Die Papier-Chromatographie auf dem Fettgebiet VIII : Der Lipoid-Nachschub in der lebenden menschlichen Haut und seine

papier-chromatographische Bestimmung * Z'cin P r o f . Dr . H . P. K a ic f m 0 n n , P r o f . Dr. A . S z u fi u 1 1 unrl 0,. J. B 1 1 rl ui i g

A71s dem Chemischen Lnndcs-C'~i&eisirchirngsamt Nordrf ie i i i -T(/rs&fni~,~i . Motistci (West f . )

Der Lipoidgehalt der Hautoberflache des lebenden Menschen ist unter wechselnden Bedingungen und bei verschiedenen Hautkrankheiten bereits eingehend unter- sucht worden. Hierbei wurden die auf der Hautoberflache befindlichen Lipoide mit einem geeigneten Losungsmittel herausgelost oder in Filterpapier und Woll-Lappchen, bei grofieren Korperoberflachen auch in Wollwesten, auf- gesaugt. Neben der quantitativen Bestimmung wurden auch Kennzahlen der gewonnenen Lipoide ermittelt. wor- aus man Schlusse auf biologische oder pathologische Vor- ginge zu ziehen versuchte. Nun darf man bei dieser Art des Vorgehens nicht iibersehen, dafi Ar t und Menge der untersuchten Oberflachenlipoide eigentlich Endergebnisse von Vorgangen sind, welche sich im Innern der Epider- mis abspielen. Sie konnten bisher nur mit Hilfe histo- chemischer Farbreaktionen. vor allem den von Unna ' an- gegebenen, gedeutet werden. Dieses Versuchsmaterial ist aber nicht am lebenden Menschen gewonnen worden und bedarf daher einer Erganzung durch objektive physio- logische Untersuchungen am Lebenden.

Beim Studium der Hautlipoide stofit man zunachst auf eine grofie Schwieriglteit: sie kommen nur in sehr gerin- gen Mengen vor, so dai3 man fur die Untersuchung ver- hiiltnismafiig grofie Hautflachen entfetten mufi, um aus- reichendes Versuchsmaterial zu erhalten. Hierdurch ver- ringert sich die Moglichkeit, kurzdauernde Flulctuationen iin Vorgang des Fettnachschubes oder der Fettregenera- tion zu erfassen.

Aus den Untersuchungen von Schzcr und Goldfarbe wissen wir, dai3 nach vollstandiger Entfettung der Haut- oberflache ein sofortiger Fettnachschub einsetzt, so dai3 die Oberflichenlipoide bereits nach 30 Min. regeneriert sind. Dieser sich so schnell abspielende Vorgang hat ver- niutlich eine allgemeine biologische Bedeutung, woriiber aber bisher wenig bekannt ist. Wenn auch die Existenz der sogenannten Zellfette in der Epidermis aufier Zwei- fel steht, vermogen wir doch iiber den Mechanismus ihrer Entstchung so gut wie nichts auszusagen. Diese Lipoide werden gleichzeitig mit der Hornschicht gebildet. Es han- delt sich also um Stoffe, die nicht aus den Talgdrusrn stammen, denn Talgdrusen-Fette werden direkt auf die I-Iautoberfl ache abgesondert. Im Schrifttum wird erwahnt, dafi die Fettsaure-Komponente der Hautlipoide haupt- siichlich aus 0 1 s a u r e besteht (Unna), dai3 mehrfach un- gesattigte Sauren vorliegen konnen und dat3 von der 'I'iefe der Epidermis nach aui3en hin die Zahl der Dop- pelbindungen der Fettsauren abnimmt '. Diese Tatsache wiirde auf Vorgange hinweisen, die eine biologische Be- dcutung haben. Um daruber Klarheit zu erhaIten, mufite die Haut des lebenden Organismus schichtweise abgetragen

;. Studien auf den Fettgebiet, 130. Mitteilung, zugleich 111. Mitteilung zur Biologie der Fette.

