Die L1-Familie neuraler Zellerkennungsmoleküle: …oops.uni-oldenburg.de/171/1/dirl1f03.pdf · sap97 und sap90/psd95 aus hirnlysaten der maus 67 abb. 18 gegenÜberstellung der cdna-sequenzen

Die L1-Familie neuraler Zellerkennungsmoleküle: Postnatale Expressionsmuster und die Identifizierung

cytoplasmatischer Interaktionspartner

Von der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften

der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg

zur Erlangung eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

angenommene Dissertation

Petra Dirks

geboren am 14. Januar 1968

in Wilhelmshaven

Oldenburg 2003

http://docserver.bis.uni-oldenburg.de/publikationen/dissertation/2004/dirl1f03/dirl1f03.html

Referent: Apl. Prof. Dr. Ulrike Janssen-Bienhold Koreferent: PD Dr. Dirk Montag Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2003

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 1

1.1 Die Entwicklung des zentralen Nervensystems 1 1.1.1 Allgemeine Prinzipien 1 1.1.2 Steuerung des Entwicklungsprozesses - Einflussnahme epigenetischer Faktoren 1 1.1.3 Die Bedeutung der Zelladhäsion für den Aufbau neuronaler Strukturen 2

1.2 Die Einteilung von Zellerkennungsmolekülen anhand ihrer Proteinstruktur 3 1.2.1 Zellerkennungsmoleküle der ECM 3 1.2.2 Integrine 4 1.2.3 Cadherine 4 1.2.4 Zellerkennungsmoleküle der Immunglobulin-Superfamilie (IgCAMs) 4

1.3 N-CAM: Der Prototyp neuronaler IgCAMs 5

1.4 Die L1-Familie 6 1.4.1 Die funktionelle Bedeutung der L1-Familie 7 1.4.2 Alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikationen 8 1.4.3 Expressionsmuster der L1-Familienmitglieder 9 1.4.4 Extrazelluläre und intrazelluläre Liganden 10 1.4.5 Gen-Targeting: Ein modernes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung von L1-Familienmitgliedern 12

1.5 Fragestellung 13

2 MATERIAL UND METHODEN 15

2.1 Chemikalien 15

2.2 Kulturmedien und Zusätze 15

2.3 Lösungen 15

2.4 Kits und Enzyme für molekularbiologische Arbeiten 16

2.5 Vektoren 16

2.6 Antikörper 16

2.7 Allgemeine molekularbiologische Techniken 17

2.7.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) 17 2.7.2 Agarose-Gelelektrophorese und Elution von DNA-Fragmenten 17 2.7.3 Ligation von DNA-Fragmenten in entsprechende Plasmid- bzw. Expressionsvektoren 17 2.7.4 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien und Transformation 18 2.7.5 Herstellung elektrokompetenter Bakterien und Elektroporation 18 2.7.6 DNA – Präparationen (Mini-, Maxipräparationen) 19 2.7.7 Sequenzierung und Sequenzanalyse 19 2.7.8 Screen einer cDNA-Bank (Maushirn, adult) 20

2.8 Expressionstudie mittels in situ Hybridisierung (ISH) 20 2.8.1 Klonierung der Neurofascin, NrCAM und GFAP cDNA 20 2.8.2 Herstellung Digoxigenin- und Fluorescein-markierter RNA-Sonden 21 2.8.3 Versuchstiere 21 2.8.4 Präparation von Hirnschnitten 21 2.8.5 konventionelle ISH: Alkalische Phosphatase (AP)-Färbung 22 2.8.6 Fluoreszenz ISH (FISH) 23

2.9 Protein-Protein Interaktionsstudien 23 2.9.1 Hefe-Zwei-Hybrid System 24

2.9.1.1 Klonierung von bait - und prey - Konstrukten 24 2.9.1.2 Herstellung chemisch kompetenter Hefen und Transformation 24 2.9.1.3 Herstellung elektrokompetenter Hefen und Elektroporation 25 2.9.1.4 Mating 25 2.9.1.5 Plasmidpräparationen aus der Hefe 26 2.9.1.6 Identifizierung positiver Protein-Protein Interaktionen 26

2.9.2 Zellkultur 27 2.9.2.1 Materialien für die Zellkultur 27 2.9.2.2 Klonierung von Expressionskonstrukten 27 2.9.2.3 Kultivierung von COS-7 Zelllinien 28 2.9.2.4 Transiente Transfektion 28

2.10 Immuncytochemie 28

2.11 Mikroskopie 29

2.12 Proteinbiochemische Methoden 29 2.12.1 Präzipitationsassay 29 2.12.2 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 30 2.12.3 Western-Blotting und Immundetektion 30

2.12.4 Strippen eines Western-Blots 31

2.13 Klonierung eines Neurofascin Targeting-Konstrukts 31 2.13.1 Screen einer genomischen Bank 31

2.13.1.1 Design einer cDNA-Sonde 31 2.13.1.2 Vermehrung der Lambda-Phagen 32 2.13.1.3 Identifizeriung positiver Plaques mittels Hybridiserung 32 2.13.1.4 Anfertigen von Plattenlysaten und Isolierung der Lambda-Phagen DNA 33

2.14 Southern-Blotting 33

3 ERGEBNISSE 35

3.1 Screen einer cDNA-Bank 35 3.1.1 Isolierung von NrCAM und Neurofascin full-length Klonen 35

3.1.1.1 NrCAM: cDNA-Sequenz und Spleißvarianten 35 3.1.1.2 Neurofascin: cDNA-Sequenz und Spleißvarianten 37

3.2 Vergleich der entwicklungsabhängigen mRNA-Expression der L1-Familienmitglieder mittels in situ Hybridisierung 39

3.2.1 Konventionelle ISH - alkalische Phosphatase Färbung 39 3.2.1.1 L1 39 3.2.1.2 CHL1 41 3.2.1.3 NrCAM 42 3.2.1.4 Neurofascin 43

3.2.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 46 3.2.2.1 Bulbus olfactorius 47 3.2.2.2 Hippocampus 49 3.2.2.3 Cerebellum 51

3.3 Interaktionsstudien 54 3.3.1 Besitzt NrCAM ein funktionelles PDZ-Bindungsmotiv? 54

3.3.1.1 Interaktionen zwischen dem Carboxyterminus von NrCAM und PDZ- Domänen membranassoziierter Proteine in der Hefe 55 3.3.1.2 Expression von NrCAM und SAP97 in COS-7 Zellen 57

3.3.1.2.1 Einfluss von NrCAM auf die subzelluläre Verteilung von SAP97 in COS-7 Zellen 57 3.3.1.2.2 NrCAM induziertes Clustering von SAP97 entlang der Zellmembran von COS-7 Zellen 59

3.3.1.3 Proteinbiochemischer Nachweis einer Interaktion zwischen PDZ-Domänen

von SAP97 und dem funktionellen PDZ-Bindungsmotiv von NrCAM 62 3.3.1.3.1 Präzipitation von SAP97 aus COS-Zelllysaten 62 3.3.1.3.2 Präzipitation von SAP97 und SAP90/PSD95 aus Hirnlysaten 65

3.3.2 Identifizierung putativer CHL1 Interaktionspartner 67 3.3.2.1 Hefe-Zwei-Hybrid Screen 67 3.3.2.2 Interaktionen zwischen CHL1-23 und den cytoplasmatischen Domänen weiterer L1-Familienmitglieder in der Hefe 70 3.3.2.3 CHL1-23 mRNA-Expression im adulten Maushirn 71

3.4 Gen-Targeting 72 3.4.1 Klonierung eines Neurofascin Targeting-Konstrukts 72

3.4.1.1 Screen einer genomischen Bank und Kartierung des Neurofascin-Gens 72 3.4.1.2 Targeting-Strategie 74

3.4.2 Nachweis der homologen sowie der Cre-vermittelten Rekombination 76

4 DISKUSSION 80

4.1 Beschreibung von Neurofascin und NrCAM cDNA-Sequenzen der Maus 80

4.2 Vergleich postnataler Expressionsmuster einzelner Mitglieder der L1-Familie 82 4.2.1 Die Mitglieder der L1-Familie zeigen charakteristische Expressionsmuster in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium untersuchter Zellpopulationen 82 4.2.2 Der Vergleich zeitlich regulierter und regionenspezifischer Expressionsmuster lässt auf eine funktionelle Spezialisierung einzelner L1-Familienmitglieder schließen 84 4.2.3 Die Expression von L1-Familienmitgliedern in Gliazellen steht im engen Zusammenhang zur aktiven Myelinisierung und Zellmigration 87

4.3 Interaktionsstudien 89 4.3.1 NrCAM besitzt ein funktionelles PDZ-Bindungsmotiv und zeigt spezifische Interaktionen mit den MAGUKs SAP90/PSD95 und SAP97 89

4.3.1.1 NrCAM beeinflusst die subzelluläre Verteilung von SAP97 in COS-7 Zellen 91 4.3.2 Isolierung eines putativen CHL1 Interaktionspartners unter Anwendung der Hefe-Zwei-Hybrid Technik 94

4.4 Gen-Targeting 96 4.4.1 Klonierung eines Neurofascin Targeting-Konstrukts 96

4.5 Schlussfolgerung und Ausblick 97

5 ZUSAMMENFASSUNG 99

6 VERÖFFENTLICHUNGEN 102

7 ANHANG I

Abbildungsverzeichnis

ABB. 1 STRUKTURELLER BAUPLAN DER L1-FAMILIENMITGLIEDER 7

ABB. 2: ÜBERSICHT VON NRCAM-ISOFORMEN 37

ABB. 3: ÜBERSICHT VON NEUROFASCIN-ISOFORMEN 38

ABB. 4 REGIONENSPEZIFISCHE EXPRESSION DER L1-FAMILIENMITGLIEDER IM ZNS DER MAUS

40

ABB. 5: ENTWICKLUNGSABHÄNGIGE EXPRESSIONSMUSTER EINZELNER L1-

FAMILIENMITGLIEDER IM HIPPOKAMPUS UND CEREBELLUM 44

ABB. 6: DOPPEL-FISH – VERGLEICH DER EXPRESSION VON L1, CHL1 UND NRCAM IM BULBUS

OLFACTORIUS 48

ABB. 7: DOPPEL-FISH – VERGLEICH DER EXPRESSION VON L1, CHL1 UND NRCAM IM

HIPPOCAMPUS 50

ABB. 8: DOPPEL-FISH – VERGLEICH DER EXPRESSION VON L1, CHL1, NRCAM UND

NEUROFASCIN IM CEREBELLUM 52

ABB. 9: DOPPEL-FISH – EXPRESSION VON NEUROFASCIN UND NRCAM IN GLIAZELLEN 53

ABB. 10: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER IN EXPRESSIONSSTUDIEN GENUTZTEN NRCAM-

UND SAP97-KONSTRUKTE 57

ABB. 11: NRCAM-FLAG TRANSFIZIERTE COS-7 ZELLEN EXPRIMIEREN EIN FUNKTIONELLES

MEMBRANPROTEIN 58

ABB. 12: NRCAM-FLAG NIMMT EINFLUSS AUF DIE SUBZELLULÄRE VERTEILUNG DES GFP-

SAP97 FUSIONSPROTEINS IN COS-7 ZELLEN 59

ABB. 13: NRCAM-FLAG INDUZIERTES CLUSTERING VON GFP-SAP97 ENTLANG DER

ZELLMEMBRAN VON COS-7 61

ABB. 14: PRÄZIPITATION VON GFP-SAP97 AUS COS-7 ZELLLYSATEN 63

ABB. 15: DER C-TERMINUS VON NRCAM ZEIGT EINE HOHE AFFINITÄT ZU REKOMBINANT UND

ENDOGEN EXPRIMIERTEM SAP97 – PRÄZIPITATIONEN SETZEN EIN FUNKTIONELLES PDZ-

BINDUNGSMOTIV VORAUS 64

ABB. 16: PRÄZIPITATION VON SAP97-DELETIONSPROTEINEN AUS COS-7 ZELLLYSATEN 65

ABB. 17: DER C-TERMINUS VON NRCAM VERMITTELT EINE SPEZIFISCHE PRÄZIPITATION VON

SAP97 UND SAP90/PSD95 AUS HIRNLYSATEN DER MAUS 67

ABB. 18 GEGENÜBERSTELLUNG DER CDNA-SEQUENZEN VON AK056967, CHL1-23, AK076826

UND DTNBP1 69

ABB. 19: VERTEILUNG VON CHL1-23 TRANSKRIPTEN IM ADULTEN MAUSHIRN 71

ABB. 20: SOUTHERN-BLOT ANALYSE DER IM BANKENSCREEN ISOLIERTEN GENOMISCHEN

KLONE 7A UND 9A 73

ABB. 21: KARTIERUNG DES NEUROFASCIN-GENS 74

ABB. 22: SOUTHERN-BLOT ANALYSE GENOMISCHER DNA-FRAGMENTE 75

ABB. 23: ÜBERSICHT VERSCHIEDENER REKOMBINATIONSEREIGNISSE WÄHREND DES ES-ZELL-

TARGETINGS 77

ABB. 24: FUNKTIONALITÄT DES PCR-NACHWEISES ZUR BESTIMMUNG DER HOMOLOGEN UND

CRE-VERMITTELTEN REKOMBINATION WÄHREND DES NEUROFASCIN-GEN-TARGETINGS

79

ABB. 25: SEQUENTIELLE EXPRESSION VON L1-FAMILIENNMITGLIEDERN IN ABHÄNGIGKEIT

VOM ENTWICKLUNGSSTADIUM NEURONALER ZELLEN 86

ABB. 26 SUBZELLULÄRES TARGETING DER MAGUKS SAP97/SAP90 IN NEURONALEN ZELLEN 92

Tabellenverzeichnis TAB. 1 VERTEILUNG VON TRANSKRIPTEN DER L1-FAMILIENMITGLIEDER IN VERSCHIEDENEN

REGIONEN DES ZNS................................................................................................................................ 46

TAB. 2: INTERAKTIONEN ZWISCHEN DER CYTOPLASMATISCHEN DOMÄNE VON

ZELLERKENNUNGSMOLEKÜLEN DER L1-FAMILIE UND PDZ-DOMÄNEN VON PROSAP2, ZO-

1, SAP90 UND SAP97 IM HEFE-ZWEI-HYBRID SYSTEM................................................................... 56

TAB. 3: INTERAKTIONEN ZWISCHEN CHL1-23 UND MITGLIEDERN DER L1-FAMILIE IM HEFE-

ZWEI-HYBRID SYSTEM.......................................................................................................................... 70

TAB. 4: PCR-NACHWEIS DER VERSCHIEDENEN REKOMBINATIONSEREIGNISSE WÄHREND DES

NEUROFASCIN-GEN-TARGETINGS. ...................................................................................................... 78

Abkürzungen AS Aminosäuren BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-indolylphosphat, BDNF brain derived neurotrophic factor BG Bergmann-Glia BSA Bovine Serum Albumine CA1/CA3 Regionen des Ammonshorn, Hippokampus CALL Cell adhesion L1 like CHL1 Close homologue of L1 CRASH corpus callosum hypohypoplasia,retardation,adducted thumbs,

spastic paraplegia und hydrocephalus CSPG Chondroitinsulfatproteoglykane DEPC Diethylpyrokarbonat DG Gyrus dentatus DGC Dystrophin-Glykoprotein Komplexe DLG Discs-large DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonukleinsäure DTNBP1 Dystrobrevin Binding Proteins 1 DTT Dithiothreitol ECM extrazelluläre Matrix EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGL externe Körnerzellschicht EGTA Ethylenglykoltetraessigsäure EPL äußere plexiforme Schicht F Fimbria FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung FKS Fötales Kälberserum FN-III Repeat Fibronektin-Wiederholungseinheit des Typs III GC Golgi-Zellen GFAP Glial fibrillary acidic protein GFP Green fluorescent protein GL Körnerzellschicht GO Glomeruläre Schicht GPI Glykosylphosphatidylinositol HBSS Hank´s Balanced Salt Solution

HF hippokampale Fissur HI Hilus HNK-1 human natural killer-1 hn-RNA heteronukleäre Ribonukleinsäure HRP Horse radish peroxidase, Meerettichperoxidase Ig Immunglobulin IgCAM Zellerkennungsmoleküle der Immunglobulin-Superfamilie IGL interne Körnerzellschicht ISH in situ Hybridisierung kB Kilobasenpaar kDA Kilodalton LB Luria-Bertani LTP Langzeitpotenzierung MAG myelinassoziiertes Glykoprotein MAGUK membranassoziierte Guanylatkinase MBP Myelin basic protein MCL Mitralzellschicht ML Molekularschicht NBT 4-Nitroblue Tetrazoliumchlorid Neo Neomycin NF Neurofascin NGF nerve growth factor OB Bulbus olfactorius OL Oligodendrozyten PAT Prolin, Alanin und Threonin PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PCL Purkinjezellschicht PCR Polymerasekettenreaktion PDZ PSD95/SAP90, Dlg und ZO-1 PSA Polysialinsäure PSD postsynaptische Dichte PVP Polyvinyl-Pyrrolidone RNA Ribonukleinsäure rpm rounds per minute SAP synapsenassoziiertes Protein SB Subikulum SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SO Stratum oriens

SR Stratum radiatum TBS Tris-gepufferte Salzlösung THS Two-Hybrid System TK Thymidinkinase Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan WM weiße Substanz ZNS zentralen Nervensystems ZO-1 Zonula occludens-1

1

1 Einleitung

1.1 Die Entwicklung des zentralen Nervensystems

1.1.1 Allgemeine Prinzipien

Die Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS) umfasst einen komplexen Prozess, dessen Mechanismen bis heute nur unvollständig geklärt sind und im Mittelpunkt weitreichender Forschungsarbeiten stehen. Bis zur Ausreifung eines funktionellen Gewebeverbandes müssen verschiedene Phasen der Neurogenese durchlaufen werden. Bereits während der frühen Embryonalentwicklung kommt es zur Ausbildung einer proliferierenden Zellmatrix (Neuralplatte), welche die Bereitstellung neuronaler Vorläuferzellen (Neuroblasten) gewährleistet. Kennzeichnend für den weiteren Aufbau neuraler Strukturen ist die Migration von Neuroblasten bzw. postmitotischen Neuronen vom Ort ihrer Entstehung zu den für sie vorgesehenen Zielgebieten (Übersichtsartikel: Hatten 1999). Anschließende Differenzierungsprozesse bedingen letztendlich die individuelle zelluläre und molekulare Identität neuronaler Zellen. Nervenzellen entsenden Axone, welche ihre präsynaptischen Endigungen in den vorgesehenen Zielregionen verzweigen. Dendritenbäume stellen die Verbindung zu afferenten Eingängen her. Der Aufbau synaptischer Kontakte bestimmt die Integrität einzelner Neurone innerhalb des Zellverbandes. Verbindungen werden hierbei zunächst unter der Beteiligung überschüssiger Synapsen und Neurone hergestellt. Aktivitätsmuster entscheiden über die Stabilisierung bzw. Eliminierung synaptischer Verbindungen. Der aktivitätsabhängige Um- und Abbau synaptischer Verschaltungen führt schließlich zur Etablierung funktioneller neuronaler Netze. Überflüssige Neurone leiten die Apoptose ein. Die Modulation synaptischer Kontakte kann bis in das adulte Stadium beobachtet werden. Mechanismen der synaptischen Plastizität bilden die Grundlage für Lernen und Gedächtnis und können als andauernde Form neuronaler Differenzierung angesehen werden (Haydon & Drapeau 1995; Lagercrantz & Ringstedt 2001).

1.1.2 Steuerung des Entwicklungsprozesses - Einflussnahme epigenetischer

Faktoren

Die korrekte Ausdifferenzierung des zentralen Nervensystems beinhaltet das exakt aufeinander abgestimmte Ineinandergreifen vielfältiger Faktoren und Mechanismen. Während bei Vertebraten der genetische Code die allgemeine Entwicklungsrichtung von Neuronen vorgibt, werden Migration und Differenzierungsprozesse, welche letztendlich die funktionelle Bedeutung sowie den morphologischen Aufbau einzelner Zellen bedingen, maßgeblich durch Komponenten des extrazellulären Milieus bestimmt. Die Wanderung von Neuronen zu ihren

Einleitung

2

Funktionsorten sowie das gezielte Auswachsen von Dendriten und axonalen Fortsätzen erfordert eine präzise Navigationsleistung der Zelle, welche durch Interaktionen mit unterschiedlichsten molekularen Positionsmarkern gelenkt wird. Neurotrophe Faktoren wie NGF (nerve growth factor) oder BDNF (brain derived neurotrophic factor) werden in Zielgebieten synthetisiert und sezerniert. Als diffusible Moleküle werden sie über den Aufbau von Konzentrationsgradienten wirksam. Neben chemotaktischen Signalen übernehmen eine Reihe lokaler Wechselwirkungen zwischen Neuronen, Neuronen und Gliazellen, sowie Neuronen und extrazellulärer Matrix (ECM) eine große Bedeutung bei der Ausbildung neuronaler Strukturen und Schaltkreise (Übersichtsartikel: Sobeih & Corfas 2002).

1.1.3 Die Bedeutung der Zelladhäsion für den Aufbau neuronaler Strukturen

Bereits vor knapp einhundert Jahren warfen einfache Experimente in der Kulturschale die Frage nach Rezeptoren an der Zelloberfläche auf, welche die Aggregatbildung identischer Zelltypen vermitteln (Wilson 1907). Bestätigt wurde diese Hypothese anhand dissoziierter Vertebratenzellen aus Embryonalgeweben verschiedenen Ursprungs. Ein Durchmischen dieser Zellen in vitro führte zur Reaggregation einzelner Zelltypen des selben Herkunftsgewebes (Townes 1955). Eine exakt aufeinander abgestimmte Zelladhäsion bildet auch die Grundlage für die Ausbildung funktioneller Hirnstrukturen. Neurone wie auch Gliazellen bedienen sich eines weiten Spektrums an Zelladhäsionsmolekülen. Der Einsatz unterschiedlichster Molekülkombinationen schafft ein großes Repertoire an Oberflächeneigenschaften und ermöglicht die subtile und komplexe Wegwahl neuronaler Zellen während der Migration und des Neuritenwachstums. Haben neuronale Zellen ihre finale Position erreicht, unterstützen Adhäsionsmoleküle Zellerkennungsprozesse und die Stabilisierung festgelegter Zell-Zell Kontakte. Im adulten Stadium wird neben der Aufrechterhaltung eines intakten Gewebeverbandes eine Beteiligung dieser Proteine an Mechanismen der synaptischen Plastizität einhergehend mit Lern- und Gedächtnisprozessen postuliert (Luthl et al 1994; Pradel et al 2000). Die funktionelle Bedeutung neuronaler Zelladhäsionsmoleküle beinhaltet allerdings weit mehr als das bloße “Aneinanderhaften” komplementärer Zellen. So kann die Expression dieser Proteine durchaus den gegenteiligen Effekt bewirken und als repulsives Signal die Abstoßung angrenzender Zellen vermitteln (Dorries et al 1996; Gotz et al 1996; Pesheva et al 1993). Zelladhäsionsmoleküle stellen den Informationsausstausch zwischen extra- und intrazellulärem Milieu her. Über die Induktion von second messenger Systemen leiten sie Signale in das Zellinnere weiter, was beispielsweise in der Neuorganisation des Cytoskeletts oder einer veränderten Genexpression endet (Crossin & Krushel 2000; Suter et al 1998). Da ein Molekül je nach vorliegenden Bedingungen und Anforderungen sowohl adhäsive als auch repulsive Eigenschaften haben kann, ist die Bezeichnung Zelladhäsionsmolekül durch Zellerkennungsmolekül zu ersetzen.

Einleitung

3

1.2 Die Einteilung von Zellerkennungsmolekülen anhand ihrer Proteinstruktur

Inhibitionsstudien unter dem Einsatz von Antikörpern führten zur Identifizierung unterschiedlichster Zellerkennungsmoleküle. Anhand struktureller Merkmale kann eine Einteilung dieser Proteine in verschiedene Genfamilien vorgenommen werden. Die Vielfalt neuronaler Zellerkennungsmoleküle hat ihren Ursprung in nur einer limitierten Anzahl von Genfamilien. Proteine der ECM werden hierbei von Membranproteinen (Integrine, Cadherine und Proteinen der Immunglobulin-Superfamilie) unterschieden. Da die vorliegende Arbeit sich mit Mitgliedern der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie auseinandersetzt, werden Struktur und Funktionen dieser Proteine detailiert dargestellt.

1.2.1 Zellerkennungsmoleküle der ECM

Moleküle der ECM werden von den ihr eingelagerten Zellen sezerniert und bilden ein komplexes Geflecht aus Proteinen und Polysacchariden. Neben Strukturproteinen wie Kollagen und Elastin sind Moleküle wie Laminine, Fibronektin, Reelin, Chondroitinsulfatproteoglykane (CSPG, z.B. Neurocan, Phosphacan, Versican oder Brevican) und Mitglieder der Tenascin-Familie in der ECM neuronaler Gewebe zu finden. Die Aneinanderreihung multipler Untereinheiten bildet die Grundlage ihrer molekularen Struktur. Während Laminin einen Komplex aus drei asymmetrisch angeordneten Polypeptidketten darstellt, bildet Fibronektin Dimere und Tenascin-C Hexamere aus (Übersichtsartikel: Colognato & Yurchenco 2000; Jones & Jones 2000; Margolis & Margolis 1997; Novak & Kaye 2000). Einzelne Untereinheiten dieser Glykoproteine setzen sich aus weiteren Domänen unterschiedlichster Funktion und Bindungseigenschaften zusammen. Die Proteindomänen ihrerseits bestehen aus kleineren Modulen, wobei der Fibronektin-Wiederholungseinheit des Typs III (FN-III repeat) und der darin lokalisierten RGD-Sequenz eine besondere Bedeutung bei der Integrin-vermittelten Zelladhäsion zugesprochen wird (Ruoslahti & Pierschbacher 1987). Zellerkennungsmoleküle der ECM unterstützen die Migration, das Neuritenwachstum und Faszikulierungsprozesse sowie die Synaptogenese neuronaler Zellen (Soussand et al 2001; Xiao et al 1998). Im adulten Tier sind Tenascine an synaptischer Plastizität einhergehend mit Lern- und Gedächtnisprozessen beteiligt (Evers et al 2002; Montag-Sallaz & Montag 2003; Strekalova et al 2002). Neben adhäsiven Eigenschaften wird insbesondere Laminin-1, CSPGs und Mitgliedern der Tenascin-Familie ein repulsiver Charakter zugeschrieben (Becker et al 2003; Dorries et al 1996; Lom & Hockberger 1997; Sango et al 2003; Scholze et al 1996).

Einleitung

4

1.2.2 Integrine

Mitglieder der Integrin-Superfamilie sind heterodimere Glykoproteine zusammengesetzt aus zwei nicht kovalent gebundenen Untereinheiten (α und β), welche die Zellmembran einfach durchspannen. Extrazellulär gehen Integrine Ca2+-abhängige Interaktionen vornehmlich mit Zellerkennungsmolekülen der ECM ein. Zudem wurde ihre Beteiligung am Aufbau von Zell-Zell Kontakten beschrieben. Intrazellulär stellen Integrine über eine Reihe von Verbindungsproteinen den Kontakt zum Aktin-Cytoskelett sowie zu einer Vielzahl cytoplasmatischer Signalmoleküle her. Integrine ermöglichen auf diese Weise eine Kommunikation zwischen ECM und Cytoskelett, wobei ein bidirektionaler Informationsaustausch erfolgen kann. Im ZNS übernehmen Integrine wichtige Funktionen nicht nur während der Embryonalentwicklung, sondern auch im adulten Stadium. Sie sind maßgeblich an der Ausbildung cortikaler Strukturen des Cerebellums sowie am Aufbau synaptischer Kontakte beteiligt. Zudem wurde eine mögliche Einflussnahme dieser Proteine auf Lern- und Gedächtnisprozessen beschrieben (Übersichtsartikel: Milner & Campbell 2002).

1.2.3 Cadherine

Cadherine sind Singlepass-Transmembran-Glykoproteine, deren funktionelle Einheit aus Dimeren besteht. In der Regel ist der extrazelluläre Teil ihrer Polypeptidkette zu fünf Domänen (Cadherin repeats) gefaltet, wobei die N-terminal gelegene Domäne eine starke, Ca2+-abhängige Interaktion mit Cadherinen des selben Subtyps vermittelt. Klassische Cadherine besitzen eine stark homologe cytoplasmatische Region, welche über Catenine am Aktin-Cytoskelett verankert ist. Ca. 30 Mitglieder der Cadherin-Familie werden differentiell zu verschiedenen Entwicklungsphasen des Gehirns exprimiert. Bereits während der frühen Embryonalentwicklung scheinen Cadherine bei der Abgrenzung neuronalen Gewebes vom übrigen Ektoderm von Bedeutung zu sein. Im adulten Gewebe sind sie maßgeblich an der Stabilisierung morphologischer Strukturen beteiligt (Übersichtsartikel: Redies 2000).

1.2.4 Zellerkennungsmoleküle der Immunglobulin-Superfamilie (IgCAMs)

Die Namensgebung der IgCAMs beruht auf der Präsenz N-terminal lokalisierter Immunglobulin-ähnlicher Domänen. Ig-Domänen stellen ein weit verbreitetes Strukturmerkmal dar, das erstmals bei Antikörpern (Immunglobulinen) des Immunsystems beschrieben wurde. Als zweites strukturelles Motiv sind oftmals die bereits erwähnten FN-III repeats in Tandem-Formation mit Ig-Domänen zu finden. Ig- und Fibronektindomänen zeigen trotz Unterschiede in der Aminosäuresequenz eine einheitliche dreidimensionale Struktur (β-Faltblatt) und werden für Zellerkennungsprozesse verantwortlich gemacht. Die Verankerung

Einleitung

5

von IgCAMs in der Zellmembran erfolgt sowohl über Transmembrandomänen als auch über Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker. Die Ig-Superfamilie schließt verschiedene Subfamilien ein, die u.a. nach der Anzahl von Ig-Domänen, sowie nach Präsenz und Anzahl von FN-III repeats unterteilt werden. Homologe der meisten Vertreter können bis hin zu den Invertebraten verfolgt werden, was ihre funktionelle Bedeutung sowohl innerhalb der Evolution als auch bei Zellerkennungsprozessen unterstreicht (Übersichtsartikel: Edelman 1987).

1.3 N-CAM: Der Prototyp neuronaler IgCAMs

N-CAM ist das erste im Nervensystem identifizierte und am besten charakterisierte Mitglied der Ig-Superfamilie. Die extrazelluläre Domäne von N-CAM setzt sich aus fünf Ig-Domänen gefolgt von zwei FN-III repeats zusammen. Alternatives Spleißen bedingt die Entstehung von vornehmlich drei Isoformen, die anhand ihrer molekularen Masse unterschieden werden (N-CAM 180, N-CAM 140, N-CAM 120). Während N-CAM 180 und -140 Transmembran-proteine sind, welche sich im Aufbau ihrer cytoplasmatischen Domäne unterscheiden, ist die dritte Isoform (N-CAM 120) über einen GPI-Anker mit der Zellmembran verbunden. Zahlreiche Spleißvarianten entstehen weiterhin durch den Einsatz unterschiedlicher Exone kodierend für extrazelluläre Bereiche des Moleküls (Barthels et al 1992; Gegelashvili et al 1993). Sämtliche Isoformen können mit N-CAM Proteinen benachbarter Zellen in Verbindung treten. Zudem konnten Interaktionen mit weiteren Mitgliedern der Ig-Superfamilie sowie spezifischen Proteoglykanen der ECM nachgewiesen werden (Horstkorte et al 1993; Lahrtz et al 1997). Maßgeblich beeinflusst wird dieses Bindungsverhalten durch das Anfügen der stark negativ geladenen Polysialinsäure (PSA) an extrazelluläre Bereiche des Moleküls. PSA vermindert die durch N-CAM vermittelte Zelladhäsion und unterstützt somit dynamische Prozesse, welche vornehmlich während der Entwicklung des Nervensystems von Bedeutung sind. Entsprechend dieser Funktion nimmt die Expression von polysialisiertem N-CAM mit fortschreitender Entwicklung ab. N-CAM abhängige Verbindungen werden auf diese Weise stabilisiert, was letztendlich dem Erhalt funktioneller Einheiten dient. Im adulten Tier scheint PSA-N-CAM an Prozessen der synaptischen Plastizität beteiligt zu sein. So konnte beispielsweise bei Ratten eine erhöhte Polysialisierung von N-CAM 180 während der Aquisition und Konsolidierung bestimmter Lernparadigmen beobachtet werden (Ronn et al 2000). Intrazellulär wurde bisher eine Komplexbildung von N-CAM 140 mit fyn, einem Mitglied der src-Familie der Tyrosinkinasen beschrieben. Die Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten könnte möglicherweise die Stabilität derartiger Komplexe beeinflussen (Crossin & Krushel 2000). Wie am Beispiel von N-CAM zu sehen ist, können bereits durch alternatives Spleißen, posttranslationale Mechanismen und deren entwicklungsabhängige Regulation vielfältige Modifikationen der Funktionsweise eines Zellerkennungsmoleküls

Einleitung

6

entstehen. Neben diesen Prozessen kann auch die Ausbildung ganzer Proteinfamilien durch Genduplikationen während der Evolution die Grundlage für eine hohe Diversität schaffen. Dieses Prinzip kann anhand der L1-Familie der IgCAMs verfolgt werden.

1.4 Die L1-Familie

Wie für Protein-Familien anderer Zellerkennungsmoleküle beschrieben, zeichnen sich auch die Mitglieder der L1-Familie durch einen einheitlichen strukturellen Bauplan aus. Aminoterminal befinden sich sechs Ig-Domänen gefolgt von vier bis fünf FN-III repeats, einer Transmembrandomäne und einer kurzen cytoplasmatischen Region. Während bei Invertebraten bisher jeweils nur ein Vertreter der L1-Familie (Drosophila melanogaster: Neuroglian; (Bieber et al 1989), Caenorhabditis elegans: LAD-1, (Chen et al 2001)) gefunden werden konnte, besitzen Teleostei zwei (L1.1 und L1.2) und Mammalia vier Mitglieder dieser Gen-Familie: L1, CHL1 (Close homologue of L1), Neurofascin und NrCAM (s. Abb. 1). Neben den genannten Transmembranproteinen können Zellerkennungsmoleküle mit einer homologen Anordnung extrazellulärer Proteindomänen, jedoch einem GPI-Linker als Membranverankerung in Vertebraten gefunden werden (F3/F11/Contactin-Subgruppe). Basierend auf dem intensiven Vergleich vorliegender Sequenzdaten beziehen Holm et al. (Holm et al 1996) Mitglieder der F3/F11/Contactin-Subgruppe in die klassische L1-Familie ein, auf welche jedoch im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit nicht eingegangen werden soll. Phylogenetische Analysen unterstützten die Hypothese der sequentiellen Genduplikation, wonach aus einem Ursprungsgen im Laufe der Evolution multiple Homologe entstanden sind (Übersichtsartikel: Hortsch 1996; Hortsch 2000). Die evolutionsbedingte Entstehung diverser, homologer Gene ermöglicht die Anpassung an immer komplexere Vorgänge, welche die Grundlage für eine Weiterentwicklung und Funktionalität neuronaler Strukturen bildet. Trotz Beibehaltung allgemeiner struktureller Eigenschaften übernehmen einzelne Mitglieder der L1-Familie spezifische Funktionen, dessen Charakterisierung Thema dieser Arbeit ist.

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Abb. 1 Struktureller Bauplan der L1-Familienmitglieder

Mitglieder der L1-Familien besitzen N-Terminal sechs Ig-Domänen (dunkelgraue Form) gefolgt von vier bis fünf Fibronektin-Domänen (hellgraue Rechtecke) und einer Transmembrandomäne. Neurofascin enthält zudem zwischen der vierten und fünften Fibronektin-Domäne eine Prolin, Alanin und Threonin reiche Region (PAT-Domäne, hellgraues Oval). Intrazellulär besitzen Mitglieder der L1-Familie die höchste Homologie. Neben der RSLE-Sequenz (schwarze Pfeile) ist eine Ankyrin-bindende Region (FIGQY bzw. FIGAY in CHL1, hellgraue Pfeile) innerhalb der cytoplasmatischen Domäne zu finden.

1.4.1 Die funktionelle Bedeutung der L1-Familie

Mitglieder der L1-Familie sind maßgeblich an Migration, Neuritenwachstum, Faszikulierung und Zellerkennungsprozessen beteiligt. Schwere neurologische Defekte (CRASH-Syndrom, Weller & Gartner 2001), ausgelöst durch verschiedene Mutationen innerhalb des L1-Gens, unterstreichen die einzigartige Bedeutung dieses Moleküls während der Entwicklung des ZNS und begründen das besonderes Interesse an der funktionellen Charakterisierung dieser Proteinfamilie. Während die Erforschung von L1, dem namensgebenden Molekül dieser Gen-Familie, bereits weitgehend fortgeschritten ist, bleiben bei der Funktionsweise der übrigen

Domänenstruktur der L1-Familienmitglieder

L1 CHL1 NrCAM Neurofascin

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Familienmitglieder viele Fragen offen. Rückschlüsse auf funktionelle Eigenschaften können hierbei auf verschiedenen Ebenen erbracht werden. Wie für N-CAM beschrieben, nehmen auch bei Proteinen der L1-Familie alternatives Spleißen, posttranslationale Modifikationen, sowie ein entwicklungsabhängiges und zelltypspezifisches Expressionsverhalten maßgeblichen Einfluss auf die einzigartige „Arbeitsweise“ jedes einzelnen Vertreters. Extra- und intrazelluläre Ligandenbindung stellen zudem einen Informationsaustausch zwischen der Zelle und ihrer Umgebung sicher.

1.4.2 Alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikationen

Alternatives Spleißen der hnRNA bietet die Möglichkeit, im Verlauf eines Entwicklungsprogramms eine Reihe von Proteinen hervorzubringen, welche Variationen eines Grundmotivs darstellen. Das Entfernen bestimmter kodierender Bereiche hat hierbei eine Abwandlung funktioneller Eigenschaften zur Folge. Mitglieder der L1-Familie weisen nicht nur auf Protein-, sondern auch auf genomischer Ebene hoch konservierte Strukturen auf (Dry et al 2001; Kohl et al 1992; Zhao et al 1998). Trotz vergleichbarer Exon/Intron Anordnungen in genomischen Sequenzen der L1-Familienmitglieder, kann ein unterschiedliches Spleißverhalten einzelner Moleküle beobachtet werden. Während für L1 bis heute ausschließlich das Spleißen der Exone 2 und 27 beschrieben wurde (Coutelle et al 1998), deuten Studien am Neurofascin-Gen des Huhns und am humanen NrCAM-Gen auf komplexe Spleißvorgänge während des RNA-Processings hin (Dry et al 2001; Hassel et al 1997). Einzelne Isoformen unterscheiden sich u.a. in ihrer Affinität zu extra- und intrazellulären Liganden (De Angelis et al., 2001, Davis et al., 1993), was bespielsweise zu einem veränderten L1 vermittelten Neuritenwachstum führen kann (Jacob et al 2002). Bis heute nur unvollständig beschrieben sind dagegen murine cDNA-Sequenzen und Spleißvarianten von NrCAM und Neurofascin. Während alternatives Spleißen Moleküleigenschaften bereits auf RNA-Ebene beeinflusst, ermöglichen nach vollendeter Translation eine Vielzahl enzymkatalysierter Reaktionen weitere Veränderungen auf Proteinebene. Neben der proteolytischen Spaltung können z.T. einheitliche Glykosylierungs- und Phosphorylierungsmuster bei Vertretern der L1-Familie beobachtet werden. Spezifische Metalloproteasen katalysieren die Abspaltung der extrazellulären Domäne von L1 und deren Freisetzung in die ECM. Entstehende Spaltprodukte unterliegen keinem weiteren proteolytischen Abbau und können somit in substratgebundener bzw. löslicher Form ein durch Integrin vermitteltes Neuritenwachstum unterstützen (Beer et al 1999). Western-Blot-Analysen löslicher Membranfraktionen sprechen für die Proteolyse weiterer L1-Mitglieder, deren funktionelle Bedeutung jedoch weitgehend ungeklärt ist (Grumet et al 1991; Hillenbrand et al 1999; Kayyem et al 1992). Neben der proteolytischen Spaltung ist das Ausstatten extrazellulärer Domänen mit einer Vielzahl von Zuckerresten charakteristisch für

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den Aufbau von Oberflächenproteinen. Vertreter der L1-Familie besitzen eine Vielzahl putativer Glykosylierungsstellen, welche u.a. das Anheften des HNK-1 (human natural killer-1) Kohlenhydratepitops ermöglichen. Dieses Epitop vermittelt adhäsive Verbindungen, welche die Grundlage für Migration und Neuritenwachstum bilden, und scheint insbesondere bei plastischen Prozessen von größter Bedeutung zu sein (Pradel et al 1999; Schmidt & Schachner 1998; Strekalova et al 2001). Intrazellulär weisen Mitglieder der L1-Familie eine Reihe potentieller Phosphorylierungsstellen auf, die Angriffspunkte für verschiedene Proteinkinasen sind (Übersichtsartikel: Kamiguchi & Lemmon 2000). Der Phosphorylierungs- bzw. Dephosphorylierungsstatus hoch konservierter Tyrosinreste bestimmt maßgeblich das trafficking von L1-Familienmitgliedern an der Zellmembran (YRSL-Motiv), sowie ihre Verbindung zum Cytoskelett (FIGQY-Motiv), was im Gegenzug extrazelluläre Bindungseigenschaften beeinflussen kann (Garver et al 1997; Tuvia et al 1997). Signale an der Zelloberfläche können auf diese Weise über die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden transzelluläre Kontakte modulieren und eine dynamische Zelladhäsion als Grundlage plastischer Prozesse ermöglichen (Schaefer et al 2002; Schmid et al 2000). Gestützt wird dieses Modell durch eine Anreicherung FIGQY-phosphorylierter Proteine in Regionen migrierender Zellen sowie in Bereichen spezialisierter Zell/Zell Kontakte (Jenkins et al 2001).

