Dissertation - archiv.ub.uni-marburg.de · CCH3 O 2,4-Diacetylphloroglucinol 1.3 Klassifizierung der Pseudomonas-Pflanzen-Wechselwirkung Nach Lugtenberg [Lugtenberg et al., 1992]

Untersuchungen zum Stoffwechsel der Aminosäuren Aspartat und

Glutamat, sowie ihrer Amide in Pseudomonas:

Klonierung und Charakterisierung von Amidohydrolase-Genen.

Konstruktion und Analyse von Transposon-Mutanten

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem

Fachbereich Chemie

der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Anja Hüser

aus

Meschede

Marburg / Lahn 1999

Vom Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg

als Dissertation am 08.12.1999 angenommen.

Erstgutachter: Prof. Dr. M. A. Marahiel

Zweitgutachter: Prof. Dr. K. H. Röhm

Danksagung

Herrn Prof. K. H. Röhm danke ich für die Themenstellung und Betreuung während der

Entstehung der vorliegenden Arbeit.

Herrn Prof. M. A. Marahiel möchte ich für die Übernahme des Zweitgutachtens danken.

Allen Mitgliedern der AG Röhm und AG Löffler danke ich für das sehr gute Arbeitsklima

und die Hilfsbereitschaft.

Mein besonderer Dank gilt Bettina Rohde, Ute Klöppner, Stefan Schleper und Holger Lindner

für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Mein besonderer Dank gilt Ute Klöppner und Uli Sievers für den Spaß, den wir (auch bei der

Arbeit) miteinander hatten, sowie die kulinarische und computertechnische Unterstützung.

Meinen Eltern möchte ich für die finanzielle Unterstützung während des Studiums danken.

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ................................................................................................................................. 1

1.1 Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen in der Rhizosphäre - (DieRhizosphäre)................................................................................................................................. 2

1.2 Wachstumfördernde Mikroorganismen ........................................................................................ 31.3 Klassifizierung der Pseudomonas-Pflanzen-Wechselwirkung ..................................................... 41.3.1 A) Indirekte Stimulation des Pflanzenwachstums (Biokontrolle) ............................................ 41.3.2 B) Direkte Förderung des Pflanzenwachstums ........................................................................ 51.3.3 C) „Bioheilung“ (Biologische Entgiftung)............................................................................... 61.4 Besiedlungsfaktoren ..................................................................................................................... 71.5 Wurzelexsudate ............................................................................................................................ 81.6 Pseudomonaden ............................................................................................................................ 81.7 Stickstoffassimilation in Bakterien............................................................................................. 101.8 Bakterielle Amidasen und Stickstoffassimilation ....................................................................... 111.9 Transport Stickstoff-haltiger Verbindungen in Bakterien........................................................... 131.10 Aminosäuren als Kohlenstoffquelle............................................................................................ 141.11 Aufgabenstellung........................................................................................................................ 14

2 MATERIAL................................................................................................................................... 16

2.1 Geräte ......................................................................................................................................... 162.2 Chemikalien................................................................................................................................ 172.3 Enzyme ....................................................................................................................................... 172.4 DNA-, RNA- und Protein-Marker .............................................................................................. 182.5 Kits ............................................................................................................................................. 182.6 Zusätzliche spezielle Materialien................................................................................................ 192.7 Medien........................................................................................................................................ 192.8 Antibiotika.................................................................................................................................. 212.9 Weitere Medienzusätze............................................................................................................... 222.10 Mikroorganismen........................................................................................................................ 222.11 Plasmide ..................................................................................................................................... 232.12 Oligonukleotide .......................................................................................................................... 24

3 METHODEN................................................................................................................................. 25

3.6 Isolierung von genomischer DNA aus Pseudomonas................................................................. 253.7 Präparation von Plasmid-DNA ................................................................................................... 273.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .............................................................................................273.9 DNA-Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen........................................................................ 293.10 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatgruppen ........................................................................... 303.11 DNA-Ligation............................................................................................................................. 303.12 Agarosegelelektrophorese........................................................................................................... 313.13 Ethidiumbromid-Färbung von Agarosegelen.............................................................................. 323.14 Präparation von DNA aus Agarosegelen .................................................................................... 323.15 Herstellung kompeteneter E. coli-Zellen .................................................................................... 333.15.1 Herstellung RbCl-kompetenter E. coli-Zellen........................................................................ 333.16 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli-Zellen.................................................................. 343.17 DNA-Sequenzierung................................................................................................................... 353.17.1 Denaturierung......................................................................................................................... 353.17.2 Hybridisierung des Primers.................................................................................................... 363.17.3 Kettenverlängerung ................................................................................................................ 363.17.4 Kettenabbruchreaktion ........................................................................................................... 373.18 Hochauflösende Polyacrylamidgelelektrophorese...................................................................... 383.19 Konstruktion einer λ-ZAP-Express Genbank............................................................................. 403.19.1 Partielle Restriktion von genomischer DNA aus P. fluorescens............................................ 413.19.2 Dichtegradientenzentrifugation.............................................................................................. 423.19.3 Tropfendialyse und DNA-Fällung.......................................................................................... 423.19.4 Ligation mit dem ZAP-Express-Vektor ................................................................................. 433.19.5 Verpackung der Ligationsansätze ..........................................................................................433.20 Titerbestimmung der Genbank ................................................................................................... 443.21 Herstellung einer Asparaginase-Sonde zum Screenen der Genbank .......................................... 44

3.22 DIG-Markierung der Asparaginase-Sonde ................................................................................. 453.23 Abschätzung der Ausbeute der DIG-Markierung der Sonde ...................................................... 463.24 Optimierung der Sondenkonzentration ....................................................................................... 473.25 Screening der Genbank mit der DIG-markierten Asparaginase-Sonde ...................................... 473.25.1 Plaque Lifts ............................................................................................................................ 473.25.2 Proteinase K-Behandlung....................................................................................................... 483.25.3 Hybridisierung........................................................................................................................ 483.25.4 Stringente Waschschritte........................................................................................................ 493.26 Chemiluminescenz-Detektion..................................................................................................... 493.27 In vivo excision........................................................................................................................... 513.28 Genome Walker PCR ................................................................................................................. 523.29 Isolierung von Gesamt-RNA ...................................................................................................... 553.29.1 RNA-Isolierung mit Guanidinisothiocyanat und Phenol........................................................ 553.29.2 RNA-Isolierung mit dem „High Pure RNA Isolation Kit“ von BM....................................... 553.30 5´- RACE.................................................................................................................................... 573.31 RNA-Markierung mit Digoxigenin ............................................................................................ 603.32 Northernblot-Analyse ................................................................................................................. 603.33 Überexpression der P. fluorescens Glutaminase-Asparaginase.................................................. 633.34 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ........................................................................................ 643.35 Reinigung der rekombinanten PF-GA-His8 über IMAC............................................................. 663.36 Konjugativer Transfer von Plasmiden ........................................................................................683.37 Aktivitätstests ............................................................................................................................. 703.37.1 Bestimmung der Asparaginase-Aktivität mit L-Asparaginsäure- β-Hydroxamat .................. 703.37.2 Mikrotiterplatten-AHA-Test .................................................................................................. 723.37.3 Glutamatbestimmung mit Glutamat-Dehydrogenase, Diaphorase und Tetrazoliumsalzen.... 733.37.4 Gekoppelter optischer Test..................................................................................................... 753.38 Mikrotiter-Glycerinstock-Platten................................................................................................ 773.39 Umstempeln von Bakterienkolonien...........................................................................................773.40 Selektion auf γ-Glutamylhydrazid-Platten.................................................................................. 77

4 ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 79

4.1 Herstellung einer λ-ZAP-Express Genbank von P. fluorescens................................................. 794.2 Herstellung einer DIG-markierten Asparaginase-Sonde ............................................................ 794.3 Klonierung des Asparaginasegens aus P. fluorescens................................................................ 814.4 Analyse des ansB-Gens .............................................................................................................. 854.5 Identifizierung eines Signalpeptids der Pf-GA ........................................................................... 874.6 Vergleich der von dem ansB-Gen aus P. fluorescens erhaltenen Sequenz mit der

Aminosäuresequenz des nativ gereinigten Proteins:................................................................... 884.7 Identifizierung eines Endonukleasegens..................................................................................... 894.8 Überexpression und Reinigung der rekombinanten Pf-GA-His8 ................................................ 904.9 Bestimmung der Substratspezifität der rekombinanten Pf-GA-His8........................................... 924.10 Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes des ansB-Gens ..................................................... 934.11 Promotoridentifizierung.............................................................................................................. 934.12 Bestimmung der ansB-Tanskriptgröße durch Northernblot-Analyse ......................................... 954.13 Nachweis der σ54-Abhängigkeit des ansB-Gens......................................................................... 964.14 Identifizierung weiterer Asparaginase-Gene in anderen Pseudomonas-Stämmen ..................... 984.15 Klonierung und Analyse eines ansB-Gens aus P. fluorescens Pf 5 ............................................ 994.16 Erzeugung von Mutanten durch Zufalls-Tn5-Mutagenese ....................................................... 1004.17 Suche nach Mutanten mit Defekten im Abbau der Aminosäuren Glutamin, Glutamat, .................

Asparagin und Aspartat ............................................................................................................ 1014.18 Gezielte Selektion..................................................................................................................... 1014.19 Suche nach Mutanten mit Defekten in der Asparaginverwertung ............................................ 1044.20 Suche nach Mutanten mit Defekten in der Glutamatverwertung.............................................. 113

5 DISKUSSION .............................................................................................................................. 114

5.1 Klonierung einer Glutaminase-Asparaginase aus P. fluorescens WT ...................................... 1145.2 Regulation der Pf-GA............................................................................................................... 1185.2.1 σ54-abhängige Promotoren ................................................................................................... 1185.2.2 Regulation von σ54-abhängigen Promotoren durch Aktivatorproteine................................. 1195.2.3 σ54-abhängige Expression des ansB-Gens in P. fluorescens................................................ 1225.2.4 Regulation anderer Asparaginasegene ................................................................................. 1235.3 Die Glutaminase-Asparaginase des Biokontroll-Stammes P. fluorescens Pf-5........................ 125

5.4 Transposon-Mutagenese zur Identifizierung weiterer am Aminosäurestoffwechsel beteiligterEnzyme ..................................................................................................................................... 125

5.4.1 Das Transposon Tn5-OT182................................................................................................ 1265.4.2 Selektionsstrategien.............................................................................................................. 1275.5 Identifizierung eines extrazellulären Endonukleasegens - endX............................................... 1345.6 Ausblick.................................................................................................................................... 135

6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................................... 137

7 ANHANG ........................................................................................................................................ 138

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ......................................................................................................... 140

9 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................. 142

DANKSAGUNG

Einleitung

1

1 Einleitung

Die Erforschung der Interaktion von Pflanzen mit Mikroorganismen der Rhizosphäre

erlangt immer größere Bedeutung. Durch die zunehmende Einflußnahme des Menschen

auf das Wachstum der Kulturpflanzen werden einerseits die Erträge der Nutzflächen

gesteigert, andererseits erhöht sich aber auch die Gefahr des Auftretens von

Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschädlingen. (Pflanzenkrankheiten durch Mikro-

organismen). Meistens wurde der Schädlingsbefall durch den Einsatz von Pestiziden

zurückgedrängt. Dabei wurden die Gefahren für Menschen und Umwelt durch den

steigenden Einsatz chemischer Schädlingsbekämpfungsmittel oft nicht richtig erkannt

oder verdrängt. Die negativen Auswirkungen dieser Stoffe auf die empfindlichen

Ökosysteme wurde erst in den letzten Jahren beachtet. Dabei spielt vor allem die

Anreicherung von Pestiziden im Grund- und Trinkwasser und damit auch in der

Nahrungskette eine entscheidende Rolle. Auch der übermäßige Einsatz von

Düngemitteln, und der daraus resultierenden Anreicherung in Bächen, Flüssen und

Seen, führt zu einer Schädigung vieler Ökosysteme.

Nicht zuletzt durch das zunehmend negative Ansehen dieser Stoffe in der Bevölkerung,

wird intensiver nach Alternativen gesucht, um diese Stoffe durch ungefährlichere zu

ersetzen. Eine Möglichkeit zur biologischen Pflanzenkontrolle ist der Einsatz

bestimmter natürlich vorkommender oder genetisch veränderter Mikroorganismen, die

in der Lage sind die Felderträge zu steigern, Pflanzenkrankheiten und ihre Erreger

sowie andere Schädlinge zurückzudrängen. Obwohl in den letzten 25 Jahren schon viele

Untersuchungen zur Erforschung der Rhizosphäre und ihrer Bewohner durchgeführt

wurden, erfordert ein kommerzieller Einsatz von natürlichen Biokontroll-Organismen

eine noch genauere Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen Bodenmikroorganis-

men und den Pflanzen.

Einleitung

2

1.1 Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen inder Rhizosphäre - (Die Rhizosphäre)

Im allgemeinen bezeichnet man als Rhizosphäre den Teil des Bodens, der die

Pflanzenwurzeln umgibt. Nach Lynch [Lynch, 1990] kann dieser Bereich in drei Zonen

unterteilt werden: die Ectorhizosphäre, die Rhizoplane und die Endorhizosphäre. Die

Ectorhizosphäre ist der Teil des Bodens, der die Pflanze direkt umgibt. Sie kann einen

beträchtlichen Abstand von der Wurzel einnehmen, z. B. dann, wenn sich

Wechselwirkungen der Wurzel mit Mycorrhiza-Pilzen (Mycorrhizosphäre) entwickeln.

Zur Ectorhizosphäre gehören auch die Wurzelhaare, der Schleim, der die Wurzel

umgibt, sowie abgestreifte Wurzelkappenzellen. Als Rhizoplane wird die eigentliche

Wurzeloberfläche bezeichnet. Unter der Endorhizosphäre versteht man das Gebiet

innerhalb der Wurzel, das von einigen Bakterien besiedelt werden kann. Hierzu gehören

der Wurzelstiel mit der Endo- und Epidermis, der Kortex und die Wurzelkappe. Die

Bedingungen in der Rhizosphäre werden durch die gegenseitige Beeinflussung des

Bodens, der Pflanzenwurzeln und der mit den Wurzeln assoziierten Organismen

bestimmt. Die Wechselwirkungen von Rhizosphären-Mikroorganismen und Pflanzen

können fördernd, neutral oder schädlich für die Pflanze sein. Dabei können die

Bedingungen, die in der Rhizosphäre herrschen, diese Wechselwirkungen beeinflussen.

Der Untersuchung der fördernden Eigenschaften bestimmter Mikroorganismen kommt

dabei eine immer größere Bedeutung zu. Ziel dieser Forschung ist es, die besten

genetischen Eigenschaften / Merkmale für eine spezifische Anwendung in einem

Mikroorganismus zu vereinigen.

Wurzelhaar

Schleim(pflanzlich und bakteriell)

Rhizoplane

Pflanzenschleim

abgestreifte Wurzelkappenzelle

Stiel mitXylem und Phloem

Epidermis

Cortex

Endodermis

Wurzelkappe

Endorhizosphäre Ectorhizosphäre

Einleitung

3

1.2 Wachstumfördernde Mikroorganismen

Als wachstumsfördernde Mikroorganismen bezeichnet man Rhizobakterien, die direkt

oder indirekt das Pflanzenwachstum fördern. Zu diesen Bakterien gehören unter

anderem Vertreter der Genera Arthrobacter, Alcaligenes, Serratia, Rhizobium,

Agrobacterium und Bacillus [O´Sullivan & O´Gara, 1992]. Obwohl einige Pseudomo-

naden, wie P. syringae, als Pflanzenpathogene bekannt sind, wurden andere Mitglieder

der fluoreszierenden Pseudomonaden, wie z. B. P. fluorescens und P. putida, als

vielversprechendste Gruppe von pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien identifi-

ziert. Versuche zeigten, daß sie sehr häufig an der Biokontrolle von Pflanzen-

krankheiten beteiligt sind [O´Sullivan & O´Gara, 1992].

Von großer Bedeutung sind auch verschiedenen andere frei-lebenden, assoziative und

symbiotische Stickstoff-fixierende Prokaryoten, sowie nicht-prokaryotische Mycor-

rhizapilze. Die Pilze versorgen die Pflanzen in erster Linie mit Phosphat, während die

Stickstoff-fixierenden Bakterien die Pflanze mit Stickstoff versorgen und sie so

zumindest teilweise, unabhängig von im Boden vorhandenen Stickstoffverbindungen

machen.

Bakterien(PGPB)

Bakterien(PGPB)

BakterienPhytohormone

N-Verbindungen

Nährstoffe

-

+

+

Besiedelung

SiderophoreAntibiotikaAmmoniakHCNInsektizide

PestizideXenobiotika

-

Phytopathogene

Besiedelung

unschädliche Produkte

-

Einleitung

4

C

CH3

O

OHHO

OHC CH3

O2,4-Diacetylphloroglucinol

1.3 Klassifizierung der Pseudomonas-Pflanzen-Wechselwirkung

Nach Lugtenberg [Lugtenberg et al., 1992] kann man die Pseudomonas-Pflanzen-

Wechselwirkungen in drei Klassen unterteilen, wobei diese Klassifizierung auch auf

andere Pflanzen-Mikroorganismen-Wechselwirkungen zutrifft.

1.3.1 A) Indirekte Stimulation des Pflanzenwachstums (Biokontrolle)

Biokontrollorganismen verstärken das Pflanzenwachstum und die Pflanzengesundheit

durch verschiedene Mechanismen. Einige dieser Bodenbakterien fördern das

Pflanzenwachstum indirekt dadurch, daß sie für die Pflanze schädliche Organismen, wie

z. B. andere Mikroorganismen, Insekten oder Unkraut unterdrücken bzw. zurück-

drängen. Dabei wenden die Biokontroll-Bakterien verschiedenen Strategien an.

Eine Strategie zur Unterdrückung schädlicher Mikroorganismen ist die Produktion von

Antibiotika und leicht flüchtigen Substanzen wie

Ammoniak und Blausäure (HCN). Es sind viele von

Pseudomonas produzierte Antibiotika bekannt, unter

ihnen Phenazine, Pyoluteorin, Tropolon und 2,4-

Diacetylphloroglucinol [O´Sullivan & O´Gara, 1992].

Dabei können die Antibiotika nicht nur positive

Wirkungen verursachen. Dadurch, daß einige dieser

Antibiotika, z. B. das Tropolon, sehr effektiv gegen viele Bakterien und Pilze wirken

[Lifshitz et al., 1987], kann die Eliminierung vieler die Pflanze ebenfalls fördernder

Organismen nicht ausgeschlossen werden. Zu den spezifischer wirkenden

antimikrobiellen Substanzen gehören das 2,4-

Diacetylphloroglucinol und das Pyoluteorin. 2,4-Di-

acetylphloroglucinol wirkt z. B. gegen Phythium

ultimum, einem Bakterium, das Zucker- und

Baumwollsämlinge schädigt. [Howell et al., 1980;

O´Sullivan & O´Gara, 1992]. Weitere wichtige

Metabolite für die Biokontrolle sind flüchtige

Substanzen, wie NH3 und HCN. So ist die von

einigen Pseudomonaden in vitro produzierte Menge an HCN toxisch für pathogene

Pilze, wie z. B. Thielaviopsis basicola. Dieser Pilz, der die schwarze Wurzelfäulnis von

C

O

OH

OHN

HCl

Cl

Pyoluteorin

Einleitung

5

Tabakpflanzen verursacht, kann auf diese Weise unterdrückt werden [O´Sullivan &

O´Gara, 1992]. Andererseits können die HCN-Mengen, die von einigen Pseudomonas-

Spezies freigesetzt werden auch das Pflanzenwachstum beeinträchtigen. So wurden die

Ertragsverluste von Kartoffeln und einiger Getreidearten auf HCN-produzierende

Pseudomonaden zurückgeführt [Bakker et al., 1987]. Auch Insekten können von den

Mikroorganismen erfolgreich bekämpft werden. Das bekannteste Beispiel für von einem

Bodenbakterium produzierte Insektengifte sind die Endo- und Exotoxine von

Bacillus thuringiensis. Diese auch als „BT Toxine“ bekannten Proteine wurden in den

letzten 30 Jahren gegen Schmetterlingsplagen eingesetzt [O´Gara et al., 1999].

1.3.2 B) Direkte Förderung des Pflanzenwachstums

Diese Art der Förderung basiert auf der Produktion von Substanzen, die als Wachstums-

Stimulatoren wirken können, man spricht auch von Pflanzenwachstumshormonen.

Dabei konnte in Versuchen das Wachstum weiter verstärkt werden, wenn

biosynthetische Vorstufen der Hormone von außen zugeführt wurden [Lugtenberg & de

Weger, 1992; Arshad & Frankenberger]. Eine weitere für die Landwirtschaft sehr

bedeutende Strategie zur Förderung des Pflanzenwachstums, sind die sogenannten

Biodünger. Sie bestehen aus mikrobiellen Inokulaten, die die Pflanzen mit Nährstoffen

versorgen, die sonst durch chemische Düngemittel zugeführt werden müßten. Die

wichtigsten Biodünger sind Prokaryoten, die die Pflanze mit Stickstoff versorgen.

Obwohl viele Eubakterien und Archaebakterien in der Lage sind, elementaren

Stickstoff aus der Luft zu Ammoniak zu reduzieren, haben nur einige dieser Bakterien

die Fähigkeit entwickelt (direkt) Stickstoff-fixierende Symbiosen mit höheren Pflanzen

auszubilden. Die für die Landwirtschaft bedeutendste ist die intrazelluläre Symbiose

zwischen Rhizobium und Hülsenfrüchte-tragenden Pflanzen, wie z. B. Bohnen,

Sojabohnen und Erbsen, sowie einiger Futterpflanzen, z. B. Klee und Luzerne. Dabei

wird auf der Pflanzenwurzel ein spezielles Organ gebildet, das als Knöllchen bezeichnet

wird. In diesen Organen wandeln Rhizobiumbakterien atmosphärischen Stickstoff in

Ammoniak um, der zum größten Teil an die Pflanzenwurzel abgegeben wird. Im

Gegenzug dazu versorgt die Pflanze die Bakterien mit anderen Nährstoffen. Weitere

Wechselwirkungen von Mikroorganismen und landwirtschaftlich wichtiger Nutz-

pflanzen sind die Rhizocenosen (biocenotische Beziehung) von Acetobacter mit

Einleitung

6

OCH2COOH

Cl

Cl

2,4-D

O

P

S

OC2H5H5C2O

NO2

Parathion

Zuckerrohr und Süsskartoffeln, Achromobacter mit Reis und Azospirillum mit Gerste,

Reis und Weizen, sowie Klebsiella mit Reis und Süsskartoffeln [O´Gara et al.,1999].

1.3.3 C) „Bioheilung“ (Biologische Entgiftung)

Als Bioheilung bezeichnet man den Einsatz von biologischen Agenzien (Bakterien /

Pilze) um chemische Schadstoffe zu entgiften oder ihre Konzentration in der Umwelt zu

reduzieren. Die Strukturen vieler synthetischer Pestizide basieren auf relativ einfachen

aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff-Grundgerüsten, die eine Vielzahl

von Substituenten, wie Halogene, Phosphat-, Nitratgruppen, tragen

können. Die biologische Entgiftung beruht auf der Tatsache, daß

viele Schadstoffe natürlich vorkommenden Substanzen ähnlich sind

und deshalb von Mikroorganismen abgebaut werden können.

Andere Substanzen haben Strukturen, die in der Natur unbekannt

sind (Xenobiotika), und sind deshalb häufig resistent gegenüber

dem mikrobiellen Abbau. Es werden deshalb zwei Arten von Xenobiotika

unterschieden:

1) Xenobiotika, die schnell, meistens innerhalb einer „Erntesaison“ abgebaut werden

können. Diese Stoffe werden heute häufig als Pestizide eingesetzt. Ein Beispiel hierfür

ist 2,4-D ( 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure), ein Herbizid, das in 4-6 Wochen abgebaut

werden kann.

2) Die zweite Gruppe von Xenobiotika besteht aus sehr widerstandsfähigen Pestiziden,

die für lange Zeiträume (Monate/Jahre) im Boden erhalten

bleiben. Beispiele hierfür sind die Insektizide Parathion ((O,O-

Diethyl-O-p-Nitrophenyl-phosphothioat) und DDT (Dichlordi-

phenyltrichlorethan), die im Boden für mehr als 15 Jahre

erhalten bleiben. DDT wurde von 1930 bis zu seinem Verbot

1979 intensiv eingesetzt. Stabile Metabolite dieses Stoffes

wurden im Boden, im Grundwasser und auch im Menschen

gefunden. Aufgrund des Anreicherungsrisikos wird der Einsatz

von Xenobiotika der zweiten Gruppe vermieden. Zu den Bakteriengruppen, die in der

Lage sind Xenobiotika abzubauen, gehören Gram-negative Aerobier, vor allem

Pseudomonas-Arten, fakultative Anaerobier, z. B. Enterobacterien, und Gram-positive

Bakterien, wie z. B. Bacillus-Arten und Corynebacterien. Auch von der Industrie in die

Einleitung

7

Umwelt eingebrachte Schadstoffe, wie z. B. polychlorierte Biphenyle (PCBs), können

von einigen Bakterien unschädlich gemacht werden. Durch effektives Einbringen von

Bakterien, die Gene für den Xenobiotika-Abbau tragen, in den Boden, könnten

Pestizide und andere Umweltgifte abgebaut werden. Da die Wurzel den Boden in einem

ausgedehnten Netzwerk durchdringt, könnte durch Besiedlung der Wurzel mit solchen

Bakterien eine Bodenschicht von ca. 1 m Dicke behandelt werden. Dabei läßt sich die

Effektivität dieser Behandlung durch genetisch veränderte Bakterien steigern, die Gene

für den Abbau spezieller Substanzen tragen [Lugtenberg & de Weger, 1992].

Obwohl viele Beispiele für die Unterdrückung von Pflanzenkrankheiten und Förderung

des Pflanzenwachstums bekannt sind [Lutgenberg & de Weger, 1992], erhält man bei

Feldversuchen unterschiedliche Ergebnisse über die Effektivität der einzelnen

Mikroorganismen. Der Grund für die schlechten Ergebnisse, die man bei Feldversuchen

mit Pflanzenwachstums-fördernden Bakterien erhält, ist häufig die schwache

Besiedlung des Wurzelsystems durch die Biokontroll-Bakterien. Eine erfolgreiche

Besiedlung des Wurzelsystems ist aber die Grundvoraussetzung für einen fördernden

Einfluß der Bakterien auf die Pflanze.

1.4 Besiedlungsfaktoren

Obwohl zahlreiche der untersuchten Pseudomonaden in vitro einen positiven Einfluß

auf das Pflanzenwachstum haben, scheitert ihr Einsatz in Feldversuchen häufig an der

unzureichenden Besiedlung des Wurzelsystems der Wirtspflanzen. Um die

Besiedlungsfähigkeit zu verbessern und dadurch den Einsatz von Biokontroll-Bakterien

effektiver zu gestalten, müssen die an der Rhizosphärenbesiedlung beteiligten

Mechanismen auch auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Der Besiedlungsvorgang

ist sehr komplex und hängt von vielen verschiedenen Faktoren, wie Feuchtigkeit,

Temperatur, pH-Wert, Bodentyp, Zusammensetzung der Wurzelexsudate, Mineralien-

gehalt und anderen Mikroorganismen, ab. Deshalb müssen die Biokontroll-Bakterien

folgende Kriterien erfüllen: Erstens müssen sie erfolgreich um die verfügbaren

Nährstoffe konkurrieren können. Ein Beispiel hierfür ist die Produktion von

Siderophoren, die den Pseudomonaden einen Wachstumsvorteil unter Eisen-

limitierenden Bedingungen verschafft. Zweitens müssen die Bakterien dem teilweise

sehr schnell wachsenden Wurzelsystemen folgen können. Es wird vermutet, daß die

Einleitung

8

Chemotaxis zu den Wurzelexsudaten und die Anlagerung an die Wurzel den Bakterien

dies ermöglichen könnte [Lugtenberg & Weger, 1992; Vande Broek et al., 1995].

Außerdem müssen Biokontrollorganismen in der Lage sein, toxische Verbindungen, wie

Phenole und Radikale, die von den Pflanzen abgegeben werden, unschädlich zu

machen. Auch der Angriff von Bakteriophagen und anderen schädlichen Mikro-

organismen, wie Bdellovibrio und Protozoen [Stephens et al., 1987; Acea et al., 1988],

stellt eine Gefahr für die Rhizosphärenbewohner dar. Die Produktion von

Bakteriotoxinen und Antibiotika ist den Pseudomonaden bei der Verteidigung von

Vorteil.

1.5 Wurzelexsudate

Die von den Pflanzen abgegebenen Wurzelexsudate scheinen eine entscheidende

Nährstoffquelle für die Rhizobakterien darzustellen. Die Exsudate bestehen

hauptsächlich aus Zuckern, Aminosäuren und organischen Säuren. Aber auch komplexe

Kohlenhydrate, Alkohole, Vitamine, Lysate und Hormone kommen vor [Kluepfel et al.,

1993]. Die Zusammensetzung der Exsudate variiert mit biotischen (z. B. Pflanzenart,

Alter, Nährstoffstatus) und abiotischen Faktoren (z. B. Temperatur, Bodenstruktur,

Vorhandensein von Pestiziden, Zufuhr von Sauerstoff und Wasser). Die Gesamtmenge

an abgegebenen Exsudaten, Wurzelkappen(zellen) und Wurzelschleim kann 3 - 15 %

des Trockengewichtes der Pflanze betragen [Campell & Graeves, 1990]. Verschiedene

Untersuchungen zeigten, daß die Aminosäuren den größten Anteil der exsudierten

Substanzen ausmachten. Dabei kamen die Aminosäuren Asparagin, Glutamin, Glutamat

und Aspartat zu 40-50 % vor [Barber & Gunn, 1974]. Ein Grund für den hohen Anteil

dieser Aminosäuren ist möglicherweise die Tatsache, daß Glutamat und Glutamin

zentrale Intermediate des bakteriellen Stickstoff-Stoffwechsels sind.

1.6 Pseudomonaden

P. fluorescens und P. putida gehören zu den fluoreszierenden Pseudomonaden. Die

fluoreszierenden Pseudomonaden unterscheiden sich von anderen Pseudomonaden

Einleitung

9

durch die Fähigkeit, ein wasserlösliches gelb-grün-fluoreszierendes Pigment zu bilden.

Sie sind Gram-negative, chemoheterotrop bewegliche Stäbchen, die polare Geißeln

besitzen. Sie werden nach Palleroni et al. in der rRNA-Homologie-Gruppe I

zusammengefaßt [Palleroni et al., 1973]. Fluoreszierende Pseudomonaden haben

einfache Nährstoffbedürfnisse und kommen in der Natur sehr häufig vor. Ver-

breitungsgebiete sind Böden, Blattpflanzen, Süßwasser, Sedimente und Seewasser. Sie

haben Bedeutung bei der biologischen Pflanzenkontrolle, Pflanzenpathogenese, beim

Verderb von Lebensmitteln aber auch in der medizinischen Pathogenese.

Einige fluoreszierende Pseudomonaden, zu denen auch verschiedenen P. fluorescens-

und P. putida-Stämme gehören, haben unter anderem durch ihre Fähigkeit Siderophore

zu bilden, Bedeutung bei der Biokontrolle erlangt. Siderophore sind Stoffe, die Eisen

sehr effizient komplexieren. Die fluoreszierenden Pseudomonaden im Boden

produzieren normalerweise gelb-grün-fluoreszierende, wasserlösliche Siderophore. Der

Grund für die Produktion dieser Siderophore ist die begrenzte Verfügbarkeit von Eisen

in der Rhizosphäre. Da jedoch fast alle lebenden Organismen Eisen für das Wachstum

benötigen, können die Mikroorganismen der Rhizosphäre nur überleben, wenn sie in der

Lage sind, Eisen in ausreichenden Mengen zu gewinnen. Unter Eisen-Mangel-

Bedingungen sezernieren die Pseudomonaden die Siderophore in den Boden. Aufgrund

der sehr hohen Affinität zu Fe3+-Ionen bilden sich sehr starke Fe3+-Siderophor-

Komplexe. Diese Komplexe sind für andere Mikroorganismen nicht verfügbar. Der

Pseudobactin 358, ein Pseudobactin, das von dem Stamm P. putida WCS358 [Hofstad et al., 1986]

produziert wird. HO-Orn = δ-N-Hydroxyornithin; HO-Asp = α-Hydroxyaspartat;

NN

OH

OH

HN

C

O

CH2CH2C

O

NH2

H

C ONH

CH2

CH2

CH2CH2 CH

NH3+

C

ONH CH

C O

NH

CHCH2HO

C O

NH

CHC

HC OHCH3

O

NHCH

CH3

C O

NH

CH CHOH

CH3

C O

NH

CH CH2 CH2 CH2 CH2 NH2

C O

NH

CH

C

CH2 COOH

O

NH

CH

OH

C O

OH

N

O

HO

+

Lys-1

HO-Asp-2

Ser-3

Thr-4Ala-5

allo-Thr-6

Lys-7

Asp-8

HO-Orn-9

Einleitung

10

Stamm, der die Siderophore produziert hat, kann diese jedoch über einen sehr

spezifischen Rezeptor in der äußeren Zellmembran aufnehmen und verwerten [Buyer

et al., 1986]. Dadurch erhalten die fluoreszierenden Pseudomonaden einen Wachstums-

vorteil gegenüber anderen, auch schädlichen Bakterien und Pilzen [Loper & Buyer,

1991].

1.7 Stickstoffassimilation in Bakterien

Viele Bakterien sind in der Lage, verschiedene Stickstoffverbindungen als

Stickstoffquellen zu nutzen. In diesen Verbindungen liegt der Stickstoff in

unterschiedlichen Oxidationsstufen vor (z.B. NH4+(-3), NO3

- (+5), N2 (0), Aminosäuren

(-3), Harnstoff (-3), Purine (-3), Pyrimidine (-3)). In den Zellen hat der Stickstoff in den

meisten Verbindungen (Aminogruppe, heterocycl. N) die gleiche Oxidationsstufe wie

im Ammoniumion. Bei der Stickstoffassimilation werden deshalb die verfügbaren N-

Substrate von den Bakterien zu NH4+ reduziert oder hydrolysiert. Innerhalb der Zellen

sind Glutamat und Glutamin, sowie Aspartat und Carbamoylphosphat die wichtigsten

Stickstoff-Donatoren [Merrick & Edwards, 1995; Fuchs, 1999]. Dabei dient Glutamin

als direkter Stickstoff-Donor für die Biosynthese der meisten N-Verbindungen der

Zelle, wie z. B. der Purin- und Pyrimidinnukleotide, von Glucosamin-6-phosphat, p-

Aminobenzoesäure und der Nicotinamid-Derivate. Im Gegensatz zu Glutamin, das nur

einen indirekten Donor für die Aminogruppe von Aminosäuren darstellt, ist Glutamat

der universelle Donor für die NH2-Gruppe der Aminosäuren und verschiedenen Amino-

Transferase-Reaktionen. Bei der Stickstoffassimilation stehen den Bakterien zwei Wege

zur Verfügung, um aus dem aufgenommenen NH4+ Glutamat bzw. Glutamin zu bilden.

Welche der beiden Möglichkeiten von den Bakterien genutzt wird hängt von der

Ammoniumkonzentration ab. Bei hohen NH4+-Konzentrationen wird NH4

+ durch das

Enzym Glutamat-Dehydrogenase (GlDH) in einer NAD(P)H-abhängigen Reaktion auf

α-Ketoglutarat übertragen, wodurch Glutamat entsteht (1)

++ + →+−+ NAD(P)GlutamatNAD(P)HatKetoglutar¡NH GlDH4 (1)

Da die GlDH einen relativen hohen Km-Wert von ca. 0,1 mM besitzt, ist sie bei

Ammoniummangel ineffektiv. Bei niedrigeren NH4+-Konzentrationen wird deshalb der

Einleitung

11

Glutamin-Synthetase (GS) / Glutamat-Synthase (GOGAT)-Weg beschritten (2). Dabei

wird NH4+ in einer ATP-abhängigen Reaktion durch die GS auf Glutamat übertragen.

Das durch diese Reaktion entstandene Glutamin wird durch das Enzym Glutamin-2-

oxoglutarat-amino-transferase (GOGAT) auf α-Ketoglutarat übertragen. In dieser

NADPH-abhängigen Reaktion entstehen zwei Glutamatreste.

iGS

4 PADPGlutaminATPGlutamatNH ++→+++ (2)

++ →+−+ NADP2GlutamatNADPHatKetoglutar¡Glutamin GOGAT (3)

Obwohl bei Ammoniummangel hauptsächlich dieser Weg für die Assimilation von

Stickstoff genutzt wird, ist die GS auch bei hohen NH4+-Konzentrtionen, bei denen der

GlDH-Weg beschritten wird, aktiv. Über das Produkt der GS-Reaktion, Glutamin, ist

die NH4+-Assimilation direkt mit dem verschiedenen Biosynthesewegen zur Produktion

von Proteinen, Nukleinsäuren etc., verbunden. Obwohl Ammoniumionen die bevor-

zugte N-Quelle für Bakterien darstellen, müssen die Bakterien dennoch in der Lage sein

eine Vielfalt alternativer Stickstoffquellen zu verwerten. Dazu müssen weitere Enzyme

für die Aufnahme und den Metabolismus von den Zellen zur Verfügung gestellt werden.

Wie bei der NH4+-Assimilation wird die Synthese und in einigen Fällen auch die

Aktivität dieser Proteine direkt durch die Verfügbarkeit ihrer Substrate reguliert

[Merrick & Edwards, 1995]. In Enterobakterien bezeichnet man diese Regulation als

„Stickstoff-Kontrolle“. Die biochemischen und genetischen Mechanismen, die die

„Stickstoff-Kontrolle“ ermöglichen, sind in den Enterobakterien weitgehend aufgeklärt.