1 P. G. Unna und J. Sdzithmacher, Lebensvorgange in der Haut der Menschen und der Tiere. Verl. F. Deuticke, Leip- gig-Wien 1925.

2 Wiener Klin. Wschr. 1927, 12-15. 3 D. /. Kooyman, Arch. Dermatol. N. Y. 25, 245, 444 [1932].

und dann histclogisch und chemisch untersucht werden. Zur Isolierung der Lipoide konnte man jede Schicht z. B. mit Petrolather extrahierm. Die so gewonnenen Ergeb- nisse waren ohne Zwcifel auch fur die praktische Derma- tologie wertvoll. Wurde doch in letzter Zeit z. B. auf die entscheidende Rolle der Veranderung der Haut- lipoide bei der Entstehung von gewerblichen Dermatosen und anderen Hauterkrankungen hingewiesen (Carrig- Xrzckaus) 4.

Nach vorstehenden Darlegungen ist also nicht nur eine Methode der chemischen IJntersuchung erforderlich, welche die Analyse kleinster Lipoidniengen, aus mog- lichst kleinen Hautflichen gewonnzn, erlaubt, sondern auch ein Verfahren, schnell und mit geringfugiger Be- schadigung die lebende Haut in Schichten zu gewinnen. Reide Forderungen sind heute erfullt. Die von H. P . Karrfmnnn fur die Analyse der Fette und Fettprodukte zuerst vorgeschlagene Papier-Chromatographie, die be- reits wichtige Ergebnisse zeitigte ', lafit sich mit kleinsten N!engen des Versuchsmaterials durchfuhren. Andererseits ist A. Szalzall das Abblattern der Epidermis in diinnen Schichten mit Hilfe der Klebestreifen-Methode gelungen. Man lost hierbei die verhornten, lipoidreichen Teile der nienschlichen Epidermis mit Hilfe eines Cellophan-Klebe- streifens ab, je nach der Dicke derselben in 8 bis I0 Zellagen. So kann man in die Tiefe der Epidermis von Zellage zu Zellage eindringen uiid den Vorgang des Nachschubs der Stoff e niit Lipoidcharakter fortlaufend durch Herawlosen und chemische Untetsuchung ver- folgen.

Isolierung der Lipoidr Die volare Seite des unbehaarten Unterarmes wurdc

rnit Hilfe von Watte, die mit Petrolather durchtrankt war, 5 bis 6 ma1 hintereinander durch gleichmafiiges Rei- ben entfettet. Nach dieser Prozedur wircl die Hautober- fliche schneeweifi und trocken, ein Zeichen dafiir, daB nach Entfernung der Lipoide das rcstliche Wasser schnell verdunstet und dadurch die Haut trocken wird. Ver- gleichsuntersuchungen ergaben. dai3 der Lipoidgehalt der Ilautoberflache bis zur Barriere-Schicht auf diese Weisc auf ein Minimum herabgedriickt wird. Zum Nachweis des Nachschubes der Lipoide wurden nun zunachst un- mittelbar nach der Entfettung, dann nach 15, 30, 45 und 60 Min. die Hautschichten bis zur Barriere abgetragen. Zu diesem Zweck wurde der 7csa-Film der Firma Beiers- clorf (Hamburg) mit gleichmafiigem Druck auf die Haut- oberflache geklebt und parallel zur Hautoberflache mit schneller Abzugsbewegung derart abgerissen, daf3 auf dem Klebestreifen ein etwa 10 qcm grofier, zusammen- hangender Film der jeweiligen Hautschicht zuriickbleibt. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis auf dem Film die von dem einen von uns (Szakall) beschriebene

Arch. Dermatol. u. Syphilis 188, 314 [1949].

ti53, 713 [1950]; 53, 69 255, 283 [1951]. 5 H . P. Knufmnnn u. J. Budwig, Frtte u Seifen 52, 331, 555.