1.4.3 Expressionsmuster der L1-Familienmitglieder

Die korrekte Ausdifferenzierung und Stabilisierung zentralnervöser Strukturen setzt eine exakt koordinierte räumliche und zeitliche Expression unterschiedlichster Moleküle voraus. Entsprechend ihrer biologischen Bedeutung kann das Auftreten neuraler Zellerkennungsmoleküle vornehmlich während der Entwicklung des Nervensystems beobachtet werden. Verschiedene Studien deuten sowohl auf überlappende, als auch unterschiedliche Expressionsmuster einzelner L1-Familienmitglieder hin. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung exprimieren Subpopulationen postmitotischer Neurone und Gliazellen, neben einzelnen Vertretern der L1-Familie, Kombinationen mehrerer Familienmitglieder (Hillenbrand et al 1999; Moscoso & Sanes 1995; Sakurai et al 2001). Subzellulär werden Mitglieder der L1-Familie oftmals entlang auswachsender axonaler Bahnen wie dem kortikospinalen Trakt, Corpus Callosum oder innerhalb der Molekularschicht des Cerebellums gefunden (Fujimori et al 2000; Lustig et al 2001; Sakurai et al 2001). Eine Anreicherung von Neurofascin und NrCAM ist weiterhin an spezialisierten Membranstrukturen, wie den Ranvierschen Schnürringen oder den intitialen Axonsegmenten von Purkinjezellen des Cerebellums zu beobachten (Jenkins & Bennett 2001a; Tait et al 2000; Trapp & Kidd 2000, Davis et al 1996 ).

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Vergleichende Expressionsstudien geben die Möglichkeit, nähere Einsichten in das funktionelle Zusammenspiel einzelner L1-Familienmitglieder zu gewinnen, und lassen möglicherweise Rückschlüsse auf die Notwendigkeit einer evolutionsbedingten Genduplikation zu. Bis heute können nur vereinzelte Arbeiten unter diesem Aspekt gefunden werden, welche jedoch nie die gesamte L1-Proteinfamilie einbeziehen (Moscoso & Sanes 1995). Zudem beschränkt sich die Beschreibung entwicklungsabhängiger Expressionsmuster oftmals auf einzelne Regionen zentralnervöser Strukturen (Hortsch 2000; Liu et al 2000). Im Mittelpunkt steht hierbei insbesondere die Embryonalentwicklung, die sich durch ausgeprägte Zellmigration, Neuritenwachstum und Faszikulierung auszeichnet (Backer et al 2002; Lustig et al 2001; Moscoso & Sanes 1995). Prozesse wie Synaptognese und Myelinisierung finden bei höheren Vertebraten dagegen vornehmlich in der frühen postnatalen Entwicklung statt. Plastische Prozesse einhergehend mit Lernen und Gedächtnis sind bis weit in das adulte Stadium zu finden. Inwieweit die Expression von Zellerkennungsmolekülen der L1-Familie einer postnatalen Regulation unterliegt, wurde in einem Teil dieser Arbeit untersucht.

1.4.4 Extrazelluläre und intrazelluläre Liganden

Zellerkennungsmoleküle sind nicht ausschließlich für den Aufbau und die Stabilisierung von Zell/Zell- bzw. Zell/ECM-Kontakten verantwortlich. Darüber hinaus vermitteln Mitglieder der L1-Familie die Weiterleitung extrazellulärer Signale in das Zellinnere (Schaefer et al 2002; Schmid et al 2000). Grundlage für die Ausübung derartiger Funktionen ist das komplexe Bindungsverhalten dieser Moleküle. Extrazellulär werden hierbei homophile von heterophilen Interaktionen unterschieden. Bei der homophilen Interaktion stellt ein Protein sowohl den Liganden als auch den Rezeptor dar, bei der heterophilen Interaktion sind unterschiedliche Moleküle am Verbindungsaufbau beteiligt. Eine Ligandenbindung kann hierbei sowohl in der trans- (Interaktion benachbarter Moleküle gegenüberliegender Zellmembranen bzw. mit der ECM) als auch in der cis- Ebene (Interaktion benachbarter Moleküle einer Zellmembran) erfolgen. Mit Ausnahme von CHL1 sind sämtliche Transmembranproteine der L1-Familie in der Lage, homophile Interaktionen aufzubauen (Hillenbrand et al 1999; Mauro et al 1992; Miura et al 1992; Tuvia et al 1997). Daneben konnten bereits vielfältige heterophile Ligandenbindungen beschrieben werden. Mitglieder der L1-Familie gehen untereinander sowie mit weiteren Mitgliedern der Ig-Superfamilie, Integrinen und Komponenten der ECM Verbindungen ein. Reaktionen auf derartige Interaktionen werden hierbei sowohl von den beteiligten Zelltypen als auch von der Identität extrazellulärer Liganden bestimmt. So vermittelt eine trans-Interaktion zwischen L1 und CD24, einem GPI-verankertem Glykoprotein, eine vom Zelltyp abhängige Induktion bzw. Inhibition von Neuritenwachstum (Kleene et al 2001). Ähnliches konnte in vitro für NrCAM beobachtet werden. Während eine Interaktion zwischen NrCAM und F3/F11 in Körnerzellen

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des Cerebellums das Auswachsen axonaler Fortsätze reduziert, löst die gleiche Verbindung ein erhöhtes Neuritenwachstum tektaler Neurone aus (Faivre-Sarrailh et al 1999; Volkmer et al 1996). NrCAM kann hierbei sowohl den Rezeptor als auch den Liganden darstellen. Zudem induziert immobilisiertes Neurofascin über heterophile Wechselwirkungen mit NrCAM das Neuritenwachstum – ein Verhalten, das in umgekehrter Anordnung nicht zu beobachten ist (Volkmer et al 1996). Verbindungen zwischen NrCAM und Axonin-1 nehmen dagegen keinen Einfluss auf das Neuritenwachstum, unterstützen jedoch die Wegfindung neuronaler Zellen (Fitzli et al 2000). Die Auslösung derart komplexer Zellantworten macht die Aktivierung unterschiedlichster Signalkaskaden erforderlich. Wie Informationen von der Zelloberfläche letztendlich in das Zellinnere gelangen, ist jedoch weitgehend ungeklärt. Kamiguchi und Lemmon (1997) postulieren hierbei die Notwendigkeit weiterer cis-Interaktionen – ein Prinzip, welches bereits für die Aktivierung unterschiedlicher Tyrosin-Rezeptorkinasen beschrieben wurde. Aktuelle Befunde zeigen, dass auch die über L1-Familienmitglieder vermittelteten Signalwege von einer Ausbildung derartiger Multi-Proteinkomplexe abhängen. Neben homophilen Interaktionen sind in diesem Fall GPI-verankerte IgCAMs als mögliche Bindungspartner in der cis-Ebene bekannt (Hall et al 2000; Sakurai et al 1997). Während auf extrazellulärer Seite bereits eine Vielzahl unterschiedlichster Liganden der L1-Mitglieder beschrieben wurden, beschränkt sich das Wissen hinsichtlich intrazellulärer Interaktionspartner auf nur wenige Moleküle. Die cytoplasmatische Domäne von Transmembranproteinen der L1-Familie umfasst ca. 100 Aminosäuren (AS) und stellt die am höchsten konservierte Region innerhalb der Molekülfamilie dar (Holm et al 1996). Allen Mitgliedern gemeinsam ist die intrazelluläre Verbindung zu Ankyrinen, einer Genfamilie peripherer Membranproteine, welche integrale Membranmoleküle mit dem auf Spektrin basierenden Cytoskelett verknüpfen (Bennett & Chen 2001; Buhusi et al 2003; Davis & Bennett 1994). Die funktionelle Bedeutung dieser Verbindung konnte bereits vielfach belegt werden. Das Zusammenspiel von L1-Familienmitgliedern und Ankyrinen ist maßgeblich am Aufbau spezialisierter Membranstrukturen beteiligt (Jenkins & Bennett 2001a; Lambert et al 1997; Lustig et al 2001a; Zhang et al 1998). Zudem weisen AnkyrinB-defiziente Mäuse einen zu L1- und NrCAM-defizienten Mäusen komplementären Phänotyp auf (More et al 2001; Scotland et al 1998). Eine Regulation der Interaktion zwischen Ankyrin und L1-Familienmitgliedern erfolgt über posttranslationale Prozesse. Die Phosphorylierung eines konservierten Tyrosinrestes innerhalb der postulierten Ankyrin-Erkennungssequenz (FIGQY) setzt die Assoziation von Neurofascin und Ankyrin herab und erhöht die laterale Motilität von Neurofascin innerhalb der Zellmembran (Garver et al 1997). Phospho-FIGQY geht Interaktionen mit dem cytoplasmatischen Protein Doublecortin ein. Da Doublecortin ähnlich wie L1-Familienmitglieder in Prozesse der Zellmigration involviert ist, scheint diese Verbindung insbesondere für dynamische Prozesse von Nutzen zu sein (Kizhatil et al 2002). Eine

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dynamische Zelladhäsion wird weiterhin über eine exakt regulierte Expression von Zellerkennungsmolekülen an der Zelloberfläche gesteuert. Die phosphorylierte Form einer auf Tyrosin-basierenden Signalsequenz (YRSL) ermöglicht die Interaktion von L1 mit dem Adaptorprotein AP-2, welches im Gegenzug die Clathrin vermittelte Endocytose vermittelt (Kamiguchi et al 1998b). Neben diesen konservierten Erkennungssequenzen innerhalb der cytoplasmatischen Domäne zeigt insbesondere der C-Terminus einzelner L1-Familienmitglieder Sequenzunterschiede auf, welche möglicherweise die strukturelle Basis für spezifische Interaktionen bieten. Während die aus Invertebraten bekannten L1-Homologen Neuroglian und LAD-1 über ein C-terminal lokalisiertes PDZ-Bindungsmotiv verfügen, kann eine entsprechende AS-Abfolge innerhalb der Vertebraten-Familie ausschließlich bei NrCAM gefunden werden (-SFVCOOH, Songyang et al 1997). PDZ-Domänen wurden erstmals in den strukturverwandten Proteinen PSD95, DLG und ZO-1 beschrieben und sind in einer Vielzahl cytoplasmatisch lokalisierter Moleküle zu finden (Übersichtsartikel: Garner et al 2000). PDZ-Domänen sind verantwortlich für den Aufbau verschiedenster Proteininteraktionen und maßgeblich an der Verankerung von Rezeptormolekülen und Ionenkanälen entlang spezialisierter Membranstrukturen beteiligt (Kim et al 1995; Kornau et al 1997). Während Neurofascin trotz des Fehlens eines charakteristischen PDZ-Bindungsmotivs mit der zweiten PDZ-Domäne von Syntenin-1 interagiert (Koroll et al 2001), sind Interaktionen zwischen NrCAM und PDZ-Domänen bis heute nicht bekannt. Ob NrCAM über ein funktionelles Bindungsmotiv verfügt wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Im Zuge dieser Fragestellung wurden u.a. Interaktionen zwischen NrCAM und dem Synapsenassoziierten Protein (SAP) 97 getestet.

1.4.5 Gen-Targeting: Ein modernes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung

von L1-Familienmitgliedern

Gentargeting bewirkt das Einfügen gerichteter Modifikationen in das Genom nach dem Prinzip der homologen Rekombination. Unterschiedlichste Targeting-Strategien machen ein ständig wachsendes Methodenspektrum der Mausgenetik aus und ermöglichen die gezielte Analyse bestimmter Gen-Funktionen in vivo. Neben der konventionellen Methode des Gen-Targetings zur Erzeugung von Nullmutanten (Knockouts), stehen heute eine Reihe induzierbarer Systeme zur Verfügung, welche eine räumliche und zeitliche Regulation der Genexpression ermöglichen (Übersichtsartikel: Muller 1999; Sauer 1998). Welche Bedeutung die Untersuchung von Knockout-Mäusen für die funktionelle Charakterisierung von Zellerkennungsmolekülen hat, wird deutlich bei der Betrachtung L1-defizienter Mäuse. Der Phänotyp dieser Tiere zeigt eindeutige Parallelen zu neurologischen Defekten, die durch verschiedene Mutationen innerhalb des humanen L1-Gens ausgelöst und unter dem Akronym CRASH (corpus callosum hypoplasia, retardation, adducted thumbs, spastic paraplegia und

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hydrocephalus) zusammengefasst werden (Übersichtsartikel: Kamiguchi et al 1998a). L1-defiziente Mäuse sind daher ein geeignetes Tiermodell bei der Erforschung erblicher Erkrankungen und zeigen, dass die Erzeugung von Knockout-Mäusen zu einem wertvollen Werkzeug bei der funktionellen Charakterisierung einzelner Gene geworden ist. Neben L1-defizienten Mäuse sind bereits CHL1- und NrCAM-defiziente Mäuse in der Literatur beschrieben. Im Gegensatz zum L1-Knockout führt sowohl die Inaktivierung des NrCAM- als auch des CHL1-Gens zu eher subtilen Veränderungen des Phänotyps. Während in NrCAM-defizienten Mäusen die Ausbildung von Katarakten zu beobachten ist (More et al 2001), weisen CHL1-defiziente Mäuse disorganisierte axonale Projektionen sowie veränderte Verhaltensmuster auf (Montag-Sallaz et al 2002). Auswirkungen einer Neurofascin-Defizienz sind bis heute nicht bekannt.

1.5 Fragestellung

Säugetiere besitzen vier Mitglieder neuraler Zellerkennungsmoleküle der L1-Familie, welche während der Evolution über sequentielle Genduplikationen aus einem Ursprungsgen entstanden sind (Übersichtsartikel: Hortsch 2000). Die Entstehung homologer Gene spricht für die Ausübung spezifischer Funktionsweisen einzelner L1-Familienmitglieder, dessen nähere Charakterisierung Thema der vorliegenden Arbeit sein sollte. Da die Erforschung von L1 bereits weitgehend fortgeschritten ist, sollten sich die vorliegenden Studien auf CHL1, NrCAM und Neurofascin konzentrieren. Eine Charakterisierung dieser Moleküle sollte hierbei auf verschiedenen Ebenen erfolgen. Da bis heute nur wenig über eine postnatale Regulation der Expression von L1-Familienmitgliedern bekannt ist, sollten Expressionsmuster von L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin während dieser Phase der Entwicklung miteinander verglichen werden. Unter Anwendung der konventionellen in situ Hybridisierung (basierend auf einer alkalischen Phosphatase-Färbung) sollte zunächst ein allgemeiner Einblick in zeitlich regulierte und regionenspezifische Expressionsmuster der vier L1-Familienmitglieder gewonnen werden. Um weitere Informationen auf zellulärer Ebene zu erhalten, sollte die fluoreszente in situ Hybridisierung etabliert werden. Diese Methode bietet neben einer erhöhten Auflösung die Möglichkeit einer Doppelmarkierung. Entwicklungsabhängige Expressionsmuster von L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin sollten insbesondere im Bulbus olfactorius, Hippocampus und Cerebellum miteinander verglichen werden. Diese Regionen zeigen z.T. deutliche Unterschiede im Ablauf einsetzender Differenzierungsprozesse und geben somit die Möglichkeit, Expressionsmuster in Beziehung zu Zellmigration, Neuritenwachstum und Synaptogenese zu setzten. Neben einer neuronalen Expression sollte weiterhin das Vorkommen von Transkripten einzelner L1-Mitglieder in Gliazellen untersucht werden. Auf Proteinebene ist das komplexe Bindungsverhalten von Zellerkennungsmolekülen

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verantwortlich für ihre spezifischen Funktionsweisen. Während bereits eine Vielzahl extrazellulärer Liganden der L1-Familienmitglieder beschrieben wurden, ist nur wenig über intrazelluläre Interaktionspartner bekannt. NrCAM besitzt als einziges Mitglied der L1-Familie ein PDZ-Bindungsmotiv (Songyang et al 1997). Die Funktionlität dieser Bindungsdomäne sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Unter Anwendung des Hefe-Zwei-Hybrid Systems sollten zunächst Interaktionen zwischen dem Carboxyterminus von NrCAM und den PDZ-Domänen verschiedener membranassoziierter Moleküle getestet werden. Gefundene Interaktionen sollten im Zellkultur-System und unter Anwendung proteinbiochemischer Methoden bestätigt werden. Putative Interaktionspartner der cytoplasmatischen Domäne von CHL1 sollten über den Hefe-Zwei-Hybrid Screen einer Rattenhirn-cDNA-Bibliothek isoliert werden. Die gezielte Inaktivierung von Genen bietet die Möglichkeit, Proteinfunktionen in vivo zu untersuchen. Während Phänotypen L1-, CHL1- und NrCAM-defizienter Mäuse bereits beschrieben sind (Dahme et al 1997; Montag-Sallaz et al 2002; More et al 2001) ist nichts über die Auswirkungen einer Neurofascin-Defizienz bekannt. Neurofascin wird insbesondere für den Aufbau spezialisierter Axon/Glia-Kontakte und Membranstrukturen verantwortlich gemacht (Jenkins & Bennett 2001a; Tait et al 2000). Inwieweit Neurofascin tasächlich eine tragende Rolle bei derartigen Prozessen übernimmt, kann beispielsweise durch das gezielte Ausschalten seiner Genfunktion überprüft werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher ein Neurofascin Targeting-Konstrukt kloniert werden, welches unter Anwendung des induzierbaren Cre/loxP-Systems die Möglichkeit bietet, Genfunktionen zu definierten Zeitpunkten bzw. innerhalb definierter Zellpopulationen zu beeinflussen. Im Zuge dieser Fragestellung sollte zunächst genomische DNA des Neurofascin-Gens über den Screen einer Phagen-Bank isoliert und kartiert werden. Zudem sollte der Nachweis der homologen Rekombination unter Anwendung des Southern-Blot- und PCR-Verfahrens etabliert werden.

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2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien

Chemikalien wurden in der Qualität pro analysis eingesetzt und von den Firmen Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg), Boehringer/Roche (Mannheim), Fluka (Steinheim), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen. Spezielle Reagenzien etc. werden zu Beginn der entsprechenden Methodenbeschreibung genannt. Sämtliche Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser angefertigt. Kits und Enzyme wurden nach Herstellerangaben verwendet.

2.2 Kulturmedien und Zusätze LB-Medium 5 g Hefe-Extrakt, 10g Bacto Tryptone, 10 g NaCl ad

1000ml H20 (+ 15g Agar für die Herstellung von Kulturplatten)

NZYDT-Medium 21,1 g NZYDT-Fertigmedium ad 1000ml H20 2 x YT-Medium 10 g Hefe-Extrakt, 16 g Bacto Peptone, 5 g NaCl ad 1000

ml H20 Weichagar 1000 ml Medium + 7 g Agar Ampicillin 100mg / ml H20 Kanamycin 25 mg / ml H20 IPTG Stocklösung 100 mg Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosidase / ml H20 X-Gal Stocklösung 400 mg 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-ß-D-galactopyranosi-

dase ad 10 ml NN-Dimethylformamid

2.3 Lösungen 10 x PBS 1,5 M NaCl, 83 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4 10 x TBS 1,5 M NaCl, 500 mM Tris/HCl, pH 7,5 10 x TCM 0,1 M MgCl2, 0,1 M CaCl2, 0,1M Tris pH 7,5 20 x SSC 3 M NaCl, 0,3 M tri-Natriumcitrat, pH 6,3 20 x SSPE 3,6 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,4), 20 mM EDTA 50 x Denhardt´s Lösung 1 % Bovine Serum Albumine (BSA), 1 % Ficoll,

1 % Polyvinyl-Pyrrolidone (PVP) in H2O 50 x TAE 2 M Tris-Acetat, 0,05 M EDTA SM – Puffer 8mM MgSO4 x 7 H2O, 100mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5

Material und Methoden

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2.4 Kits und Enzyme für molekularbiologische Arbeiten DIG RNA Labeling Mix Roche Diagnostics GmbH, Mannheim DNase I, RNase-free Roche Diagnostics GmbH, Mannheim ExSite (Site-Directed Mutagenesis Kit) Stratagene, Cedar Creek, TX Fluorescein RNA Labeling Mix Roche Diagnostics GmbH, Mannheim High Prime DNA Labeling Kit Roche Diagnostics GmbH, Mannheim QIAEX II Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden QIAquick Nukleotid Removal Kit Qiagen, Hilden Rapid DNA Ligation Kit Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Restriktionsenzyme Roche Diagnostics GmbH, Mannheim T3 RNA Polymerase Roche Diagnostics GmbH, Mannheim T4 Polynukleotidkinase (3´Phosphatase frei) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim T7 RNA Polymerase Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Taq DNA Polymerase Promega, Madison, WI, USA Taq PCR Core Kit Qiagen, Hilden TSATM Cyanine3 System NENTM Life Science Products, Boston, MA TSATM Fluorescein System NENTM Life Science Products, Boston, MA Ultrapure dNTP Set Amersham Pharmacia

2.5 Vektoren pBlueskript KS - Klonierungsvektor Stratagene, Cedar Creek, TX pUC 18 Klonierungsvektor Stratagene, Cedar Creek, TX pEGFF-C1 Living ColorsTM Clontech / BD Biosciences, Heidelberg pGADT7 MATCHMAKER THS Clontech / BD Biosciences, Heidelberg

(Two-Hybrid System) pGBKT7 MATCHMAKER THS Clontech / BD Biosciences, Heidelberg pACT2 MATCHMAKER THS Clontech / BD Biosciences, Heidelberg pAS2-1 MATCHMAKER THS Clontech / BD Biosciences, Heidelberg

2.6 Antikörper

Antikörper Spezies Verdünnung Hersteller Alexa Fluor 568, anti Maus IgG

Ziege ICC: 1 : 1000 Molecular Probes Europe BV, Leiden, Niederland

anti-Digoxigenin-AP Schaf ISH: 1 : 500 Boehringer, Mannheim anti-Digoxigenin-POD Schaf ISH: 1 : 500 Boehringer, Mannheim anti-FLAG M2 Maus ICC: 1 : 1000-1500

WB: 1 : 10000 Sigma, Steinheim

anti-Fluorescein-POD Schaf ISH: 1 : 500 Boehringer, Mannheim anti-GFP Maus WB: 1 : 15000 Covance, Richmond, Californien anti-Kaninchen IgG-HRP Ziege WB: 1 : 10000 Dianova, Hamburg anti-Maus IgG-HRP Ziege WB: 1 : 10000 Dianova, Hamburg anti-ProSAP1 Kaninchen WB: 1 : 600 zur Verfügung gestellt von Dr. C. Spilker anti-PSD95 Maus WB: 1 : 250 BD Biosciences, NJ, USA anti-SAP97 Maus WB: 1 : 5000 zur Verfügung gestellt von Dr. U. Thomas


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2.7 Allgemeine molekularbiologische Techniken

2.7.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Spezifische Primer für die Amplifikation von DNA-Fragmenten wurden u.a. mit dem Primer3-Programm (www-genome-wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi) designed und zur Subklonierung gewonnener DNA-Fragmente mit Restriktionsschnittstellen am 5Énde versehen. Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech AG (Ebersberg) nach gewünschter Nukleotidabfolge synthetisiert und geliefert. Eine Zusammenfassung der in dieser Arbeit eingesetzten Primer bzw. Primerkombinationen unter Angabe ihrer Bezeichnung, Verwendung und PCR-Bedingungen kann im Anhang gefunden werden. Sämtliche PCR-Reaktionen wurden in einem Thermocycler der Firma Perkin Elmer (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems) durchgeführt.

2.7.2 Agarose-Gelelektrophorese und Elution von DNA-Fragmenten Agarose SeaKem LE agarose, BMA, Rockland, ME USA Ethidiumbromid-Lösung 10 mg / ml in H2O 10 x DNA-Probenpuffer 0,1 % Xylolcyanol, 0,1 % Bromphenolblau 50 % Glycerin Laufpuffer 1 x TAE Längenstandard 100 bp DNA Ladder, extended; Roth, Karlsruhe GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder; MBI Fermentas, St. Leon-Rot Lambda DNA/EcoRI +HindIII Marker MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden je nach Fragmentgrösse 0,7 – 2 %ige Agarose-Gele in 1 x TAE-Puffer hergestellt. Die Visualisierung der DNA erfolgte mittels Ethidiumbromid (1 µg / ml). Die elektrophoretische Auftrennung der in 1 x Probenpuffer aufgenommenen Proben erfolgte in horizontalen Elektrophoresekammer (BioRad) bei einer Stromstärke von ca. 10 V / cm. DNA-Fragmentgrössen wurden mit Hilfe verschiedener Längenstandards bestimmt. Für Klonierungsschritte benötigte DNA-Fragmente wurden unter Anwendung des Qiaex II Gelextraktions-Kits aus dem Gel eluiert.

2.7.3 Ligation von DNA-Fragmenten in entsprechende Plasmid- bzw.

Expressionsvektoren

Zur Ligation von DNA Fragmenten in die dafür vorgesehenen Vektoren, wurde zunächst der Vektor mit den entsprechenden Enzymen linearisiert. Anschließend erfolgte die Ligation unter Anwendung des Rapid DNA Ligation Kits.


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2.7.4 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien und Transformation

Zur Herstellung chemisch kompetenter Zellen wurden zunächst 5 ml LB Medium mit einer Kolonie E. coli JM 109 angeimpft und über nacht bei 37 oC unter Schütteln inkubiert. 4 ml dieser Übernachtkultur wurden in 200 ml LB Medium, 1 % 1M MgSO4 überführt und bis auf eine optische Dichte von 0,3 – 0,4 OD600 kultiviert. Diese Kultur wurde 20 – 30 min auf Eis gestellt und anschließend 10 min bei 5000 rpm, 4 oC zentrifugiert. Nach Spülen des Zellpellets in 20 ml eiskaltem 50 mM CaCl2 wurde das Pellet in 100 ml 50 mM CaCl2 (eiskalt) resuspendiert und 1 h auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in 20 ml eiskaltem 50 mM CaCl2, 20 % Glycerin aufgenommen, aliquotiert und bei − 85 oC gelagert. Zur Transformation wurden kompetente Zellen auf Eis aufgetaut und der Transformationsansatz (10 µl Ligationsansatz + 20 µl 10 x TCM ad 75 µl H2O) in 15 ml Falconröhrchen vorbereitet. 125 µl der Zellen wurden zum Tranformationsansatz gegeben und 30 – 45 min auf Eis inkubiert. Nach einem zwei minütigen Hitzeschock bei 42 oC, wurde 1 ml LB-Medium zum Ansatz gegeben, worauf eine 30 – 45 minütige Inkubation bei 37 oC im Schüttelinkubator erfolgte. Transformierte Bakterien wurden auf entsprechenden Selektionsplatten ausplattiert.

2.7.5 Herstellung elektrokompetenter Bakterien und Elektroporation

Zur Herstellung elektrokompetenter Bakterien vom Stamm E. coli XL blue MRF´ wurde eine Übernachtkultur in 15 ml 2 x YT-Medium angelegt. Die gesamte Kultur wurde in 200 ml Medium überführt und bis auf eine optische Dichte von 0,94 OD600 kultiviert. Diese Kultur wurde auf Eis abgekühlt und geerntet (Zentrifugation 5000 rpm, 10 min, 4 oC). Das Pellet wurde in 150 ml eiskaltem Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Nach der Wiederholung dieses Waschschrittes wurde das Bakterienpellet in 50 ml 10 %igem Glycerin aufgenommen, zentrifugiert und abschließend in 5 ml 10 %igem Glycerin resuspendiert. Elektrokompetente Zellen wurden aliquotiert und bei –85 oC gelagert. Zur Elektroporation wurden 50 µl kompetente Bakterien auf Eis aufgetaut und mit 1 µl der Plasmid-DNA vermischt. Nach einer 5minütigen Inkubation auf Eis wurde dieser Ansatz in eine eiskalte Küvette (0,2 cm Elektrodenabstand) überführt und mit 2,5 kV, 200 Ω und 25 µF elektroporiert. Anschließend wurden transformierte Bakterien sofort in 1 ml vorgewärmten LB-Medium resuspendiert, in 2 ml Reaktionsgefässe überführt und 1 h bei 37 oC, 1200 rpm inkubiert. Bakterien wurden bei 3000 rpm (5 min) abzentrifugiert, auf entsprechenden Selektionsplatten ausplattiert und bei 37 oC über Nacht kultiviert.


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2.7.6 DNA – Präparationen (Mini-, Maxipräparationen) P1-Puffer Qiagen 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA; pH 8,0

+ 100 µg/ml RNAse A (4 oC) P2-Puffer Qiagen 200 mM NaOH, 1 % SDS P3-Puffer Qiagen 2,5 M Kaliumacetat; pH 4,8 QBT- Puffer Qiagen 750 mM NaCl, 50 mM MOPS, 15 % Ethanol; pH 7,0,

0,15 % Triton-X 100 QC-Puffer Qiagen 1 M NaCl, 50 mM MOPS, 15 % Ethanol; pH 7,0 QF-Puffer Qiagen 1,35 M NaCl; 50 mM MOPS, 15 % Ethanol; pH 8,2

Für eine Plasmid Minipräparation wurden 3 ml Selektionsmedium mit einer Einzelkolonie transformierter Bakterien angeimpft und über Nacht inkubiert (37 oC, 200 - 250 rpm). 1,5 ml der Übernachtkultur wurden 5 min bei 14.000 rpm, RT zentrifugiert. Das entstandene Zellpelett wurde in 300 µl P1-Puffer gelöst. Die Lyse dieser Zellsuspension erfolgte unter Zugabe von 300 µl P2-Puffer (5 min, RT). Zur Fällung des bakteriellen Debris wurde das Lysat mit 300 µl P3-Puffer versetzt und bei 14.000 rpm, 4 oC für 15 min zenrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die Fällung der DNA erfolgte unter Zugabe von 800 µl Isopropanol und anschließender 15minütiger Zentrifugation (14.000 rpm, 4 oC). Das enstandene DNA-Pelett wurde nach einmaligem Waschen in 70 %igem Ethanol getrocknet und in 50 µl 1 mM Tris, pH 7,0 aufgenommen. Eine Präparation größerer DNA-Mengen (Maxipräparation) erfolgte aus einer 200 ml Übernachtkultur unter Anwendung des Qiagen Plasmid Maxi Kits. Gewonnene DNA-Peletts wurden in 1 ml 10 mM Tris pH 7,0 aufgenommen. Sollte die unter diesen Bedingungen isolierte DNA für die Synthese von in situ Sonden bzw. für die Transfektion eukaryotischer Zellen eingesetzt werden, erfolgte eine weitere Aufreinigung der DNA durch Chloroformextraktion und anschließender Ethanolfällung.

2.7.7 Sequenzierung und Sequenzanalyse

Klonierte DNA-Konstrukte sowie während eines Banken-Screens isolierte Plasmide wurden mittels Sequenzierung hinsichtlich ihrer Identität überprüft. Hierzu wurde die vorliegende DNA unter Anwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits aufgereinigt und mittels fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleotide nach der Kettenabbruchmethode automatisch sequenziert. Sequenzreaktionen wurden im IfN-Speziallabor „Molekularbiologische Techniken“ (Dr. W. Tischmeyer) ausgeführt. Eine Analyse der Daten erfolgte unter Anwendung des GCG-Sequenzanalyse-Programms (Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin) sowie mittels Datenabgleichs innerhalb öffentlich zugänglicher Datenbanken (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).


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2.7.8 Screen einer cDNA-Bank (Maushirn, adult)

Verschiedene in dieser Arbeit gewählten Ansätze zur Charakterisierung neuronaler Zellerkennungsmoleküle setzten das Vorliegen der cDNA einzelner Moleküle voraus. Zur Isolation entsprechender full-length Klone war in einigen Fällen der Screen einer cDNA-Bank (Rapid-Screen cDNA Library Panel: Mouse Adult Brain; OriGene Technologies, Inc.; Rockville, Maryland) erforderlich. Das Durchsuchen der Plasmid-DNA erfolgte nach Vorschrift des Herstellers in drei PCR Runden mit genspezifischen Primern:

1 PCR-Screen der 96-well Ausgangsplatte, zusammengesetzt aus Plasmid DNA (ca. 5000 cDNA-Klone / well) 2 PCR-Screen der korrespondierenden 96-well Subplatte, zusammengesetzt aus Glycerinkulturen (ca. 50 cDNA-Klone / well) 3 PCR-Kolonienscreen, ausplattiert von positiven wells der Subplatte

2.8 Expressionsstudie mittels in situ Hybridisierung (ISH)

Mittels in situ Hybridisierung wurde ein Vergleich entwicklungsabhängiger Expressionsmuster einzelner Mitglieder der L1-Familie auf RNA Ebene durchgeführt. Zum Einsatz hierbei kam neben der konventionellen Methode des Nachweises Digoxigenin (Dig)-markierter Sonden die Fluoreszenz in situ Hybridisierung, welche u.a. eine hohe räumliche Auflösung sowie die Möglichkeit einer Doppelmarkierung bietet. RNA-Sonden umfassen den extrazellulären Bereich der Zellerkennungsmoleküle (s.a. Holm

et al. 1996) und wurden für CHL1 und L1 von Dr. D. Montag zur Verfügung gestellt. Zur

Untersuchung einer nicht neuronalen Expression wurden eine MAG (myelinassoziiertes

Glykoprotein) - Sonde (zur Verfügung gestellt von Herrn Dr. D. Montag) als

Oligodendrozytenmarker und eine GFAP (Glial fibrillary acidic protein) - Sonde als

Astrozytenmarker eingesetzt.

2.8.1 Klonierung der Neurofascin, NrCAM und GFAP cDNA

Entsprechend der vorliegenden CHL1- und L1-Sonden wurden RNA-Sonden für Neurofascin und NrCAM synthetisiert. Die benötigte cDNA, kodierend für den extrazellulären Bereich, wurde mittels PCR (Template: full-length Klone aus cDNA-Bankenscreen) mit genspezifischen Primern amplifiziert und über geeignete Schnittstellen in den pBlueskript KS- Vektor kloniert. Zur Synthese der GFAP-Sonde wurde ein 1,2 kb Fragment der Maus cDNA, kodierend für den N-terminalen Bereich des Proteins, in den pBlueskript KS- Vektor subkloniert. (s.a. Jucker et al 1995; Lewis et al 1984).


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2.8.2 Herstellung Digoxigenin- und Fluorescein-markierter RNA-Sonden

Zur Synthese Dig- bzw Fluorescein markierter sense bzw. antisense RNA-Sonden wurde das Ausgangsplasmid zunächst vollständig mit entsprechenden Restriktionsenzymen linearisiert. Zur Aufreinigung des geschnittenen Plasmids folgte eine Chloroformextraktion mit anschließender Ethanol-Fällung. Die präzipitierte DNA wurde in 20µl DEPC-H20 gelöst. Die Konzentration der gelösten DNA wurde anhand ihrer opischen Dichte (OD 260nm; Ultraspec 1100 pro, Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt. Die in vitro Transkription verlief in folgendem Reaktionsansatz: 1 µg DNA + 2 µl 10 x Transkriptionspuffer + 5 µl 40 mM DTT + 1 µl RNAsin + 2 µl 10 x RNA Labeling Mix + 1,5 µl RNA-Polymerase ad 20 µl DEPC-H2O. Dieser Ansatz wurde für 3 h bei 37 oC inkubiert. Nach erneuter Zugabe von 1 µl RNA-Polymerase erfolgte eine weitere Inkubationsphase über Nacht. Zum Abbau der DNA Matrize wurde 1 µl DNAse zum Ansatz gegeben. Diese Reaktion erfolgte in 15 – 20 min bei 37 oC. Zur Fällung der gewonnenen RNA wurden 2,4 µl 4 M LiCl; 2 µl 0,5 M EDTA und 65 µl Ethanol zum Ansatz gegeben. Nach Waschen der RNA in 70% igem Ethanol wurde das entstandene Pellet getrocknet und in 100 µl DEPC- H2O gelöst. Sonden mit einer Länge von ≥ 300 Nukleotiden wurden einer alkalischen Hydrolyse unterzogen, um ca. 0,3 kb Fragmente zu erhalten. Hierzu wurden zu 100 µl RNA 100 µl Hydrolysepuffer (40 mM NaHCO3, 60 mM Na2CO3) gegeben, anschließend wurde dieser Ansatz für eine definierte Zeit bei 65 oC inkubiert. Die Dauer der Hydrolyse wurde nach folgender Formel berechnet: (Sondenlänge in kb – 0,3 kb) / (Sondenlänge in kb x 0,3 x 0,11). Nach Ablauf der Reaktion erfolgte die Neutralisation des Ansatzes mit 100 µl 0,1 N HCl. cRNA-Sonden wurden bei –70 oC gelagert.

2.8.3 Versuchstiere

C57BL/6 Mäuse wurden von Charles River Laboratories (Deutschland GmbH) bezogen. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen (12 h : 12 h / Hell-Dunkel Zyklus - 6 Uhr Licht an; Raumtemperatur: 21 ± 2 oC, Luftfeuchtigkeit 50 - 55 %) bei freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Tötung der Tiere erfolgte durch eine intraperitoneale Injektion von Chloralhydrat zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung: E16, P1, P5, P14, P21, 2 - 3 Monate und adult. Embryonen wurden trächtigen Mäusen entnommen, welche nach der Operation getötet wurden.

2.8.4 Präparation von Hirnschnitten

Mäuse verschiedener Entwicklungsstadien wurden dekapitiert. Während zum Zeitpunkt E16 der gesamte Kopf für weitere Schritte tiefgefroren wurde, wurde bei älteren Tieren das Hirn frei präpariert und entnommen. Präparierte Gehirne wurden in - 40 oC kaltem 2-Methylbutan tiefgefroren (Lagerung bei - 20 oC). 14 µm dicke Schnitte der Präparate wurden in einem


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motorisiertem Crystat (Leica, Wetzlar) angefertigt und auf Sialin-beschichtete Objekträger gezogen. Diese Schnitte wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -70 oC tiefgefroren.

2.8.5 konventionelle ISH: Alkalische Phosphatase (AP)-Färbung Fixierlösung 4 % Parformaldehyd in PBS, pH7,2 P1-Dig 0,1 M Tris-HCl; 0,15 M NaCl; pH 7,5 P3-Dig 0,1 M Tris-HCl; 0,1 M NaCl; 50 mM MgCl2; pH 9,5 P4-Dig 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 8,0 MBM 0,1 M Tris-HCl; 0,15 M NaCl, 1% Blocking Reagent;

0,5 % BSA Prähybridisierunspuffer 2,5 x Denhardt´s Lösung; 25 mM EDTA;

50 mM Tris-HCl pH 7,6;0,25 mg / ml Hefe tRNA; 20 mM NaCl, 50 % Formamid

Hybridisierungspuffer 20 mM Tris-HCl pH7,5; 1 mM EDTA, 1 x Denhardt´s Lösung, 0,5 mg / ml Hefe tRNA; 0,1 mg/ml Poly A; 0,33 M NaCl, 0,1 M Dithiothreitol (DTT); 10 % Dextran-Sulfat; 50 % Formamid

Entwicklungspuffer 0,34 mg /ml 4-Nitroblue Tetrazoliumchlorid (NBT); 0,175 mg / ml 5-Bromo-4-Chloro-3-indolylphosphat, (BCIP); 0,25 mg / ml Levamisol (Sigma) in P3-Dig

Die Prozessierung hergestellter Gewebeschnitte erfolgte nach einem Protokoll von Montag-Sallaz et al. (Montag-Sallaz et al 1999). Präparate wurden für mind. 30 min bei 4 oC fixiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS und 5minütiger Inkubation in 70 %igem Alkohol wurden die Schnitte zweimal in H2O gewaschen und zur Permeabilisierung der Membranen für 5 min in 0,1 M HCl inkubiert. Eine Neutralisation erfolgte durch Waschen der Präparate in PBS, bevor sich eine 20minütige Inkubation in 0,25 % Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin, pH 8,0 anschloß. Nach weiteren Waschschritten in PBS erfolgte die Dehydrierung der Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 80 %, 95 %iger Alkohol). Dehydrierte Schnitte wurden getrocknet, bevor mit der Prähybridisierung begonnen wurde. Hierzu wurden die Schnitte für 3 h im Prähybridisierungspuffer bei 37 oC inkubiert. Anschließend erfolgte die Hybridisierung mit spezifischen Dig-markierten RNA-Sonden bei 55 oC über Nacht. Zur Entfernung unspezifischer Bindungen wurden die Objektträger 2 x 30 min in vorgewärmten 0,2 SSC bei 55 oC gewaschen. Anschließend folgten drei Waschschritte in vorgewärmtem 0,1 SSC / 50 % Formamid (90 min, 55 oC). Zur Vorbereitung auf die Antikörper-Applikation wurden die Schnitte abschließend für 10 min in 0,2 SSC und 10 min in P1-Dig bei RT gewaschen. Präparate wurden 30 min in MBM blockiert und über Nacht bei 4 oC mit Anti-Dig Fab Fragmenten inkubiert. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen in P1-Dig entfernt. In Vorbereitung auf die Signalentwicklung wurden die Schnitte in P3-Dig gewaschen und für die anschließende Enzymreaktion im Dunkeln unter Zugabe des Entwicklungspuffers inkubiert. Gestoppt wurde diese Reaktion durch Waschen der Objektträger in P4-Dig. Für weitere Analysen wurden die Präparate in Fluoromount eingebettet und eingedeckelt.


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2.8.6 Fluoreszenz ISH (FISH)

FIS-Hybridisierungen wurden unter Anwendung des TSA™ Cyanine3 bzw. Fluorescein Systems durchgeführt. Bis zur Hybridisierung wurden die Präparate wie im o.g. Protokoll prozessiert. Für Doppelmarkierungen wurde eine Mischung Dig- und Fluorescein markierter RNA-Sonden (kodierend für verschiedene Moleküle) zur Hybridisierung auf die Schnitte gegeben. Nach Waschungen in SSC erfolgte das Abbinden endogener Peroxidase-Aktivitäten in 2 % H2O2 in PBS. Nach Blockierung der Schnitte in MBM erfolgte die sequentielle Detektion der applizierten RNA-Sonden. Hierzu wurden die Schnitte zunächst mit Fab-Fragmenten des Meerettichperoxidase (HRP) gekoppelten Antikörpers anti-DIG inkubiert (4 oC, über Nacht). Nach Waschen in P1-Dig erfolgte die Signalentwicklung unter Anwendung des TSATM - Systems (Cyanine3 Substrat Kit). Die Enzymreaktion wurde nach 3 – 10 min durch Waschen in P1-Dig gestoppt. Zur Entwicklung des zweiten Signals wurden restliche Peroxidase Aktivitäten in 2 % H2O2 in PBS unterbunden, bevor eine Inkubation mit Fab Fragmente des anti-Fluorescein-HRP erfolgte (4 oC, über Nacht). Die anschließende HRP vermittelte Signalentwicklung erfolgte unter Anwendung des Fluorescein Substrat Kits. Nach Abstoppen der Enzymreaktion wurden die Präparate für weitere Analysen in Vectashield mit DAPI (Vector Laboratories, Inc. Burlingame) eingebettet und eingedeckelt. Zur Detektion geringer mRNA-Mengen wurden Biotin-markierte Antikörper und das Streptavidin-HRP System (TSA Kit) genutzt.