Die Elemente dieses Systems, das auch als ntr-System bezeichnet wird, wurden auch in

vielen anderen Bakterien nachgewiesen [Merrick & Edwards, 1995].

1.8 Bakterielle Amidasen und Stickstoffassimilation

Wie bereits erwähnt wurde, können viele Bakterien außer Ammoniumionen auch andere

stickstoffhaltigen Verbindungen verwerten. Die meisten dieser Verbindungen werden

von bestimmten Enzymen zu NH4+ reduziert oder hydrolysiert. Zu diesen Enzymen

gehören die Amidasen. Eine der bekanntesten Amidasen ist die Glutaminase-

Einleitung

12

Asparaginase, die Glutamin und / oder Asparagin zu NH4+ und Glutamat bzw. Aspartat

hydrolysiert (4).

AspartatNHAsparagin 4seAsparagina + → + (4)

Dabei ist eine genaue Trennung zwischen Glutaminasen und Asparaginasen nicht

möglich, da die meisten dieser Enzyme beide Substrate umsetzen. Glutaminasen /

Asparaginasen wurden unter anderem in folgenden Bakterien gefunden: E. coli (ansB)

[Jennings & Beacham, 1990], Pseudomonas sp.7A (PGA) [Roberts, 1976], P. stutzeri

MB-405 [Manna et al., 1995], P. aeruginosa [Wilson et al., 1995], W. succinogenes

(ansA) [Lubkowski et al., 1996], B. subtilis (ansA) [Sun & Setlow, 1991], und

S. enterica (ansB) [Jennings et al., 1993]. Vor allem die E. coli Asparaginase hat

besondere Bedeutung erlangt, da sie als Tumortherapeutikum bei bestimmten

Leukämieformen eingesetzt wird [Gallagher et al., 1989]. Diese hochaffine

Asparaginase ist im Periplasma lokalisiert, besitzt einen niedrigen Km-Wert und wird

durch das FNR- und CRP-Protein kontrolliert [Jennings & Beacham, 1993]. In dem im

Boden lebenden Gram-positiven Bakterium B. subtilis liegt das Gen für die

Asparaginase (ansA) in dem ans-Operon, das zusätzlich noch eine Aspartase (ansB) und

ein Repressorprotein (ansR) kodiert. Dieses Operon wird durch die Verfügbarkeit von

Ammoniumionen und Aspartat reguliert [Sun & Setlow, 1993].

In Bezug auf die Pflanzen-Mikroorganismen-Wechselwirkungen sind besonders die

Asparaginasen, die in einigen Pseudomonas Stämmen (Pseudomonas sp. 7A, P. stutzeri

MB-405), gefunden wurden, zu beachten. Die bekannteste unter ihnen, die PGA aus

Pseudomonas sp. 7A wurde nur als Protein isoliert und sequenziert [Roberts, 1976]. Sie

zeigt große Homologien zu anderen bakteriellen Asparaginasen.

In einigen Pflanzen, wie z.B. Arabidopsis thalina und Lupinus angustifolius wurden

gleichfalls Asparaginasen identifiziert und deren Gene kloniert [Vincze et al., 1994;

Dickson et al., 1992; Casado et al., 1995].

Da Asparagin in manchen Pflanzen, wie z. B. in der Lupinie, eine zentrale Funktion im

Metabolismus und interzellulären Transport von Stickstoff besitzt, wird vermutet, daß

die Asparaginase in Pflanzen ebenfalls für die Stickstoffassimilation und Asparagin-

Verwertung von Bedeutung ist [Casado et al., 1995]. So ist Asparagin z. B. in Lupinus

angustifolius die Hauptkomponente, die von den Knöllchen an die Wurzel abgegeben

wird. Außerdem werden 50-70 % des Stickstoffs, die die Pflanze ihren Samen zur

Einleitung

13

Verfügung stellt in Form von Asparagin abgegeben. Die Asparaginasen der Pflanzen

bzw. Pflanzensamen können das Asparagin zu Aspartat und NH4+ abbauen und sind so

in der Lage Stickstoff für die Synthese von Aminosäuren und Proteinen zu erhalten. Im

Hinblick auf die Wechselwirkungen der Pflanzen mit Mikroorganismen könnte die

Abgabe von Asparagin an die Samen und somit an die Rhizosphäre in sofern von

Bedeutung sein, daß Bakterien mit hoher Asparaginase-Aktivität einen Selektionsvorteil

bei der Besiedelung der Wurzel hätten.

1.9 Transport Stickstoff-haltiger Verbindungen in Bakterien

Um die verschiedenen Stickstoffquellen effektiv verwerten zu können, müssen die

Stickstoffverbindungen zunächst in die Zelle transportiert werden. Für NH3 wird

angenommen, daß es schnell durch die Cytoplasmamembran diffundieren kann.

Aufgrund des Auftretens sehr großer NH4+-Gradienten über bakterielle Membranen,

wurde zusätzlich ein aktives NH4+-Transportsystem vermutet. Bis jetzt konnte jedoch

erst ein Gen für den aktiven Ammonium-Transport aus E. coli kloniert werden [Barnes

et al., 1993]. Die Aktivität dieses Sytems (amtA) wird einerseits durch die vorhandenen

NH4+-Konzentrationen kontrolliert. Andererseits wird eine Kontrolle durch das ntr-

System vermutet.

Über den Transport anderer N-haltiger Verbindungen ist noch nicht sehr viel bekannt.

Bis jetzt wurden erst einige Gene für Aminosäure-Transporter identifiziert. Ein Beispiel

hierfür ist das Transport-Protein für L-Asparagin in S. enterica [Jennings et al., 1995]

sowie der Glutamat-Aspartat-Carrier von E. coli [Tolner et al., 1992]. Wie

Untersuchungen an R. capsulatus zeigen, kann ein Transporter verschiedene

Aminosäuren transportieren. Weiterhin gibt es Indizien für mehr als ein

Transportsystem für eine Aminosäure in Bakterien. So gibt es in R. capsulatus außer

einem Transportsystem für Asparagin, Aspartat, Glutamin und Glutamat, mindestens

einen weiteren Transporter für die genannten Aminosäuren, der jedoch eine geringere

Affinität besitzt [Zheng & Haselkorn, 1996].

Einleitung

14

1.10 Aminosäuren als Kohlenstoffquelle

In der Zelle dienen außer NH3 bzw. NH4+ die Aminosäuren als Stickstoff-Donatoren für

die Synthese stickstoffhaltiger Verbindungen. Dabei fungieren Glutamat und Glutamin

primär, sowie Aspartat und Carbamoylphosphat sekundär als Stickstoff-Überträger.

[Merrick & Edwards 1995; Fuchs, 1999]. Neben ihrer Funktion als Stickstoffquelle sind

die Aminosäuren nach den Kohlenhydraten die zweitwichtigste Kohlenstoffquelle in

Prokaryoten. Sie werden für die Synthese von Proteinen und anderen Biomolekülen

verwendet. Da überschüssige Aminosäuren im Gegensatz zu den Fetten und

Kohlenhydraten nicht gespeichert werden können, werden sie als Brennstoffe genutzt.

Dazu wird zunächst die α-Aminogruppe entfernt und das übrigbleibenden

Kohlenstoffgerüst in ein gängiges Stoffwechselprodukt überführt. Aus den

Kohlenstoffgerüsten aller 20 Aminosäuren entstehen nur sieben verschiedenen

Moleküle: Pyruvat (aus Ala, Gly, Cys, Ser, Thr, Trp), Acetyl-CoA (Trp, Ile, Leu),

Acetoacetyl-CoA (Leu, Lys, Phe, Tyr, Trp), α-Ketoglutarat (Glu, Gln, His, Pro, Arg),

Succinyl-CoA (Ile, Met, Val), Fumarat (Tyr, Phe, Asp) und Oxalacetat (Asn, Asp).

Diese sieben Moleküle sind wichtige Intermediate im Stoffwechsel (z. B. im

Citratzyklus, Glykolyse und Gluconeogenese, Fettsäureabbau, der Bildung von

Ketonkörpern, und in Bakterien und Pflanzen außerdem im Glyoxylatzyklus). In dem

komplizierten Netzwerk des Aminosäureabbaus besitzt das Glutamat eine zentrale

Aufgabe. Glutamat selbst wird zu α-Ketoglutarat desaminiert. Die Amidgruppe von

Glutamin (oder Asparagin) wird durch eine Glutaminase (oder Asparaginase)

hydrolysiert. Es entsteht NH4+ und Glutamat bzw. Aspartat. Auch die Aminosäuren

Prolin, Arginin und Histidin werden zunächst in Glutamat überführt.

Die Aminosäuren werden also einerseits zum Aufbau verschiedener Kohlenstoffgerüste

verwendet, andererseits werden sie auch zur Energiegewinnung abgebaut.

Die Aminosäureverwertung ist also, nicht nur in Prokaryoten, von Bedeutung als

Stickstoff-, sondern auch als Kohlenstoffquelle.

1.11 Aufgabenstellung

Zur Untersuchung der Aminosäureverwertung in Pseudomonas sollten stellvertretend in

dem Stamm P. fluorescens Enzyme identifiziert, kloniert und charakterisiert werden, die

Einleitung

15

an der Verstoffwechselung der in der Rhizosphäre von Pflanzen häufig auftretenden

Aminosäuren Glutamat, Glutamin, Asparagin und Aspartat beteiligt sind. Zu diesen

Enzymen gehören die Amidohydrolasen, unter denen die Glutaminasen / Asparaginasen

die bekanntesten Vertreter sind. Aufgrund der vorliegenden Sequenzinformationen, von

bereits klonierten Glutaminasen-Asparaginasen sollte eine spezifische Asparaginase-

Sonde hergestellt werden, mit der aus einer P. fluorescens-Genbank ein Asparaginase-

Glutaminase-Gen kloniert werden konnte.

Anschließend sollte mit Hilfe der Transposon-Mutagenese nach weiteren Enzymen in

P. fluorescens gesucht werden, die an der Verwertung der oben genannten Aminosäuren

beteiligt sind.

Material

16

2 Material

2.1 Geräte

Tab. 2.1: In dieser Arbeit verwendete Geräte

Gerät Modell Hersteller/Lieferant

Agarosegel-Elektrophoresekammer

Gelkammer Modell B2 AGS GmbH, Heidelberg

Autoklav DampfsterilisatorVST 40/60S

Zirbus Apparate- undMaschinenbau GmbH;Osterode

Brutschrank Heraeus; HanauDigitalkamera D 120 Zoom Digital Camera KodakElektrophoreseDokumentation

Kodak Digital ScienceEDAS 120 System

Kodak

Heizblöcke Thermostat 5320 Eppendorf, HamburgTechne DB2A Techne

Hybridisierungsflaschen Hybridisation bottles Amersham, BraunschweigHybridisierungsofen Hybridisierungsofen, Midi

Dual 14MWG Biotech; München

Inkubationsschüttler G 25 New Brunswick ScientificNürtingen

Inkubationsschüttler Novotron AK 82 Infors HT AG;CH-4103 Bottmingen

Mikrotiterplatten-Lesegerät

Reader 3550 UV mit Steue-rungssoftware KineticCollector

Biorad, München

Peristaltische Pumpe Typ P-1 Pharmacia, FreiburgPhotodrucker Kodak SP 700

Color PrinterKodak

Photometer U-2000 Spektralphoto-meter

Hitachi, Tokyo

Power-Supply Consort E 452 AGS GmbH, HeidelbergSequenzgel-Elektrophoresekammer

Modell S2 Life Technologies,Eggenstein

Sterilbank D624 RF Schirp ReinraumtechnikSterilisierschrank Trockensterilisator UT12 Heraeus InstrumentsThermocycler Cetus Perkin Elmer, LangenTischzentrifuge EBA 12 Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Centrifuge 5415C Eppendorf; HamburgVideo-Scanner Mitsubishi Video Copy

Prozessor mit ThermoprinterMitsubishi

Zentrifugen Suprafuge 22 Heraeus SepatechJ2-21 BeckmannMinifuge RF Heraeus, Hanau

Ultrazentrifuge Sorvall Combi Plus Sorvall, Dupont

Material

17

2.2 Chemikalien

Soweit nicht anders angegeben wurden alle Chemikalien von den Firmen Sigma

(Deisenhofen), Fluka (Deisenhofen), Merck (Darmstadt), Applichem (Darmstadt), Carl

Roth GmbH (Karlsruhe), peqlab Biotechnologie GmbH (Erlangen), Amersham

(Braunschweig) und Life Technologies (Eggenstein) bezogen.

2.3 Enzyme

Tab. 2.2: In dieser Arbeit verwendete Enzyme

Enzym Bezeichnung Hersteller

Alkalische Phosphatase calf intestine alkalinephosphatase (CIP)

Boehringer Mannheim

DNA-Polymerasencloned Pfu-Polymerase Stratagene, HeidelbergLong PCR System peqlab Biotechnologie

GmbH, ErlangenPwo-Polymerase peqlab Biotechnologie

GmbH, ErlangenTaq-Polymerase peqlab Biotechnologie

GmbH; ErlangenRestriktionsenzyme Boehringer Mannheim

(=Roche Diagnostics),Mannheim

Reverse Transcriptase SuperScriptTM II Life Technologies,Eggenstein

RNaseA Qiagen; HildenterminaleDeoxynukleotidyl-Transferase

Life Technologies,Eggenstein

T4-DNA Ligase T4-DNA-Ligase Roche, MannheimT3-RNA-Polymerase Roche, MannheimT7-RNA-Polymerase Roche, MannheimDiaphorase Sigma, DeisenhofenGlutamat-Dehydrogenase Sigma, Deisenhofen

Material

18

2.4 DNA-, RNA- und Protein-Marker

Tab. 2.3: In dieser Arbeit verwendete Größenstandards

Bezeichnung Hersteller

λHind III peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

λBstE II peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

λEco RI / Hind III peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

1 kb DNA-Leiter peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

100 bp Leiter peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

100 bp Leiter Plus peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

RNA-Sizer peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

RNA-Längenstandard I; DIG-markiert Boehringer Mannheim, Mannheim

Dalton-Marker VII-L Sigma, Deisenhofen

2.5 Kits

Tab. 2.4: In dieser Arbeit verwendete Kits

Kit Hersteller

5´RACE System for rapid amplificationof cDNA ends) Version 2.0

Life Technologies, Eggenstein

DIG Northern Starter Kit Boehringer Mannheim, MannheimDIG DNA Labeling and Detection Kit Boehringer Mannheim, MannheimDNeasy Tissue Kit Qiagen, HildenQIAamp Tissue kit Qiagen, HildenQiagen genomic-tip 500/G Qiagen, HildenQIAprep Spin Plasmid Kit Qiagen, HildenQIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, HildenQIAquick PCR Purification Kit Qiagen, HildenHigh Pure RNA Isolation Kit Boehringer Mannheim, MannheimTALONspin Columns Clontech Laboraties, HeidelbergT7-Sequenase Version 2.0 DNASequencing Kit

USB / Amersham, Braunschweig

ZAP Express predigested Vector Kit Stratagene, HeidelbergZAP predigested Gigapack cloning Kit Stratagene, Heidelberg

Material

19

2.6 Zusätzliche spezielle Materialien

Tab. 2.5: In dieser Arbeit verwendete spezielle Materialien

Bezeichnung Hersteller

Polypropylen mesh for hybridisation bottles Amersham, Braunschweig

96-Well-plates, steril GreinerGmbH; Frickenhausen

96-Well-plates; unsteril GreinerGmbH; Frickenhausen

MF-Membranfilter (Cellulose-Mischester);

0,025 µm Porengröße

Millipore; Eschborn

Cellulose-Acetat-Filter; 0,2 µm Porengröße Sartorius; Göttingen

2.7 Medien

Die verwendeten Medien bzw. ihre Bestandteile wurden im Autoklaven sterilisiert

(30 min, 121 °C, 1,3 bar). Lösungen und Medienzusätze, die nicht autoklaviert werden

konnten, wurden durch einen Filter mit 0,2 µm Porengröße (Sartorius, Göttingen)

sterilfiltriert. Zur Herstellung fester Nährmedien wurden die jeweiligen Medien mit

1,5 % Agar versetzt.

LB-Medium

Luria Bertani Medium [Sambrook et al., 1989]

NaCl 10 g/lTrypton 10 g/lHefeextrakt 5 g/l

pH 7,0

M1-Medium

Anzuchtmedium für Pseudomonas [DSM; 1993]

Pepton 5 g/lFleischextrakt 3 g/l

pH 7,0

Material

20

MG-Medium(Mannitol-Glutamat-Medium (Keane et al., 1970))

Mannitol 10 g/lL-Glutaminsäure 2 g/lKH2PO4 0,5 g/lNaCl 0,2 g/lMgSO4 x 7 H2O 0,2 g/l

M9-Minimalmedium

[Sambrook et al., 1989]

5x M9- - Lösung

Na2HPO4, wasserfrei 36,06 g/lKH2PO4 15 g/lNaCl 2,5 g/l

pH 7,4

5xM9+ - Lösung

Na2HPO4, wasserfrei 36,06 g/lKH2PO4 15 g/lNaCl 2,5 g/lNH4Cl 5 g/l

pH 7,4

weitere Lösungen für M9-Medium

MgSO4-Lösung 1 M autoklaviertCaCl2-Lösung 1 M autoklaviert20 % Glucose sterilfiltriert

M9+-Medium

= M9-Minimalmedium mit 22,2 mM Glucose und 18,6 mM NH4ClM9+ - Lösung 1 VolumenteildH2O 4 Volumenteileautoklavieren+ 20 % Glucose 8 ml+ 1 M MgSO4 0,8 ml+ 1 M CaCl2 10 µl

Material

21

M9- - Medium

= M9-Minimalmedium ohne Glucose (22.2 mM) und ohne Ammoniumchlorid(18,6 mM)Die Aminosäure, die statt dessen als einzige C- und N-Quelle eingesetzt wurde, istjeweils angegeben

M9- - Lösung 1 VolumenteildH2O 4 Volumenteileautoklavieren+ 1 M MgSO4 0,8 ml+ 1 M CaCl2 40 µl

NZY-Medium

NaCl 5 g/lMgSO4 x 7H2O 2 g/lHefeextrakt 5 g/lNZ Amin (Casein Hydrolysat) 10 g/l

pH 7,5 (mit NaOH)

NZY Top Agar

NZY-MediumAgarose 0,7 % (w/v)

2.8 Antibiotika

Tab. 2.6: In dieser Arbeit verwendete Antibiotika

Antibiotika Stammlösung Endkonzentration

Ampicillin 50 mg/ml 50 µg/ml und 100 µg/ml

Carbenicillin 50 mg/ml in dH2O 300 µg/ml

Chloramphenicol 34 mg/ml in Ethanol 100 µg/ml

Kanamycin 10 mg/ml 25 µg/ml und 50 µg/ml

Tetracyclin 5 mg/ml in Ethanol 12,5 µg/ml und 50 µg/ml

Material

22

2.9 Weitere Medienzusätze

Tab. 2.7: Weitere Medienzusätze, die in dieser Arbeit verwendet wurden

Substanz Stammlösung Endkonzentration imMedium

Ammoniumchlorid 3 M 18 mMCalciumchlorid 1 M

Glucose 20 %, sterilfiltriert 1 mM und 22,2 mMγ-Glutamylhydrazid 0,2 M 2 mM

IPTG 0,1 M in dH2O 0,2 mMMagnesiumsulfat 1 M

X-Gal 20 mg/ml in DMF 40 µg/ml

Aminosäuren* Stammlösung Endkonzentration imMedium

Aspartat 0,1 M 10 mMAsparagin 0,1 M 5 mM und 10 mM

Glutamat 1,2 M 0,8 mM und 5 mMGlutamin 0,1 M 10 mM

* alle sterilfiltriert

2.10 Mikroorganismen

Tab. 2.8: In dieser Arbeit verwendete Mikroorganismen

Mikroorganismen Beschreibung Quelle

E. coliE. coli XL1Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17

supE44 relA1lac[F´proAB lacIqZ∆M15 Tn10(Tetr)]

StratageneBullock et al., 1987

E. coli XL1Blue MRF´ ∆(mrcA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1gyrA96 relA1lac[F proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]

StratageneShort et al., 1992

E. coli XLOLR ∆(mrcA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 thi-1 recA1 gyrA96relA1lac[F proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]Su- (nonsuppressing) λr (lambdaresistent)

Stratagene

E. coli CU1783(BL21Ω) Durch Insertion des Ω-Fragmentes vonpMJ13 in das ansB-Gen führte zumVerlust der Asparaginase II Aktivität

Harms et al., 1991

E. coli S17-1 pOT182 Merriman T.R. &Lamont I.L., 1993

E. coli S17-1 Simon et al., 1983

Material

23

Mikroorganismen Beschreibung QuellePseudomonas

P. fluorescens Wildtyp; ATCC 13525 DSMP. putida Wildtyp; ATCC 12633 DSMP. putida KT2440 mt-2 hsdR1 (r - m+) Bagdasarian et al.,

1982P. putida KT2440 rpoN- rpoN-Mutante Köhler et al.. 1989P. fluorescens W24 Biokontrollstamm Schulz et al., 1998P. fluorescens W34 Schulz et al., 1998P. fluorescens Pf-5 Biokontrollstamm Corbell N. et al.,

1995P. fluorescens (GSPB230)

GSPB

P. putida II232 Biokontrollstamm Schulz et al., 1998P. chlororaphis Biokontrollstamm Schulz et al., 1998

P. syringae syringaeFF5

G.W. Sundin

P. syringae pv glycinea(XV16) WT

DSM

P. syringae pv glycineaPG 4180 N9

COR+; CMA+; CFA+; ncr+; Kmr Ullrich et al., 1994

P. syringae pv tomato(DC 3000)

Romantschuk

2.11 Plasmide

Tab. 2.9: In dieser Arbeit verwendete Plasmide

Plasmid Beschreibung Quelle

pBluescript SK(+) Phagemid Klonierungsvektor;Stratagene

StratageneAlting-Mees et al., 1989

pASK-C Derivat von pASK-75 Bader; 1996pBK-CMV Phagemid Klonierungsvektor;

StratageneStratagene

Alting-Mees et al., 1992λZAP Express Klonierungsvektor Stratagene

Alting-Mees et al., 1992 &Short et al., 1988

Tn5-OT182 Derivat von pSUP102(Gm)::Tn5-B21

(Simon et al. 1989)

Merriman & Lamont , 1993

pOT182 Vektorplasmid, trägt Tn5-OT182„self cloning promotor probe

vector“

Merriman & Lamont , 1993

Material

24

2.12 Oligonukleotide

Tab. 2.10: In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide

Alle synthetische Oligonukleotide wurden von der Firma Eurogentec (Belgien)

hergestellt.

Bezeichnung Strang* Nukleotidsequenz** Schnittstelle

AsnFor s 5´- TGTTCGAATTCACNGGNGGNACNATNG -3´ EcoRI

AsnBack as 5´- TGTCCGGATCCAYNGTRTCNGTNCCRTG -3´ BamHI

PR 1 s 5´- GACCTATCAAGCGGCGAAAGTCGG -3´ ---

PR 2 as 5´- TGTGTCGGTACCGTGGGTGATCAC -3´ KpnI

PSGA 1 s 5´-CGGGTGTTCTAGATGAACCTG -3´ XbaI

PSGA 2 as 5´- CGGTGAATTCAGACAGCGGG -3´ EcoRI

ADA 1 5´- CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCG

GCCGCCCGGGCAGGT -3´ ---

ADA 2 5´-ACCTGCCC-NH2- 3´ ---

ADP 5´- CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC -3´ ---

GSP 2 as 5´- TACTCGGCGACCCAACTGCAGAAGGT -3´ PstI

GSP 3 as 5´- GCTCTAGAATCACCACGTTGGCCAG -3´ XbaI

GSP 4 as 5´- TGGAATATTCATGCAGGCGTG -3 SspI

* as = antisense; s = sense** N = ACGT; R = AG; Y = CTRestriktionsschnittstellen sind grau unterlegt

Methoden

25

3 Methoden

3.6 Isolierung von genomischer DNA aus Pseudomonas

Zur Isolierung von genomischer DNA aus Pseudomonas wurde eine modifizierte

Methode nach Birnboim & Doly [Birnboim & Doly, 1979] angewandt. Sie beruht auf

alkalischer Lyse der Zellen, sowie auf der Reinigung der DNA durch Adsorption an

Anionentauschersäulen. Abhängig davon, wieviel DNA benötigt wurde, wurden 2

verschiedene Systeme verwendet.

Für größere Mengen wurden Qiagentip/G-Anionentauschersäulen (Qiagen) verwendet.

20 ml Übernachtkultur (1,3 x 1010 Zellen) wurden abzentrifugiert und in 11 ml Puffer

B1, der 200 µg/ml RNase A enthielt, resuspendiert. Nach Zugabe von 300 µl Lysozym

(100 mg/ml) und 500 µl Proteinase-K (20 mg/ml) wurde mindestens 30 min bei 37 °C

inkubiert, solange, bis die Lösung homogen war. Durch diese Inkubation wurden die

Zellen durch Lysozym und durch die Detergentien, die im Puffer B1 enthalten sind,

vollständig lysiert. Nach Zugabe von 4 ml Puffer B2 und vorsichtigem Invertieren des

Reaktionsgefäßes, wurde das Lysat ca. 30 - 60 min bei 50 °C inkubiert, bis es

vollständig klar war. Durch die Inkubation in Puffer B2 wird die DNA vollständig von

Proteinen befreit. Nachdem die Genomic tip500/G-Säule mit 10 ml QBT-Puffer

equilibriert worden war, wurde das Lysat aufgetragen. Falls das Lysat zu viskös war,

wurde es mit bis zu 10 Volumen QBT-Puffer versetzt und auf maximaler Stufe kurz

gevortext, bevor es auf die Anionentauscher-Säule aufgetragen wurde. Der Durchlauf

wurde verworfen und die Säule zweimal mit 15 ml QC-Puffer gewaschen. Die

genomische DNA wurde mit 15 ml QF eluiert und durch Zugabe von 0,7 Volumen

100 % Isopropanol gefällt. Nachdem die DNA durch Zentrifugation bei 10000 rpm in

einer Tischzentrifuge pelletiert worden ist, wurde sie zweimal mit 70 % Ethanol

gewaschen und nach Trocknen in TE-Puffer oder Wasser aufgenommen und bei 55 °C

2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur gelöst.

Puffer B1 50 mM EDTA50 mM Tris/HCl0,5 % Tween-200,5 % Triton X-100

pH 8,0

Methoden

26

Puffer B2 3 M GuHCl20 % Tween-20

pH 5,5

Puffer QBT 750 mM NaCl50 mM MOPS15 % Ethanol0,15 % Triton X-100

pH 7,0

Puffer QC 1,0 M NaCl50 mM MOPS15 % Ethanol

pH 7,0

Puffer QF 1,25 M NaCl50 mM Tris/HCl15 % Ethanol

pH 8,5

TE-Puffer 10 mM Tris/HCl1 mM EDTA

pH 8,0

Für kleinere DNA-Mengen wurden kleine zentrifugierbare Anionentauschersäulen

(QIAamp Tissue Kit; DNeasy Kit) der Firma Qiagen verwendet. Dazu wurde 1,5 ml

Pseudomonas Übernachtkultur 5 min bei 5000 rpm abzentrifugiert und das Zellpellet in

180 µl ATL-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 20 µl Proteinase-K-Lösung

(20 mg/ml), wurde die Suspension solange bei 55 °C inkubiert, bis die Zellen

vollständig lysiert waren. Danach wurden 20 µl RNaseA-Lösung (20 mg/ml) zugegeben,

gemischt und 2 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Puffer AL und erneutem

Mischen wurde 10 min bei 70 °C inkubiert. Anschließend wurden 200 µl 100 % Ethanol

zugegeben, gemischt, die Lösung auf eine Spin - Säule aufgetragen und 1 min bei

8000 rpm zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule in ein neues

Auffanggefäß gestellt. Die Säule wurde zweimal mit 500 µl AW-Puffer gewaschen.

Zum Eluieren der DNA wurden zweimal jeweils 200 µl vorgewärmter Puffer AE

(70 °C) auf die Säule aufgetragen, 1 min inkubiert und zentrifugiert.

Methoden

27

3.7 Präparation von Plasmid-DNA

Zur Präparation von Plasmid-DNA wurden Qiagen-Mini-Spin-Säulen verwendet

(QIAprep Spin Plasmid Kit) verwendet. Die Prozedur basiert ebenfalls auf einer

modifizierten Methode nach Birnboim & Doly [Birnboim & Doly, 1979] und auf der

Adsorption von DNA an Silicagel unter „Hochsalz“-Bedingungen [Vogelstein &

Gillespie, 1979].

1,5 ml Bakterien-Übernachtkultur wurden abzentrifugiert und das Pellet in 250 µl Puffer

P1, der 0,7 mg/ml RNaseA enthielt, resuspendiert. Zur Lyse der Zellen wurden 250 µl

Puffer P2 zugegeben und vorsichtig gemischt, bis die Lösung klar und viskos war. Die

Proteine wurden durch Zugabe von 350 µl Puffer N3 und sofortigen Invertieren

ausgefällt und 10 min bei 13000 rpm in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert. Durch die

hohe Salzkonzentration werden nicht nur die Proteine, sondern auch die chromosomale

DNA und Zellbruchstücke denaturiert und durch SDS ausgefällt. Die kleinere Plasmid-

DNA renaturiert dagegen und verbleibt im Überstand. Der Überstand wurde auf eine

Qiagen-Spin-Säule gegeben und 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Durchlauf

wurde verworfen und die Säule gewaschen. Dazu wurden erst 0,5 ml PB-Puffer

aufgetragen und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurden 0,75 ml PE-

Puffer aufgetragen und erneut bei 10000 rpm zentrifugiert. Um noch vorhandene

Ethanolreste des PE-Puffers zu entfernen, wurde 1 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Zur

Elution der Plasmide wurden 30 - 50 µl 10 mM Tris/HCl, pH 8,5 auf die Säulen

gegeben und 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert.

3.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mit der Polymerase-Kettenreaktion können DNA-Fragmente amplifiziert werden [Saiki

et al., 1988]. Dazu werden zwei synthetische Oligonukleotidprimer benötigt, die jeweils

komplementär zu dem 3´- und dem 5´-Ende des zu amplifizierenden DNA-Fragmentes

sind. Die Elongation dieser Primer wird durch die Taq-DNA-Polymerase katalysiert.

Die Taq-DNA-Polymerase ist eine hitzestabile DNA-Polymerase, die aus dem in heißen

Quellen lebendem Bakterium Thermus aquaticus gewonnen wird. Sie besitzt eine

optimale Amplifizierungstemperatur von 72 °C. Nach dem Ansetzen der PCR wurde die

Methoden

28

Template-DNA zunächst bei 94 °C hitzedenaturiert. Die anschließende Abkühlung des

Gemisches auf eine für die eingesetzten Oligonukleotide berechnete Hybridi-

sierungstemperatur, die zwischen 40 °C und 65 °C lag, ermöglicht den Oligonukleotiden

sich an die komplementären Sequenzen der DNA-Matrize anzulagern. Nach der

Anlagerung dienen die Oligonukleotide als Primer für die DNA-Polymerase, die die

Primer in 5→3´-Richtung verlängert. Die auf diese Weise neu entstehenden DNA-

Doppelstränge werden erneut bei 94 °C denaturiert, wieder mit den Primern hybridisiert

und die DNA-Polymerase-Reaktion wiederholt. Dieser Zyklus aus Denaturierung,

Hybridisierung und Kettenverlängerung kann mit einem programmgesteuerten

Thermocycler bis zu 50 mal wiederholt werden. Dabei verdoppelt sich theoretisch bei

jedem Zyklus die Menge des gewünschten DNA-Fragments [Mullis & Faloona, 1987].

Alle bei dieser Arbeit durchgeführten Polymerase-Kettenreaktionen wurden in einem

Thermocycler der Firma Perkin Elmer durchgeführt. Neben der Taq-DNA-Polymerase

(peqlab, Erlangen) wurde noch die „Long PCR System“-Polymerase (peqlab) und die

Pfu-Polymerase (Stratagene) eingesetzt. Die „Long PCR System“ Polymerase ist

besonders für die Amplifizierung langer DNA-Fragmente, sowie für eine hohe

Produktausbeute geeignet. Sie besitzt ein Temperaturoptimum von 68 °C. Die Pfu-

Polymerase, die aus dem hyperthermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus

gewonnen wird, ist thermostabiler als die Taq-Polymerase, und hat eine geringere

Fehlerrate. Außerdem besitzt sie eine korrekturlesende 3´→5´-Exonukleaseaktivität. Sie

wurde eingesetzt, wenn eine besonders hohe Genauigkeit oder glatte Enden bei den

Amplifikaten erforderlich waren.

Alle durchgeführten PCRs wurden als „Hot Start“-PCR durchgeführt. Das bedeutet, daß

der Reaktionsansatz ohne Polymerase in einen auf 94 °C vortemperierten Thermocycler

gestellt wurde, und die DNA-Polymerase erst während einer initialen Denaturierung von

zwei Minuten zugegeben wurde. Dadurch wurden unspezifische Hybridisierungs- und

Amplifizierungsereignisse verhindert. Nach dem letzten Zyklus wurden die PCR-

Ansätze noch 5-8 Minuten bei 72 °C (bzw. 68 °C) gehalten, um noch nicht vollständig

amplifizierte DNA-Fragmente fertigzustellen.

Methoden

29

Reaktionsansätze(100 µl)

Template-DNA 0,1 - 1 µg

Oligonukleotide 1 µM

10 x Puffer 10 µl

dNTPs 200 - 300 µM

MgCl2 1,25 mM

------------------------------------------------------------------------------

Taq-Polymerase 2,5 Units

Pfu-Polymerase 5 Units

„Long PCR System“-Polymerase 2,5 Units

3.9 DNA-Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen

Die Hydrolyse von ds-DNA-Fragmenten und Plasmid-DNA erfolgte durch Restriktions-

endonukleasen des Typs II. Diese Enzyme erkennen und hydrolysieren palindrome

Tetra-, Penta- oder Hexanukleotidsequenzen. Dabei entstehen an den 3´-Enden des

gespaltenen DNA-Doppelstranges Hydroxylgruppen, während die 5´-Enden Phosphat-

gruppen tragen. Je nachdem, welches Enzym verwendet worden ist, entstanden bei einer

Restriktion glatte („blunt“) oder versetzte („sticky“) Enden. Die Aktivität der

Restriktionsenzyme wird folgendermaßen definiert: Ein Unit eines Enzyms ist diejenige

Menge des Enzyms, die ausreicht, um 1 µg λ-DNA bei 37°C in 1 h vollständig zu

schneiden. Aufgrund dieser Definition konnte die benötigte Menge an Enzym anhand

der zu spaltenen DNA-Menge berechnet werden. Für eine hydrolytische Spaltung

wurden zwischen 50 ng (analytischer Restriktion) und 4 µg (präparative Restriktion)

DNA mit der entsprechenden Menge Enzym und 1/10 Volumen an 10x-Reaktionspuffer

versetzt und mit dH2O auf das Endvolumen aufgefüllt. Analytische Restriktionen

wurden mindestens 1 h, präparative Restriktionen mehrere Stunden oder über Nacht bei

37°C inkubiert. Wurden PCR-Fragmente geschnitten, so mußten die Restriktionsansätze

mindestens 20 h inkubiert werden, da die durch die PCR-Primer eingeführten

Restriktionsschnittstellen an den Enden der PCR-Fragmente lokalisiert waren. Weil es

für Restriktionsendonukleasen schwierig ist an die Enden von DNA-Fragmenten zu

Methoden

30

gelangen und dort zu schneiden, mußten die Ansätze länger inkubiert werden, um eine

möglichst vollständige Restriktion zu erreichen.

3.10 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatgruppen

Um zu verhindern, daß mit nur einer Restriktionsendonuklease gespaltene Vektor-DNA

wieder mit sich selbst ligierte, wurden die geschnittenen Vektoren mit alkalischer

Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) behandelt. Dieses Enzym katalysiert die Hydrolyse

endständiger 5´-Phosphatgruppen von linearen DNA-Molekülen. Da die T4-DNA-

Ligase nur DNA-Fragmente verbindet, die am 5´-Ende eine Phosphatgruppe tragen,

konnte durch die Dephosphorylierung der Vektoren die Ausbeute an rekombinanten

Plasmiden bei der Ligation verbessert werden. Die Dephosphorylierung wurde direkt im

Anschluß an eine Restriktion in dem Restriktionsansatz durchgeführt.

Für die Durchführung wurde zu einem Restriktionsansatz 0,1 Unit CIP gegeben und 1 h

bei 37°C inkubiert.

3.11 DNA-Ligation

Bei der Ligation werden zwei DNA-Fragmente zu einem durchgehenden Doppelstrang

verknüpft. Dabei katalysiert die T4-DNA-Ligase in Anwesenheit von ATP die

Ausbildung einer kovalenten Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten 3´-

Hydroxyl- und 5´-Phosphatgruppen.

Für eine Ligation wurden 50-200 ng Vektor-DNA mit der dreifachen Menge an DNA-

Fragment, 1/5 Volumen 5x-Ligase-Puffer, 1 µl 10 mM ATP und 1 µl T4-DNA-Ligase

(1 Unit/µl) versetzt. Abhängig davon, mit welchem Restriktionsenzym geschnitten

worden war, wurde bei 4 °C, 16 °C oder RT über Nacht inkubiert.

Methoden

31

3.12 Agarosegelelektrophorese

DNA-Fragmente können analytisch oder präparativ durch Agarosegelelektrophorese

aufgetrennt werden. Dabei wandern die negativ geladenen DNA-Moleküle von der

Kathode zur Anode. Um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen, enthalten die

Agarosegele Ethidiumbromid, das sich zwischen GC-Basenpaaren der DNA einlagert

und so einen Komplex bildet, der unter UV-Licht sichtbar ist.

