Zeitschrift fiir die gesamte experimentelle Medizin, Bd. 129, S. 286--297 (1957)

Aus dem Insgitut far allgemeine und experimentelle Pathologie (Prof. Dr. V. UEER) urtd dem Institut ftir allgemeine Biologie (Prof. Dr. F. HEE~IK)

der medizinisehen ~'akult~t der Masaryk Universitgt, Brno. Aus der I. Medizinisehen Klinik (Prof. Dr. P. LUKL)

tier medizinischen Fakult~t der P~laek:~ UniversitY,, Olomouc (CSI~)

Die Papierelektrophorese der Ultrafiltratproteine yon Myelom- und Makroglobuliniimieseren

Von

D. WIEDERMANN~ ~. SMARDA_ nnd B. WIEDERMANN

Nit 6 Textabbildimgen

(Eingegangen am 24. Januar 1957)

Mehrere andere Autoren sowie auch einer yon uns stellten verglei. chende Elektrophoresestudien der im Blutserum und in den extravaseu- 1/iren KSrperfliissigkeiten befindlichen Proteine an. So wurden elektro- phoretiscJae EiweiBfraktionen im Urin and in versehiedenen K&]~er- hShlen-Ergiissen untersueht und meistens gut iibereinstimmende Unter- sehiede deren relativer Prozentzahlen in bezug auf die SerumeiweiBver- h~ltnisse verzeiehnet.

Aus der Gruppe yon ~hnliehen Arbeiten soll hier beispielsweise die vor kurzem ersehienene Publikation yon PIE]?ER U. I-IEINE erwghnt wer- den. Diese Autoren haben mehr als 80 Parallelelektrophoresen yon Seren und Pleuraergtissen versehiedener ~tiologie vorgenommen. Sie konnten feststellen, dab im Pleuraexsudat der Prozentanteil der Albumine hSher, derjenige der a~-Globuline deutlieh niedriger ist als im Serum. Bei dieser Feststellung bemerkten sie aueh riehtig, dab bei der nephrotisehen Pro- teinurie ~hnliehe Verh~ltnisse herrschen : I m Urin findet sieh analog zum Exsudat reiehlieh Albumin und kaum etwas a 2- Globulin. Die angefiihrte Beobaehtung ist in guter Ubereinstimmung aueh mit unseren Erfah- rungen (WIEDERMA~N 1).

Es bestand die Vermutung, dab die Unterschiedliehkeit der Pro- teinogramme der Seren und der untersuehten extravaseulgren Fliissig- keiten Folge einer selektiven Wirkung der Capillarmembran bei dem physikalischen Filtrationsprozel~ sei. D~bei kommt es in diesen sozu- sagen n~ttirliehen Ultrafiltraten zu einer Anreieherung der aus kleinen globul~ren Kolloiden bestehenden elek~rophoretisehen Fraktionen (vgl. PIEPEE U. HEINE).

Diese Vermutung konnte in Modellversuehen mit Serumultrafiltration bei gleiehzeitiger papierelektrolohoretiseher Untersuehung der Ultra-

Papierelektrophorese der Ultrafiltr~tproteine 287

filtratprogeine eindeutig besti~tigt werden (WIEDERMANN U. SMARDA). Bei Ultrafiltration yon Seren dutch Kollodiummembranen geeigneter Porenweite wurden Ulgrafiltrate gewonnen, welehe im elektrophoretisehen Eiweigbild loathologisehen K6rl0erfliissigkeiten ghneln. Unter geeigneten Versuehsbedingungen kommt es n~mlieh analog zu den Verhgltnissen in vivo, zu einer Anreieherung derselben kleinmolekularen Fraktionen aueh in den artefiziellen Ultrafiltraten. Dutch stufenweise VergrSgerung des mittleren Porendurehmessers yon ca. 20 bis auf 160 m/t war es uns mSglieh, in vitro das elektrophoretisehe Eiweil3bild der Proteinurie und yon KSrperh6hlenergfissen sowohl des selektiven wie aueh des nieht- selektiven Typus zu imitieren.

OTT bestimmte kfirzlieh dureh Messung des kolloidosmotisehen Druk- kes elektrophoretiseh gewonnener reiner Eiweigfraktionen deren mittlere Molekulargewiehte. Diese Messungen der mittleren Molekulargewiehte yon elektrophoretisehen SerumeiweiBfraktionen sind in (Jbereinstim- mung mit den eigenen Ergebnissen der sehon besehriebenen Versuehe mit Serumultrafiltration.

An dieser Stelle m6gen aueh Ultrafiltrationsversuehe yon PAPPEN- H ~ I ~ mit einigen monodispersen Kolloiden und niehtkolloiden LS- sungen angeffihrt werden. PAPP~NgEIMER bemerkte, dag bei Verringe- rung und Anngherung des Porendurchmessers an die GrSge der filtrier- ten Teilehen die Kollodiummembran anfgnglieh den Durehtri t t der gel6sten Teilehen verlangsamte (restricted diffusion) ohne ihn aber g~nz- lieh zu verhindern.