2.9 Protein-Protein Interaktionsstudien

Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Identifizierung intrazellulärer Interaktionspartner von Zellerkennungsmolekülen der L1-Familie. Trotz hoher Homologien auf cytoplasmatischer Seite, besitzt NrCAM als einziges L1-Familienmitglied C-terminal ein charakteristisches PDZ-Bindungsmotif (-SFV). Da bekannt ist, dass PDZ-Domänen beinhaltende Proteine ähnlich wie NrCAM am Aufbau spezialisierter Membranstrukturen beteiligt sind, wurden verschiedene Techniken (Hefe-Zwei-Hybrid System, Expression in heterologen Zellen, Proteinbiochemische Analysen) genutzt, um mögliche Interaktionen zwischen NrCAM und PDZ-Domänen membranassozierter Proteine zu untersuchen. Putative intrazelluläre Interaktionspartner von CHL1 wurden über den Screen einer Ratten cDNA-Bank unter Anwendung des Hefe-Zwei-Hybrid Systems isoliert.


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2.9.1 Hefe-Zwei-Hybrid System

Hefe-Zwei-Hybrid Studien wurden unter Anwendung des MATCHMAKER Two-Hybrid Systems (Clontech / BD Biosciences, Heidelberg) durchgeführt. Die Hefestämme AH109 und Y187 sowie ein Aliquot der pACT2-Rattenhirn-cDNA-Bibliothek wurden von Dr. M. Kreutz zur Verfügung gestellt. Weitere Komponenten wie Vektoren und Medien wurden von der Firma Clontech bezogen. Nähere Angaben können in entsprechenden Handbüchern gefunden werden.

2.9.1.1 Klonierung von bait - und prey - Konstrukten

bait-Konstrukte (Vektor pGBKT7) kodierend für die intrazelluläre Domäne von CHL1, L1, Neurofascin und NrCAM wurden von Dr. I. Schön zur Verfügung gestellt. Prey-Konstrukte kodierend für verschiedene PDZ-Domänen der MAGUKs SAP97 und SAP90 wurden von Dr. U. Thomas zur Verfügung gestellt. Ein ProSAP2 bait-Konstrukt kodierend für die PDZ-Domäne des Moleküls (zur Verfügung gestellt von Prof. Dr T. Boeckers) wurde in den entsprechenden prey-Vektor (pACT2) umkloniert. cDNA-Fragmente kodierend für die PDZ-Domänen 1-3 der MAGUK ZO-1 wurden mittels PCR amplifiziert und entsprechend ihres Leserahmens in den prey-Vektor pGADT7 subkloniert.

2.9.1.2 Herstellung chemisch kompetenter Hefen und Transformation 10 x LiAc 1 M Lithiumacetat in H2O, pH 7,5, sterilfiltriert 10 x TE 0,1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA PEG/TE/LiAc 1 x TE, 1 x LiAc, 40 % Polyethylenglykol carrier-DNA 10 mg / ml Heringssperma DNA DTT-Stammlösung 100 mM in H2O, sterilfitriert

Zur Herstellung chemisch kompetenter Hefen wurden zunächst 50 ml YPD Medium mit dem entsprechenden Hefestamm angeimpft und über Nacht bei 300 rpm und 30 oC kultiviert. Nach Zentrifugation (500 x g, 5 min, RT) und Resuspension der Zellen in 50 ml frischem Medium erfolgte eine weitere ca. dreistündige Inkubation bei 300 rpm und 30 oC. Nach zwei Waschschritten in 1 x TE und 1 x TE/LiAc wurden die kompetenten Zellen in 1,5 ml 1 x TE/LiAc aufgenommen. Zur Transformation wurden 75 µg carrier-DNA, versetzt mit 0,5 µg Plasmid-DNA, zu 50 µl kompetenten Hefen gegeben. Nach Zugabe von 300 µl PEG/TE/LiAc wurde dieser Ansatz 30 min bei 30 oC inkubiert. Es folgte ein 20 minütiger Hitzeschock bei 42 oC und Abkühlen der Zellen auf Eis, bevor die Zellen geerntet (500 x g, 5 min) und in 200 – 300 µl Wasser aufgenommen wurden. Abschließend wurden bis zu 100 µl der transformierten Zellen auf entsprechenden Selektionsplatten ausgestrichen und ca. 3 Tage bei 30 oC inkubiert. Bait- und prey-Konstrukte wurden hierbei unabhängig voneinander in die Hefestämme Y187 bzw. AH109 transformiert.


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2.9.1.3 Herstellung elektrokompetenter Hefen und Elektroporation

Aufgrund der erhöhten Transformationseffizienz wurden Hefen zum Screen einer Rattenhirn cDNA-Bibliothek elektroporiert. Hierzu wurden 50 ml Selektionsmedium (-W) mit Hefen, welche zuvor mit dem erforderlichen bait-Konstrukt chemisch transformiert wurden, angeimpft und bei 30 oC, 300 rpm inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Hauptkultur (ca. 250 – 300 ml Selektionsmedium) mit der Übernachtkultur auf eine optische Diche von 0,3 OD600 gebracht und bis auf eine Dichte von 1,2 –1,5 OD600 kultiviert (30 oC, 250 rpm). Die Hefen wurden geerntet (500 x g, 5 min) und das Zellpellet zweimal in eiskaltem Wasser gewaschen. Anschließend wurde das Hefepellet in 50 ml eiskaltem 1 M Sorbitol gewaschen, erneut zentrifugiert und in 20 ml LiAc/DTT-Lösung resuspendiert. Diese Suspension wurde 30 min bei 30 oC unter Schütteln inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren der Hefen wurde das Pellet erneut in 50 ml 1M Sorbitol gewaschen. Abschließend wurden die elektrokompetenten Hefen in ca. 100 µl Sorbitol aufgenommen. Zur Elektroporation wurden 300µl der kompetenten Zellen zu 1µg Plasmid-DNA gegeben, durchmischt und 5 min auf Eis inkubiert. Dieser Ansatz wurde in eine eiskalte 0,2 cm Küvette überführt und mit 1,5 – 2,5 kV, 200 Ω und 25 µF elektroporiert. Nach der Elektroporation wurden die Hefen sofort in vorgewärmtem YPDA-Medium aufgenommen und in ein 2 ml Reaktionsgefäss überführt. Es folgte eine einstündige Inkubation bei 30 oC, 1200 rpm. Transformierte Hefen wurden in einem Verhältnis 1 : 5 verdünnt und auf Selektionsplatten (-ALWH, SD-Dropout-Medium) ausplattiert. Die Platten wurden für ca. eine Woche bei 30 oC inkubiert. Hefen mit Reportergen vermittelten Interaktionsphänotyp wurden im ß-Galactosidaseassay (2.9.1.6) auf einen LacZ+ Phänotyp untersucht und über Retransformationsversuche verifiziert.

2.9.1.4 Mating

Doppelt transformierte Hefen wurden neben Kotransformationen über die Verschmelzung (mating) von Hefezellen gewonnen. Hierzu wurden 0,5 ml YPD Medium mit jeweils einer Kolonie transformierter Y187 und AH109 Hefen angeimpft, durchmischt und bei 250 rpm, 30 oC über Nacht kultiviert. Ein Aliquot dieser Mating-Kultur wurde für die Selektion diploider Zellen auf –LW Platten, ein weiteres Aliquot auf entsprechende Selektionsplatten plattiert und für 3 - 5 Tage bei 30 oC inkubiert.


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2.9.1.5 Plasmidpräparationen aus der Hefe Lysispuffer 200 mM NaOH, 1 % SDS Phenol-Chloroform-Lösung Phenol-Chloroform-Isoamyalkohol (25:24:1) Plasmide wurden aus drei Tage alten 10 ml Kulturen isoliert. Hierzu wurden die Hefen zunächst abzentrifugiert (500 x g, 5 min). Zum Pellet wurden 200 µl Lysispuffer, 200 µl Glasperlen (Glass beads , 425-600 microns, Sigma) und 200 µl Phenol-Chloroform-Lösung gegeben. Nach gutem Durchmischen dieses Ansatzes (1 min Vortex) und anschließender Zentrifugation wurden 150 µl der wässrigen Phase zur Plasmidfällung entnommen. Eine DNA-Fällung erfolgte bei RT (5 min) unter Zusatz von 15 µl 3 M NaAc (pH 5,2) und 450 µl Isopropanol. Die DNA wurde abzentrifugiert (14000 rpm, 5 min), mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl 1mM Tris, pH 7,0 aufgenommen. Zur Aufreinigung von prey-Plasmiden wurde die gewonnene Plasmidmischung zur Elektroporation von E. coli XL1-blue MRF´ eingesetzt. E. coli Transformanten wurden anhand der eingebrachten Ampicillin-Resistenz selektioniert.

2.9.1.6 Identifizierung positiver Protein-Protein Interaktionen Z-Puffer 16,1 g Na2HPO4 . 7 H2O, 5,5 g NaH2PO4 . H2O, 0,75 g KCl,

0,246 g MgSO4. 7 H2O ad 1000 ml H2O, pH 7,0 Detektionslösung 100 ml Z-Puffer, 0,27 ml ß-Mercaptoethanol,

0,8 ml X-Gal Stocklösung Positive Klone wurden anhand ihres His+ und LacZ+ Phänotyps identifiziert. Hierzu wurden kotransformierte Hefen zum einen auf entsprechende Selektionsplattern (-LWH, -ALWH) ausgestrichen, zum anderen einem ß-Galactosidaseassay unterzogen. Zum Nachweis der ß-Galactosidase Aktivität wurden Kolonien frischer Hefekulturen von Selektionsplatten auf Filterpapier (Whatman® International Ltd., Maidstone, England) übertragen. Um anheftende Hefen aufzubrechen, wurde das Filterpapier für ca. 10 s in flüssigen Stickstoff gehalten. Nach kurzem Auftauen wurde der Filter mit der hefetragenden Seite nach oben auf einen zweiten Filter gelegt, der zuvor mit der Detektionslösung getränkt wurde. Während einer Inkubation von 1 – 8 Stunden bei 30 oC wurden ungefähr stündlich auftretende Blaufärbungen kontrolliert.


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2.9.2 Zellkultur

2.9.2.1 Materialien für die Zellkultur 10 x Trypsin / EDTA Invitrogen, Karlsruhe ChamberSlides, Lab Tek Nunc, Wiesbaden Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen, Karlsruhe Fötales Kälberserum (FKS) Invitrogen, Karlsruhe Ham´s F12 Invitrogen, Karlsruhe Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen, Karlsruhe L-Glutamin Invitrogen, Karlsruhe Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) Invitrogen, Karlsruhe Zellkultur-Flaschen Nunc, Wiesbaden

2.9.2.2 Klonierung von Expressionskonstrukten

Oligonukleotide Flag-sense: TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG CCG

Flag-anti: CGG CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA

Sämtliche in dieser Arbeit eingesetzten SAP97 - Konstrukte lagen im pEGFP-C1 Vektor vor und wurden von Dr. U. Thomas zur Verfügung gestellt. Eine nähere Beschreibung dieser Konstrukte kann unter Wu et al. (Wu et al 1998) gefunden werden (s. a. Ergebnisse, Abb. 10). Da zu Beginn der Zellkulturarbeiten kein geeigneter NrCAM-Antikörper zum Nachweis einer erfolgreichen Transfektion vorlag, wurde das Wildtyp-NrCAM mit einem Flag-Epitop versehen. Kommerziell erwerbliche Vektoren waren für diesen Ansatz nicht geeignet, da ein C-terminales FLAG-Epitop eine mögliche Bindung zu SAP97 verhindert hätte. Ein N-terminal lokalisiertes Epitop wäre bei der Prozessierung des Proteins mit der Signalsequenz abgespalten worden und hätte somit nichts über die zelluläre Lokalisation von NrCAM ausgesagt. Aus den genannten Gründen wurde ein FLAG-Epitop in eine singuläre Eco RV Restriktionsschnittstelle, lokalisiert zwischen fünftem FN-III repeat und Transmembrandomäne, eingefügt (Ausgangsplasmid: Accesion-Nr. AJ543321, schematische Darstellung s. Ergebnisse Abb. 10). Hierzu wurden Oligonukleotide kodierend für das Flag-Epitop (DYKDDDDK) von der Firma MWG Biotech bezogen. Die lyophylisiert gelieferten Nukleotide wurden unter Zugabe von H20 auf eine Endkonzentration von 100 pmol / ml eingestellt. 30 µl der sense- und antisense Probe wurden zur Hybridisierung miteinander gemischt und auf eine Temperatur von ca. 96 oC erhitzt. Nach ca. 3 min wurde dieser Ansatz langsam wieder auf RT abgekühlt und anschließend sofort bei -20 oC tiefgefroren. 4 µg der hybridisierten DNA wurden zur Phosphorylierung der 5´Hydroxylenden unter Anwendung der T4-Polynukleotid Kinase eingesetzt. Zur Ligation in das linearisierte NrCAM-Plasmid wurden dann 100 bzw. 200 ng der phosphorylierten DNA eingesetzt. Minipräparationen wurden mit Hilfe einer speziellen PCR auf den Einbau des Epitops überprüft. Die Richtigkeit der Flag-Orientierung wurde über das Auftreten einer zusätzlichen PvuI Schnittstelle


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(eingebracht durch das Oligonukleotid) im Plasmid nachgewiesen. Abschließende Sequenzreaktionen dienten der Kontrolle eines fortlaufenden Leserahmens. Punktmutationen, welche der Zerstörung des C-terminalen PDZ-Bindungsmotivs (SFV → SFA) dienten, wurden unter Anwendung des Site-directed-Mutagenesis Kits (Primer: NrCAM.SFV SFA.for: GTC TTT AAG CTC TGT GCC AAT GTC, NrCAM.SFV SFA.rev: TTA AGC AAA GGA GTT CAT TGC GTT) durchgeführt.

2.9.2.3 Kultivierung von COS-7 Zelllinien Komplettmedium DMEM, 10 % FKS, 2 mM L-Glutamin, 1 % Pen-Strep Einfriermedium 90 % Komplettmedium, 10 % DMSO

COS-7 - Zellen wurden in Komplettmedium bei 37 oC, 5 % CO2 und 90 % H2O-gesättigter Luft kultiviert. 80 – 90 % konfluente Zellen wurden alle drei bis vier Tage passagiert. Nach einmaligem Waschen der Zellen in HBSS wurden die Zellen trypsinisiert und in einem Verhältnis von etwa 1:10 geteilt.

2.9.2.4 Transiente Transfektion

Zur transienten Transfektion von COS-7 - Zellen wurde das liposomale Transfektionsagens PolyFect (Qiagen, Hilden) eingesetzt. Der Transfektionsansatz wurde je nach Verwendungszweck in speziellen Poly-D-Lysin beschichteten Inkubationskammern (Immuncytochemie) bzw. in 10 cm Kulturschalen (Proteinbiochemie) durchgeführt. Die Fixierung bzw. Lyse der Zellen erfolgte jeweils ca. 48 h nach Transfektion.

2.10 Immuncytochemie Blockierpuffer 10 % Pferdeserum, 5 % Sucrose, 2 % BSA,

0,3 % TritonX - 100 (optional) gelöst in 1 x PBS Fixierlösung 8 % Paraformaldehyd in 1 x PBS (Lagerung bei -20 oC)

Zur Vorbereitung auf immuncytochemische Analysen wurden Zellen in speziell dafür vorgesehene Inkubationskammern (ChamberSlides) kultiviert. Nach einmaligem Waschen der Zellen mit PBS erfolgte die 20minütige Fixierung in 4 % Paraformaldehyd bei 37 oC. Die fixierten Zellen wurden mit PBS gewaschen und für 30 min blockiert. Die Inkubation mit dem Erstantikörper erfolgte über Nacht bei 4 oC. Nach Absaugen der Antikörperlösung wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, bevor die Inkubation mit dem Fluorezenz-markierten Zweitantikörper im Dunkeln (90 min, RT) erfolgte. Überschüssige Antikörper wurden durch mehrere Waschungen mit PBS entfernt bevor das Eindeckeln der Objekträger


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in Vectashield® mit DAPI erfolgte. Sollte ein Clustering von Zellerkennungsmolekülen an der Zelloberfläche erreicht werden, wurden die lebenden Zellen für 1 Stunde mit dem Erstantikörper (1:1500 in Komplettmedium) inkubiert, bevor die Fixierung und nachfolgende Schritte erfolgten.

2.11 Mikroskopie

Lichtmikroskopische Aufnahmen erfolgten an einem Zeiss Axioskop Mikroskop, ausgerüstet mit einem Neurolucida-System (BioMetric Systems). Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen erfolgten an einem Leica DM RXE Mikroskop, ausgestattet mit einer Spot RT cooled CCD Kamera (Visitron Systems, Puchheim). Digitale Bilder wurden unter Anwendung der Meta View Software (Visitron Systems) erstellt. Ein Leica TSC4D Mikroskop diente der konfokal mikroskopischen Auswertung.

2.12 Proteinbiochemische Methoden

2.12.1 Präzipitationsassay Lysispuffer 1 50mM Tris, pH 8,0; 150mM NaCl; 5mM EDTA;

1 % NP-40; 0,5 % Na-Deoxycholat; 0,1 % SDS Lysispuffer 2 20 mM Tris, pH 7,2; 150 mM NaCl; 1mM EDTA; pH 7,0;

1mM EGTA; pH 7,0; 0,5 % Triton TX-100 Proteininhibitoren 1µg/ml TEW;10µg/ml SBTI; 1mM PMSF; 0,5 mM IAA

Interaktionen zwischen NrCAM und PDZ-Domänen der MAGUKs SAP97 und PSD95 wurden abschließend auf proteinbiochemischen Wege verifiziert. Hierzu sollte heterolog exprimiertes SAP97 aus COS-Zelllysaten bzw. endogen exprimiertes Protein aus Maushirnlysaten präzipitiert werden. Zur Präzipitation eingesetzte Sepharose beads wurden mit den letzten 12 AS des NrCAM C-Terminus (funktionelles PDZ-Bindungsmotiv: APSPVNAMNSFV-COOH, Negativkontrolle: APSPVNAMNSFV-CONH2) gekoppelt (Pineda Antikörper-Service, Berlin). COS-7 Zellen wurden in 10 cm Kulturschalen ausplattiert und transient mit SAP97 Konstrukten transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und geerntet (Zentrifugation 800 rpm, 5 min). Das Zellpellet wurde in 500µl eiskaltem Lysispuffer + Proteininhibitoren aufgenommen und für 15 min auf Eis inkubiert. Zur Herstellung von Hirnlysaten wurden Gehirne adulter Mäuse präpariert und in der Sagittalebene geteilt. Ein halbes Gehirn wurde in 2 ml eiskalten Lysispuffer + Proteininhibitoren überführt und mit dem Ultra Turrax (IKA Labortechnik, Staufen) homogenisiert. Homogenate wurden anschließend für 1 h bei 4 oC unter starkem Schütteln inkubiert. Unlösliche Bestandteile der COS-Zell bzw. Hirnlysate wurden durch eine


30

30minütige Zentrifugation bei 14000 rpm und 4 oC getrennt (P1). Zu 500 µl Lysat (Ü1) wurden 25 µl der Peptid-gekoppelte Sepharose beads gegeben. Es folgte eine 3 – 12 stündige Inkubation unter ständigem Rotieren bei 4 oC. Sepharose beads wurden pelletiert (5 min, 1000 rpm, 4 oC) und der Überstand gesammelt (Ü2). Abschließend wurden beads dreimal mit eiskaltem Lysispuffer gewaschen und in 50 µl 2 x SDS-Probenpuffer aufgenommen. Gebundene Proteine wurden durch Kochen der Proben (~ 100 oC, 10 min) eluiert. Die Überstande 1 und 2 wurden lyophylisiert und in einem Endvolumen von 50 (COS-Zellen) bzw 250 µl (Hirnpräparation) 2 x SDS-Probenpuffer gelöst. Proteine der einzelnen Fraktionen wurden anschließend elektrophoretisch getrennt und im Western-Blot Verfahren analysiert.

2.12.2 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 2 x SDS Probenpuffer 135 mM Tris, pH 6,8; 4 % SDS; 20 % Glycerin;

10 % 2-Mercaptoethanol; 0,016 % Bromphenolblau 10 x SDS Laufpuffer 0,25 M Tris, 1,92 M Glycin, 1 % SDS

Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte unter denaturierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE nach der Methode von Lämmli (Lämmli 1970). Die zu analysierenden Proben wurden im Verhältnis von 1:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 min gekocht. 20-25 µl der aufgearbeiteten Proben wurden auf das Sammelgel (5%) aufgetragen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in einem 8 %igem Trenngel bei einer konstanten Stromstärke von 25 mA / Gel und einer maximalen Spannung von 250 V (BioRad-System, München).

2.12.3 Western-Blotting und Immundetektion Blotpuffer 25 mM Tris; 192 mM Glycin; 20 % Methanol Ponceau S 0,2 % Ponceau S; 3 % Trichloroacetic Acid (TCA) TBS-T 0,5 % Tween 20 in1 x TBS

SDS-Gele wurden nach der elektrophoretischen Auftrennung 20 min in Blotpuffer equilibriert. Der Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Membran erfolgte in Blotpuffer für 1 h (4 oC) bei einer konstanten Spannung von 100 V und einer maximalen Stromstärke von 350 mA (Trans-Blot-Cell; BioRad, München). Der Erfolg des Blotvorgangs wurde durch Färbung der Nitrocellulose-Membran in Ponceau S kontrolliert. Zur Proteindetektion wurde der Blot zunächst für 1 h in TBS-T + 5 % Magermilchpulver blockiert. Die zur Anwendung kommenden Antikörper wurden in der gleichen Blockierlösung verdünnt. Die Inkubation mit dem Erstantikörper erfolgte über Nacht bei 4 oC. Nach dreimaligem Waschen in TBS-T wurde der Blot für eine Stunde mit dem entsprechenden Zweitantikörper inkubiert. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen in TBS-T entfernt. Nach einem letzten Waschschritt in TBS wurde der Blot für die Signalentwicklung vorbereitet. Die


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Antigendetektion erfolgte hierbei indirekt über die an den Zweitantikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase unter Anwendung des ECL-Detektionssystem (Amersham Life Science). Nach 60 sec Enzymreaktion wurde das Signal durch Exposition der Nitrocellulose-Membran auf sensitive Filme (HyperFilm, Amersham Life Science) und anschließender Filmentwicklung (Entwicklungsmaschine Curix 60, Agfa, Leverkusen) sichtbar gemacht.

2.12.4 Strippen eines Western-Blots Strip-Puffer 0,2 M Glycin, 0,1 % SDS, 1,0 % Tween 20, pH 2,2

Sollten Western Blots sequentiell mit verschiedenen Antikörpern aus der selben Spezies analysiert werden, wurden Erst- und Zweitantikörper durch mehrmaliges Waschen (2 x 60 min, 1 x 10 min) in Strip-Puffer entfernt. Eine Neutralisation erfolgte durch 4 x 5 min waschen in TBS-T. Anschließend wurde der Blot blockiert und mit dem nächsten Antikörper inkubiert. Weitere Schritte folgten dem o.g. Protokoll (2.12.3).

2.13 Klonierung eines Neurofascin Targeting-Konstrukts

2.13.1 Screen einer genomischen Bank

2.13.1.1 Design einer cDNA-Sonde

Zur Isolierung eines genomischen Klones kodierend für die 5´Region des Neurofascin-Gens wurde eine genomische Bank (129Sv, (Muller et al 1994) mittels Hybridisierung gescreent. Die zum Screen eingesetzte cDNA-Sonde sollte auf genomischer Ebene nicht mehr als ca. 10 kb umfassen. Um Aussagen über die Exon/Intron Struktur des Neurofascin-Gens der Maus treffen zu können, wurden Vergleiche anhand genomischer Sequenzen des Huhns (Hassel et al 1997) und des Menschen (vorausgesagt über einen Abgleich der vorliegenden full-length cDNA-Sequenz mit öffentlich zugänglichen Datenbanken) aufgestellt. Auf der Grundlage dieser Sequenzvergleiche wurde ein SmaI 70 / NcoI 830 – Fragment (Ausgangsplasmid: Accession Nr. AJ543322) kodierend für 135 Nukleotide der 5úntranslatierten Region sowie den Exonen 2 - 4 als Sonde für Hybridisierungen gewählt.


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2.13.1.2 Vermehrung der Lambda-Phagen

Zur Vermehrung von Lamda Phagen wurde der Bakterienstamm LE392 als Wirtsorganismus eingesetzt. Zur Herstellung phagensensitiver Bakterien wurden zunächst 3 ml LB-Medium mit LE392 angeimpft und über Nacht bei 37 oC und ca. 250 rpm kultiviert. 200 µl dieser Übernachtkultur wurden in 10 ml LB-Medium, 1 % Maltose, 10 mM MgSO4 überführt und bis zum Erreichen einer OD600 von ca. 0,4 weiter kultiviert. Anschließend wurden die Zellen bei 3500 rpm zentrifugiert, mit 10 mM MgSO4 gewaschen und nach erneuter Zentrifugation in 1 ml 10 mM MgSO4 resuspensiert. Zur Titerbestimmung der Phagen wurden verschiedene Verdünnungen der genomischen Bank in SM-Puffer angesetzt. 100 µl der einzelnen Verdünnungen wurden mit 100 µl phagensensitiven Bakterien gemischt, in 3 ml Weichagar, 1 % Maltose, 10 mM MgSO4 aufgenommen, auf vorgewärmte 85 mm NZYDT-Platten geschichtet und über Nacht bei 37 oC kultviert. Zum Screen wurden schließlich 50 µl einer 10-4 verdünnten Phagenlösung (resultierend in 3 – 5 x 104 Plaques / Platte, was einer 3-4 fachen Repräsentation des Genoms entspricht) mit 100 µl sensitiven Bakterien gemischt, in 9 ml Weichagar, 1 % Maltose, 10 mM MgSO4 aufgenommen und auf 140 mm Kulturplatten ausplattiert. Positve Plaques (Identifizierung s. 2.13.1.3) wurden in 1 ml SM-Puffer überführt und bei 4 oC über Nacht inkubiert. 10-2, 10-3 und 10-4 Verdünnungen dieser Lysate wurden dann auf 85 mm NZYDT-Platten ausgestrichen und einem erneuten Screen unterzogen. Auf diese Weise wurden positive Phagen vereinzelt, welche abschließend zur Isolation der genomischen DNA eingesetzt wurden.

2.13.1.3 Identifizeriung positiver Plaques mittels Hybridisierung Hybridisierungspuffer 5 x Denhardt, 5 x SSC, 0,02 % SDS, 50 % Formamid

Zur Identifizierung positiver Kolonien wurden Duplikate der Kulturplatten auf Hybond NX Filter gezogen. Durch Einstechen asymmetrisch angeordneter Markierungspunkte wurde die Position des Filters festgehalten. Anschließend erfolgte eine ca. 2minütige Denaturierung in 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl. Hierzu wurden die Filter mit der zelltragenden Seite nach oben auf Whatman Filterpapier gelegt, welches zuvor mit Denaturierungspuffer getränkt wurde. Nach einer Neutralisation in 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl; pH 7,5 wurden die Filter in 2 x SSC gewaschen, wobei versucht wurde, verbleibende Zellreste zu entfernen. Die Filter wurden auf Whatman-Papier getrocknet und für ca. 2 h bei 80 oC gebacken. Es folgte die 30minütige Prähybridisierung der Filter in 20 ml Hybridisierungspuffer + 40 µl Herings-DNA (10 mg / ml) bei 42 oC. Währenddessen wurde die zur Hybridisierung eingesetzte, radioaktiv markierte Sonde mit dem High Prime DNA Labeling Kit laut Herstellerangaben synthetisiert. Nicht eingebaute Nukleotide wurden mit dem Qiaquick Nukleotid Removal Kit entfernt. Die markierte Sonde wurde in 5 ml Hybridisierungslösung aufgenommen, 10 min bei 100 oC


33

gekocht und auf Eis abgekühlt. Die Hybridisierung der Blots erfolgte unter stringenten Bedingungen über Nacht bei 65 oC. Zur Entfernung unspezifisch gebundener Sonden wurden die Blots zunächst in 2 x SSC, 0,1 % SDS, dann in 1 x SSC, 0,1 % SDS und abschließend in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS gewaschen. Blots wurden in Filmkassetten mit Verstärkerfolien auf BioMax-MS™-Filmen (Kodak, Rochester, NY, USA) bei –70 oC exponiert, bevor die maschinelle Entwicklung der Signale erfolgte (Curix 60, Agfa, Leverkusen).

2.13.1.4 Anfertigen von Plattenlysaten und Isolierung der Lambda-Phagen DNA L2 30 % PEG 6000; 3 M NaCl L3 100 mM NacCl;100 mM Tris, pH 7,5; 25 mM EDTA L4 4 % SDS in H2O L5 3 M KAc, pH 5,5

Zur Anfertigung von Plattenlysaten wurden 100 µl phagensensitiver Bakterien mit 100 µl unverdünnten bzw. 10-1 verdünnten Lysaten positiver Phagen gemischt, in 3 ml Weichagar 1 % Maltose, 10 mM MgSO4 überführt und auf 85 mm NZYDT-Platten geschichtet. Nach einer Kultivierung bei 37 oC über Nacht, wurden 5 ml SM-Puffer auf die Platten gegeben. Es folgte eine erneute Inkubationsphase bei 4 oC über Nacht, bevor das Lysat gesammelt, mit 250 µl Chloroform versetzt und bei 4 oC gelagert wurde. Eine weitere Anreicherung der Phagen erfolgte dann in Flüssigkultur. Hierzu wurde zunächst eine Übernachtkultur der Wirtsbakterien in 5 ml LB-Medium, 1 % Maltose angelegt. 2,5 ml dieser Übernachtkultur wurden dann mit 5 – 10 µl des Plattenlysats angeimpft und zur Adsorption der Phagen für 30 min bei 37 oC (ohne Schütteln!) inkubiert. Mit diesem Ansatz wurden 250 ml LB-Medium, 10 mM MgSO4 angeimpft und über 5 – 7 h bei 37 oC, 180 rpm bis zum Eintritt der sichtbaren Lyse inkubiert. Unter Zugabe von Chloroform (2 %) wurde die Phagen-Kultur bei 4 oC bis zur DNA-Isolation gelagert. Die Präparation der Phagen-DNA erfolgte nach dem Protokoll der Firma QIAGEN über QIAGEN-tip 100 Säulen (QIAGEN Lambda Handbook 02/99). Anstelle des beschriebenen Puffers L1 wurden 1 ml RNAse (10 mg / 10ml) und 3 mg DNAseI zu 250 ml der Phagen-Kultur gegeben.

2.14 Southern-Blotting Hybridisierungslösung 5 x Denhardt, 5 x SSPE, 0,5 % SDS Heringssperma-DNA 10 mg / ml Prähybridisierungslösung 10 ml Hybridisierungslösung + 40µl Heringssperma-DNA

Die aus den Phagen isolierte genomische DNA wurde unter Anwendung der Southern-Blot-Technik hinsichtlich ihrer Identität überprüft. Hierzu wurde die DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten und mittels Gelelektrophorese in einem 0,7 %igem


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Agarosegel getrennt. Nach der Auftrennung wurde das Gel in 0,25 M HCl denaturiert (10 min), mit H2O gewaschen und in einer 0,4 M NaOH Lösung neutralisiert. Anschließend wurde die DNA durch Vakuumtransfer (15 Hg, 1 h; BioRad, München) auf eine Nylonmembran (Hybond ™-N+, Amersham, Mannheim) übertragen. Nach Waschen des Blots in 2 x SSC erfolgte die Hybridisierung mit α32P-dCTP markierten DNA-Sonden. Hierzu wurde der Blot vorbereitend für 30 min bei 65 oC prähybridisiert. Radioaktiv markierte Sonden wurden wie bereits beschrieben (2.13.1.3 oben) synthetisiert. Die anschließende Hybridisierung des Blots erfolgte über Nacht bei 65 oC. Zur Entfernung unspezifischer Bindungen wurden die Blots folgendermaßen bei 65 oC gewaschen: 2 x 30 min 2 SSPE, 0,1 % SDS; 30 min 1 x SSPE, 0,1 % SDS; 2 x 30 min 0,1 x SSPE, 0,1 % SDS. Die Signalentwicklung erfolgte wie unter 2.13.1.3 beschrieben.

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3 Ergebnisse 3.1 Screen einer cDNA-Bank

3.1.1 Isolierung von NrCAM und Neurofascin full-length Klonen

Verschiedene in dieser Arbeit gewählte Ansätze zur Charakterisierung neuronaler Zellerkennungsmoleküle der L1-Familie machten das Vorliegen der cDNA dieser Moleküle erforderlich. Full-length Klone kodierend für L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin wurden über den PCR-Screen einer adulten Maushirn cDNA-Bank isoliert. Da bis heute murine cDNA-Sequenzen von NrCAM und Neurofascin nur unvollständig beschrieben sind, wurden gewonnene Klone ihrer vollen Länge nach sequenziert und hinsichtlich auftretender Spleißvarianten untersucht.

3.1.1.1 NrCAM: cDNA-Sequenz und Spleißvarianten Der Screen einer cDNA-Bank (Maushirn, adult) unter Anwendung degenerierter Primer, welche die für den intrazellulären Bereich von L1-Familienmitgliedern kodierende Region amplifizieren, führte zur Isolierung sieben unabhängiger NrCAM Klone mit Insert-Längen von ca. 3,5 - 4,6 kb. Das gesamte Insert des 4,6 kb Klons wurde sequenziert und unter der Accesion-Nr. AJ543321 in der EMBL-Datenbank hinterlegt. Die eingereichte Sequenz besitzt auf AS-Ebene 97 % Identität zum Ratten (Accession Nr. U81037) und 92 % Identität zum humanen Ortholog (Accession Nr AJ001057). Weitere isolierte Klone wurden mittels PCR und Sequenzreaktionen hinsichtlich des Auftretens alternativer Spleiß-Isoformen untersucht. Die Analyse der Daten zeigte unterschiedliche Regionen alternativen Spleißens innerhalb des Maus Moleküls. Ein Vergleich zu beschriebenen Isoformen des Ratten und des humanen Orthologen wies auf ähnliches Spleißen in den verschiedenen Spezies hin (Gegenüberstellung s. Abb. 2). Die an dieser Stelle genannten Exonangaben beziehen sich auf beschriebene Exon/Intron Anordnungen innerhalb des humanen NrCAM-Gens (Dry et al 2001), welche über einen Vergleich vorliegender cDNA-Sequenzen mit dem Mausgenom (Accession Nr. NW_000051.1) bestätigt wurden. Exon 5, kodierend für sechs AS am N-Terminus des Moleküls, unterliegt im Ratten Molekül alternativem Spleißen und wurde in keinem der isolierten Klone gefunden. Exon 10, kodierend für die zwischen zweiter und dritter Ig-Domäne lokalisierten AS VDELNDTIAANLSDTE, fehlt sowohl in einigen Isoformen der Ratte als auch des Menschen und wurde in allen untersuchten Klonen gefunden. Wang et al. (Wang et al 1998) beschreiben in humanen Isoformen von NrCAM das Spleißen eines Bereiches, kodierend für 10 AS (EIKDPTWIVK - human), welche zwischen der fünften und sechsten Ig-Domäne lokalisiert sind. Weder in der Ratte noch in den während dieser Arbeit isolierten Maus cDNA-Klonen wurde das Spleißen der entsprechenden Region gefunden. Die

Ergebnisse

36

betreffenden Bereiche wurden sowohl anhand humaner als auch muriner genomischer Sequenzen (Dry et al 2001, NW_000051.1) den Exonen 16 und 17, kodierend für den C-terminalen Bereich der fünften- bzw. den N-termialen Bereich der sechsten Ig-Domäne, zugeordnet (Abb. 2). Exon 19, kodierend für die zwischen Ig-Domänen und FN-III repeats lokalisierten AS APTPTPAPIY, fehlte, übereinstimmend zu Angaben publizierter Ratten- und Human-Sequenzen, in einem der isolierten Klone. Zwischen der vierten und fünften Fibronektin-Domäne wird das Spleißen kodierender Regionen für unterschiedliche Spezies beschrieben (Davis et al 1996; Lane et al 1996; Wang et al 1998). Die in dieser Arbeit untersuchten cDNA-Klone zeigten vergleichbar zu beschriebenen Ratten-Sequenzen (Davis et al 1996) kein Speißen des, die Aminosäuren QITEEAITTVDE kodierenden, Bereiches wie es für humane Isoformen gezeigt ist (Wang et al 1998). Auch diese Region konnte weder über den Abgleich mit humanen noch murinen genomischen Sequenzen einem eigenen Exon zugeordnet werden, sondern liegt auf Exon 27, welches für den C-terminalen Bereich des vierten FN-III repeats kodiert. Ein für die Aminosäuren GKK kodierender Bereich (lokalisiert auf Exon 27, fehlend in Accession Nr. AJ543321) wurde, wie für das Ratten-Ortholog beschrieben, in verschiedenen Klonen gefunden. Die dem Exon 28 entsprechende Sequenz, kodierend für 10 AS, welche N-terminal zum fünften FN-III repeat lokalisiert sind, wurde in allen untersuchten cDNA-Klonen der Maus gefunden. Die Präsenz einer fünften Fibronektin-Domäne wurde bis heute nur in vereinzelten Molekülen des Menschen sowie des Huhns beschrieben (Grumet et al 1991; Wang et al 1998). Die Exon 30 entsprechende Sequenz, kodierend für den C-terminalen Teil des fünften FN-III repeats, wurde in einem der isolierten Klone (Accession Nr. AJ543321) gefunden. Exon 29 entsprechende Sequenzen, kodierend für den N-terminalen Bereich dieser Domäne, lagen dagegen in keinem Klon vor. Die Exon 33 kodierte Sequenz für die cytoplasmatisch lokalisierte RSLE-Sequenz, wurde in verschiedenen Klonen gefunden. Abb. 2 gibt eine schematische Übersicht der durch alternatives Spleißen entstehenden NrCAM-Isoformen der Maus im Vergleich zu publizierten Isoformen aus Ratte und Mensch. Eine entsprechende Gegenüberstellung auf AS-Ebene ist im Anhang zu finden.

Ergebnisse

37

Abb. 2: Übersicht von NrCAM-Isoformen

Schematische Darstellung der NrCAM-Domänenstruktur (Accession Nr. AJ543321). Oben: Kodierende Bereiche genannter AS unterlagen alternativem Spleißen repräsentiert durch verschiedene Maus cDNA-Klone. Kodierende Bereiche für AS in Klammern wurden in keinem der Klone gefunden. Zahlen geben Exone an. Exonangaben in Klammern beschreiben das Auftreten alternativer Spleißerkennungssequenzen innerhalb dieser Bereiche. Unten: weitere Isoformen bekannt aus Orthologen der Ratte bzw. des Menschen.

3.1.1.2 Neurofascin: cDNA-Sequenz und Spleißvarianten Der unter gleichen Bedingungen wie für NrCAM durchgeführte cDNA-Bankenscreen führte zur Isolierung sechs unabhängiger Neurofascin-Klone mit Insert-Längen von 3,0 - 4,4 kb. Das 4,4 kb Insert wurde der vollen Länge nach sequenziert. Die cDNA-Sequenz kann unter der Accession Nr. AJ543322 in der EMBL-Datenbank eingesehen werden. Das Neurofascin Protein der Maus besitzt 98 % Identität zum Ratten (Accession Nr. U81035) und 97 % Identität zum humanen Ortholog (Accession Nr. XM_046808). Exonangaben beziehen sich auf die von Hassel et al (1997) publizierten Angaben zum Neurofascin-Gen des Huhns. Genomische Sequenzen sind in Bereichen des Neurofascin-Gens der Maus bisher nur unvollständig in öffentlichen Datenbanken hinterlegt, so dass eindeutige Aussagen zu Exon/Intron Anordnungen für diese Spezies nicht möglich waren. Da bis heute keine Isoformen des humanen Neurofascins beschrieben sind, beziehen sich nachfolgende Vergleiche auf publizierte Spleißvarianten der Ratten- und Huhn-Orthologen (Davis et al 1996; Hassel et al 1997). PCR und Sequenzdaten zeigten zwei, für verschiedene Isoformen kodierende cDNA-Klone auf. Exon 3, kodierend für 6 AS am N-Terminus des Moleküls, sowie Exon 17, kodierend für die Region zwischen sechster Ig-Domäne und erstem FN-III repeat, konnten in allen isolierten Klonen gefunden werden. Kodierende Bereiche für 17 AS zwischen zweiter und dritter Ig-Domäne (Exon 8), die gesamte dritte Fibronektin-Domäne (Exon 22 und 23) sowie das RSLE-Motiv (Exon 32) fehlten, übereinstimmend mit publizierten Isoformen der Ratte, in allen vorliegenden cDNA-Sequenzen. Alternatives Spleißen wurde ausschließlich für die Exone 26 - 29, welche für die Neurofascin-spezifische

NrCAM-Isoformen der Maus

(DPKLLD) APTPTPAPIY5 19

GKK(27) 29

fünfter FNIIIrepeat RSLE

33

VDELNDTIAANLSDTE EIK-DPTRIIK10 (16/17)

QITEEAITTVDE(27)

AGILPPDVGAGK28

weitere Isoformen in Ratte und Mensch

Ig Ig Ig Ig Ig Ig FNIII 1 FNIII 2 FNIII 3 FNIII4 FN/2

30

Ergebnisse

38

PAT-Domäne und den fünften FN-III repeat kodieren, beobachtet. Beide Sequenzbereiche sind in Accession Nr. AJ543322 vorhanden, fehlten jedoch gemeinsam in zwei der isolierten Neurofascin Klone. Eine Gegenüberstellung der AS-Sequenzen von Neurofascin-Orhologen aus Maus, Ratte und Mensch kann im Anhang gefunden werden.