Normalerweise wurden 0,8 - 1,2 %ige (w/v) Agarosegele verwendet. Zur Herstellung

dieser Gele wurde die Agarose mit 1x TB-Puffer aufgekocht und die Lösung mit einer

1 %igen (w/v) Ethidiumbromidlösung auf eine Endkonzentration von 0,5 µg/ml

gebracht. Nach Abkühlung auf unter 50 °C wurde die Gellösung in eine

Flachbettapparatur gegossen, in die zuvor ein Probenkamm befestigt worden war.

Nachdem das Gel erstarrt war, wurde es mit 1x TB-Puffer überschichtet und der

Probenkamm vorsichtig herausgezogen. Dadurch entstanden 4 mm breite Proben-

taschen, in die maximal 20 µl DNA-Lösung gefüllt werden konnten. Bevor die DNA-

Proben aufgetragen werden konnten, mußten sie noch im Verhältnis 5:1 mit 6x DNA-

Probenpuffer versetzt werden. Durch diesen Puffer wurde die Dichte der DNA-Lösung

erhöht, so daß diese leicht in die Taschen pipettiert werden konnte. Außerdem enthält

der 6x Puffer noch Farbmarker, durch die der Verlauf der Elektrophorese verfolgt

werden konnte. Die Farbmarker, Bromphenolblau und Xylencyanol, besitzen eine

elektrophoretische Beweglichkeit, die der von 300 bp- und 4000 bp DNA-Fragmenten

entspricht. [Sambrook et al., 1989]

Als Größenstandard diente mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnittene λ-

DNA oder DNA-Gemische, die Fragmente im Bereich zwischen 100 bp und 23 kb

enthielten. Die Gelelektrophorese wurde bei 3-5 V / cm durchgeführt. Nach Beendigung

der Elektrophorese konnten die DNA-Ethidiumbromid-Komplexe unter kurzwelligem

UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht werden, da die durch das UV-Licht angeregten

Komplexe im sichtbaren Licht bei 590 nm im Orangeroten fluoreszierten. Die Gele

wurden mit einer Videokamera mit Orangefilter, oder mit einer KODAK DC120

Kamera fotografiert. Für die Präparation von bestimmten DNA-Fragmenten wurden

präparative Gele hergestellt. Dazu wurden jeweils mehrere Zähne des Probenkammes

abgeklebt, so daß Probentaschen entstanden, in die bis zu 50 µl DNA-Lösung

aufgetragen werden konnten. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die DNA-

Methoden

32

Fragmente, um größere durch UV-Licht ausgelöste DNA-Schäden zu vermeiden, unter

langwelligem UV-Licht (365 nm) aus dem Gel herausgeschnitten und aus dem Gel

extrahiert. (siehe Präparation von DNA aus Agarosegelen)

10x TB-PufferTris-Base 900 mMBorsäure 900 mM

Ethidiumbromidlösung

Ethidiumbromid 1 % (w/v)

1x TB-Puffer

10x TB-Puffer 100 mldH2O 900 ml

6x DNA-Probenpuffer

Bromphenolblau 0,25 % (w/v)Xylen-Cyanol 0,25 % (w/v)Ficoll-400 15 % (w/v)

(oder von Firmen zu den Markern mitgelieferte Puffer)

3.13 Ethidiumbromid-Färbung von Agarosegelen

Zur nachträglichen Ethidiumbromid-Färbung von Agarosegelen wurden die Gele 30 -

45 min in 0,1 M Ammoniumacetat-Lösung, die 0,5 µg/ml Ethidiumbromid enthielt,

inkubiert.

3.14 Präparation von DNA aus Agarosegelen

Das gewünschte DNA-Fragment wurde unter UV-Licht von 365 nm möglichst knapp

aus dem Gel geschnitten, mit 3 Volumen QG-Puffer versetzt und bei 50 - 56 °C solange

inkubiert, bis sich das Gel vollständig gelöst hatte. Dabei wurde alle 2 - 3 min gemischt.

Nachdem das Gel vollständig gelöst war, mußte die Farbe der Lösung gelb sein, da der

Puffer QG einen Farbindikator enthielt. Bei pH-Werten, die über 7,5 liegen, färbt der

Methoden

33

Indikator die Lösung orange bis violett. In dem Fall mußte die Lösung mit 10 µl 3 M

Natriumacetat auf ein pH von 7,5 oder kleiner eingestellt werden. Nach Zugabe von

einem Gelvolumen Isopropanol wurde die Lösung auf eine Spin-Säule (Qiagen)

aufgetragen und 1 min in einer Microzentrifuge bei 10000 rpm zentrifugiert. Die Säule

wurde mit QG- und PE-Puffer gewaschen. Dazu wurden zunächst 0,5 ml QG-Puffer

aufgetragen und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. danach wurden 0,75 ml PE-Puffer

aufgetragen und erneut bei 10000 rpm zentrifugiert. Zur Entfernung noch vorhandener

Ethanol-Reste wurde anschließend noch einmal 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert.

Danach wurde die Säule in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gestellt und die DNA mit

30-50 µl 10 mM Tris/HCl, pH 8,5, oder sterilem dH2O eluiert.

3.15 Herstellung kompeteneter E. coli-Zellen

Kompetente Bakterienzellen besitzen die Fähigkeit, Fremd-DNA effizient

aufzunehmen. Dazu werden die Zellen mit hochkonzentrierten Salzlösungen behandelt,

so daß die Plasmamembran der Zellen unter bestimmten Bedingungen für die DNA-

Aufnahme durchlässig wird. Es gibt verschiedene Möglichkeiten E. coli-Zellen

kompetent zu machen. Bei der einen Methode wird CaCl2 bei der anderen RbCl

verwendet. RbCl-kompetente Zellen haben den Vorteil, daß sie in relativ kurzer Zeit

hergestellt werden und dann bei - 80 °C gelagert werden können. Auf diese Weise

können größere Mengen kompetenter Zellen hergestellt werden, die dann je nach Bedarf

verwendet werden können. Außerdem zeigen mit RbCl behandelte Zellen oft eine

bessere Aufnahmefähigkeit von DNA).

3.15.1 Herstellung RbCl-kompetenter E. coli-Zellen

200 ml LB-Medium wurden im Verhältnis 1:100 mit einer E. coli-Übernachtkultur

angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5 wachsen gelassen. Anschließend wurden die

Zellen 5 min bei 4000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Nachdem der Überstand vorsichtig

abgenommen worden war, wurden die Zellen vorsichtig in 4 °C kaltem TFB 1-Puffer

resuspendiert (30 ml TFB 1 / 100 ml Kultur) und 90 min auf Eis inkubiert. Danach

wurden die Zellen erneut 5 min bei 4000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand

Methoden

34

wurde vorsichtig abgenommen und die Zellen vorsichtig in eiskaltem TFB 2-Puffer

resuspendiert (4 ml / 100 ml Kultur). Die Zellen wurden in 400 µl Aliquots aufgeteilt,

für einige Minuten in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bis zur Verwendung bei

- 80 °C gelagert.

TFB 1-Puffer(sterilfiltriert)

Rubidiumchlorid 100 mMManganchlorid 50 mMKaliumacetat 30 mMCalciumchlorid 10 mMGlycerin 15 %

pH 5,8

TFB 2-Puffer(autoklaviert)

MOPS 10 mMRubidiumchlorid 10 mMCalciumchlorid 75 mMGlycerin 15 %

pH 8,0

3.16 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli-Zellen

Bei der Transformation werden Plasmide in kompetente Zellen übertragen. Plasmide

werden auch als Autosomen bezeichnet, da sie sich in einer geeigneten Wirtszelle

autonom replizieren können. Bei der Transformation wird die zu den kompetenten

Bakterienzellen gegebene DNA als Doppelstrang an die Zellmembran gebunden.

Nachdem einer der beiden Stränge durch membrangebundene Nukleasen abgebaut

worden ist, wird die DNA während eines Hitzeschocks als Einzelstrang von der Zelle

aufgenommen.

200 µl RbCl-kompetente E. coli-Zellen wurden zu einem Ligationsansatz gegeben und

mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Während eines nachfolgenden zweiminütigen

Hitzeschocks bei 42 °C fand die eigentliche DNA-Aufnahme statt. Danach wurden die

Zellen mit 0,5 ml LB-Medium versetzt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Danach wurden

die Zellen kurz abzentrifugiert, in höchstens 100 µl des Überstandes wieder

Methoden

35

resuspendiert und auf LB-Agarplatten, die entsprechende Zusätze (Antibiotika, IPTG,

X-Gal, etc.) enthielten, ausplattiert. Nur die Zellen, die Plasmid-DNA aufgenommen

hatten, trugen die Resistenz gegen die in den Agarplatten enthaltenen Antibiotika und

wuchsen über Nacht im Brutschrank bei 37 °C zu einer Einzelkolonie heran.

3.17 DNA-Sequenzierung

Die Bestimmung von DNA-Sequenzen erfolgte nach der Kettenabbruchmethode von

Sanger [Sanger et al., 1977]. Bei dieser Methode wird ein Oligonukleotid, das

komplementär zu einem bestimmten Bereich einer gegebenen einzelsträngigen DNA ist,

an diese angelagert und dient dort als Primer. Ausgehend von diesem Primer

synthetisiert die DNA-Polymerase in vier verschiedenen Reaktionsansätzen, in

Gegenwart von radioaktiv markierten [α35S] dATP und einem Gemisch aus den drei

anderen Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs), den zu der vorgegebenen DNA-

Matrize komplementären DNA-Strang. Durch Zugabe von Didesoxyribonukleo-

sidtriphosphaten (ddNTPs) wird die DNA-Synthese abgebrochen, sobald ein ddNTP

eingebaut wird, da der DNA-Polymerase die 3´-Hydroxylgruppe für die Ausbildung der

nächsten Phosphodiesterbindung fehlt. Wird jeweils ein Didesoxyanalogon einer Base,

in geringerer Konzentration als die dNTPs, zu einem Ansatz gegeben, erhält man durch

statistisch verteilte Kettenabrüche unterschiedlich lange DNA-Fragmente. Jeder der vier

Ansätze wird dann auf einem denaturierenden, hochauflösenden Harnstoff-

Polyacrylamidgel aufgetrennt. Durch Autoradiographie können die DNA-Fragmente

sichtbar gemacht und so die Sequenz der vorgegebenen DNA bestimmt werden.

3.17.1 Denaturierung

Zur Denaturierung wurden 8 µl Plasmidlösung (ca. 1,5 µg) mit 2 µl 2 M Natronlauge

versetzt und 10 min bei RT inkubiert. Zur Neutralisation wurde die denaturierte DNA

mit 3 µl 3 M Natriumacetat versetzt. Nach Zugabe von 7 µl dH2O wurde die DNA mit

60 µl 100 %igem kaltem Ethanol versetzt und in flüssigem Stickstoff gefällt. Nachdem

die DNA durch eine 15 minütige Zentrifugation bei 4 °C abgetrennt worden war, wurde

Methoden

36

das DNA-Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 7 µl dH2O

aufgenommen.

3.17.2 Hybridisierung des Primers

7 µl denaturierte DNA wurden mit 2 µl 5x Sequenase-Puffer und 1 µl des Primers

versetzt und 2 min bei 65 °C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde das

Reaktionsgemisch in dem Wasserbad langsam, über einen Zeitraum von mindestens

30 min, auf unter 30 °C abgekühlt. Danach wurde das Gemisch bis zur Verwendung auf

Eis gestellt oder bei - 20 °C gelagert.

5x Sequenase-Puffer

Tris/HCl, pH 7,5 200 mMMagnesiumchlorid 100 mMNatriumchlorid 250 mM

3.17.3 Kettenverlängerung

Zu 10 µl Hybridisierungsgemisch wurden 1 µl 0,1 M DDT, 2 µl des 1x Labeling-Mix,

0,5 µl [α 35S] dATP und 2 µl verdünnte DNA-Polymerase pipettiert und 2-5 min bei RT

inkubiert.

5x Labeling-Mix

dCTP, dGTP, dTTP je 7,5µM

Enzymverdünnungspuffer

Tris / HCl, pH 7,5 10 mMDTT 5 mMBSA 0,5 mg/ml

Phosphatase

Tris/HCl, pH 7,5 10 mMPyrophosphatase 5 U/mlEDTA 0,1 mMGlycerin 50 %

Methoden

37

Sequenase Version 2.0

Kaliumphosphat, pH 7,4 20 mMSequenase (DNA-Polymerase) 13 u/µlDTT 1 mMEDTA 0,1 mMGlycerin 50 %

verdünnte DNA-Polymerase-Lösung

Enzymverdünnungspuffer 1,625µlPyrophosphatase 0,125µlSequenase Version 2.0. 0,25µl

3.17.4 Kettenabbruchreaktion

In vier Eppendorf-Reaktionsgefäße wurde jeweils 2,5 µl eines Didesoxynukleotid-

Terminationsgemisches gegeben und bei 37°C vorinkubiert. Jeweils 3,5 µl des

Kettenverlängerungsansatzes wurde zu dem Terminationsgemisch pipettiert und 5 min

bei 37 °C inkubiert. Die Kettenabbruchreaktion wurde durch Zugabe von 4 µl

Stoplösung zu jedem der 4 Ansätze gestoppt. Zur Lagerung konnten die Proben bis zu

drei Monaten bei - 20°C eingefroren werden. Bevor die Proben auf einem Sequenzgel

aufgetragen wurden, mußten sie noch 2 min bei 75 °C denaturiert werden.

ddA-Terminations-Mix

Natriumchlorid 50 mMddATP 8 mMdATP, dCTP, dGTP, dTTP je 80 mM

ddC-Terminations-Mix

Natriumchlorid 50 mMddCTP 8 mMdATP, dCTP, dGTP, dTTP je 80 mM

ddG-Terminations-Mix

Natriumchlorid 50 mMddGTP 8 mMdATP, dCTP, dGTP, dTTP je 80 mM

Methoden

38

ddT-Terminations-Mix

Natriumchlorid 50 mMddTTP 8 mMdATP, dCTP, dGTP, dTTP je 80 mM

Stop-Lösung

Formamid 95 %EDTA 20 mMBromphenolblau 0,05% (w/v)Xylen-Cyanol 0,05% (w/v)

3.18 Hochauflösende Polyacrylamidgelelektrophorese

Die bei der Sequenzierungsreaktion entstandenen DNA-Fragmente wurden auf einem

denaturierenden, hochauflösenden Harnstoff-Polyacrylamidgel aufgetrennt.

Zunächst wurden zwei Glasplatten der Größe 34 x 42 cm2 und 34 x 44 cm2 mit dH2O

und Ethanol gründlich gereinigt. Auf die größere der beiden Platten wird eine

Bindesilanlösung, auf die kleinere eine Trennsilanlösung aufgetragen und 30 min

einwirken gelassen. Durch diese Behandlung bleibt, nach Abschluß der Elektrophorese,

das Gel an der größeren Platte haften. Um überschüssige Binde- und Trennsilanlösung

zu entfernen, wurden die Platten erneut mit dH2O und Ethanol gereinigt. Auf die große

Platte wurden dann drei ca. 2 cm breite Whatman-3MM-Papierstreifen so aneinander-

gelegt, daß sie mit den Rändern der Glasplatte abschlossen und sich keine

Zwischenräume zwischen ihnen befanden. Die kleine Platte wurde dann so auf die große

gelegt, daß sich die Papierstreifen nicht gegeneinander verschoben. Nachdem die Platten

mit Spannklammern zusammengeklammert worden waren, konnte die frisch angesetzte,

noch warme Harnstoff-Acrylamid-Lösung durch die offene Seite zwischen die Platten

gegossen werden. Anschließend wurden zwei Haifischzahnkämme mit ihrer glatten

Seite 1-2 mm in das Gel gesteckt und mit Spannklammern fixiert. Das Gel

polymerisierte über Nacht vollständig aus und wurde dann in eine „S2“-

Elektrophoresekammer (Life Technologies) eingespannt. Nachdem 0,8x TTE in die

Pufferreservoire gefüllt wurde, konnten die Kämme vorsichtig aus dem Gel gezogen

werden. Um die Geloberfläche von überschüssigen Gelresten zu befreien, wurde sie mit

Hilfe einer Spritze mehrmals mit Puffer gespült. Danach wurden die Kämme so in das

Methoden

39

Gel gesteckt, daß die Zähne 1-2 mm in das Gel hineinragten. Bevor die Proben

aufgetragen wurden, wurde das Gel ungefähr 30 - 45 min bei 60 W (ca. 1700 V)

vorgewärmt. Direkt vor dem Auftragen der Proben wurden die Probentaschen mit

0,8x TTE-Puffer gespült. Nach zweiminütiger Denaturierung bei 75°C wurden die

Proben aufgetragen. Die Elektrophorese dauerte zwischen 4 und 8 h. Nach Beendigung

der Elektrophorese wurde das Gel aus der Kammer genommen und die beiden

Glasscheiben vorsichtig voneinander getrennt. Dabei blieb das Gel an der größeren, mit

Bindesilan behandelten Platte haften. Das Gel wurde 15-30 min fixiert und danach der

Harnstoff unter fließendem Wasser aus dem Gel gewaschen. Nachdem das Gel bei

80 °C getrocknet worden war, wurde ein Röntgenfilm aufgelegt und bei RT über Nacht

exponiert.

40 %ige Acrylamid-Lösung

Bisacrylamid 2 % (w/v)Acrylamid 38 % (w/v)

20x TTE-Puffer

Tris-Base 216 gTaurin 72 gEDTA(Di-Natrium-Salz) 4 gdH2O ad 1 l(filtrieren, autoklavieren)

0,8x TTE-Puffer

20x TTE-Puffer 80 mldH2O 1920 ml

Bindesilan-Lösung

100 % Ethanol 25 ml10 % Essigsäure 750 µlMethylacryl-oxy-propyltrimethylsilan 5 µl

Trennsilan-Lösung

5 % (v/v) Dichlordimethylsilan in CHCl3

Methoden

40

Acrylamidgel-Lösung

Harnstoff 50 g20x TTE-Puffer 4 ml38 %ige Acrylamidlösung2 %ige Bisacrylamidlösung 15 mldH2O add 100 mlTEMED (Radikalstarter) 25 µlAPS-Lösung, 10 % (w/v) 550 µl

Fixierer

Methanol 10 % (v/v)Essigsäure 10 % (v/v)dH2O 80 % (v/v)

Zusätzlich wurden Sequenzierungen bei der Firma Toplab GmbH (Martinsried) in

Auftrag gegeben.

3.19 Konstruktion einer λ-ZAP-Express Genbank

Eine Genbank oder Genombibliothek ist eine statistische Präsentation der Gesamt-DNA

eines Organismus durch relativ kleine, DNA-Fragmente tragende Klone. Als Gesamt-

DNA kann genomische DNA oder cDNA verwendet werden. Die DNA-Fragmente

können entweder in Plasmiden vorliegen, die in Bakterienzellen transformiert werden,

oder in Bakteriophagen-DNA kloniert sein, die sich durch Infektion in Bakterienzellen

einschleusen läßt. Wichtig ist ein ausreichender Titer der Genbank, d.h. die

ursprüngliche Gesamt-DNA muß durch die Summe der einzelnen DNA-Fragmente

komplett, möglichst mehrmals und statistisch einander überlagernd, wiedergegeben

werden können. Dann läßt sich ein beliebiger DNA-Abschnitt aus der Genbank isolieren

und bearbeiten.

Die verschiedenen Genbanksysteme unterscheiden sich hauptsächlich in der Größe der

eingebauten DNA-Inserts. Zur Identifizierung des Asparaginase-Gens aus

P. fluorescens, dessen Größe aufgrund der bekannten Proteinsequenz der

Pseudomonas sp. 7A Glutaminase-Asparaginase (PGA) und der bekannten E. coli

Asparaginase II auf ca. 1,3 – 1,5 kb geschätzt wurde, wurde das ZAP-Express Genbank-

System gewählt. Obwohl der ZAP-Express Vektor nur DNA-Fragmente von maximal 9

Methoden

41

- 12 kb aufnehmen kann, besitzt er den Vorteil, daß die gewünschten Inserts durch eine

„ in vivo excision“ direkt, ohne Phagenisolierung und Umklonierung, in ein Plasmid

subkloniert werden können.

3.19.1 Partielle Restriktion von genomischer DNA aus P. fluorescens

Zur Konstruktion der Genbank mußte die chromosomale DNA statistisch in Fragmente

der gewünschten Größe geschnitten werden. Das wird durch partielle Restriktion mit

einer Endonuklease erreicht, die eine Tetranukleotid-Erkennungssequenz besitzt.

Endonukleasen mit Tetranukleotid-Erkennungssequenzen schneiden sehr oft und eignen

sich deshalb zur statistischen Restriktion. Durch eine Verdünnungsreihe der

Enzymkonzentration bei gleicher DNA-Menge kann eine DNA-Fraktion hergestellt

werden, die Fragmente der gewünschten Größe enthält. Zur partiellen Restriktion wurde

Sau3AI verwendet, das komplementäre Enden zu den mit BamHI vorbehandelten ZAP-

Express-Vektorarmen bildet. Dadurch wurde eine Ligation der statistisch geschnittenen

DNA mit den Phagenarmen möglich.

317 µg genomische DNA von P. fluorescens (800 µl) wurden mit 2 ml 1 x

Restriktionspuffer gemischt und auf sieben 400 µl Aliquots aufgeteilt. Nach Zugabe von

1 µl Sau3AI (10 Units/µl) zum ersten Aliquot und Mischen wurden 150 µl in das

nächste Aliquot pipettiert, wieder gemischt und wieder 150 µl auf das nächste Aliquot

pipettiert usw. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C, wurde das Enzym durch

15 minütiges Erhitzen auf 65 °C inaktiviert. Von jedem Aliquot wurden 10 µl für ein

Agarosegel abgenommen. Zu den ursprünglichen Aliquots wurden jeweils 2 µl

alkalische Phosphatase (CIP) gegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert. Zur Inaktivierung

der alkalischen Phosphatase wurde der Ansatz 15 min bei 68 °C erhitzt und die Aliquots

anschließend auf Eis gestellt.

Die statistische Restriktion wurde durch Elelektrophorese (5 h bei 50 mA auf Eis) auf

einem 0,5 %igem Agarosegel überprüft und diejenigen Ansätze, die DNA im Bereich

von 9 - 12 kb enthielten, einer genaueren Größenfraktionierung unterzogen.

Methoden

42

3.19.2 Dichtegradientenzentrifugation

(ohne Ethidiumbromid-Färbung)

Da die Ansätze der partiellen Restriktion außer den gewünschten DNA-Fragmenten

auch noch viele kleinere Fragmente enthielten, die aber nicht mit den Phagenarmen

ligiert werden sollten, mußte noch eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt

werden.

Die Dichtegradientenzentrifugation dient zur Auftrennung von DNA-Fragmenten

unterschiedlicher Größe. Dabei ordnen sich die verschieden großen DNA-Fragmente

während der Zentrifugation entsprechend ihrer Größe in dem Gradienten an. Der

Gradient wurde aus einer 5 %igen und einer 30 %igen NaCl-Lösung mit Hilfe eines

Gradientenmischers und einer peristaltischen Pumpe in einem Zentrifugenröhrchen

hergestellt. Die zu trennende DNA-Lösung wurde vorsichtig oben auf den Gradienten

pipettiert. Die Zentrifugation erfolgte 4,5 h bei 37000 rpm in einer Ultrazentrifuge. Nach

Beendigung der Zentrifugation wurden von oben vorsichtig 500 µl Aliquots

abpippetiert, gegen TE-Puffer dialysiert (Tropfendialyse) und auf einem 0,5 % igen

Agarosegel analysiert.

5% ige NaCl-Lösung

NaCl l5 % (w/v)EDTA 3 mM

pH 8,0

30 %ige NaCl-Lösung

NaCl 30 % (w/v)EDTA 3 mM

pH 8,0

3.19.3 Tropfendialyse und DNA-Fällung

Zur Dialyse kleiner Probenvolumina (bis zu 150 µl) wurde die sogenannte Tropfen-

dialyse verwendet. Dazu wurden sterile Petrischalen mit sterilem TE-Puffer gefüllt. Pro

Schale wurden dann vorsichtig 2 MF-Membranfilter (Millipore) aus Zellulosemischester

auf den Puffer gelegt. Pro Filter wurden vorsichtig 150 µl Probe mit einer Pipette

Methoden

43

aufgetragen, die Schalen abgedeckt und 20 - 30 min stehengelassen. Danach wurden die

dialysierten Proben vorsichtig von den Filtern abgenommen und in ein neues steriles

Reaktionsgefäß überführt. Überschritt das Probenvolumen 150 µl, so konnte die gleiche

Probe erneut auf den Filter aufgetragen werden.

Jede dialysierte Fraktion wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,5 und 2,5

Volumen 100 % Ethanol versetzt und über Nacht bei - 20 °C gelagert. Durch

30 minütige Zentrifugation bei 13000 rpm und 4 °C wurde die DNA pelletiert. Die

DNA-Pellets wurden zweimal mit 70 % Ethanol (-20°C) gewaschen, getrocknet und in

10 µl sterilem dH2O aufgenommen. Durch Agarosegelelektrophorese auf einem

0,5 %igem Gel konnte die Fraktionierung überprüft werden.

3.19.4 Ligation mit dem ZAP-Express-Vektor

Um Mehrfach-Insertionen zu vermeiden wurden die DNA-Fragmente im gleichen oder

geringerem molaren Verhältnis wie die Vektorarme eingesetzt.

Zur Ligation der DNA-Fragmente mit den Phagenarmen wurden 1 µl mit BamHI

behandelter ZAP-Express Vektor (1 µg/µl) mit 1,5 µl DNA-Fragmenten, 0,5 µl 10 x

Ligase Puffer, 0,5 µl 10 mM rATP und 1,5 µl dH2O versetzt, gemischt und 2 µl (1 U/µl)

T4-DNA-Ligase zugefügt. Die Ligation wurde über Nacht in einem Wasserbad bei

14 °C durchgeführt.

3.19.5 Verpackung der Ligationsansätze

(Verpackung in Phagenpartikel)

4 µl Ligationsansatz wurden auf Eis zu dem „Freeze-thaw“-Extrakt (Stratagene)

gegeben und mit 15 µl Ultraschallextrakt (Stratagene) versetzt und vorsichtig mit einer

Pipette gemischt. Dabei durften keine Luftblasen entstehen. Die Mischung wurde kurz

abzentrifugiert und 2 h bei 22 °C inkubiert. Danach wurden 500 µl SM-Puffer und 20 µl

CHCl3 zugegeben, vorsichtig gemischt, um noch vorhandenen zelluläre Bruchstücke

abzutrennen, kurz zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß

überführt. Bis zur weiteren Verwendung wurde diese Phagenlösung bei 4 °C gelagert.

Methoden

44

SM-Puffer

NaCl 5,8 gMgSO4*7 H2O 2,0 g1 M Tris/HCl (pH 7,5) 50,0 ml2 % (w/v) Gelatine 5,0 mladd dH2O auf 1 l

3.20 Titerbestimmung der Genbank

50 ml LB-Maltose-MgSO4-Medium (0,2 % Maltose, 10 mM MgSO4) wurden mit einer

Einzelkolonie E. coli XL1Blue MRF´ angeimpft und über Nacht bei 30 °C inkubiert.

Am folgenden Tag wurde frisches LB-Maltose-MgSO4-Medium 1:100 mit der

Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C bis zu einer OD600 von 1,0 inkubiert. Mit

frischen LB-Medium wurden die Zellen dann auf eine OD600 von 0,5 verdünnt. Von der

Genbank wurden folgende Verdünnungen in SM-Puffer hergestellt: 1:10, 1:100, 1:1000

und 1:10000. Je 200 µl der E. coli XL1Blue MRF´-Zellen (OD600 = 0,5) wurden mit

jeweils 1 µl der einzelnen Genbank-Verdünnungen versetzt und 15 min bei 37 °C

inkubiert. Nach Zugabe von 3 ml NZY Top Agar (48 °C) wurde auf vorgewärmten

(37 °C) NZY-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zur Bestimmung

des Titers (pfu/ml) wurden die Plaques auf den einzelnen Platten gezählt.

3.21 Herstellung einer Asparaginase-Sonde zum Screenen der

Genbank

Zur Identifizierung eines Gens in einer Genbank benötigt man eine sogenannte DNA-

Sonde für das gesuchte Gen. Als Sonden können Teilstücke von Genen, die das gleiche

Protein in anderen Organismen kodieren, eingesetzt werden. Allerdings ist es besser,

man verwendet DNA-Fragmente aus demselben Organismus, da dann die

Wahrscheinlichkeit, daß richtige Gen zu finden deutlich größer ist. Aufgrund des

degenerierten genetischen Codes unterscheiden sich Gene aus unterschiedlichen

Organismen, die das gleiche Protein kodieren, zum Teil sehr in ihren DNA-Sequenzen.

Als Sonde sollte ein ca. 250 bp großes DNA-Fragment hergestellt werden, das

bestimmte hochkonservierte Bereiche der periplasmatischen Asparaginase abdeckt.

Methoden

45

Dazu wurde zunächst mit degenerierten Asparaginase-Primern PCR-Amplifizierungen

mit genomischer DNA aus P. putida und P. fluorescens als Template durchgeführt. Die

degenerierten Primer wurden aufgrund von Sequenzhomologien bereits bekannter

Asparaginasegene verschiedener Prokaryoten erstellt. Da auch bei der Unter-

schiedlichkeit der DNA-Sequenzen verschiedener Organismen die Proteine immer

hochkonservierte Bereiche besitzen, wurden die Primer so synthetisiert, daß sie genau in

solchen hochkonservierten Bereichen lagen. Allerdings besteht bei degenerierten

Primern das Problem, das die Annaeling-Temperatur sehr niedrig gehalten werden muß,

und deshalb auch unspezifische Amplifikate entstehen können. Die eingesetzten Primer

AsnFor und AsnBack wurden von DNA-Sequenzen abgeleitet, die in hochkonservierten

Bereichen bekannter Asparaginasen lagen und für die Aminosäuren T9-A14 und H87-

M92 (E. coli Numerierung) kodierten.

Als Matrize wurden verschiedene Verdünnungen genomischer P. fluorescens DNA, die

aus einer 1,5 ml Übernachtkultur präpariert wurde, eingesetzt. Zu der DNA wurden

10 pmol Forward- und 10 pmol Backward-Primer, 10 µl dNTP-Mix (10 mM),

0,25 µmol MgCl2 und 10 µl 10x PCR-Puffer gegeben . Mit sterilem dH2O wurde auf

100 µl aufgefüllt, 2,5 Units Taq-Poymerase zugegeben, mit Mineralöl überschichtet und

in einen Thermocycler gestellt. Die Amplifizierung erfolgte nach 2 min Denaturierung

bei 94 °C, zunächst mit 3 Cyclen bei 1,5 minütiger Denaturierung bei 94 °C, 1 min

Annaeling bei 44 °C und 1 min Polymerisierung bei 72 °C. Danach folgten 30 Cyclen

mit jeweils 1 min 94 °C, 1 min 56 °C, 1 min 72 °C. Abschließend erfolgte noch eine

4 minütige Inkubation bei 72 °C, um noch nicht vollständig aufgefüllte DNA-Stränge

fertigzustellen. Das Ergebnis der PCR wurde auf einem 0,8 %igen Agarosegel

analysiert.

3.22 DIG-Markierung der Asparaginase-Sonde

Die Sonde wurde über PCR mit der DIG-Markierung versehen. Dazu wurde der „PCR

DIG-Labeling MIX“ (Boehringer Mannheim) eingesetzt. Der dNTP-Mix enthielt dATP,

dCTP, dGTP (je 2 mM), dTTP (1,9 mM) und 0,1 mM DIG-markiertes dUTP (DIG-

dUTP), das während der PCR von der Polymerase anstelle von dTTP eingebaut wird.

Als Matrize diente das Plasmid 1/22. Dieses Plasmid bestand aus dem Vektor

Methoden

46

pBluescript SK (+), der die über PCR amplifizierte Asparaginase-Sonde als Insert

enthielt. Als Primer wurden die auf der Sonden-DNA-Sequenz basierenden Primer PR 1

und PR 2 eingesetzt.

PR 1: 5´- GAC CTA TCA AGC GGC GAA AGT CGG -3´

PR 2: 5´- TGT GTC GGT ACC GTG GGT GAT CAC –3´

5 µl Plasmid 1/22 wurden mit jeweils 100 pmol PR 1 und PR 2, 10 µl 10 x Pfu-Puffer,

5 µl DMSO, 10 µl PCR DIG-Labeling Mix in ein 0,5 ml PCR-Gefäß zusammen-

gegeben. Mit dH2O wurde auf ein Gesamtvolumen von 100 µl aufgefüllt, 2,5 Units

cloned Pfu-Polymerase (Stratagene) zugegeben und gemischt. Nachdem die Mischung

kurz abzentrifugiert worden war, wurde sie mit Mineralöl überschichtet und in einen

Thermocycler (Perkin Elmer) gestellt. Die Amplifizierung erfolgte nach folgenden

Temperaturprofil:

Zyklen T / °C t / min T / °C t / min T / °C t / min

1 94 1

5 94 1 58 1 72 1

30 94 1 64 1 72 1

1 72 4

1 4

3.23 Abschätzung der Ausbeute der DIG-Markierung der Sonde

Da man, um optimale Hybridisierungssignale zu erhalten, zum Screenen 5-25 ng/ml

DIG-markierte Sonde einsetzen darf, muß nach der Markierungsreaktion der DIG-

Gehalt der Sonde bestimmt werden. Dazu wird ein „Spot-Test“ mit einer markierten

Kontroll-DNA, dessen DIG-Gehalt genau bekannt ist, durchgeführt.

Sowohl von der DIG-markierten Sonde, als auch von der Kontroll-DNA wird eine

Verdünnungsreihe mit folgenden Konzentrationen angesetzt: 1 ng/µl, 100 pg/µl,

10 pg/µl, 1 pg/µl und 0,1 pg/µl. Von jeder Verdünnung wird 1 µl auf ein Membranstück

aufgetragen und einer Chemilumineszens-Detektion mit CSPD unterworfen. Der direkte

Methoden

47

Vergleich der Intensitäten der Probe und der Kontrolle erlaubt die Abschätzung der

Markierungsausbeute.

3.24 Optimierung der Sondenkonzentration

Da es bei zu hoher Konzentration der eingesetzten DIG-markierten Sonde zu

unspezifischen Reaktionen mit der Membran kommen kann (Hintergrund-Probleme),

muß vor dem eigentlichen Screening-Vorgang die Probenkonzentration optimiert

werden. Dazu werden kleine Membranstücke, auf denen keine DNA transferiert wurde,

in unterschiedlich konzentrierten Hybridisierungslösungen inkubiert und anschließend

eine Chemiluminescens-Detektion durchgeführt. Die Sondenkonzentration, die einen

akzeptablen Hintergrund gibt, wird für die Hybridisierung eingesetzt.

3.25 Screening der Genbank mit der DIG-markierten Asparaginase-

Sonde

Zum Screenen der Genbank wurden 50000 pfu der Genbank auf 20 NZY-Platten mit

Top Agar ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Dazu wurde die

entsprechende Menge der Phagenlösung mit 600 µl Wirtszellen (E. coli XL1Blue

MRF´) der OD600 von 0,5 mit 6,5 ml NZY Top Agar pro Platte ausplattiert.

3.25.1 Plaque Lifts

Um die Phagen-DNA auf die Membranen zu übertragen, wurden zunächst die Plaques

von den NZY Top Agar-Platten auf die Membranen übertragen. Dazu wurden die

Platten 30 min bei 4 °C vorgekühlt, um zu vermeiden, daß beim späteren Abheben der

Membranen von den Platten, Top Agar-Reste an den Membranen haften bleiben.

Danach wurde auf jede Plattenoberfläche vorsichtig eine ungeladene Nylonmembran

(QIABRANE, Qiagen) aufgelegt. Dabei dürfen weder Luftblasen entstehen, noch dürfen

die Membranen nachträglich bewegt werden, da der Transfer sofort beginnt. Die

Membranen wurden 1 min auf den Platten gelassen. Um später positive Klone

Methoden

48

identifizieren zu können, wird die Orientierung der Membran auf der Platte markiert.

Danach werden die Membranen vorsichtig von den Platten genommen und kurz auf

trockenes Whatman 3MM Papier gelegt. Bei diesem, wie auch den folgenden Schritten

zeigten die Plaque-tragende Seite der Membranen nach oben. Dann werden die

Membranen auf mit Denaturierungslösung getränktes Whatman 3MM-Papier gelegt und

5 min inkubiert. Nachdem die Membranen wieder kurz auf trockenes Whatman 3MM

Papier gelegt worden waren, wurden sie 15 min auf ein mit Neutralisationslösung

getränktes Filterpapier gelegt. Anschließend wurden die Membranen wieder auf

trockenes Whatman 3MM Papier gelegt und danach 10 min auf Filterpapier inkubiert,

das mit 2x SSC getränkt war. Die Filter wurden dann 1-2 h auf Whatman 3MM Papier

getrocknet. Durch UV-Crosslinking wurde die transferierte DNA fest auf den

Membranen gebunden. Dazu wurden die Membranen mit der DNA-Seite nach unten

2 min auf einem 254 nm-UV-Transilluminator gelegt.

3.25.2 Proteinase K-Behandlung

Um Hüll- und andere Proteine von den Membranen zu entfernen, wurden sie einer

Proteinase-K-Behandlung unterworfen. Dazu wurden die Membranen in saubere

Petrischalen gelegt und 0,5 ml einer 2 mg/ml Proteinase-K-Lösung auf die Membranen

pipettiert und gleichmäßig verteilt. Die Schalen wurden abgedeckt und 1 h bei 37 °C

inkubiert. Danach wurden die Membranen zwischen vollständig nasses (mit dH2O,

steril) Filterpapier gelegt, und durch herüberrollen einer Flasche Druck ausgeübt. Die

Zell- und Agarreste wurden durch vorsichtiges Abziehen des oberen Filterpapiers

entfernt (Die Reste hingen an diesem Filterpapier). Falls noch Zell- oder Agarreste auf

den Membranen hafteten, mußte dieser Schritt wiederholt werden.