6 Fette u. Seifen 53, 399 [1851].

406 F E T T E U N 53. Jahrg.

D S E I F E N Nr.7 1951

Barriere als zusammenhangende's, weii3es Hautchen fase- rigen Baues erscheint. Nach Entfernung dieser Trenn- schicht gelangt man bcreits in die wasserreiche Rete Mal- fdzigii, in der keine durch Petrolather extrahierbaren Stoffe mehr vorhanden sind. Zuni Vergleich wurden zu- erst die einzelnen Schichten von der nicht entfetteten Haut abgeiragen. Nach der Entfettung des Unterarmes erfolgtsn die Abtragungen immer von einer neuen Haut- pnrtie, und zwar in nebeneinanderliegcnden Schichten sofort nach dcr Entfettung und den obengenannten Zei- ten. Da bei den dargclegten Verhaltnksen die Barricre hercits in einer 'riefe von 6: Schichten erreicht wurde, ent- fernten wir jeweils 6 Schichten, wovon immer zwei ge- meinsam extrahiert wurden. Die Filme wurden hierbei so ausgeschriitten, dai3 die beiden zusammen extrahierten einer 20 qcin groi3en Flache entsprachen. Da sie durch Restandtcile der Klebemasse verunreinigt sein konnen, uvrde vergleichsweise ein gleichartig hergestellter Aus- zug der reinen Klebestreifen chromatographiert. Aufier- dem wurden die gesamten Lipoide der Haut, die ohne Klebestreifen gewonnen waren, zum Vergleich herange- zogen. Letztere erhielt man durch Eintauchen beider I-fande bis zum untersten Drittel des Unterarmes in Pe- trolather oder durch Fettentnahine am Oberschenkel. Der nach Abdunsten des Petrolathers erhaltene Ruckstand wurde bei 50O C getrocknet.

Piif,y,.ofir(il'hi.~c/ie I J ~ i t e r ~ i ~ c l i ~ i n g LJm die lipoidloslichen Bestandteile der Epidermis zu

untersuchen. wurden die auf vorstehend bcschriebene Weise von dem einen von uns (S.) gewonnenen ,,Haut- fette" der papyrographischen Analyse unterworfen. Zu oricnticrenden Vorproben wurden jeweils 1 bis 2 Trop- fen dieser Losungen auf Filtrierpapier (598 GL, S. u. S.) a,ufgetropft, worauf dicse Flecken mit dem alkalischen Permanganat-Reagens, mit Kupferacetat, Kobaltacetat oder Rhodamin-Losung behandelt wurden.

lJnser Hauptinteresse galt dem lipcidloslichen, gegen Kaliumpermanganat stark reduzierend wirkenden Be- standteil, der auf Grund von Vorprohen als M l a a u r e angesprochen wurde. Zur Trennung derselben von den iibrigen Bestandteilen der Haut!ipoide und zur Identi- fizierung wurden die bereits beschriebenen Methoden henutzt. Von den qualitativen Nachweisen seien nur das spezifische Verhalten gegeniiber den1 alkalischen Perman- ganat-Reagens und die charakteristischen Reaktionen. die die Kobalt- und Thallium-Seifen liefern, genannt (s. Mit- teilg. im gleichen Heft, S. 390). SchlieMich stimmen die Er- scheinungen der Wanderungstendenz (WT) mit denen der Mlsiiure uberein. Das Untersuchungsmaterial wurde zu r Bestimmung der WT mit zwolf unterschiedlichen Was- ser/Methanol-Gemischcn (1 0 O i o , 20 O i o , 30 O i o , 40 O/o, 50 ' i o , 60 Oio, 70 O/O, 7 5 O/O, 80 O i o , 90 O/O, 99 O / o Methanol) entwickelt., ini Parallel-Papyrogranm gleichzeitig Propion-, Butter-, Valerian-, Capron-, Mnanth-. Capryl-, Octen-, Pelar- gon-, Nonylen-, Caprin-, [Jndecylen-, Stearin-. 01-, Ela- idin-, Linol- und Erucasaure. Nur die Mlsaure stimmte in ihrer WT mit der aus Hautfett bei der Entwicklung gewanderten Fettsaure iiberein.