Eine bedentende Verlangsamung der Diffusion kann naeh eigenen Beobaehtungen bereits bei einer viel grSl~eren Porenweite, als der GrSge der filtrierten Eiweil3teilehen entsprieht, eintreten. Bei geeigneten Poren- weiten der Membranen hat diese fiir einzelne elektrophoretisehe Frak- tionen versehiedene Werte, was mit deren rnittleren )/Iolekulargewiehten zusammenh~ngt. Wir haben vors~ttzlieh eine solehe Permeabilit~tsstufe der Membranen gew/~hlt, damit sieh die Diffusionsverlangsamung der Eiweigfraktionen bei der Filtrierung bestimmterweise in den Proteino- grammen der Ultrafiltrate selektiv auswirke. Mit der steigenden 3/Iembran- permeabilitgt werden die Versehiedenheiten in der Filtrationsgesehwin- digkeit der einzelnen elektrophoretisehen Serumeiweigfraktionen kleiner, bis sehliel31ieh bei grSgeren Permeabilit/~tswerten das EiweiBbild des Ultrafiltrates dem des dazugehSrenden Serums ganz ~hnelt.

Auf Grund dieser unserer Erfahrungen fiber die Ultrafiltration bei Normalseren sowie bei einigen dysprotein/~misehen setzten wit voraus, dub gerade die kleinen )/IembranporengrSBen zur Untersuehung und Dif- ferenzierung aueh yon atypisehen EiweigkSrpern, sog. Paraproteinen, verwendet werden k6nnten. Die letzteren kommen unter den Serum- eiweiBfraktionen bei den Paraproteinosen in Erseheinung, zu welchen

19"

288 D. WI~DE~MA~, J. SM~kRDJk und B. WI]~DER~cIX~:

m a n nach WUHI~MANN U. WUNDERLY haupts~eh] ich 2 kl inische Einhe i ten , naml ich das Myelom und die Makroglobul ingmie Wa ldens t rSm z~hlt. Wi r versuch ten durch U] t ra f i l t r a t ion yon Seren bei geeigneter Mem- branloermeabi l i t~t die Para l0ro te inf rak t ion yon anderen F r a k t i o n e n der Ul t ra f i l t r a t e abzusondern. Insbesondere bei der Makrog]obul ingmie Wa]- dens t rSm war ein Erfolg zu erwar ten , da das mi t t l e re Molekulargewicht der P a r a p r o t e i n f r a k t i o n bei dieser K r a n k h e i t ve rmut l i eh hSher sein sollte als jenes anderer Serumeiweil3frakt ionen sowie auch jener yon 3/[yelomfallen. Wi r verweisen bier auf die heute bere i ts umfangre iche L i t e r a tu r fiber die Makroglobul ine , namen t l i ch auf die Sedimenta t ions- messungen in der Ul t razent r i fuge . Ube r die Pa rap ro te ine yon lVIyelo- matoseseren is t bekann t , dal~ ihr Molekulargewieht sich meis t n ich t sehr viel yon den] der normalen y-Globul ine un te r sche ide t {PUTNAM u. UDIZ~). Deswegen v e r m u t e t e n wir, dab die P a r a p r o t e i n f r a k t i o n e n be im Myelom zugleich mi t anderen Serumeiwei~kSrl0ern auch Membranen m i t re]a t iv niedr iger Permeabilitg~t pass ieren werden.

Die LSsung dieser F r a g e n k5nn te n ieh t n u t yon theore t i sehem, son- dern auch yon 10raktischem Interesse sein und bei der Differenzierung yon Makroglobul inamien und Myelomatosen behilf l ich sein. Nach Ver- besserung der Methode in ana ly t i scher Hins ich t kSnn ten auf ahnl iche Weise viel le icht auch andere P ro t e ina r t en in bezug auf ihre Durch t r i t t s - fah igkei t geprfif t werden.

Methodisehes

Metbodik der Ultrafiltration. Zu den Ultrafiltrationsversuchen verwendeten wir Kollodiummembranen, welche mit bestimmten Abanderungen nach ELFORD her- gestellt worden waren. In der Technik der Zubereitung der U]trafllter und bei den Messungen der mittleren PorengrSl~e hielten wir ~ns an die Angaben yon BAvE]~ u. HUGtIES. Die uns zur Verffigung stehenden Kollodiumfilter von verschiedenen Porenweiten waren andererseits urspriinglieh fiir bakteriologische Untersuehungen hergestellt worden (Ros~z~B~c u. SMAm)A). Die Qualitat der Ultrafilter wurde nach ERnx u. PISA kontrolliert un4 verhaltnismal~ig niedrige Variationsbreiten der Membranporen festgestellt. Wir arbeiteten mit unverdiinnten Seren und ver- wen@ten einen Fi]trationsdruck yon 1--1,5 Arm. je naeh der angewandten Poren- grSBe der Membran, wie es yon G~AB~ empfohlen wurde.

Materialeindiekung. Bei unseren Versuchen waren die Ultrafiltrate ziemlich eiweil~arm und mu$ten deshalb vor der elektrophoretisehen Analyse stark einge- diekt werden. Dies erzielten wir dutch Konzentrationsdialyse gegen Gummi ara- bieum-Gel. Die Dialyse dauerte 3--5 Std und das Gel wurde dabei gleichma$ig durchmischt.

