n g s -

i n s t i t u t s be t 50 e l ( V .

A b b . 215. E l e k t r o n e n a b z u g s b i l d d e r Ober f lg .che y o n /ixivrfcn E r y t h r o e y t e n . B l u t a u s s t r i e h . F i x a t i o n m i t A ] k o h o l - E s s i g s h u r e . D a u e r 1 M i n u t e . Dt~ten wie be t 25. M a n b e a c h t e d ie s t a r k e V e r g n d e r u n g d e r Oberf l i~ehe t ier r o t e n B l u t k O r p e r c h e n d u r e h die n u t k u r z d a u e r n d e F i x a t i o n . D i e s c Ve r{~nde rung d e r S t r u k t u r d e r Ober f l f i , dm l{tlat s i e h i m L i c h t m i k r o s k o p

n a t u r g e m h B n i e h t d a r s t e l l e n .

die im Strom der pa~hologisch vergnderten Sgfte sieherlieh auch Ver- gnderungen erfghrt, die sich dutch die Technik des Abdruckverfahrens von Mahl f ibermikroskopisch sichtbar maehen lassen*.

* Herrn Prof. Hinsberg danke ich for besonders wertvolle ~atsehlgge bet der Gewinnung der Abzugsbilder.


V e r s u c h e zur K o m b i n a t i o n des A b d r u c k v e r f a h r e n s n~ch M a h l u n d des U l t r a s c h a l l m i k r o t o m s , wie sie im t h e o r e t i s c h e n Tel l e rwi thn t ~mrden , k o n n t e n ~us Z e i t m a n g e l n i ch t ausge f t ih r t we rden . E i n t e c h n i s c h e s P r o b l e m s te l len diese Ve r suche j e d o c h ke ineswegs dar .

Z u s a m m e n f a s s u n g .

:Die v o r s t e h e n d e n t h e o r e t i s c h e n E r 6 r t e r u n g e n der O b j e k t b e e i n f l u s s u n g d e r a b b i l d e n d e n E l e k t r o n e n s t r a h l e n ira E l e k t r o n e n f i b e r m i k r o s k o p u n d de r be in l S c h n e i d e n m i t d e m M i k r o t o m bzw. d e m U l t r a s c h a l l m i k r o t o m a u f t r e t e n d e n Kr i t f t e geben uns e inen U b e r b l i c k i iber die GrOBe der w i c h t i g s t e n F a k t o r e n .

:Es wurde fe rner n a c h ebenso e i n g e h e n d e r t h e o r e t i s c h e r B e t r a c h t u n g des S c h n e i d e v o r g a n g e s du rch Ve r suche geze ig t , dab es m S g l i c h ist , g le ichmi tBige S c h n i t t e e iner wesen t l i ch gev ingeren D icke als l 0 -3 rnm m i t d e m U l t r a s c h a l l m i k r o t o m he rzus t e l l en u n d u n t e r B e n u t z u n g dieses m i t H i l f e a n d e r e r Ver fahren , wie d e m D a c h s c h n i t t v e r f a h r e n des Ver fasse r s u n d d e m Ober f l ' Schenabdruckvevfah ren n a c h M a h l , g u t e G e w e b e b i l d e v y o n S c h n i t t e n m i t d e m L 'be rmi l ( roskop zu gewinnen .

I )a t t l i t w~iren W e g e gewiesen zu einev evfo lgre ichen G e w e b e u n t e r - s u c h u n g mi t d e m E l e k t r o n e n i i b e r m i k v o s k o p u n d das Tot" geOffnet , we lches b i shev besonders de r Mediz in die E r k e n n t n i s dev f e ins t en u n d l e t z t e n Z u s a m m e n h i t n g e zwischen Ze l lbau u n d Ze l l funk t ion , zwischen d e r des t ru - i e r e n d e n W i r k u n g des , , P a t h o g e n s " im F e i n s t b a u der Zel le u n d d e m , , P a t h o s " als k l in i scher E r s c h e i n u n g v e r s p e r r t e !

Schr i f t tmn .

i Krause, F.." Naturwiss. 1938, }t. 8, 122. - - 2 Kausche, G . A . u . H . Ruska: Biochem. Z. 303, 221--230 (1939). - - a Beischer, D. u. F. Krause: ~Naturwiss. 1938, H. 8, 825. - - Z, angew. Chem. 51, 331 (i938). - - ~ Husemann, E. u. H..R~tska: J. prakt. Chem. 156, It. 1--3 (1940). __ s Matron, L.: (a) Bull. Aead. roy. Belg. 20, 439 (1934). - - (b) Bull. Acad. roy. Belg. 21, 553 (1935). - - (e) Bull. Acad. roy. Belg. 22, 1336 (1936). - - ~ Driest, E. u. H. Mitller: Z. Mikrosk. 52, 53 (1935). - - 7 Krau2e, F . : Z. Physik 102, It. 5 u. 6 (1936). - - s Krause, F . : Elektrotechn. Z. 59, 851 (1938). - - Elektrotechn. Z. 59, 1170 (1938). - - 9 Krause, F . : (a) Natur- wiss. 1937, K. 51, 817. - - (b) Im Buch: Beitrige zur Elektronenoptik yon H. Busch und E. BriOche. Leipzig: Johann Ambrosius Barth 1937. - - (c) Z. I~adiologica 3, 122--145 (1938). - - (d) Umsch. 42. 769 (1938). - - (e) Arch. exper. Zelfforsch. 22, 668 (1939). - - i0 Piekarski, G. u. H. R~tska: Klin. Wschr. 1989 I, 383--386. - - li Fr~hbrodt, E. u. H. Ruska: Arch. Mikrobiol. l l , 137--154 (19~0). - - Lembke, A . u. H. Ruska: Klin. Wschr. 1940 I, 217--220. - - Ruska, H. u. C. Wolpers: Kiln. Wschr. 1940I, 695. - - Jakob, A . : Klin. Wschr. 19411, 719/720. - - Emmel, L., F. GSlz u. A. Jakob: Dtsch. Tropenmed. Z. 46, 573 (1942). - -

Die Erzielung iibermikroskopiseher Elektronenbilder yon Gewebesehnitten. 391

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Die Erzielung übermikroskopischer Elektronenbilder von Gewebeschnitten