Abb. 3: Übersicht von Neurofascin-Isoformen

Schematische Darstellung der Neurofascin-Domänenstruktur (Accession Nr. AJ543322). Oben: Kodierende Bereiche genannter AS unterliegen alternativem Spleißen repräsentiert durch verschiedene Maus cDNA-Klone. Kodierende Bereiche für AS bzw. Proteindomänen in Klammern wurden in keinem der Klone gefunden. Zahlen geben Exone (nach Hassel et al 1997) an. Unten: weitere Isoformen bekannt aus Orthologen der Ratte bzw. des Huhns

(KKPHNETSLRNHTDMYS)8

(dritter FNIII repeat)

22+23(RSLE)

33

PAT-Domäne +

fünfter FNIII repeat26 - 29

PSIQNE3 17

LADQATPTNRLAALP

Neurofascin-Isoformen der Maus

weitere Isoformen der Ratte und Huhn

Ig Ig Ig Ig Ig Ig FNIII 1 FNIII 2 FNIII 4 FNIII 5PAT

Ergebnisse

39

3.2 Vergleich der entwicklungsabhängigen mRNA-Expression der L1-

Familienmitglieder mittels in situ Hybridisierung

3.2.1 Konventionelle ISH - alkalische Phosphatase Färbung

Der Vergleich entwicklungsabhängiger Expressionsmuster von Mitgliedern der L1-Familie sollte Einblicke in das funktionelle Zusammenspiel dieser Molekülfamilie liefern. Während sich bereits verschiedene Arbeiten mit dem Expressionsverhalten einzelner Familienmitglieder insbesondere während der Embryonalentwicklung auseinandergesetzt haben, konzentrierte sich die vorliegende Studie auf einen Vergleich der postnatalen mRNA-Expressionsmuster der vier L1-Familienmitglieder. Unter Anwendung der konventionellen, nicht fluoreszenten ISH wurde zunächst ein allgemeiner Einblick in die entwicklungsabhängige mRNA-Expression von L1, CHL1, Neurofascin und NrCAM gewonnen. Die lichtmikroskopische Auswertung von sagittalen und frontalen (zur Verfügung gestellt von Dr. M. Montag-Sallaz) Hirnschnitten der Maus zeigte eine weit verbreitete mRNA-Expression der vier Moleküle während des gesamten untersuchten Zeitraumes (E15, P1, P5, P14, P21, adult). Neben überlappenden Expressionsmustern wurde insbesondere im Bulbus olfactorius (OB), dem Cerebellum und Hippocampus eine regionenspezifische und entwicklungsabhängige mRNA-Expression der einzelnen Moleküle detektiert. Sense-Sonden für L1, CHL1, NrCAm und Neurofascin dienten zur Kontrolle der Spezifität detektierter Signale und lieferten keine Färbungen in Sagittalschnitten der Maus. 3.2.1.1 L1 Eine erhöhtes Vorkommen von L1-Transkripten wurde vornehmlich während der frühen Entwicklung des Maushirns beobachtet. Die Expression erreichte ihr Maximum um den Tag P14 und nahm zum adulten Stadium (18 Monate) ab. Die räumliche Verteilung der L1-mRNA blieb zu allen untersuchten Zeitpunkten weitgehend unverändert. Im Bulbus olfactorius waren L1-Transkripte in verschiedenen Schichten neuronaler Zellen zu finden. Eine ausgeprägte Expression fand sowohl in einer limitierten Anzahl infraglomulärer Zellen als auch entlang der Mitralzellschicht statt (Abb. 4, A). In der granulären Schicht wurden ausschließlich unspezifische Signale detektiert, welche unter Anwendung der FISH nicht bestätigt wurden (s. 3.2.2.1, Abb. 6, A).

Ergebnisse

40

Abb. 4 Regionenspezifische Expression der L1-Familienmitglieder im ZNS der Maus

Lichtmikroskopische Aufnahmen von Frontal- (A-E) und Sagittalschnitten (E-L) des Maushirns nach Hybridisierung mit Digoxiginin-markierten L1- (A, E, I), CHL1- (B, F, J), NrCAM- (C, G, K) und Neurofascin- (D, H, L) -Sonden. Die L1-Familienmitglieder zeigen ein für das jeweilige Molekül charakteristisches Expressionsmuster im Bulbus olfactorius (A-D), Hippocampus (E-H) und Cerebellums (I-L). GO: Glomeruläre Schicht, EPL: äußere plexiforme Schicht, MCL: Mitralzellschicht, GL: Körnerzellschicht, CA1-CA3: Regionen des Ammonshorn, CA1-Grenzen in F und CA3 in G sind mit Pfeilen markiert, DG: Gyrus dentatus, äußere Zellschicht mit erhöhter L1- bzw. NrCAM-Expression sind in E und G mit Pfeilen markiert, HI: Hilus, SB: Subikulum, SO: Stratum oriens, SR: Stratum radiatum, F: Fimbria, HF: hippokampale Fissur, ML: Molekularschicht, WM: weiße Substanz, PCL: Purkinjezellschicht, IGL: interne Körnerzellschicht, GC: Golgi-Zellen, in J mit Pfeil markiert. *: unspezifische Färbung. Maßeinheit 100µm

L1 CHL1 NrCAM Neurofascin

Bul

bus

olfa

ctor

ius

Hip

poca

mpu

sC

ereb

ellu

m

A B C D

E F G H

I J K L

GOEPL

GL

GO

EPL

GL

CA1

CA3 DGHI

PCLML

IGL GC

WM

SBFSO

SRHF

ML

MCL

*

Ergebnisse

41

Im Hippocampus wurde bis in das adulte Stadium eine einheitliche L1-Expression in Pyramidenzellen entlang des Ammonshorn (CA1, CA2 und CA3) detektiert. Im Gyrus dentatus (DG) traten Transkripte erstmals zum Zeitpunkt P5 innerhalb einer dünnen, der Molekularschicht angrenzenden Zellschicht auf. Weiterhin zeichneten sich zu P5 vereinzelte Zellen der Strata lacunosum, radiatum, oriens sowie der hilaren Region durch eine erhöhte L1- Expression aus (Abb. 4, E). Mit zunehmenden Alter dehnen sich L1-Transkripte innerhalb des DGs in tiefere Schichten aus, so dass bereits zum Zeitpunkt P14 in sämtlichen Körnerzellen des DGs L1-mRNA zu finden war. Hierbei wurde eine eine leichte Umverteilung bezüglich des Expressionslevels beobachtet. Tiefer gelegene Körnerzellen, in enger Nachbarschaft zur hilaren Region, zeichneten sich bis P21 im Vergleich zu höheren Zellschichten durch eine verstärkte Anreicherung der L1-mRNA aus. Dieser Gradient konnte im adulten Tier nicht gefunden werden. Im Cerebellum wurden L1-Transkripte bereits in frühen Anlagen (P1 – P5) detektiert. Während dieser Phase der Entwicklung ist die Molekularschicht kaum ausgebildet. Da undifferenzierte Purkinjezellen noch keine einheitliche Zellschicht bilden und fast unmittelbar an die externe Körnerschicht (EGL) grenzen, war eine eindeutige Zuordnung der mRNA zu bestimmten Zellpopulationen nur schwer möglich (Abb. 5, I, S. 44). Zum Zeitpunkt P14 ist sowohl die Zellmigration der Körnerzellen als auch die Ausbildung der Molekularschicht fast abgeschlossen und eine L1-Expression war unter Anwendung der konventionellen ISH ausschließlich in der externen und internen Körnerzellschicht (IGL) detektierbar (Abb. 4, I; Abb. 5, J, S. 44). Ab P21 zeigt die Cytoarchitektur des Cerebellum keine Unterschiede zum adulten Stadium, die EGL ist abgebaut und L1-Transkripte waren nur in der IGL zu finden (Abb. 5, K und L). Im Cortex wurde bis zum Zeitpunkt P14 eine erhöhte L1-Expression in den Schichten I – IV beobachtet. Diese Verteilung war in adulten Tieren nicht mehr sichtbar und L1-Transkripte wurden einheitlich in den verschiedenen Schichten des Cortex gefunden. Im Thalamus konnte zu allen untersuchten Stadien der Entwicklung eine deutliche L1-Expression nachgewiesen werden, welche dem einleitend erwähnten, zeitlichen Expressionsverlauf folgte.

3.2.1.2 CHL1 Im Gegensatz zu L1 wies CHL1 ein äußerst dynamisches Expressionsverhalten im Laufe der Entwicklung auf. CHL1-Transkripte wurden, ähnlich wie für L1 beschrieben, vornehmlich während der frühen Entwicklung des Maushirns detektiert. Ein Expressionspeak von CHL1 war jedoch bereits zum Zeitpunkt P5 zu beobachten. Bis P21 nahm diese Expression nur geringfügig ab. Die nach P21 folgende Expressionsabnahme war deutlich stärker ausgeprägt als sie für L1 beobachtet wurde, so dass im adulten Tier nur wenig CHL1-mRNA zu finden war.

Ergebnisse

42

Am Embryonaltag 16 war sowohl die Expressionsmenge als auch die Verteilung von CHL1- und L1-Transkripten durchaus vergleichbar. Einzelne Hirnstrukturen sind zu diesem Zeitpunkt nur schwer voneinander zu unterscheiden. Auffallend war jedoch ,dass im OB keine CHL1-mRNA gefunden werden konnte (Abb. 4, B). CHL1-Transkripte wurden auch zu späteren Zeitpunkten der Entwicklung in dieser Region nicht detektiert. Im Hippocampus wurden CHL1-Transkripte vornehmlich in Pyramidenzellen der CA1 detektiert. Im DG war eine CHL1-Expression nicht vor P14 zu beobachten. CHL1-mRNA konnte zudem in vereinzelten Zellen des Hilus, der Strata oriens und radiatum gefunden werden (Abb. 4, F). Diese Verteilung innerhalb des Hippocampus blieb bis in das adulte Stadium bei deutlich geringerem Expressionslevel erhalten (Abb. 5, A-D, S. 44). Im Cerebellum war zum Zeitpunkt P1 das Auftreten von CHL1-mRNA in nur wenigen Zellen nachweisbar. Ab P5 fand eine allgemeine Expressionszunahme in dieser Region statt. Bereits zu diesem Zeitpunkt wurde eine deutlich erhöhte Transkription in vereinzelten Zellen beobachtet, bei welchen es sich vermutlich um Golgi-Zellen der IGL handelte. Ab P14 konnten Transkripte von CHL1 ausschließlich der IGL zugeordnet, wobei einzelne, der dort vorhandenen Golgi-Zellen durch ihre intensive Färbung in den Vordergrund traten (Abb. 4, J). Im Cortex fand zum Zeitpunkt P5 eine erhöhte CHL1-Expression in den äußeren Schichten (I – IV) statt. Zu späteren Zeitpunkten (P14-21) beschränkte sich die Lokalisation der CHL1-Transkripte vornehmlich auf die Schicht IV. Im adulten Tier wurden derartige Unterschiede nicht mehr gefunden, eine CHL1-Expression erstreckte sich einheitlich über alle Schichten des Cortex. Im Thalamus zeigte CHL1 während der gesamten postnatalen Entwicklung eine ausgeprägte Expression im antero-ventralen Nucleus.

3.2.1.3 NrCAM NrCAM zeigte einen zu L1 vergleichbaren zeitlichen Expressionsverlauf. Die Expression erreichte ihr Maximum zum Zeitpunkt P14 und nahm bis in das adulte Stadium ab. Im OB war bereits ab E16 eine deutliche Anreicherung von NrCAM-Transkripten in der Mitralzellschicht sowie im äußeren Bereich der Körnerzellschicht in enger Nachbarschaft zur externen plexiformen Schicht detektierbar. Zudem wiesen Zellen innerhalb der infra/periglomerulären Region des OBs punktuell eine intensive NrCAM-Expression auf (Abb. 4, C). Diese räumliche Verteilung blieb während der gesamten postnatalen Entwicklung und im adulten Tier erhalten. Auch im Hippocampus wurde ein charakteristisches Expressionsmuster von NrCAM beobachtet. Im Vergleich zur CA1 zeigten die Regionen CA2 und CA3 des Ammonshorn eine deutlich erhöhte NrCAM-Expression. Besonders auffällig wurde dieser Gradient zum Tag P5 und blieb, wenn auch in abgeschwächter Form, bis in das adulte Stadium erhalten. NrCAM-mRNA innerhalb des DGs wurde erstmals zum Zeitpunkt P5 nachgewiesen. Wie für L1 beschrieben, beschränkte sich

Ergebnisse

43

die Expression zunächst auf die äußere, der Molekularschicht angrenzenden Zellschicht (Abb. 4, G) und griff im Laufe der Entwicklung auf tiefer gelegene Körnerzellen über. Zudem wiesen zu allen untersuchten Zeitpunkten das Subikulum und einzelne Zellkörper innerhalb der hilaren Region eine deutliche Anreicherung der NrCAM-mRNA auf. Im Cerebellum wurden NrCAM-Transkripte bereits am Tag P1 und P5 detektiert. Wie bereits dargelegt war eine eindeutige Zurordnung der mRNA zu verschiedenen Zellpopulationen jedoch erst ab P14 zu treffen. Eine NrCAM-Expression fand zu diesem Zeitpunkt sowohl in der EGL und IGL als auch in der Purkinjezellschicht (PCL) statt. Transkripte innerhalb der PCL lieferten eine eher diffuse Färbung, welche sich nicht auf Zellsomata beschränkte (Abb. 4, K). NrCAM-Expression war schließlich bis in das adulte Stadium sowohl in der Körner- als auch in der Purkinjezellschicht des Kleinhirns zu finden. Im Cortex wurde zu allen untersuchten Zeitpunkten im Vergleich zu anderen Hirnregionen (mit Ausnahme der CA2/CA3 und des Subikulums) eine auffallend hohe NrCAM-Expression detektiert. Ähnlich wie L1 und CHL1 wies NrCAM während der frühen postnatalen Entwicklung (P5) einen Expressionsgradienten innerhalb einzelner cortikaler Schichten – mit abnehmender Expression in tiefer gelegenen Zellschichten – auf. Am Tag P14 war eine starke Färbung sämtlicher cortikaler Schichten zu sehen. Eine allgemeine Expressionsabnahme innerhalb des Cortex war ab dem Zeitpunkt P21 bis in das adulte Stadium zu verfolgen. Eine verhältnismäßig hohe Expression blieb ausschließlich in der Schicht IV erhalten. Unabhängig vom Entwicklungsstadiums des Tieres wurde eine erhöhte Akkumulation von NrCAM-Transkripten in vereinzelten Zellkörpern des Thalamus, des Caudatum putamen sowie der lateralen präoptischen Region gefunden.

3.2.1.4 Neurofascin Im Gegensatz zu L1, CHL1 und NrCAM fand die Neurofascin-Expression in zwei deutlich voneinander trennbaren Zellpopulationen statt. Als Oligodendrozyten identifizierte Gliazellen (s.FISH, Abb. 9, S. 53) traten während der frühen postnatalen Entwicklung durch eine intensive Färbung in den Vordergrund. Ein auffälliger Anstieg stark exprimierender Oligodendrozyten wurde entlang eines caudo-rostralen Gradienten von E16 bis P14 beobachtet. Zu P14 waren zahlreiche Neurofascin positive Gliazellen entlang der meisten Faserbahnen des Maushirns, wie dem Corpus callosum oder der anterioren Komissur zu finden. Ab P21 nahmen Neurofascin exprimierende Oligodendrozyten deutlich ab. Im adulten Tier (18 Monate) waren eindeutig gefärbte Gliazellen nur selten zu detektieren.

Ergebnisse

44

Abb. 5: Entwicklungsabhängige Expressionsmuster einzelner L1-Familienmitglieder im Hippokampus und Cerebellum Lichtmikroskopische Aufnahmen zeigen die entwicklungsabhängige Expression von CHL1 im Hippocampus (A-D) und von Neurofascin (E-H) und L1 (I-L) im Cerebellum. Untersucht wurden verschiedene Zeitpunkte der postantalen Entwicklung: P5 (A, E, I), P14 (B, F, J), P21 (C, G, K) und 18 Monate (D, H, L). OL: Oligodendrozyt, PC: Purkinjezelle, weitere Abkürzungen können der Abb. 4 entnommen werden. Pfeile weisen auf beschriebene Zellschichten bzw. –typen hin. Maßeinheit 100 µm

DG

CA1

CA3 HI

A B C D

E F G H

I J K L

IGL

EGL

PCL

EGL

MLPCL

IGL

WS

PCLEGL

IGL

WS

P5 P14 P21 18 MonateC

HL1

Neu

rofa

scin

L1H

ippocampus

Cerebellum

PCL

IGL

ML

PC

PC

OL OLPC

Ergebnisse

45

Neuronale Zellen wiesen eine eher schwache Neurofascin-Expression zu allen untersuchten Zeitpunkten auf. Im Gegensatz zu L1, CHL1 und NrCAM wurde eine kontinuierliche Zunahme neuronaler Neurofascin-Transkripte mit zunehmenden Alter (bis 12 Wochen) beobachtet. Im OB war Neurofascin-mRNA ab E16 in Neuronen der Mitralzell-, Körnerzell- und periglomerulären Schicht lokalisiert. Am Tag P14 wurden zudem stark gefärbte Zellkörper, welche Gliazellen darstellen, innerhalb der granulären Schicht sichtbar. Dieses Expressionsmuster blieb bis in das adulte Stadium unter einem Anstieg neuronaler und einer Abnahme gliärer Transkripte bestehen (Abb. 4, D). Im Hippocampus fand eine mäßige Neurofascin-Expression in Pyramidenzellen entlang des Ammonshorn (CA1, CA2 und CA3) statt. Zum Zeitpunkt P5 waren, ähnlich wie für L1 und NrCAM beschrieben, schwach gefärbte Zellen in der äußeren Schicht des DGs sowie im Hilus zu finden. Zudem traten stark gefärbte Oligodendrozyten in der Fimbria Hippocampus sowie entlang der hippocampalen Fissur auf (Abb. 4, H). Während das neuronale Expressionsverhalten bis zum Tag P14 keine Veränderungen aufwies, nahm die Dichte Neurofascin positiver Gliazellen innerhalb der hippokampalen Formation deutlich zu. Dieses Verhältnis (neuronaleExpression/gliäre Expression) kehrte sich wie erwähnt mit zunehmenden Alter um. Im Cerebellum fand die Neurofascin-Expression, vergleichbar zur Expression der übrigen L1-Mitglieder, bereits in frühen Anlagen statt. Am Tag P5 wurde ein Zellband, welches vermutlich die sich ausdifferenzierende PCL darstellt, mit erhöhter Neurofascin-Expression zwischen der nur schwach entwickelten Molekularschicht und der IGL sichtbar. In der weißen Substanz lagen stark gefärbte Gliazellen vor. Ab P14 waren Neurofascin-Transkripte eindeutig der PCL und IGL zuzuordnen. Intensiv gefärbte Oligodendrozyten traten jedoch weiterhin in den Vordergrund (Abb. 4, L). Zum Zeitpunkt P21 wurde eine weitere Zunahme neuronaler Neurofascin-Transkripte insbesondere innerhalb der PCL verzeichnet, wobei sich die Färbung deutlich auf Zellsomata beschränkte. Neurofascin positive Oligodendrozyten konnten dagegen nur in deutlich verringerter Zahl gefunden werden (Abb. 5, E-H). Während der gesamten Entwicklung wiesen neuronale Zellen des Cortex eine gemässigte Neurofascin-Expression auf. Nur am Tag P5 wurde eine leicht erhöhte Transkription in den oberen Schichten gefunden, während zu den anderen untersuchten Entwicklungsstadien eine einheitliche Verteilung der Neurofascin-mRNA beobachtet wurde.

Ergebnisse

46

3.2.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Bereits unter Anwendung der konventionellen ISH wurden charakteristische Expressionsmuster der einzelnen L1-Familienmitglieder gefunden. So wurde neben einer zeitlichen Regulation auch eine Zelltyp- bzw. regionenspezifische Expression von L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin nachgewiesen (zusammengefasst in: Tab. 1). Um Aussagen über die subzelluläre Verteilung bzw. Kolokalisationen einzelner Transkripte innerhalb verschiedener Zellpopulationen des Bulbus olfactorius, Hippocampus und Cerebellums zu treffen, wurde die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für weitere Arbeiten etabliert. Diese Methode bietet, neben einer erhöhten Sensitivität und Auflösung, die Möglichkeit einer Doppelmarkierung. Die Auswertung der Daten erfolgte hierbei sowohl unter Anwendung der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie als auch der konfokalen Mikroskopie. Schwache Expressionen, deren Detektion unter Anwendung der AP-basierten Färbung zum Teil limitiert war, wurden mit Hilfe der FISH deutlich bestimmt. Zur Detektion von Gliazellen wurden GFAP- und MAG- spezifische RNA-Sonden als Astrozyten- bzw. Oligodendrozyten Marker eingesetzt. Die oben beschriebenen Expressionsmuster einzelner L1-Familienmitglieder wurden unter Anwendung der FISH bestätigt.

Bulbus olfactorius Hippokampus Cerebellum Gliazellen

GO MCL GL CA1 CA3 DG EGL ML PCL IGL OL BG

L1 ++ +++ – +++ +++ +++ +++ ++ - +++ - -

CHL1 – – – +++ + +++ - + - +++ - -

NrCAM + +++ +++ + +++ +++ +++ + ++ +++ - ++

Neurofascin +++ +++ ++ ++ ++ ++ + ++ +++ ++ +++ -

Tab. 1 Verteilung von Transkripten der L1-Familienmitglieder in verschiedenen Regionen des ZNS

Tabelle fasst die regionenspezifische Expression der L1-Familienmitglieder in Zellschichten des Bulbus olfactorius, Hippokampus und Cerebellums zusammen. Zeitlich regulierte Expressionen können dieser Tabelle nicht entnommen werden. -: keine Expression, +: schache Expression, ++: mäßige Expression, +++: starke Expression. GO: glomeruläre Schicht, MCL: Mitralzellschicht, GL: Körnerzellschicht, CA1/CA3: Regionen des Ammonshorn, DG: Gyrus dentatus, EGL: externe Körnerzellschicht, ML: Molekularschicht, PCL: Purkinjezellschicht, IGL: interne Körnerzellschicht, OL: Oligodendrozyten, BG: Bergmann-Glia

Ergebnisse

47

3.2.2.1 Bulbus olfactorius Bereits die nicht fluoreszente ISH zeigte die Expression von L1, NrCAM und Neurofascin im Bulbus olfactorius. CHL1-Transkripte wurden dagegen zu keinem der untersuchten Zeitpunkte in dieser Hirnregion detektiert. Auch die FISH lieferte trotz einer maximalen Signalverstärkung mittels Biotin-markierter Antikörper und dem Streptavidin-HRP System keinen Hinweis auf eine CHL1-Expression innerhalb des OB. L1, NrCAM und Neurofascin exprimierende Zellen wurden dagegen in verschiedenen Schichten des OB gefunden. In der glomerulären Schicht waren vornehmlich Neurofascin-Transkripte detektierbar, welche sowohl innerhalb supra- als auch infraglomerulärer Bereiche gefunden wurden. Eine ausgeprägte L1-Expression beschränkte sich dagegen auf infraglomeruläre Zellen (möglicherweise tufted Zellen), welche bis in die externe plexiforme Schicht gefunden werden konnten (Abb. 6, B). NrCAM-mRNA war in periglomerulären Zellen nur in geringen Mengen zu finden. Kolokalisationsstudien zeigten eine deutliche Koexpression von Neurofascin und L1 in infraglomerulären Zellen (Abb. 6, B). Kolokalisationen von NrCAM und Neurofascin bzw. L1-Transkripten wurden dagegen nur in wenigen Fällen beobachtet. Stark exprimierende NrCAM-positive infraglomeruläre Zellen konnten deutlich von L1 bzw. Neurofascin positiven Zellen unterschieden werden (Abb. 6, D,F). In der Mitralzellschicht waren derartige Unterschiede nicht zu finden. L1-, Neurofascin- und NrCAM-Transkripte zeigten eine gleichmäßige Verteilung in den Mitralzellen dieser Schicht (Abb. 6, A,C,E). Kolokalisationen wurden sowohl von L1/NrCAM und L1/Neurofascin als auch von NrCAM und Neurofascin gefunden. Innerhalb der granulären Schicht (GL) waren L1-Transkripte unter Anwendung der FISH nicht detektierbar (Abb. 6, A). Insbesondere in äußeren Bereichen der GL fand vornehmlich eine NrCAM-Expression statt (Abb. 6, C). Eine deutlich geringere Neurofascin-Expression wurde in Körnerzellen kolokalisiert mit NrCAM-Transkripten beobachtet (Abb. 6, E).

Ergebnisse

48

Abb. 6: Doppel-FISH – Vergleich der Expression von L1, Neurofascin und NrCAM im Bulbus olfactorius

Fluoreszensmikroskopische Aufnahmen von Sagittalschnitten des adulten Maushirns in Bereichen des Bulbus olfactorius. Eine mRNA-Detektion erfolgte über die Hybridisierung mit Digoxyginin- und Fluorescein-markierten RNA-Sonden und anschließender Signalentwicklung mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper. A, B Expression von L1- (rot) und Neurofascin- (NF, grün) in der Mitral- (A) und glomerulären Schicht (B). C, D: Expression von NrCAM (rot) und L1 (grün) in der Mitral- (C) und glomerulären Schicht (D). E, F: Expression von NrCAM (rot) und Neurofascin (grün) in der Mitral- (E) und glomerulären Schicht (F). Abkürzungen können der Abb. 4 entnommen werden. Pfeile weisen auf Kolokalisationen einzelner Transkripte hin. Maßeinheiten: 30 µm (A), 50 µm (B-F)

EPL

MCL

GLEPL

GO

EPL

MCL

GL

EPL

MCL

GL

GO

EPL

GO

EPL

Mitrallzellschicht adult

Glomeruläre Schicht adult

L1 ro

t / N

F gr

ünN

rCA

M ro

t / L

1 gr

ünN

rCA

M ro

t / N

F gr

ün

A B

C D

E F

infra

supra

Ergebnisse

49

3.2.2.2 Hippocampus Ähnlich wie für den Bulbus olfactorius beschrieben wurde innerhalb der hippocampalen Formation eine für die einzelnen Mitglieder der L1-Familie spezifische mRNA-Expression zu allen untersuchten Zeitpunkten beobachtet. Besonders ausgeprägt waren Unterschiede in der räumlichen Verteilung einzelner Transkripte zum Zeitpunkt P5 bzw. P14 (Abb. 7). Während L1 und Neurofascin eine einheitliche Expression entlang des Ammonshorns aufwiesen, wurde eine deutliche räumliche Trennung von CHL1- und NrCAM-Transkripten in dieser Region beobachtet. Während CHL1-mRNA vornehmlich in der CA1 zu finden war , beschränkte sich die NrCAM-Expression zum größten Teil auf Pyramidenzellen der CA2/CA3. Die Doppel-FISH zeigte Kolokalisationen von L1- und CHL1-mRNA in Zellen der CA1 sowie von L1- und NrCAM-mRNA in Zellen der CA2/CA3 (Abb. 7 A, B). Im Gegensatz dazu zeigten Doppelmarkierungen unter dem Einsatz CHL1- und NrCAM- spezifischer RNA-Sonden eine deutliche Trennung CHL1 bzw. NrCAM exprimierender Zellen innerhalb des Ammonshorns (Abb. 7 C). Im DG wurden, wie anhand der konventionllen ISH beschrieben, einzelne Transkripte von L1-Familienmitgliedern erstmals am Tag P5 detektiert. Eine Expression beschränkte sich zunächst auf die Moleküle L1 und NrCAM. Kolokalisationen beider Transkripte wurden zu diesem Zeitpunkt vornehmlich in der äußeren, der Molekularschicht angrenzenden Zellschicht gefunden (Abb. 7, D). Ab P14 waren Transkripte sämtlicher L1-Familienmitglieder innerhalb des DGs zu finden. Verschiedene Kombinationen von RNA-Sonden der einzelnen Moleküle zeigten eine gleichmäßige Verteilung sämtlicher Transkripte innerhalb dieser Region, wobei Koexpressionen in Körnerzellen des DGs für alle Mitglieder der L1-Familie gefunden werden konnten. Im Hilus waren eindeutige Kolokalisationen von NrCAM und L1 in vereinzelten Zellen (vermutlich Mooszellen) zu finden (Abb. 7, D). CHL1 wurde in nur wenigen Zellen dieser Region in Kolokalisation mit L1 bzw. NrCAM exprimiert. Wie anhand der nicht fluoreszenten ISH Daten zu sehen ist, fand eine neuronale Neurofascin-Expression im Gegensatz zu anderen Molekülen der L1-Familie während der frühen postnatalen Entwicklung in nur geringfügigem Ausmaß statt. Zum Zeitpunkt P14 konnte auch unter Anwendung der FISH nur eine schwache Färbung neuronaler Zellen innerhalb des gesamten Hippocampus detektiert werden. Eine starke Neurofascin-Expression fand dagegen in Oligodendrozyten statt, welche anhand der Kolokalisation mit MAG-Transkripten eindeutig identifiziert wurden (Abb. 9, A, S. 53).

Ergebnisse

50

Abb. 7: Doppel-FISH – Vergleich der Expression von L1, CHL1 und NrCAM im Hippocampus

Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Sagittalschnitten des Maushirns zeigen die mittels FISH detektierte mRNA-Expression von L1, CHL1 und NrCAM in Regionen des Hippocampus. Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). A: Transkripte von NrCAM (rot) und L1 (grün) in Regionen des Ammonshorns, P5. Vergrößerter Bereich zeigt die Koexpression beider Moleküle in Zellen der CA3. B: Transkripte von CHL1 (rot) und L1 (grün) in Regionen des Ammonshorns, P14. Vergrößerter Bereich zeigt die Koexpression der Moleküle in Zellen der CA1. C: CHL1- (rot) und NrCAM- (grün) Expression in Regionen des Ammonshorns, P5. Vergrößerter Bereich zeigt die deutlich Trennung CHL1- und NrCAM exprimierender Zellen. D: Verteilung von NrCAM (rot) und L1- (grün) Transkripten in Bereichen des Gyrus dentatus, P5. Pfeile weisen auf Kolokalisationen der Transkripte in Zellen des Hilus hin. Abkürzungen entsprechen denen der Abb. 4. Maßeinheit: 50 µm

CA 1CA3

CA1

CA3

CA3

CA1

DG

ML

NrC

AM

rot /

L1

grün

P5C

HL1

rot /

NrC

AM

grü

nP5

CH

L1 rot / L1 grünP14

NrC

AM

rot / L1 grünP5

A B

C D

Ergebnisse

51

3.2.2.3 Cerebellum Innerhalb des Cerebellums wurde während der frühen postnatalen Entwicklung eine charakteristische räumliche Verteilung von Transkripten der L1-Familiemitglieder besonders deutlich . Zum Zeitpunkt P5 zeigten postmitotische Körnerzellen der EGL, welche durch die schwach entwickelte Molekularschicht in die IGL wandern, eine erhöhte L1- und NrCAM-Expression (Abb. 8, B). Zum Tag P14 ist die Migration der Körnerzellen nicht vollständig abgeschlossen. In prämigratorischen Zellen der EGL waren Transkripte von L1, NrCAM und Neurofascin, jedoch nicht von CHL1 zu finden. Doppelmarkierungen wiesen hierbei auf eine einheitliche Expression genannter Moleküle in Körnerzellen der EGL hin. In den Interneuronen der Molekularschicht war unter Anwendung der FISH eine Expression der Moleküle L1 und Neurofascin in Kolokalisation zu beobachten. NrCAM- und CHL1-Transkripte wurden in dieser Schicht nur in geringen Mengen detektiert. Zellen der PCL exprimierten ausschließlich NrCAM und Neurofascin-Transkripte. Die Verteilung der Neurofascin-mRNA beschränkte sich deutlich auf Zellsomata von Purkinjezellen (identifiziert anhand ihrer Zellgröße). NrCAM lieferte eine eher diffuse Färbung innerhalb dieser Zellschicht. Doppelmarkierungen unter Anwendung Neurofascin und NrCAM spezifischer Sonden zeigten zum Zeitpunkt P14 nur wenige Kolokalisationen beider Transkripte in Zellen der PCL (Abb. 8, E). FISH unter Anwendung einer GFAP mRNA-Sonde, welche Bergmann Glia innerhalb der PCL markiert, zeigte eine zu NrCAM vergleichbare diffuse Färbung der mRNA. Transkripte wurden hierbei bis weit in die Molkularschicht gefunden. Doppelmarkierungen unter gleichzeitiger Applikation einer NrCAM- und GFAP-spezifischen Sonde wiesen deutliche Kolokalisationen beider Transkripte in den radialen Gliazellen des Cerebellums zum Zeitpunkt P14 auf (Abb. 9, D, F). Eine Neurofascin- und GFAP-Expression konnte dagegen eindeutig verschiedenen Zellpopulationen zugeordnet werden (Abb. 9, E). Im adulten Tier wurde eine Umverteilung der NrCAM-Expression mit einer erhöhten Kolokalisation von Neurofascin- und NrCAM-Transkripten innerhalb der PCL sichtbar (Abb. 9, F). In der IGL fand eine Expression sämtlicher L1-Familiemitglieder statt. Doppelmarkierungen unter Einsatz verschiedener Sonden-Kombinationen zeigten eine gleichmäßige Verteilung sämtlicher Transkripte innerhalb der IGL. Aussagen über mögliche Kolokalisationen einzelner Transkripte ließen sich in dieser Schicht aufgrund der hohen Zelldichte nur schwer treffen. Sämtliche Sonden lieferten eine diffuse, punktierte Färbung, welche eine eindeutige Zuordnung zu einzelnen Körnerzellen nicht ermöglichte. Ausschließlich Golgi-Zellen der IGL, welche anhand ihrer Größe deutlich von Körnerzellen zu unterscheiden waren, wiesen eine Koexpression insbesondere von L1 und CHL1 auf (Abb. 8 A,C). In der weißen Substanz des Cerebellums beschränkte sich die Expression von Mitgliedern der L1-Familie auf Neurofascin. Wie für die hippokampale Formation beschrieben zeigte die Doppel-FISH (Neurofascin/MAG) zum Zeitpunkt P14 eine erhöhte Neurofascin-Expression in den myelinbildenden Gliazellen des ZNS (Abb. 9 B).

Ergebnisse

52

Abb. 8: Doppel-FISH – Vergleich der Expression von L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin im Cerebellum

Konfokal- (A, B) und fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (C-F) zeigen die mittels FISH detektierte mRNA-Expression der L1-Familienmitglieder in Bereichen des Cerebellums (sagittal Ebene). Zellkörper in A und B wurden mit DAPI gefärbt (blau). A, C: Expression von CHL1 (rot) und L1 (grün) zu P14. Vergrösserter Bereich in A bzw. Pfeile in C zeigen Koexpressionen der Moleküle in Golgi-Zellen der IGL. B, D: Verteilung von NrCAM- (rot) und L1- (grün) Transkripten zum Zeitpunkt P5 (B) und im adulten Stadium (D). E, F: Expression von NrCAM (rot) und Neurofascin (grün, NF) zum Zeitpunkt P14 (E) und im adulten Tier (F). Zu P14 wurde eine starke NF-Expression in Oligodendrozyten (OL, Pfeil) detektiert. In der PCL wurden NrCAM- und NF-Transkripte in verschiedenen Zellpopulationen detektiert (vergrösserter Bereich, E). Im adulten Tier fand eine zunehmende Koexpression der Moleküle in Purkinjezellen der PCL statt (vergrösserter Abschnitt, F). Abkürzungen s.a. Abb. 4. Maßstab: 10µm (A, B), 20 µm (C-F)

EGL

ML

IGL

ML

IGL

PCL

IGL

GC

ML

EGL

ML

IGL

PCL

WM

IGL

PCL

ML

PCLIGL

ML

OL

A B

C D

E F

CH

L1 ro

t / L

1 gr

ünP1

4

NrC

AM

rot / L1 grünP5

CH

L1 ro

t / L

1 gr

ün

P14

NrC

AM

rot / L1 grünadult

NrC

AM

rot /

NF

grün

P14

NrC

AM

rot / NF grün

adult

Ergebnisse

53

Abb. 9: Doppel-FISH – Expression von Neurofascin und NrCAM in Gliazellen

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen die mittels FISH detektierte Expression von Neurofascin (NF) und NrCAM in Gliazellen des ZNS. Doppel-FISH, unter Anwendung Neurofascin- und MAG-spezifischer RNA-Sonden, zeigte zum Zeitpunkt P14 eine deutliche Kolokalisation beider Transkripte (MAG: rot, Neurofascin: grün) in Oligodendrozyten innerhalb des Hippocampus (A) und Cerebellums (B). Kolokalisationen von GFAP (rot) und Neurofascin (grün)-Transkripten wurden nicht gefunden. Hier gezeigt in Regionen des Cerebellums. C: Übersicht verschiedener Zellschichten des Cerebellums (P14). E: Die vergrösserte Aufnahme zeigt eine deutliche Trennung GFAP- (Bergmann-Glia) unf Neurofascin- (Purkinjezellen) exprimierender Zellen (Pfeil) innerhalb der Purkinjezellschicht (PCL). NrCAM (grün) zeigte zum Zeitpunkt P14 Koexpressionen mit GFAP (rot) in den Bergmann-Glia des Cerebellums (D; Pfeil; F: Vergrösserung der PCL). Maßeinheiten: 10 µm (A, B, F); 25 µm (D, E); 30 µm (C)

CA1

CA3DG

F WM

PCL

WM

PLC

PLCIGL

ML

EGL

EGL

ML

PCL

A B

C D

E F

GFA

P ro

t / N

F gr

ünC

ereb

ellu

m P

14M

AG

rot /

NF

grün

H

ippo

kam

pus

P14 M

AG

rot / NF grün

Cerebellum

P14G

FAP rot / N

rCA

M grün

Cerebellum

P14

Ergebnisse

54

3.3 Interaktionsstudien

3.3.1 Besitzt NrCAM ein funktionelles PDZ-Bindungsmotiv?

Funktionelle Eigenschaften von Molekülen werden in vivo, wie am Beispiel der L1-Familie gezeigt wurde, u.a. durch eine zeitlich und räumlich koordinierte Expression bzw. Transkription reguliert. Auf Proteinebene tragen gezielte Protein-Protein-Interaktionen maßgeblich zur spezifischen Funktionsweise bei. Während auf extrazellulärer Seite bereits eine Vielzahl unterschiedlichster Liganden einzelner L1-Familienmitglieder identifiziert wurden (s. 1.4.4), beschränkt sich das Wissen über intrazelluläre Interaktionspartner auf nur wenige Moleküle. Trotz der hohen Homologie innerhalb der intrazellulären Domäne von L1, CHL1, Neurofascin und NrCAM können gerade am Carboxyterminus Unterschiede in der Aminosäureabfolge detektiert werden. NrCAM besitzt als einziges Mitglied der L1-Familie (Vertebraten) ein charakteristisches PDZ-Bindungsmotiv (-SFV) an seinem C-terminalen Ende. PDZ-Domänen sind maßgeblich am Aufbau spezialisierter Membranstrukturen beteiligt und werden u.a. für die korrekte räumliche Anordnung synaptischer Kanal- und Rezeptorproteine verantwortlich gemacht (Garner et al 2000). Da auch NrCAM innerhalb von Membranspezialisationen (z.B. Ranvierschen Schnürringen) in enger Nachbarschaft zu Ionenkanälen zu finden ist (Davis et al 1996), wird seine Beteilung am Aufbau derartiger Strukturen diskutiert. Ob das PDZ-Bindungsmotiv von NrCAM tatsächlich Interaktionen mit PDZ-Domänen vermittelt, wurde unter Anwendung verschiedener Systeme untersucht. Hierzu wurden Bindungsstudien mit Mitgliedern der MAGUK (membranassoziierte Guanylatkinasen)-Familie (SAP90/PSD95, SAP97, Zonula occludens-1) und ProSAP2 durchgeführt. Da Neurofascin trotz des Fehlens eines klassischen PDZ-Bindungsmotivs mit der PDZ-Domäne von Syntenin-1 interagiert (Koroll et al 2001), sind Interaktionen sämtlicher L1-Familienmitglieder mit PDZ-Domänen nicht auszuschließen und wurden ebenfalls getestet.

Ergebnisse

55

3.3.1.1 Interaktionen zwischen dem Carboxyterminus von NrCAM und PDZ-Domänen membranassoziierter Proteine in der Hefe

Mögliche Interaktionen zwischen L1-Familienmitgliedern und den MAGUKs SAP90/PSD95, SAP97 und Zonula occludens-1 (ZO-1) sowie ProSAP2, einem synapsenassoziierten Protein, wurden unter Anwendung des Hefe-Zwei-Hybrid Systems untersucht. Eingesetzte bait-Konstrukte kodierten für die intrazellulären Domänen der L1-Familienmitglieder, prey-Konstrukte kodierten für einzelne PDZ-Domänen der getesteten MAGUKs und ProSAP2. Bait- und prey-Konstrukte wurden unabhängig voneinander in die Hefestämme Y187 bzw AH109 transformiert und hinsichtlch ihres Trp+- bzw. Leu+-Phänotyps selektioniert. Doppeltransformanten wurden über das Mating einzeltransformierter Hefezellen gewonnen. Diploide Hefen (Trp+/Leu+-Phänotyp) wurden auf entsprechendes Selektionsmedium (-Trp/-Leu/-His) plattiert. Hefen mit Reportergen vermittelten Interaktionsphänotyp (Trp+/Leu+/His+- Phänotyp) wurden abschließend mittels eines ß-Galactosidaseassays (LacZ+-Phänotyp) auf Interaktionen der eingebrachten Fusionsproteine geprüft und verifiziert. Zum Ausschluss falsch-positiver Interaktionen wurden sowohl bait- als auch prey- Konstrukte auf eine mögliche Selbstaktivität geprüft. Tab. 2 fasst die Ergebnisse der getesteten bait/prey-Kombinationen zusammen. Den Erwartungen entsprechend zeigten Mitglieder der L1-Familie ohne PDZ-Bindungsmotiv (L1, CHL1 und Neurofascin) in der Hefe keine Interaktionen mit PDZ-Domänen der getesteten Proteine. Interaktionen zwischen NrCAM und PDZ-Domänen wurden dagegen anhand des Hefe-Zwei-Hybrid Systems bestätigt. NrCAM interagierte in der Hefe spezifisch mit PDZ-Domänen der MAGUKs SAP90 (PDZ1-3, PDZ1-2) und SAP97 (PDZ1-3, PDZ1-2). Interaktionen mit PDZ-Domänen der MAGUK ZO-1 und der PDZ-Domäne von ProSAP2 fanden dagegen nicht statt. Obwohl von SAP97 sämtliche PDZ-Domänen unabhängig voneinander als prey-Konstrukte vorlagen und in Kombination mit der intrazellulären Domäne von NrCAM im Hefe-Zwei-Hybrid System getestet wurden, war eine eindeutige Aussage zur interagierenden PDZ-Domäne nicht möglich. Interaktionen zwischen dem NrCAM C-Terminus und den PDZ-Domänen 2 und 3 von SAP97 fanden in der Hefe nicht statt. Das SAP97-PDZ1 prey-Konstrukt zeichnete sich durch eine hohe Selbstaktivität aus und zeigte Aktivitäten nicht nur mit den intrazellulären Domänen sämtlicher L1-Familiemitglieder, sondern auch mit dem leeren bait-Vektor pGBKT7. Um Aussagen über die Funktionlität der PDZ-Bindungsdomäne von NrCAM zu treffen, wurde mit Hilfe einer gerichteten Mutation ein Austausch der C-terminalen Aminosäure Valin (-SFV) zu Alanin (-SFA) vorgenommen. Mit Zerstörung des PDZ-Bindungsmotivs ging auch die Interaktion mit PDZ-Domänen von SAP90 (PDZ1-3) und SAP97 (PDZ1-3) in der Hefe verloren. Das RSLE-Motiv zeigte keinen Einfluss auf eine SAP90/- bzw. SAP97/NrCAM Bindung.