3.25.3 Hybridisierung

Die Hybridisierung wurde in Hybridisierungsflaschen (Amersham Hybridization bottles)

in einem Hybridisierungsofen (MWG; München) durchgeführt. Pro Flasche wurden 3 -

4 Membranen eingesetzt. Um sicherzustellen, daß die Membranen nicht anein-

anderklebten und mit genügend Hybridisierungslösung benetzt waren, wurden zwischen

die Membranen Mesh-Sheets (Hybridization Mesh aus Polypropylen; Amersham)

Methoden

49

gelegt. Nachdem die Membranen in die Rollerbottles gelegt wurden, wurden 60 - 80 ml

Prähybridisierungslösung hinzugefügt und 1 - 1,5 h bei 68 °C im Hybridisierungsofen

inkubiert.

Die DIG-markierte doppelsträngige Sonde wurde durch 5 min Kochen bei 95 - 100 °C

denaturiert und sofort auf Eis gestellt. Die denaturierte Sonde wurde mit 6 ml auf 68 °C

vorgewärmter Hybridisierungslösung gemischt. Dabei betrug die Konzentration der

DIG-Sonde in der Lösung 15 ng/ml.

Die Prähybridisierungslösung wurde aus den Flaschen entfernt und pro Flasche 6 ml

Hybridisierungslösung hinzugefügt. Bei 68 °C wurde über Nacht im Hybridisierungs-

ofen inkubiert. Am Ende der Hybridisierung wurde die Hybridisierungslösung entfernt

und die Membranen in Petrischalen gelegt. Die Hybridisierungslösung wurde bei -20 °C

gelagert und konnte bis zu einem Jahr verwendet werden.

3.25.4 Stringente Waschschritte

Die Membranen wurden jeweils 5 min mit reichlich 2x SSC, 0,1% SDS vorsichtig bei

RT gewaschen und dann zweimal für 15 min bei 68 °C in 0,5x SSC, 0,1 % SDS

gewaschen.

3.26 Chemiluminescenz-Detektion

(Wenn nicht extra angegeben wurden alle Detektionsschritte bei RT durchgeführt.)

Die Membranen durften zwischen den einzelnen Schritten nicht trocknen.

Nach der Hybridisierung und den Waschschritten wurden die Membranen für 1 min im

Waschpuffer equilibriert. Danach wurden die Membranen in Hybridisierungsbeutel mit

10 ml Blockierungslösung eingeschweißt und 30 - 60 min geschüttelt. Das Anti-DIG-

AP-Konjugat wurde 1:10000 in Blockierungslösung verdünnt. Nachdem die

Blockierungslösung entfernt worden war, wurden die Membranen 30 min mit 10 ml

Antikörperlösung inkubiert. Danach wurden die Membranen zweimal 15 min mit

Waschpuffer gewaschen und anschließend 2 min in Detektionspuffer equilibriert. Das

CSPD wurde 1:100 in Detektionspuffer verdünnt. Jeweils 1,5 ml CSPD-Lösung wurden

mit jeweils einer Membran in einem Hybridisierungsbeutel eingeschweißt und 5 min

Methoden

50

inkubiert. Danach wurden die Membranen aus den Beuteln genommen, die

überschüssige Lösung kurz abtropfen gelassen und in neue Beutel eingeschweißt. Bei

RT werden ca. 7 – 8 h zum Erreichen der stationären Phase der Chemilumines-

zensreaktion benötigt. Um die Reaktion zu beschleunigen wurden die eingeschweißten

Membranen im Dunkeln 15 min bei 37 °C inkubiert. Danach wurde ein Film (BIOMAX

MR; Kodak) für 30 - 60 min aufgelegt. Nach der Entwicklung des Films konnten

positive Plaques identifiziert werden.

Prähybridisierungslösung

SSC 5xN-Lauroylsarcosin 0,1 % (w/v)SDS 0,02 % (w/v)Blockierungs-Reagenz 1 %

Hybridisierungslösung

wie Prähybridisierungslösung+ DIG-markierte Sonde

Denaturierungslösung

NaOH 0,5 MNaCl 1,5 M

Neutralisierungslösung

Tris/HCl, pH 7,5 1,0 MNaCl 1,5 M

20 x SSC-Puffer

NaCl 3 MNatriumcitrat 300 mM

2 x SSC-Puffer

NaCl 0,3 MNatriumcitrat 30 mM

Proteinase-K-Lösung

Proteinase Kin 2 x SSC-Puffer 2 mg/ml

Methoden

51

Waschpuffer

Maleinsäure 100 mMNaCl 150 mM

pH 7,5Tween-20 0,3 % (v/v)

Maleinsäurepuffer

Maleinsäure 100 mMNaCl 150 mM

pH 7,5

Blockierungslösung

Blockierungs-Reagenz inMaleinsäurepuffer 1 % (w/v)

Detektionspuffer

Tris/HCl 100 mMNaCl 100 mM

pH 9,5

3.27 In vivo excision

Bei der in vivo excision können DNA-Inserts, die in den ZAP Express Vektor kloniert

worden sind, durch einen (ExAssist) Helferphagen herausgeschnitten und in pBK-

CMV-Phagemide subkloniert werden [Alting-Mees et al., 1992; Short et al., 1988;

Short et al., 1992]. Dazu werden E. coli-Zellen mit den beim Genbankscreening

erhaltenen positiven Phagen infiziert. Zusätzlich werden die E. coli-Zellen mit einem

Helferphagen infiziert. Innerhalb der E. coli Zellen erkennen dann sogenannte „Trans-

acting-Proteine“ des Helferphagen die Initiator- und Terminatorsequenzen des ZAP-

Express-Vektors. Beide Signale werden von dem Helferphagen Gen II-Protein erkannt

und ein neuer DNA-Strang synthetisiert, der den zwischen dem Initiator und Terminator

liegenden Strang ersetzt. Der ersetzte DNA-Strang wird dann zirkularisiert, als

filamentöser Phage von den Helferphagenproteinen verpackt und von den Zellen

abgegeben. Durch Infektion eines F´-Stammes mit diesem Phagen und Inkubation in

Gegenwart von Kanamycin können dann die pBK-CMV-Plasmide mit den gewünschten

DNA-Fragmenten erhalten werden.

Methoden

52

Die durch Screening identifizierten positven Plaques wurden mit einer abgeschnittenen,

sterilen Pipettenspitze aus den Top Agarplatten gestochen und über Nacht bei 4 °C in

500 µl SM-Puffer und 20 µl CHCl3 gelöst (= Phagenstocklösung). 3 ml LB-Maltose-

MgSO4-Medium wurden mit einer Einzelkolonie E. coli XL1Blue MRF´ angeimpft und

über Nacht bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden bei 1000 xg abzentrifugiert und in

10 mM MgSO4 auf eine OD600 von 1,0 resuspendiert. 200 µl dieser Zellen wurden mit

250 µl Phagenstocklösung und 1 µl ExAssist Helferphagen (Stratagene) versetzt und

15 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 3 ml NZY-Medium wurde über Nacht bei

37 °C inkubiert. Die Zellen wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt,

10 min bei 70 °C inkubiert und dann bei 2000 xg abzentrifugiert. Der Überstand, der

den pBK-CMV-Phagemid-Vektor als filamentöse Phagenpartikel enthält, wurde in ein

neues Gefäß pipettiert. Er kann bei 4 °C 1-2 Monate gelagert werden.

NZY-Medium wurde mit einer Einzelkolonie E. coli XLOLR angeimpft und über Nacht

bei 30 °C inkubiert, dann abzentrifugiert und mit 10 mM MgSO4 auf eine OD600 von 1,0

resuspendiert. 10 µl und 100 µl des Phagenüberstandes wurden mit jeweils 200 µl

E. coli XLOLR-Zellen (in 10 mM MgSO4) versetzt und 15 min bei 37 °C inkubiert.

Nach Zugabe von 300 µl NZY-Medium wurde noch einmal 45 min inkubiert, danach

auf LB Kan25-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.

Von den auf den Platten gewachsenen Kolonien wurden 4 ml LB Kan25-Kulturen

angesetzt und Plasmide isoliert. Durch Restriktionsendonuklease-Spaltung und

Agarosegelelektrophorese wurden die Plasmide kontrolliert. Plasmide mit

entsprechenden Inserts wurden sequenziert, um die DNA-Sequenz des gesuchten

Asparaginasegens zu erhalten.

3.28 Genome Walker PCR

Mit der Methode der „Genome Walker PCR“ kann man von einem bekannten Teil einer

DNA-Sequenz in unbekannte Bereiche vordringen und so die DNA-Sequenz ermitteln

[Siebert et al., 1995]. Bei dieser Methode wird zunächst genomische DNA des

Organismus aus dem die Sequenz aufgeklärt werden soll, isoliert. Die DNA wird in 5

Aliquots mit einem der folgenden Restriktionsenzyme geschnitten: PvuII , DraI, EcoRV,

ScaI, SspI. (Jedes dieser fünf Enzyme erzeugt glatte (blunt) DNA-Enden.) Dadurch

Methoden

53

erhält man 5 DNA-Bibliotheken. Die DNA-Fragmente werden mit zwei Adaptern, von

denen einer am 3´- Ende mit einer NH2-Gruppe blockiert ist, ligiert. Dann wird mit

einem Adapterprimer und einem genspezifischen Primer eine PCR durchgeführt. Die

dabei entstandenen Fragmente werden mit einer zweiten PCR, bei der außer dem

Adapterprimer ein weiterer „nested“ genspezifischer Primer eingesetzt wird, noch

einmal amplifiziert. (s. Abb. 3.1)

Zur Herstellung der 5 Genbibliotheken von genomischer DNA aus P. fluorescens

wurden jeweils 1,8 ng DNA mit 4 µl (10 Units/µl) PvuII , DraI, SspI, ScaI und EcoRV

geschnitten (2 h bei 37 °C). Durch Gelextraktion wurden möglichst große Fragmente

der einzelnen Restriktionen isoliert und mit folgenden Adaptern ligiert:

ADA 1:

5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3´

ADA 2: 5´- ACCTGCCC-NH2-3´

Zur Ligation wurden 12 µl geschnittene DNA mit 3,2 µl (160 pmol) ADA 1 und 1,6 µl

(160 pmol) ADA 2 und 1 U T4-DNA-Ligase ligiert. Mit den Adapterprimer (ADP) und

einem genspezifischen Primer (PR 2) wurde dann eine PCR durchgeführt.

ADP: 5´-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3´

Dazu wurden 30 µl Template-DNA mit jeweils 64 pmol ADP und PR 2, 10 µl 10x

PCR-Puffer, 4 µl dNTPs (10 mM, Appligene), 5 µl DMSO versetzt und mit dH2O auf

100 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 2,5 U Taq-Polymerase (peqlab), wurde die Lösung

mit Mineralöl überschichtet und in den Thermocycler gestellt. Die Amplifizierung

erfolgte nach folgendem Temperaturprofil:

Zyklen T / °C t / min T / °C t / min T / °C t / min1 94 25 94 0,5 55 1 72 15 94 0,5 60 1 72 130 94 0,5 65 1 72 11 4

Anstelle einer zweiten PCR wurden die erhaltenen PCR-Fragmente nach Aufreinigung

sequenziert.

Methoden

54

Abb. 3.1: Schematische Darstellung der „Genome Walker PCR“

genomische DNA

DraI PvuII ScaIEcoRV SspI

5´3´ 5´

3´

X

XADA 1

ADA 1ADA 2

ADA 2

Ligation mit Adaptern ADA 1 und ADA2

PCR mit genspezifischen Primer

X

XADA 1

ADA 1ADA 2

ADA 2

XADA 1 ADA 2

PCR mit ADP und genspez. Primer

Sequenzierung der erhaltenen PCR-Fragmente

Adapter

genspez. Primer

Adapterprimer (ADP)

X Blockierung

Restriktionsfragmente

Methoden

55

3.29 Isolierung von Gesamt-RNA

Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Gram- negativen Bakterien wurden zwei

Methoden verwendet.

3.29.1 RNA-Isolierung mit Guanidinisothiocyanat und Phenol

Für die Präparation größerer Mengen RNA aus Bakterien wurde eine etwas

abgewandelte Methode von Chirgwin und Chomczynski verwendet [Chirgwin, J. M.

et al, 1979; Chomczynski et al, 1987]. Grundlage dieses Verfahrens sind die

Eigenschaften von Guanidinisothiocyanat, das Zellen lysieren und zugleich RNasen

inaktivieren. Durch eine anschließende organische Extraktion werden Proteine von der

RNA abgetrennt [Sabourin et al. 1996] Für die Isolation wurde peqGold RNApure-

Lösung (peqlab) verwendet. Diese Lösung enthält eine Mischung aus

Guanidinisothiocyanat und Phenol.

Die Bakterienzellen wurden abzentrifugiert und das Zellpellet mit jeweils 1 ml / 10x106

Zellen resuspendiert. Während einer fünfminütigen Inkubation bei RT wurden die

Zellen lysiert und RNasen inaktiviert. Nach Zugabe von 0,2 ml CHCl3 / 10x106 Zellen

und kräftigem Mischen wurde 10 min bei RT inkubiert. Durch eine fünfminütige

Zentrifugation bei 12000 rpm erfolgte die Trennung der organischen und wäßrigen

Phase. Die obere, wäßrige Phase, in der sich die RNA befand, wurde in ein neues

Reaktionsgefäß transferiert und mit 1 ml / 10x106 Zellen Isopropanol versetzt. Nachdem

15 min bei RT inkubiert worden war, wurde die ausgefällte RNA 10 min bei 12000 rpm

und 4 °C abzentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde zweimal mit 75%igem Ethanol

gewaschen, kurz getrocknet und dann in RNase freiem dH2O gelöst.

3.29.2 RNA-Isolierung mit dem „High Pure RNA Isolation Kit“ von BM

Bei dieser Methode werden die Bakterienzellen zunächst mit Lysozym in einem

Lysepuffer lysiert. Dabei werden gleichzeitig alle RNasen inaktiviert. Danach werden in

Gegenwart eines chaotropen Salzes Nukleinsäuren spezifisch an eine Glasfaser-

oberfläche gebunden [Vogelstein & Gillespie, 1979]. Dabei sind die Bindebedingungen

Methoden

56

für RNA optimiert. Durch eine DNaseI-Reaktion direkt auf der Glasfasersäule, werden

Reste noch vorhandener DNA abgebaut. Nach einigen Waschschritten wird die RNA in

RNase-freiem Wasser eluiert.

1,5 ml einer P. fluorescens Übernachtkultur wurden bei 5000 rpm in einer

Tischzentrifuge abzentrifugiert und das Zellpellet in 200 µl 10 mM Tris pH 8,0

resuspendiert. Anschließend wurden 4 µl Lysozym (50 mg/ml) zugegeben und 10 min

bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 400 µl Lyse-Puffer und Mischen wurde das Lysat

auf eine Glasfaser-Filtersäule (High Pure Filter Tube, Boehringer Mannheim) pipettiert

und 15 s bei 10000 rpm zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen, 100 µl DNaseI-

Lösung auf die Säule gegeben und 1 h bei RT inkubiert. Danach wurde die Säule mit

500 µl Waschpuffer I, 500 µl Waschpuffer II und mit 200 µl Waschpuffer II gewaschen.

Durch eine anschließende zweiminütige Zentrifugation bei 12000 rpm wurden noch

vorhandene Waschpufferreste entfernt. Die RNA wurde mit 50 - 100 µl mit RNase-

freiem Wasser von der Säule eluiert.

Lyse-Puffer

Guanidiniumchlorid 4,5 MTris/HCl 50 mMTriton X-100 30 % (w/v)

pH 6,6

DNase-Inkubationspuffer

NaCl 1 MTris/HCl 20 mMMnCl2 10 mM

pH 7,0

DNaseI-Lösung

DNase 10 µlDNase-Inkubationspuffer 90 µl

Waschpuffer I

Guanidiniumchlorid 5 MTris/HCl 20 mM(in 37,5 % Ethanol)

pH 6,6

Methoden

57

Waschpuffer II

NaCl 20 mMTris/HCl 2 mM(in 37,5 % Ethanol)

pH 7,5

3.30 5´- RACE

(„Rapid Amplification of cDNA Ends“)

Um den Promotor eines Gens zu finden, wird normalerweise ein „Primer Extension“-

Experiment durchgeführt. Bei dieser Methode wird an die mRNA bzw. RNA ein

genspezifischer Primer angelagert, der am 5´-Ende markiert ist. Mit Hilfe einer

Reversen-Transkriptase wird dann der Primer zur cDNA verlängert („Primer

Extension“). Dabei kann die cDNA nur so lang werden, bis das Ende der mRNA (also

der Transkriptionsstart) erreicht ist. Die so erhaltenen cDNA wird auf einem Sequenzgel

parallel zu einer Sequenzierung des Genabschnittes aufgetragen und elektrophoretisch

getrennt. Nach Detektion mit einem Röntgenfilm, erscheint das Signal der Markierung

des Primers auf der Höhe der Base, bei der die Transkription beginnt. Die 5´-RACE-

Methode ist praktisch eine um eine PCR erweiterte „Primer Extension“ [Frohman et al.,

1988].

Bei der 5´-RACE wird zunächst mRNA präpariert. Mit einem genspezifischen Primer 1

(GSP 1) wird der erste Strang der cDNA mit einer Reversen-Transkriptase synthetisiert.

Durch RNase-Verdau (RNase-Mix aus RNase H und RNase T1) wird dann die RNA

abgebaut. Mit einer terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) wird an das 3´-

Ende des cDNA-Erststranges eine Oligo (dC)-Ankersequenz angehängt. Mit dem

Ankerprimer (AAP) für diese Sequenz und einem genspezifischen Primer 2 (GSP 2)

wird über PCR der zweite Strang der cDNA hergestellt und die cDNA amplifiziert. Das

so erhaltene PCR-Produkt kann mit einem weiteren genspezifischen Primer mit Hilfe

der PCR angereichert werden. Außerdem können die amplifizierten Fragmente über die

durch die Primer eingeführten Restriktions-Schnittstellen kloniert werden. Nach der

Klonierung können die erhaltenen Fragmente sequenziert werden und so der

Transkriptionsstart identifiziert werden. Ein Schema der RACE-Methode ist in

Abbildung 3.2 dargestellt.

Methoden

58

Abb. 3.2: Schema der 5´RACE

Da Pseudomonaden Prokaryoten sind und eine spezifische Isolierung von mRNA nicht

möglich ist, wird von der Gesamt-RNA ausgehend mit der cDNA-Synthese begonnen.

Dazu wird zunächst aus 25 ml P. fluorescens Übernachtkultur mit Guanidin-

isothiocyanat und Phenol (RNApure; peqlab) und PLGAII Zentrifugenröhrchen (peqlab)

Gesamt-RNA isoliert. Nach spektroskopischer Mengen- und Reinheitsbestimmung

wurden ca. 500 ng RNA mit 2,5 pmol genspezifischer Primer (PR 2) versetzt, und mit

dH2O auf 15,5 µl aufgefüllt. Durch 10 minütige Inkubation bei 70 °C wurde die RNA

denaturiert. Nachdem die RNA auf Eis gestellt worden war, wurde sie mit 2,5 µl 10x

PCR-Puffer, 2,5 µl 25 mM MgCl2, 1 µl dNTP-Mix (10 mM) und 2,5 µl DTT (0,1 M)

versetzt, so daß ein Gesamtvolumen von 24 µl erhalten wurde. Nach vorsichtigem

Mischen wurde 1 min bei 42 °C vorinkubiert, dann 1 µl

SuperScript II Reverse Transcriptase (Life Technologies) zugefügt und 50 min bei 42 °C

inkubiert. Um die Reaktion abzustoppen, wurde 15 min auf 70 °C erhitzt und danach

kurz zentrifugiert. Nachdem die Reaktionsmischung eine Temperatur von 37 °C erreicht

hatte, wurde 1 µl RNase Mix (Life Technologies) zugefügt und 30 min bei 37 °C

inkubiert. Danach wurde die Mischung auf Eis gestellt und der Erststrang der cDNA mit

RNA

GSP 1

GSP 2

Ankerprimer

cDNARNA

Anlagerung des genspezifischen Erststrangprimers (GSP 1) an die RNA

Umschreiben der RNAin cDNA mit Reverser Transcriptase

Abbau der RNA-Matrize mit RNase H

Aufreinigung der cDNA

Anhängen einer Ankersequenz mit dCTP und TdT

Amplifizierung der "dC-getailten" cDNAmittels PCR mit einem Ankerprimer undeinem genspezifischen Primer (GSP 2)

PCR-Produkt geeignet für Klonierung,Amplifizierung, "nested" PCR

Methoden

59

„Glass Max DNA Spin Säulen“ (Life Technologies) aufgereinigt. Um die Oligo-dC-

Ankersequenz an den cDNA-Strang zu hängen, wurden 10 µl der isolierten cDNA mit

6,5 µl DEPC-dH2O und 2,5 µl 2 mM dCTP versetzt. Nach 2-3 min Inkubation bei 94 °C

wurde die Mischung kurz zentrifugiert und dann auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 1 µl

TdT (Life Technologies) wurde 10 min bei 37 °C inkubiert und danach die TdT 10 min

bei 65 °C inaktiviert. Nach Zentrifugation wurde die Reaktionsmischung auf Eis

gestellt. Für die PCR der dC-tailed cDNA werden 31,5 µl dH2O, 5 µl 10 x PCR-Puffer,

3 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl dNTP-Mix (10 mM), 2 µl GSP2, 2 µl AAP und 5 µl der dC-

tailed cDNA zusammengemischt und mit 0,5 µl (5 U/µl) versetzt. Nach Überschichten

mit Mineralöl erfolgte die Amplifizierung bei folgenden Temperaturen:

(Der Thermocycler wurde auf 94 °C vorgeheizt)

Cyclen T / °C t / min T / °C t / min T / °C t /min

1 94 2

5 94 0,5 53 1 72 1

30 94 0,5 55 1 72 1

1 72 5

1 4

GSP 2: 5´- TAC TCG GCG ACC CAA CTG CAG AAG GT –3´

Das Ergebnis der PCR wurde auf einem 1 %igen Agarosegel überprüft.

Ein Teil der erhaltenen Fragmente wurde direkt zur Klonierung in pBluescript SK(+)

eingesetzt, mit einem weiteren Teil wurde eine zweite PCR mit einem „nested“ Primer

durchgeführt. Mit einigen Fragmenten wurde die Amplifizierung nochmals mit den

gleichen Primern wiederholt.

AAP: 5´- GGCCACGCGTCGACTAGTACG GGI IGG GII GGG IIG –3´

AUAP: 5´- GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC –3´

Methoden

60

3.31 RNA-Markierung mit Digoxigenin

Zur Markierung von RNA wurde das „DIG Northern Starter Kit“ der Firma Roche

verwendet. Bei diesem Verfahren wird eine Template-DNA von einer RNA-Polymerase

in vitro transkribiert. Die in dem Transkriptionspuffer vorhandenen DIG-dUTPs werden

in die entstehende RNA eingebaut [Feinberg & Vogelstein, 1983].

Zur Herstellung der RNA-Sonde wurde das in pBluescript II SK(+) klonierte ansB-Gen

als Matrize verwendet. Da bei der in vitro Transkription bessere Ausbeuten mit

linearisierter Template-DNA erzielt werden, wurde das ansB-Gen mit PvuII aus dem

Vektor herausgeschnitten. Die beiden PvuII-Schnittstellen liegen vor dem T3- bzw.

hinter dem T7-Promotor, so daß auf jeden Fall die beiden Promotorsequenzen

vorhanden waren. Nach der Restriktion wurde das linearisierte ansB-Fragment durch

eine Gelextraktion isoliert. Um RNase-Kontaminationen zu vermeiden wurde die

Matrizen-DNA mit Phenol/CHCl3 extrahiert und mit Ethanol gefällt. 1 µg der auf diese

Weise aufgereinigten Matrizen-DNA wurde in ein RNase-freies Reaktionsgefäß

pipettiert, mit 4 µl 5x Transkriptionspuffer und 2 µl T7-RNA-Polymerase versetzt. Mit

sterilem DMPC-behandeltem Wasser wurde auf 20 µl Gesamtvolumen aufgefüllt und

1 h bei 42 °C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden 2 µl RNase-freie DNase

zugegeben und 15 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 µl

0,2 M EDTA, pH 8,0 abgestoppt und die mRNA-Sonde bis zur weiteren Verwendung

bei -70 °C gelagert.

3.32 Northernblot-Analyse

Für die Northernblot-Analyse wurde zunächst RNA auf einem denaturierenden

Formaldehydgel aufgetrennt und nach Transfer auf eine Nylonmembran mit einer

spezifischen RNA-Sonde hybridisiert. Durch Chemiluminescenz-Detektion (mit CDP-

Star, BM) konnten hybridisierende Fragmente sichtbar gemacht werden.

15 µl Gesamt-RNA wurden mit 20 µl RNA-Ladepuffer versetzt und 10 min bei 65 °C

denaturiert. Nachdem die Proben 1 min auf Eis gestellt worden waren, wurden jeweils

Methoden

61

20 µl auf ein 1 %iges Formaldehydgel aufgetragen und 5 h bei 3 - 4 V/cm (80 V)

aufgetrennt. Der Laufpuffer wurde jeweils nach 2 h erneuert. Anschließend wurde die

RNA im Kapillarblotverfahren [Sambrook et al., 1989] auf eine positiv geladene

Nylonmembran (Boehringer Mannheim) transferiert. Die Fixierung der RNA auf die

Membran erfolgte durch eine 3 minütige Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm).

Die Prähybridisierung erfolgte für 2 h bei 68 °C mit einer gebrauchsfertigen

Hybridisierungslösung („DIG Easy Hyb“, Boehringer Mannheim) im Hybridisierungs-

ofen. Zur Hybridisierung wurden 1 µg DIG-markierte RNA 5 min bei 100 °C

denaturiert, direkt auf Eis gestellt und danach in 20 ml auf 68 °C vorgewärmte

Prähybridisierungslösung („DIG Easy Hyb“, Boehringer Mannheim) pipettiert. Nach

Entfernung der Prähybridisierungslösung wurde die Membran über Nacht bei 68 °C mit

der Hybridisierungslösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran 2 x 5 min mit

2x SSC, 0,1 % SDS bei RT und 2 x 15 min bei 68 °C mit 0,1x SSC, 0,1 % SDS

gewaschen. Zur Detektion wurde die Membran zunächst kurz in Waschpuffer gelegt

und anschließend 30 min in Blockierungslösung bei RT inkubiert. Nach 30 minütiger

Inkubation mit 10 ml Anti-DIG-Antikörperkonjugat-Lösung wurde 2 x 15 min mit

Waschpuffer gewaschen. Nachdem die Membran 5 min in Detektionspuffer equilibriert

worden war, wurde sie mit 1 ml CDP-Starlösung (Boehringer Mannheim) 5 min bei RT

inkubiert. Überschüssige CDP-Starlösung wurde entfernt und die Chemilumineszenz

auf einem Röntgenfilm (BIOMAX MR, Kodak) sichtbar gemacht.

10x MOPS

MOPS 200 mMNatriumacetat 50 mMEDTA 20 mM

pH 7,0 (mit NaOH)

RNA-Ladepuffer

Formamid 12,4 MFormaldehyd 2,2 MMOPS 1,12 xGlycerin 7,45 %Bromphenolblau 0,25 %DMPC-behandeltes dH2O 100 µl

Methoden

62

Agarosegel-Lösung

Agarose 1,5 gMOPS 125 ml37 % Formaldehyd 25 ml

Gel-Laufpuffer

MOPS 1 x

DIG Easy Hyb

20x SSC

NaCl 3 MNatriumcitrat 0,3 M

pH 7,0

Detektion

Waschpuffer

Maleinsäure 0,1 MNaCl 0,15 M

pH 7,5Tween 20 0,3 % (v/v)

Maleinsäurepuffer

Maleinsäure 0,1 MNaCl 0,1 M

pH 7,5 (mit NaOH (s))

10x Blockierungslösung

Blockierungsreagenz inMaleinsäurepuffer 10 % (w/v)

1x Blockierungslösung

1:10 Verdünnung in Maleinsäurepuffer

Anti-DIG-Antikörperkonjugat-Lösung

1:10 Verdünnung der Antikörper-Stocklösung in Blockierungslösung

Methoden

63

Detektionspuffer

Tris/HCl 0,1 MNaCl 0,1 M

pH 9,5

3.33 Überexpression der P. fluorescens Glutaminase-Asparaginase

Zur Überexpression wurde das ansB-Gen in den Expressionsvektor pASK-C [Bader,

1996] kloniert. Dieser Vektor wurde von dem Vektor pASK75 (Biometra, Göttingen)

abgeleitet.

Der Vektor pASK-C wurde für die Expression der Dihydro-orotat-Dehydrogenase

(DHODH) aus Ratte eingesetzt. Dazu wurde ein DNA Fragment, das die cDNA der

DHODH der Ratte und ein DNA-Fragment, das für 8 Histidinreste kodiert, über die

XbaI- und HindIII-Schnittstellen in den Vektor pASK 75 kloniert. Dabei wurden alle

Merkmale, die eine Regulation der Expression in pASK 75 ermöglichen [Schmidt et al.,

1994], erhalten. Die Expression von Proteinen mit dem pASK 75-Vektor steht unter

Kontrolle des tetA-Promotors. Der Operator dieses Promotors wird durch das ebenfalls

von pASK 75 kodierte Repressorprotein (TetR) blockiert. Durch Zugabe von nicht

antibiotisch wirksamen Konzentrationen an Anhydrotetrazyklin (AHT) wird der

Promotor induziert. Dadurch wird eine genaue Regulation der Expression möglich.

Abb. 3.3: Expressionsvektor pASK-C

Dieser Vektor ermöglicht die Expression eines rekombinanten Plasmids mit C-terminalen His8-tag.ori = Replikationsursprung; Ampr = β-Lactamasegen, vermittelt Ampicillin-Resistenz; DHODH =Dihydroorotat-Dehydrogenasegen; tetR = Tet-Repressorgen; Ptet = Tet-Promotor; f1-IG = intergenischeRegion des Phagen f1

XbaINdeI

DHODH (cDNA Ratte)

EcoRIHis-8HindIII

f1-IG

Amp

tetR

ori

pASK-C4490 bp

Ptet

r

Methoden

64

Zur Klonierung wurde zunächst das noch vorhandene Insert (cDNA DHODH, Ratte)

durch Restriktion mit XbaI und EcoRI aus dem Vektor pASK-C entfernt. Der Bereich,

der die 8 Histidinreste kodiert, verblieb im Vektor. Nachfolgend wurde das ansB-Gen

mit XbaI und EcoRI aus dem Vektor pB-PGA geschnitten und mit dem mit

XbaI / EcoRI geschnittenen pASK-C-Vektor ligiert. Durch diese Klonierung wurde

erreicht, daß bei der Expression am C-Terminus der rekombinanten Pf-GA ein His8tag

angehängt wird, der eine Aufreinigung über Immobilisierte-Metallchelat-Affinitäts-

Chromatographie (IMAC) erlaubt. Für die Expression wurde das erhaltene Plasmid

pASK-C/PGA in den Asparaginase-defizienten E. coli-Stamm CU1783 (=BL21Ω)

[Harms et al., 1991] transformiert. Zur Überexpression wurden zunächst 50 ml

LB Amp100-Medium mit einer Einzelkolonie BL21Ω-pASK-C/PGA angeimpft und über

Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 200 ml LB Amp100-Medium mit

2 ml der Übernachtkultur angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Durch

Zugabe von 20 µl Anhydrotetracyklin (AHT) (2 mg/ml) wurde die Expression des ansB-

Gens induziert. Die Expression erfolgte über einen Zeitraum von 5 h. Vor Induktion,

sowie 1, 2, 3, 4 und 5 h nach Induktion wurde jeweils 1 ml Kultur für ein SDS-Gel und

für Aktivitätstests aus der Kultur entnommen. Die Proben für das SDS-Gel wurden

abzentrifugiert, das Pellet in 450 µl TE-Puffer resuspendiert, mit 150 µl 4x SDS-Puffer

versetzt und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Als Kontrolle wurden

200 ml LB Amp100-Medium ebenfalls im Verhältnis 1:100 aus der Übernachtkultur

angeimpft und bei 37 °C inkubiert. Diese Kultur wurde jedoch nicht induziert. Nach der

fünfstündigen Inkubation wurden jeweils 25 ml abzentrifugiert und die Pellets bei -

20 °C für eine Reinigung gelagert.

3.34 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) dient der Auftrennung von

Proteingemischen nach ihrer Größe und somit zur Überprüfung der Reinheit von

Proteinproben. Durch die Komplexierung mit SDS erhalten die Proteine eine negative

Ladung und können in einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt werden.

Die Laufstrecke der denaturierten Proteine in dem Gel hängt von der Mobilität der SDS-

Protein-Komplexe in der Acrylamid-Matrix ab und ist proportional zum Logarithmus

Methoden

65

der Proteinmasse. Für die Elektrophorese wurde das Laemmli-Gelsystem verwendet, das

sich zur Auftrennung von Proteinen mit Massen von 30-200 kDa eignet. Bei diesem

Gelsystem werden die Proteine in einem kurzen Sammelgel bei pH 6,8 konzentriert und

anschließend in einem längeren Trenngel bei pH 8,8 aufgetrennt. Die Elektrophorese

wurde in Minigelkammern durchgeführt, in denen das Trenngel die Maße 8 x 13 cm hat.

Die Trenngel- und Sammelgellösung wurden direkt nacheinander in die Gelapparatur

gefüllt und ein Kamm in das Sammelgel gesteckt. Nachdem das Gel auspolymerisiert

war, wurde es in eine Elektrophoresekammer gestellt, mit Laufpuffer überschichtet und

der Kamm vorsichtig aus dem Gel gezogen. Die Proben wurden vor dem Auftragen im

Verhältnis 1:1 mit Probenpuffer versetzt und 5 min bei 95 °C denaturiert. Die

Auftrennung der Proben im Sammelgel erfolgte 15 min bei 80 V und im Trenngel bei

200 V 1-1,5 h. Die Elektrophorese wurde beendet, wenn die blaue Farbstoffront gerade

aus dem Gel herausgelaufen war.

Gelzusammensetzung

Sammelgel Trenngel

Acrylamidkonzentration

des Gels

12 %

Sammelgelpuffer 1250 µl ---

Trenngelpuffer --- 2500 µl

10 % SDS-Lösung 500 µl 1000 µl

Acrylamid 650 µl 4000 µl

Glycerin (87 %) --- 1000 µl

H2O (bidest) 2600 µl 1450 µl

TEMED 10 µl 25 µl

APS (10 %) 25 µl 50 µl

Trenngelpuffer

Tris/HCl 1,5 M

pH 8,8

Methoden

66

Sammelgelpuffer

Tris/HCl 0,5 M

pH 6,8

Probenpuffer

Tris/HCl 0,1 MSDS 2 %β-Mercaptoethanol 3 %Glycerin 10 %Bromphenolblau 0,01 % (w/v)

Laufpuffer

Tris 25 mMGlycin 0,19 MSDS 3,5 mM

APS 10 % (w/v)

3.35 Reinigung der rekombinanten PF-GA-His8 über IMAC

Eine schnelle und sehr effiziente Möglichkeit der Proteinreinigung stellt die

immobilisierte Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (IMAC) dar. Diese Methode

beruht auf einer sehr festen Komplexbildung eines His-tag-Proteins mit einem

Übergangsmetallion, das sehr fest an einen „Harz“ gebunden ist. Durch diese sehr

stabile Bindung können die Übergangsmetallionen auch unter extremen Chromato-

graphiebedingungen nicht ausgewaschen werden. Durch die ebenfalls sehr starke

Bindung des His8-tags mit den Metallionen können unspezifisch gebundene Proteine

leicht unter relativ stringenten Bedingungen ausgewaschen werden. Die Elution des His-

tag-Proteins erfolgt entweder durch einen pH-Gradienten (in Richtung kleinerer pH-

Werte) oder durch einen Imidazol-Gradienten. Durch pH-Absenkung werden die N-

Atome der Histidinreste protoniert, so daß die Dissoziation des Proteins von der Säule

erfolgt. Bei der Elution mit Imidazol findet eine Verdrängung der His-tag-Proteine

durch Imidazol statt, das aufgrund seiner Ähnlichkeit mit den Histidinresten um die

Koordinationsstellen konkurriert.

Methoden

67

Für kleine Mengen reinen Proteins wurden TALONspin-Säulen (Clontech, Heidelberg)

eingesetzt. Der TALON-IMAC-Harz ist ein sehr beständiger und nicht-Nickel-haltiger

IMAC-Harz. TALON enthält einen speziellen Polydentat-Metall-Chelator. Dieser

Chelator bindet das elektropositive Metallion über vier Koordinationsstellen in einer

elektronegativen Tasche. Dadurch wird ein Auswaschen der Metallionen verhindert.

Zwei weitere Koordinationsstellen sind frei zugänglich, so daß sie His-tag-Proteine

binden können.

Prozedur

Das bei der Expression erhaltene Zellpellet wurde in 2 ml Ultraschall-Puffer / 25 ml

Kultur resuspendiert und nach Zugabe von 0,75 mg/ml Lysozym 30 min bei RT

inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen. Die unlöslichen

Bestandteile wurden durch eine 10minütige Zentrifugation bei 12000 x g und 4 °C

abgetrennt. Der klare Überstand wurde auf eine TALONspin-Säule aufgetragen und das

His8-tag-Protein nach Herstellerangaben mit einem pH-Gradienten gereinigt.

Für größere Mengen Protein bzw., wenn sehr reines Protein benötigt wurde, wurde eine

FPLC-Reinigung über Ni-NTA-Agarose (Qiagen) durchgeführt. Dazu wurde eine Säule

(Name Bezeichnung; Pharmacia) mit ca. 2-3 ml Ni-NTA-Agarose gefüllt. Bevor mit der

Reinigung begonnen wurde, wurde die Säule mit 2-3 Bettvolumen Puffer A equilibriert.