Die Papierelektrophorese der Ultra/iltratproteine Die Versuchsbedingungen der papierelektrophoretisehen Analyse wurden yon

einem yon uns sehon frfiher ausfiihrlieh beschrieben (W]~.D~MAZ~N 2). Jedes Serum wurde gleichzeitig auf 3 Elektrophoresestreifen untersucht und dann naeh Hitze- denaturierung mit Amidosehwarz 10 B (Bayer) auf gewShnliche Ar~ gefarbt. Die Proteinogramme wurden gr6Btenteils visuell gewertet. Zu quantitativen Zweeken wurden die elektrophoretisehen Streifen nach Auffarben photometrisch in situ naeh den Angaben yon GRASSI~ANN, HANNIG U. KN]~DEL gewertet. Die Prozentzahlen

Papierelektrophorese der Ultrafiltratproteine 289

wurden aus den Elektrophoresekurven dnrch Planimetrierung gewonnen. Es mug angefghrt werden, dab die bloBe visuelle Absehgtzung der Proteinogramme vollauf zur Feststellung der Ergebnisse, zu welchen wir in dieser Arbeit gelangten, gent~gte.

Paraproteingmisehe Gradienten zwischen der fl- und ~-Fraktion welche in ihrer elektrophoretischen Mobilitgt ungefghr der Fibrinogenfraktion entsprechen, haben wir nach WIEDE~A~ als ~-Gradient bezeichnet. Da sie sich aber bei der Papier- elektrophorese dureh eine bedeutende und die ganze y-Fraktion iiberdeekende Sehwanzbildung anszeiehneten, haben wir die ~-Gradiente gemeinsam mit den ?-Globulinen quantitativ gewertet. Bei allen der 3 Makroglobulingmiefglle handelte es sieh um eine solche ~-Paraproteinamie.

Die Ultrazentri/ugierung der Serumproteine Die Makroglobuline wurden durch Ultrazentrifugierung und Sedimentations,

messung in den Sandoz-Laboratorien in Basel, Sehweiz, yon Dr.-Ing. E. WI~DS,- ~AN~ eindeutig nachgewiesen. (Gleichzeitig sprechen wir Herrn Dr.-Ing. E. WI~D~- MA~, Basel, unseren verbindliehen Dank ffir die gefgllige Durehfiihrung der Ultra- zentrifugation und Elektrophorese naeh der klassisehen Methode aus.)

Krankengut, Versuchsanordnung und Ergebnisse

Die Versuche wurden an Seren yon 5 Myelomkranken und yon 3 Ma- krog lobul in~mie-WMdens t r6m-Kranken ausgefiihrt. Es ist naheliegend, einige klinische Da ten hier anzufiihren, um die Eigensehaften der loatho - logischen Proteinfrak~ionen beziiglieh auf die E r k r a n k u n g dami t besser erkl/~ren zu kSnnen.

Fall 1. Patient C., 48 Jahre alter Mann mit �89 fiir Myelom typiseher Anamnese und typischem Skeletbefund. Im Knochenmark Infiltration mit fast ausgereiften Myelomzellen. Bence-Jones- Protein negativ, gur Zeit Serumgesamt- eiweig : 7,7 g-%. Papierelektrophorese : Albumin- 42,5; a t- 4,8; a2- 6,5; fl- 12,4; ~- und y-Globulin-33,8~o, l~6sum6: Myelom mit ~-Paraprotein~imie.

Ultrafiltration~versuehe: Das Serum wurde durch Membranen mittlerer Po- renweite yon 17, 22 und 24 m# flltriert. In allen Serumultrafiltraten war eine namhafte paraprotein~misehe Fraktion nebst anderen Eiweil~fraktionen papier- elektrophoretiseh feststellbar.

Fall 2. Patientin L., 26j~hrige Frau. Im Jahre 1951 wurde Adeno- und Splenomegahe gefunden. Nasen- und Zahnfleisehbluten bei normaler Throm-

Abb. 1. Fa l l2 . Makrog lobu l i n~mieWalden - boeytenzahl sowie normaler Blutungs- str6m. Oben: Serum-Eiweil]h'aktionen mit und Gerirmungszeit. Im peripheren Blur- r Unten: Ultrafiltrat-

e iwe ig f rak t ionen ohne Pa rap ro t e ine (Poren- bild atypische lymphoide Zellen. Im weite = 34m~) Myelogramm bis zu 55% lymphoider Zellen. lm Urin damals Bence-Jones-Uroprotein positiv, nun aber immer negativ. Nach RSntgenbestrahlung trat eine klinische Remission mit teilweiser Restitution im EiweiBspektrum ein. I)anach wurde im Jahre 1955 durch Ultrazentrifugation

Z. exper. Mad., Bd. 129 19a

290 ]). W~]~DERM~, J. S~tl~DA und B. WIEDERMANI'~:

eine geringere Menge yon Makroglobulinen mit einer Sed.-Konst. yon 16 S und bei der klassisehen Elektrophorese eine kleine ~-Paraprotein~mie festgestellt. Zur Zeit Gesamtserumeiwei• : 12 g-%, ttyperprotein~mie. Papierelektrophorese: Albumin- 45,4; a 1- 7,3 ; %- 10,8; fl- 14,1 ; ~- und y-Globuhn- 22,4%. (~-Gradient dargestellt als ein feiner abet sehr deutlieher Streifen, s. Abb. 1.) R~sum@: Makroglobuhnamie WaldenstrSm mit r

Ultrafiltrationsversuche: Bei der Ultrafiltrierung dutch Membranen mit Poren von 34, 40 und 46 m~ befand sieh unter den Filtratproteinen keine paraprotein- amische Fraktion (s. Abb. 1). Erst bei Anwendung einer Porenweite yon 51, 55, 60 und 61 m# waren die Paraproteine auf den Proteinogrammen der Ultrafiltrate sieht- bur. Die Paraproteine passierten also die Membranen erst bei hSheren PorengrSl~en als diejenigen des Myelomkranken im vorigen Falle.