Die quantitative Erfassung der Illsaure in den Haut- lipoiden wurde nach d t r retentiographischen und plani- nietrischen Methode vorgenommen 8. Die Ergebnisse wechseltcn hei verschiedenen Hautextraktionen und sind

Fette u. Seifen 1. c. Fette u. Seifen 52, 713 119511.

F C T T E U N I ) S E I F E N 53.Jahrg. Nr.7 1951

wahrscheinlich auch ahhangig von der Konstitution der Versuchsperson sowie von dem Ort der Entnahme. Sie erlauben immerhin die Annahme cines Gehaltes von 30 bis 40 '10 Olsaure im Durchschnitt. Da,s Schrifttum spricht von einem Anteil von etwa 48'10 Mlsaure in den Haut- lipoiden, nachgewiesen rnit Osmiumtetroxyd. Wahr- scheinlich sind Komponenten der Hautlipoide, die im Pa- pyrogramm unterhalb der Mlsaure liegen, hohermole- kular und zum Teil auch ungesattigt, so dai3 sie bei dem Nachweis der Olsaure mit Osmiumtetroxyd mit erfaih wcrden.

Nach der Isolierung und Identifizierung der Mlsaure. die fur die Hautphysiologie von besonderer Bedeutung zu sein scheint, wurde der Fettnachschub wie folgt unter- sucht:

Die nach der AbriB-Methode hergestellten Extrakte der ein- zelnen Haiitschichten lagen in I S Losungen - jeweils in 2 ml F'ctrolather aufgenommcn - vor. Diesc wurden ir. 6 Ver- suhsreihen gewonnen, wobei je 3 Proben die Anteile der Olsaure aus den verschicdenen Hautschichten enthielten: a) Fxtraktion der zwei aul3eren Schichtlagen der Epidermis,

c) ., ,, ., tiefsten ,, ., mittleren ,, b) ..

unmittelbar iiber der Barriere. Die Proben wurden entnonimen: Vor der Entfettung der Haut, also den Normalzustand der

Epidermis darstellend; sofort nach Entfettung der Haut; 15, 30, 45 und GO hIin. nach erfolgter Entfettung.

Zum Vergleich entwickelte man einmal die drei Flecken einer Versuchsserie im Parallel-Chromatogramm (also stets a. b, c nebeneinander). Zum anderen wurden Parallel-Chro- matogramme hergestellt, auf denen sich die Olsaure-Anteile in gleichen Hautschichtlagen, also samtliche Werte a , sodann die Werte b und schliefilich die Wsrte c neheneinander be- fanden. Auf diese Weise wurde ein Bild erhalten von den uiiterschiedlichen Mengen der Ulsaure in den gleichen Schicht- lagen der verschiedenen Versuchsserien. Die entwickelten Pa- pyrogramnie behandelte man nach etwa 10 Min. Trocknungs- zeit rnit dem bereits friiher beschriebenen alkalischen Kalium- pcrmanganat-Reagens. Nach den bisherigen Erfahrungen ist tlieser Nachweis der einpfindlichste. Die rein visuelle Beur- trilung der zu vergleichenden Olsaure-Mengen kann auf diese M'eise schnell und zuverlassig erfolgen, zumal mit Hilfe des Ksliumpermanganat-Reagenzes auch die Konzentrationsvertei- lung innerhalb des gewanderten Fleckens beurteilt werden Itann. Zur planimetrischen Auswertung der Flarhe der Kup- icrseife entwickelter Ulsaurc-Flecken ist dagegen eine langere Entwieklungsdauer erforderlich (Anderung der Verteilung und dcr Konzentration innerhalb des Olsaurs-Fledtens!).

Das Ergebnis der Untersuchung ist in nachstehender schematischer Darstellung zusammengestellt.