Um die Eluierung des Proteins zu verbessern wurde die Säule nachfolgend mit 100 %

Puffer E 1 (= 250 mM Imidazol) gespült und erneut mit Puffer A equilibriert. Um

unspezifische Proteinbindungen von vornherein einzuschränken, wurden der

Zellrohextrakt nach Ultraschallaufschluß mit 10 mM Imidazol aufgetragen. Nach dem

Auftragen wurde die Säule mit 3-5-Bettvolumen Puffer B gewaschen, bevor die

Proteine mit einem linearen Imidazolgradienten von 20 mM - 250 mM bzw. 500 mM

eluiert wurden. Dabei wurde das Eluat fraktioniert gesammelt. Die Flußrate beim

Auftragen der Zellrohextrakte und beim Waschen betrug 0,75 ml/min. Während des

Gradienten betrug die Flußrate 0,5 ml/min. Es wurden jeweils 2 ml-Fraktionen

gesammelt. Um zu testen, in welchen Fraktionen sich die Haupt-Asparaginase-Aktivität

befand wurde ein Mikrotiterplatten-AHA-Test durchgeführt. Die Fraktionen mit der

größten Aktivität wurden durch SDS-PAGE auf ihre Reinheit untersucht.

Methoden

68

Puffer A

NaH2PO4 50 mMNaCl 300 mMImidazol 10 mM

pH 8

Puffer B


pH 8

Puffer E1


pH 8

Puffer E2


pH 8

3.36 Konjugativer Transfer von Plasmiden

Zum Transfer von Plasmiden in P. fluorescens wurde die Methode der natürlichen

Konjugation durch „diparentales mating“ angewendet. Bei dieser Methode wird ein

mobilisierbares Plasmid (mob+) von einem Donorbakterium auf ein

Repizientenbakterium übertragen. Als Donorbakterium diente der E. coli Stamm S 17-1

[Simon et al., 1983], der genetisch so verändert wurde, daß er die Transfergene des

„broad host range“ IncP-Typ Plasmids RP 4 in seinem Chromosom integriert enthielt.

Dadurch ist der Stamm in der Lage jedes gramnegative Bakterium als Empfänger für

den konjugativen DNA-Transfer zu nutzen. Als Vektorplasmid diente der

„suicide“ Vektor pOT182, welcher den „self cloning“ Vektor Tn5::OT182 enthält

[Merriman & Lamont, 1993]. Der Vektor ist abgeleitet von pSUP 102(Gm)::Tn5-B21

[Simon et al., 1989] und eignet sich für die „random“ Tn5-Mutagenese. Innerhalb des

Tn5-Elements befinden sich Gene, die Resistenz gegen Carbenicillin und Tetracyclin

Methoden

69

vermitteln. Das Plasmid pOT182 besitzt nur den ColE1-Replikationsursprung und ist

nicht in der Lage sich außerhalb von E. coli zu replizieren. Das Plasmid enthält die mob-

Erkennungsstelle und kann daher von dem Donorstamm mit hoher Frequenz in

Rezipientenstämme mobilisiert werden.

Als Rezipient diente der P. fluorescens WT Stamm (DSM), der nach erfolgreicher

Transkonjugation eine Antibiotika-Resistenz gegen Tetracyclin und Carbenicillin besaß.

Dadurch konnten Transkonjuganten auf Agarplatten, die diese beiden Antibiotika

enthielten, selektiert werden.

Von E. coli S 17-1 (pOT182) und P. fluorescens WT wurden Übernachtkulturen in LB,

Cm100 und LB angezogen. Mit diesen Kulturen wurde frisches LB, Cm100 (E. coli S 17-1

pOT182) bzw. LB-Medium (P. fluorescens) im Verhältnis 1:100 angeimpft und bei

37 °C bzw. 30 °C bis zu einer OD600 von ungefähr 0,5 inkubiert. Wenn die Zellen nicht

die gleiche OD600 besaßen, so wurde sichergestellt, daß die P. fluorescens-Zellen eine

höhere OD600 als der Donorstamm hatten. Der P. fluorescens-Rezipient und der

Donorstamm wurden in den Verhältnissen 1:1; 1:2, 1:5 und 5:2 miteinander vermischt

und die Zellen bei 5000 rpm kurz abzentrifugiert. Die Zellpellets wurden in jeweils

100 µl dH2O oder M9+Salzlösung resuspendiert. Jeweils 50 µl dieser Zellsuspension

wurden auf Cellulose-Acetat-Filter (0,2 µm Porengröße, Sartorius), die auf vorge-

wärmten LB-Agarplatten ohne Antibiotika lagen, aufgetropft und bei 30 °C über Nacht

inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit jeweils 1 ml dH2O von den Filtern

gespült und folgende Verdünnungen in dH2O angesetzt: 100 : 100 und 100 : 500.

Jeweils 100 µl von den Verdünnungen und 100 µl der unverdünnten Zellsuspension

wurden auf Selektionsplatten ausplattiert. Als Selektionsplatten wurden M9+Cb300Tet50-

M9-Cb300Tet50-Glutamat (5 mM) und M9+Cb300Tet50 γ-Glutamylhydrazid (2 mM)-

Platten verwendet. Nach dem Ausplattieren wurden die Selektionsplatten 2 - 4 Tage bei

30 °C inkubiert, bevor die einzelnen Transkonjuganten auf M9+Cb300Tet50-, M9-

Cb300Tet50-Glutamat (5 mM)und M9+Cb300Tet50 γ-Glutamylhydrazid (2 mM) - Master-

Platten umgesetzt wurden. Bevor die Mutanten auf defekte Enzyme, die am N-

Stoffwechsel beteiligt sind, getestet werden konnten, mußten sie mindestens dreimal auf

frische Selektionsplatten umgesetzt werden. Dadurch wurde sichergestellt, daß der

E. coli-Donor nicht mehr vorhanden war.

Methoden

70

Abb. 3.4. Transposon Carrier Plasmid pOT182

ori 1 = p15A Replikationsursprung; aac1 = Gentamicin-Acetyltransferase I-Gen; lacZ = β-Galaktosidase-Gen (verkürzt); bla = β-Lactamasegen; ori 2 = pBR325 Replikationsursprung; tetR = tet-Regulatorgen;tetA = Tetracyklin/H+-Antiportergen; tnp = Transpoase; mob = RP 4-Mobilisierungsregion, enthältChloramphenicol-Acetyltransferase (cat)-Gen;

3.37 Aktivitätstests

3.37.1 Bestimmung der Asparaginase-Aktivität mit L-Asparaginsäure- β-Hydroxamat

[Derst et al., 1994]

Zur Bestimmung der Asparaginase-Aktivität wurde L-Asparaginsäure-β-Hydroxamat

(AHA) als Substratanalogon eingesetzt. Die Asparaginase setzt dieses Substrat zu L-

Asparaginsäure und Hydroxylamin um. Das Hydroxylamin reagiert in mäßig alkalischer

Lösung mit 8-Hydroxychinolin im Überschuß zu einem grünen Indoxinfarbstoff. Der

Vorteil von AHA gegenüber den natürlichen Substraten Asparagin oder Glutamin liegt

in dem um den Faktor 10 höherem Km-Wert der Reaktion. Dadurch ist der Nachweis des

entstehenden Hydroxylamins wesentlich empfindlicher.

ori 1

aacC1

lacZ

bla

ori 2tetRtetA

tnp

mob

18658 bp

pOT182

Methoden

71

Reaktionsgleichung:

Abb. 3.5: Reaktionsgleichung des AHA-Tests

Der Test wurde mit lebenden Zellen durchgeführt. Da Pseudomonas ebenso wie E. coli

eine periplasmatische und eine cytosolische Asparaginase besitzt, war es wichtig, das

für den Test nur intakte Zellen verwendet wurden. Durch den Test sollte nur die

Aktivität der regulierten periplasmatischen Asparaginase gemessen werden. Durch die

Lyse von toten Zellen und der damit verbundenen Freisetzung der cytosolischen

Asparaginase, wären die Meßwerte verfälscht worden.

100 µl Zellsuspension wurden mit 10 µl 10 mM AHA versetzt und 30 min bei RT

inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurden 10 µl 12 % TCA zugegeben. Nach

Zugabe von 1 ml Oxinlösung, Erhitzen für eine Minute auf 100 °C, Abkühlen auf RT

und kurzer Zentrifugation wurde die Extinktion bei 705 nm bestimmt.

O

CH2

CO-

C H

COO-

H3N+

CNHOHO

CH2

C H

COO-

H3N+

L-AHA L-Asp

+ NH2OH

NH2OH + + OH-

8-Hydroxychinolin

+ O2

N

OH

NH

O

N

'

N

OH

N

OH

Methoden

72

3.37.2 Mikrotiterplatten-AHA-Test

Für die Aktivitätsbestimmung der Mutanten wurde dieser Test zur Durchführung in

Mikrotiterplatten modifiziert. Dazu wurden 100 µl M9--Glutamat-Medium in jedes Well

vorgelegt und jeweils mit einer Einzelkolonie inokuliert. Die Platte wurde auf einem

Inkubationsschüttler bei 30 °C inkubiert und die OD600 alle 60 min bestimmt. Sobald

die Bakterien die exponentielle Phase erreicht hatten, wurden 10 µl 10 mM AHA

zugegeben und weitere 30 min bei 30 °C inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl

Oxinlösung wurde die Platte 10-15 min bei RT stehengelassen und anschließend die

Extinktion bei 655 nm im ELISA-Reader gemessen.

Bei beiden Testverfahren wurde jeweils eine Positiv- und eine Negativkontrolle

durchgeführt.

Für die Negativkontrolle wurde P. fluorescens WT in M9+-Medium angezogen, da die

periplasmatische Asparaginase durch Glucose reprimiert wird [Klöppner, 1999]. Da die

Asparaginase durch Glutamat induziert wird [Klöppner, 1999], wurde als Positiv-

kontrolle P. fluorescens WT in M9--Glutamat-Medium angezogen. Als Leerwert dient

reine Oxinlösung.

AHA-Lösung

L-Asparaginsäure-β-Hydroxamat

in 50 mM MOPS 10 mM

pH 7,0

MOPS

MOPS in dH2O 50 mM

pH 7,0

Na2CO3-Lösung

Na2CO3 in dH2O 1 M

Methoden

73

Oxin-Lösung

2 % Hydroxychinolin

in Ethanol 25 %

1 M Na2CO3 75 %

TCA-Lösung

TCA in dH2O 12 %

M9+Medium

= M9-Minimalmedium

M9--Glutamat-Medium

M9-Medium ohne Ammoniumchlorid und ohne Glucose, aber mit 5 mM

Glutamat

3.37.3 Glutamatbestimmung mit Glutamat-Dehydrogenase, Diaphorase undTetrazoliumsalzen

Diese Glutamatbestimmung beruht auf der Umsetzung von L-Glutamat durch die

Glutamat Dehydrogenase (GlDH) zu α-Ketoglutarat in Anwesenheit von NAD.[Beutler,

H.O. & Michal,G., 1974] Das entstehende NADH setzt dann in Gegenwart des Enzyms

Diaphorase INT zu einem rotem Formazan um, dessen Extinktion im sichtbaren Bereich

bei 490 nm gemessen wird. Die Reaktionsgleichungen für diese Umsetzung lauten:

( )

( ) FormazanNADHINTNADH

HNHNADHatKetoglutarOHNADGlutamatL

Diaphorase

GlDH

+ →++

+++− →++−

++

++

2

1 32 α

Durch die Rückoxidation (2) des in der ersten Reaktion gebildeten NADH, wird die

ungünstige Gleichgewichtslage der Reaktion (1) nach rechts verschoben. Dabei wird die

Methoden

74

GlDH im Überschuß eingesetzt, um einen vollständigen Umsatz des Glutamats zu

gewährleisten.

Um den Test für eine sehr große Anzahl von Pseudomonas-Mutanten

(Bakterienkulturen) praktikabel zu machen, wurde die ursprüngliche Versuchsvorschrift

von Beutler & Michal [Beutler & Michal, 1975] so modifiziert, daß der Test in 96-Well-

Plates (Mikrotiterplatten) durchgeführt werden konnte.

Für die Bestimmung der Glutamatabbaufähigkeit wurden die Bakterien in M9--

Glutamat-Medium angezogen. Dabei betrug die Glutamat-Konzentration im Medium

0,8 mM. Damit die Bakterien besser anwuchsen, wurde dem Medium 1 mM Glucose

zugesetzt.

300 µl M9--Glucose-Medium wurden pro Well in einer Mikrotiterplatte vorgelegt, jedes

Well mit einer Bakterienkolonie inokuliert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Das

Wachstum der Bakterien wurde durch eine OD600-Messung direkt nach dem Animpfen

und nach der Übernachtinkubation kontrolliert. Von diesen Übernachtkultur-Platten

wurden 50 µl aus jedem Well in eine neue Mikrotiterplatte überführt. In dieser Platte

wurden vorher folgende Lösungen in jedes Well vorgelegt:

20 µl β-NAD+

20 µl INT

200 µl Triethanolamin-Phosphat-Puffer

Nach Zugabe von 5 µl Diaphorase wird die Extinktion bei 490 nm im ELISA-Reader

(Biorad) bestimmt. Durch diese Messung wird der Nullwert der Reaktion bestimmt, da

das INT lichtempfindlich ist und schon nach kurzer Zeit eine rote Farbe aufweist. Nach

dieser Messung wurden in jedes Well 5 µl GlDH zugegeben und die Platte 15 min im

Dunkeln bei RT stehengelassen. Danach wird in 3 Minuten-Abständen die Extinktion

bei 490 nm im ELISA-Reader bestimmt. Je stärker die Rotfärbung war, desto weniger

Glutamat wurde umgesetzt.

Triethanolamin-Phosphat-Puffer

Triethanolamin 0,08 M

Kaliumphosphat 0,02 M

pH 8,6

Methoden

75

(a) 1,86 g Triethanolaminhydrochlorid in dH2O lösen mit ca. 4,4 ml 2 M

KOH auf pH 8,6 einstellen, 0,63 ml Triton X-100 zugeben und mit dH2O

auf 100 ml auffüllen.

(b) 0,86 g K2HPO4 und 7 mg KH2PO4 in 100 ml dH2O lösen

20 ml (a) + 5 ml (b)

β-NAD-Lösung

β-NAD in dH2O 6,7 mM

(bei 4 °C 2 Wochen haltbar)

Iodnitrotetrazoliumchlorid (INT) Lösung

INT in dH2O 1,19 mM

(bei 4 °C im Dunkeln 3 Monate haltbar)

Diaphorase

Diaphorase in dH2O 1 mg/ml

Glutamat-Dehydrogenase (GlDH)

GlDH in 50 % Glycerin 5 mg/ml

3.37.4 Gekoppelter optischer Test

Mit dieser Methode läßt sich direkt der Umsatz an natürlichem Substrat Asparagin über

die Detektion der entstehenden Ammoniumionen ermitteln. In Gegenwart eines hohen

Überschusses des Enzyms Glutamat-Dehydrogenase kann man die Abnahme von

NADH bei 340 nm, gemäß folgender Reaktion, verfolgen:

++ ++ →++− NADOHGlutamatNADHNHatKetoglutar GlDH24α

Methoden

76

Der Extinktionskoeffizient beträgt 6220 l cm-1 mol-1.

Mit diesem Test kann außerdem die Umsatzrate weiterer Substrate des Enzyms ermittelt

werden.

Der Nachweis wurde in Mikrotiterplatten bei einem Gesamtvolumen von 300 µl

durchgeführt. zu 268 µl Puffer-Substratlösung wurden 10 µl α-Ketoglutarat, 10 µl

NADH/ADP-Lösung und 2 µl Glutamat-Dehydrogenase gegeben. Die Reaktion wurde

durch Zugabe von 10 µl Asparaginase gestartet und die Abnahme an NADH mittels

eines Mikrotiterplattenlesegerätes und des Computerprogramms „PC-Kinetik-Collector“

(Biorad) direkt am PC verfolgt.

Puffer

Natriumacetat 100 mMMOPS 100 mM

pH 5,0

α-Ketoglutarat-Lösung

α-Ketoglutarat in H2O 240 mM

pH 7,0

NADH/ADP-Lösung

NADH 10 mMADP 50 mMin H2O frisch angesetzt

Glutamat-Dehydrogenase

GlDH in 50 % Glycerin 1,3 U/µl

Substrate

L-Asparagin-Stammlösung 20 mM

D-Asparagin-Stamlösung 20 mM

L-Glutamin-Stammlösung 20 mM

Methoden

77

3.38 Mikrotiter-Glycerinstock-Platten

Um das Wachstum von Pseudomonas-Mutanten auf verschiedenen Medien zu

untersuchen, wurden Bakterien in 96-Well-Plates (steril, Greiner) in M9--Medium mit

Glutamat (5 mM) oder Asparagin (5-10 mM) angezogen. Dazu wurden 270 µl M9--

Medium in jedes Well pipettiert und mit einer Bakterienkolonie inokuliert. Nach

Wachstum bei 30 °C über Nacht wurde die OD600 bestimmt, pro Well 80 µl 87%iges

Glycerin zugegeben und die Platte bei -86 °C eingefroren.

3.39 Umstempeln von Bakterienkolonien

Zur Überprüfung der Fähigkeit der Pseudomonas-Mutanten auf verschiedenen AS zu

wachsen, wurden die Bakterien mit einem speziell für 96-Well-Plates konstruierten

Replica-Plater von den Glycerinstock-Platten auf die gewünschte M9+Platte gestempelt.

Der Replica-Plater besteht aus Edelstahlschrauben, die in einer Metallplatte befestigt

sind. Dabei entsprechen die Anzahl und die Abstände der Schrauben denen einer 96-

Well-Platte. Mit diesem Stempel kann das Koloniemuster der Glycerinstock-Platten als

Positivabdruck auf entsprechende Agarplatten übertragen werden.

Dazu wurde der Replica-Plater, nachdem er in der Flamme sterilisiert worden war, in

eine Glycerinstock-Platte getaucht. Dabei darf die Platte nicht vollständig auftauen.

Nachdem an jedem „Zacken“ des Stempels etwas von dem entsprechendem

Glycerinstock haften geblieben war, wurde der Stempel auf eine M9--Agarplatte, die die

entsprechende Aminosäure enthielt, gesetzt. Diese Platten wurden über Nacht bei 30 °C

inkubiert und Kolonien, die nicht angewachsen waren am nächsten Tag identifiziert.

3.40 Selektion auf γ-Glutamylhydrazid-Platten

Zur Selektion von Bakterien, die kein Glutamat abbauen oder in die Zelle transportieren

können, wurden γ-Glutamylhydrazid-Platten eingesetzt. Dazu wurden die Bakterien auf

M9+Cb300Tet50 γ-Glutamylhydrazid-Platten ausplattiert. Da das γ-Glutamylhydrazid ein

Methoden

78

toxisches Substratanalogon des Glutamats (Aspartats) ist, können nur Zellen auf diesen

Platten überleben, welche einen Defekt entweder im Glutamat-Transportsystem oder in

einem Glutamat-abbauenden Enzym haben. Sobald die Zellen das γ-Glutamylhydrazid

aufnehmen und abbauen können, wird Hydrazin bzw. ein Hydrazinium-Ion freigesetzt

(s. Abb. 3.6), welches extrem toxisch ist, und zum Tod der Zelle führt.

Abb. 3.6: Zersetzung von γ-Glutamlhydrazid

+ H2O + H3N-NH2

+C

O

HOC

O

N

HNH2

NH2

NH2

O

CHO

O

CO -

C

O

HOC

O

OH + H2N-NH2

NH2H

NC

HO

O

C

+ H2ONH2

NH2

O

Ergebnisse

79

4 Ergebnisse

Zur Untersuchung der Aminosäure-Verwertung sollten Enzyme identifiziert und

kloniert werden, die am Abbau und Transport der Aminosäuren Asparagin, Aspartat,

Glutamin und Glutamat beteiligt sind. Zu den wenigen bekannten Enzymen, die an der

Verwertung der genannten Aminosäuren beteiligt sind, gehören die Glutaminasen-

Asparaginasen. Da von einigen Asparaginasen die Gene bereits kloniert wurden, bot es

sich an, zunächst nach einer Glutaminase-Asparaginase in P. fluorescens zu suchen, sie

zu klonieren und zu sequenzieren. Anschließend wurde mit Hilfe der Transposon-

Mutagenese versucht, weitere Enzyme, die am Abbau und Transport von Asparagin,

Aspartat, Glutamin und Glutamat beteiligt sind, zu identifizieren.

4.1 Herstellung einer λZAP-Express Genbank von P. fluorescens

Zur Herstellung einer λZAP-Express Genbank wurde zunächst aus 25 ml einer

P. fluorescens Übernachtkultur mit einer Genomic-tip 500/G-Säule genomische DNA

isoliert. Die DNA wurde mit Sau3AI statistisch geschnitten. Die Restriktionsansätze,

die hauptsächlich DNA-Fragmente im Größenbereich von 9-12 kb enthielten, wurden

einer Dichtegradientenzentrifugation unterworfen. Nach Tropfendialyse gegen TE-

Puffer, DNA-Fällung und analytischem Agarosegel, wurden die Fraktionen mit DNA-

Fragmenten im Bereich von 9-12 kb bestimmt. Diese wurden mit dem BamHI-

geschnittenen λZAP-Armen ligiert und in Phagenhüllen verpackt. Die hergestellte

Genbank hatte einen Titer von 2,2 x 108 pfu/ml.

4.2 Herstellung einer DIG-markierten Asparaginase-Sonde

Durch PCR mit degenerierten Asparaginaseprimern (AsnFor und AsnBack), die

aufgrund von Sequenzhomologien bekannter Asparaginasegene synthetisiert wurden,

wurde mit P. fluorescens DNA als Template ein 266 bp großes DNA-Fragment

erhalten. Grundlage für die Primer waren zwei hochkonservierte Bereiche zwischen den

Aminosäuren T-9 und A-14 sowie zwischen H-87 und M-92 (E. coli-Numerierung). Es

Ergebnisse

80

wurden degenerierte Primer erstellt, um die Wahrscheinlichkeit der Anlagerung an

entsprechende homologe Sequenzen der Pseudomonas DNA zu erhöhen. Das erhaltene

Fragment wurde über die durch die Primer eingeführten Schnittstellen für BamHI und

EcoRI in den Vektor pBluescript SK(+) kloniert und in kompetente E. coli XL1Blue

Zellen transformiert. Es wurde ein positiver Klon erhalten, aus dem das Plasmid 1/22

isoliert und sequenziert wurde. Ein Vergleich (BLASTN, BLASTP) der Sequenz von

1/22 mit in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte Homologien zu dem ansB-Gen

aus E. coli, zu dem von der Proteinsequenz abgeleiteten Glutaminase-Asparaginasegen

aus Pseudomonas sp.7A sowie zu einigen anderen bekannten Asparaginasen aus

verschiedenen Organismen. Die gefundenen Übereinstimmungen sind in den Tabellen

4.1 und 4.2 zusammengefaßt.

Tabelle 4.1: Übereinstimmungen der Sonde mit konservierten Asparaginase-Bereichen

Organismus Aminosäuresequenz um T-9 bis A-14*

E. coli LPNITILA TGGTIA GGGD

P. fluorescens LANVVILA TGGTIA GAGA

P. sp 7A LANVVILA TGGTIA GAGA

Aminosäuresequenz um H-87 bis M-92*

E. coli DGFVIT HGTDTM EETAY

P. fluorescens DGIVIT HGTDTL

P. sp. 7A DGIVIT HGTDTL EETAY

*) Numerierung bezieht sich auf die E. coli Sequenz

P. sp. 7A = Pseudomonas sp. 7A

Dabei muß berücksichtigt werden, daß die DNA-Sequenz der Pseudomonas sp. 7A

Glutaminase-Asparaginase (PGA) von der Aminosäuresequenz abgeleitet wurde. Da die

PGA nur als Protein isoliert und gereinigt worden ist, wurde eine Proteinsequenzierung

durchgeführt. Die abgeleitete DNA-Sequenz ist daher nicht zu 100 % korrekt. Dennoch

beweist die sehr große Ähnlichkeit auf Proteinebene, daß die klonierte Sonde eine

Teilsequenz der gesuchten Asparaginase aus P. fluorescens enthält. Dies wurde durch

weitere Übereinstimmungen auf Proteinebene mit Asparaginasen aus E. chrysanthemi,

B. subtilis, A. glutaminasificans und S. cerevisiae bestätigt.

Ergebnisse

81

Tabelle 4.2: Übereinstimmungen der Sonde mit Asparaginasen auf DNA- und Protein-ebene

Übereinstimmungen mit der Asparaginase-Sonde auf Proteinebene

Ähnlichkeit* Identität*

AnsB (E. coli) 77 % 51 %

PGA (Pseudomonas sp.7A) 95 % 87 %

Übereinstimmungen mit der Asparaginase-Sonde auf DNA-Ebene

ansB (E. coli) 63 % 66 %

ansB (Pseudomonas sp.7A) 76 % 75 %

*) Die Angaben beziehen sich auf die gesamte Sequenz der Sonde.

Aufgrund der erhaltenen Sequenz wurden die für P. fluorescens spezifischen Primer

PR 1 und PR 2 erstellt. Mit diesen Primern wurde aus dem Plasmid 1/22 über PCR eine

spezifische DIG-markierte Asparaginase-Sonde mit einer Länge von 211 bp hergestellt.

4.3 Klonierung des Asparaginasegens aus P. fluorescens

Nachdem die Ausbeute der DIG-Markierung abgeschätzt und die Sondenkonzentration

optimiert worden war, wurde die λZAP-Express Genbank mit der Sonde durchsucht.

Dazu wurden auf 20 große (ø 150 mm) NZY Topagar Platten 5000 pfu/ml der Genbank

ausplattiert und nach Inkubation Membranabdrücke genommen. Die Membranabdrücke

der Plaques wurden mit der Sonde hybridisiert und detektiert. Obwohl der Hintergrund

relativ hoch war, wurden einige Plaques ausgestochen, auf kleine (ø 90 mm) NZY

Topagarplatten ausplattiert und erneut mit der Sonde hybridisiert. Dabei wurden von

jeder Platte zwei Membranabdrücke genommen, um sicherzugehen, daß nicht durch

unspezifische Reaktionen der Sonde mit der Membran nicht-positive Plaques erhalten

wurden. Die erhaltenen positiven Plaques wurden bis zur Homogenität vereinzelt, so

daß nur noch positive Plaques auf einer Platte verblieben. Die positiven Plaques wurden

aus den Platten ausgestochen und die Inserts aus den Phagen durch eine „in vivo

excision“ direkt in das pBK-CMV-Plasmid überführt. Von den erhaltenen Plasmiden

wurden einige sequenziert.

Ergebnisse

82

Die erhaltene DNA-Sequenz des Plasmids pBK-PGA sowie die daraus abgeleitete

Proteinsequenz ergaben große Homologien zu bereits bekannten Asparaginasen. Dabei

zeigte der Vergleich mit der Glutaminase-Asparaginase (PGA) aus Pseudomonas sp.7A

mit 84,8 % Übereinstimmung auf Proteinebene die größte Homologie. Der Vergleich

der Proteinsequenzen ergab außerdem, daß ca. 45 Aminosäuren am N-terminalen Ende

fehlten. Eine genauere Analyse der DNA-Sequenz zeigte eine interne Sau3AI-

Schnittstelle bei Aminosäure 59 (E. coli-Numerierung). Durch diese natürlich

vorhandene Sau3AI-Schnittstelle war das Gen bereits unvollständig bei der

Genbankherstellung in die Phagenarme ligiert worden. Auch die Sequenzierung

weiterer subklonierter Inserts lieferte das gleiche Ergebnis.

Da die Wahrscheinlichkeit relativ groß war, daß auch weitere aus der Genbank

erhaltene Klone interne Sau3AI-Schnittstellen aufwiesen, wurde der noch fehlende Teil

der Sequenz mit Hilfe der „Genome Walker PCR“ ermittelt. Diese Methode ermöglicht

die Amplifizierung von DNA-Bereichen, die stromaufwärts oder stromabwärts von

einem bereits bekannten Genabschnitt liegen. Dazu wurden aus genomischer DNA von

P. fluorescens durch Restriktion mit DraI, PvuII, SspI, EcoRV und ScaI fünf Genom-

Bibliotheken angelegt, die jeweils Fragmente aus der entsprechenden Restriktion

enthielten. Die DNA-Fragmente wurden mit den Adaptern ADA 1 und ADA 2 ligiert.

Durch eine anschließende PCR mit einem spezifischen Adapterprimer ADP und dem

genspezifischen Primer PR 2 wurden aus der PvuII- und der SspI-Bank Fragmente von

ca. 700 bp und 750 bp erhalten. Es wurden noch weitere Fragmente erhalten. Diese

waren jedoch zu klein oder enthielten zu wenig DNA, so daß sie nicht sequenziert

wurden. Das PvuII- und das SspI-Fragment wurden aus einem Agarosegel isoliert,

aufgereinigt und von Primer PR 2 aus sequenziert. Die Länge der erhaltenen Sequenzen

betrug 649 bp (PvuII-Fragment) und 640 bp (SspI-Fragment). Abgesehen von den 9 bp,

um die das PvuII-Fragment größer war, stimmten die beiden Sequenzen vollständig

überein. Die beiden Sequenzen enthielten den noch fehlenden vorderen Bereich des

Asparaginasegens sowie noch 295 bp (PvuII-Fragment) stromaufwärts vom

Translationsstart. Aufgrund der gewonnenen Sequenzinformation wurden die zwei

genspezifischen Primer PSGA 1 und PSGA 2 synthetisiert, mit denen das gesamte Gen

über PCR amplifiziert wurde. Der Primer PSGA 1 liegt 34 bp stromaufwärts vom ATG-

Startcodon und enthält eine natürlich vorkommende Xba I-Schnittstelle. Der Primer

PSGA 2 liegt 89 bp stromabwärts vom Stopcodon und enthält eine künstliche EcoRI-

Ergebnisse

83

Schnittstelle. Über diese beiden Schnittstellen wurde das amplifizierte Fragment in den

Vektor pBluescript SK(+) kloniert, wodurch das Plasmid pB-PGA erhalten wurde. Eine

Sequenzierung des Plasmids ergab eine 100%ige Übereinstimmung mit der aus der

Genbank erhaltenen Sequenz und mit der Sequenz, die aus der Genome Walker PCR

ermittelt worden war. Die Gesamtsequenz der P. fluorescens Glutaminase-Asparaginase

(Pf-GA), sowie die Bereiche, die durch die „Genome Walker PCR“ erhalten wurden,

und der Bereich hinter dem P. fluorescens ansB-Gen sind in Abbildung 4.1 dargestellt.

Demnach ist das ansB-Gen 1086 bp groß. Das von dieser Sequenz abgeleitete Protein

besteht aus 362 Aminosäuren.

Ergebnisse

84

1 AACGACAGGGCATCTGCCCCACCGTCAAACACGCCTGCATGAATATTCCATCATGGTTTT 61 CGGACAACCGAACGCAATAGCCCCTCACTGTTCGGAAAGCCGGACAAACGCCCCTCAGCC 121 CCACCTGCAAAAACCAATATAAGTTGTTTTAAATCAACACGTTAATTTATATGTTCGGCC

-24 -12 +1 181 ACCATCAGCCT GGTACAAATCCTGCTCTTTCTCAGCACCTCGCGGCATTCAGAATCGCCC

PSGA 1 RBS 241 GGGTGTTCTAGATGAACCTGCTACCGCACTCATCAAAAACCAGAGAGAAAAATAATGAAA G C S R * T C Y R T H Q K P E R K I MM KK 2

301 TCTGCACTGAAAACCTTCGTTCCGGGCGCCCTAGCCCTACTGCTGCTGTTCCCCGTTGCT S A L K T F V P G A L A L L L L F P V A 22 GSP 3 361 GCCCAGGCAAAGGAAGTCGAAACCAAGACCAAGCTGGCCAACGTGGTGATTCTCGCCACC A Q A K E V E T K T K L A N V V I L A T 42

PR 1 421 GGCGGGACCATTGCCGGCGCCGGCGCCAGCGCCGCCAACAGCGCCACCTACCAGGCGGCC G G T I A G A G A S A A N S A T Y Q A A 62

PR 1 481 AAGGTCGGTATCGAGCAATTGATCGCCGGTGTTCCTGAGCTTAGCCAGATCGCCAATGTC K V G I E Q L I A G V P E L S Q I A N V 82

GSP 2 541 CGCGGCGAGCAAGTGATGCAAATTGCGTCCGAGAGCATCAACAACGAAAACCTTCTGCAG R G E Q V M Q I A S E S I N N E N L L Q 102

GSP 2 PR 2 601 TTGGGTCGCCGAGTAGCCGAACTGGCTGACAGCAAGGACGTGGACGGCATCGTTATCACC L G R R V A E L A D S K D V D G I V I T 122 PR 2 661 CACGGTACCGACACCCTCGAAGAAACCGCTTACTTCCTGAACCTTGTGGAAAAGACCGAC H G T D T L E E T A Y F L N L V E K T D 142 721 AAGCCAATCATCGTCGTCGGTTCAATGCGTCCTGGTACCGCCATGTCGGCTGACGGCATG K P I I V V G S M R P G T A M S A D G M 162 781 CTCAACCTGTACAACGCCGTGGCTGTCGCCGGCAGCAAAGACGCTCGCGGCAAGGGTGTA L N L Y N A V A V A G S K D A R G K G V 182 841 CTGGTCACCATGAACGATGAGATCCAATCGGGTCGCGACGTCAGCAAAATGATTAACATC L V T M N D E I Q S G R D V S K M I N I 202 901 AAGACCGAAGCATTCAAAAGCCCGTGGGGCCCGTTGGGCATGGTCGTTGAAGGCAAATCC K T E A F K S P W G P L G M V V E G K S 222 961 TATTGGTTCCGCTTGCCTGCCAAGCGGCACACCATGGATTCCGAGTTCGACATCAAGACC Y W F R L P A K R H T M D S E F D I K T 242 1021 ATCAAAAGCCTGCCAGACGTGGAAATCGCCTACGGCTACGGCAACGTGAGCGACACCGCC I K S L P D V E I A Y G Y G N V S D T A 262 1081 GTCAAGGCCCTGGCCCAGGCCGGTGCCAAAGCCATCATCCATGCCGGCACCGGCAATGGT V K A L A Q A G A K A I I H A G T G N G 282 1141 TCGGTGTCTTCCAAAGTCGTCCCTGCCCTGCAGGAACTGCGCAAGCAAGGCGTGCAAATC S V S S K V V P A L Q E L R K Q G V Q I 302 1201 ATTCGCTCTTCCCACGTGAATGCCGGCGGTTTCGTTCTGCGTAATGCTGAACAGCCTGAC I R S S H V N A G G F V L R N A E Q P D 322 1261 GACAAGTACGACTGGGTTGTCGCACACGACCTTAACCCACAGAAAGCCCGCATTCTGGCA D K Y D W V V A H D L N P Q K A R I L A 342 1321 ATGGTTGCCCTGACCAAGACCCAGGACAGCAAAGAATTGCAACGGATGTTCTGGGAATAT M V A L T K T Q D S K E L Q R M F W E Y 362 1381 TGATTGTTGGTGACACCGGTAGAGGCGGGCTTGCTTGCCTCTACTTCCCCGCTCGCCCCT * L L V T P V E A G L L A S T S P L A P -

PSGA 2 1441 CGCTACACATTCCCCGCGCGACACCCGCTGTCTGAATGGACCGTCAAAACCAACTGGCTT

Abb. 4.1 DNA- und Proteinsequenz der P. fluorescens Glutaminase-Asparaginase

Die Consensus-Sequenzen des σ54-abhängigen Promotors (-24 / -12) sind fett gedruckt und unterstrichen. DerTranskriptions- und Translationstartpunkt sind fett gedruckt. Das Signalpeptid ist grau unterlegt und Reste mitkatalytischer Funktion sind eingerahmt. Folgende Primer sind durch Pfeile gekennzeichnet: PR1 und PR2(=Sondenprimer), PSGA1 und PSGA2 (Primer zur Amplifizierung des Gens durch PCR), GSP1 und GSP2(zusammen mit PR2; Primer zur Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes durch 5´RACE (vgl. 4.10)).

Ergebnisse

85

4.4 Analyse des ansB-Gens

Ein Vergleich der Aminosäuresequenz mit der Glutaminase-Asparaginase aus

Pseudomonas sp. 7A und AnsB aus E. coli ergab Identitäten von 85 % und 49 %. Die

Ähnlichkeit beträgt 88 % und 58 %. Weitere Übereinstimmungen mit bekannten

Asparaginasen des Typs II sind in Tabelle 4.3 und 4.4 zusammengefaßt.