Fall 3. Patient P., 50j~hriger Mann mit ljahriger ffir Myelom typischer Ana- mnese und mit typisehem Skelet- und Knoehenmarkbefund. Bence-Jones-Eiweil~ stark positiv; bei tier Elektrophorese zeigte sieh eine einzige langsam wandernde homogene Komponente mit geringen Spuren anderer Eiweii~fraktionen. Protein- gehaltim Serum: 10 g.O/0, tIyperproteinamie. Papierelektrophorese: Albumin- 49,5; %- 3,8; a2- 5,0; fi- 5,4; >,-Globulin-36,30/o. l~6sum@: Myelom mit y-Paraprotein- ~mie.

Ultrafiltrationsversuehe: ])as Serum wurde blol~ bei einer einzigen niedrigen Porengr613e yon 22 mtt filtriert und unter den Filtrateiweil~k6rpern eine starke para- protein~mische Fraktion vorgefunden. Es bestehen also hier ~hnliche Verh~ltnisse wie bei dem Fall 1.

Fall 4. Patientin A., 56jghrige Frau. In der Anamnese 4 Jahre dauernde Blu- tungserseheinungen. Blasse und Schwache. Hepato- und Splenomegahe. Im l~6nt- genbild des Skelets nebst diffuser Osteol0orose keine Yer~nderungen. Im Blutbild An~mie und Lymphocytose. ImMyelogramm bis zu 35% kleiner Lymphoidelemente. Serumviscosit~t enorm erhSht. Serumeiweil~gehalt: 14,4g-~ ! SIA Reaktion: negativ! ])urch Ultrazentrifugierung starke Makroglobuhnkomponente yon 13 S und eine Nebenkomponente yon 18 S gefnnden. Papierelektrophorese: Albumin- 31,5; a 1- 3,1; %- 3,2; fi- 3,8; ~- und y-Globulin- 58,4%. R~sum@: Makroglobuhn- ~mie WaldenstrSm mit ~-Paraprotein~mie.

(Serum und klinische ])aten dieser Patientin wurden uns dureh die Liebenswiir- digkeit yon Dr. C. SVE~LA, Medizinische Katheder ffir Arztefortbildung, Praha-Kr~, fibermittelt.)

Ultrafiltrationsversuche: ])as Serumultrafiltrat bei Porch yon 3~ mtt enthielt eine starke paraprotein~misehe Fraktion. ])as Serum wurde weiter bei kleineren Porenweiten yon 22 und 24 m/~ filtriert. Die entsprechenden Filtrate waren aber praktiseh eiweil~los, also aueh ohne Para.proteine. Wir setzten voraus, dab der Miit- erfolg dutch zu grol~e Serumviscosit~t verursaeht wurde. ])aher verdfinnten wir das Material 1:1 mit physiologiseher Koehsalzl5sung und filtrierten yon neuem bei Porenweiten yon 22 und 27 m#. Aber aueh bei verdfinntem Serum hatten wir keinen Erfolg. ])eshalb und wegen der sehweren Anemic der Kranken, welehe 6ftere Blut- entnahmen nicht erlaubte, nahmen wir yon weiteren Versuchen mit diesem Makro- globulingmieserum Abstand. Die Frage yon Mil~erfolgen in ahnlichen F&llen werdeu wir in dieser Arbeit sp~,ter behandeln.

Fall 5. Patient W., ein 70j&hriger Mann, klagt ein 1/2 Jahr fiber Sehmerzen der unteren Extremitaten. Ermiidung, An&mie. Keine hgmorrhagische Diathese. RSnt- genbild des Skelets derzeit ohne Knochenherdvergnderungen. Im Blutbild hypo- chrome An&mie, Leukocytose und I%utrophilie. Im Myelogramm derzeit keine pathologisehen Elemente. Bence-Jones-Uroprotein negativ. Serumgesamteiweil~: 6,9 g-%. Papierelektrophorese: Albumin-40,9; a 1- 9,5; az- 12,4; fi- 13,6; ~- und

Papierelektrophorese der Ultrafiltratproteine 291

y-Globulin-23,6~o. (Im (-Bereich eine feine, aber deutliche paraprotein~mische Fraktion, s. Abb. 2). R@sum6: lgyeloma incip, mit (-Paraprotein~mie.

Ultrafiltrationsversuche : Die Se- rumfiltration wnrde bei Porenweiten yon 22, 24 und 27 m# durchgefiihrt. In allen Ultrafiltraten war eine deut- liclie paraprotein~mische Fraktion unter den l~iltratproteinen feststell- bar (vgl. Abb. 2). - - ghnlich wie bei den vorigen Myelomseren.