Ergebnisse

56

ß- Galactosidaseassay

CHL1 L1 Neuro-fascin

NrCAMNrCAM +RSLE

NrCAM -SFA

pGBKT7

ProSAP2 – – – – – -/- – ZO-1 PDZ1-3 – – – – – -/- – SAP90 PDZ1-3 – – – ++ ++ – – SAP90 PDZ2 – – – – – -/- – SAP97 PDZ1-3 – – – ++ ++ – – SAP97 PDZ1-2 – – – + + – – SAP97 PDZ1 ++ ++ ++ ++ ++ -/- ++ SAP97 PDZ2 – – – – – -/- – SAP97 PDZ3 – – – – – -/- – pGADT7 – – – – – – –

Wachstumstest SAP90 PDZ1-3 – – – +++ +++ – – SAP97 PDZ1-3 – – – +++ +++ – – ZO-1 PDZ1-3 – – – – – – – pGADT7 – – – – – – –

Tab. 2: Interaktionen zwischen der cytoplasmatischen Domäne von Zellerkennungsmolekülen der L1-Familie und PDZ-Domänen von ProSAP2, ZO-1, SAP90 und SAP97 im Hefe-Zwei-Hybrid System

Interaktionen zwischen den carboxyterminalen Domänen der L1-Familienmitglieder und PDZ-Domänen der Moleküle ProSAP2, ZO-1, SAP90 und SAP97 wurden in der Hefe anhand ihres LacZ+- und His+-Phänotyps identifiziert. Zur Quantifizierung der ß-Galactosidase Aktivität wurde die Zeit bis zum Eintritt der Blaufärbung von Kolonien bestimmt (+++: 1-2 h, ++: 2-4 h, +: 4-8h, –: keine signifikante ß-Galactosidase Aktivität). Kolonien mit H+ - Phänotyp (+++) zeigten ein vergleichbares Wachstum auf -LW (Selektion diploider Hefen) und -LWH Selektionsplatten. -/-: bait/prey Kombinationen wurden nicht getestet.

Ergebnisse

57

3.3.1.2 Expression von NrCAM und SAP97 in COS-7 Zellen

3.3.1.2.1 Einfluss von NrCAM auf die subzelluläre Verteilung von SAP97 in COS-7 Zellen

Die unter Anwendung des Hefe-Zwei-Hybrid Systems gewonnenen Daten wurden in einem unabhängigen System verifiziert. Aufgrund der stark überlappenden Expressionsmuster in vivo (Lustig et al 2001; Muller et al 1995) konzentrierten sich die folgenden Studien vornehmlich auf NrCAM/SAP97-Interaktionen. Um eine Assoziation von NrCAM und SAP97 in Säugerzellen (COS-7) zu zeigen, wurden zunächst entsprechende Expressionskonstrukte kloniert. SAP97-Konstrukte zur Expression eines Fusionsproteins mit einem N-terminal lokalisierten GFP-Tag wurden von Dr. U. Thomas zur Verfügung gestellt (s.a. Wu et al 1998). NrCAM (Accession Nr. AJ543321) wurde mit einem internen FLAG-Epitop, lokalisiert zwischen FN-III repeat und Transmembrandomäne, versehen (Abb. 10).

Abb. 10: Schematische Darstellung der in Expressionsstudien genutzten NrCAM- und SAP97-Konstrukte

A.: NrCAM versehen mit einem Flag-Epitop, welches in eine singuläre EcoRV Restriktionschnittstelle eingefügt wurde. B: SAP97-Fusionsprotein mit N-terminal lokalisiertem GFP. Balken geben unter Angabe der AS-Grenzen Deletionsbereiche an (s. a. Wu et al 1998).

SFVIg Ig Ig Ig Ig Ig FNIII 1 FNIII 2 FNIII 3 FNIII4 FN/2

DYKDDDDK

EcoRV

A NrCAM-Flag Expressionskonstrukt

GFP PDZ1 PDZ2 PDZ3 PDZ4 SH3 GK

∆ PDZ1-2186 369 429 493

∆ PDZ3

∆ PDZ1-3186 493

BGFP-SAP97 Expressionskonstrukt

TM

Ergebnisse

58

NrCAM-Flag transfizierte COS-7 Zellen exprimierten ein funktionelles Membranprotein (Abb. 11).Während konfluent gewachsene, untransfizierte COS-7 Zellen einen einheitichen Zellrasen bildeten, lagerten sich NrCAM-Flag transfizierte Zellen zu dichten Zellaggregaten zusammen. In der Immuncytochemie wurde nach Applikation eines monoklonalen Flag-Antikörpers (ohne Permeabilisierung der Zellmembran) ein spezifisches Signal entlang der Zelloberfläche detektiert.

Abb. 11: NrCAM-Flag transfizierte COS-7 Zellen exprimieren ein funktionelles Membranprotein

A: konfluent gewachsene, nicht transfizierte COS-7 Zellen bilden einen einheitlichen Zellrasen. B: Ausbildung dichter Zellaggregate in NrCAM-Flag transfizierten COS-7 Zellen. C: Monoklonale Flag-Antikörper detektieren das NrCAM-Flag Protein an der Zelloberfläche transfizierter COS-7 Zellen

In Übereinstimmung mit der von Tiffany et al. (Tiffany et al 2000) beschriebenen Verteilung von SAP97 in COS Zellen, zeigten GFP-SAP97 transfizierte Zellen eine cytoplasmatische Verteilung des GFP-Fusionsproteins mit dessen Anreicherung in perinukleären Bereichen. In Kotransfektion mit NrCAM-Flag war eine erhöhte Rekrutierung von GFP-SAP97 an die Zellmembran zu beobachten (Abb. 12). Eine Anreicherung in perinukleären Bereichen wurde nicht gesehen.

COS-7 Zellen

nicht transfiziert NrCAM-Flag transfiziert Immuncytochemie

A B C

Ergebnisse

59

Abb. 12: NrCAM-Flag nimmt Einfluss auf die subzelluläre Verteilung des GFP-SAP97 Fusionsproteins in COS-7 Zellen

Links: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen GFP-SAP97 transfizierter COS-7 Zellen. GFP-SAP97 wurde anhand der GFP-Eigenfluoreszenz visualisiert. Pfeile weisen auf die Anreicherung des Proteins in perinukleären Bereichen hin. Rechts: Fluoreszensmikroskopische Aufnahme einer GFP-SAP97/NrCAM-Flag kotransfizierten Zelle. Fixierte Zellen wurden zur Detektion des NrCAM-Flag Proteins mit monoklonalem Flag-Antikörper inkubiert. Die Signalentwicklung erfolgte unter Anwendung eines fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpers (Alexa Fluor 568). Pfeile weisen auf eine erhöhte Rekrutierung von GFP-SAP97 an die Zellmembran hin.

3.3.1.2.2 NrCAM induziertes Clustering von SAP97 entlang der Zellmembran von COS-7 Zellen

Da eine erhöhte Ansammlung von SAP97 entlang der Zellmembran in Abhängigkeit von NrCAM-Flag nicht immer eindeutig detektiert werden konnte, wurde versucht, ein durch Antikörper induziertes Clustering von NrCAM und in Folge dessen ein Clustering von SAP97 an der Zelloberfläche zu erreichen. Hierzu wurden lebende, transfizierte Zellen in Komplettmedium unter Zusatz des Flag-Antikörpers inkubiert. Um optimale Bedingungen für diesen Ansatz zu schaffen, wurden zunächst verschiedene Antikörperkonzentrationen (1:1500, 1:5000, 1:10000, 1:15000 in Komplettmedium) hinsichtlich eines Clusterings von NrCAM-Flag getestet. Nach einer einstündigen Inkubation transfizierter Zellen konnte ein Clustering von NrCAM-Flag bei allen getesteten Antikörperkonzentrationen beobachtet werden (nicht gezeigt). Besonders deutlich wurde die Aggregation von NrCAM-Flag bei einer 1:1500fachen Verdünnung des Flag-Antikörpers in Komplettmedium. Eine Einflussnahme auf die endogene Verteilung von GFP-SAP97 in einzeltransfizierten Zellen

SAP97einzeltransfiziert

SAP97/NrCAMkotransfiziert

NrCAM

SAP97

SAP97 / NrCAM

Ergebnisse

60

war nach Applikation des Flag-Antikörpers nicht zu beobachten (nicht gezeigt). In NrCAM-Flag/GFP-SAP97 transfizierten Zellen wurde neben einem Antikörper induzierten NrCAM-Flag-Clustering eine Ausbildung von GFP-SAP97-Aggregaten detektiert. Die Auswertung fluoreszensmikroskopischer Daten zeigte hierbei eine deutliche räumliche Überlappung von NrCAM-Flag und GFP-SAP97-Aggregaten an der Zelloberfläche, was insgesamt für ein NrCAM-Flag induziertes Clustering von GFP-SAP97 spricht (Abb. 13A). Im Hefe-Zwei-Hybrid System interagierte die cytoplasmatische Domäne von NrCAM sowohl mit den PDZ-Domänen 1-3 als auch mit den PDZ-Domänen 1-2 von SAP97. Mit der Zerstörung des PDZ-Bindungsmotivs in NrCAM ging diese Interaktion verloren. In COS-7 Zellen wurde die Spezifität der Interaktion anhand verschiedener GFP-SAP97 Deletionskonstrukte und anhand eines mutierten NrCAM-Flag Konstrukts untersucht. Die Deletion sämtlicher PDZ-Domänen innerhalb von GFP-SAP97 (SAP97 ∆PDZ1-3) führte in kotransfizierten COS-7 Zellen, vergleichbar zu Einzeltransfektionen des full-length Konstrukts, zu einer cytosolischen Verteilung des Proteins mit Anreicherungen in perinukleären Bereichen. Ein durch NrCAM-Flag vermitteltes Clustering konnte nicht induziert werden (Abb. 13, B). Das Entfernen der dritten PDZ-Domäne (SAP97 ∆PDZ3) zeigte keinen Einfluss auf das NrCAM-Flag induzierte Clustering von GFP-SAP97 an der Zellmembran. Wie für das GFP-SAP97 full-length Konstrukt beobachtet, zeigten fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen auch hier einheitliche Muster von NrCAM-Flag und GFP-SAP97-Aggregaten entlang der Zellmembran (Abb. 13, C). Die Deletion der PDZ-Domänen 1-2 (SAP97 ∆PDZ1-2) führte zu einer deutlich veränderten subzellulären Verteilung des Proteins in COS-7 Zellen. SAP97 ∆PDZ1-2 war ausschließlich in perinukleären Bereichen detektierbar, was möglicherweise auf einen gestörten intrazellulären Transport während früher Prozessierungsvorgänge zurückzuführen ist. In Kotransfektion mit NrCAM-Flag fand keine Änderung dieser Proteinverteilung statt (Abb. 13, D). Die Zerstörung des funktionellen PDZ-Bindungsmotivs in NrCAM (-SFV → SFA) zeigte keinen Einfluss auf das Antikörper induzierte Clustering von NrCAM (-Flag, SFA). Eine NrCAM-Flag-SFA vermittelte Aggregatbildung des SAP97-Fusionsproteins wurde dagegen nicht beobachtet. Wie in einzeltransfizierten COS-7 Zellen zeigte GFP-SAP97 in Kotransfektion mit NrCAM-Flag-SFA eine diffuse cytosolische Verteilung mit einer Anreicherung des Proteins in perinukleären Bereichen (Abb. 13, E). Bei der hier beschriebenen Assoziation von GFP-SAP97 und NrCAM-Flag in eukaryotischen Zellen handelte es sich – entsprechend der im Hefe-Zwei-Hybrid System gewonnenen Daten – um eine spezifische Bindung. NrCAM-Flag nahm keinen Einfluss auf die subzelluläre Verteilung von der MAGUK ZO-1 in kotransfizierten Zellen. Sowohl in ko- als auch in einzeltransfizierten Zellen zeigte ZO-1 eine diffuse cytoplasmatische Verteilung. Ein NrCAM-Flag induziertes Clustering fand nicht statt (nicht gezeigt).

Ergebnisse

61

Abb. 13: NrCAM-Flag induziertes Clustering von GFP-SAP97 entlang der Zellmembran von COS-7

Legende s. folgende Seite

A

E

B

C

D

NrCAM-SFV

NrCAM-SFA

NrCAM-SFV

NrCAM-SFV

NrCAM-SFV

SAP97 full length

SAP97 full length

SAP97 ∆PDZ1-3

SAP97 ∆PDZ3

SAP97 ∆PDZ1-2

Ergebnisse

62

Abb. 13: NrCAM-Flag induziertes Clustering von GFP-SAP97 entlang der Zellmembran von COS-7,

Fluoreszenzmikroskopische Analyse der subzellulären Verteilung von GFP-SAP97 und NrCAM-Flag in kotransfizierten COS-7 Zellen. A: Kotransfektion von NrCAM-SFV und full-length SAP97. B: NrCAM-SFV + SAP97∆1-3. C: NrCAM-SFV + SAP97∆PDZ3. D: NrCAM-SFV + SAP97∆PDZ1-2. E: NrCAM-SFA + full-length SAP97. Um ein Clustering von NrCAM-Flag an der Zelloberfläche zu erreichen, wurden lebende Zellen in Komplettmedium unter Zusatz des monoklonalen Flag-Antikörpers inkubiert. Fixierte Zellen wurden zur NrCAM-Flag Detektion mit einem fluoreszenzmarkiertem Zweitantikörper inkubiert (linke Spalte). GFP-SAP97 Konstrukte wurden anhand der GFP Eigenfluoreszenz visualisiert (mittlere Spalte). Das Übereinanderlegen gewonnener Bilder zeigte z.T. deutliche Kolokalisationen der rekombinant exprimierten Proteine (rechte Spalte, rot: NrCAM-Flag, grün GFP-SAP97) Pfeile zeigen Kolokalisationen an. Pfeilspitzen beschreiben unabhängige Proteinanreicherungen von NrCAM-Flag und GFP-SAP97.

3.3.1.3 Proteinbiochemischer Nachweis einer Interaktion zwischen PDZ-Domänen

von SAP97 und dem funktionellen PDZ-Bindungsmotiv von NrCAM

3.3.1.3.1 Präzipitation von SAP97 aus COS-Zelllysaten

Die im Hefe-Zwei-Hybrid- und Zellkultursystem gewonnenen Hinweise auf eine SAP97/NrCAM Interaktion wurden abschließend über einen proteinbiochemischen Nachweis bestätigt. Da weder mit dem zur Verfügung stehenden Flag- noch mit dem GFP-Antikörper Immunpräzipitationen von NrCAM-Flag bzw. GFP-SAP97 möglich waren, wurde im nächsten Schritt ein Präzipitationsassay unter Anwendung Peptid-gekoppelter Sepharose beads etabliert. Hierzu wurden COS-7 Zellen transient mit full-length GFP-SAP97 transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, geerntet und lysiert. Zur Lyse wurden zwei unterschiedliche Puffer genutzt, welche sich vornehmlich bezüglich der gewählten Detergentien unterschieden (Zusammensetzung s.: 2.12.1, S. 29). Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation getrennt (P1). Sepharose beads gekoppelt mit 12, dem NrCAM C-Terminus entsprechenden, Aminosäuren (APSPVNAMNSFV-COOH) wurden zum Überstand (Ü1) gegeben. Nach mehrstündiger Inkubation wurden beads pelletiert (Überstand: Ü2, Pellet: P2), mit Lysis-Puffer gewaschen und in 2xSDS-Probenpuffer aufgenommen. Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und GFP-SAP97 wurde im Western-Blot Verfahren unter Anwendung eines GFP-Antikörpers detektiert. Als Kontrolle dienten untransfizierte Zellen. Unabhängig vom eingesetzten Lysispuffer wurde eine deutliche Anreicherung von GFP-SAP97 in der P2-Fraktion transfizierter Zellen detektiert. Im Western-Blot war eine verstärkte Bande in Übereinstimmung mit dem zu erwartenden Molekulargewicht bei ca. 150 kDa zu sehen. Auch in den Fraktionen P1 und Ü1 war GFP-SAP97 Immunreaktivität zu beobachten (Abb. 14, Lysispuffer 1). In der Ü2-Fraktion konnte dagegen auch nach verlängerter Exposition (nicht gezeigt) kein Signal gefunden werden. In nicht transfizierten Zellen wurde in keiner Fraktion ein GFP-spezifisches Signal detektiert.

Ergebnisse

63

Abb. 14: Präzipitation von GFP-SAP97 aus COS-7 Zelllysaten

Sepharose beads gekoppelt mit den C-terminalen 12 AS des NrCAM präzipitieren GFP-SAP97 aus Lysaten transient transfizierter COS-7 Zellen (T). Monoklonale GFP-Antikörper zeigen eine spezifische Immunoreaktivität im Western-Blot bei ca. 150kDa und detektieren GFP-SAP97 in der unlöslichen Fraktion (P1, Spur 2), dem Lysat (Ü1, Spur 4) und dem Präzipitat (P2, 20fach konzentriert, Spur 6) transient transfizierter COS-7 Zellen. Entsprechende Banden konnten in untransfizierten Zellen (NT) nicht detektiert werden (Spur 1, 3, 5). Keine Immunoreaktivität ist in Zelllysaten nicht-transfizierter und GFP-SAP97 transfizierter Zellen nach der Präzipitation (Ü2, Spur 7-8) zu finden.

Parallel zu den im Hefe-Zwei-Hybrid- und Zellkultursystem gewonnenen Daten wurde unter Anwendung des beschriebenen Präzipitationsassays die Spezifität der NrCAM/SAP97 Bindung sowohl anhand verschiedener GFP-SAP97-Deletionskonstrukte (∆PDZ1-3, ∆PDZ1-2, ∆PDZ3), als auch anhand eines veränderten NrCAM-PDZ-Bindungsmotivs überprüft. Hierzu wurde ein Peptid genutzt, das statt der Carboxygruppe (-SFVCOOH) eine C-terminale Amidgruppe (-SFVCONH2) besitzt. In Übereinstimmung mit den Hefe-Zwei-Hybrid- und Expressionsdaten war eine Präzipitation von GFP-SAP97 ausschließlich mit einem funktionellen PDZ-Bindungsmotiv (-SFVCOOH) zu erreichen. Während -SFVCOOH gekoppelte Sepharose beads rekombinant in COS-7 Zellen exprimiertes GFP-SAP97 fast vollständig präzipitierten (Abb. 15, in der Ü2 Fraktion war lediglich nach verlängerter Exposition ein immunpositives Signal im Western-Blot sichtbar), fand unter dem Einsatz –SFVCONH2 gekoppelter beads keine Präzipitation statt. Eine deutliche Anreicherung von GFP-SAP97 wurde wie erwartet in der konzentrierten Ü2-Fraktion detektiert (Abb. 15, linker Blot). Neben dem rekombinant exprimierten GFP-SAP97 präzipitierten -SFVCOOH gekoppelte Sepharose beads endogen exprimiertes SAP97 aus COS-7 Zellen. SAP97 spezifische Antikörper detektierten neben dem GFP-SAP97 Fusionsprotein eine spezifische Doppelbande des endogen exprimierten SAP97 bei ca. 120 kDa (s.a. Wu et al 1998). Unter Anwendung der –SFVCONH2 gekoppelten beads konnte keine SAP97-Präzipitation gezeigt werden, eine deutliche Anreicherung von endogenem SAP97 wurde unter diesen Bedingungen in der Ü2-Fraktion detektiert (Abb. 15, rechter Blot)

NT T NT T NT T NT T

P1 Ü1 P2 Ü2

123 kDa

Ergebnisse

64

Abb. 15: Der C-Terminus von NrCAM zeigt eine hohe Affinität zu rekombinant und endogen exprimiertem SAP97 – Präzipitationen setzen ein funktionelles PDZ-Bindungsmotiv voraus

COS-7 wurden 48 h nach einer transienten Transfektion mit GFP-SAP97 lysiert. Zelllysate wurden mit Pepdid-gekoppelten Sepharose beads (-SFVCOOH: funktionelles PDZ-Bindungsmotiv, -SFVNH2: verändertes Bindungsmotiv) inkubiert. Die Ü2-Fraktion wurde lypophylosiert und entprechend der P2-Fraktion in einem Endvolumen von 50µl aufgenommen. Proteine der Präzipitate (P2) sowie Lysate vor (Ü1) und nach (Ü2) der Präzipitation wurden elektrophoretisch getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Derselbe Blot wurde sequentiell mit GFP- (links) bzw. SAP97-spezifischen Antikörpern (rechts) inkubiert. Monoklonale GFP-Antikörper zeigten spezifische Immunoreaktionen bei ca. 150 kDa. Pfeil weist auf Immunreaktionen des endogen exprimierten SAP97 bei ca 120 kDa hin. NT: nicht transfizierte Zellen.

Dass eine SAP97-Präzipitation unter Anwendung von -SFVCOOH gekoppelten beads auf eine PDZ-Domänen vermittelte Interaktion zurückzuführen ist, wurde anhand der unterschiedlichen SAP97-Deletionskonstrukte belegt. Eine SAP97-Präzipitation blieb nach dem Entfernen der PDZ-Domänen 1-3 bzw. 1-2 aus. Die Anreicherung von SAP97 ∆PDZ1-3 wurde ausschließlich in der Ü2-Fraktion beobachtet. In der P2-Fraktion konnte SAP97 dagegen nicht detektiert werden (Abb. 16, Spur 1-3). Ähnlich verhielt es sich für SAP97 ∆PDZ1-2. Aufgrund einer geringen Transfektionseffizienz konnten schwache Immunreaktionen nach kurzer Filmexposition ausschließlich in der aufkonzentrierten Ü2-Fraktion nachgewiesen werden. (Abb. 16, Spur 4-6). Erst nach deutlich verlängerter Expositon wurden Signale in der Ü1-Fraktion sichtbar. In der P2-Fraktion wurde SAP97 ∆PDZ1-2 dagegen auch nach langen Expositionszeiten nicht detektiert. Das Entfernen der dritten PDZ-Domäne hatte keinen Einfluss auf die Präzipitation von GFP-SAP97. Entsprechend dem SAP97 Wildtyp-Protein wurde SAP97 ∆PDZ3 in der P2-Fraktion detektiert. Auch nach der Aufkonzentrierung ungebundener Proteine waren nur schwache Immunreaktionen in der Ü2-Fraktion detektierbar (Abb. 16, Spur 7-9).

NT Ü1 Ü1P2 P2Ü2 Ü2

-SFVCOOH -SFVCONH2

GFP-Antikörper

NT Ü1 Ü1P2 P2Ü2 Ü2

-SFVCOOH -SFVCONH2

SAP97-Antikörper

123 kDa

Ergebnisse

65

Abb. 16: Präzipitation von SAP97-Deletionsproteinen aus COS-7 Zelllysaten

COS-7 Zellen wurden transient mit verschiedenen SAP97-Deletionskonstrukten transfiziert. Anschließende Präzipitationsassays wurden mit dem funktionellen NrCAM-PDZ-Bindungsmotiv (-SFVCOOH) durchgeführt. Eine Präzipitationen von SAP97 konnte nach dem Entfernen der PDZ-Domänen 1-3 bzw 1-2 (∆ PDZ1-3, Spur 2, ∆ PDZ1-2, Spur 5) nicht erreicht werden. Ü2-Fraktionen wurden lyophylisiert und endsprechend der P2-Fraktion in einem Endvolumen von 50µl aufgenommen. Deletionsproteine waren in den entsprechenden Ü2-Fraktionen (Spur 3 bzw. Spur 6) nachweisbar. Das Entfernen der dritten PDZ-Domäne hatte keinen Einfluss auf eine NrCAM-C-Terminus vermittelte Präzipitation. SAP97∆PDZ3 konnte angereichert in der P2-Fraktion detektiert werden (Spur 8).

3.3.1.3.2 Präzipitation von SAP97 und SAP90/PSD95 aus Hirnlysaten

Ob der NrCAM C-Terminus auch intaktes, in vivo exprimiertes SAP97 präzipitiert, wurde anhand von Maushirnextrakten geprüft. Hierzu wurden frisch präparierte Hirne von adulten Mäusen in der Sagittalebene halbiert. Die Hirnhälften wurden in jeweils 2 ml Lysispuffer 1 bzw. 2 lysiert. Nach der Abzentrifugation unlöslicher Bestandteile wurden die Lysate wiefolgt aufgeteilt: 500 µl des Ausgangsmaterial wurden eingeengt und in einem Endvolumen von 250 µl in 2 x SDS-Probenpuffer aufgenommen (Ü1), 500 µl wurden mit -SFVCOOH

gekoppelten beads, 500 µl mit –SFVCONH2 gekoppelten beads inkubiert. Beads wurden nach mehrstündiger Inkubation pelletiert (P2), der Überstand entsprechend dem Ausgangsmaterial eingeengt und in 250 µl Probenpuffer (Ü2) gelöst. Nach mehrmaligem Waschen der beads in Lysispuffer, wurden diese in 50 µl Probenpuffer (P2) aufgenommen. Zur elektrophoretischen Auftrennung wurden 20µl der Überstände 1 und 2, 2 µl der -SFVCOOH -P2-Fraktion und 10 µl der -SFVCONH2 -P2-Fraktion auf SDS-Gele aufgetragen. Unabhängig vom Lysispuffer wurde eine Anreicherung von SAP97 in der P2-Fraktion in Folge einer -SFVCOOH –Präzipitation detektiert. Neben der in COS-7 Zellen beschriebenen Doppelbande (120 kDa) waren Immunreaktionen mit vergleichbarer Intensität bei ca. 140 kDa zu finden. Dies entspricht dem von Muller et al (1995) beschriebenen Molekulargewicht von SAP97. Zudem trat in dieser Fraktion die Immunoreaktivität eines 90-95 kDa Proteins in den Vordergrund (Abb. 17, A). Hierbei ist eine Kreuzreaktion mit dem nahe verwandten SAP90/PSD95 denkbar (mündliche Mitteilung Dr. U.Thomas). Präzipitationen erfolgten nicht

Ü1 P2 P2 P2Ü1 Ü1 Ü2Ü2Ü2

∆ PDZ1-3 ∆ PDZ1-2 ∆ PDZ3

123 kDa

Ergebnisse

66

mit -SFVCONH2 gekoppelten beads. Trotz Auftragen des fünffachen Volumens wurden Immunoreaktivitäten in der entsprechenden P2-Fraktion nicht detektiert. Während die Ü2-Fraktion in Folge einer -SFVCOOH -Präzipitation im Vergleich zum Ausgangsmaterial (Ü1) deutlich verringerte Immunreaktionen aufwies, zeigte die Ü2-Fraktion nach -SFVCONH2 -Präzipitation vergleichbare Signalintensitäten wie die Ü1-Fraktion (Abb. 17, linker Blot). Die letzten 12 AS des NrCAM-C-Terminus präzipitierten demnach SAP97 aus Hirnlysaten der Maus und wiesen eine hohe Affinität zum Protein auf. Im Hefe-Zwei-Hybrid System wurden neben NrCAM/SAP97 Interaktionen, spezifische Interaktionen zwischen NrCAM und den PDZ-Domänen von SAP90/PSD95 detektiert. Interaktionen mit PDZ-Domänen der Moleküle ZO-1 und ProSAP2 wurden dagegen nicht beobachtet. Gestützt wurde diese Beobachtung unter Anwendung des beschriebenen Präzipitationsassays (Ausgangsmaterial: Hirnlysate adulter Mäuse). Die Inkubation des in Abb. 17 gezeigten Blots mit SAP90/PSD95-Antikörpern zeigte infolge einer -SFVCOOH vermittelten Präzipitation auch eine deutliche Anreicherung von SAP90 in der P2-Fraktion. In der entsprechenden Ü2-Fraktion waren im Vergleich zum Ausgangsmaterial nur geringe Immunreaktivitäten detektierbar (Abb. 17, B). Interaktionen fanden dagegen nicht mit der PDZ-Domäne von ProSAP1, einem weiteren Mitglied der ProSAP/Shank Familie, statt. ProSAP1 spezifische Banden bei ca. 180 kDa (Boeckers et al 1999a) wurden ausschließlich im Ausgangsmaterial (Ü1) und den entsprechenden Ü2-Fraktionen nachgewiesen (Abb. 17, C). Zusammengefasst stehen proteinbiochemische Daten im Einklang mit Befunden aus dem Hefe-Zwei-Hybrid und Zellkultur-System. Der NrCAM C-Terminus zeigt eine hohe Affinität zu den MAGUKs SAP97 und SAP90. Es handelt sich hierbei um eine durch PDZ-Domänen vermittelte Interaktion, dessen Spezifität in allen Systemen bestätigt wurde.

Ergebnisse

67

Abb. 17: Der C-Terminus von NrCAM vermittelt eine spezifische Präzipitation von SAP97 und SAP90/PSD95 aus Hirnlysaten der Maus

Hirnlysate wurden mit Peptidgekoppelten Sepharose beads (-SFVCOOH: funktionelles PDZ-Bindungsmotiv, -SFVNH2: verändertes PDZ-Bindungsmotiv) inkubiert. Proteine der Präzipitate (P2) sowie Lysate vor (Ü1) und nach (Ü2) der Präzipitation wurden elektrophoretisch getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Derselbe Blot wurde sequentiell mit SAP97 (A), SAP90/PSD95 (B) und ProSAP1-Antikörpern (C) inkubiert. SAP97-Antikörper zeigen spezifische Immunoreaktivitäten bei ca. 120 und 140 kDa. Spezifische SAP90 Immnreaktionen sind bei ca. 90 kDa zu finden. ProSAP1-Antikörper zeigen schwache spezifische Immunreaktionen bei ca. 180 kDa.

3.3.2 Identifizierung putativer CHL1 Interaktionspartner 3.3.2.1 Hefe-Zwei-Hybrid Screen CHL1 ist das zuletzt identifizierte Mitglied der L1-Famile und wurde erstmals 1996 von Holm et al. (Holm et al 1996) beschrieben. Bisher wurden nur wenige Interaktionspartner für dieses Molekül gefunden. Intrazellulär interagiert CHL1 wie die übrigen Mitglieder der L1-Familie mit Ankyrin (Buhusi et al 2003). Um Proteine zu identifizieren, welche möglicherweise intrazelluläre Signalwege oder das räumliche Targeting von CHL1 durch eine direkte Interaktion mit der cytoplasmatischen Domäne beeinflussen, wurde der Hefe-Zwei-Hybrid Screen einer adulten Rattenhirn cDNA-Bank durchgeführt. Hierzu wurde das in 2.9.1.1 (S. 24) beschriebene CHL1 bait-Konstrukt eingesetzt. Im Verlauf des Screens wurden 3,4 × 105 Transformanten hinsichtlich eines Reportergen-vermittelten Interaktionsphänotyps (Ade+-, His+-, Leu+-, Trp+- sowie LacZ+-Phänotyp) untersucht. Über Retransformationsexperimente wurden Interaktionsphänotypen verifiziert und falsch-positive Klone aussortiert. Nach Sequenzierung und Identifizierung identischer prey-Klone blieben von ursprünglich 25 untersuchten Hefekolonien zwei unterschiedliche prey-Proteine, wovon eines für die mitochondriale CDK103-mRNA der Ratte kodierte (Accession Nr. Y17322, gefunden in 11 unabhängigen Klonen) und somit für weitere Studien uninteressant war. Zu

123 kDa

77 kDa

A) SAP97-Antikörper

-SFV

CO

OH

-SFV

NH

2

-SFV

NH

2

-SFV

CO

OH

Ü1 -SFV

CO

OH

-SFV

NH

2

-SFV

NH

2

-SFV

CO

OH

Ü1

P2 P2Ü2 Ü2

B) SAP90/PSD95-Antikörper

180 kDa

-SFV

CO

OH

-SFV

NH

2

-SFV

NH

2

-SFV

CO

OH

Ü1

P2 Ü2

C) ProSAP1-Antikörper

Ergebnisse

68

einem weiteren Klon (im folgenden CHL1-23 genannt) konnten in der Datenbank neben verschiedenen EST-Klonen folgende Einträge gefunden werden: Accession Nr.: AK046967 cDNA-Klon isoliert aus Kleinhirn zehn Tage alter Mäuse, kodierend für hypothetisches Protein (Klon: B930008G03), lokalisiert auf Chromosom 18 der Maus Accession Nr.: AK076826 cDNA-Klon isoliert aus Testis adulter, männlicher Mäuse, kodierend für Dystrobrevin Binding Protein 1 (DTNBP1) (Klon: 4930500M13), lokalisiert auf Chromosom 13 der Maus Das cDNA-Insert von CHL1-23 umfasst 648 Nukleotide und einen kodierenden Bereich von 115 AS. Auf Nukleotid- bzw. Proteinebene zeigt der N-terminal Bereich von CHL1-23 eine fast 100 %ige Homologie zu AK046967 und AK076826. C-terminal wurde eine 100%ige Homologie zwischen AK076826 und DTNBP1 (Accession-Nr. NP_080048) gefunden. Auf genomischer Ebene konnten ähnlich wie auf cDNA-Ebene nur unvollständige Aussagen über CHL1-23 getroffen werden. Im Ratten-Genom wurde der 3´-Bereich von CHL1-23 drei Exonen zugeordnet. Die Nukleotide 209-329 (mit Homologie zu AK046967), 330-501 sowie 502-648, weisen 99 % Übereinstimmung zu genomischen Sequenzen des Chromosoms 17 (Rattus norvegicus Chromosom 17 WGS supercontig, NW_ 043108.1) auf. Im Maus-Genom waren vergleichbare Einträge ausschließlich für die Nukleotide 339-502 zu finden, welche 86 % Identität zum Chromosom 18 Klon RP-23-244D21 (Accession Nr. AC121576.2) aufweisen. Dieser Klon konnte dem Mus musculus Chromosom 18 Contig Mm18_39714_30 zugeordnet werden. Da der C-terminale Bereich von AK046967 (ohne Homologie zu CHL1-23) einem Exon des gleichen Contigs entspricht und ca. 42.600 Nukleotide oberhalb des CHL1-23 Exons lokalisiert ist, könnte es sich hierbei möglicherweise um Spleißvarianten handeln. Der 5´-Bereich von CHL1-23 mit Homologie zu AK046967 und AK076826 zeigte mit Übereinstimmungen von 65 – 70 % nur geringfügige Homologien zu verschiedenen Bereichen des Human-, Ratten- und Maus Genoms. Abb. 18 zeigt eine Gegenüberstellung der cDNA-Sequenzen von AK076826, DTNBP1, CHL1-23 und AK046967. Abb. 18 Gegenüberstellung der cDNA-Sequenzen von AK056967, CHL1-23, AK076826 und DTNBP1 Das 5´-Ende der vorliegenden CHL1-23 Sequenz besitzt eine fast 100%ige Übereinstimmung zu AK046967 und AK076826 (gelbe Buchstaben). Graue Buchstaben markieren homologe Bereiche zwischen AK076826 und DTNBP1. Das 3´-Ende von CHL1-23 ist auf drei Exonen des Chromosoms 17 der Ratte lokalisiert. Grüne und blaue Buchstaben umfassen einzelne Exonabschnitte. Unterstrichene Regionen zeigen weitere Übereinstimmungen zwischen CHL1-23 und AK046967.

Ergebnisse

69

Abb. 18 Gegenüberstellung der cDNA-Sequenzen von AK056967, CHL1-23, AK076826 und DTNBP1

Legende s. vorherige Seite

AK076826 CCGCAGCCCGCGCCCGCCCGCCGCAAGTTTGTTCCCCGCCGCTGCGGCCTGCGCGGAGAG 114DTNBP1 CCAC-GCTTACCGAAGTACTCTGCTGGACTAGAATTACTTAGCA-GGTATGAG-GATGCG 297CHL1-23 --------------CGCCCGCCGCAAGTTTGTTCCCCGCCGCCGCGGCCTGCGCGGAGGG 46AK046967 -GGCAGCCCGCGCCCGCCCGCCGCAAGTTTGTTCCCCGCCGCTGCGGCCTGCGCGGAGAG 59 * * * ** * * ** ** * * * *AK076826 AGGATCGCGCG-CGGGGAGGCGCCGAGGGGCA-GCAAGAGTGGAGAAAGTGCGGAAAGAA 172DTNBP1 TGGGCTGCACTTCACAGAAGAGCCAAGGAGTGTGCAGACGCTGGCGAGCTGGTGGACAGC 357CHL1-23 AGGATCGCGCG-CGGGGAGGCGCCGAGGGGCA-GCAAGAGTGGAGAAAGTGCGGAAAGAA 104AK046967 AGGATCGCGCG-CGGGGAGGCGCCGAGGGGCA-GCAAGAGTGGAGAAAGTGCGGAAAGAA 117 ** ** * * ** * *** *** * *** * * * ** * *AK076826 GCAACAGCCGCTCCACCCGC-----GGGCGGAAAAGTGGCCGGGC--------GCGGCGG 219DTNBP1 GAGGTGGTCATGCTGTCTGCCCACTGGGAGAAGAAGAGGACCAGCCTGAACGAGCTGCAG 417CHL1-23 GCAACAGCCGCTCCACCCGC-----GGGCGGAAAAGTGGCCGGGC--------GCGGCGG 151AK046967 GCAACAGCCGCTCCACCCGC-----GGGCGGAAAAGTGGCCGGGC--------GCGGCGG 164 * * * * * ** *** * * *** ** * ** ** ** *AK076826 CGGGATGCGGCGCAGCTAACGG-TCCCCGGCGGCCGCCGGAGCCGCTAGGCGCAGAGGCA 278DTNBP1 GGGCAGCTGCAGCAGCTGCCCGCTCTCCTGCAGGACTTGGAGTCTCTGATGGCAAGCCTG 477CHL1-23 CGGGATGCGGCGCGGCTAACGG-TCCCCGGCGGCCGCCCGAGCCGCTAGGCGCAGAGGCA 210AK046967 CGGGATGCGGCGCAGCTAACGG-TCCCCGGCGGCCGCCGGAGCCGCTAGGCGCAGAGGCA 223 ** * * ** *** * * ** ** ** * *** * ** ***AK076826 GCTCA----TTTAGAGACAAGTTTTGAAGAG--GTAGAGAACCATTTGCTGCACCTGGAG 332DTNBP1 GCTCA----TTTAGAGACAAGTTTTGAAGAG--GTAGAGAACCATTTGCTGCACCTGGAG 531CHL1-23 GATCCCAGGTGTAGGGCAGGAGCTCCAG-AACAGTCCAG------TGGCTTTGCCTCTGC 263AK046967 GCTCACAAGTGTAGGGCTGGAGCTACAGGAACCATCCAGGTGCACTGGCTTGGCCTCTGC 283 * ** * *** * * * * * ** * *** ***AK076826 GACT-TGTGTGG-GCAGTGTGAGTTAGAAAGACACAA-GCAGGCCCAGGCCCAACACCTG 389DTNBP1 GACT-TGTGTGG-GCAGTGTGAGTTAGAAAGACACAA-GCAGGCCCAGGCCCAACACCTG 588CHL1-23 ATCTGTCTGTGCCTCTGTCTCATTCTGTTTCCTGCTGTGCGTGGACATGGATGGCCCAGA 323AK046967 ATCTTTCTGTGCCACTGTCTCATTCTGTTTCCGGCTGTGCGTGGATGCGGATGGCCCAGA 343 ** * **** * ** * * * * * ** * * * *AK076826 GAGAGCTA---CAAGAAAAGTAAGAGGAAGGAGCTTGAAGCCTTCAAAGCTG--AACTCG 444DTNBP1 GAGAGCTA---CAAGAAAAGTAAGAGGAAGGAGCTTGAAGCCTTCAAAGCTG--AACTCG 643CHL1-23 AAGAGGT----TTCCAAGGAAAAGAATAG----CT----TTTCTTCAAA-----GCCTCA 366AK046967 GAGAGAAAGAACACGGAGGAGAAGGTTAGAGACCTGCAGTTCCACCAAGCTCTTGCTTGG 403 **** * *** * ** ** *AK076826 ATACAGA--GCACACACAGAAGGCCCTGGAAATGGAGCACACCCA--GCAACTGAAGCTG 500DTNBP1 ATACAGA--GCACACACAGAAGGCCCTGGAAATGGAGCACACCCA--GCAACTGAAGCTG 699CHL1-23 CCATCAG--------AACGGCATCAGAGCAGAAGGGGCCCAGCCTTAGAAATCCCATTTG 418AK046967 CTATTAATTGCATCCAGCTATGTTGGTGCTGTCATAGTCCCACCT--GGGGTCATTGTTA 461 * * * * * ** * *AK076826 AAGGAGCGGCAGAAGTTCTTCGAGGAAGCCTTCCAGCAGGACATGGAACAGTACCTGTCC 560DTNBP1 AAGGAGCGGCAGAAGTTCTTCGAGGAAGCCTTCCAGCAGGACATGGAACAGTACCTGTCC 759CHL1-23 AGAGCCAGCGTGGAGTCCTGTGGCTGGTTTCTACTGCA--AACCGATGTATCCTGGGTCA 476AK046967 ATAACACTCGTCAAGAACTGTG--TGGGAACTTCTGCC--TCCTTAAAGGGCTTTAGAAC 517 * ** ** * * * ** *AK076826 ACGGGCTACCTGCAGATCGCAGAGAGGCGAGAGCCTATGGGCAGCATGTCATCCATGAAA 620DTNBP1 ACGGGCTACCTGCAGATCGCAGAGAGGCGAGAGCCTATGGGCAGCATGTCATCCATGGAA 819CHL1-23 TTATGCTAATCACAG-TGATT---AAATGACTATATACTTAC----TTTGGGCCACACTT 528AK046967 TCATATGATATGTAC-TCACTGATAAGTGGATATTAGCCCAGAA-ACTTAGAATAAATAC 575 * * * * * * *AK076826 GTGAATGTGGACGTGCTGGAGCAGATGGACCTGATGGACATCTCAGACCAGGA----GGC 676DTNBP1 GTGAATGTGGACGTGCTGGAGCAGATGGACCTGATGGACATCTCAGACCAGGA----GGC 875CHL1-23 CTATAATTCTAACTTCTGGGA--------------------------------------- 549AK046967 CCAAGATAC-AATTTCCAAGACAGATGAAACTGAAGAAGAACGAAGACCAAAGTGTGGAC 634 * * *

Ergebnisse

70

3.3.2.2 Interaktionen zwischen CHL1-23 und den cytoplasmatischen Domänen weiterer L1-Familienmitglieder in der Hefe

Da sich die Transmembranproteine der L1-Familie durch eine hohe Homologie im cytoplasmatischen Bereich auszeichnen, ist, wie für Ankyrin beschrieben (Davis & Bennett 1994, Buhusi et al 2003), eine Bindung gleicher intrazellulärer Liganden möglich. Aus diesem Grund wurde die Bindung zwischen CHL1-23 und den übrigen Mitgliedern der L1-Familie im Hefe-Zwei-Hybrid-System getestet. Weiterhin wurde ein prey-Konstrukt, welches ausschließlich für den N-terminalen Bereich (mit Homologie zu AK046967 und AK076826) kodiert, kloniert. Prey- (CHL1-23) und bait-Konstrukte (cytoplasmatische Domänen von CHL1, L1, Neurofascin und NrCAM) wurden unabhängig voneinander in die Hefestämme AH109 bzw. Y187 transformiert. Doppeltansformanten wurden über das Mating einzeltransformierter Hefen erhalten. Interaktionen wurden sowohl anhand eines ß-Galaktosidaseassays als auch anhand eines Wachstumstests (Ade+-, His+-, Leu+-, Trp+- Phänotyp) verifiziert. CHL1-23 zeigte neben der beschriebenen Interaktion mit CHL1 Interaktionen mit L1 und Neurofascin im Hefe-Zwei-Hybrid System. Interaktionen mit NrCAM fanden in der Hefe nicht statt (Tab. 3). Der N-terminale Bereich von CHL1-23 interagierte mit keinem Mitglied der L1-Familie.