Tabelle: 4.3 Übereinstimmung mit der Pf-GA auf DNA-Ebene

Mikroorganismus Gen Ähnlichkeit[%]

Identität[%]

Länge derÜbereinstimmung

[bp]E. coli ansB 57 57 980

Wollinella succinogenes ansA 59 59 750Erwinia chrysanthemi asn 59 59 962

Saccharomyces cerevisiae asp1 61 61 272Bacillus licheniformis ansA 65 65 107

Bacillus subtilis ansA 60 60 104

Tabelle:4.4 Übereinstimmung mit der Pf-GA auf Proteinebene

Mikroorganismus Protein Ähnlichkeit[%]

Identität[%]

Länge derÜber-

einstimmung[AS]

Pseudomonas sp. 7A PGA 88 85 337Acinetobacterglutaminasificans

Glutaminase-Asparaginase

70 63 330

E. coli L-Asparaginase II 58 49 330W. succinogenes Asparaginase 58 48 327E. chrysanthemi L-Asparaginase 56 46 349S. cerevisiae intrazelluläres Isozym

der L-Asparaginase46 35 331

B. licheniformis Asparaginase 41 30 321B. subtilis L-Asparaginase 42 31 177

Das Alignment in Abbildung 4.2 zeigt einen Vergleich der Pf-GA mit bekannten

Asparaginasen des Typs II. Wie das Alignment zeigt, ist die Pf-GA den anderen

bekannten L-Asparaginasen in ihrer Sequenz sehr ähnlich. Die größten

Übereinstimmungen finden sich mit der PGA aus Pseudomonas sp. 7A. Diese große

Ähnlichkeit ist sicher auf die nahe Verwandtschaft der beiden Pseudomonas-Stämme

zurückzuführen. Die Aminosäurereste, in denen die Pf-GA nicht mit der PGA

Ergebnisse

86

Abb. 4.2: Vergleich der abgeleiteten P. fluorescens Glutaminase-Asparaginase-Sequenz mit

Aminosäuresequenzen von L-Asparaginasen des Typs II

1 T-12 Y-25Pf-GA MKSALKTFVP GALALLLLFP VAAQA KEVET KTKLANVVIL ATGGTIAGAG ASAANSATYQPGA .......... .......... ..... KEVEN QQKLANVVIL ATGGTIAGAG ASAANSATYQEcAnsB .......... .MEFFKKTAL AALVMGFSGA ALA LPNIT IL ATGGTIAGGG DSATKSN.YTAGA .......... .......... .......... ... KNNVVIV ATGGTIAGAG ASSTNSATYSWA .......... .......... .......... . MAKPQVTIL ATGGTIAGSG ESSVKSS. YSErA .........M ERWFKSLFVL VLFFVFTASA ADKLPNIV IL ATGGTIAGSA ATGTQTTGYK

61 S-58 120Pf-GA AAKVGIEQLI AG VPELSQIA NVRGEQVMQI ASESINNENL LQLGRRVAEL ADSKDVDGI VPGA AAKVGVDKLI AG VPELADLA NVRGEQVMQI ASESITNDDL LKLGKRVAEL ADSNDVDGI VEcAnsB VGK VGVENLV NAVPQLKDIA NVKGEQVVNI GSQDMNDNVW LTLAKKIN.. TDCDKTD GFVAGA AAKVPVDALI KA VPQVNDLA NIT GIQALQV ASESITDKEL LSLARQVNDL VKKPSVNGVVWA AGAVTVDKLL AA VPAINDLA TIK GEQISSI G SQEMTGKVW LKLAKRVNEL LAQKETEAVIErA AGALGVDTLI NA VPEVKKLA NVKGEQFSNM ASENMTGDVV LKLSQRVNEL LARDDVDGVV

D-90 121 T-89 180Pf-GA ITHGTDTLEE TAYFLNLVEK T DKPIIV VGS MRPGTAMSAD GMLNLYNAVA VAGSKDARGKPGA ITHGTDTLEE TAYFLDLTLN T DKPIVVVGS MRPGTAMSAD GMLNLYNAVA VASNKDSRGKEcAnsB ITHGTDTMEE TAYFLDLTVK CDKPVVMVGA MRPSTSMSAD GPFNLYNAVV TAADKASANRAGA ITHGTDTMEE TAFFLNLVVH TDKPIVLVGS MRPSTALSAD GPLNLYSAVA L ASSNEAKNKWA ITHGTDTMEE TAFFLNLTVK SQKPVVLVGA MRPGSSMSAD GPMNLYNAVN VAINKASTNKErA ITHGTDTVEE SAYFLHLTVK S DKPVVFVAA MRPATAI SAD GPMNLLEAVR VAGDKQSRGR

181 K-162 240Pf-GA GVLVTMNDEI QSG RDVSKMI NIKTEA FKS. PWGPLGMVVE GKSYWFRLPA KRHTMDSEFDPGA GVLVTMNDEI QSG RDVSKSI NIKTEA FKS. AWGPLGMVVE GKSYWFRLPA KRHTVNSEFDEcAnsB GVLVVMNDTV LDGRDVTKTN TTDVATFKSV NYGPLGYIHN GKIDYQRTPA RKHTSDTPFDAGA GVMVLMNDSI FAA RDVTKGI NIHTHA FVS. QWGALGTLVE GKPYWFRSSV KKHTNNSEFNWA GVVIVMNDEI HAA REATKLN TTAVNAFASP NTGKIGTVYY GKVEYFTQSV RPHTLASEFDErA GVMVVLNDRI GSA RYITKTN ASTLDTFKAN EEGYLGVIIG NRIYYQNRID KL HTTRSVFD

241 N-248 300Pf-GA IKTIK..S LP D VEIA YGYGN VSDTAVKALA QAGAKAIIH A GTGNGSVSSK VVPALQELR.PGA IKQIS..S LP QVDIA YSYGN VTDTAYKALA QNGAKALIHA GTGNGSVSSR LTPALQTLR.EcAnsB VSKLN..E LP K VGIV YNYAN ASDLPAKALV DAGYDGIVS A GVGNGNLYKS VFDTLATAA.AGA IEKIQGDA LP GVQIV YGSDN MMPDAYQAFA KAGVKAIIH A GTGNGSMANY LVPEVRKLHDWA ISKIE..E LP R VDIL YAHPD DTDVLVNAAL QAGAKGIIH A GMGNGNPFPL TQNALEKAA.ErA VRGLT..S LP K VDIL YGYQD DPEYLYDAAI QH GVKGIVY A GMGAGSVSVR GIAGMRKAM.

301 E-283 360Pf-GA KQ GVQII RSS HVNAGGFVLR NAEQPDDKYD WVVAHDLNPQ KARILAMVAL TKTQDSKELQPGA KT GTQII RSS HVNQGGFVLR NAEQPDDKND WVVAHDLNPE KARILVELAM VKTQDSKELQEcAnsB KT GTAVVRSS RVPTG.ATTQ DAEVDDAKYG FVASGTLNPQ KARVLLQLAL TQTKDPQQIQAGA EQ GLQIVRSS RVAQG.FVLR N AEQPDDKYG WIAAHDLNPQ KARLLMALAL TKTNDAKEIQWA KS GVVVARSS RVGSG.STTQ EAEVDDKKLG FVATESLNPQ KARVLLMLAL TKTSDREAIQErA EK GVVVIRST RTGNG.IVPP DE ELPG.... .LVSDS LNPA HARILLMLAL TRTSDPKVIQ

361 366Pf-GA RMFWE YPGA RIFWE YEcAnsB QIFNQ YAGA NMFWN YWA KIFST YErA EYFHT Y

gelb: Reste mit katalyt. Funktion; rot: konservierte AS; fett gedruckt = erste Aminosäure des (reifen) Proteins; Pf-GA =P. fluorescenes WT GA; PGA = Pseudomonas sp.7A-GA, EcAnsB = E. coli Asparaginase II; AGA = A. glutaminasificans-Asparaginase; ErA = E. chrysanthemi-Asparaginase; WA = W. succinogenes-Asparaginase; Signalpeptide sind unterstrichen

Ergebnisse

87

übereinstimmt, sind meistens sehr ähnlich (Austausch von Isoleucin gegen Leucin und

Isoleucin gegen Valin) oder zumindest ähnlich (Austausch von Valin gegen Leucin) in

ihren Eigenschaften, so daß dadurch wahrscheinlich keine größeren

Strukturunterschiede auftreten. Im folgenden bezieht sich die Numerierung der

Aminosäuren auf die E. coli-Asparaginase II. Alle Aminosäuresequenzen enthalten

zwischen Threonin-9 und Alanin-14 die gleiche Aminosäuresequenz TGGTIA.

Ebenfalls hochkonserviert ist die Region um Aspartat-90 (THGTDT). Auch weitere

hochkonservierte Bereiche stimmen mit den anderen Asparaginasen überein. Alle Reste,

denen aufgrund von Untersuchungen an der Asparaginase II aus E. coli (AnsB)

katalytische Funktionen zugeordnet wurden [Wehner et al., 1994], sind bis auf

Asparagin-248 in der Pf-GA konserviert. Diese Reste sind in der Abbildung 4.2 gelb

unterlegt.

4.5 Identifizierung eines Signalpeptids der Pf-GA

Der Vergleich der Aminosäuresequenz der Pf-GA und der PGA aus

Pseudomonas sp. 7A zeigt, daß die Pf-GA-Sequenz 24 Aminosäuren länger ist. Auch

die von ansB abgeleitete Aminosäuresequenz ist länger.

Das Alignment in Abbildung 4.2 zeigt, daß die Aminosäuresequenzen bis Aminosäure-

22 (E. coli-Numerierung) nicht übereinstimmen. Bei einigen Sequenzen fehlt der

vordere Bereich ganz. Von AnsB ist bekannt, daß es sich um ein periplasmatisches

Enzym handelt. Periplasmatische Proteine erhalten während ihrer Synthese im Cytosol

sogenannte Signalsequenzen. Diese Sequenzen sorgen dafür, daß die Proteine, teilweise

schon während ihrer Synthese, ins Periplasma transportiert werden. Dort werden die

Signalsequenzen von Signalpeptidasen abgespalten. Die Signalsequenz von AnsB ist

bekannt. Sie umfaßt 22 Aminosäuren. Die Schnittstelle für die Signalpeptidase liegt

zwischen Alanin-22 und Leucin-23. Aufgrund der Sequenzhomologien mit AnsB sowie

der Tatsache, daß durch proteinchemische Untersuchungen eine Asparaginase-Aktivität

im Periplasma von P. fluorescens nachgewiesen werden konnte [Klöppner, 1999], wird

vermutet, daß es sich bei der klonierten Pf-GA ebenfalls um ein periplasmatisches

Enzym handelt. Deshalb wurde der vordere Bereich der Sequenz nach Schnittstellen für

Signalpeptidasen durchsucht. Dazu wurde das Programm „Signalseq“ (HUSAR, DKFZ

Ergebnisse

88

Heidelberg) angewandt. Dieses Programm berechnet aufgrund der von „von Heijne“

aufgestellten Regeln und Wahrscheinlichkeitstabellen Schnittstellen von

Signalpeptidasen in Signalsequenzen [von Heijne, 1986]. Tatsächlich befand sich hinter

Alanin-25 eine Schnittstelle für Signalpeptidasen. Das daraus resultierende Signalpeptid

von 25 Aminosäuren zeigt die typischen Eigenschaften, die alle zur Zeit bekannten

Signalpeptide besitzen [von Heijne, 1986]. Es ist zwischen 13 und 36 Aminosäuren lang

und besitzt in der Nähe des aminoterminalen Endes mindestens einen positiv geladenen

Rest (Lysin). Das Zentrum des Peptids wird von mehreren stark hydrophoben Resten

gebildet. Die Aminosäuren -3 und -1 vor der Schnittstelle besitzen kleine neutrale

Seitenketten. Ein Vergleich der Pf-GA-Signalsequenz mit der Asparaginase aus E. coli

(AnsB) ist in Abbildung 4.3 dargestellt.

10 20 25

Pf-GA M K S A L K T F V P G A L A L L L L F P V A A Q A ↓ K E VAnsB M E F F K K TA L A A L V M G F S G A A L A ↓ L P N

Abb. 4.3: Signalsequenzen der Pf-GA und der Asparaginase II (AnsB) aus E. coli

Die Sequenz der reifen Pf-GA beginnt also erst bei Aminosäure 26. Wie das Alignment

in Abbildung 4.2 zeigt, stimmt ab diesem Lysin-Rest die Sequenz mit der Sequenz der

PGA aus Pseudomonas sp. 7A sehr gut überein. Der Grund für das Fehlen der

Signalsequenz in der PGA aus Pseudomonas sp. 7A ist, daß diese Sequenz aufgrund

einer Aminosäuresequenzierung erhalten wurde. Im Folgenden wird die Numerierung

der Pf-GA bei diesem Lysin-Rest mit 1 beginnen.

4.6 Vergleich der von dem ansB-Gen aus P. fluorescens erhaltenenSequenz mit der Aminosäuresequenz des nativ gereinigtenProteins

Die abgeleitete Sequenz der ersten 10 Aminosäuren der Pf-GA (KEVETKTKLA; vgl.

Abb. 4.1) stimmt auch vollständig mit der Aminosäuresequenz einer Asparaginase

überein, die aus dem P. fluorescens Wildtypstamm gereinigt wurde, aus dem auch das

ansB-Gen kloniert wurde [Klöppner, 1999]. Diese Übereinstimmung mit dem aus dem

Periplasma nativ gereinigten Enzym bestätigt die Vermutung, daß es sich bei der

Ergebnisse

89

GG(-24)GC(-12)

TSXbaI

Signalpeptid

ansBAgeI TS

Signalpeptid

endX

klonierten Pf-GA um ein periplasmatisches Enzym handelt. Das gereinigte Enzym wird

durch Glutamat, Asparagin und Glutamin als einziger C- und N-Quelle induziert und

durch Ammoniumchlorid und Glucose reprimiert [Kloeppner, 1999].

4.7 Identifizierung eines Endonukleasegens

Eine Restriktionsanalyse des aus der Genbank erhaltenen Plasmids pBK-PGA zeigte,

daß das Insert in dem pBK-CMV-Phagemid (pBK-PGA) ca. 2,5 kb groß war. Deshalb

wurde mit einem weiteren Primer, der stromabwärts von dem ansB-Gen hybridisierte,

eine zusätzliche Sequenzierung durchgeführt. Es wurden noch ca. 1650 bp sequenziert.

In diesem Bereich wurde nach weiteren offenen Leserahmen gesucht. 447 bp

stromabwärts vom ansB-Stopcodon wurde ein vollständiger offener Leserahmen von

687 bp gefunden. Das von dieser Sequenz abgeleitete Protein besteht aus 229

Aminosäuren. Datenbankvergleiche mit Hilfe der Programme BLASTN, BLASTP,

BLASTX und TBLASTN (HUSAR; DKFZ Heidelberg) zeigten sowohl auf DNA- als

auch auf Proteinebene Ähnlichkeiten zu extrazellulären DNasen aus

Aeromonas hydrophila und Vibrio cholerae, zur Endonuclease I aus E. coli und zu einer

Nuclease aus E. chrysanthemi. Die Ähnlichkeiten mit den genannten Enzymen betragen

zwischen 65 und 67 % auf DNA-Ebene und zwischen 39 und 45 % auf Proteinebene.

Die Identitäten liegen zwischen 65 und 67 % auf DNA- und zwischen 34 und 40 % auf

Proteinebene, wobei die Länge der übereinstimmenden Sequenzen zwischen 203 und

217 Aminosäuren beträgt. Deshalb wurde das Gen mit endX, für eine Endonuklease mit

noch nicht bekannter Funktion, bezeichnet. Die DNA- und Proteinsequenz des endX-

Gens, sowie ein Vergleich mit den oben genannten Nukleasen sind in den Abbildungen

A.1 und A.2 im Anhang dargestellt. Die Genkarte in Abbildung 4.4 zeigt die Lage der

beiden Gene zueinander auf dem Chromosom.

Abb. 4.4: Genkarte des ansB- und endX-Gens

TS = Transkriptionsstartpunkt; GG (-24) und GC (-12) = Consensus-Sequenzen des σ54-Promotors

Ergebnisse

90

4.8 Überexpression und Reinigung der rekombinanten Pf-GA-His8

Die proteinchemischen Untersuchungen der Pf-GA wurden stets mit lebenden Zellen

durchgeführt. Obwohl der angewendete Aktivitätstest mit L-Asparatat-β-hydroxamat

(AHA) spezifisch für die periplasmatische Asparaginase ist, können Ungenauigkeiten

nicht ganz ausgeschlossen werden. Eine weitere cytosolisch lokalisierte Asparaginase

könnte die Aktivitätsbestimmung des periplasmatischen Enzyms verfälschen, wenn

Zellen während oder vor der Messung absterben. Bei der nachfolgenden Lyse der Zellen

würde die cytosolische Asparaginase freigesetzt und könnte mit dem AHA-Substrat

reagieren und dadurch die Meßwerte verfälschen.

Für eine genaue Charakterisierung wurde versucht, die Pf-GA in einen

Überexpressionsvektor zu klonieren. Als Expressionsvektor wurde das Plasmid pASK-

C [Bader et al., 1996] gewählt. Dieser Vektor ist so konstruiert, daß ein „Histidintag“

aus 8 Histidinresten während der Expression an das C-terminale Ende des Proteins

angehängt wird. Dadurch wird eine Reinigung über „immobilisierte Metallchelat-

Affinitäts-Chromatographie“ (IMAC) ermöglicht. Die Klonierung ergab das Plasmid

pASK-C/PGA (s. Abb. 4.5). Die Expression erfolgte wie in Abschnitt (Methodenteil)

beschrieben. Zur Überprüfung der Expression wurde jeweils vor Induktion, sowie 1, 2,

3, 4 und 5 h nach Induktion Proben aus der Kultur entnommen und auf einem SDS-Gel

aufgetrennt. Parallel dazu wurden Proben aus einer Kontrollkultur, die nicht induziert

worden war, entnommen und ebenfalls auf dem SDS-Gel aufgetragen. Abbildung 4.6

zeigt das Ergebnis der SDS-PAGE. Auf dem Gel ist die Überexpression eines Proteins

mit einer Masse etwas oberhalb von 36 kDa deutlich zu sehen. Aufgrund der von der

DNA-Sequenz abgeleiteten Proteinsequenz für die Pf-GA wurde eine Masse von

38,7 kDa berechnet. Allerdings ist auch in der nicht-induzierten Kontrollkultur eine,

wenn auch schwächere, Expression des Proteins zu erkennen. Das bedeutet, daß der

Promotor nicht vollständig von dem Repressor blockiert war. Obwohl dadurch die

Expression nicht unter optimalen Bedingungen induziert werden konnte, war die

Überexpression der Pf-GA zufriedenstellend. Gereinigt wurde die überexprimierte Pf-

GA zunächst über TALONspin-Säulen, wobei das Protein mit einem pH-Gradienten

eluiert wurde. Allerdings enthielt die auf diese Weise gereinigte Pf-GA noch geringe

Verunreinigungen. Deshalb wurde zusätzlich eine FPLC-Reinigung über Ni-NTA-

Agarose durchgeführt.

Ergebnisse

91

Abb. 4.5: Expressionsvektor pASK-C/PGA

ori = Replikationsursprung; Ampr = β-Lactamasegen, vermittelt Ampicillin-Resistenz; ansB = ansB-Gen;tetR = Tet-Repressorgen; Ptet = Tet-Promotor; f1-IG = intergenische Region des Phagen f1

Mit Hilfe dieses Verfahrens ließ sich das Protein durch Elution mit 500 mM Imidazol

sauber erhalten. Auf dem SDS-Gel in Abbildung 4.7 ist das gereinigte Protein, sowie

das Pellet und der Überstand des Ultraschallaufschlusses gezeigt. Zusätzlich wurden

noch Proben von vor der Induktion und nach 5 h Expression aufgetragen.

GS 0 h 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h

K E K E K E K E K E K E

Abb. 4.6: Überexpression der rekombinanten Pf-GA-His8

GS = Größenstandard; 0, 1, 2, 3, 4, 5 h = Expressionsdauer; K = Kontrollkultur;E = Expressionskultur

4536

2924

20

14

kDa

Pf-GA

XbaI

ansB

EcoRI

His-8HindIII

f1-IG

Amp

tetR

ori

pASK-C/PGA

Ptet

r

Ergebnisse

92

GS 0h 5h P ÜS R

Abb.4.7: Überexpression und Reinigung der rekombinanten Pf-GA-His8

GS =Größenstandard; 0 h = vor Induktion; 5 h = nach 5 h Expression; P = Pellet nachUltraschallaufschluß; ÜS = Überstand nach Ultraschallaufschluß; R = gereinigtes Protein

4.9 Bestimmung der Substratspezifität der rekombinanten Pf-GA-His8

Um zu testen, ob die rekombinante Pf-GA die gleiche Substratspezifität und Aktivität

wie das nativ gereinigte Enzym besaß, wurden gekoppelte Aktivitätstests mit L-

Asparagin, D-Asparagin und L-Glutamin als Substrate durchgeführt. Bei diesem Test

werden die bei der Pf-GA-Reaktion entstehenden Ammoniumionen direkt weiter mit α-

Ketoglutarat, NADH und einem Überschuß Glutamat-Dehydrogenase zu Glutamat

umgesetzt. Dabei wird die Abnahme des NADH durch Extinktionsmessung bei 340 nm

verfolgt. Für die Bestimmung der Substratspezifität wurden jeweils 18 mM der

Substrate mit 10 µl gereinigter Pf-GA-His8, 8 mM α-Ketoglutarat, 333 µM NADH und

2,6 units Glutamat-Dehydrogenase umgesetzt. Die drei Substrate werden alle von der

rekombinanten Pf-GA umgesetzt, aber mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Setzt

man die Umsatzrate von L-Asparagin gleich 100 %, so erhält man für Glutamin eine

Umsatzrate von 141 % und für D-Asparagin von 46 %. Diese Werte stimmten sehr gut

mit den Umsatzraten des nativ gereinigten Enzyms, von 100 % für L-Asparagin, 40 %

für D-Asparagin und 150 % für L-Glutamin überein [Kloeppner, 1999]. Dadurch wurde

die Identität der beiden Enzyme noch einmal bestätigt.

66 kDa

45 kDa

36 kDa

29 kDa

24 kDa

20 kDa

14 kDa

Pf-GA

Ergebnisse

93

4.10 Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes des ansB-Gens

Um den Transkriptionsstartpunkt des ansB-Gens zu bestimmen, wurde eine 5´-RACE

durchgeführt. Dazu wurde aus einer P. fluorescens-Übernachtkultur Gesamt-RNA

isoliert. Mit dem genspezifischen Primer PR 2, der auch für die DIG-Markierung der

Asparaginase-Sonde eingesetzt wurde, synthetisierte man mit einer Reversen

Transkriptase einen cDNA-Strang. Der Primer PR 2 wurde deshalb gewählt, da er

einerseits den DNA-Bereich abdeckt, der über dem hochkonservierten

Aminosäurebereich H-87 / M-92 liegt, so daß er sehr spezifisch ist. Andererseits

entstand dadurch eine cDNA, die mindestens 360 bp lang war. Dadurch wurde

gewährleistet, daß man bei den nachfolgenden PCRs ein DNA-Fragment erhielt, das

groß genug und deshalb auf Agarosegelen gut zu identifizieren war. Nach Abbau der

RNA und Aufreinigung des cDNA-Stranges, wurde am 3´-Ende mit Hilfe einer

Terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase eine Oligo-dC-Ankersequenz angehängt.

Mit einem zweiten genspezifischen Primer GSP 2, der 35 bp stromaufwärts von PR 2

hybridisiert, und einem spezifischen Ankerprimer AAP für die Oligo-dC-Sequenz

wurde die Zweitstrangsynthese und Amplifizierung der cDNA durchgeführt. Durch eine

weitere PCR mit dem Primer GSP 3, der 170 bp stromaufwärts von GSP 2 mit der

cDNA hybridisierte und einem abgekürzten universellen Ankerprimer AUAP, wurde

die cDNA noch einmal amplifiziert. Über die durch die Primer eingeführten

Restriktionsschnittstellen XbaI (GSP 3) und SalI (AUAP) wurde das erhaltene PCR-

Fragment in den Vektor pBluescript SK (+) kloniert und sequenziert. Über

Sequenzvergleiche mit pBluescript SK (+) und dem ansB-Gen wurde der

Transkriptionsstartpunkt 79 bp stromaufwärts vom ATG-Startcodon identifiziert. Der

Transkriptionsstartpunkt und die DNA-Bereiche, mit denen die eingesetzten Primer

hybridisieren, sind in Abbildung 4.1 dargestellt.

4.11 Promotoridentifizierung

Nachdem der Transkriptionsstartpunkt eindeutig bestimmt worden war, wurde in dem

stromaufwärtsliegenden DNA-Bereich nach Consensus-Sequenzen für Promotoren

gesucht. Solche Consensus-Sequenzen werden von den σ-Untereinheiten der RNA-

Polymerasen erkannt und ermöglichen die Anlagerung der RNA-Polymerase an die

Ergebnisse

94

DNA. Es gibt verschiedene RNA-Polymerasen, die sich nur in der Größe ihrer σ-

Untereinheit unterscheiden. Die allgemeine Untereinheitenstruktur von RNA-

Polymerasen ist: α2ββ´σ. Die in Prokaryoten am häufigsten auftretende RNA-

Polymerase besitzt eine σ70-Untereinheit. Diese Untereinheit erkennt Consensus-

Sequenzen in der Region um die Positionen -10 (= TATAAT) und -35 (= TTGACA).

Eine Untersuchung der stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt liegenden DNA-

Region ergab jedoch keine Übereinstimmung mit -10 und -35 Consensus-Sequenzen für

die σ70-RNA-Polymerase. Eine weitere RNA-Polymerase der Prokaryoten besitzt eine

σ54-Untereinheit und bindet an Promotoren, deren Consensus-Sequenz sich stark von

denen der σ70-Promotoren unterscheiden [Collado-Vides et al., 1991]. Diese σ54-

Promotoren wurden kommen seltener als σ70-Promotoren vor, wurden aber schon bei

vielen vor allem an der Stickstoff-Fixierung beteiligten Genen identifiziert. Die σ54-

Promotoren besitzen zwei hochkonservierte Motive bei -24 (GG) und -12 (GC). Auch

der Bereich zwischen diesen Motiven ist genau definiert [Fischer et al., 1994; Beynon

et al., 1983; Thöny et al., 1989]. Eine Untersuchung der P. fluorescens DNA-Sequenz

stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt zeigte eine 100 %ige Übereinstimmung

mit -24/-12-Regionen bekannter σ54-Promotoren. Dieser Bereich erfüllte alle

Sequenzbedingungen für einen σ54-Promotor [Beynon et al., 1983; Ausubel F.M.,1984].

In Abbildung 4.8 ist dieser Sequenzbereich des ansB-Gens von P. fluorescens

dargestellt.

Abb. 4.8: Consensus-Sequenzen und Promotorbereich des P. fluorescens ansB-Gens

nif-Promotor-Consensus*: CTGG - N8 - CTGCA N9 Py

-24 -12 +1

ansB-Consensus: ACCATCAGCCTGGTACAAATCCTGCTCTTTCTCAGC

-35 -10 +1

Vgl. σ70-Promotor: TCTTGACAT - N11-15 - TATAAT -N5-8 - (ACGT)**

Abb.: Vergleich der P. fluorescens ansB-Promotorsequenz mit der Consensus-Sequenz von σ54-Promotoren und mit der σ70-Consensus-Sequenz aus E. coliPy = Pyrimidinbase* Diese -24/-12-Consensus-Sequenz beruht auf Untersuchungen von nif-Promotorsequenzen vonK. pneumoniae [Beynon et al., 1983].** An der Stelle +1 können alle Basen auftreten.

Ergebnisse

95

4.12 Bestimmung der ansB-Tanskriptgröße durch Northernblot-Analyse

Um festzustellen, ob das ansB-Gen monocistronisch oder zusammen mit dem

Endonukleasegen abgelesen wird, das 447 bp stromabwärts von dem ansB-Gen liegt,

wurde eine Northernblot-Analyse durchgeführt. Außerdem wurde untersucht, ob

verschiedene Kulturmedien die Expression des ansB-Gens induzieren oder reprimieren.

Dazu wurden sowohl von P. fluorescens (DSM WT), als auch von P. putida Kulturen in

M9+ (M9-Minimalmedium mit 18,6 mM NH4Cl und 22 mM Glucose) und M9--

Glutamat-Medium (M9-Minimalmedium ohne NH4Cl, ohne Glucose aber mit 5 mM

Glutamat) angezogen und die Gesamt-RNA isoliert. Gleiche Mengen RNA wurden

unter denaturierenden Bedingungen auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine

Nylonmembran transferiert und mit einer ansB-spezifischen RNA-Sonde hybridisiert.

Zur Herstellung der RNA-Sonde wurde das in pBluescript II SK(+) klonierte ansB-Gen

(Plasmid pB-PGA) verwendet. Das ansB-Gen wurde mit PvuII so aus dem Plasmid

geschnitten, daß noch größere Bereiche Plasmid-DNA mit den T7- und T3-

Promotorsequenzen auf dem ansB-Fragment lagen. Dieses DNA-Fragment wurde

isoliert, aufgereinigt und als Template für die in vitro-Transkription mit gleichzeitiger

DIG-Markierung eingesetzt. Die durch die in vitro-Transkription vom T3-Promotor

hergestellte mRNA entsprach dem natürlichen Transkript des ansB-Gens. Da mit dieser

Sonde kein spezifisches Hybridisierungssignal erwartet wurde, konnte diese Sonde nur

als Negativkontrolle eingesetzt werden. Die RNA-Sonde, die durch Transkription vom

T7-Promotor aus hergestellt wurde, war komplementär zu dem natürlichen Transkript

und wurde als spezifische Sonde für die Hybridisierung eingesetzt. Die Hybridisierung

erfolgte unter hochstringenten Bedingungen bei 68 °C in DIG Easy Hyb-Lösung

(Boehringer Mannheim). In mehreren Experimenten wurde eine hybridisierende Bande

von ca. 1,2 kb identifiziert (s. Abb. 4.9), wie sie bei einer monocistronischen

Transkription des ansB-Gens erwartet wurde. Wie das Bild des Northernblots zeigt

(Abb. 4.9), ist das Hybridisierungssignal mit der RNA, die aus der M9--Glutamat-

Kultur gewonnen wurde, sehr stark. Das Signal mit der RNA aus der M9+-Kultur ist

dagegen sehr schwach. Bei P. putida war bei der RNA aus M9--Glutamat ein schwaches

und bei der RNA aus der M9+-Kultur kein Hybridisierungssignal sichtbar. Da jeweils

gleiche RNA-Mengen auf das Gel aufgetragen wurden, bestätigt die unterschiedliche

Ergebnisse

96

Signalstärke die Regulation, die aufgrund von proteinchemischen Untersuchungen

bereits vermutet wurde [Klöppner, 1999].

Abb. 4.9: Northernblot

Als Template wurden jeweils gleiche Mengen Gesamt-RNA aus P. fluorescens WT bzw. P. putida WTeingesetzt. Die mRNA-Sonde entsprach der „anti-sense“-mRNA des P. fluorescens WT ansB-Transkripts. Die Hybridisierung erfolgte unter stringenten Bedingungen bei 68 °C. GS = RNA-Längenstandard I (BM); 1 = P. fluorescens-RNA aus M9+-Kultur; 2 = P. fluorescens-RNA aus M9--Glu-Kultur; 3 = P. putida-RNA aus M9+-Kultur; 4 = P. putida-RNA aus M9--Glu-Kultur

4.13 Nachweis der σ54-Abhängigkeit des ansB-Gens

Die gefundenen -24 / -12-Sequenzen stimmen zwar mit bereits bekannten σ54-

Promotoren überein, dennoch sind sie kein eindeutiger Beweis für eine σ54-

Abhängigkeit des Promotors. Um eine σ54-Promotoraktivität zu bestätigen wurden

Aktivitätstests mit einer RpoN (= σ54)-defizienten Mutante des P. putida-Stammes

KT2440 (P. putida KT2440rpoN) [Köhler et al., 1989] durchgeführt. Als

Vergleichsstämme dienten der Stamm P. putida KT2440 WT, P. fluorescens WT sowie

der Biokontrollstamm P. fluorescens Pf 5. In beiden P. fluorescens-Stämmen wurde

bereits eine PF-GA-Aktivität nachgewiesen. Bevor der Beweis mit der RpoN-

defizienten Mutante durchgeführt werden konnte, mußte zunächst sichergestellt werden,

GS 1 2 3 4

10000

6000

4000

3000

2000

1500

1000

500

Ergebnisse

97

daß in dem Stamm P. putida KT2440 eine Glutaminase-Asparaginase-Aktivität

vorliegt. Dazu wurde der Stamm in M9+- und M9--Glutamat-Medium angezogen und

ein Aktivitätstest mit AHA durchgeführt. Es wurde eine GA-Aktivität nachgewiesen.

Dabei war die Aktivität im M9--Glutamat-Medium induziert und im M9+-Medium nicht

induziert. Die Regulation entsprach also der der anderen untersuchten Pseudomonaden.

Die Stämme P. fluorescens WT, Pf 5, P. putida KT2440 und P. putida KT2440rpoN

wurden jeweils in M9+- und M9--Medium angezogen und die Asparaginase-Aktivitäten

in der exponentiellen Wachstumsphase mit AHA bestimmt. Dazu wurden jeweils

mehrere Messungen in der exponentiellen Wachstumsphase durchgeführt. Bei jeder

Messung wurde gleichzeitig die OD600 bestimmt. Die erhaltenen relativen spezifischen

Aktivitäten sind in Abbildung 4.10 dargestellt. Wie die Abbildung zeigt, wird die

Asparaginase-Aktivität in P. fluorescens WT, Pf 5 und P. putida KT2440 durch

Glutamat induziert und durch Ammoniumchlorid/Glucose nicht induziert. Die

Aktivitätsunterschiede können auf die Unterschiedlichkeiten der Organismen

zurückgeführt werden. Bei der Mutante P. putida KT2440rpoN ist die Regulation

vollständig ausgeschaltet. Zusätzlich beweist das Experiment die Regulation der Pf-GA.

Sie wird durch Glucose und Ammoniumchlorid nicht induziert und durch Glutamat als

einziger C- und N-Quelle induziert.

Abb. 4.10: relative spezifische GA-Aktivität verschiedener Pseudomonas-Stämme.

M9+ = M9-Minimalmedium (enthält 22,2 mM Glucose und 18 mM NH4Cl); M9-Glu = M9-Minimalmedium ohne Glucose, ohne NH4Cl aber mit 5 mM Glutamat; PF = P. fluorescens; PP =P. putida; rpoN- = rpoN-defiziante Mutante des P. putida KT2440-Stammes; Die spezifische Aktivitätdes P. putida KT2440 WT-Stammes in M9-Glu-Medium wurden auf 100 % gesetzt und alle anderen aufdiesen Wert bezogen.

020406080

100120140160180

PFWT PPWT Pf 5 PPKT2440 PPKT2440rpoN-

Stamm

rel.s

pez.

Akt

ivitä

t M9+

M9-Glu

Ergebnisse

98

4.14 Identifizierung weiterer Asparaginase-Gene in anderenPseudomonas-Stämmen

Um festzustellen, ob auch eindeutig wachstumsfördernde Pseudomonaden (PGPB) das

ansB-Gen besitzen, wurden mit verschiedenen wachstumsfördernden und

pflanzenpathogenen Pseudomonas-Stämme (vgl. Tabelle 4.5) eine PCR mit den Pf-GA-

spezifischen Primern PSGA1 und PSGA2 durchgeführt.

Tabelle 4.5: Pseudomonas Stämme, mit denen die PCR durchgeführt wurde

wachstumsfördernde Stämme pflanzenpathogene Stämme

P. fluorescens Pf-5 P. syringae pv glycinea (XV16) WT

P. fluorescens W24 P. syringae pv glycinea PG 4180N9

P. fluorescens W34 P. syringae pv tomato (DC 3000)

P. fluorescens (GSPB 230) P. syringae syringae

P. putida II 232

P. chlororaphis I 112

Dazu wurde aus Übernachtkulturen genomische DNA präpariert und als Template in

der PCR eingesetzt. Für die PCRs wurden zunächst die gleichen Bedingungen gewählt,

wie für den P. fluorescens WT. Wenn dabei keine Amplifikate erhalten wurden, wurden

die Hybridisierungstemperaturen herabgesetzt (48 °C; 54 °C anstelle von 53 °C; 58 °C).

a) b)

Abb.11 a, b: PCR mit wachstumsfördernden Pseudomonas Stämmen

a) M1 = λ-Hind III-Marker; Pf5 = P. fluorescens Pf5; P.chl. = P. chlororaphis; T = Template-DNA; M2 = 100 bp Leiter plus;b) M1 = 100 bp Leiter plus; W24 = P. fluorescens W24

Ergebnisse

99

Außerdem wurden die Template- und Mg2+-Ionenkonzentrationen variiert. Unter diesen

Bedingungen zeigten nur die Stämme P. fluorescens Pf-5, P. fluorescens W24 und

P. chlororaphis eine Bande von ca. 1300 bp erhalten. In Abbildung 11 a und b sind die

amplifizierten Banden dargestellt.

4.15 Klonierung und Analyse eines ansB-Gens aus P fluorescens Pf 5

Die bereits beschriebenen Untersuchungen wurden an einem P. fluorescens-Wildtyp-

Stamm durchgeführt. Im Hinblick auf Besiedlungsstudien und Anwendbarkeit auf

Kulturflächen außerhalb des Labors ist es sinnvoll zu untersuchen, ob die gefundenen

Gene / Enzyme auch in sogenannten Biokontrollstämmen vorkommen.

Ein gut untersuchter Biokontrollstamm ist der von Corbell und Loper beschriebene

P. fluorescens-Stamm Pf-5 [Corbell & Loper, 1995].

Da die Ähnlichkeit/Identität der Pf-GA und der PGA aus Pseudomonas sp. 7A sehr

groß war, wurde vermutet, daß die Ähnlichkeit zwischen dem P. fluorescens WT und

Pf 5 sowohl auf Protein- als auch auf DNA-Ebene ebenfalls hoch ist. Deshalb wurde mit

den spezifischen P. fluorescens-ansB-Primern PSGA 1 und PSGA 2 und genomischer

DNA aus Pf 5 als Template eine PCR durchgeführt. Wobei die gleichen

Hybridisierungstemperaturen gewählt wurden wie bei P. fluorescens WT. Man erhielt

ein ca. 1,3-1,4 kb großes DNA-Fragment, das in den Vektor pBluescript SK(+) kloniert

wurde. Das erhaltene Plasmid pB-Pf5-PGA wurde nach Restriktionsanalyse sequenziert.

Die erhaltene DNA-Sequenz stimmt zu 82 % mit der ansB-Sequenz aus P. fluorescens

WT überein und die von dieser Sequenz abgeleitete Proteinsequenz stimmt zu 90 % mit

der Pf-GA überein. Ein Teil des Vergleichs dieser beiden Sequenzen auf Proteinebene

ist in Abbildung 4.12 dargestellt.