Fall 6. Pat ient V., 49 Jahre alter Mann. Die Beschwerden dauern un- gef~hr 1 Jahr. Durch Kuochentrepa- nation wurde Myelosklerose festge- stellt. Art dem Skelet ein massiver osteosklerotischer ]3efund. Im Blut- bild wurde eine erythroblastische Angmie gefunden. Knochenmark- punktat : Hypoplasie des Knochen- markes, atypische Plasmocyten und Osteoblasten. Im Urin Bence-Jones- EiweiB positiv. Serumgesamteiweil] : 11,6g-%, Hyperprotein/~mie.Papier- Abb. 2. iFall 5. l~yeloma incip. Oben: Serum-

eiweiftfraktionen rail ~-Paraproteinen. Unten: elektrophorese : Albumin- 39,4; a~- UltrafilCrateiweiltfrak~ionen mit P a r a p r o t e i n e n

3,9 ; a 2- 6,5 ; fl- 9,3; y- Globulin- 40,9~o (Porenweite = 2 4 rap)

Abb. 3 Abb. 4 Abb. 3. Fall 6. Myeloma. Oben: Sernmeiwei~fraktionen mit ~-Paraproteinen. Unten: Para-

proteine im Urin (Bence-Jones-Uroprotein) Abb. 4. Fall 6. XVIyeloma. Oben: Ultrafiltrateiwei2fraktionen mit zweigeteflten Paraprote- inen (Porenweite = 18m~). Unten: Ultrafiltrateiwei2fraktionen rail nngeteilten Para-

proteinen (Porenweite = 24 m~)

(vgl. auch Abb. 3). R@sum6: 0steoblastisches Plasmocytom (atypische Osteomyelo- retikulose) mit y-Paraproteingmie.

Ultrafiltrationsversuche : Bei den Porendurchmessern yon 16 und 17 m# waren unter den FiltrateiweiBkSrpern keine Paraproteine nachweisbar. Sie kamen erst

292 D. WI~D~.RMA~X, J. SMAaDA und B. WIEDEI~M&NN-.*

bei der Porenweite yon 18 m# in den Proteinogrammen zum Vorsehein. Es ist also mSglich vorauszusetzen, dal~ auch beim Myelom eine Absonderung der Paraprotein- fraktion yon den anderen Filtratproteinen m6glieh ist, jedoch bei einer kleineren Membranporeaweite. Bei der Serumfiltrution dureh Poren yon 18 m# konnten wir eine interessante Erscheinung beobaehten, n~mlieh dab sich die Paraproteinkom- ponente nach der Filtration bei der Elektrophorese der Ultrafiltratproteine zu 2 deut- lich getrermteu Fraktionen spMtete (s. Abb. 4). Bei mit einer Porenweite yon 22 und 24 m# gewonnenen Ultrafiltraten war diese Komponeute natiirlich wieder fest- stellbar, aber ungeteilt (s. aueh Abb. 4). Es ist nieht ohne Bedeutung, dug dieselbe Erscheinung 6fter an biologischen Capillarmembranen, so z.B. derjenigen der Nierenglomeruli bemerkt wurde. Ebenso wie andere Autoren konnten auch wir bei der Elektrophorese der Uroproteine yon Myelom- bzw. MakroglobulinS, mie- Patienten eine ~hnliche Zweiteilung der im Serum homogenen Paraproteinfraktion beobachten. In diesem Zusammenhang taucht wiederum der Gedanke einer Ana- logie zwischen der Wirkung der Glomerulusmembran und der artefizie]len Kollo- diummembraa bei der Ultrafiltration ~uf.

Die eine positive Koehprobereaktion auf Bence-Jones-Eiweig aufweisenden Uroproteine ersebienen bei diesem Kranken Ms einzige langsam wandernde und elektrophoretiseh homogene Fraktion (vgl. Abb. 3). Die Ultrafiltration des Bence- Jones-Uroproteins bei der Poreaweite yon l l m# gab ein negatives Resultat, da das Filtr~t ganz eiweil~frei war. In einem weiteren Ultrafiltrationsversueh wollten wir das Verhalten des Bence-Jones-Proteins zu den normalen BluteiweigkSrpern priifen. Leider besM3en wir keine Filtermembranen der Porenweite von 11--16 m/~, welche die pathologischen Uroproteine vie]leieht besser charakterisieren kSnnten. DeshMb vermisehten wir gleiehe Teile NormMseren und eingediektes Bence-Jones-Protein. Der kleinere Teil der Misehung wnrde elektrophoretiseh untersucht. Den gr6Beren Teil filtrierten wir dutch Poren yon 16 m#, dieselben, welche in den vorangegange- aen Serumfiltrationsversuehen zur Verhinderung des Durchtrittes yon Serumpara- protein geniigt hatten. DiesmM fanden wir aber unter den FiltrateiweiBkSrpern eine starke Paraproteinkomponente. Das ist in Ubereinstimmung mit den Literatur- angaben, wonaeh die Paraproteine im Urin im Verh~ltnis zu denselben im Serum regelm/~gig k]einmolekular sind (und deshMb auch manchmM ohne die iibrigen Blutproteine die Glomerulusmembran passieren k6nnen).