ß-Galactosidaseassay CHL1 L1 Neuro-fascin

NrCAM NrCAM +RSLE pGBKT7

CHL1-23 +++ +++ +++ – – – CHL1-23 N-Terminus – – – – – –

Wachstumstest CHL1-23 +++ +++ +++ – – – CHL1-23 N-Terminus – – – – – –

Tab. 3: Interaktionen zwischen CHL1-23 und Mitgliedern der L1-Familie im Hefe-Zwei-Hybrid System

Interaktionen zwischen CHL1-23 und der cytoplasmatischen Domäne von L1-Familienmitgliedern wurden in der Hefe anhand ihres His+- und LacZ+-Phänotyps identifiziert. Zur Quantifizierung der ß-Galactosidase Aktivität wurde die Zeit bis zum Eintritt der Blaufärbung von Kolonien bestimmt (+++: 1-2 h, ++: 2-4 h, +: 4-8h, -: keine signifikante ß-Galactosidase Aktivität). Kolonien mit H+ - Phänotyp (+++) zeigten ein vergleichbares Wachstum auf -LW (Selektion diploider Hefen) und -LWH Selektionsplatten.

Ergebnisse

71

3.3.2.3 CHL1-23 mRNA-Expression im adulten Maushirn

Um Aussagen über die Expression von CHL1-23 treffen zu können, wurde anhand der aus dem Hefe-Zwei-Hybrid Screen gewonnenen cDNA eine RNA-Sonde für in situ Hybridisierungen synthetisiert. Auf mRNA-Ebene wurde eine CHL1-23-Expression, ähnlich wie bei den Mitgliedern der L1-Familie (diese Arbeit, 3.2), in weiten Bereichen des adulten Maushirns detektiert. Im Bulbus olfactorius waren Transkripte vornehmlich in der glomerulären- und Mitralzellschicht zu finden (Abb. 19, A). Im Hippocampus wurde eine einheitliche Expression entlang des Ammonshorns in den Regionen CA1-CA3 beobachtet. Zudem konnte CHL1-23 mRNA im Gyrus dentatus, der hilaren Region sowie vereinzelten Zellen der Stratum oriens detektiert werden (Abb. 19, B). Im Cerebellum fand eine erhöhte Expression innerhalb der PCL statt. Jedoch auch einzelne Zellen der GCL (vermutlich Golgi-Zellen) sowie Interneurone innerhalb der ML wiesen eine zum Teil erhöhte CHL1-23-Expression auf (Abb. 19, C).

Abb. 19: Verteilung von CHL1-23 Transkripten im adulten Maushirn

Lichtmikroskopische Auswertung von Sagittalschnitten des Gehirns adulter Mäuse nach Hybridisierung mit einer spezifischen, Digoxiginin-markierten CHL1-23 RNA-Sonde. A: CHL1-23-Expression im Bulbus olfactorius. B: CHL1-23-Expression im Hippokampus. C: CHL1-23-Expression im Cerebellum. GL: Körnerzellschicht, IPL: interne plexiforme Schicht, MCL: Mitralzellschicht, EPL: externe plexiforme Schicht, GO: glomeruläre Schicht, CA1/CA3: Regionen des Ammonshorns, DG: Gyrus dentatus, IGL: interne Körnerzellschicht, PCL: Purkinjezellschicht, ML: Molekularschicht

A B C

GL

IPL

MCL

EPL

GO

CA1

CA3DG PCL

IGLML

HippokampusBulbus olfactorius Cerebellum

Ergebnisse

72

3.4 Gen-Targeting

3.4.1 Klonierung eines Neurofascin Targeting-Konstrukts

Während bereits Phänotypen L1-, CHL1- und NrCAM defizienter Mäuse beschrieben wurden (Dahme et al 1997; Frints et al 2003; Montag-Sallaz et al 2002; More et al 2001; Sakurai et al 2001), sind über die Auswirkungen einer Neurofascin-Defizienz bis heute keine Angaben zu finden. Im Gegensatz zu L1, CHL1 und NrCAM fällt Neurofascin während der frühen postnatalen Entwicklung durch eine stark erhöhte Expression in Oligodendrozyten auf (Collinson et al 1998, diese Arbeit). Im adulten Tier zeigt Neurofascin eine weit verbreitete Expression, welche vornehmlich auf Neurone beschränkt ist. Verschiedene Arbeiten schreiben Neurofascin u.a. eine besondere Bedeutung beim Aufbau von Axon-Glia Kontakten insbesondere innerhalb der Ranvierschen Schnürringe zu (Lustig et al 2001a Lambert et al 1997). Inwieweit derartige Prozesse tatsächlich durch Neurofascin getragen werden, kann beispielsweise durch die Inaktivierung des Neurofascin-Gens überprüft werden. Zur Erzeugung induzierbarer Neurofascin-defizienter Mäuse wurde das Cre/loxP System gewählt. Bei diesem System werden Rekombinase-Erkennungssequenzen (loxP-Sequenzen) in Intronbereiche des entsprechenden Gens mittels homologer Rekombination eingebracht. loxP-Sequenzen flankieren hierbei Exonsequenzen, welche für die Genfunktion maßgeblich sind. Da loxP-Sequenzen nur wenige Nukleotide umfassen und in Intronbereichen lokalisiert sind, erhofft man, dass sie keinen Einfluss auf Genfunktionen haben. In dieser Arbeit wurde durch die Klonierung eines entsprechenden Neurofascin Targeting-Konstrukts die Grundlage zur Erzeugung induzierbarer Neurofascin Knockout-Mäuse geschaffen. 3.4.1.1 Screen einer genomischen Bank und Kartierung des Neurofascin-Gens Die Klonierung eines Neurofascin Targeting-Konstrukts setzte zunächst das Vorliegen genomischer DNA voraus. Zu diesem Zweck wurde eine genomische Lambda-Phagen Bank mittels Hybridisierung gescreent (Muller et al 1994). Die zur Hybridisierung eingesetzte, radioaktiv markierte Sonde wurde auf der Basis eines SmaI / NcoI Fragments der Neurofascin cDNA (Accession Nr. AJ543322) synthetisiert und umfasste folgende Bereiche des Neurofascin-Gens: 135 Nukleotide der 5úntranslatierten Region des Exons 1, das ATG-Exon (Exon 2), Exon 3 kodierend für 6 AS sowie Exon 4 kodierend für die N-terminale Hälfte der ersten Ig-Domäne. Dieser Screen führte zur Isolierung von zwei unabhängigen Klonen, welche im folgenden als 7A und 9A bezeichnet werden.

Ergebnisse

73

Die Phagen-DNA beider Klone wurde mit den Restriktionsenzymen SalI, XhoI, BamHI und SacI geschnitten. Sämtliche Schnittstellen sind in der multiple cloning site des LambdaEMBL3-Vektors jeweils am 5´- und 3Énde inserierter DNA zu finden und ermöglichten eine erste Charakterisierung genomischer Klone. Die Fragmente wurden im Agarose-Gel getrennt und unter Anwendung der Southern-Blot Technik hinsichtlich ihrer Identität geprüft. Die bereits zum Screen eingesetzte Sonde lieferte im Blot spezifische Signale sowohl mit 7A- als auch 9A- Fragmenten (Abb. 20). Vektorfragmente wurden dagegen nicht markiert.

Abb. 20: Southern-Blot Analyse der im Bankenscreen isolierten genomischen Klone 7A und 9A

Phagen-DNA der Klone 9A und 7A wurde mit den Restriktionsenzymen SalI, XhoI, BamHI (BHI) und SacI geschnitten Links: Auftrennung von DNA-Fragmenten im Agarose-Gel, Spur 1-4 Restriktionsfragmente des Klons 9A, Spur 5-8 Restriktionsfragmente des Klons 7A. Rechts: Southern-Blot Analyse der im Agarose-Gel aufgetrennten DNA-Fragmente.

Für die weitere Analyse wurden die im Southern-Blot markierten XhoI-, BamHI- und SacI-Fragmente von 9A in den Vektor pBluescript KS- subkloniert. XhoI-Fragmente wurden zur Zerstörung der Schnittstelle in die SalI site des Vektors eingebracht. Eine detailierte Kartierung des Neurofascin-Gens erfolgte mittels Restriktionsanalysen und Sequenzreaktionen (Abb. 21). Zum heutigen Zeitpunkt können die gewonnenen Daten über einen Abgleich mit öffentlichen Datenbanken bestätigt werden (Mus musculus chromosome 1 genomic contig, NT039180.1). 9A umfasst die Exone 2-4 des Neurofascin-Gens. Das ATG-Exon (Exon 2) wurde auf einem 5,0 kb XhoI-Fragment lokalisiert, welches als Grundlage zur Klonierung des Targeting-Konstrukts genutzt wurde (Klon: 9AXho20).

9A 7A9A 7A

Sal I

Xho I

BH ISac

I

Sal I

Xho I

BH ISac

I

Sal I

Xho I

BH ISac

I

Sal I

Xho I

BH ISac

I

10 kB

5 kB

Ergebnisse

74

Abb. 21: Kartierung des Neurofascin-Gens

Schematische Darstellung des in 9A repräsentierten Neurofascin-Genabschnitts. Senkrechte, grüne Balken geben Grenzen des 9A-Klons an. Aufgeführt wurden die für Klonierungen und zum Nachweis der homologen Rekombination entscheidenden Schnittstellen. Zahlen beziehen sich auf Nukleotidangaben innerhalb des 9A-Klons. Horizontale Balken geben Bereiche der zum Nachweis der homologen Rekombintion getesteten, radioaktiv markierten DNA-Sonden an. Blau: Sonden, welche im Southern-Blot keine spezifische Signale liefern. Rot: Zum Nachweis der homlogen Rekombination geeignete DNA-Sonde. Gestrichtelte Linien umfassen Bereiche subklonierter DNA-Fragmente unter Angabe verwendeter Klonbezeichnungen.

3.4.1.2 Targeting-Strategie Bei der Ausarbeitung einer Targeting-Strategie ist zunächst der spezifische Nachweis einer homologen Rekombination nach Einbringen des Targeting-Vektors in das Genom embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) zu berücksichtigen. Dieser Nachweis kann sowohl über Southern-Blot- als auch PCR-Analysen erfolgen. Bei Anwendung der Southern-Blot Technik müssen eingesetzte Sonden nicht im Targeting-Konstrukt enthaltene Genbereiche markieren, um die homologe Rekombination von einer illegitimen Rekombination zu unterscheiden. Verschiedene 5´-Sonden wurden hinsichtlich ihrer Spezifität im Southern-Blot getestet. Aus öffentlichen Datenbanken wurden weitere Sequenzdaten über die 5´gelegenen Bereiche von 9AXho20 ermittelt. Mittels PCR wurde ein ca. 600 bp Fragment amplifiziert (Template: genomische Maus-DNA, zur Verfügung gestellt von Dr. D. Montag), welches zum Teil mit 9AXho20 überlappt (Abb. 21, Sonde 1). Dieses Fragment wurde über geeignete Schnittstellen in pBluescriptKS- kloniert und anhand entsprechender enzymatischer Verdaue verifiziert. Im Southern-Blot konnten unter dem Einsatz dieser Sonde keine spezifischen Signale detektiert werden (nicht gezeigt). Da zum Zeitpunkt dieser Arbeiten keine weiteren Informationen über genomische Sequenzen des Neurofascin-Gens zugänglich waren, mussten weitere Sonden anhand der vorliegenden DNA synthetisiert werden. Eine externe 3´Sonde wurde aus dem Klon 9AXho4 isoliert (1000bp SacI – Fragment; Abb. 21, Sonde 2). Eine zweite externe 5´Sonde wurde auf der Basis des 9AXho20-Klons synthetisiert (Abb. 21, Sonde 3). Hierzu wurde ein 340bp Fragment, welches die Nukleotide 460 - 800 von 9AXho20 umfasst, mittels PCR amplifiziert, radioaktiv markiert und im Southern-Blot getestet.

2

ClaI (1

212)

BamHI (1

862)

NcoI (2

446)

EcoRI (2

958)

XhoI (5

004)

9AXho20

9ABam8

XhoI (7

796)

9AXho4

4

SacI (5

935)

BamHI (-

213)

Sonde 2Sonde 1 Sonde 3

SpeI (3

5)Nco

I (296

)0 10000

3

Hind III

(-167

3)

Hind III

(868

2)

Ergebnisse

75

Während die 3´Sonde keine Signale im Southern-Blot lieferte (nicht gezeigt), wurden mit der 5´Sonde spezifische Banden geschnittener genomischer Maus-DNA erkannt (Abb. 22). Wie anhand der aufgestellten Restriktionskarte zu erwarten, lieferten BamHI, NcoI, BamHI/HindIII und BamHI/EcoRV –Fragmente im Southern-Blot Signale bei ca 2,0 kb. Ein HindIII -Fragment konnte bei ca. 10 kb detektiert werden.

Abb. 22: Southern-Blot Analyse genomischer DNA-Fragmente

Genomische Maus-DNA (zur Verfügung gestellt von Dr. D. Montag) wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI, HindIII, SacI, EcoRI, PstI, XhoI, NcoI, BamHI (BHI)/HindIII (HIII), BamHI/EcoRV (RV), HindIII/EcoRV und EcoRI (RI)/PstI geschnitten. DNA-Fragmente wurden im 0,7%igen Agarose-Gel aufgetrennt, auf Hybond N+ Membranen übertragen und mit radioaktiv markierten DNA-Sonden inkubiert. Die zur Hybridisierung eingesetzte Sonde umfasst die Nukleotide 460 – 800 des 9AXho20 Klons.

Im folgenden wurde das Neurofascin Targeting-Konstrukt auf der Basis des 9AXho20 Klons kloniert. Hierzu wurden unabhängig voneinander der 5Árm (Nukleotide 800-1862 von 9AXho20), die mittlere Region (ATG-Exon mit einer 5´gelegenen loxP-Erkennungssequenz) und der 3Árm (Selektionsmarker TK/Neo-Kassette flankiert von zwei loxP-sites und ca. 2,55 kb genomischer DNA zur homologen Rekombination) kloniert. Da einzelne Klonierungsschritte oftmals über singuläre XhoI Schnittstellen der Vektoren durchgeführt wurden, konnten zusätzliche Bereiche des 9ABam8-Klons aufgrund der internen XhoI site nicht zur Verlängerung des 3Árms genutzt werden. Nach Fertigstellung der genannten Teilstücke wurde das gesamte Konstrukt in pBluescript KS- zusammengefügt. Eine singuläre NotI Schnittstelle im Klonierungsvektor kann zur Linearisierung des Plasmids genutzt werden.

1,9 kB

5 kB

21 kB

BamHI

HindIII

SacI

EcoRI

PstI XhoI

NcoI

BHI / HIII

BHI / RV

HIII / R

VRI /

PstI

Ergebnisse

76

3.4.2 Nachweis der homologen sowie der Cre-vermittelten Rekombination

Entscheidend für das erfolgreiche Targeting eines definierten Genlocus ist der eindeutige Nachweis der homologen- sowie der Cre-vermittelten Rekombination innerhalb der ES-Zellkultur. Im Southern-Blot sollte HindIII geschnittene DNA infolge einer homologen Rekombination und einem korrekten Targeting Signale bei ca. 4,5 kb liefern (Wildtyp ca. 10 kb, Abb. 22, Spur 2). Da es sich bei der Southern-Blot Technik jedoch um ein aufwendiges Verfahren handelt, welches zudem das Vorhandensein radioaktiv markierter Sonden voraussetzt, wurde als Alternative die PCR zur Analyse etabliert. Hierzu wurden spezifische Primer designed, welche den Nachweis verschiedener Ereignisse während des Targetings ermöglichen (Abb. 23).

Ergebnisse

77

Abb. 23: Übersicht verschiedener Rekombinationsereignisse während des ES-Zell-Targetings

a) In Folge der homologen Rekombination werden drei loxP-Sequenzen (graue Pfeilspitzen) in Intronbereiche des Neurofascin-Gens eingebracht. Zwei loxP-sites flankieren die TK/Neo-Kassette, eine dritte ist oberhalb des ATG-Exons lokalisiert. Zudem ist eine durch den Targeting-Vektor eingebracht HindIII-Schnittstelle (rot) zu finden, welche zum Nachweis der homologen Rekombination im Souther-Blot genutzt werden kann. Grüne Balken geben die Grenzen der Targeting-Sequenz an. Zahlen beziehen sich auf Nukleotidangaben innerhalb des 9AXho20-Klons. P1-P8: zum PCR-Nachweis eingesetzte Primer (nähere Informationen s. Tab. 4) b) In Folge der Cre-vermittelten Rekombination können drei verschiedene Deletionen auftreten. Typ 1: Deletion der TK/Neo-Kassette. loxP-Sequenzen sind in Intronbereichen ober- und unterhalb des ATG-Exons lokalisiert. Typ 2: Neben der TK/Neo-Kassette ist das ATG-Exon entfernt. Typ 3: Deletion des ATG-Exons. Klone werden über TK-Gen ausselektioniert (negativ Selektion)

Gen-Targeting

a) homologe Rekombination

Genlocus

Genlocus nach Targeting

b) Cre-vermittelte Rekombinase

1 3

Targeting-Sequenz repräsentiert in 9AXho20

ClaI (1

212)

BamHI (1

862)

NcoI (2

446)

EcoRI (

2958

)

XhoI (5

004)

BamHI (-

213)

SpeI (

35)

NcoI (2

96)

HindIII

(-167

3)

ATG

800 5004

HindIII

(868

2)

Hind III

(-167

3)

HindIII

(868

2)

ATG TK Neo1 3

P1 P3 P5 P7

P2 P4 P6 P8

1,8 kB 1,6 kB

EcoRI (2

958)

TK/Neo-Box eingefügt in NcoI (2446)

loxP-Sequenzin BamHI (1862)

HindIII

ATGTyp 1 31

P3

P4

P5

P6

P1

P2

P7

P8

Typ 2 31

P1

P2

P3

P6

P7

P8

TK NeoTyp 3 31

P1

P2

P3

P6

P7

P8

Ergebnisse

78

Während des Gen-Targetings erfolgt zunächst die Transformation von ES-Zellen mit dem linearisierten Targeting-Vektor mittels Elektroporation. Positive Klone werden über das eingebrachte Neomycin-Resistenz-Gen selektioniert. Nach dem Nachweis der homologen Rekombination (Tab. 4) erfolgt die transiente Transfektion mit dem Cre-Expressionsplasmid. Die Cre-vermittelte Rekombination führt je nach genutzter Erkennungssequenz zu drei verschiedenen Deletionen (Abb. 23). Zum einen werden ausschließlich die von loxP-Sequenzenn flankierten Selektionsmarker (TK/Neo Kassette) entfernt (Abb. 23, Typ 1). Verbleibende loxP-Sequenzen sind ausschließlich in den ATG-Exon benachbarten Intronbereichen zu finden und sollten keinen Einfluss auf den Phänotyp der Mäuse nehmen. Derartige Klone sind für die Blastozyteninjektion gesucht. Neben den Selektionsmarkern kann zusätzlich das ATG-Exon entfernt werden (Abb. 23, Typ 2), was zur Entstehung eines nicht-funktionellen Alleles führen kann. Findet die Cre-vermittelte Rekombination an Erkennungssequenzen statt, welche ausschließlich das ATG-Exon flankieren (Abb. 23, Typ 3) entstehen Klone, welche über das TK-Gen (Thymidinkinase-Gen, negative Selektion) eliminiert werden können. Der PCR-Nachweis sämtlicher Ereignisse ist in Tab. 4 zusammengefasst.

Produktgrössen in bp

Cre-vermittelte Rekombination Primer-

kombinationen Lage Wildtyp

Homologe

Rekombination Typ 1 Typ2 Typ3

P1 / P2 700 - 1700 1000 1000 1000 1000 1000 P1 / P4 700 - 1880 1180 1280 1280 – – P1 / P6 700 - 2600 1900 5400 2100 1400 4800 P3 / P4 1710 - 1880 170 270 270 – – P3 / P6 1710 - 2600 900 4400 1100 400 3800 P3 / P8 1710 - 5070 3300 6800 3500 2800 6200 P5 / P6 2370 - 2600 230 3630 330 – – P5 / P8 2370 - 5070 2700 6100 2800 – – P7 / P8 4570 - 5070 500 500 500 500 500

Tab. 4: PCR-Nachweis der verschiedenen Rekombinationsereignisse während des Neurofascin-Gen-Targetings.

Tabelle fasst die zu erwartenden PCR-Produktgrössen zum Nachweis verschiedener Rekombinationsereignisse währende des Gen-Targetings zusammen. Lage und Kombinationen gewählter Primer sind bildlich in Abb. 23 dargestellt. Nukleotidangaben zur Lage der Primer beziehen sich auf Positionen innerhalb des 9AXho20-Klons. Die Spalten 3-7 geben errechnete PCR-Produktgrössen in bp an. Primerkombinationen, welche Produkte >2000 bp liefern, sind für den Nachweis ungeeignet.

Ergebnisse

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Die Funktionalität der zum Nachweis gewählten Primer (Lage s. Abb. 23) wurde unter dem Einsatz genomischer DNA von Wildtypmäusen geprüft und ist in Abb. 24 dargestellt. Die Primerkombinationen P1/P2, P1/P4, P1/P6, P3/P4, P3/P6, P5/P6, P7/P8 lieferten PCR Produkte der berechneten Grösse (PCR-Bedingungen s. Anhang) und können für spätere Nachweisreaktionen genutzt werden.

Abb. 24: Funktionalität des PCR-Nachweises zur Bestimmung der homologen und Cre-vermittelten Rekombination während des Neurofascin-Gen-Targetings

Die zum Nachweis des Gen-Targetings gewählten Primer wurden in der PCR getestet. Als Template diente genomische DNA von Wildtyp-Mäusen. PCR Produkte wurden in einem 1%igen Agarose-Gel aufgetrennt. Folgende Primerkombinationen wurden gewählt: P1/P2: (Spur 1); P1/4 (Spur 2), P1/P6 (Spur 3); P3/P4 (Spur4); P3/P6 (Spur5), P3/P8 (Spur 6), P5/P6 (Spur 7); P5/P8 (Spur 8); P7/P8 (Spur 9). Lage der Primer und zu erwartende Fragmentgrössen können der Abb. 23 bzw. Tab. 4 entnommen werden. Sterne markieren unspezifische PCR-Produkte

2000 bp

1000 bp

500 bp200 bp

80

4 Diskussion Thema der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung neuronaler Zellerkennungsmoleküle der L1-Familie. Während bei Invertebraten bisher jeweils nur ein Vertreter dieser Proteinfamilie identifiziert werden konnte, sind in Säugern mindestens vier Transmembranmoleküle dieser Genfamilie zu finden: L1, CHL1, Neurofascin und NrCAM (Übersichtsartikel: Hortsch 1996; Hortsch 2000). Die evolutionsbedingte Entstehung homologer Gene lässt eine Spezialisierung einzelner Familienmitglieder bei der Ausübung biologischer Funktionen vermuten. Während die Erforschung von L1, dem namensgebenden Molekül dieser Proteinfamilie, weitgehend fortgeschritten ist, bleiben zu den spezifischen Funktionen der übrigen Familienmitglieder viele Fragen offen. Ein Beitrag zur näheren Charakterisierung funktioneller Eigenschaften weiterer L1-Familienmitglieder wurde in dieser Arbeit unter verschiedenen Gesichtspunkten erbracht. Neben einer familienübergreifenden Expressionsstudie, wurden mögliche intrazelluläre Interaktionspartner von NrCAM und CHL1 identifiziert. Weiterhin wurde ein Neurofascin Targeting-Konstrukt als Grundlage zur Erzeugung induzierbarer Neurofascin-Knockout Mäuse kloniert.

4.1 Beschreibung von Neurofascin und NrCAM cDNA-Sequenzen der Maus

Experimentelle Ansätze erforderten zunächst die Isolierung von L1, CHL1, Neurofascin und NrCAM full-length Klonen aus einer Maushirn cDNA-Bank. Vollständige cDNA-Sequenzen einzelner Neurofascin- und NrCAM-Klone wurden in der EMBL Datenbank hinterlegt (Neurofascin: Accession Nr. AJ543322; NrCAM: Accession Nr. AJ543321). Unabhängig voneinander isolierte Neurofascin- und NrCAM-Klone wurden hinsichtlich des Aufretens von alternativem Spleißen untersucht. Sowohl PCR als auch Sequenzdaten belegen das Auftreten verschiedener Neurofascin- und NrCAM-Isoformen im adulten Maushirn. Der Vergleich gewonnener Daten mit publizierten Spleißvarianten der Orthologen aus Huhn-, Ratte und Mensch (Davis & Bennett 1994; Dry et al 2001; Hassel et al 1997; Wang et al 1998) zeigt für beide Moleküle sowohl untereinander als auch innerhalb der verschiedenen Spezies ein vergleichbares Spleißverhalten. Trotz einheitlicher Exon/Intron Anordnungen in den Genen der L1-Familienmitglieder wurde für L1 bislang ausschließlich das Spleißen der Exone 2 und 27 beschrieben werden (Coutelle et al 1998). Im Gegensatz dazu wurden für NrCAM und Neurofascin weitere Spleißvarianten für Isoformen mit verschiedenen extrazellulären Bereichen identifiziert. Mit Ausnahme von kodierenden Bereichen der FN-III repeats, beziehen sich diese Spleißvorgänge auf Exone, welche im L1-Gen nicht vorhanden sind (Dry et al., 2001, Hassel et al., 1997). So sind sowohl im NrCAM- als auch im Neurofascin-Gen zusätzliche Exone zwischen kodierenden Bereichen der zweiten und dritten Ig-Domäne sowie der sechsten Ig-Domäne und dem ersten FN-III repeat lokalisiert. Weiterhin sind in Sequenzabschnitten, welche der vierten und

Diskussion

81

fünften Fibronektin-Domäne entsprechen, verschiedene Genstrukturen zu erkennen. Das NrCAM-Gen enthält in dieser Region ein zusätzliches Exon, welches im L1-Gen nicht vorhandenen ist. Im Neurofascin-Gen sind in diesem Bereich zwei zusätzliche Exone lokalisiert, welche kodierende Sequenzen der „Neurofascin-spezifischen“ PAT-Domäne enthalten. Das Spleißen von Exonen, welche für AS-Sequenzen außerhalb gefalteter Proteindomainen kodieren, könnte maßgeblich die Ausbildung tertiärer Proteinstrukturen und somit extrazelluläre Bindungseigenschaften beeinflussen. Derartige Mechanismen werden beispielsweise bei der Modulation homo- und heterophiler Bindungseigenschaften der Moleküle L1 und Neurofascin vermutet (De Angelis et al 2001; Jacob et al 2002; Volkmer et al 1998). Während das Fehlen der N-terminal lokalisierten Domäne (kodiert von Exon 2) extrazelluläre Interaktionen von L1 und Neurofascin herabsetzt, scheint das Spleißen des entsprechenden Exons (Exon 5) keinen Einfluss auf NrCAM-vermittelte Interaktionen zu nehmen. So zeigten NrCAM-transfizierte COS-7 Zellen trotz des Fehlens der N-terminal lokalisierten Aminosäuren DPKLLD im Gegensatz zu untransfizierten Zellen eine deutliche Aggregatbildung (s.Ergebnis, Abb. 11). Ob es sich hierbei um homo- oder heterophile Interaktionen mit unbekannten Liganden handelt, konnte anhand der vorliegenden Daten nicht beantwortet werden. Das intrazellulär lokalisierte RSLE-Motiv kann mit Ausnahme von CHL1 (Holm et al 1996) in allen Transmembranproteinen der L1-Familie gefunden werden. Es ist Bestandteil des YRSLE-Signalmotivs, welches essentiell für das korrekte Targeting von L1 innerhalb neuronaler Wachstumskegel ist, und wird in sämtlichen neuronalen L1-Transkripten gefunden (Kamiguchi & Lemmon 1998; Schaefer et al 2002). Inwieweit dieses Exon auch bei NrCAM und Neurofascin einer gewebsspezifischen Expression unterliegt ist bislang ungeklärt. Es kann jedoch vermutet werden, dass das RSLE-Motiv auch in diesen Molekülen ein gezieltes Trafficking entlang neuronaler Membranen ermöglicht. Neben konventionellen Spleißmechanismen wurde in einigen isolierten NrCAM Klonen das Auftreten einer alternativen 5´-Spleißstelle innerhalb des Exons 27 gefunden. Derartige Vorgänge sind bereits anhand humaner Isoformen (Exone 16, 17, 27 - Lane et al 1996; Wang et al 1998) ersichtlich und wurden auch für andere Gene beschrieben (Sawamura et al 2003).

Diskussion

82

4.2 Vergleich postnataler Expressionsmuster einzelner Mitglieder der L1-Familie

Die entwicklungsabhängigen Expressionsmuster von den Transmembranproteinen der L1-Familie wurde mittels ISH untersucht. Während sich bisher publizierte Studien vornehmlich mit der Expression einzelner L1-Familienmitglieder während der Embyonalentwicklung auseinandersetzen, verschafft die vorliegende Arbeit einen familienübergreifenden Einblick in postnatale Regulationsmechanismen. Der direkte Vergleich von Expressionsmustern auf mRNA-Ebene an Hirnschnitten exakt gleicher Entwicklungsstufen erlaubte die Detektion subtiler, zeitlich regulierter Transkriptionsunterschiede, welche allein über den Vergleich bestehender Literaturdaten nicht ersichtlich waren. Während die nicht fluorezente ISH Einblicke in das entwicklungsabhängige Expressionsverhalten einzelner L1-Familienmitglieder lieferte, ermöglichte die FISH eine detailierte Untersuchung auf zellulärer Ebene. Doppelmarkierungen hoben die zelltypspezifische Expression von L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin hervor. Die simultane Detektion unterschiedlicher Transkripte ließ eindeutige Aussagen über Kolokalisationen zu. Interpretationsfehler bedingt durch den Vergleich parallel angefertigeter ISHs, welche immer mit Abweichungen in der Schnittebene verbunden sind, wurden auf diese Weise ausgeschlossen.

4.2.1 Die Mitglieder der L1-Familie zeigen charakteristische Expressionsmuster in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium untersuchter Zellpopulationen

Ein erster Vergleich der entwicklungsabhängigen Expression von L1-Familienmitgliedern zeigte eine weite Verteilung der vier Transkripte im Maushirn zu allen untersuchten Zeitpunkten (E16, P1, P5, P14, adult). Die neuronale Expression von Neurofascin war im Vergleich zu anderen Mitgliedern der L1-Familie nur schwach ausgeprägt und zeigte während der gesamten postnatalen Entwicklung kaum Unterschiede in ihrer Intensität (Collinson et al 1998). Ein allgemeiner Expressionspeak der Moleküle L1, CHL1 und NrCAM konnte in Übereinstimmung mit publizierten Daten (Hillenbrand et al 1999; Liljelund et al 1994; Moscoso & Sanes 1995) zwischen P5 und P14 beobachtet werden. Einmal etablierte Expressionsmuster blieben bei meist abnehmenden –mengen bis in das adulte Stadium erhalten. Trotz dieser zum Teil stark überlappenden Eigenschaften wurden bei der näheren Betrachtung verschiedener Hirnregionen charakteristische Unterschiede in der Verteilungen neuronaler Transkripte sämtlicher L1-Familienmitglieder beobachtet, welche sowohl einer zeitlichen als auch räumlichen Regulation unterlagen. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Analyse der Expression im Bulbus olfactorius, Hippocampus und Cerebellum. Diese Strukturen zeigen wesentliche Unterschiede im zeitlichen Verlauf einsetzender Differenzierungsprozesse und ermöglichten auf diese Weise die entwicklungsabhängige Expression von L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin in Beziehung zu fundamentalen Prozessen der Neurogenese (Zellproliferation, Migration,

Diskussion

83

Neuritenwachstum, Synaptogenese) zu setzen. Der Bulbus olfactorius ist verantwortlich für die einleitende Verarbeitung olfaktorischer Stimuli und deren Weiterleitung an höhere Hirnregionen. Bereits zum Tag P0 ist die Einteilung neuronaler Zellen in Schichten deutlich zu erkennen. Grundlegende synaptische Verbindungen sind geknüpft und können anhand topographisch organisierter Reizantworten verfolgt werden (Guthrie & Gall 2003; Treloar et al 1999). Entsprechend des fortgeschrittenen Entwicklungsstandes dieser Hirnregion wurden postnatal keine Veränderungen bezüglich der Expression von Zellerkennungsmolekülen der L1-Familie detektiert. Zu allen untersuchten Zeitpunkten fand – mit Ausnahme von CHL1 – eine Expression sämtlicher Familienmitglieder in verschiedenen Zellpopulationen des Bulbus olfactorius statt. Während NrCAM- und Neurofasin-Transkripte in allen Schichten des OB zu finden waren (glomeruläre-, Mitral- und Körnerzellschicht), konnte L1-mRNA ausschließlich in der glomerulären- und Mitralzellschicht detektiert werden. Im Vergleich zu anderen Hirnregionen nahm die neuronale Expression dieser Moleküle im OB mit zunehmenden Alter nur geringfügig ab. Hohe Expressionsmengen konnten bis in das adulte Stadium verfolgt werden. Deutlich verzögert findet dagegen die Ausdifferenzierung der hippokampalen Formation (Ammonshorn, Gyrus dentatus) statt. Während Pyramidenzellen des Ammonshorn pränatalen Ursprungs sind und sich bereits zum Tag P1 morphologisch deutlich abgrenzen, wird der Großteil granulärer Zellen des Gyrus dentatus postnatal gebildet. Eine ausgeprägte Zellproliferation im Hilus (polymorphe Schicht) bzw. an der Basis der Körnerzellschicht wird bis P16 (Ratte) beobachtet und kommt – wenn auch in geringem Umfang – selbst im adulten Stadium nicht zum Stillstand (Gaarskjaer 1986). Entscheidende Prozesse der Synaptogenese finden im Hippocampus ab ca. P5 statt (Jiang et al 2001; Sanchez-Andres et al 1997; Slomianka & Geneser 1997; Super et al 1998), einem Zeitpunkt der durch eine ausgeprägte, regionenspezifische Expression der Moleküle L1 (CA1-CA3), CHL1 (CA1/CA2) und NrCAM (CA3) entlang des Ammonshorns gekennzeichnet war. In postmitotischen Zellen des Gyrus dentatus, welche zum Tag P5 ein schmales Band entlang der Molekularschicht bilden (Gaarskjaer 1986), wurden zunächst ausschließlich Transkripte von L1 und NrCAM eindeutig detektiert. Ab P14 umfasste die Expression dieser Moleküle die gesamte Körnerzellschicht, zudem konnten CHL1-Transkripte in gleichem Maße detektiert werden. Bei einer unveränderten Verteilung neuronaler Transkripte nahm die Expression von L1, CHL1 und NrCAM innerhalb der hippokampalen Formation im adulten Tier ab, wurde aber weiterhin deutlich nachgewiesen. Eine neuronale Expression von Neurofascin war im Hippocampus insbesondere während der frühen postnatalen Entwicklung nur schwach ausgeprägt, regionenspezifische Unterschiede konnten nicht gefunden werden. Im Cerebellum findet selbst die Anordnung geschichteter Strukturen erst postnatal statt. Kurz nach der Geburt haben Vorläuferzellen postmitotischer Purkinjezellen die Migration abgeschlossen und bilden zunächst eine dichte Schicht oberhalb cerebellarer Kerne. Erst nach

Diskussion

84

dem Erreichen ihrer finalen Position kann das Auswachsen von Neuriten beobachtet werden (Hatten & Heintz 1995). In der zweiten und dritten postnatalen Woche bilden Purkinjezellen charakteristische Dendritenbäume aus und gehen synaptische Verbindungen mit Afferenzen der unteren Olive sowie verschiedenen Interneuronen des Kleinhirns ein. Proliferierende granuläre Vorläuferzellen formen die externe granuläre Schicht (EGL) an der Oberfläche des Cerebellums und sind bis ca. P15 zu finden. Postmitotische Körnerzellen beginnen im Gegensatz zu Pyramidenzellen bereits vor dem Beginn ihrer Migration mit dem Auswachsen axonaler Fortläufer (Parallelfasern) und wandern entlang radialer Gliazellen (Bergmann-Glia) in die interne granuläre Schicht (IGL) (Komuro & Rakic 1998). Haben granuläre Zellen ihren Zielort erreicht, führt der Aufbau synaptischer Verbindungen zu ihrer abschließenden Differenzierung (Übersichtsartikel: Hatten & Heintz 1995). Erst zum Zeitpunkt P21 sind genannte Entwicklungsprozesse abgeschlossen und die Cytoarchitektur des Cerebellums zeigt keine Unterschiede zum adulten Stadium. Die Expression sämtlicher Mitglieder der L1-Familie wurde bereits in frühen Anlagen des Cerebellums detektiert. In Körnerzellen wurden Transkripte aller untersuchten Moleküle gefunden. Während sich die Expression von CHL1 auf die IGL beschränkte, konnten L1 und NrCAM-Transkripte sowohl in der IGL als auch in postmitotischen Zellen der EGL detektiert werden (Sakurai et al 2001). Neurofascin-mRNA konnte nur schwach in den entsprechenden Schichten detektiert werden. In der PCL fand zu allen untersuchten Zeitpunkten ausschließlich die Expression der Moleküle Neurofascin und NrCAM statt. Bereits ab P5 waren Neurofascin positive Purkinjezellen deutlich zu erkennen, ein weiterer Expressionsanstieg innerhalb dieser Zellpopulation wurde zwischen P14 und P21 beobachtet. Kolokalisationen mit NrCAM-Transkripten nahmen im Verlauf der Entwicklung zu und stehen im Einklang mit dem von Jenkins und Bennet (Jenkins & Bennett 2001a) beschriebenen Proteinvorkommen innerhalb cerebellarer Purkinjezellen. Während bereits 96 % der Purkinjezellen ab P9 Neurofascin-Cluster an ihren initialen axonalen Segmenten ausgebildet haben, wird eine Anreicherung des NrCAM Proteins innerhalb dieser Region erst in adulten Tieren beschrieben (Jenkins & Bennett 2001a).

4.2.2 Der Vergleich zeitlich regulierter und regionenspezifischer Expressionsmuster lässt auf eine funktionelle Spezialisierung einzelner L1-Familienmitglieder schließen

Fasst man die oben genannten Daten zusammen, sind regionenübergreifend grundlegende Prinzipien im Expressionsverhalten einzelner L1-Familienmitglieder zu erkennen. In Abhängigkeit des jeweils erreichten Entwicklungsstadiums untersuchter Hirnregionen wurde ein Expressionsmaximum der Moleküle L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin in Korrelation mit dem Eintritt zellulärer Differenzierungsprozesse wie Migration, Neuritenwachstum, Faszikulierung, Myelinisierung und Synaptogenese beobachtet. Dieser Expressionsverlauf

Diskussion

85

steht im Einklang mit den allgemein postulierten Funktionsweisen dieser Molekülgruppe, welche die genannten Prozesse umfassen (Übersichtsartikel: Hortsch 1996). Trotz der z.T. einheitlichen Expressionsmuster wurde bei näherer Betrachtung einzelner Zellpopulationen eine geordnete zeitliche Abfolge bei der Expression einzelner Zellerkennungsmoleküle sichtbar. Sowohl Hippocampus als auch Cerebellum zeichnen sich durch einen proliferierenden Pool granulärer Zellen während der postnatalen Entwicklung aus. Während postmitosche Zellen des Gyrus dentatus (Hippocampus) und der EGL (Cerebellum) bereits kurz nach ihrer finalen Teilung mit der Expression von L1 und NrCAM begonnen haben, konnte erst zu späteren Zeitpunkten das Einsetzen einer CHL1-Expression innerhalb dieser Zellen beobachtet werden (zusammengefasst am Beispiel des Cerebellums in Abb. 25). Dieses, in zwei voneinander unabhängigen Zellpopulationen detektierte, sequentielle Auftreten von L1/NrCAM bzw. CHL1-Transkripten deutet unterschiedliche Funktionsweisen der genannten Moleküle an. Während postmitotische Zellen des DG ihre Migration bereits abgeschlossen haben und mit dem gezielten Auswachsen axonaler Fortsätze (Moosfasern) in die CA3 Region beginnen, vollziehen Zellen der EGL nach Abschluss der Mitose neben dem Neuritenwachstum eine Wanderung entlang radialer Glia in die IGL, um ihre finale Position zu erreichen. Die frühe Expresssion von L1 und NrCAM in postmitotischen bzw. prämigratorischen Körnerzellen steht somit im Einklang mit beschriebenen Funktionen dieser Moleküle während der Migration, dem Auswachsen der Axone, ihrer Faszikulierung und Wegfindung (Demyanenko & Maness, 2003; Faivre-Sarrailh, 1999; Perrin et al 2001; Stoeckli et al 1995). Stark überlappende Expressionsmuster von L1 und NrCAM unterstützen weiterhin die von Sakurai et al. (Sakurai et al 2001) aufgestellte Hypothese kompensatorischer Effekte in L1- bzw. NrCAM-defizienten Mäusen. So weisen Doppelmutanten im Gegensatz zu Einzelmutanten schwere Defekte innerhalb des Cerebellums auf, was bei näherer Betrachtung auf eine stark reduzierte IGL zurückzuführen ist. Das verstärkte Auftreten von CHL1-Transkripten zu späteren Zeitpunkten der Ausdifferenzierung granulärer Zellen spricht für besondere Funktionen dieses Moleküls während des Axon-Targetings bzw. der Synaptogenese. Gestützt wird diese Hypothese durch den Phänotyp CHL1-defizienter Mäuse, welche fehlerhafte axonale Projektionen und synaptische Verschaltungen sowohl von olfaktorischen Neuronen als auch von Moosfasern des Hippocampus aufweisen (Montag-Sallaz et al 2002).