Auch diese Asparaginase besitzt ein Signalpeptid (s. Abb. 4.12). Um die Regulation, die

aufgrund von proteinchemischen Untersuchungen von den gleichen Faktoren wie bei

der Pf-GA abzuhängen scheint, zu bestätigen, wurde eine Northernblot-Analyse des

Gens durchgeführt. Dazu wurden Pf 5-Zellen in M9+- und M9--Glutamat-Medium

angezogen und Gesamt-RNA isoliert. Nach Auftrennung auf einem denaturierenden

Formaldehydgel und Transferierung auf eine Nylonmembran wurde mit der für die Pf-

GA spezifischen T7-mRNA-Sonde hybridisiert.

Ergebnisse

100

Wie beim P. fluorescens-WT wurde mit der RNA, die aus der M9--Kultur gewonnen

wurde, ein, wenn auch schwaches, Signal erhalten. Mit der RNA aus dem M9+-Medium

ergab sich kein Hybridisierungssignal (nicht gezeigt).

. . . . . . 61Pf5-GA MKSALKTFVPGALALLLLFPVAAQAKEVETKTKLANVVILATGGTIAGAGASAANSATYQA |||| |.| ||||||||| | | |||| ||. ||.|||:||||||||||||||||||||||Pf-GA MKSAFKSFAPGALALLLLLPAALQAKEAETQQKLSNVVVLATGGTIAGAGASAANSATYQA . . . . . . 122Pf5-GA AKVGIEQLIAGVPELSQIANVRGEQVMQIASESINNENLLQLGRRVAELADSKDVDGIVIT ||||||||||||:|||||:||||||.||||||||| |||||||||||||||||||||||||Pf-GA AKVGIEQLIAGIPELSQLANVRGERVMQIASESITNENLLQLGRRVAELADSKDVDGIVIT . . . . . . 183Pf5-GA HGTDTLEETAYFLNLVEKTDKPIIVVGSMRPGTAMSADGMLNLYNAVAVAGSKDARGKGVL |||||||||||||||||||||||:|||||||||||||||||||||||||||||.|||||||Pf-GA HGTDTLEETAYFLNLVEKTDKPIVVVGSMRPGTAMSADGMLNLYNAVAVAGSKNARGKGVL

Abb. 4.12: Aminosäuresequenzvergleich der Pf5-GA mit der Pf-GA (vorderer Teil)

Pf5-GA = Proteinsequenz der Asparaginase aus P. fluorescens Pf-5; Pf-GA = Proteinsequenz der GA desP. fluorescens WT; Die Signalpeptide sind grau unterlegt; die erste Aminosäure des reifen Proteins ist fettgedruckt

4.16 Erzeugung von Mutanten durch Zufalls-Tn5-Mutagenese

Um einerseits die Pf-GA in P. fluorescens durch eine „Knock-out“-Mutation zu

inaktivieren und andererseits weitere Enzyme zu identifizieren, die an der Verwertung

von Asparagin, Aspartat, Glutamat und Glutamin beteiligt sind, wurde eine Zufalls-

Transposon-Mutagenese durchgeführt. Als Transposonvektor diente das von dem

Transposon Tn5-B21 [Simon et al., 1989] abgeleitete Transposon Tn5-OT182

[Merriman & Lamont, 1993]. Die Konjugation wurde als „diparentales Mating“ mit

E. coli S 17-1 (pOT182) (vgl. Abb. 3.4) als Donor und P. fluorescens WT als Rezipient

durchgeführt. Zum Screenen nach Mutanten, die Defekte in einem Enzym hatten, das

am Abbau der oben genannten Aminosäuren beteiligt ist, wurden die Mutanten nach

Verlust des Donors auf verschiedene Minimalmedienplatten umgesetzt, die bestimmte

Aminosäuren enthielten. Außerdem wurden gezielt Aktivitätstests durchgeführt.

Ergebnisse

101

4.17 Suche nach Mutanten mit Defekten im Abbau der AminosäurenGlutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat

Die Suche nach Mutanten mit einem derartigen Defekt, erwies sich als schwierig. Da es

sich bei allen gesuchten Enzymen um abbauende Enzyme handelte, war eine gezielte

Selektion nicht möglich. Da P. fluorescens und P. putida die stickstoffhaltigen

Aminosäuren Asn, Gln, Glu, Asp sowohl als Kohlenstoff- als auch als Stickstoffquelle

nutzen können [Kloeppner, 1999] wurde zunächst nach Mutanten gesucht, die nicht

mehr in der Lage sind, auf einer oder mehreren der genannten Aminosäuren als einziger

C- und N-Quelle zu wachsen. Zur Selektion von Transkonjuganten wurden die Zellen

nach der Konjugation zunächst auf M9+Cb300Tet50-Platten ausplattiert. Nach Anlegen

von „Masterplates“, wurden die Transkonjuganten mit einem Lederberg-Samt-Stempel

auf M9-Cb300Tet50-Platten umgesetzt. Diese enthielten jeweils eine der Aminosäuren

Asparagin, Aspartat, Glutamin, und Glutamat in der Konzentration von 10 mM als

einzige C- und N-Quelle. Nach Inkubation von 1-2 Tagen bei 30 °C wurde auf den

Platten nach Mutanten gesucht, die nicht mehr wuchsen. Mit dieser Methode wurden

jedoch keine Mutanten eindeutig identifiziert.

4.18 Gezielte Selektion

Die zuvor durchgeführte Selektion war darauf ausgelegt, alle Transkonjuganten zu

selektieren. Daher wurden bei jeder Konjugation sehr viele Mutanten erhalten. Die

weitere Suche nach Mutanten, die auf einer der Aminosäuren Aspartat, Asparagin,

Glutamat und Glutamin als einziger C- und N-Quelle nicht mehr wachsen konnten,

beruhte auf der Wachstumsfähigkeit auf den entsprechenden Aminosäuren. Dabei war

es teilweise schwierig zu erkennen, ob sich die einzelnen Kolonien auf den Platten ver-

mehrten, oder ob lediglich Reste vom Umstempeln auf den Platten erschienen. Auf-

grund der sehr großen Zahl an Transkonjuganten wären quantitative Tests sehr aufwen-

dig und kostspielig gewesen. Deshalb wurden einige „Vorselektionen“ durchgeführt,

bevor mit spezifischen Tests weitergearbeitet wurde. Da an der Verwertung dieser

Aminosäuren viele Enzyme beteiligt sind, wurde die Selektion vielseitig angelegt, damit

parallel nach verschiedenen Mutanten gesucht werden konnte. Zum Verständnis ist in

Abbildung 4.13 ein Übersichtsschema der einzelnen Selektionen und Tests dargestellt.

Konjugation(P. fluorescens +E. coli S17-1 pOT182)

Selektion auf M9+*-Platten Selektion auf M9-* Glutamat-PlattenSelektion auf M9+* γ-Glutamyl-

hydrazid-Platten

Wachstumkein Wachstum

⇒ keine Trans-konjuganten

⇒ alle Transkonjugan-ten, die das Transposonin ihr Chromosom inte-

griert haben

kein WachstumWachstum

Wachstumkein Wachstum

Umsetzen aufM9-Asn-Platten

AHA-Test

Glutamat-Test

⇒ Mutanten mitDefekten in der Asn-

VerwertungKolonien mit geringeroder keiner Aktivität

Mutanten mit Defekten in

der Glutamat-Verwertung

der Asparagin-Verwertung

AHA-Test PCR

Erfassung von PGA-defizientenMutanten

⇒ keine Trans-konjuganten oder

Mutanten, dienicht auf Glu alseinziger C+N-

Quelle wachsenkönnen

⇒ Mutanten, die keine Defektein einem Glutamat-abbauendenoder Glutamat-transportieren-

den Enzym haben.

Umsetzen auf M9--Asparaginplatten

kein Wachstum Wachstum

⇒ Mutanten mit Defekten inder Asparagin-Verwertung

⇒ Mutanten, die keineDefekte in der Aspa-

ragin-Verwertunghaben.

AHA-Test PCR

Erfassung von PGA-defizientenMutanten

kein Wachstum Wachstum

⇒ Mutanten, die γ-Glutransportieren und ab-bauen können⇒ keine Defekte imGln-Abbau oder Glu-Transport

⇒ Mutanten, dieDefekte im Gln-Abbau oder imGlu-Transporter

haben.

Glutamat-Test

AHA-Test

⇒ (quantitative) Er-fassung von Mutan-ten, die Glu nicht

verwerten oder trans-portieren können

⇒ Erfassungvon Mutanten,die Defekte in

der PGAbesitzen

Abb. 4.13 Selektionsschema: M9- = M9 ohne NH4Cl/Glucose; M9

+ = M9 mit NH4Cl/Glucose; * = Carbenicillin300Tetracyklin50; γ-Glu = γ-Glutamylhydrazid; Glu = Glutamat;

Gln = Glutamin; Asn = Asparagin;

(1) (2) (3)

Ergebnisse

103

Zur Vereinfachung wurde im Schema und bei der Beschreibung der Ergebnisse

folgende Abkürzungen und Bezeichnungen verwendet: M9+ (bzw. +) steht für M9-

Minimalmedium mit Glucose und Ammoniumchlorid als C- und N-Quelle. M9- (bzw. -)

bedeutet M9-Minimalmedium ohne NH4Cl und Glucose. Die Aminosäure, die als

einzige C- und N-Quelle diente, wird im Anschluß an diese Bezeichnung angegeben.

Das * steht für die Antibiotika Carbenicillin und Tetrazyklin, die zur Selektion positiver

Transkonjuganten in den Konzentrationen 300 µg/ml und 50 µg/ml (Cb300Tet50)

eingesetzt wurden.

Nach der Konjugation wurden die Zellen außer auf M9+*-Platten (1) zusätzlich auf M9-

*Glu- (2) und M9+*γ-Glutamylhydrazid-Platten (3) ausplattiert (vgl. Selektionsschema).

Um sicherzustellen, daß die Donorbakterien (E. coli S17-1/pOT182) nicht mehr

vorhanden waren, wurden die Zellen dreimal auf frische Selektionsplatten umgesetzt.

Um die Kolonien später identifizieren zu können, wurden schon beim ersten Umsetzen

„Masterplatten“ der Transkonjuganten erstellt. Auf den M9+*-Platten sollten nur solche

Mutanten wachsen, die das Transposon in ihr Chromosom integriert haben. Bakterien,

die das Transposon nicht in ihr Chromosom integriert hatten, bzw. Donorbakterien

sollten das mehrmalige Umsetzen auf frische Selektionsplatten nicht überleben, weil sie

keine Resistenz gegen die Antibiotika (Cb, Tet) besitzen. Da diese Selektion nur auf

positive Transkonjuganten ausgelegt war, wurden sehr viele Kolonien erhalten. Zur

Identifizierung von relevanten Mutanten mit Defekten in der Glutamatverwertung,

wurden quantitative Glutamat-Tests durchgeführt. Zur Identifizierung von Glutaminase-

Asparaginase-defizienten Mutanten dienten zunächst AHA-Tests in Mikrotiterplatten.

Da die Ergebnisse dieser Tests durch das teilweise sehr unterschiedliche Wachstum der

Kolonien nicht gut vergleichbar waren, wurden die Kolonien zusätzlich auf M9-*-

Platten mit Asparagin (10 mM) als einziger C- und N-Quelle umgesetzt. Auf diese

Weise wurden Kolonien selektiert, die Defekte in der Asparaginverwertung besaßen,

also im Asparagin-Abbau oder Asparagin-Transport. Diese Mutanten wurden dann mit

AHA-Tests und PCR mit PF-GA-spezifischen Primern auf GA-Defekte untersucht.

Mutanten, die in der Lage sind, auf M9-*-Platten mit Glutamat als einziger C- und N-

Quelle zu wachsen, sollten keinen Defekt in einem Glutamat-transportierenden oder

Glutamat-abbauenden Enzym haben. Mutanten, die auf diesen Platten nicht wuchsen,

hatten entweder das Transposon nicht in ihr Chromosom integriert und besaßen deshalb

keine Resistenz gegen die beiden Antibiotika, oder sie waren nicht in der Lage Glutamat

Ergebnisse

104

als einzige C- und N-Quelle zu verwerten. Die auf den Glutamatplatten gewachsenen

Mutanten wurden auf M9-*-Asn-Platten umgesetzt. Da Asparagin dort die einzige C-

und N-Quelle ist, sollten die Mutanten auf diesen Platten keine Defekte in der

Asparaginase, in einem Asn-Transporter oder anderen Asn-abbauenden Enzym haben.

Mutanten, die kein Wachstum auf dieser Aminosäure zeigten, sollten in einem der

genannten Proteine einen Defekt haben. Durch AHA-Tests und PCRs mit PF-GA-

spezifischen Primern wurden solche Mutanten auf PF-GA-Defekte untersucht.

Mutanten, die auf M9+*γ-Glutamylhydrazid-Platten (3) kein Wachstum zeigten,

konnten γ-Glutamylhydrazid in die Zelle transportieren und abbauen. Durch Abbau

dieses Glutamin-Analogons entsteht toxisches Hydrazin bzw. ein Hydraziniumion,

welches zum Tod der Zelle führt. Transkonjuganten, die γ-Glutamylhydrazid entweder

nicht transportieren oder abbauen konnten, sind jedoch in der Lage auf diesen Platten zu

wachsen. Dabei wurde davon ausgegangen, daß, wie in anderen Organismen auch,

Glutamin und Glutamat von demselben Transportsystem in die Zelle gebracht werden.

(vgl. Kapitel 5.4.2)

Die genaue Durchführung der einzelnen Selektionen und die erhaltenen Ergebnisse sind

in den folgenden Kapiteln beschrieben.

4.19 Suche nach Mutanten mit Defekten in der Asparaginverwertung

Zunächst wurden die Bakterien nach der Konjugation in verschiedenen Verdünnungen

auf M9+*-Platten ausplattiert, um Bakterienzellen zu selektieren, die das Transposon in

ihr Chromosom integriert hatten. Es wurden je nach Verdünnung zwischen 50 und 500-

600 Mutanten pro Platte erhalten. Nachdem durch mehrmaliges Umsetzen auf M9+*-

Platten sichergestellt war, daß keine Donorbakterien mehr vorhanden waren, wurden zur

Identifizierung von Mutanten verschiedene Tests durchgeführt. Begonnen wurde mit

AHA-Tests der Mutanten in Mikrotiterplatten. Wie in Kapitel 3.32.2 beschrieben,

wurden für diesen Test die einzelnen Kolonien in jeweils 100 µl M9--Glutamat-Medium

in Mikrotiterplatten angezogen und das Wachstum durch OD600-Messung verfolgt.

Sobald die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase waren, wurde der AHA-Test,

wie in 3.32.2 beschrieben, durchgeführt. Da immer Positiv- und Negativkontrollen

durchgeführt wurden, ließ sich die Asparaginase-Aktivität sowohl qualitativ als auch

quantitativ bestimmt. In Abbildung 4.14 sind zwei typische Testplatten dargestellt. In

Ergebnisse

105

L WT - + - +

den ersten vier Wells der obersten Reihe (A1-A4) befinden sich die Leerwerte bzw. eine

induzierte und eine nicht-induzierte P. fluorescens-WT Kultur. Eine gelbe oder

hellgrüne Färbung zeigt keine bzw. eine geringe Asparaginase-Aktivität an. Wie in

Abbildung 4.14 zu erkennen, war in einigen Wells keine oder nur eine geringe Aktivität

festzustellen. Allerdings zeigte die Überprüfung der OD600-Werte, daß viele Mutanten

mit geringer Pf-GA-Aktivität, in den Mikrotiterplatten nicht oder nur schwach

angewachsen waren.

Abb. 4.14: Mikrotiter-AHA-Testplatten

L = Leerwert (reines Medium); WT = Wildtyp; + = M9-Medium mit NH4Cl und Glucose; - = M9-Medium ohne NH4Cl, ohne Glucose aber mit 5 mM Glutamat (Die Markierungen auf den Platten habenkeine Bedeutung; sie markieren nur die letzte Kolonie einer Agarplatte; WT + = Negativkontrolle (nicht-induziert); WT - = Positivkontrolle (induziert)

Ein Problem dieses Tests war, daß das Wachstum der einzelnen Kolonien in den

Mikrotiterplatten teilweise sehr unterschiedlich war. Es konnte daher nicht

ausgeschlossen werden, daß bei Durchführung des Tests bereits einige Kulturen den

Anfang der stationären Wachstumsphase erreicht hatten. Durch die in dieser Phase

auftretenden toten Bakterienzellen konnten die Meßergebnisse durch freigesetzte

cytosolische Asparaginase verfälscht werden. Die quantitative Erfassung der Aktivität

(durch Absorptionsbestimmung bei 655 nm im ELISA-Reader) war durch die in der

Lösung vorhandenen Zellen bzw. durch TCA ausgefällte Proteine ungenau bzw. nicht

gut vergleichbar. Ein Abzentrifugieren der Testplatten und Transferieren des klaren

Überstandes vor der Messung in eine neue Mikrotiterplatte war zwar möglich, erwies

sich in der Praxis aber als sehr umständlich. Die scheinbar PF-GA-negativen oder nicht

eindeutigen Mutanten, die durch diesen Test identifiziert wurden, untersuchte man

durch PCR mit den spezifischen P. fluorescens ansB-Primern PSGA1 und PSGA2 auf

L WT - + - +

Ergebnisse

106

eine Insertion in dem ansB-Gen. Allerdings zeigten alle 63 getesteten Mutanten eine

spezifische ansB-Bande, deren Größe der des Wildtyps entsprach.

Aufgrund der genannten Probleme bei dem Mikrotiter-AHA-Test wurden die

Transkonjuganten zur weiteren Selektion auf M9--Asparaginplatten umgestempelt.

Dadurch sollte die große Zahl der Mutanten auf diejenigen eingeschränkt werden, die

Defekte in der Asparaginase-Verwertung besaßen. Dies ermöglichte eine Durchführung

des AHA-Tests bzw. die Anzucht der Bakterien in größeren Kulturen.

Zum Umsetzen wurden zunächst Mikrotiter-Glycerinstockplatten angelegt und die

Mutanten von diesen Platten auf M9--Asparaginplatten umgestempelt. Um ein

zufälliges Nicht-Wachstum, z. B. durch Fehler beim Umstempeln, auszuschließen,

wurden diese Mutanten mindestens zweimal auf frische Asparaginplatten umgesetzt.

Durch Überprüfung der OD600 bei der Herstellung der Stockplatten wurde sichergestellt,

daß mangelndes Wachstum auf den Asparaginplatten nicht dadurch zustande kam, daß

die Kolonien schon in den Stockplatten nicht anwuchsen.

Um die Anzahl der Transkonjuganten einzuschränken, die auf Asparaginplatten

umgesetzt werden sollten, wurden die Bakterien nach der Konjugation statt auf M9+*-

auf M9-*-Glutamat-Platten umgesetzt. Mutanten, die auf diesen Platten wuchsen, hatten

offenbar keine Defekte in der Glutamatverwertung. Von diesen Mutanten wurden

Glycerinstockplatten angelegt und die Kolonien auf M9--Asparaginplatten umgesetzt.

Mutanten, die auf diesen Platten nicht mehr anwuchsen, sollten also einen Defekt in der

Asparaginverwertung haben. Insgesamt wurden durch die Selektionen (1) und (2) (s.

Abb. 4.13) 15 Mutanten identifiziert, die nicht auf den Asparaginplatten wuchsen. Um

festzustellen, ob diese Mutanten eine Insertion im ansB-Gen besaßen, wurde eine PCR

mit den ansB-spezifischen Primern PSGA1 und PSGA2 durchgeführt.

Außerdem wurde die Pf-GA-Aktivität mit dem AHA-Test bestimmt. In Abb. 4.15 ist

das Ergebnis der PCR von sieben Mutanten gezeigt.

Ergebnisse

107

Abb.4.15: Ergebnis der PCR von sieben Mutanten

Die PCR wurde mit den Pf-GA-spezifischen Primern PSGA 1 und PSGA 2 und genomischer DNA dereinzelnen Mutanten durchgeführt.M = Marker (100 bp-Leiterplus (peqlab) in bp; Die Zahlen (2/26; 1/29; 5/42; 1/48; 5/83; 7/84; 8/94)geben die Platten bzw. Kolonie-Nummer an.

Wie man erkennt, ist bei den Mutanten 1/48 und 5/83 die ansB-Bande zu höheren

Werten verschoben. Alle anderen, außer 3/26, zeigen eine ansB-Bande bei ca. 1300 bp,

wie sie auch bei der PCR mit dem Wildtyp erhalten wurde. Das Fehlen einer Bande bei

3/26 kann auf typische PCR-Probleme zurückgeführt werden. Eine Wiederholung der

PCR mit Zellen dieser Kolonien zeigte ebenfalls ein spezifisches ansB-Amplifikat bei

3/26. Die anderen acht Mutanten zeigten ebenfalls eine PCR-Bande, die der des

Wildtyps entsprach.

Wie bereits erwähnt, wurde parallel zu der PCR ein AHA-Test mit den 15 Mutanten

durchgeführt. Dazu wurden die Kolonien in 50 ml M9+-Medium über Nacht bei 30 °C

angezogen. Mit dieser Übernachtkultur wurden dann jeweils 50 ml M9+ und 50 ml M9--

Glutamat-Medium im Verhältnis 1:100 angeimpft und bei 30 °C inkubiert. Stündlich

wurde die OD600 bestimmt und 100 µl für einen AHA-Test entnommen. Als Kontrolle

wurde der P. fluorescens WT in beiden Medien angezogen, gleichfalls das Wachstum

(OD600) bestimmt und ein AHA-Test durchgeführt. Dabei muß erwähnt werden, daß die

Mutante 5/83 sowohl in M9+-, M9--Glu als auch LB-Medium nicht mehr angewachsen

war. Deshalb konnte diese Mutante nicht mehr überprüft werden. Stellvertretend für die

restlichen getesteten Mutanten sind die Wachstumskurven und spezifischen Aktivitäten

Ergebnisse

108

der Mutanten 5/25, 1/48 und 67 in den Abbildungen 4.17, 4.18, 4.20 und 4.21

dargestellt. Die Wachstumskurven des Wildtyps und die aus den AHA-Tests erhaltenen

spezifischen Aktivitäten sind in den Abbildungen 4.16 und 4.19 dargestellt.

Abb. 4.16: Wachstumskurven des P. fluorescens WT in M9+ und M9--Glutamat

M9+ = M9-Medium mit NH4Cl und Glucose. M9-Glu = M9-Medium ohne Glucose und NH4Cl aber mit5 mM Glutamat

Abb. 4.17 Abb. 4.18

Abb. 4.17 ,4.18: Wachstumskurven der Mutanten 5/25, 1/48 und 67 in den Medien M9+

und M9--Glutamat (5 mM)

M9+ = M9-Medium mit NH4Cl und Glucose. M9-Glu = M9-Medium ohne Glucose und NH4Cl aber mit5 mM Glutamat

Man erkennt, daß sowohl der Wildtyp als auch die Mutanten in den beiden Medien

gleichartig wachsen, wobei das Wachstum in dem M9--Medium mit Glutamat als

einziger C- und N-Quelle insgesamt geringer war. Das kann aber daran liegen, daß mit

Glutamatkonzentrationen von 5 mM den Zellen nur relativ wenig Nährstoffe zur

Verfügung stand und sie deshalb schneller die stationäre Phase erreichten.

In den Abbildungen 4.19, 4.20 und 4.21 sind die relativen spezifischen Pf-GA-

Aktivitäten der Mutanten und des Wildtyps in verschiedenen Medien in Abhängigkeit

von der Zeit dargestellt. Dabei beziehen sich die Zeitangaben auf Stunden nachdem die

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1,5 3,45 4,45 5 6 7

Zeit / h

OD

600

M9+

M9-Glu

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1 2 3 4 5 6

Zeit / h

OD

600 Mut 67

Mut 1/48

Mut 5/25

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

0,45

0 1 2 3 4 5 6

Zeit / h

OD

600 Mut 67

Mut 1/48

Mut 5/25

Ergebnisse

109

Kulturen aus der Übernachtkultur angeimpft wurden. Betrachtet man die relativen

spezifischen Aktivitäten des P. fluorescens WT, so stellt man fest, daß im M9+-

Medium, also in Medium mit Glucose und Ammoniumchlorid als C- und N-Quelle, die

PF-GA-Aktivität gleichbleibend niedrig war. Sie wurde weder induziert noch

reprimiert. In M9--Glutamat-Medium - d. h. in M9-Minimalmedium, mit Glutamat als

einziger C- und N-Quelle - war die PF-PGA Aktivität ca. 3-4 x höher als in M9+-

Medium. Dabei fällt auf, daß die Aktivität kurz nach dem Animpfen aus der M9+-

Übernachtkultur am größten war. Danach fiel die PF-GA-Aktivität leicht ab und bleibt

dann relativ konstant. In der M9+-Kultur beobachtet man die gleiche Tendenz. Zunächst

ist die Aktivität am größten, dann fällt sie leicht ab. Der leichte Anstieg der Aktivität bei

5 h und 6 h kann dadurch erklärt werden, daß die Zellen sich zu dem Zeitpunkt schon in

der stationären Phase befinden. Durch die in dieser Wachstumsphase absterbenden

Zellen wurde die cytosolische Asparaginase-Glutaminase freigesetzt, deren Aktivität

dann bei dem AHA-Test mit erfaßt wurde.

Abb. 4.19: Relative spezifische Pf-GA-Aktivität von P. fluorescens WT in M9+ und

M9--Glutamat;

M9+ = M9-Medium mit NH4Cl und Glucose. M9-Glu = M9-Medium ohne Glucose und NH4Cl aber mit10 mM Glutamat; Zeit / h = Zeit nach Animpfen in Stunden; Als Bezugspunkt diente die Aktivität bei1,5 h in M9-Glu;

Bei den Mutanten verhielten sich die relativen spezifischen Aktivitäten entsprechend. In

M9+-Medium war die Aktivität ca. 2-3 x geringer als in M9--Glutamat-Medium.

0

20

40

60

80

100

120

1,5 3,45 4,45 5 6 7

Zeit / h

rel.

spez

. Akt

ivitä

t

M9+

M9-Glu

Ergebnisse

110

Abb. 4.20: Relative spezifische Pf-GA-Aktivität der Mutanten 5/25, 1/48 und 67 in

M9+-Medium

M9+ = M9-Medium mit NH4Cl und Glucose. M9-Glu = M9-Medium ohne Glucose und NH4Cl aber mit5 mM Glutamat; Mut = Mutante; die spez. Aktivitäten sind auf die spezifische Aktivität des WT in M9-Glu Medium bezogen;

Zunächst war die Aktivität in M9+ etwas erhöht, pendelte sich dann aber auf Werte um

10 % ein. Ein Vergleich mit dem Wildtyp zeigt, daß in M9+-Medium der erste Wert des

WT kleiner ist als bei Mutanten.

Abb. 4.21: Relative spezifische Pf-GA-Aktivität der Mutanten 5/25, 1/48 und 67 in M9-

-Glutamat-Medium (c (Glu) = 5 mM;

M9+ = M9-Medium mit NH4Cl und Glucose. M9-Glu = M9-Medium ohne Glucose und NH4Cl aber mit5 mM Glutamat; Mut = Mutante; die spez. Aktivitäten sind auf die spezifische Aktivität des WT in M9-Glu Medium bezogen;

0

10

20

30

40

1 2 3 4 5 6

Zeit / h

Mut 5/25

Mut 1/48

Mut 67

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6Zeit / h

Mut 5/25

Mut 1/48

Mut 67

Ergebnisse

111

In M9--Glutamat-Medium war die PF-PGA der Mutanten wie beim WT induziert.

Analog zum WT stieg hier die PF-GA-Aktivität in der ersten Zeit nach dem Animpfen

an, bevor sie ein wenig absank. Der Anstieg nach vier Stunden kann wiederum durch

das Erreichen der stationären Wachstumsphase und der dadurch freigesetzten

cytosolischen Asparaginase-Glutaminase erklärt werden.

In Abbildung 4.22 sind die relativen spezifischen Aktivitäten der Mutanten und des

Wildtyps M9+- und M9--Glutamat noch einmal übersichtlich dargestellt. Man erkennt

bei allen eine Induktion in M9--Glutamat und eine relativ niedrige Aktivität in

Glucose/Ammoniumchlorid-Medium. Die Mutanten zeigten also eine dem Wildtyp

entsprechende Regulation und Aktivität der PF-PGA. Die Unterschiede in den

Absolutwerten können auf unterschiedliche Zelldichten, während der Messungen

zurückgeführt werden.

Die restlichen 12 Mutanten zeigten vergleichbare Wachstumskurven und relative

spezifische Aktivitäten (nicht gezeigt). Die untersuchten Mutanten hatten also entgegen

den zuerst gemachten Beobachtungen keine Defekte in der PF-PGA.

Abb. 4.22: Vergleich der relativen spezifischen Pf-GA-Aktivitäten des P. fluorescensWT und der Mutanten in M9+ und M9--Glutamat-MediumM9+ = M9-Medium mit NH4Cl und Glucose. M9-Glu = M9-Medium ohne Glucose und NH4Cl aber mit5 mM Glutamat; PfWT = P. fluorescens WT; die spez. Aktivitäten sind auf die spezifische Aktivität desWT in M9-Glu Medium bezogen;

Zur Kontrolle wurden die Mutanten noch einmal in M9--Asparagin-Flüssigmedien

angezogen und AHA-Tests durchgeführt. Obwohl alle Mutanten auf den M9--

0

20

40

60

80

100

120

PfWTM9+

PfWT M9-Glu

5/25 M9+ 5/25 M9-Glu

1/48 M9+ 1/48 M9-Glu

67 M9+ 67 M9-Glu

Ergebnisse

112

Asparaginplatten nicht angewachsen waren, wuchsen sie in den Flüssigmedien an. Die

gemessenen relativen spezifischen Aktivitäten sind in Abbildung 4.23 zusammengefaßt.

Wie die Abbildung 4.23 zeigt, ist die Pf-PGA auch in M9--Asparagin-Medium aktiv,

wenn auch geringer als in M9--Glutamat.

Abb. 4.23: Relative spezifische Aktivität der Mutanten und des P. fluorescens WT in

M9--Asparagin-Medium; c(Asn) = 10 mM

OD600 = optische Dichte bei 600 nm; Mut = Mutante; WT = Wildtyp; die spez. Aktivitäten sind auf diespezifische Aktivität des WT in M9-Asn-Medium bezogen

Um die Anzahl möglicher Mutanten mit Defekten in der Asparagin-

Glutaminverwertung weiter einzuschränken, wurden die Mutanten nach der

Konjugation auf M9+*γ-Glutamylhydrazid-Platten (γ-Glu-Platten) ausplattiert. γ-Glu-

tamylhydrazid ist ein toxisches Substratanaloges des Glutamins. Wenn es in die Zelle

gelangt und abgebaut wird, entstehen Hydraziniumionen, die toxisch für die Zelle sind.

Auf diesen Platten sollten also nur Transkonjuganten wachsen, die Defekte im

Glutamin-Abbau besitzen. Da die Pf-PGA sowohl Glutamin als auch Asparagin

umsetzt, sollten durch diese Selektion Mutanten mit Defekten in der Pf-PGA oder

anderen Asn / Gln abbauenden Enzymen selektiert werden.

Da in vielen Bakterien mindestens ein Transportprotein für den Transport von Glu, Gln,

Asn und Asp existiert, war zu erwarten, daß Mutanten mit einem Defekt in einem dieser

Transporter auch auf diesen Platten wachsen können, sofern der Defekt nicht durch

einen zweiten Transporter ausgeglichen wird.

Auf diesen Platten wuchsen meist nur sehr wenige Mutanten. Diese wurden mit Hilfe

des AHA-Tests auf Defekte in der PF-PGA untersucht. Allerdings konnten auch bei

dieser Selektion keine PF-GA-negativen Mutanten identifiziert werden.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Mut 5/25 Mut 1/48 Mut 67 WTOD600

rel.spez.Akt.

Ergebnisse

113

4.20 Suche nach Mutanten mit Defekten in der Glutamatverwertung

Um Mutanten zu identifizieren, die Defekte in der Glutamatverwertung, also im

Transport und Abbau, besaßen, wurden mit den Mutanten, die auf den M9+*- und

M9+*γ-Glu-Platten wuchsen, Glutamat-Tests durchgeführt. Dazu wurden die Trans-

konjuganten in M9-Minimalmedium angezogen, das kein Ammoniumchlorid dafür aber

1 mM Glucose und 0,8 mM Glutamat enthielt. Die Glucose sollte das Anwachsen aller

Mutanten ermöglichen, auch derjenigen die kein Glutamat verwerten konnten. Das

Wachstum der Zellen wurde durch OD600-Bestimmung überprüft und noch vorhandenes

Glutamat mit der Glutamat-Dehydrogenase (GlDH), Diaphorase und Iodnitrotetra-

zoliumchlorid (INT) bestimmt (vgl.3.32.3). Da in diesem Fall nicht abgebautes

Glutamat quantitativ erfaßt wurde, ermöglichte dieser Test auch die Bestimmung von

Mutanten, deren Glutamatverwertung nur eingeschränkt war.

Allerdings konnte bei diesen Versuchen noch keine Mutante eindeutig identifiziert

werden, die Glutamat nicht verwerten konnte.

Diskussion

114

5 Diskussion

Biokontroll-Bakterien beeinflussen auf verschiedene Art und Weise das

Pflanzenwachstum positiv. Um ihre pflanzenfördernden Eigenschaften im Boden

ausüben zu können, müssen sie in der Lage sein, das Wurzelsystem effektiv zu

besiedeln. Dabei ist unter anderem der Wettbewerb um Nährstoffe von Bedeutung. Nur

Bakterien, die die vorhandenen Nährstoffe verwenden können, haben Vorteile bei der

Besiedelung der Wurzel. Da die Aminosäuren Glutamin, Glutamat, Asparagin und

Aspartat mit 40 - 50 % [Barber & Gunn, 1974] einen Großteil der Aminosäuren in den

Wurzelexsudaten vieler Nutzpflanzen (Getreide, Gemüse) ausmachen, stellt sich die

Frage, ob die Bakterien durch die effiziente Verwertung der Aminosäuren einen

Besiedelungsvorteil erhalten. Dazu muß zunächst der Stoffwechsel dieser Aminosäuren

charakterisiert werden. Bei der Untersuchung des Stoffwechsels von Glutamin/Glutamat

und Asparagin/Aspartat schien es sinnvoll, zunächst ein gut bekanntes bakterielles

Enzym zu klonieren und genauer zu charakterisieren. Deshalb wurde in dieser Arbeit

aus dem P. fluorescens Wildtyp-Stamm ATCC 13525, der als Modellorganismus

gewählt wurde, zuerst eine Glutaminase-Asparaginase kloniert und deren Regulation

untersucht. Anschließend wurde versucht, weitere Enzyme zu identifizieren, die an der

Verwertung der oben genannten Aminosäuren beteiligt sind.

5.1 Klonierung einer Glutaminase-Asparaginase aus P. fluorescensWT

Asparaginasen und Glutaminasen gehören zur Enzymklasse der Amidohydrolasen. In

vielen Fällen kann jedoch nicht eindeutig zwischen einer Asparaginase- und

Glutaminase-Aktivität unterschieden werden, da viele dieser Enzyme sowohl Asparagin

als auch Glutamin als Substrate nutzen. Solche Enzyme werden deshalb als

Glutaminasen-Asparaginasen bezeichnet. Asparaginasen und Glutaminasen wurden

bereits in vielen Gram-negativen und einigen Gram-positiven Bakterien sowie in

einigen Hefen- und Pflanzenspezies identifiziert. Weil die Asparaginase II aus E. coli

als Tumortherapeutikum bei akuter Lymphatischer Leukämie (ALL), einer Art des

Blutkrebses, eingesetzt wird, zählt dieses E. coli-Enzym zu den am besten untersuchten

Asparaginasen. In E. coli gibt es zwei Asparaginasen, die sowohl kloniert als auch

Diskussion

115

charakterisiert worden sind [Jennings et al., 1990 und 1993]. Aufgrund dieser

Ergebnisse können die Asparaginasen bzw. Glutaminasen-Asparaginasen in 2 Klassen

(Typ I und Typ II) eingeteilt werden. Die Typ I-Asparaginase in E. coli (AnsA) ist im

Cytosol lokalisiert, besitzt eine geringe Substrataffinität und wird konstitutiv exprimiert.

Die Asparaginasen (bzw. Glutaminasen-Asparaginasen) des Typs II sind im Periplasma

lokalisiert, besitzen eine hohe Substrataffinität und ihre Expression wird reguliert. Im

Gegensatz zu den Asparaginasen des Typs I, die ausschließlich Asparagin umsetzen,

besitzen die Typ II-Enzyme eine breitere Substratspezifität. Sie setzen häufig außer L-

Asparagin auch L-Glutamin und teilweise die D-Isomere dieser Aminosäuren um. Die

beiden Klassen der Asparaginasen unterscheiden sich aber nicht nur in den

Eigenschaften, sondern auch in der DNA- und Aminosäuresequenz [Jennings &

Beacham, 1990]. Der Vergleich des aus dem P. fluorescens WT klonierten Gens und der

daraus abgeleiteten Proteinsequenz mit anderen Glutaminase-Asparaginase-Sequenzen

zeigte große Übereinstimmungen mit verschiedenen Glutaminasen-Asparaginasen vom

Typ II.

Tabelle 5.1: Eigenschaften der Glutaminasen-Asparaginasen

Enzym Organismus SwissProt/

Trembl

Lokali-

sierung

M

(kDa)

UE Gutaminase-

aktivität (%)

Asparaginase II E. coli ASG2_ECOLI Peripl. 138,4 4 1

Asparaginase W. succinogenes ASPG_WOLSU Cytopl. 139,5 4 <1

Asparaginase E. chrysanthemi ASPG_ERWCH Peripl. 140,2 4 90

Glutaminase-

Asparaginase

Acinetobacter

glutaminasificans

ASPQ_ACIGL ? 141,9 4 100

Glutaminase-

Asparaginase

Pseudomonas sp.