Fall 7. Patientin H., 47 Jahre Mte Frau. 1 Jahr Sehmerzen in den Knoehen, jedoeh im RSntgenbild keine osteolytisehen Kuochenherdver~nderungen. Im Blut- bild An&mie, Lymphocytose. Keiue h~morrhagisehe Diathese. Im SternMpunktat Vermehrung plasmatiseher Elemente, vereinzelt atypische Plasmoblasten. Bence- Jones.Uroprotein negativ. Gesamtserumeiweil3" 12,4 g-~ Hyperprotein~mie. Pa- pierelektrophorese: Albumin- 33,3; a 1- 3,3; a 2- 4,7; ill- 4,5; fi~- und y-Globulin- 54,2%. R~sum6: Myelom mit fl2-Paraprotein~mie.

Ultrafiltrationsversuche: Das Serum wurde dureh Membranen mittlerer Poren- weite yon II, 17, 24 und 57 mtt filtriert. ])as Ultrafiltrat der ersteu Porenweite war eiweil~frei. Bei der PorengrSl~e yon 17 mtt und h6her wurde nebst den anderen Ei- weiBfraktionen in den Ultrafiltraten noeh eine starke Paraproteinkomponente wahr- genommen.

Fall 8. Patient B., 56 Jahre alter Mann mit 2 Jahre dauerndelt anamnestiseh festgesteilten Nasen- und Mundblutungen. Im Blute leukoerythroblastische I~eak- tion und stark vermehrte Lymphoidzellen. Im Knoehenmark Infiltration mit Lym- phoidelementen, KMne Adenomegalie und Sl01enomegalie. Die Ultrazentrifugatiou und klassisehe Elektrophorese stellte eine Makroglobulinkomponente yon 16 S mit einer ~-Paraprotein~mie lest. Im Urin Bence-Jones-EiweiB, bei der Elektrophorese in 2 Komponeuten gespalten, wovon die langsamer wandernde sehwach zur

Papierelektrophorese der Ultrafiltratproteine 293

Darstellung kommt (Abb. 5). Das Auftreten der Zweiteilung der Paraproteine bei der Elektrophorese yon kiinstlichen sowie natiirlichen Ultrafiltraten wurde bereits oben behandelt. Der Serumeiwefl3spiegel: 8,5 g-~ SIA Reaktion: Stark positiv- massive Triibung. Papierelektrophorese: Albumin- 43,8; a 1- 5,1; %- 7,2; fi- 7,4; ~- und y-Globulin- 36,5% (vgl. Abb. 5). R6sum6: Makroglobulin- /~mie WaldenstrSm mit ~-Para- protein~mie.

Ultrafiltr ationsversuehe: Bei diesem Kranken wurde die Serum- ultrafiltration durch eine gr5Bere Porositatenanzahl durehgefiihrt. Bei Anwendung yon Ultrafiltern mit Poren yon 17, 22, 39 und 40 m# waren die Filtrate g~nzlich ohne Paraproteine (vgl. Abb. 6). Die paraprotein~misehe Komponente erschien auf den Proteinogrammen erst bei einer Porenweite yon 46 mp und dariiber (s. Abb. 6), z. B. 51 m/~.

Nebst tier Serumultrafiltration Abb. 5. Fall 8. :Yiakroglobulin~mie Waldens t rSm. haben wir ans dem Serum dutch Oben: Serumeiwei/~fraktionen mit ~-Paraprote-

inen. Un ten : Parapro te ine im Urin (Bence-Jones- Prgeipitation in destilliertem Was- Uroprotein, zweigeteilt) ser das Makroglobulin isoliert und in physiologischer Koehsalzl5sung resuspendiert. Das isolierte Para- protein war elektrophoretiseh homogen. Die Elektrophorese der restliehen SerumeiweiBkSrper er- wies, dab die paraproteingmische Fraktion praktisch his auf einen unbedeutenden Rest aus dem in destilliertem Wasser unlSslichen Makrog]obulin bestand. Mittels Mischungs-Elektr ophoreseversueh konnte best~tigt werden, daI~ das isolierte sowie das im Nativserum befindliche Makroglobulin elektro- phoretisch identiseh sind.

Jxt physiologiseher NaC1-LSsung aufgelSstes Makroglobulin filtrier- t e n w i t d u r e h 22 v e r s c h i e d e n e Abb. 6. Fal l 8. ~Vs %ValdenstrSm. Ultrafilter mit Porenweiten zwi- Oben: Ultrafil~rateiweil~fraktionen ohne Para-

proteine (Porenweite = 22 nag). Un ten : Ul t raf i l t ra t - sehen 17--300 m/~. Auf Anwesen- eiweil3fraktionen mit Paraproteinen (Porenweite heit yon Protein in den U]trafil- = 46 m~) traten wurde mittels der Snlfo- salicyls~ureprobe nnd tier Koehprobe geprtift. Auf diese Weise konnten wir wahr- nehmen, dal~ das isolierte Makroglobulin die Membran erst bei den Porenweiten yon etwa 200 m# passierte. Fiir das besondere Verhalten des isolierten Makro- globulins bei den Ultrafiltrationsversuchen werden wit im Weiteren eine wahr- seheinliehe Erkl~rung anfiihren.