Diskussion

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Neben der zeitlichen Regulation ermöglicht die zell- bzw. regionenspezifische Expression von Erkennungsmolekülen, definierte Membraneigenschaften an der Zelloberfläche zu schaffen. Mitglieder der L1-Familie zeigten eine charakteristische Verteilung ihrer mRNA in allen untersuchten Hirnregionen. Besonders auffällig hierbei war das Fehlen von CHL1-Transkripten innerhalb sämtlicher Zellschichten des Bulbus olfaktorius. Im Hippocampus grenzten sich Pyramidenzellen der CA1 und CA2/CA3 deutlich durch ihre erhöhte CHL1- bzw. NrCAM-Expression voneinander ab. Im Cerebellum beschränkten sich Purkinjezellen während der frühen postnatalen Entwicklung fast ausschließlich auf die Expression von Neurofascin. Die funktionelle Bedeutung derartiger Expressionsmuster ist vermutlich vornehmlich in dem komplexen Aufbau neuronaler Verbindungen zu suchen. Die Präzision synaptischer Verschaltungen setzt das gezielte Auffinden von Zielneuronen voraus und kann in weiten Teilen des ZNS anhand ihrer geschichteten Anordnung verfolgt werden (Sanes & Yamagata 1999).Wie am Beispiel des Hippocampus zu sehen, innervieren afferente Fasern die Dendriten hippokampaler Neuronen in geordneter Weise (Turner et al 1998; Witter et al 1989). Eine Beteiligung adhäsiver Verbindungen wird hierbei sowohl auf Seiten der

EGL

ML

PCL

IGL

ProliferierendeZellschicht

Postmitotische Körnerzellen

L1, NrCAM(Neurofascin)

MigrierendeKörnerzellen

L1, NrCAM(Neurofascin)

BG PCBG: NrCAMPC Neurofascin, (NrCAM)

Postmigratorische Körnerzellen

L1, CHL1, NrCAM,Neurofascin

Abb. 25: Sequentielle Expression von L1-Familiennmitgliedern in Abhän-gigkeit vom Entwicklungs-stadium neuronaler Zellen

Schema fasst das zeitlich verzögerte Auftreten von Transkripten der Moleküle L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin zu verschiedenen Zeit-punkten der Neurogense am Beispiel des Cerebellums zusammen. Während postmitotische Körnerzellen eine deutliche L1- und NrCAM-Expression sowohl zu Zeitpunkten der tangentialen Migration innerhalb der EGL, als auch der radialen Migration innerhalb der Molekularschicht (ML) zeigten, konnten CHL1-Transkripte in der selben Zellpopulation erst nach Abschluss der Migration zu Zeitpunkten einsetzender Synaptogense detektiert werden. NrCAM-mRNA wurde während der frühen postnatalen Entwicklung (P14) weiterhin in Bergmann-Glia detektiert. Purkinje-zellen exprimieren während ihrer Differenzierung Neurofascin, Kolokali-sationen mit NrCAM wurden erst im adulten Tier deutlich detektiert. (Zeichnung nach: Yacacubova & Komuro 2002)

Diskussion

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hippokampalen Formation als auch auf Seiten afferenter Eingänge diskutiert (Forster et al 1998; Skutella et al 1999). Dissoziierte Zellen des entorhinalen Cortex haften (in Ca2+ unabhängiger Weise) entsprechend ihrer Projektionsbahnen vornehmlich innerhalb der äußeren Molekularschicht organotypischer Hippocampuskulturen. Da Zellen aus anderen cortikalen Bereichen ein ähnliches Verhalten aufweisen, werden hierfür weit verbreitete Zellerkennungsmoleküle verantwortlich gemacht. Membranpräparationen früher postnataler Entwicklungsstadien werden weiterhin als Substrat einwachsender entorhinaler Fasern bevorzugt, was die Bedeutung zeitlich regulierter Expressionsmuster unterstreicht. Skutella et al (1999) machen vornehmlich integrale Membranproteine für das gezielte Auswachsen axonaler Fortsätze verantwortlich und weisen neben N-CAM eine deutliche L1-Immunreaktivität in verwendeten Membranpräparationen nach. Die auf Axone beschränkte L1-Expression (Persohn & Schachner 1990) macht eine Beteiligung dieses Moleküls auf hippokampaler Seite allerdings eher unwahrscheinlich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte eine weit verbreitete mRNA-Expression der vier L1-Familienmitglieder innerhalb des Cortex detektiert werden. Zudem sind auf Proteinebene L1-Familienmitglieder in sämtlichen Schichten des Hippocampus zu finden (Lustig et al 2001; Miller et al 1993). Es kann also davon ausgegangen werden, dass die gezielte Expression einzelner Zellerkennungsmoleküle der L1-Familie im Wechselspiel mit einer Vielzahl weiterer Moleküle (s. 1.4.4, S. 10) den Aufbau funktioneller, neuronaler Schaltkreise beeinflusst. Gestützt wird diese Hypothese weiterhin durch die bis in das adulte Stadium erhöhte Expression dieser Moleküle in Regionen fortwährender Synaptogenese wie dem Bulbus olfactorius und Hippocampus. Beide Hirnregionen zeichnen sich auch im adulten Tier durch die Rekrutierung neugeborener Neurone und den ständigen Umbau synaptischer Verbindungen aus (Cameron & McKay 2001; Carleton et al 2003). Hinzukommende Neurone müssen in bestehende Verbindungen einbezogen werden. Mechanismen der synaptischen Plastizität erfordern genau wie entwicklungsabhängige Prozesse eine hohe Dynamik adhäsiver Verbindungen. L1 nimmt Einfluss auf die Ausbildung der Langzeitpotenzierung (Luthi et al 1996; Luthl et al 1994) und wird durch spezifische Aktivitätsmuster in seiner Expression reguliert (Itoh et al 1995). Da L1-defiziente Mäuse keine Beeinträchtigungen bei der Ausbildung von LTP zeigen, ist die funktionelle Bedeutung dieses Moleküls bei derartigen Prozessen jedoch in Frage gestellt (Bliss et al 2000). Inwieweit weitere Mitglieder der L1-Familie entsprechende Aufgaben übernehmen ist bis heute ungeklärt.

4.2.3 Die Expression von L1-Familienmitgliedern in Gliazellen steht im engen

Zusammenhang zur aktiven Myelinisierung und Zellmigration

Neben der Verteilung neuronaler Transkripte wurde die Expression von L1-Familienmitgliedern in Gliazellen untersucht. Oligodendrozyten bzw. Astrozyten wurden

Diskussion

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anhand der Expression spezifischer Markerproteine (MAG: Oligodendrozyten, GFAP: Astrozyten) identifiziert. MAG-Sonden markierten einzelne Zellkörper und gestatten eindeutige Aussagen über Koexpressionen mit L1-Familienmitgliedern zu allen untersuchten Zeitpunkten. GFAP zeigte ein Expressionsmaximum um P14 und wurde im adulten Tier nur schwach detektiert. Zudem lieferten RNA-Sonden eine eher diffuse, filamentöse Färbung (Landry et al 1990), so dass Kolokalisationsstudien mit Transkripten der L1-Familienmitglieder nur in wenigen Hirnregionen während der frühen postnatalen Entwicklung vorgenommen werden konnten. Zur Expression von L1 in Astro- bzw. Oligodendrozyten sind in der Literatur zum Teil kontroverse Daten zu finden. Während verschiedene Arbeitsgruppen die Expression dieses Moleküls in beiden Gliazellpopulationen beschreiben (Itoh et al 2000; Takeda et al 1996), wurde in Übereinstimmung mit der Arbeit von Hillenbrand et al. (Hillenbrand et al 1999) eine eindeutige L1-Expression auf mRNA-Ebene in Gliazellen des ZNS nicht nachgewiesen. Auch CHL1-mRNA zeigte keine Kolokalisationen mit GFAP- bzw. MAG-Transkripten. Diese Beobachtung steht nicht im Widerspruch zu der bisher beschriebenen CHL1-Expression in Astrozyten, welche sich in vivo auf Subpopulationen entlang der Lamina cribosa des optischen Nervs bzw. auf reaktive Zellen beschränkt (Hillenbrand et al 1999; Rolf et al 2003). In Oligodendrozyten wurde CHL1 bislang ausschließlich in Vorläuferzellen detektiert, ausgereifte Zellen zeigen, wie auch in der vorliegenden Arbeit, keine Expression dieses Moleküls (Hillenbrand et al 1999; Holm et al 1996). Im Gegensatz dazu wurden Neurofascin- und NrCAM-Transkripte während der frühen postnatalen Entwicklung verschiedenen Gliazellpopulationen zugewiesen. Entsprechend der Arbeit von Collinson et al. (Collinson et al 1998) wurde eine ausgeprägte Neurofascin-Expression in Oligodendrozyten während der frühen postnatalen Entwicklung detektiert. Anhand der vorliegenden Studie wurde zudem gezeigt, dass neben dem zeitlichen Expressionsverlauf auch die räumliche Verteilung Neurofascin-positiver Gliazellen im Einklang mit aktiven Myelinisierungsprozessen innerhalb des ZNS steht. Neurofascin exprimierende Oligodendrozyten nahmen mit fortschreitender Myelinisierung entlang eines caudo-rostralen Gradienten zu. Während Neurofascin/MAG positive Zellen bereits zum Tag E16 in frühen Anlagen des Cerebellums detektiert werden konnten, traten Kolokalisationen dieser Moleküle im Bulbus olfactorius erstmals zu P14 auf. Mit Beendigung der Myelinisierung axonaler Fasern wurde eine deutliche Abnahme der Neurofascin Transkription in Oligodendrozyten ab P21 beobachtet. Dieses Expressionsmuster deckt sich mit dem des myelin basic proteins (MBP), welches als Markerprotein aktiver Myelinisierungsprozesse angesehen wird (Foran & Peterson 1992), und bestätigt die bereits oftmals für Neurofascin postulierte Schlüsselfunktion beim Aufbau spezifischer Axon-Glia Kontakte (Davis et al 1996; Lambert et al 1997; Tait et al 2000). Neurofascin/GFAP-Kolokalisationen konnten zu keinem der untersuchten Zeitpunkte gefunden werden. Die

Diskussion

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Expression in einer Subpopulation von Astrozyten wurde ausschließlich für NrCAM beobachtet. NrCAM-Transkripte waren zum Tag P14 in Koexpression mit GFAP in spezialisierten Astroglia des Cerebellums (Bergmann-Glia), deren Zellkörper entlang der PCL lokalisiert sind, zu finden. Obwohl NrCAM-mRNA auch im adulten Tier in der PCL gefunden wurde, traten Koexpressionen nach Ausdifferenzierung der cerebellären Cytoarchitektur zum grössten Teil mit Neurofascin innerhalb der Purkinjezellen auf. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der von Lustig et. al. (Lustig et al 2001) beschriebenen transienten Expression von NrCAM in Radialglia während der Embryonalentwicklung des Maushirns und lässt auf Funktionen bei der Zellmigration schließen. Die Zellmigration cerebellärer Körnerzellen entlang der Bergmann-Glia ist erst ab ca. P21 abgeschlossen und steht somit im engen Zusammenhang zu einer erhöhten NrCAM-Expression sowohl innerhalb migrierender Neurone als auch wegweisender Gliazellen (s. a. Abb. 25).

4.3 Interaktionsstudien Um zelluläre Prozesse wie Migration, axonales Wachstum sowie Aufbau und Festlegung spezifischer Zell/Zell-Kontakte zu beeinflussen, müssen extrazelluläre Signale an das Zellinnere weitergegeben werden. Mitglieder der L1-Familie zeichnen sich durch ein komplexes Bindungsverhalten aus. Extrazellulär wurden neben homophilen Interaktionen (Hillenbrand et al 1999) eine Vielzahl heterophiler Liganden beschrieben (Übersichtsartikel: Hortsch 1996, s.a. Einleitung 1.4.4). Zellantworten sind trotz gleicher Rezeptor-Ligand Kombinationen nicht immer identisch (Kleene et al 2001) und lassen auf eine Beteiligung unterschiedlicher intrazellulärer Signalwege schließen. Das Auffinden von Interaktionspartner auf cytoplasmatischer Seite hilft, mögliche Verbindungen zu intrazellulären Signalwegen herzustellen, und bildete einen weiteren Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit.

4.3.1 NrCAM besitzt ein funktionelles PDZ-Bindungsmotiv und zeigt spezifische

Interaktionen mit den MAGUKs SAP90/PSD95 und SAP97

Trotz der hohen Homologie der intrazellulären Bereiche einzelner L1-Familienmitglieder werden insbesondere am C-Terminus von L1, CHL1, Neurofascin und NrCAM deutliche Unterschiede in der AS-Folge gefunden (Holm et al 1996). Während die aus Invertebraten bekannten L1-Homologen Neuroglian und LAD-1 über ein charakteristisches PDZ-Bindungsmotiv an ihrem C-Terminus verfügen (Chen et al 2001), trägt nur NrCAM eine entsprechende AS-Sequenz innerhalb der Vertebraten-Familie (-SFVCOOH, Songyang et al 1997). Da nichts über die Funktionalität dieser putativen PDZ-Bindungsstelle bekannt war, wurden mögliche Interaktionen zwischen der cytoplasmatischen Domäne von NrCAM und PDZ-Domänen der MAGUKs PSD95/SAP90, SAP97 und ZO-1 sowie dem

Diskussion

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Synapsenassoziierten Protein ProSAP2/Shank3 im Hefe-Zwei-Hybrid System untersucht. Analoge L1-, CHL1- und Neurofascin bait-Konstrukte wurden kloniert und unter gleichen Bedingungen getestet. Erwartungsgemäß zeigten weder L1 noch CHL1 im Hefe-Zwei-Hybrid System Interaktionen mit PDZ-Domänen der genannten Proteine. Obwohl Neurofascin mit der zweiten PDZ-Domäne von Syntenin-1 interagiert (Koroll et al 2001), wurde eine Interaktion mit PDZ-Domänen der in dieser Arbeit getesteten Proteine nicht detektiert. NrCAM zeigte spezifische Interaktionen mit PDZ-Domänen der MAGUKs PSD95/SAP90 und SAP97. Keine Interaktion fand dagegen zwischen NrCAM und den PDZ-Domänen von ZO-1 und ProSAP2 statt. Während die genannten Interaktionen unabhängig vom Vorhandensein des RSLE-Motives beobachtet wurden, führte ein AS-Austausch innerhalb der postulierten PDZ-Bindungsdomäne (SFV→SFA) zur Zerstörung der NrCAM/PDZ-Bindung. Proteinbiochemisch wurde die Spezifität dieser Interaktion unter Anwendung eines Präzipitationsassays bestätigt. Sepharose beads gekoppelt mit den letzten 12 AS des NrCAM- C-Terminus zeigten eine hohe Affinität zu SAP97 und präzipitierten sowohl rekombinant als auch endogen exprimiertes Protein aus COS-Zelllysaten bzw. Hirnextrakten. In Übereinstimmung mit gezeigten Interaktionen in der Hefe fanden Präzipitationen ausschließlich mit einem funktionellen PDZ-Bindungsmotiv statt. Weiterhin war das Vorhandensein der PDZ-Domänen 1 und 2 innerhalb des SAP97 Proteins für Interaktionen mit dem C-Terminus von NrCAM erforderlich. Neben SAP97 präzipitieren Peptid-gekoppelte Sepharose beads SAP90/PSD95 aus Hirnlysaten. Unter Einsatz desselben Ausgangsmaterials wurde dagegen keine Präzipitation von ProSAP1 beobachtet. Insgesamt belegen diese Daten die Funktionalität und Spezifität des PDZ-Bindungsmotivs auf Seiten von NrCAM und stehen im Einklang mit der von Bezprozvanny und Maximov (Bezprozvanny & Maximov 2001) vorgenommenen Einteilung unterschiedlicher PDZ-Domänen hinsichtlich ihrer Ligandenspezifität. Demnach besitzen SAP90/PSD95 und SAP97 PDZ-Domänen des selben Typs und interagieren mit dem klassischen -S/T-X-Φ Motiv (X = beliebige AS, Φ = hydrophobe AS). ZO-1 zeichnet sich durch PDZ-Domänen unterschiedlicher Bindungseigenschaften aus. So bindet beispielsweise die PDZ-Domäne 1 dieses Moleküls an das -X-YV Motiv der Claudine 1-8 (Itoh et al 1999). Weiterhin wurde eine Interaktion zwischen den PDZ-Domänen von ZO-1 und dem -SVWI-Motiv des Connexins45 beschrieben (Kausalya et al 2001). Die PDZ-Domäne von Mitgliedern der ProSAP/Shank-Familie besitzt mit ca. 30 % Übereinstimmung eine nur geringe Homologie zu entsprechenden Domänen der MAGUKs SAP90 (PDZ1) und -97 (PDZ2) (Boeckers et al 1999a). Obwohl eine Bindung an das klassische -S/T-X-Φ Motiv gefunden werden kann, werden die AS Leucin und Isoleucin gegenüber Valin in der C-terminalen Position bevorzugt (Kreienkamp et al 2002)

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4.3.1.1 NrCAM beeinflusst die subzelluläre Verteilung von SAP97 in COS-7 Zellen

Die Interaktion von NrCAM mit SAP97 in eukaryotischen Zellen und ihr Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation von SAP97, wurde anhand von Expressionsstudien in COS-7 Zellen untersucht. Während SAP97 in einzeltransfizierten Zellen in perinukleären Bereichen akkumulierte (Murata et al 2001; Tiffany et al 2000), fand infolge einer SAP97/NrCAM Kotransfektion die erhöhte Rekrutierung des Proteins an die Zelloberfläche statt. Gestützt wurde diese Beobachtung durch ein NrCAM-induziertes Clustering von SAP97 entlang der Zellmembran, welches in Übereinstimmng mit Interaktionsstudien in der Hefe und proteinbiochemischen Daten ausschließlich mit einem funktionellen PDZ-Bindungsmotiv erreicht werden konnte. Interaktionen fanden hierbei über die PDZ Domänen 1-2 auf Seiten von SAP97 statt. SAP97 ist das Säugerhomolog des Drosophila DLG (Discs-large) Proteins und wird gemeinsam mit SAP90/PSD95, Capsyn-110/PSD93 und SAP102/NE-DLG in der Familie DLG-ähnlicher membranassoziierter Guanylatkinasen (MAGUKs) zusammengefasst. Mitglieder dieser Proteinfamilie besitzen eine einheitliche Anordnung multipler Proteindomänen, bestehend aus drei PDZ-Domänen, gefolgt von einer SH3 - Domäne, der I3 - Region und einer nicht-aktiven Guanylatkinase (GUK)-Domäne (Dimitratos et al 1999). MAGUKs sind ähnlich wie Zellerkennungsmoleküle verstärkt innerhalb von Zell/Zellkontakten wie Synapsen zu finden. Das synaptische Targeting Membranassoziierter Guanylatkinasen wird von einer Vielzahl an Faktoren bestimmt. Neben einer N-terminalen Palmytoylierung nehmen die PDZ-Domänen 1-2 sowie ein C-Terminal lokalisiertes Targeting-Motiv entscheidenden Einfluss auf die Anreicherung von SAP90 innerhalb der postsynaptischen Dichte (PSD, Craven & Bredt 2000; Craven et al 1999; El-Husseini et al 2000). Ein von Palmytoylierungen unabhängiges Targeting wird in Spleißvarianten von SAP90 sowie in SAP97 über das N-terminal lokalisierte L27-Motiv (benannt nach den Proteinen Lin2 und Lin7, Doerks et al 2000) vermittelt (Chetkovich et al 2002; Mendoza et al 2003; Wu et al 1998). Eine Anreicherung von DLG- bzw. SAP97-Isoformen entlang dendritischer Spines wird weiterhin durch das innerhalb der I3- bzw. HOOK-Region lokalisierte Protein 4.1 Bindungsmotiv moduliert (Rumbaugh et al 2003; Thomas et al 2000). Neben einer dendritischen Lokalisation zeigen DLG-verwandte Proteine deutliche Immunreaktivitäten ausserhalb synaptischer Kontakte entlang axonaler Fortsätze (Aoki et al 2001; Muller et al 1995). Die Verteilung innerhalb unterschiedlicher Subkompartimente neuronaler Zellen lässt unterschiedliche Targeting-Mechanismen vermuten (s.Abb. 26).

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Abb. 26 Subzelluläres Targeting der MAGUKs SAP97/SAP90 in neuronalen Zellen

Schematische Abbildung fasst bisher beschriebene und in dieser Arbeit postulierte Mechanismen des subzellulären Targetings der MAGUKs SAP97 und SAP90 zusammen.

Welche Faktoren letztendlich eine axonale Lokalisation dieser Proteine bedingen ist bis heute ungeklärt. In Drosophila wurden Interaktionen zwischen DLG und dem präsynaptisch lokalisierten Zellerkennungsmolekül Fasciclin II beschrieben, welche analog zu der in dieser Arbeit gezeigten NrCAM/SAP97 Interaktion zwischen dem C-Terminus von FasciclinII und den PDZ-Domänen 1-2 von DLG stattfinden. Zudem konnte die Ausbildung membranständiger Multiproteinkomplexe zwischen DLG, FasciclinII und spannungsabhängigen Kalium-Kanälen (KV) in COS-7 Zellen beobachtet werden (Thomas et al 1997). Auch die Säuger-Homologen SAP90 und SAP97 zeigen Interaktionen mit entsprechenden Kalium-Kanälen (Kim & Sheng 1996; Murata et al 2001). Eine Kolokalisation dieser Proteine konnte in Vertebraten bereits in verschiedenen Membranspezialisierungen gefunden werden (Baba et al 1999; Laube et al 1996). In COS-Zellen nehmen SAP90 bzw. SAP97 unterschiedlichen Einfluss auf die subzelluläre Verteilung von KV-Kanälen. Während SAP90 und KV-Kanäle Aggregate entlang der Zellmembran bilden, inhibiert SAP97 das subzelluläre Targeting dieser Ionenkanäle. SAP97/KV-Cluster werden ausschließlich in intrazellulären Kompartimenten detektiert (Murata et al 2001; Tiffany et al 2000). Trotz Einsatz desselben Zellsystems nahm SAP97 in der vorliegenden Studie keinen Einfluss auf die endogene Verteilung von NrCAM in kotransfizierten COS-Zellen. Vielmehr induzierte NrCAM eine Umverteilung des SAP97-Proteins und bedingte die erhöhte Rekrutierung des Moleküls an die Zellmembran. Interessant wäre es also zu untersuchen, ob NrCAM – ähnlich wie FasciclinII – in der Lage ist, die subzelluläre Lokalisation von SAP97/KV-Komplexen zu beeinflussen. In vivo können sowohl NrCAM,

Dendriten Axon

SAP97/SAP90 - Targeting

Ranviersche SchnürringePräsynaptische Endigungen

• NrCAM/PDZ1-2 ??? • Weitere Faktoren ?

Postsynaptische Membranen

• N-terminale Palmytoylierung• PDZ 1-2• C-terminales Targeting-Motiv• L27-Motiv• I3/HOOK-Region

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MAGUKs als auch KV-Kanäle innerhalb Ranvierscher Schnürringe detektiert werden (Girault & Peles 2002). Im adulten Tier ist NrCAM gemeinsam mit Neurofascin, AnkyrinG und Na+-Kanälen in der nodalen Region Ranvierscher Schnürringe lokalisiert (Lambert et al 1997), KV-Kanäle und SAP90 (oder verwandte Proteine, Baba et al 1999) werden dagegen in juxtanodalen Bereichen gefunden. Bis zum Aufbau dieser Proteinverteilung kann eine zeitlich geordnete Abfolge molekularer Ereignisse während der Entwicklung beobachtet werden (Girault & Peles 2002). Vor Abschluss der Myeliniserung sind sowohl NrCAM als auch Neurofascin und Ankyrine einheitlich über das Axon verteilt. Die anschließende Ausbildung von NrCAM und Neurofascin Aggregaten in nodalen Regionen geht der Umverteilung von AnkyrinG voraus (Lambert et al 1997). Auch KV-Kanäle sind zunächst in der nodalen Region lokalisiert, bevor sie ihre endgültige Postion in juxtanodalen Bereichen einnehmen (Vabnick et al 1999). Welche Moleküle letztendlich das korrekte Targeting spannungsabhängiger K+-Kanäle bedingen ist bislang ungeklärt. Denkbar wäre eine indirekte, über PDZ-Domänen vermittelte, transiente Bindung an NrCAM, welche in Abwesenheit von AnkyrinG stattfindet. Interaktionen zwischen Mitgliedern der L1-Familie und Ankyrinen werden über den Phosphorylierungszustand der Ankyrin-Erkennungssequenz (FIGQY) reguliert (Garver et al 1997). Die Tyrosinphosphorylierung innerhalb dieser Sequenz unterliegt einem entwicklungsabhängigen Muster und tritt vornehmlich während der frühen Entwicklung auf (Jenkins et al 2001). Sie setzt Bindungsaffinitäten zwischen L1-Familienmitgliedern und Ankyrinen deutlich herab (Garver et al 1997) und gibt möglicherweise Erkennungssequenzen für andere Interaktionspartner frei. Inwieweit eine Interaktion zwischen NrCAM und PDZ-Domänen tatsächlich über den Phosphorylierungszustand von NrCAM beeinflusst wird, bedarf jedoch einer weiteren Untersuchung. In Vertebraten wurde eine Interaktion zwischen SAP90 und Zellerkennungsmolekülen bisher ausschließlich innerhalb der PSD beschrieben (Irie et al 1997). Während sich viele Arbeiten mit der funktionellen Bedeutung und dem Targeting DLG-ähnlicher Proteine innerhalb synaptischer Membranen auseinandersetzen, ist nur wenig über ihre extra-synaptische Bedeutung bekannt. Aktuelle Arbeiten in Drosophila heben gerade derartige Funktionsweisen hervor und beschreiben schwere axonale Defekte nach selektiver Blockierung der Proteinexpression einer neuronenspezifischen DLG-Isoform. Untersuchte Embryonen zeigen neben einer gestörten Faszikulierung deutliche Beeinträchtigungen in der axonalen Wegfindung (Mendoza et al 2003). Überlappende Expressionsmuster (Lustig et al 2001; Muller et al 1995) und Funktionsweisen in vivo, sowie die in dieser Arbeit in verschiedenen Modellsystemen beschriebene Interaktion zwischen NrCAM und SAP97 geben deutliche Hinweise auf eine Funktionalität derartiger Interaktionen insbesondere während der Entwicklung des Nervensystems. Neben einer Interaktion zwischen NrCAM und Mitgliedern der MAGUK-Familie sind Interaktionen mit weiteren Gerüstproteinen durchaus denkbar. So zeigen NrCAM-defiziente

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Mäuse die Ausbildung von Katarakten, was mit einer gestörten Ausbildung von gap junctions in der Linse betroffener Tiere einhergeht (More et al 2001). Welche Faktoren diesen Phänotyp bedingen ist bislang ungeklärt. Möglicherweise ist NrCAM am Aufbau derartiger Zell-Zellkontakte über die Rekrutierung von Gerüstproteinen an die Zellmembran beteiligt. Bereits heute wurden Interaktionen zwischen Connexinen und ZO-1 (Kausalya et al 2001) beschrieben. Interaktionen zwischen NrCAM und ZO-1 konnten in der vorliegenden Studie jedoch nicht gefunden werden. Ob andere Proteine indirekte Verbindungen zwischen NrCAM und Connexinen herstellen können, bedarf einer weiteren Klärung. Das in dieser Arbeit etablierte Präzipitationsassay liefert ein potentielles Werkzeug zur Bearbeitung dieser Fragestellung und zur Isolierung weiterer Interaktionspartner des C-Terminus von NrCAM.

4.3.2 Isolierung eines putativen CHL1 Interaktionspartners unter Anwendung der

Hefe-Zwei-Hybrid Technik

Der Screen einer Rattenhirn-cDNA-Bibliothek unter Anwendung eines bait-Konstruktes kodierend für die cytoplasmatische Domäne von CHL1 führte zur Isolierung eines cDNA-Fragmentes mit Homologien zu bisher nicht charakterisierten Proteinen bzw. Protein-Isoformen. Insgesamt konnten sowohl auf cDNA- als auch auf genomischer Ebene nur unvollständige Aussagen über die Identität des, in dieser Arbeit beschriebenen, putativen CHL1 Interaktionspartners – hier als CHL1-23 bezeichnet – getroffen werden. Der N-terminale Bereich des Proteins zeigte eine fast 100% Homologie zu dem hypothetischen Protein AK046967 (lokalisiert auf Chromosom 18 der Maus) und einer putativen Isoform des Dystrobrevin Binding Proteins 1 (DTNBP1, lokalisiert auf Chromosom 13 der Maus). Auf genomischer Ebene konnte für den entsprechenden Bereich trotz Fortschreiten der Genomprojekte derzeit keine Zuordnung getroffen werden. Im Gegensatz dazu wurden für kodierende Sequenzen des CHL1-23-Carboxyterminus (ohne Homologien zu bekannten bzw. hypothetischen Proteinen) ausschließlich Datenbankeinträge auf genomischer Ebene gefunden. Entsprechende cDNA-Sequenzen wurden auf 3 Exonen des Chromosoms 17 der Ratte bzw. einem Exon des Chromosoms 18 der Maus lokalisiert. Es ist demnach anzunehmen, dass CHL1-23 von einem bisher nur unvollständig sequenzierten Gen kodiert wird. Vermutlich enthält dieses Gen zahlreiche Exone, was zu einer Vielzahl alternativer Spleißprodukte führen könnte. So ist es beispielsweise möglich, dass AK046967 und CHL-23 aufgrund der gleichen Chromosom-Zugehörigkeit putative Spleißvarianten darstellen. Da der N-Terminus von CHL1-23 auf Proteinebene Homologien zu unterschiedlichen Genen zeigte, könnte es sich hierbei um eine konservierte Proteindomäne handeln, die in verschiedenen Molekülen zu finden ist. Eindeutige Aussagen hierüber lassen sich allerdings erst nach endgültigem Abschluss der Genomprojekte treffen. Interessant wäre es jedoch, diesen Aspekt im Zusammenhang mit einer CHL1-Interaktion anhand der putativen

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DTNBP1-Isoform zu untersuchen. Bisher weist ausschließlich der in Datenbanken beschriebene EST-Klon (Accession Nr. AK046967) auf das Vorkommen dieser Isoform hin. Dystrobrevin und bindende Moleküle sind innerhalb des Dystrophin-Glykoprotein Komplexes (DGC) zu finden. Der DGC wurde erstmals innerhalb der neuromuskulären Endplatte beschrieben, kann jedoch auch in weiteren synaptischen Verbindungen und Membranspezialisationen gefunden werden. DGC stellt Verbindungen zum Cytoskelett her und ist auf diese Weise an der Stabilisierung spezifischer Zell/Zell-Kontakte beteiligt. Weiterhin wird die Beteiligung dieses Komplexes an der transmembranen Signalleitung diskutiert (Grady et al 2000, Albrecht & Froehner et al., 2002). Interaktionen mit Zellerkennungsmolekülen sind also aufgrund vergleichbarer Funktionsweisen durchaus denkbar. Interessanterweise werden sowohl Defekte innerhalb des humanen DTNBP1-Gens als auch des humanen CHL1-Gens (CALL: Cell adhesion L1 like) mit Schizophrenie in Verbindung gebracht (Sakurai et al 2002; van den Oord et al 2003). Obwohl Interaktionen zwischen dem N-terminalen Bereich von CHL1-23 (mit Homologie zur DTNBP1-Isoform) und CHL1 in der Hefe nicht gezeigt werden konnten, sind Interaktionen mit dem Wildtyp-Protein nicht auszuschließen. Möglicherweise werden für eine Bindung benötigte Strukturen nur über zusätzliche Proteinabschnitte stabilisiert, was jedoch in weiteren Versuchen geklärt werden sollte (s.a. Koroll et al 2001, trotz des Nachweises einer spezifischen Bindung zwischen Neurofascin und der zweiten PDZ-Domäne von Syntenin-1, können Interaktionen in der Hefe ausschließlich mit einem Konstrukt kodierend für die Syntenin-PDZ-Domänen 1 und 2 erreicht werden). Interaktionen in der Hefe konnten weiterhin zwischen CHL1-23 und L1 bzw. Neurofascin detektiert werden. CHL1-23 als intrazellulärer Interaktionspartner könnte somit eine Bedeutung bei grundlegenden Funktionsweisen neuronaler Zellerkennungsmoleküle übernehmen. Gestützt wird diese Vermutung durch die weit verbreitete Expression des Moleküls im adulten Maushirn, welche in weiten Teilen mit der Expression von L1-Familienmitgliedern übereinstimmte. Insgesamt bietet der in dieser Arbeit isolierte putative Interaktionspartner von CHL1 Möglichkeiten zur weiteren Charakterisierung von Zellerkennungsmolekülen der L1-Familie. Da bisher nur unvollständige Aussagen zur Identität von CHL1-23 getroffen werden konnten, ist zunächst die Isolierung bzw. Klonierung der full-length cDNA zur weiteren Charakterisierung von Proteineigenschaften erforderlich. Da der PCR-Screen der in 2.7.8 beschriebenen cDNA-Bank unter Anwendung unterschiedlicher Primerkombinationen (nicht gezeigt) bisher nicht zur Isolierung eines CHL1-23 full-length Klons führte, sollten weitere Strategien für diesen Ansatz überlegt werden (beispielsweise Screen von DNA-Banken mittels Hybridiserung unter Anwendung der in dieser Arbeit isolierten cDNA). In der Hefe gezeigte Interaktionen sind weiterhin in unabhängigen Systemen zu bestätigen.

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4.4 Gen-Targeting

4.4.1 Klonierung eines Neurofascin Targeting-Konstrukts

Neben der Beschreibung entwicklungsabhängiger Expressionsmuster und dem Auffinden neuer Interaktionspartner bietet das gezielte Ausschalten einzelner Gene die Möglichkeit, postulierte Genfunktion in vivo zu überprüfen. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit klonierte Neurofascin Targeting-Konstrukt bildet die Basis zur Erzeugung und Charakterisierung Neurofascin-defizienter Mäuse, dessen Phänotyp bislang nicht beschrieben wurde. Genomische DNA, welche zum Targeting genutzte Genabschnitte umfasst, wurde über den Screen einer Lambda-Phagen Bank isoliert und charakterisiert. Auf der Grundlage gewonnener DNA-Sequenzen wurden Nachweismethoden etabliert, welche die Grundvoraussetzung für ein korrektes Targeting sind. Abschließend wurde ein Neurofascin-Targeting Konstrukt kloniert. Dieses Konstrukt bietet aufgrund eingebrachter loxP-Erkennungssequenzen in Intronbereichen ober- und unterhalb des ATG-Exons die Möglichkeit, Genfunktionen zelltypspezifisch bzw. zu definierten Zeitpunkten auszuschalten. Der Einsatz des induzierbaren Cre/loxP Systems zeigt insbesondere bei der Charakterisierung Neurofascin-spezifischer Genfunktionen eine Reihe von Vorteilen. Neurofascin grenzt sich während der frühen postnatalen Entwicklung durch seine ausgeprägte Expression in Oligodendrozyten deutlich von anderen Mitgliedern der L1-Familie ab (Collinson et al 1998, diese Arbeit). Verschiedene Protein-Isoformen zeigen hierbei eine zelltypspezifische Verteilung. Während eine 186 kDa Isoform (NF186) in Neuronen detektiert werden kann, ist eine 155 kDa Variante (NF155) vornehmlich in Oligodendrozyten zu finden (Tait et al 2000). NF186 und NF155 sind maßgeblich am Aufbau Ranvierscher Schnürringe beteiligt. Auf axonaler Seite ist NF186 in Kolokalisation mit NrCAM und AnkyrinG in nodalen Bereichen Ranvierscher Schnürringen zu finden und geht cis-Interaktionen mit spannungsabhängigen Na+-Kanälen ein (Ratcliffe et al 2001). Auf der Gliazellseite ist NF155 in paranodalen Bereichen lokalisiert und geht trans-Interaktionen mit dem axonal verankerten Caspr/Paranodin-Contactin Komplex ein (Charles et al 2002). Die auf diese Weise aufgebaute transzelluläre Verbindung wirkt möglicherweise als Diffusionsbarriere und bedingt die strikte räumliche Trennung nodaler und juxtanodaler Proteinkomponenten (Winckler et al 1999), welche Grundlage der saltatorischen Erregungsleitung ist. Verschiedene Mausmodelle weisen bereits heute auf die Wichtigkeit der paranodalen Glia/Neuron Verbindung hin. Ceramid-Galactosyltransferase- (essentielles Enzym für die Synthese der Myelinkomponenten Galactocerebrosid und –sulfatid) defiziente Mäuse zeigen deutliche Veränderungen im Aufbau paranodaler Kontakte. Während auf Gliazellseite NF155 innerhalb paranodaler Loops fehlt, kann auf axonaler Seite neben einer veränderten Verteilung des Caspr/Paranodin-Contactin Komplexes die Ansammlung spannungsabhängiger K+-Kanäle in paranodalen Regionen beobachtet werden. Die

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Aggregation von NF186 und spannungsabhängigen Na+-Kanälen in nodalen Bereichen wird dagegen nicht gestört (Dupree et al 1999; Poliak et al 2001). Ein vergleichbarer Phänotyp kann in Caspr/Paranodin-Knockout-Tieren beobachtet werden. Insgesamt führen diese Mutationen zu schweren neurologischen Defekten mit stark veränderten Leitfähigkeiten axonaler Bahnen (Bhat et al 2001). Ob NF155 tatsächlich eine tragende Rolle beim Aufbau juxta- und paranodaler Mikrodomänen innerhalb Ranvierscher Schnürringe trägt, kann möglicherweise durch die Charakterisierung Neurofascin-defizienter Mäuse geklärt werden. Das Cre/loxP-System bietet hierbei die Möglichkeit, Genfunktionen gezielt in Oligodendrozyten bzw. Neuronen zu beeinflussen. Interessant wäre beispielsweise die Kreuzung homozygoter Mäuse, welche das gefloxte Neurofascin-Gen tragen, mit transgenen Tieren, welche die Cre-Rekombinase unter dem Oligodendrozyten-spezifischen MBP-Promotor exprimieren (in Datenbanken beschrieben unter: http://www.mshri.on.ca/nagy/Cre-pub.html). MBP zeigt einen mit Neurofascin vergleichbaren Expressionsverlauf (s. a. 4.2.3), was ein gezieltes Ausschalten von Genfunktionen während aktiver Myelinisierungsprozesse ermöglicht. Desweiteren bietet auch das gezielte Ausschalten neuronaler Genfunktionen interessante Fragestellungen. Neurofascin kann in Kolokalisation mit NrCAM, AnkyrinG und spannungsabhängigen Na+-Kanälen nicht nur in nodalen Bereichen Ranvierscher Schnürringe gefunden werden. Membranspezialisationen mit gleichem Proteinaufbau sind außerdem in initialen Axonsegmenten cerebellarer Purkinjezellen lokalisiert (Jenkins & Bennett 2001a) Beide Strukturen sind für die Initiierung von Aktionspotentialen verantwortlich und somit maßgeblich am neuronalen Informationsausstausch beteiligt. Inwieweit Neurofascin an der Rekrutierung und Cluster-Bildung spannungsabhängiger Na+-Kanälen beteiligt ist (postuliert von: Lambert et al 1997; Lustig et al 2001a), wäre anhand des gezielten Ausschaltens der neuronalen Neurofascin-Expression, was selbst auf Purkinjezellebene möglich ist (L7/pcp-2 Promotor, Barski et al 2000), zu untersuchen.