2 i

:$ I a b c a b c

p1

3 :c1

30 45 60 Ausoanos- unmittelbar 15 w'erf nach L M i n nach Entfettung der Haut-

Darstellung der Ulsaure-Mengen in den einzelnen Sdiichtlagen der lebenden menschlichen Haut

a) in den 2 augeren Epidermis-Schichten, b: in den 2 mitileren Epidermis-Schichten, c) in den 2 tiefsten Epidermis-Schichten, unmittelbar iiber der

Barriere.

407

Die gefundenen Werte schwanken, j e nach Ort und Art der Entnahme, in geringen Grenzen. Sie gestatten aber trotzdem einen Ruckschlut3 auf den Wech8sel des 01- saure-Gehalts in den einzelnen Hautschichten im Verlauf des Lipoid-Nachschubs. Die in der Abbildung markier- ten Flachen veranschaulichen deutlich die Empfindlichkeit des Nachweises sowie die erheblichen Unterschiede in der Speicherung der Olsaure in den verschiedenen Schich- ten der lebenden menschlichen Haut wahrend der Wan- derung der Lipoide.

Die vorstehenden Untersuchungen zeigen, dat3 die nach Entfettung in der Epidermis vordringenden Lipoide ganz uberwiegend aus Fettsauren. vorwiegend Ulsaure, be- stehen. Dag.eg.cn enthalt der Extrakt der nicht entfette- ten I-Iaut, wahrscheinlich durch die Anwesenheit eines erhrblichen Anteils der Lipoide drr Talgdriisen, G 1 y - c e r i d e. Sie konnten nach Entwickeln mit 99"ioigem Al- liohol durch Anfarben mit Rhodamin und Nilblau nach- gewiesen werden g. In den tieferm Schichtlagen dcr Haut verliefen diese Reaktionen auch nach Auftragen relativ groi3er Mengen (2 bis 3 ma1 niehr als zum Olsaure-Nach- weis diente) negativ. Wurden dagegen nur Bruchteilc. eines Milligrammes des I-Iauttalges in 1 ml Petrolather gelost, auf Papier aufgetropft und niit 99"ioigem Alkohol entwickelt, so war der rote Fleck des Fettes auf dein blauen Grund des Papiers deutlich und ncch nach Tagen erkennbar.

Neben Olsaure wurden in den untersuchten Lipoiden auch niedrigmolekulare Fettsauren (wahrscheinlich But- tersaure) erkannt. Auf ihre genauere Prufung wurde zu-

Fette u. Seifen 53, 3'3'2 [t951].

nichst verzichtet, da cs hier auf den Nachweis ankam, dafl die fiir das Kedox-Sybtem der Haut wesentlichen Schichten im Anschlui3 an die Barriere mit ihren SH- Gruppen in erster Linie a 1 s a u r e enthalten, die von den unteren Hautschichten her, und zwar von der Bar- riere an, innerhalb kurzer Zeit nachgebildet werden kann, falls sie von aufien her der Haut entzogen wird.

Nachdem Vegiin und Wil l iams lo bei der IJntersuchung der Plasmalipoide festgestellt haben, dai3 die fettartigen Bestandteile mit Proteinkorpern netzartig verkuppelt sind, hann man annehmen, dai3 die in der Haut nachgebil- deten Ulsaure-Anteile derartigen Lipoproteinen ent- stammen, die entweder durch das Capillarsystein in die oberen Hautschichten gelangen, oder, was noch wahr- sclieinlicher ist, bereits in der Barriere vorliegen. Das Vorkommen solcher Lipoide, die an Eiweii3 gebunden sind, ist bereits beschrieben worderr", 15. Jedoch ist die Art ihrer Bindung noch unbekannt. Mit den iiblichen Fett-Farbemethoden lassen sie sich nicht nachweisen und nur bei saurer Reaktion mit Fettlosemitteln extra- hieren 13. Versuche zum Nachweis der Lipoproteine in der Barriere sollen noch angestellt werden.