294 ~). WIEDEI~I~AIq~, J. S~[AI{DA und B. WIEI)m~MAI~:

Diskussion der Ergebnisse

Wenn wit das elektrophoretische EiweiBspektrum in unseren Ultra- filtraten den bio]ogischen KSrperflfissigkeiten gegenfiberstellen, k6nnen bei niedrigen Membranporosit~ten 2 Grundtypen yon Ultrafiltraten der paraproteingmischen Seren aufgestellt werden. Proteinogramme yon Ultrafiltraten, welehe keine Paral0roteine enthielten, ~hnelten den Ultra- filtraten yon NormMseren, entsprechend dem EiweiBbilde der nephro- tisehen Proteinurie. Ultrafiltrat-Proteinogramme mit einer paraprotein- iimischen Fraktion imitierten das Bild einer Paraproteinurie verbunden mit einer nephrotischen Proteinurie.

Wir hatten Gelegenheit, neben den )/[yelomseren die Seren yon 3 Pa- tienten mit Makroglobulingmie WaldenstrSm zu behandeln, die bereits frfiher dutch Ultrazentrifngierung untersucht worden waren. Bei einem yon diesen 3 Kranken war es mSglich, das Makrog]obulin durch Preci- pitation in destilliertem Wasser prgparativ zu isolieren nnd nach dessen AuflSsung seine Eigenschaften bei der Ultrafiltration zu verfolgen. Nachdem die paraproteingmische Serumfraktion fast c~uantitativ yon diesem Makroglobulin gebildet wurde, war ein Vergleich der Eigenschaf- ten des im Nativserum befindlichen mit dem dutch Prgcipitation iso- lierten Makroglobu]in mSglich. Zu unserer Uberraschung waren beide Ergebnisse prinzipiell versehieden, obwohl die elektrophoretisehen Beweg- lickheiten in beiden F~llen keine Unterschiede aufwiesen.

In diesem Zusaramenhange sollen die Versuchsergebnisse yon WIF~DE- ~IAN~ erw~hnt werden. Dieser Autor bemerkte bei der Ultrazentrifugie- rung yon mehreren Makroglobulinseren neben der Makroglobulinhaulot- komponente einige Nebenkomponenten mit h6heren Sedimentations- konstanten und Molekulargewichten. Diese Erscheinung erklgrte er sich durch die MSglichkeit einer teilweisen Assoziation yon Makroglobulinen, bei welcher sich aber die elektrische Ladung der Partikel wesentlich nicht i~ndert. Damit bestand die MSglichkeit einer Erkl~rung der Diskrepanz zwischen der Elektrophorese, welche eine einzige Paraproteinfraktion ergab, und der Sedimentationsmessung in der U]trazentrffuge, die meh- rere Komponenten aufwies.

Die Makroglobulinaggregation wurde auch durch Beobachtungen ila Elektronenmikroskop bestgtigt (GAI~D, I-IELLEI~ U. MAI~MI~OS). Dies- beziigliche mit dem Elektronenmikroskop hergestellte Anfnahmen zeigen, dab das Makroglobulin die Tendenz aufweist, Aggregate aus einer grSBe- ten Anzahl sph~rischer Partikel zu bilden.

Manche paraprotein~Lmische und mukroglobu]in~mische Seren zeich- hen sich durch eine erhShte Viscosit~Lt aus. Diese oft extremen Viscosi- t~tswerte k6nnen durch Zusalnmentreten mehrerer Eiweil3teilchen, Pro- teinfaden- und Gerfiststrukturenbildung erkl~rt werden (vgl. I~EGNInRS, WIEM]~, WUNDEI%LY U. BURTIN).

Papierelektrophorese der U]trafiltratproteille 295

Wir sind deshalb der Ansicht, dab die erhShte Bildung yon Protein- aggregaten yon prinzipie]ler Bedeutung bei der Erkliirung einiger Diskre- panzen auch in unseren Ultrafiltrationsversuchen sein kSnnte. Es ist wahrscheinlich, dab das in destilliertem Wasser pr~tcipitierte Makro- globulin sich nicht mehr in den Zustand auflSst, in welchem es ira Nativ- serum vor der Isolierung enthalten war, auch wenn seine elektropho- retischen Eigenschaften sich dabei nicht wesentlich ver~ndern. Die faden- fSrmigen Proteinkomplexe dfirften wahrscheinlich die Ursache der schnel- len Filterblockade sein, so da6 dann bloI3 die Fliissigkeit filtriert wird und nicht das in ihr gelSste Protein. Durch Filterblockade mit Protein- komplexen mSchten wir uns einerseits die negativen Ergebnisse der Fil- trierung von iso]iertem Makroglobulin bis zu einer Membranporenweite yon ca. 200 m#, anderseits den Mi~erfolg der Versuche bei einigen hoch- viscosen paraprotein~mischen Seren erkl~ren. Hier kSnnten wir auch unseren Fall yon Makroglobulin~tmie 4 einreihen. Bei letzterem wurden zwar die Paraproteine im Ultrafiltrat bei der PorengrSi3e yon 35 m/~ in grol3er ~enge aufgefunden, die weiteren Versuche bei niedrigeren Poren- weiten ergaben jedoch wegen offensiehtlicher Filtersperre nieht den er- warteten entscheidenden Erfolg.