4.5 Schlussfolgerung und Ausblick Die evolutionsbedingte Weiterentwicklung zentralnervöser Gewebe, kann anhand der zunehmenden Komplexität morphologischer Strukturen und neuronaler Schaltkreise beobachtet werden. Die korrekte Ausdifferenzierung und Aufrechterhaltung eines funktionellen Gewebeverbandes setzt zunehmend präzise Zellerkennungsprozesse voraus, welche maßgeblich durch membranständige Moleküle beeinflusst werden. Während Invertebraten nur einen Vertreter neuraler Zellerkennungsmoleküle L1-Familie besitzen, sind in Säugetieren vier Mitglieder dieser Gen-Familie (L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin) zu finden. Die Enstehung vier homologer Gene lässt, trotz der Beibehaltung eines einheitlichen strukturellen Bauplanes, die Spezialisierung einzelner Familienmitglieder vermuten – eine Hypothese die insbesondere durch die vorliegende Arbeit bestätigt wird. Die familienübergreifende Studie postnataler Expressionsmuster der L1-Mitglieder zeigte subtile

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Unterschiede in dem zeitlich regulierten Auftreten einzelner Transkripten. Während die neuronale Expression von L1 und NrCAM mit zellulären Prozessen der Migration und des Neuritenwachstums korrelierte, konnte CHL1-mRNA verstärkt zu Zeitpunkten einsetzender Synaptogenese detektiert werden. Regionen- bzw. zelltypspezifische Expressionsmuster lassen zudem einen spezifischen Beitrag der L1-Familienmitglieder beim Aufbau neuronaler Kontakte vermuten. Die in dieser Arbeit beschriebenen Expressionsmuster helfen beim gezielten Auffinden individueller Funktionsweisen der Moleküle L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin. So wäre es beispielsweise interessant, eine Beteiligung von CHL1 am Aufbau synaptischer Verbindungen auf molekularer Ebene zu untersuchen. CHL1-defiziente Mäuse zeigen fehlerhafte axonale Projektionen in Bereichen des Hippokampus und Bulbus olfactorius (Montag-Sallaz et al 2002). Aktuelle Arbeiten beschreiben zudem eine veränderte Prozessierung neuer und vertrauter Reize (Montag-Sallaz et al 2003). Ob CHL1 einen direkten Einfluss auf synaptische Eigenschaften nimmt, ist bislang jedoch ungeklärt und sollte Thema weiterer Forschungsarbeiten sein. Möglicherweise trägt auch der in dieser Arbeit identifizierte, putative Interaktionspartner (CHL1-23) von CHL1 zu einem weiteren Verständnis derartiger Prozesse bei. Individuelle Bindungseigenschaften nehmen weiteren Einfluss auf spezifische Funktionsweisen der L1-Familienmitglieder. Insbesondere das Auffinden intrazellulärer Interaktionspartner verspricht, die durch Erkennungsmoleküle vermittelten Zellantworten zu verstehen. Neben der Identifizierung eines putativen CHL1-Interaktionspartners, konnte in dieser Arbeit die Funktionlität der C-terminal lokalisierten PDZ-Bindungsdomäne von NrCAM beschrieben werden. NrCAM zeigte spezifische Interaktionen mit den MAGUKs SAP90 und SAP97. Zudem nimmt NrCAM Einfluss auf die subzelluläre Verteilung von SAP97 in heterologen Zellen. Diese Daten ermöglichen es unter Berücksichtigung der hier beschriebenen Expressionsmuster, die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion näher zu charakterisieren. Die gerichtete Inaktivierung von Gen-Funktionen bietet die Möglichkeit, Proteinfunktionen in vivo zu untersuchen. Das im Rahmen dieser Arbeit klonierte Neurofascin Targeting-Konstrukt bildet die Grundlage zur Erzeugung induzierbarer Neurofascin-Knockout-Mäuse. Gefundene Neurofascin-Expressionsmuster ermöglichen zudem die gezielte Untersuchung des Phänotyps Neurofascin-defizienter Mäuse. Neurofascin grenzte sich durch eine stark erhöhte Expression in Oligodendrozyten zu Zeitpunkten aktiver Myelinisierungsprozesse von den übrigen L1-Familienmitgliedern ab, was die Spezifität dieses Moleküls belegt. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit die Notwendigkeit der Entstehung homologer Gene im Zuge der Evolution. Homologe Gene der L1-Familie übernehmen individuelle Funktionen und ermöglichen die Anpassung an immer komplexere Vorgänge, welche die Grundlage für eine Weiterentwicklung und Funktionalität neuronaler Strukturen bilden.

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5 Zusammenfassung Neurale Zellerkennungsmoleküle erfüllen wichtige Funktionen während der Entwicklung des zentralen Nervensystems. Sie sind beteiligt an einer Vielzahl zellulärer Prozesse und nehmen entscheidenen Einfluss auf Zellmigration, Neuritenwachtum, axonale Wegfindung, Synaptogenese und Myelinisierung. Im adulten Tier wird eine Beteiligung von Zellerkennungsmolekülen an Mechanismen der synaptischen Plastizität, der Grundlage von Lernen und Gedächtnis, diskutiert. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die funktionelle Charakterisierung von Zellerkennungsmolekülen der L1-Familie. Mitglieder der L1-Familie besitzen extrazellulär sechs Ig-Domänen und vier bis fünf FN-III repeats, gefolgt von einer Transmembrandomäne und einer kurzen, hoch konservierten cytoplasmatischen Region. Säugetiere besitzen vier Vertreter dieser Gen-Familie: L1, CHL1 (Close homologue of L1), NrCAM und Neurofascin. Schwere neurologische Defekte (CRASH-Syndrom, Weller & Gartner 2001), ausgelöst durch verschiedene Mutationen innerhalb des humanen L1-Gens, unterstreichen die Bedeutung dieses Moleküls während der Entwicklung des zentralen Nervensystems und verstärken das Interesse an der funktionellen Charakterisierung dieser Protein-Familie. Während die Erforschung von L1 bereits weit fortgeschritten ist, bleiben zu den Funktionen der übrigen Familienmitglieder viele Fragen ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Beitrag zur näheren Charakterisierung von CHL1, NrCAM und Neurofascin unter verschiedenen Gesichtspunkten geleistet. Die entwicklungsabhängigen Expressionsmuster der L1-Familienmitglieder wurden auf mRNA-Ebene mittels in situ Hybridisierungen untersucht. Während sich bisher publizierte Daten vornehmlich auf die Expression einzelner L1-Mitglieder während der Embryonalentwicklung beschränken, wurde im Verlauf dieser Arbeit erstmals eine familienübergreifende Studie postnatal regulierter Expressionsmuster aufgestellt. Der direkte Vergleich von Expressionen auf mRNA-Ebene ermöglichte das Auffinden subtiler, räumlich und zeitlich regulierter Transkriptionsunterschiede, welche anhand bestehender Literaturdaten nicht ersichtlich waren. In Abhängigkeit des jeweils erreichten Entwicklungsstadiums der in dieser Arbeit untersuchten Hirnregionen konnte ein Expressionsmaximum der L1-Familienmitglieder in Korrelation mit fundamentalen Differenzierungsprozessen gefunden werden. Die nähere Betrachtung einzelner Zellpopulationen zeigte erstmals die geordnete, zeitliche Abfolge der Expression einzelner L1-Familienmitglieder. Postmitotische Körnerzellen des Hippokampus und Cerebellums zeigten bereits zu Zeitpunkten der Migration und des Neuritenwachstums deutliche Expression von L1 und NrCAM auf. Koexpression mit CHL1 wurde dagegen erst zu Zeitpunkten einsetzender Synaptogenese detektiert. Neben der zeitlichen Regulation wurden eindeutige Unterschiede in der räumlichen Verteilung der Transkripte der L1-Familienmitgliedern gefunden. Besonders auffällig war das

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Fehlen von CHL1-Transkripten im Bulbus olfactorius. Im Hippocampus grenzten sich NrCAM exprimierende Pyramidenzellen der CA2/CA3 deutlich von CHL1-exprimierenden Zellen der CA1 ab. In der Purkinjezellschicht (PCL) des Cerebellums wurden ausschließlich NrCAM und Neurofascin-Transkripte detektiert. Kolokalisationsstudien unter Anwendung der fluoreszenten in situ Hybridisierung zeigten erstmals, dass Neurofascin und NrCAM-Transkripte verschiedenen Zellpopulationen der PCL zuzuordnen sind. Während sich die Neurofascin-Expression auf Purkinjezellen beschränkte, wurden NrCAM-Transkripte während der frühen postnatalen Entwicklung vornehmlich in Kolokalisation mit GFAP-Transkripten in den Bergmann-Glia detektiert. Die zelltypspezifische, zeitlich und räumlich regulierte Expression einzelner L1-Familiemitglieder deutet neben überlappenden Funktionsweisen eine Spezialisierung der Moleküle L1, CHL1, NrCAM und Neurofascin und ihrer biologischen Funktionen an. Auf Proteinebene beeinflusst das komplexe Bindungsverhalten einzelner L1-Familienmitglieder diese spezifischen Funktionen. Während bereits eine Vielzahl homo- und heterophiler Bindungen auf extrazellulärer Seite identifiziert wurden, ist nur wenig über intrazelluläre Interaktionspartner bekannt. NrCAM besitzt an seinem Carboxyterminus ein charakteritisches PDZ-Bindungsmotiv (-SFV, Songyang et al 1997). In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Funktionalität dieser Domäne unter der Anwendung verschiedener Modellsysteme beschrieben. Der C-Terminus von NrCAM zeigte im Hefe-Zwei-Hybrid System spezifische Interaktionen mit PDZ-Domänen der membranassoziierten Guanylatkinasen SAP97 und PSD95/SAP90. Biochemisch wurde diese Interaktion anhand eines Präzipitationsassays bestätigt. In COS-7 Zellen vermittelte NrCAM die verstärkte Rekrutierung von SAP97 an die Zellmembran. Diese Interaktionen gingen mit der Zerstörung des funktionellen NrCAM PDZ-Bindungsmotivs oder Deletion der SAP97 PDZ-Domänen 1 und 2 verloren. Interaktionen zwischen NrCAM und SAP97 könnten in vivo das axonale Targeting von SAP97 vermitteln. Mittels Hefe-Zwei-Hybrid Screen einer Rattenhirn-cDNA-Bibliothek wurde ein neuer, putativer Interaktionspartner der cytoplasmatischen Domäne von CHL1 identifiziert (genannt: CHL1-23). CHL1-23 zeigt Homologien zu EST-Klonen und wird von einem bisher nicht beschriebenem Gen auf Chromosom 17 der Ratte kodiert. In der Hefe zeigte CHL1-23 auch Interaktionen mit L1 und Neurofascin. Auf mRNA-Ebene wurden überlappende Expressionsmuster von CHL1-23 und den Mitgliedern der L1-Familie detektiert. CHL1-23 könnte somit eine wichtige Aufgabe zur Vermittlung grundlegender Funktionen dieser Zellerkennungsmoleküle haben. Zur Überprüfung dieser Hypothese ist allerdings eine weitere Charakterisierung des CHL1-23 Proteins erforderlich. Die Erzeugung von Knockout-Mäusen bietet die Möglichkeit, Genfunktionen in vivo zu analysieren. Während die Phänotypen L1-, CHL1- und NrCAM-defizienter Mäusen in der Literatur beschrieben sind (Dahme et al 1997; Montag-Sallaz et al 2002; More et al 2001), ist nichts über die Auswirkungen einer Neurofascin-Defizienz bekannt. Während der frühen

Zusammenfassung

101

postnatalen Entwicklung fällt Neurofascin durch eine stark erhöhte Expression in Oligodendrozyten auf (Collinson et al 1998, diese Arbeit). Auf Proteinebene ist Neurofascin innerhalb spezialisierter Membranbereiche zu finden. Verschiedene Arbeiten schreiben Neurofascin eine Schlüsselfunktion beim Aufbau von Axon-Glia Kontakten und bei der Rekrutierung von spannungsabhängigen Na+-Kanälen zu (Jenkins & Bennett 2001a; Ratcliffe et al 2001; Tait et al 2000). Inwieweit derartige Prozesse tatsächlich von Neurofascin getragen werden, kann durch gezielte Inaktivierung des Neurofascin-Gens in der Maus untersucht werden. In dieser Arbeit wurde ein Neurofascin-Targeting Konstrukt kloniert. Zudem wurden Nachweisreaktionen zur Identifizeriung der homologen und Cre-vermittelten Rekombination auf Southern-Blot und PCR-Ebene etabliert. Dies bildet die Grundlage für die Erzeugung induzierbarer Neurofascin-Knockout Mäuse.

102

6 Veröffentlichungen Teile dieser Arbeit wurden in Posterform veröffentlicht: Dirks, P., Schön, I., Monatg, D., Montag-Sallaz, M., 2001 Dynamic expression pattern of cell recognition molecules belonging to the L1-family during postnatal mouse brain development. Proceedings of the 4th Meeting of the German Neuroscience Society 2001, Vol. 1, p. 42, Thieme Verlag Dirks, P., Thomas, U., Montag, D., 2002 Potential involvement of NrCAM in recruitment of membrane-associated guanylate kinases (MAGUKs) to the cytoplasmic surface. 3rd Forum of the European Neuroscience, p.005.2

I

7 Anhang

PCR-Bedingungen

Bezeichnung Bedingungen

PCR 1 (94 oC, 4 min) (40 Cyclen: 93 oC, 3 min; 44 oC, 30 s; 72 oC, 1 min) (72 oC, 7 min)

PCR 2 (94 oC, 3 min) (40 Cyclen: 94 oC, 30 s; 44 oC, 30 s; 72 oC, 2 min) (72 oC, 7 min)

PCR 3 (94 oC, 3 min) (35 Cyclen: 94 oC, 1min; 55 oC, 1min; 72 oC, 90 s) (72 oC, 5 min)

PCR 4 (93 oC, 3 min) (40 Cyclen: 94 oC, 30 s; 55 oC, 30 s; 72 oC, 1 min) (72 oC, 2 min)

Primer

Sequenzierungen

Forward Primer Lage Reverse Primer Lage

Neurofascin CGC TCG AGA TAA CAT CCT GAT TGA

460 - 479 CCT ACT TGC AAA GTA GTG C

4053 - 4033

AGG AGT TGC AGA AAG AAC GC

1006 - 1025 GTA AGC TTC AGT CTG GTT GTT GGT G

3602 - 3586

GGT ACA AGA AAG GTG GGG A

1133 -1149 GCG GCA GTG GTT GTA GTA

3243 - 3226

ATC TAC AGG ATG CCC GAG G

1862 - 1880 CTC CGT CGC CAC TTG ACA AT

2601 - 2582

ACA GTC TCC TGG CTG AAG GA

1942 - 1961 CCT CGG GCA TCC TGT AGA T

1880 - 1862

ATT GTC AAG TGG CGA CGG AG

2582 - 2601 CCC CAC CTT TCT TGT ACC

1149 - 1133

AAG CCA CAA CAG TTC CCA TC

3159 - 3178 TCA ATC AGG ATG TTA TCT CG

480 - 460

CAT CAG CAG TAC CGT CAT

3544 - 3562

GGC ACT ACT TTG CAA GTA GG

4033 - 4053

NrCAM CTT CTG AAG AGC AAT GCT AA

262 - 281 ATT TCC AGG AGC CAC CAT T

2979 - 2961

AAG AAG ACG GAA TGC TTT CC

1343 - 1359 TGC ATT GCA TCT TCA TAC

2492 - 2475

GAC GTA TAC TTG TGT CGC A

1989 - 2007 TAC TAT CCT TTT GGG CCA C

1984 - 1966

GAT TAC ATG GAA GCC CCT GA

2718 - 2737 TGG CTT TCA TTG CCC TCT G

1262 - 1244

AGT CCC TAG TGC TCC CTC AT

3276 - 3295 TTG ATG ACA AGG GTT CCT GAG

426 - 446

TCG AAC ACC TTC AGA CAG GA

4041 - 4033 TTA GCA TTG CTC TTC AGA AG

281 - 262

Anhang

II

Amplifikationen

Verwendung Forward Primer Reverse Primer Lage PCR-Bedingungen

cDNA-

Bankenscreen

L1-Familienmitglieder

TTC TCG AGG (AGCT)GG (ACT)AA (AG)TA (CT)(GCT)C AGT (AGCT)(AC)A (AGC)GA

TAA AGC TTG (AGCT)CC (AG)AT (AG)AA GGA (GCT)CC (AG)TC CTC

Cytoplasma- tische Domäne

PCR 1

ZO-1 GCT CAT CTC TTT GCA CTA

GGA ATT GCA ATC TCT GGT

506 - 1179 PCR 3

CGG CCA TTT GAA CGC AAA

TTT AGG GTC ACA GTG TGG

5003 – 5557 PCR 3

Klonierungen CHL1-23-prey N-terminus

ATC CGA ATT CGC GGC CGC GT

TTC TCG AGT GCC TCT GCG CCT A

Vektor - 210 PCR 4

ZO-1-prey PDZ 1-3

ACG GAT CCC TAA GAG CAC AGC AAT

AAG AGC TCA TTC TAC AAT GCG GCG

426 – 1925 PCR 4

Neurofascin in situ-Sonde

TTC TCG AGG ACT CTG GGG AGT ATT

GTA AGC TTC AGT CTG GTT GTT GGT G

1221 - 3602

NrCAM in situ-Sonde

TAA AGC TTT TCC TGG ACT CGT AA

ATG AAT TCC TCT GTG ATC TGA CTG

658 - 3554

NF-TK Sonde 1 TAA AGC TTG GCA CCA TGA AGA GA

ATG AAT TCA ATG CCT TAC AGC TGG

-200 - 400 PCR 4

NF-TK Sonde 3 ATA AGC TTC CAT CCT CAT ATC CGT

ACG AAT TCC TAT CTG CCT ATC TGA

460 - 800

Neurofascin-Targeting – Primer zum Nachweis der homologen Rekombination

Primer 1 TTC ACA GAT GTC GGTCTT TCC Primer 2 TGT ACA TTG TTG CTT GTC CCA Primer 3 GCT ATT TTT GAT TGG CAG CAG Primer 4 GTC TCT TGA CCA CAG AGC AGG Primer 5 ACC AAG GAT AAC CCA GTT TGG Primer 6 TGC CCCT TCC TAG TCC TCT ACC Primer 7 GGG TGA CAG AGA GAA GCA CTG Primer 8 TGG TCT TCA TGT ACC GCA CTC Primerkombinationen wurden unter den Bedingungen der PCR 4 getestet, Informationen zur Lage der Primer s. Tab. 4, S. 78.

Anhang

III

Gegenüberstellung von NrCAM-AS-Sequenzen der Orthologen aus Maus (AJ543321), Mensch (AJ001057) und Ratte (U81037) Maus ------MPKKKHLSAGGVPLILFLCQMISALDVPLD------LVQPPTITQQSPKDYIID 48 Ratte ADQLKTMPKKKPLSAGRAPLFLFLCQMISALDVPLDPKLLDDLVQPPTITQQSPKDYIID 60 Mensch ------MPKKKRLSAGRVPLILFLCQMISALEVPLDPKLLEDLVQPPTITQQSPKDYIID 54 ***** **** .**:**********:**** ****************** Maus PRENIVIQCEAKGKPPPSFSWTRNGTHFDIDKDPLVTMKPGSGTLVINIMSEGKAETYEG 108 Ratte PRENIVIQCEAKGKPPPSFSWTRNGTHFDIDKDPLVTMKPGSGTLVINIMSEGKAETYEG 120 Mensch PRENIVIQCEAKGKPPPSFSWTRNGTHFDIDKDPLVTMKPGTGTLIINIMSEGKAETYEG 114 *****************************************:***:************** Maus VYQCTARNERGAAVSNNIVVRPSRSPLWTKERLEPIVLQNGQSLVLPCRPPIGLPPAIIF 168 Ratte VYQCTARNERGAAVSNNIVVRPSRSPLWTKERLEPIILRSGQSLVLPCRPPIGLPPAIIF 180 Mensch VYQCTARNERGAAVSNNIVVRPSRSPLWTKEKLEPITLQSGQSLVLPCRPPIGLPPPIIF 174 *******************************:**** *:.****************.*** Maus WMDNSFQRLPQSERVSQGLNGDLYFSNVLPEDTREDYICYARFNHTQTIQQKQPISLKVI 228 Ratte WMDNSFQRLPQSERVSQGLNGDLYFSNVLPEDTREDYICYARFNHTQTIQQKQPISLKVI 240 Mensch WMDNSFQRLPQSERVSQGLNGDLYFSNVLPEDTREDYICYARFNHTQTIQQKQPISVKVI 234 ********************************************************:*** Maus SVDELNDTIAANLSDTEFYGAKSSKERPPTFLTPEGNESHKEELRGNVLSLECIAEGLPT 288 Ratte SVDELNDTIAANLSDTEFYGAKSSKERPPTFLTPEGNESHKEELRGNVLSLECIAEGLPT 300 Mensch SVDELNDTIAANLSDTEFYGAKSSRERPPTFLTPEGNASNKEELRGNVLSLECIAEGLPT 294 ************************:************ *:******************** Maus PIIYWIKEDGMLPANRTFYRNFKKTLQITHVSEADSGNYQCIAKNALGAVHHTISVTVKA 348 Ratte PVIYWIKEDGTLPVNRTFYRNFKKTLQIIHVSEADSGNYQCIAKNALGAVHHTISVTVKA 360 Mensch PIIYWAKEDGMLPKNRTVYKNFEKTLQIIHVSEADSGNYQCIAKNALGAIHHTISVRVKA 354 *:*** **** ** ***.*:**:***** ********************:****** *** Maus APYWIVAPQNLVLSPGENGTLICRANGNPKPRISWLTNGVPIEIALDDPSRKIDGDTIIF 408 Ratte APYWIVAPHNLVLSPGENGTLICRANGNPKPRISWLTNGVPVEIALDDPSRKIDGDTIMF 420 Mensch APYWITAPQNLVLSPGEDGTLICRANGNPKPRISWLTNGVPIEIAPDDPSRKIDGDTIIF 414 *****.**:********:***********************:*** ************:* Maus SNVQESSSAVYQCNASNKYGYLLANAFVNVLAEPPRILTSANTLYQVIANRPALLDCAFF 468 Ratte SNVQESSSAVYQCNASNKYGYLLANAFVNVLAEPPRILTSANTLYQVIANRPALLDCAFF 480 Mensch SNVQERSSAVYQCNASNEYGYLLANAFVNVLAEPPRILTPANTLYQVIANRPALLDCAFF 474 ***** ***********:*********************.******************** Maus GSPMPTIEWFKGTKGSALHEDIYVLHDNGTLEIPVAQKDSTGTYTCVARNKLGMAKNEVH 528 Ratte GSPMPTIEWFKGTKGSALHEDIYVLHDNGTLEIPVAQKDSTGTYTCVARNKLGMAKNEVH 540 Mensch GSPLPTIQWFKGAKGSALHEDIYVLHENGTLEIPVAQKDSTGTYTCVARNKLGMAKNEVH 534 ***:***:****:*************:********************************* Maus LEIKDPTRIIKQPEYAVVQRGSKVSFECRVKHDHTLIPTIMWLKDNGELPNDERFSTDKD 588 Ratte LEIKDPTRFIKQPGYAVVQRGSKVSFECKVKHDHTLIPTILWLKDNGELPNDERFSVDKD 600 Mensch LEIKDPTWIVKQPEYAVVQRGSMVSFECKVKHDHTLSLTVLWLKDNRELPSDERFTVDKD 594 ******* ::*** ******** *****:******* *::***** ***.****:.*** Maus HLVVSDVKDDDGGTYTCTANTTLDSASASAVLRVVAPTPTPAPIYDVPNPPFDLELTNQL 648 Ratte HLVVSDVKDEDGGTYTCAANTTLDSVSASAVLRVVAPTPTPAPIYDVPNPPFDLELTNQL 660 Mensch HLVVADVSDDDSGTYTCVANTTLDSVSASAVLSVVAPTPTPAPVYDVPNPPLDLELTDQL 654 ****:**.*:*.*****.*******.****** **********:*******:*****:** Maus DKSVQLTWTPGDDNNSPITKFIIEYEDAMHDAGLWRHQAEVSGTQTTAQLKLSPYVNYSF 708 Ratte DKSVQLTWTPGDDNNSPITKFIIEYEDAMHEAGLWRHQAEVSGTQTTAQLKLSPYVNYSF 720 Mensch DKSVQLSWTPGDDNNSPITTIHDEYEDAMHKPGLWHHQTEVSGTQTTAQLKLSPYVNYSF 714 ******:************.: *******..***:**:********************* Maus RVMAENSIGRSMPSEASEQYLTKAAEPDQNPMAVEGLGTEPDNLVITWKPLNGFQSNGPG 768 Ratte RVMAENSIGRSVPSEASEQYLTKAAEPDQNPTAVEGLGTEPDNLVITWKPLNGFQSNGPG 780 Mensch RVMAVNSIGKSLPSEASEQYLTKASEPDKNPTAVEGLGSEPDNLVITWKPLNGFEFNGPG 774 **** ****:*:************:***:** ******:***************: ****

Anhang

IV

Maus LQYKVSWRQKDGDDEWTSVVVANVSKYIVSGTPTFVPYLIKVQALNDVGFAPEPAAVMGH 828 Ratte LQYKVSWRQKDGDDEWTSVVVANVSKYIVSGTPTFVPYLIKVQALNDVGFAPEPAAVMGH 840 Mensch LQYKVSWRQKVGDDEWTSVVVANVSKYIVSGTPTFVPYLIKVQALNDMGFAPEPAVVMGH 834 ********** ************************************:*******.**** Maus SGEDLPMVAPGNVRVSVVNSTLAEVHWDPVPPKSVRGHLQGYRIYYWKTQSSSKRNRRHI 888 Ratte SGEDLPMVAPGNVRVSVVNSTLAEAHWDPVPPKSVRGHLQGYRIYYWKAQSSSKRNRRHI 900 Mensch SGEDLPMVAPGNVRVNVVNSTLAEVHWDPVPLKSIRGHLQGYRIYYWKTQSSSKRNRRHI 894 ***************.********.****** **:*************:*********** Maus EKKILTFQGTKTHGMLPGLQPYSHYALNVRVVNGKGEGPASTDRGFHTPEGVPSAPSSLK 948 Ratte EKKILTFQGSKTHGMLPGLQPYSHYVLNVRVVNGKGEGPASADRGFHTPEGVPSAPSSLK 960 Mensch EKKILTFQGSKTHGMLPGLEPFSHYTLNVRVVNGKGEGPASPDRVFNTPEGVPSVPSSLK 954 *********:*********:*:***.***************.** *:*******.***** Maus IVNPTLDSLTLEWDPPSHPNGILTEYILQYQPINSTHELGPLVDLKIPANKTRWTLKNLN 1008 Ratte IVNPTLDSLTLEWDPPSHPNGILTEYILKYQPINSTHELGPLVDLKIPANKTRWTLKNLN 1020 Mensch IVNPTLDSLTLEWDPPSHPNGILTEYTLKYQPINNTHELGPLVDLKIPANKTRWTLKNLN 1014 ************************** *:*****.************************* Maus FSTRYKFYFYAQTSVGPGSQITEEAITTVDE---AGIPPPDVGAGKGKEE---------- 1055 Ratte FSTRYKFYFYAQTSVGSGSQITEEAITTVDEGKKAGILPPDVGAGK-------------- 1066 Mensch FTTRYKFYFYAQTSAGSGSQITEEAVTTVDE---AGILPPDVGAGKVQAVNPRISNLTAA 1071 *:************.*.********:***** *** ******** Maus --------------------------------WRKEIVNGSRSFFGLKGLMPGTAYKVRV 1083 Ratte ------------------------------------------------------------ Mensch AAETYANISWEYEGPEYANFYVEYGVAGSKEEWRKEIVNGSRSFFGLKGLMPGTAYKFRV 1131 Maus GAEGDSGFVSSEDVFETGPAMASRQVDIATQGWFIGLMCAVALLILILLIVCFIRRNKGG 1143 Ratte -------------------AMASRQVDIATQGWFIGLMCAVALLILILLIVCFIRRNKGG 1107 Mensch GAVGGPRFVSSEGVFETGPAMASRQVDIATQGWFIGLMCAVALLILILLIVCFIRRNKGG 1191 ***************************************** Maus KYPVKEKEDAHADPEIQPMKEDDGTFGEYSDAEDHKPLKKGSRTPSDRTVKKEDSDDSLV 1203 Ratte KYPVKEKEDAHADPEIQPMKEDDGTFGEYSDAEDHKPLKKGSRTPSDRTVKKEDSDDSLV 1167 Mensch KYPVKEKEDAHADPEIQPMKEDDGTFGEYSDAEDHKPLKKGSRTPSDRTVKKEDSDDSLL 1251 ***********************************************************: Maus DYGEGVNGQFNEDGSFIGQYSGKKEKEPAEGNESSEAPSPVNAMNSFV 1251 Ratte DYGEGVNGQFNEDGSFIGQYSGKKEKEPAEGNESSEAPSPVNAMNSFV 1215 Mensch DYGEGVNGQFNEDGSFIGQYSGKKEKEPAEGNESSEAPSPVNAMNSFV 1299

Anhang

V

Gegenüberstellung von Neurofascin-AS-Sequenzen der Orthologen aus Maus (AJ543322), Mensch (XM_046808) und Ratte (U81036) Maus MARQQAPPWVHIALILFLLSLGGAIEIPMDPSIQNELTQPPTITKQSVKDHIVDPRDNIL 60 Mensch MARQPPPPWVHAAFLLCLLSLGGAIEIPMDPSIQNELTQPPTITKQSAKDHIVDPRDNIL 60 Ratte ------------------------IEIPMD------LTQPPTITKQSVKDHIVDPRDNIL 30 ****** ***********.************ Maus IECEAKGNPAPSFHWTRNSRFFNIAKDPRVSMRRRSGTLVIDFRSGGRPEEYEGEYQCFA 120 Mensch IECEAKGNPAPSFHWTRNSRFFNIAKDPRVSMRRRSGTLVIDFRSGGRPEEYEGEYQCFA 120 Ratte IECEAKGNPAPSFHWTRNSRFFNIAKDPRVSMRRRSGTLVIDFRSGGRPEEYEGEYQCFA 90 ************************************************************ Maus RNKFGTALSNRIRLQVSKSPLWPKENLDPVVVQEGAPLTLQCNPPPGLPSPVIFWMSSSM 180 Mensch RNKFGTALSNRIRLQVSKSPLWPKENLDPVVVQEGAPLTLQCNPPPGLPSPVIFWMSSSM 180 Ratte RNKFGTALSNPIRLQVSKSPLWPKENLDPVVVQEGAPLTLQCNPPPGLPSPVIFWMSTSM 150 ********** **********************************************:** Maus EPITQDKRVSQGHNGDLYFSNVMLQDMQTDYSCNARFHFTHTIQQKNPFTLKVLT----- 235 Mensch EPITQDKRVSQGHNGDLYFSNVMLQDMQTDYSCNARFHFTHTIQQKNPFTLKVLT----- 235 Ratte EPITQDKRVSQGHNGDLYFSNVMLQDMQTDYSCNARFHFTHTIQQKNPFTLKVLTNNPYN 210 ******************************************************* Maus ------------TRGVAERTPSFMYPQGTSSSQMVLRGMDLLLECIASGVPTPDIAWYKK 283 Mensch ------------TRGVAERTPSFMYPQGTASSQMVLRGMDLLLECIASGVPTPDIAWYKK 283 Ratte DSSLRNHPDIYSARGVAERTPSFMYPQGTSSSQMVLRGMDLLLECIASGVPTPDIAWYKK 270 :****************:****************************** Maus GGDLPSNKAKFENFNKALRITNVSEEDSGEYFCLASNKMGSIRHTISVRVKAAPYWLDEP 343 Mensch GGDLPSDKAKFENFNKALRITNVSEEDSGEYFCLASNKMGSIRHTISVRVKAAPYWLDEP 343 Ratte GGDLPSDKAKFENFNKALRITNVSEEDSGEYFCLASNKMGSIRHTISVRVKAAPYWLDEP 330 ******:***************************************************** Maus KNLILAPGEDGRLVCRANGNPKPTVQWMVNGEPLQSAPPNPNREVAGDTIIFRDTQISSR 403 Mensch KNLILAPGEDGRLVCRANGNPKPTVQWMVNGEPLQSAPPNPNREVAGDTIIFRDTQISSR 403 Ratte KNLILAPGEDGRLVCRANGNPKPTVQWLVNGDPLQSAPPNPNREVAGDTIIFRDTQISSR 390 ***************************:***:**************************** Maus AVYQCNTSNEHGYLLANAFVSVLDVPPRMLSARNQLIRVILYNRTRLDCPFFGSPIPTLR 463 Mensch AVYQCNTSNEHGYLLANAFVSVLDVPPRMLSPRNQLIRVILYNRTRLDCPFFGSPIPTLR 463 Ratte AVYQCNTSNEHGYLLANAFVSVLDVPPRMLSPRNQLIRVILYNRTRLDCPFFGSPIPTLR 450 *******************************.**************************** Maus WFKNGQGSNLDGGNYHVYENGSLEIKMIRKEDQGIYTCVATNILGKAENQVRLEVKDPTR 523 Mensch WFKNGQGSNLDGGNYHVYENGSLEIKMIRKEDQGIYTCVATNILGKAENQVRLEVKDPTR 523 Ratte WFKNGQGSNLDGGNYHVYQNGSLEIKMIRKEDQGIYTCVATNILGKAENQVRLEVKDPTR 510 ******************:***************************************** Maus IYRMPEDQVAKRGTTVQLECRVKHDPSLKLTVSWLKDDEPLYIGNRMKKEDDSLTIFGVA 583 Mensch IYRMPEDQVARRGTTVQLECRVKHDPSLKLTVSWLKDDEPLYIGNRMKKEDDSLTIFGVA 583 Ratte IYRMPEDQVAKRGTTVQLECRVKHDPSLKLTVSWLKDDEPLYIGNRMKKEDDSLTIFGVA 570 **********:************************************************* Maus ERDQGSYTCMASTELDQDLAKAYLTVLADQATPTNRLAALPKGRPDRPRDLELTDLAERS 643 Mensch ERDQGSYTCVASTELDQDLAKAYLTVLADQATPTNRLAALPKGRPDRPRDLELTDLAERS 643 Ratte ERDQGSYTCMASTELDQDLAKAYLTVLADQATPTNRLAALPKGRPDRPRDLELTDLAERS 630 *********:************************************************** Maus VRLTWIPGDDNNSPITDYVVQFEEDQFQPGVWHDHSRFPGSVNSAVLHLSPYVNYQFRVI 703 Mensch VRLTWIPGDANNSPITDYVVQFEEDQFQPGVWHDHSKYPGSVNSAVLRLSPYVNYQFRVI 703 Ratte VRLTWIPGDDNNSPITDYVVQFEEDQFQPGVLHDHSKFPGSVNSAVLHLSPYVNYDFRVI 690 ********* ********************* ****::*********:*******:**** Maus AVNEVGSSHPSLPSERYRTSGAPPESNPSDVKGEGTRKNNMEITWTPMNATSAFGPNLR- 762 Mensch AINEVGSSHPSLPSERYRTSGAPPESNPGDVKGEGTRKNNMEITWTPMNATSAFGPNLR- 762 Ratte AVNEVGSSHPSLPSERYRTSGAPPESNPSDVKGEGTRKNNMEITWTPMNATSAFGPNLRY 750 *:**************************.******************************

Anhang

VI

Maus YIVKWRRRETRETWNNVTVWGSRYVVGQTPVYVPYEIRVQAENDFGKGPEPDTIIGYSGE 822 Mensch YIVKWRRRETREAWNNVTVWGSRYVVGQTPVYVPYEIRVQAENDFGKGPEPESVIGYSGE 822 Ratte YIVKWRRRETRETWNNVTVWGSRYVVGQTPVYVPYEIRVQAENDFGKGPEPETVIGYSGE 810 ************:**************************************:::****** Maus DLP--------------------------------------------------------- 825 Mensch DLP--------------------------------------------------------- 825 Ratte DYPRAAPTEVKIRVLNSTAISLQWNRVYPDTVQGQLREYRAYYWRESSLLKNLWVSQKRQ 870 * * Maus --------------------------------------------------SAPRRFRVRQ 835 Mensch --------------------------------------------------SAPRRFRVRQ 835 Ratte QASFPGDRPRGVVGRLFPYSNYKLEMVVVNGRGDGPRSETKEFTTPEGVPSAPRRFRVRQ 930 ********** Maus PNLETINLEWDHPEHPNGILIGYILRYVPFNGTKLGKQMVENFSPNQTKFSVQRADPVSR 895 Mensch PNLETINLEWDHPEHPNGIMIGYTLKYVAFNGTKVGKQIVENFSPNQTKFTVQRTDPVSR 895 Ratte PNLETINLEWDHPEHPNGILIGYTLRYVPFNGTKLGKQMVENFSPNQTKFSVQRADPVSR 990 *******************:*** *:**.*****:***:***********:***:***** Maus YRFSLSARTQVGSGEAATEESPAPPNEATPTAAPPTLPPTTVGTTGLVSSTDATALAATS 955 Mensch YRFTLSARTQVGSGEAVTEESPAPPNE--------------------------------- 922 Ratte YRFSLSARTQVGSGEAATEESPTPPNEATP------------------------------ 1020 ***:************.*****:**** Maus EATTVPIIPTVVPTTVATTIATTTTTTAATTTTTTTESPPTTTAGTKIHETAPDEQSIWN 1015 Mensch ------------------------------------------------------------ Ratte ------------------------------------------------------------ Maus VTVLPNSKWANITWKHNFRPGTDFVVEYIDSNHTKKTVPVKAQAQPIQLTDLFPGMTYTL 1075 Mensch ------------------------------------------------------------ Ratte ------------------------------------------------------------ Maus RVYSRDNEGISSTVITFMTSTAYTNNQADIATQGWFIGLMCAIALLVLILLIVCFIKRSR 1135 Mensch ---------------------AYTNNQADIATQGWFIGLMCAIALLVLILLIVCFIKRSR 961 Ratte -------------------TAAYTNNQTDIATQGWFIGLMCAIALLVLILLIVCFIKRSR 1061 ******:******************************** Maus GGKYPVREKKDVPLGPEDPKEEDGSFDYSDEDNKPLQGSQTSLDGTIKQQESDDSLVDYG 1195 Mensch GGKYPVREKKDVPLGPEDPKEEDGSFDYSDEDNKPLQGSQTSLDGTIKQQESDDSLVDYG 1021 Ratte GGKYPVREKKDVPLGPEDPKEEDGSFDYSDEDNKPLQGSQTSLDGTIKQQESDDSLVDYG 1121 ************************************************************ Maus EGGEGQFNEDGSFIGQYTVKKDKEETEGNESSEATSPVNAIYSLA 1240 Mensch EGGEGQFNEDGSFIGQYTVKKDKEETEGNESSEATSPVNAIYSLA 1066 Ratte EGGEGQFNEDGSFIGQYTVRKDKEETEGNESSEATSPVNAIYSLA 1166

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Danksagung Eine Reihe besonderer Menschen haben zum Gelingen der vorliegenden Arbeit auf

unterschiedlichste Weise beigetragen – bei Ihnen möchte ich mich an dieser Stelle bedanken.

Herr Dr. Dirk Montag stellte die interessante Thematik dieser Arbeit und verschaffte mir die Möglichkeit, am Institut für Neurobiologie, Magdeburg, meine Promotion zu erstellen. Er überließ mir bei der Bearbeitung der Fragestellung größtmögliche Freiräume und unterstützte die Entwicklung eigener Ideen. Von meiner Magdeburger Zeit erhoffte ich mir, interessante Forschung mit dem Erlernen moderner Arbeitstechniken zu verbinden – ich wurde nicht enttäuscht. Vielen Dank! Frau Dr. Monique Montag-Sallaz wies mich in die Geheimnisse der in situ Hybridisierungen ein und stand mir der bei der Bearbeitung mikroskopischer Aufnahmen tatkräftig zur Seite. Auch privat ist sie zu einer guten Freundin geworden, wofür ich mich hiermit bedanken möchte. Frau Dr. Ilona Schön begleitete mich durch das erste Laborjahr in Magdeburg und erleichterte mir den Einstieg in die Molekularbiologie. Erste Arbeiten im Hefe-Labor führten wir in Zusammenarbeit durch. Sie lehrte mich, dass Planung alles ist! Vielen Dank! Andrea Baarke kämpfte sich zeitgleich mit mir durch die Promotion. Sie ertrug alle meine Launen und war für jeden Spaß zu haben. Ich wünsche Ihr für „das Leben nach der Promotion“ alles Gute und hoffe auch weiterhin, in Kontakt mit ihr zu bleiben. Angelika Reichel danke ich für die ausgezeichnete technische Unterstützung, die so manchen Arbeitsschritt erleichterte. Mein Dank gilt weiterhin den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Neurochemie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Eckhard Gundelfinger, welche stets mit Tipps und Tricks zur Verfügung standen. Dr. Ulrich Thomas, Dr. Karl-Heinz Smalla und Dr. Christina Spilker danke ich für die Gabe verschiedener Antikörper. Frau Prof. Dr. Ulrike Janssen-Bienhold danke ich für ihre herzliche Art und das in mich gesetzte Vertrauen! Dr. Mark Pottek vollführte eine Blitz-Korrektur dieser Arbeit und ich bedanke mich bei ihm, für konstruktive Kritikpunkte und aufmunternde Worte.

Auf privater Ebene haben eine Vielzahl lieber Menscher die Fertigstellung dieser Arbeit ermöglicht! Edith, Elke, Suse, Silvia, Jochen und viele mehr standen mir zur Seite, wenn die Einsamkeit in Magdeburg mich überrollte. Sie ließen stundenlange Telefonate über sich ergehen und waren auch mit Besuchen nicht geizig. Vielen Dank! Meine Eltern stellten meine Arbeit nie in Frage. Sie unterstützten mich in allen Bereichen und standen bei naturbedingten Katastrophen selbst nachts vor meiner Haustür. Ihnen gilt an dieser Stelle mein ganz besonderer Dank. Mein Freund Frank Tischler sorgte neben Naturkatastrophen für die kleinen privaten Katastrophen, die das Leben so interessant machen. ...aber ob ich ihm dies wirklich danken soll?

Lebenslauf Zur Person Name Petra Dirks Geburtsdatum 14. Januar 1968 Geburtsort Wilhelmshaven Familienstand ledig Schulbildung 1974 – 1978 Grundschule in Heidmühle 1978 – 1980 Orientierungsstufe Schortens 1980 – 1987 Mariengymnasium Jever Berufsausbildung 1987 – 1989 Ausbildung zur Apothekenhelferin mit Abschluss 1990 – 1991 berufliche Fortbildung zum Geprüften Pharmareferenten mit Abschluss Hochschulstudium 1991 Beginn des Biologiestudiums an der

Carl-von-Ossietzky-Universität Oldenburg 1994 Vordiplom 1998-99 Diplomarbeit bei Prof. Dr. Reto Weiler,

Arbeitsgruppe Neurobiologie an der Carl-von-Ossietzky-Universität Oldenburg

1999 – 2003 Wissenschftliche Angestellte am Leibniz-Institut für Neurobiologie in Magdeburg, Arbeitsgruppe Neurogenetik Dr. Dirk Montag seit April 2003 Wissenschaftliche Angestelle an der Carl-von-Ossietzky-Universität Oldenburg Oldenburg, den 08. August 2003

Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen verwendet habe. Petra Dirks

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Die L1-Familie neuraler Zellerkennungsmoleküle: …oops.uni-oldenburg.de/171/1/dirl1f03.pdf · sap97 und sap90/psd95 aus hirnlysaten der maus 67 abb. 18 gegenÜberstellung der cdna-sequenzen