Der Notgemeinschaft der Deutschcn Wissenschaft schulden wir Dank fur die Forderung dieser Arbeiten.

l o Nature, London 165, 7C8 [ 19.501. l1 C. Karifmcnzn u. E. Lelimniin, Virchows Arch. 261, 623

l2K. Koga, Ber. Physiol. 84, 28 [1933]. 1:lG. B. Laughlzn u. Cr. K. 7 h e i s , J. Amer. leath. h e m . assoc.

~

j19261.

19, 428 [ 19241.

Die Papier-Chromatographie auf dem Fettgebiet IX: Anwendung auf Lackrohstoffe *

Urtii /';.of. Dr. H . P. K n ii f 711 n n n . Dr. J. B u d 701 i g unr? C. W. S c 11 nt i d t ACS denz Clzcn!isrlieri Lanrlcs-U~ite,.szicliriiig.~nm! Nordi l ie i i i -U~rs t fn l~~~r 71nd deni Zmtitzi t f i i i Pharmcr-rir

lirin' clieniisciie 'Tcrhnologic. rler Universitiit Miivster (Westf .)

Die Trennung von Fetten, Fettsiuren und Seilen mit I-Iilfe der Papier-Chromatographie wurde in friiheren Veroffentlichungcn beschrieben '. Diese Arbeitsweise ha- hen wir auch auf das Lackgebiet iibertragen. Ilierbei ergaben sich zahlreiche hi~wendungsmiiglichkeiten zur Charakterisierung und Trennung von Substanzen ver- schiedenen Ursprungs und unterschirdlicher Konstitution. Ober die in dieser Hinsicht bereits vorliegenden Ergeb- nisse werden wir in Kiirze berichten. Im Rahmen die- ser Mitteilung sollen die Ergebnisse der papyrographi- srhen Untel-suchung der S t a n d o 1 k o c h u n g von Lein- a1 mitgeteilt werden.

Die sich bei der Standolkochung abspielenden Vor- gange werden meist nur durch die Sestimrnung der JZ, der SZ und der Viskositiit verfolgt. Dariiber berichtete z. B. der eine von uns mit S. Fii i tke2. Bei der Molckul- vei-grofierung vermindern sich die Uoppelbindungen, ul)d die zuerst entstandenen dimeren und trimeren Verbin- dungen tretcn bei fortschreitender Kochung zu noch

"' Studien auf dem Fettgehiet, 131. Mitteilung. Fette u. Seifen 52, 331, 713 [1950]; 53, 285, 390 [1951]. Fette u. Seifen 45, 2% [I!)%].

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hdhermolekularen Produkten zusamnien. Der von /. Sclzcibcr fur diesen Vorgang formulierte Mechanismus, nach dem die isolierten Doppelbindungen zunachst in d i t konjugierte Form ubergehen und dann nach C. P. A . Kn/>]wlnieicr in Art der Dien- Synthese miteinander rcagieren, hat durch Untersuchungen von M . Pcstemcr und Mitarbeitern insofern eine Stiitze gefunden, als diese bei der Warmebehnndlung von Leinol das Auf- treten von Konjuen-Fettsauren spektrophotometrisch feststellen konnten. Auch R. F . Puschke und P. H . Wheeler deuten auf Grund von Modellversuchen die Warmepolymerisation von Olen als Dien-Reaktionen konjugierter Systeme Sie nehmen eine thermische Kon- jugierung an, gefolgt von Dien-Synthesen mit nichtkon- jugierten Polyensauren. Eine Trennung der Glycerid- Komponenten des Leinol-Standols in Anteile verschie- deiier Viskositat und MolelculargroRe wurde schon frii- her von H . P. Kazifmnnn7 mit Hilfe der Saulen-Chro- - ~-

Farbe u. Lack 1929, 385. Farbenztg. 38, 1018, 1077 j19331. Fette u. Seifeii 50, 153 [1943]. 51, 101 [1944]. J. Amer. Oil Chem. SOC. 26, 278 [1949]. DRP 741 359 [1!)37]; Fette u. Seifen 46, 286 [1939]; 47, 460 [ tg-~n]; 49, 841 [1942].

FETTE U N D S E I F E N 53.Jahrg. Nr.1 1951