Wenn wir die Ergebnisse unserer Ultrafiltrationsversuche mit Myelom und Makroglobulin~mieseren zusammenfassen, kSnnen wir in 2 yon unseren 3 makroglobulin~mischen F~llen wesentliche Unterschiede yon den 5 untersuchten Myelomen feststel]en. Bei den erst genannten Seren konnte man durch Ultrafiltration die Paraproteinfraktion yon anderen Ultrafiltratproteinen bei der Porenweite yon 40 m# bzw. yon 46 m~ und darunter absondern. Die entsprechende Fraktion in den ~iyelomseren passierte jedoch die Membranen schon bei einer PorengrSl~e yon 17, 18, 22, 24 m/~ und natfirlich auch bei hSheren Porosit~ten.

Nachdem zu unseren Ultrafiltrationsversuchen wegen der Seltenheit der diagnostisch gesicherten F~lle eine relativ k]eine Anzahl yon makro- globulini~mischen Seren zur Verffigung standen, ffihlen wir uns nicht berechtigt, die evtl. klinisch-diagnostischen M6glichkeiten bei dieser Krankhei t abzusch~tzen. Wir bemerken gleichzeitig, dal~, soweit uns bekannt ist, die Ultrafiltration zur LSsung i~hnlicher Fragenkomplexe bisher nicht verwendet worden ist. In F~llen, wo das Makroglobulin den wesentlichen Teil der Paraproteinfraktion im Serum bildet, konnten wit offensiehtlich Verschiedenheiten gegenfiber dem Myelom erwarten. In Fs wo das Makroglobulin blol3 einen kleinen Teil der Paraprotein- ffaktion bildet, dfirften wahrscheinlich keine signifikanten Unterschiede gegenfiber dem Myelomserum zu erwarten sein. Wir gedenken unsere Versuche fortzusetzen, um so mehr, als unsere Ultrafiltrationseinrichtung sowie Kollodiummembranen ursprfinglich zu bakteriologischen Unter- suchungen best immt waren. Wir glauben aber, dal3 unsere bisherigen

296 D. WIEDERMANN, J. SMARDA und B. WIEDERMANN:

Versuchsergebnisse ein gutes Beispiel yon neuen AnwendungsmSglich- keiten der Ultrafiltration auf dem Eiweil~gebiet bringen.

Absehliel~end sei noehmals den Herren Prof. V. UHE~ (Brno), Prof. F. HERCIK (Brno) und Prof. J. KA~LiK (Olomouc) fiir ihre kritischen Bemerkungen und wert- vollen Ratschlgge herzliehst gedankt. Herrn Chefarzt Dr. A. UCgYT~ (Brno) danken wit fiir wohlwollendes Durchsehen des Manuskriptes.

Zusammenfassung

Die Autoren verwendeten die U]trafiltration durch Kollodiummem- branen yon gemessener Porenweite und die Papierelektrophorese der Ultrafiltratproteine zur Erforschung der pathologischen Serumproteine in 5 Fgllen yon Myelom und 3 F~llen yon Makroglobulingmie Walden- strSm. Neben der Sernmultrafiltration wurden in einem Fall die Ultra- filtrationsversuche auch mit isoliertem Makroglobulin, in einem anderen mit dem Bence-Jones-Uroprotein durchgefiihrt. Zur Differenzierung die- ser Eiwei~k5rper wurden haupts~ichlich Membranen mit einer Porenweite yon 17--55 m~ gebraueht.

Proteinogramme yon Ultrafiltraten, welche keine Paraproteine ent- hielten, ahnelten den Ultrafiltraten yon Normalseren, wie dies anch beim Eiweil~bilde der nephrotischen Proteinurie der Fall ist. Ultrafiltrat- proteinogramme mit paraproteinamischer Fraktion imitierten das Bfld einer Paraproteinurie, verbunden mit einer nephrotischen Proteinurie.

Bei 2 yon 3 Makroglobulin~mief~llen waren die paraprotein~mischen Fraktionen erst dureh Membranfilter mit um ca. 25 m/, hSherer Poren- grSl~e als ~thnliche Fraktionen yon 5 nntersuchtenMyelomseren filtrierbar. Im dritten Falle waren die Versuche wegen frtihzeitiger Filterblockade dnrch Paraproteine ergebnislos.

Das aus einem der Seren gewonnene isolierte und resuspendierte Ma- kroglobu]in trat durch das Membranfilter erst bei einer viel hSheren PorengrS~e yon ca. 200 mt~ durch, wogegen im Nativserum dasselbe Makroglobulin, das die gesamte paraprotein~mische Fraktion bildete, bereits bei einer Porositgtsstnfe yon ca. 46 m# die Membranen passierte.

In der Diskussion wurde die Frage der vorzeitigen Filterblockade dutch Paraproteinaggregate behandelt und ferner kritiseh die evtl. Un- tersuchungsmSglichkeiten mit dieser Methode zur Differenzierung yon paraprotein~tmischen Seren erSrtert.

Unter geeigneten Ultrafiltrationsbedingungen war in einem Myelom- falle die MSglichkeit gegeben, die Spaltung der im Serum homogenen Paraproteine bei der Elektrophorese der Ultrafiltratproteine zu beob- achten.

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der Masaryk-Universi t~t