7A

ASPQ_PSES7 ? 144,8 4 140

Glutaminase-

Asparaginase

Pseudomonas

fluorescens

O68897 Peripl. 144,7 4 140

SwissProt/Trembl = Datenbank-Acession-Nr.; UE = Untereinheiten; M = Gewicht in Kilodalton;

Die größte Übereinstimmung besteht mit der PGA aus dem nicht näher charakterisierten

Bakterium Pseudomonas sp. 7A [Lubkowski et al., 1994]. Die hohe Übereinstimmung

von 88 % auf Proteinebene ist wegen der Verwandtschaft der beiden Organismen nicht

überraschend. Auch auf DNA-Ebene ist die Homologie ausgeprägt, wobei berück-

sichtigt werden muß, daß die DNA-Sequenz der PGA aus Pseudomonas sp. 7A von der

Diskussion

116

durch Aminosäuresequenzierung erhaltenen Proteinsequenz abgeleitet worden ist.

Aufgrund des degenerierten genetischen Codes sind natürlich Abweichungen möglich.

Die gefundene Signalsequenz (vgl. Abb. 4.3) bzw. die Identität der ersten zehn

Aminosäuren des reifen Proteins mit einer Glutaminase-Asparaginase, die aus einem

periplasmatischen Überstand desselben P. fluorescens WT-Stammes nativ gereinigt

wurde, bestätigten die periplasmatische Lokalisation des Proteins. Aufgrund der

Tatsache, daß dieses Enzym Glutamin schneller umsetzt als Asparagin [Klöppner, 1999;

Hüser et al., 1999] und in Analogie zu der von Roberts [Roberts, 1976] isolierten PGA

aus Pseudomonas sp. 7A wurde das P. fluorescens Enzym mit Pf-GA, für P. fluorescens

Glutaminase-Asparaginase, bezeichnet. Das klonierte Gen wurde, in Anlehnung an die

E. coli-Bezeichnung, ansB genannt. Wie das Alignment in Abbildung 4.2 zeigt, stimmt

die Sequenz der Pf-GA auch mit weiteren L-Asparaginasen des Typs II gut überein. Alle

Reste, die eine katalytische Funktion besitzen sind auch in der Pf-GA konserviert (vgl.

Abb. 5.1).

Enzym Teilsequenzen

114 248 ↓ ↓

EcAnsB TGGTI YTVG IG SQD ITHGTDT VGAMRP GNGNLYK DA EVDD

WA TGGTI YSAG IG SQE ITHGTDT VGSMRP GNGNPFP DA EVDD

ErA TGGTI YKAG MASEN ITHGTDT VAAMRP GAGSVSV DE ELPG

AGA TGGTI YSAA VA SES ITHGTDT VGSMRP GNGSMAN NAEQPD

PGA TGGTI YQAA IA SES ITHGTDT VGSMRP GNGSVSS NA EQPD

PfGA TGGTI YQAA IA SES ITHGTDT VGSMRP GNGSVSS NA EQPD

kat.Reste

↑ ↑ ↑ ↑↑ ↑ 12 25 58 89 90 283

Abbildung 5.1: Alignment der katalytischen Reste

EcAnsB = E. coli-Asparaginase II; WA = Asparaginase aus W. succinogenes; ErA = E. chrysanthemi-Asparaginase; AGA = A. glutaminasificans-Asparaginase; PGA = Pseudomonas sp. 7A-GA; Pf-GA =P. fluorescens-Glutaminase-Asparaginase; die Nummerierung bezieht sich auf das E. coli-Enzym

Einige weitere Aminosäuren, die vor allem an der Substratbindung beteiligt sind,

stimmen zwar nicht überein, scheinen aber dennoch die Aktivität der Pf-GA nicht

negativ zu beeinflussen. Zum besseren Verständnis ist in Abbildung 5.2 das aktive

Zentrum der E. coli-Asparaginase II dargestellt. So ist z. B. in AnsB aus E. coli der Rest

Ala-114, zusammen mit Ser-58, Asp-90 und Glu-283, durch Bildung von Wasser-

stoffbrücken, an der Substratbindung beteiligt. In der Pf-PGA, der PGA aus

Diskussion

117

Pseudomonas sp. 7A und der Asparaginase aus A. glutaminasificans ist dieser Rest

gegen Serin ausgetauscht. In den Asparaginasen aus S. cerevisiae und den beiden Gram-

positiven Organismen B. subtilis und B. licheniformis (im Alignment nicht gezeigt)

befindet sich an dieser Stelle ein Serinrest. Außer in AnsB befindet sich nur noch in den

Asparaginasen aus W. succinogenes und E. chrysanthemi an dieser Stelle ein Alaninrest.

Aufgrund der Tatsache, daß nur die Carbonylgruppe des Alaninrestes-114 an der

Substratbindung beteiligt ist, sollte ein Serinrest an dieser Stelle keine negativen

Auswirkungen auf die Katalyse haben. Ebenfalls nicht konserviert ist Asn-248, dem

aufgrund der Untersuchungen an AnsB eine Beteiligung bei der Substratbindung

zugeordnet wurde [Wehner et al., 1994]. Bei P. fluorescens, Pseudomonas sp.7A,

E. chrysanthemi und A. glutaminasificans befindet sich an dieser Position Serin. Nur die

Enzyme aus E. coli und W. succinogenes enthalten an dieser Position 248 einen

Asparaginrest. Da sowohl Asparagin als auch Serin hydrophil und polar sind, sind keine

Auswirkungen auf die Substratbindung zu erwarten. Allerdings beeinflußt Asparagin-

248 in der E. coli Asparaginase II zusammen mit Gln-59 selektiv die Substratspezifität

[Wehner et al., 1994]. Auffallend ist jedoch, daß alle Enzyme mit einem Serinrest in

Position 248 eine hohe Glutaminase-Aktivität zeigen (vgl. Abb. 5.1).

Abbildung 5.2: Aktives Zentrum der E. coli Asparaginase II

D90 Q59

Y25

K162

E283(C)

N248(C)

T12

T89

S58

A114

Substrat

G11

Diskussion

118

Durch die Reinigung und Bestimmung der Substratspezifität der rekombinanten Pf-GA-

His8 wurde die Zugehörigkeit der Pf-GA zur Klasse der Typ II-Asparaginasen bestätigt

(vgl. Tab. 5.1). Sowohl das Gewicht, als auch die Substratspezifität (Umsatz von L-Asn,

L-Gln und sogar D-Asn) stimmten mit dem nativ gereinigten Enzym aus

periplasmatischen Überständen überein [Klöppner, 1999]. Daß L-Glutamin schneller

von der Pf-GA umgesetzt wird als L-Asparagin, entspricht der häufig in den

Pseudomonaden gefundenen doppelten Substratspezifität der Pseudomonas Glu-

taminasen-Asparaginasen [Imada et al., 1973]. Die breitere Substratspezifität der

periplasmatischen Enzyme ermöglicht es den Bakterien, mit einem Enzym zwei

Aminosäuren aufzunehmen bzw. verfügbar zu machen. Für die cytosolische

Asparaginase wäre eine hohe Glutaminase-Aktivität katastrophal, da Glutamin ein

wichtiger NH2-Donor in der Zelle ist. Deshalb setzen z. Β. Die Typ II-Enzyme aus

E. coli und Pseudomonas, die im Periplasma lokalisiert sind, sowohl Glutamin als auch

Asparagin um, während die cytosolische Asparaginase vom Typ II aus W. succinogenes

sehr spezifisch für Asparagin ist. Interessant hierbei ist außerdem, daß sich die

cytosolischen und periplasmtischen Enzyme in der Struktur der aktiven kaum Zentren

unterscheiden. Wodurch die unterschiedliche Substratspezifität im Periplasma und im

Cytosol vermittelt wird, ist bis jetzt nicht geklärt.

5.2 Regulation der Pf-GA

5.2.1 σ54-abhängige Promotoren

Nachdem der Transkriptionsstartpunkt identifiziert worden war, wurde in dem strom-

aufwärts liegenden DNA-Bereich nach einem Promotor für die Anlagerung der RNA-

Polymerase gesucht. Obwohl die Consensus-Sequenzen für den am häufigsten in Proka-

ryoten vorkommenden RNA-Polymerase-Sigmafaktor (σ70) in unterschiedlichen Genen

und Organismen geringfügig variiert, so liegen sie immer um die Basen -35 und -10.

Eine Überprüfung dieses Bereichs ergab jedoch keine Übereinstimmungen mit

bekannten σ70-abhängigen Promotoren. Dagegen wurden bei den Basen -24 und -12 die

invarianten GG- und GC-Motive von σ54-abhängigen Promotoren gefunden [Thöny

Diskussion

119

et al., 1989]. Auch die Abstände zwischen diesen beiden Bereichen und dem

Transkriptionsstartpunkt zeigten signifikante Übereinstimmungen (vgl. Abb. 4.9)

[Fischer et al., 1994; Beynon et al., 1983; Thöny et al., 1989].

σ54-Promotoren wurden zuerst bei einem Glutamin-Synthetase-Gen in

Salmonella thyphimurium [Garcia et al., 1977] und bei nif-Genen in Klebsiella

pneumoniae [Beynon et al., 1983; Ausubel et al., 1984; Alvarez-Morales et al., 1985]

identifiziert. Die σ54-abhängigen Promotoren treten zwar nicht so häufig auf wie die

σ70-abhängigen, dennoch wurden sie mittlerweile bei vielen Genen in den unter-

schiedlichsten Prokaryoten identifiziert. Dabei sind sie nicht nur, wie zunächst vermutet,

ausschließlich an der Expression von Stickstoff-regulierenden Genen beteiligt. Einige

Beispiele für Gene, die unter der Kontrolle von σ54-abhängigen Promotoren stehen,

sind: Glutamin-Synthetase-Gen, Urease-Gen und Flagellin-Gen in P. aeruginosa [Härtig

et al., 1998], des xylAB Operon und xylS in P. putida [Inouye et al., 1984], das

Carboxypeptidase G2-Gen in P. putida [Kustu et al., 1989], das Glutamin-Synthetase-

Gen in E. coli und S. thyphimurium [Kustu et al., 1989], sowie ntrA und nifHDK in

K. penumonia [Helmann & Chamberlin, 1988].

5.2.2 Regulation von σ54-abhängigen Promotoren durch Aktivatorproteine

Interessant ist, daß alle bis jetzt bekannten σ54-abhängigen Promotoren einer positiven

Kontrolle durch Regulatorproteine unterliegen. Denn im Gegensatz zu σ70-abhängigen

RNA-Polymerasen ist das σ54-RNA-Polymerase-Holoenzym nicht in der Lage nach

Anlagerung und Bildung eines stabilen geschlossenen Promotorkomplexes die

Transkription zu initiieren. Erst durch die Anlagerung eines transkriptionellen

Aktivators (Regulators) erfolgt in Anwesenheit von ATP die Umwandlung in einen

offenen Promotorkomplex, der die Transkription ermöglicht.

In vielen Fällen binden die Aktivatorproteine nicht direkt an die σ54-RNA-Polymerase,

sondern zunächst an spezifische Erkennungsstellen, die häufig 100 - 200 bp

stromaufwärts, in einigen Fällen aber auch 1 kb vom Transkriptionsstartpunkt entfernt

sein können [Kustu et al., 1989]. Die Interaktion des an diese konservierten Regionen

gebundenen Aktivatorproteins mit dem an der Consensus-Sequenz (-24/-12)

gebundenen σ54-RNA-Polymerase-Holoenzym erfordert eine Schleifenbildung der

Diskussion

120

AT PAD P

TRANSKRIPTION

Responsregulator

Sensorkinase

chemisches Signal

RNA-Polymerase

DNA

Strukturgen

P L AS M AM E M B R AN

AT P

AD P

chemisches Signal

5 4σ

R R a

R R a R R i

P

P

dazwischenliegenden DNA-Bereiche [Fischer et al., 1994; Thöny et al., 1989]. Dieser

Prozeß kann entweder durch die Anlagerung des Aktivators an die RNA-Polymerase

direkt erfolgen oder durch das DNA-Bindeprotein IHF („integration host factor“)

unterstützt werden [Fischer et al., 1994; Shingler et al., 1996] (vgl. Abbildung 5.3). Die

Aktivität der positiven Regulatorproteine selbst wird durch Signale aus der Umgebung

beeinflußt. Dabei können die Regulatorproteine entweder direkt oder indirekt mit der

Abbildung 5.3: Regulation der σ54-abhängigen Transkription durch Aktivatorproteine

RRa = aktiviertes Aktivatorprotein; RRi = inaktives Aktivatorprotein

DNA in Wechselwirkung treten [Shingler, 1996; Thöny et al., 1989]. Voraussetzung für

die direkte Wechselwirkung ist, daß die Regulatorproteine im Cytosol produziert oder

frei zugänglich sind. Ein Vorteil dieser Art von Regulation ist eine schnelle direkte

Antwort auf ein Induktionssignal aus der Umgebung. Die indirekte Wechselwirkung

besteht aus einem Phosphorylierungs-Signal-Transduktions-System [Steiger, 1996].

Diese Aktivierung erfolgt zwar nicht direkt, ermöglicht aber eine Kommunikation

zwischen extrazellulären Signalen und intrazellulärer transkriptioneller Antwort. Bei der

indirekten Aktivierung sind die Regulator (Aktivator)-Proteine sogenannte „Antwort-

Proteine“ für bestimmte Zwei-Komponenten-Regulationssysteme. Diese Systeme

Diskussion

121

enthalten eine „Sensor-Histidin-Kinase“, die meistens, aber nicht immer,

membrangebunden ist. Diese Kinase erkennt ein spezifisches Signal aus der Umgebung

und aktiviert sofort durch Phosphorylierung das Aktivatorprotein, das sich dann an die

DNA binden und dem RNA-Polymerase-Holoenzym die Transkription ermöglichen

kann. Diese Art der Aktivierung tritt z. B. bei dem nif-Regulatorprotein NtrC auf, das

aufgrund des Stickstoffgehaltes der Zelle reguliert wird [Fischer et al., 1994]. Bei der

direkten Aktivierung wird das Aktivatorprotein durch bestimmte Substrate und / oder

Intermediate des katabolischen Stoffwechselweges aktiviert, den sie regulieren. Bei-

spiele hierfür sind XylR und PhlR in Pseudomonas, die den Abbau von bestimmten

aromatischen Komponenten kontrollieren [Abril et al., 1988; Shingler & Morr, 1994].

Die beschriebene Regulation von σ54-abhängigen Promotoren ist in Abbildung 5.3

dargestellt.

AACGACAGGGCATCTGCCCCACCGTCAAACACGCCTGCATGAATATTCCATCATGGTTTT

-127 -111

*** *** CGGACAACCGAACGCAATAGCCCCTCACTGTTCGGAAAGCCGGACAAACGCCCCTCAGCC

-70 -58

*** *** CCACCTGCAAAAACCAATATAAGTTGTTTTAAATCAACACGTTAATTTATATGTTCGGCC

-24 -12 ↓TSStart ACCATCAGCCTGGTACAAATCCTGCTCTTTCTCAGCACCTCGCGGCATTCAGAATCGCCC

RBS ↓TLStart GGGTGTTCTAGATGAACCTGCTACCGCACTCATCAAAAACCAGAGAGAAAAATAATGAAA G C S R * T C Y R T H Q K P E R K I MM KK

TCTGCACTGAAAACCTTCGTTCCGGGCGCCCTAGCCCTACTGCTGCTGTTCCCCGTTGCT S A L K T F V P G A L A L L L L F P V A

Signalpeptid

GCCCAGGCAAAGGAAGTCGAAACCAAGACCAAGCTGGCCAACGTGGTGATTCTCGCCACC

A Q A K E V E T K T K L A N V V I L A T

Abbildung 5.4: Promotorbereich des P. fluorescens ansB-Gens

Die *** kennzeichnen mögliche Aktivator-Bindungssequenzen; -24 / -12 = Consensus-Sequenzen; RBS =Ribosomen-Bindungsstelle; TSStart = Transkriptionsstartpunkt; TLStart = Translationsstartpunkt; dasStartcodon ist fett gedruckt; das Signalpeptid der Pf-GA ist unterstrichen.

Wie bereits erwähnt wurde, besitzen einige der σ54-abhängigen Promotoren mehr als

100 bp stromaufwärts vom Transkriptionsstart Aktivatorsequenzen (TGT N6-10 ACA),

Diskussion

122

die ebenfalls stark konserviert sind [Thöny et al. 1989; Buck et al., 1986]. An diese

Aktivatorsequenzen binden Regulatorproteine, die für die Aktivierung der Expression

notwendig sind [Thöny et al., 1989]. Bei Base -127 (TGT) und -111 (ACA), sowie bei -

58 (ACA) und -70 (TGT) scheinen auch im Promotor des P. fluorescens-ansB-Gens

solche Aktivator-Bindungs-Sequenzen zu liegen (vgl. Abb. 5.4). Dabei entspricht die

Anzahl der Basen zwischen -127 und -111 nur ungefähr der geforderten Anzahl von 6

bis 10 Basen, während der Abstand zwischen -70 und -58 mit dem in bestimmten nif-

Promotoren übereinstimmt [Buck et al., 1986]. Um festzustellen, ob es sich bei den im

ansB-Gen gefundenen Sequenzen tatsächlich um Aktivator-Bindungssequenzen handelt,

müßte die Funktion dieser Bereiche erst durch Deletionsmutagenese untersucht werden.

Wie die Aktivierung in P. fluorescens erfolgt, ist noch unklar. Prinzipiell sind beide

Möglichkeiten vorstellbar, denn Glutamat kann sowohl ins Cytosol transportiert werden,

als auch im Periplasma eine Signaltransduktion auslösen.

5.2.3 σ54-abhängige Expression des ansB-Gens in P. fluorescens

Um die σ54-Abhängigkeit des ansB-Promotors zu bestätigen, wurde die spezifische

Glutaminase-Asparaginase-Aktivität einer RpoN-defizienten Mutante des Pseudo-

monas-Stammes P. putida KT2440 (P. putida KT2440rpoN) [Köhler et al., 1989] mit

der des P. fluorescens-Wildtyps verglichen. Die RpoN-defiziente Mutante P. putida

KT2440rpoN wurde bereits zur Identifizierung einer Reihe von Genen verwendet, deren

Expression von dem σ54-Faktor (RpoN) abhängt. Die identifizierten Gene vermittelten

unter anderem den Metabolismus von Nitrat, Harnstoff und ungeladenen Aminosäuren

(Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Serin) als N-Quellen, sowie C4-Dicarboxylaten

(Succinat, Fumarat) und α-Ketoglutarat als C-Quellen [Köhler et al., 1989]. Sowohl der

P. fluorescens Wildtyp-Stamm, sowie die Stämme P. fluorescens Pf-5, P. putida WT

und P. putida KT2440 WT zeigten eine Induktion durch Glutamat und eine Repression

bzw. keine Induktion durch Ammoniumchlorid und Glucose. Das vollständige Aus-

bleiben dieser Effekte bei der RpoN-defizienten P. putida-Mutante zeigt, daß die

periplasmatische Glutaminase-Asparaginase in diesem Stamm σ54-abhängig ist (vgl.

Abb. 4.11). Obwohl dies noch kein eindeutiger Beweis dafür ist, daß die Glutaminase-

Asparaginase auch in den anderen Stämmen von σ54 abhängt, so legt doch die nahe

Diskussion

123

Verwandtschaft der Organismen - sie gehören alle zu den fluoreszierenden Pseudomo-

naden und der RNA-Homologie-Gruppe I - die Vermutung nahe, daß auch bei ihnen die

Regulation dieses Enzyms σ54-abhängig ist.

5.2.4 Regulation anderer Asparaginasegene

In nicht sehr nah verwandten Organismen ist die Regulation der Asparaginasen sehr

unterschiedlich. So wird, wie bereits erwähnt, die Transkription des ansB-Gens in

E. coli durch das cAMP-Rezeptor-Protein (CRP) und durch das Produkt des fnr-Gens,

das FNR-Protein, positiv reguliert [Jennings & Beacham, 1990 und 1993; Jerl-

ström et al., 1987]. Durch diese Regulatorproteine kann E. coli die Expression von ansB

in Abhängigkeit von Kohlenstoffquellen, vor allem Glucose, und vom Sauerstoffgehalt

in der Umgebung regulieren. Dabei erfolgt die positive Regulation gleichzeitig durch

CRP und FNR [Jennings & Beacham, 1990 und 1993]. Der Grund für die Induktion

dieser Asparaginase unter Anaerobiose in E. coli ist, daß unter sauerstoff-limitierenden

Bedingungen der Stoffwechselweg der Fumarat-Atmung beschritten wird. Da Fumarat

unter anderem aus Aspartat gebildet wird, ist für eine ausreichende Fumarat-Versorgung

die Bildung von Aspartat aus Asparagin notwendig. In dem im Boden lebenden

Bakterium B. subtilis ist dagegen die Synthese der Asparaginase AnsA (Typ I) nicht von

CRP und FNR abhängig. Das Operon, das außer der Asparaginase (AnsA) auch noch

eine Aspartase (AnsB) codiert, wird durch Aspartat induziert und durch

Ammoniumionen reprimiert [Sun & Setlow, 1993].

Wie die proteinchemischen Untersuchungen und die Northernblot-Analyse zeigte, liegt

in der Pf-GA eine vollständig andere Regulation als in den bis jetzt bekannten

Glutaminasen-Asparaginasen vor. Das Enzym wird offenbar nicht durch seine Substrate

(Gln und Asn), sondern durch die Produkte Glutamat und Aspartat induziert. Eine

Induktion durch Substrate ist sinnvoll, wenn Asparagin oder Glutamin als einzige C-

und N-Quelle vorliegen. Durch die Induktion der Pf-GA sind die Zellen dann in der

Lage diese Aminosäuren als Nahrungsquellen zu nutzen und so zu überleben. Im

Gegensatz dazu ist die Induktion der Pf-GA durch Glutamat bzw. Aspartat als einziger

C- und N-Quelle nicht leicht zu verstehen.

Diskussion

124

In B. subtilis liegt das Gen für eine Asparaginase (ansA) zusammen mit einem

Aspartase-Gen (ansB) in einem Operon. Dieses Operon wird sowohl durch Asparagin

als auch Aspartat als einziger C- und N-Quelle induziert bzw. transkribiert

[Sun & Setlow, 1993]. Da dabei immer beide Enzyme exprimiert werden, ist diese Art

der Regulation sinnvoll, wenn auch nicht unbedingt aus energetischer Sicht. Denn eins

der beiden Enzyme kann auf jeden Fall das Substrat umsetzen. Eine mögliche Erklärung

für die Induktion der Pf-GA durch die Produkte Glutamat und Aspartat wäre, daß durch

Glutamat nicht nur die Pf-GA, sondern auch weitere Enzyme induziert werden. Eine

2D-Gel-Analyse zeigte, daß in P. fluorescens durch Glutamat außer der Pf-GA noch

weitere Proteine in induziert werden, die bei Wachstum auf Glucose / Ammonium-

chlorid-Medium nicht vorkommen [Klöppner, 1999]. Glutamat und Aspartat könnten

also ein globales Regulationssystem in P. fluorescens anschalten, durch das koordiniert

mehrere Proteine induziert werden. Solche globalen Regulationssysteme, wurden bereits

in den phytopathogenen Pseudomonaden P. syringae und P. viridiflava sowie in dem

Biokontrollstamm P. fluorescens Pf-5 identifiziert [Corbell et al., 1995]. In Pf-5 wird

z. B. durch ein klassisches Zwei-Komponenten-Regulationssystem die Produktion

verschiedener Antibiotika (Pyoluteorin, Pyrrolinitrin, 2,4-Diacetylphloroglucinol),

HCN, extrazelluläre Proteasen und eine Tryptophan-Seitenketten-Oxidase reguliert. Die

Systeme in den beiden phytopathogenen Stämmen besitzen zwar Ähnlichkeit mit dem

System in Pf-5, nur ist dort das Regulationssystem an der Pathogenese der

Pseudomonaden beteiligt [Corbell et al., 1995] Durch welche Verbindungen diese

Regulationssysteme, die immer auch eine Sensorkinase-Komponente enthalten,

angeschaltet werden, ist bis jetzt nicht bekannt. Deshalb kann auch nicht gesagt werden,

ob Glutamat im P. fluorescens WT ein entsprechendes Regulationssystem induziert.

Eine weitere mögliche Erklärung ist allerdings an die Voraussetzung gebunden, daß

Glutamat und Aspartat immer zusammen mit Glutamin und Asparagin von den Wurzeln

exsudiert werden. Unter solchen Bedingungen würde eine Induktion der Pf-GA durch

Glutamat und Aspartat gleichzeitig die Verwertung von Asparagin und Glutamin

ermöglichen.

Diskussion

125

5.3 Die Glutaminase-Asparaginase des Biokontroll-StammesP. fluorescens Pf-5

Hinweise für die Beteiligung der Pf-GA an der Biokontrolle waren die durchgeführten

Polymerase-Kettenreaktionen mit „Template-DNA“ aus verschiedenen phytopatho-

genen und pflanzenfördernden Pseudomonaden. Mit den Stämmen P. fluorescens Pf-5,

W24 und P. chlororapsis wurden PCR-Amplifikate erhalten, die der Größe des

P. fluorescens Wildtyp-Fragments entsprachen (vgl. Abb. 4.11). Bei den phytopatho-

genen Stämmen wurden keine entsprechenden PCR-Amplifikate erhalten (vgl. 4.14). In

Übereinstimmung damit steht, daß in diesen Stämmen auch keine Pf-GA-Aktivität

nachweisbar ist [Klöppner, 1999]. Ein Vergleich der DNA und der daraus abgeleiteten

Proteinsequenzen des aus P. fluorescens Pf-5 klonierten PCR-Fragments ergab hohe

Übereinstimmung mit der Pf-GA-Sequenz. Die großen Übereinstimmungen sind wegen

der Verwandtschaft der beiden Organismen nicht überraschend. Durch die Klonierung

des ansB-Gens aus Pf-5 wurde das Vorhandensein der Pf-GA auch auf molekularer

Ebene bestätigt. Allerdings muß beachtet werden, daß die PCRs mit P. fluorescens-

spezifischen Primern (PSGA1, PSGA2) durchgeführt wurden. Hinzu kommt, daß die

beiden Primer nicht innerhalb des Gens, sondern vor dem Start- und hinter dem

Stopcodon hybridisierten. Selbst wenn die DNA-Sequenzen innerhalb der ansB-Gene

ähnlich sein oder übereinstimmen würden, so ist die Wahrscheinlichkeit relativ gering,

daß die DNA-Sequenzen auch außerhalb der Gene übereinstimmen. Außerdem findet

man häufig größere Übereinstimmungen auf Protein- als auf DNA-Ebene. Dennoch

zeigen die Ergebnisse, daß Glutaminasen-Asparaginasen in vielen Pseudomonas-Arten

vorkommen.

5.4 Transposon-Mutagenese zur Identifizierung weiterer amAminosäurestoffwechsel beteiligter Enzyme

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war, durch Transposon-Mutagenese Mutanten

zu suchen, die einen Defekt in der Pf-GA oder in einem anderen am Stoffwechsel der

Aminosäuren Asparagin, Aspartat, Glutamin und Glutamat beteiligten Protein besitzen.

Durch die Untersuchung solcher Mutanten sollten dann außer Enzymen, die die

Aminosäuren verwerten, auch wichtige Regulatorproteine und Regulationsfaktoren

Diskussion

126

identifiziert werden. Für die Mutagenese wurde eine Zufalls-Transposon-Mutagenese

mit einem Tn5-Element gewählt.

Transposon-Elemente sind eigenständige DNA-Elemente, die die Fähigkeit besitzen,

sich an neue Stellen innerhalb des Genoms ihrer Wirtsorganismen zu bewegen. Dieser

Transpositionsprozeß ist unabhängig von den klassischen homologen Rekombinations-

system (rec) des Organismus. Die Insertion eines Transposon-Elements setzt keine

Homologie zwischen den Enden des Elements und der Zielstelle voraus. Transposon-

Elemente wurden in einer Vielzahl prokaryotischer und eukaryotischer Zellen gefunden,

die sich in ihrem Aufbau und Merkmalen unterscheiden. Sie verursachen Deletionen,

Duplikationen, Inversionen, Amplifikationen und Translokationen, und können zur

Einführung spezieller Gene in das Genom eines Ziel-Bakteriums genutzt werden. Durch

die Tatsache, daß sich die Transposon-Elemente ohne die Rekombinationsmechanismen

der Zelle in das Genom ihrer Wirtszellen integrieren können, bietet die Transposon-

Mutagenese auch eine Möglichkeit zur genetischen Manipulation von anderen Bakterien

als E. coli. Vor allem bei Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Mikroorga-

nismen und Pflanzenwurzeln wurden durch Transposon-Mutagenese viele wichtige

Ergebnisse gewonnen. So konnte z. B. die Reaktion eines P. fluorescens Stammes auf

Kohlenstoff-limitierenden Bedingungen im Boden untersucht werden [van Overbeek

et al., 1997]. Auch für Besiedelungsstudien wurde die Transposon-Mutagenese

eingesetzt. Dabei wurden die zu untersuchenden Bakterien durch verschiedene „Nicht-

Antibiotika“-Kassetten, z. B. lacZ oder GFP, markiert, so daß sie leicht identifiziert

werden konnten [Fedi et al., 1996; Burlage et al., 1996].

5.4.1 Das Transposon Tn5-OT182

Tn5 ist das am häufigsten eingesetzte Transposon-Element zur Untersuchung von

Gram-negativen „Nicht-E. coli“ Spezies. Der Grund dafür sind die Vorteile, die Tn5

gegenüber anderen Transposons besitzt. Dazu gehören die hohe Übertragungsfrequenz

in das Genom einer Vielzahl von Bakterienspezies, die unspezifische Insertion, sowie

die geringe Wahrscheinlichkeit für Genom-Wiederherstellung durch Transposition.

Außerdem bleibt das Transposon nach seinem Einbau in das Wirtsgenom sehr stabil

erhalten [Simon et al., 1989]. Bis jetzt wurden die unterschiedlichsten Tn5-Elemente

(Transposon-Vektoren) für die Untersuchung von Bakterien-Pflanzen-Wechsel-

Diskussion

127

wirkungen eingesetzt [Fedi et al., 1996; van Overbeek et al., 1997; van Elsas et al.,

1991]. Dabei enthielten die Tn-Elemente häufig Reportergene, durch die die Regulation

der Gene, die mutagenisiert wurden, direkt untersucht werden konnte.

Ein solches System ist das Transposon Tn5-OT182. Es ist von Tn5-B21 [Simon et al.,

1989] abgeleitet und wurde unter anderem zur Untersuchung von Pyoverdin-

Siderophor-Synthesegenen in P. aeruginosa verwendet [Merriman & Lamont, 1993].

Das Plasmid pOT182 (vgl. Abb. 3.4) das das Tn5-OT182 trägt, ist ein „Selbst-

klonierungs-Vektor“ mit einer breiten Wirtsspezifität. Außer dem ColE1-

Replikationsursprung, der die Klonierung von DNA direkt neben dem Tn erlaubt,

enthält es noch ein promotorloses lacZ-Reportergen, das die Untersuchung der

Transkription der Gene ermöglicht, in die das Tn5-Element inseriert wurde. Zur

Selektion von positiven Transkonjuganten trägt es Gene, die Resistenz gegen

Tetrazyklin und β-Lactame codieren.

5.4.2 Selektionsstrategien

Um Mutanten zu identifizieren, die Defekte an der Verwertung der oben genannten

Aminosäuren besaßen, wurden die Transkonjuganten nach Verlust des Donors von

M9+-Platten auf M9--Minimalplatten umgesetzt, die anstelle von Glucose und

Ammoniumchlorid eine der Aminosäuren Asparagin, Aspartat, Glutamin, Glutamat

sowie Succinat als einzige C- und N-Quelle enthielten. Succinat wurde als Nährstoff

gewählt, weil es ein wichtiges Intermediat des Zitratzyklus ist. Auf den einzelnen

Platten sollten nur Mutanten wachsen, die keine Defekte in der Verwertung der

jeweiligen Aminosäure hatten. Zum Umstempeln wurde ein Samtstempel nach

Lederberg verwendet. Dadurch entstand zum einen das Problem, daß nicht so viele

Mutanten pro Platte umgestempelt werden konnten wie gewünscht, da sonst eine

Trennung der umgesetzten Bakterien schwierig war. Das größte Problem dieser

Selektion war aber sicherlich, daß immer nach nicht-wachsenden Mutanten gesucht

werden mußte. Auf diese Weise stand kein eindeutiges Merkmal zur Verfügung, nach

dem man suchen konnte. Ein weiterer Nachteil dieser Selektion ist, daß es mehr als ein

Enzym für die Verwertung der einzelnen Aminosäuren geben kann. In diesem Fall kann

ein Defekt in einem dieser Enzym durch andere kompensiert werden. Deshalb wurde die

Selektion teilweise etwas spezifischer gestaltet und zusätzlich noch Tests zur

Diskussion

128

Identifizierung von Mutanten durchgeführt (vgl. Abb. 4.13). Dabei waren spezifische

Tests nur für die Untersuchung der Pf-GA-Aktivität (AHA-Test) und für Mutanten mit

Defekten in der Glutamatverwertung (Glutamat-Test) möglich. Allerdings blieb auch

hier das Problem bestehen, daß nichts darüber bekannt ist, wieviele Enzyme an der

Verwertung der einzelnen Aminosäuren beteiligt sind.

Der erste Teil der Selektion (Abb. 4.13 (1)) war zunächst nur auf die Suche von

positiven Transkonjuganten angelegt. Diese wurden dann mit weiteren Tests auf

Defekte in der Pf-GA (AHA-Test) und Glutamatverwertung (Glutamat-Test) untersucht.

Aufgrund der sehr großen Zahl an Transkonjuganten, die bei dieser Selektion anfielen,

wurde der AHA-Test in Mikrotiterplatten durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß das

teilweise extrem unterschiedliche Wachstum der Kolonien, die Meßergebnisse

verfälschte. Außerdem bestand die Gefahr, daß durch absterbende und lysierende Zellen

die cytosolische Asparaginase freigesetzt und deren Aktivität zusätzlich gemessen

wurde. Für den Glutamat-Test waren solche Probleme nicht zu erwarten, da durch die

Messung nur der Gesamtverbrauch an vorgegebenen Glutamat bestimmt wurde. Auch

bei diesem Test können Defekte in einem Enzym, das durch ein zweites ausgeglichen

wird, nur dann festgestellt werden, wenn das zweite Enzym eine wesentlich geringere

Umsatzrate besitzt.

Zur weiteren Selektion wurden die Transkonjuganten auf Asparagin als einzige C- und

N-Quelle umgesetzt. Mutanten, die auf diesen Platten nicht wachsen, sollten einen

Defekt in der Asparaginverwertung besitzen. Um festzustellen, ob der Defekt in der Pf-

GA lag, wurden AHA-Tests und PCRs durchgeführt.

Aufgrund der sehr großen Zahl der Mutanten, die getestet werden mußten und durch die

Probleme bei dem AHA-Test in den Mikrotiterplatten, wurde die Selektion weiter

eingeschränkt. Dazu wurden die Zellen nach der Konjugation auf Glutamat als einzige

C- und N-Quelle umgesetzt (vgl. Abb. 4.13 (2)). Die Mutanten, die auf diesen Platten

wuchsen, sollten keine Defekte in der Glutamatverwertung (Abbau und Transport)

besitzen (vgl. Abb. 5.5). Auch hierbei tritt wieder das Problem auf, daß ein Defekt in

einem dieser Enzyme nicht bemerkt wird wenn die Zellen mehr als ein Glutamat-

verwertendes Enzym haben. Auch diese Zellen wurden auf Asparagin als einzige C- und

N-Quelle umgesetzt. (vgl. Abb. 5.6).

Diskussion

129

Glutamat im Periplasma

Abb. 5.5: Selektionsstrategie für die Suche nach Transposon-Mutanten

Mutanten, die hier nicht wuchsen, wurden durch AHA-Tests und PCRs auf Defekte in

der Pf-GA untersucht. Obwohl einige Kolonien auf den Asparaginplatten nicht

wuchsen, zeigten sie normale AHA-Aktivitäten und eine spezifische ansB-Bande. Der

Grund dafür ist nicht ganz klar. Eine Erklärung dafür könnte sein, daß zwar die Pf-GA

intakt ist, aber ein Transporter Defekte aufweist, der sowohl Asparagin als auch

Aspartat transportiert. Eine andere Möglichkeit wäre, daß das Aspartat in der Zelle nicht

weiter umgesetzt werden kann. Da es keine geeignete Möglichkeit gab, die Asparagin-

und Aspartat-Aufnahme der Zellen genau zu bestimmen, konnten die Mutanten nicht

auf Transportmängel untersucht werden. Der Grund, daß auch bei den Glutamat-Test

keine Mutanten eindeutig identifiziert wurden, kann z. B. damit zusammenhängen, das

es in Gram-negativen Bakterien mehr als ein Transportsystem für die Aminosäuren Asp,

Asn, Gln und Glu gibt. So sind in E. coli schon drei Transportsysteme für diese

Transport ins Cytosol kein Transport in Cytosol

keine Mutation imGlutamat-Transporter

Defekt imGlutamat-Transporter

Zellen sterbenAbbau im Cytosol kein Abbau im Cytosol

keine Defekte in derGlutamat-Verwertung

Mutation in einemGlutamat-abbauenden

Enzym

Umsetzen aufAsparagin Zellen sterben

s. Abb. 5.6

Diskussion

130

Aminosäuren bekannt. Aber auch in verschiedenen Rhodobacter-Spezies wurden mehr

als ein Transporter entdeckt [Jacobs et al., 1995; Zheng & Haselkorn, 1996]. Bei

Untersuchungen an Rhodobacter sphaeroides wurde festgestellt, daß nach Inaktivierung

eines Transporters ein weiterer Transporter noch aktiv ist. Dieser hatte allerdings eine

wesentlich geringere Aktivität [Zheng & Haselkorn, 1996].

Mit der letzten Selektion (Abb. 4.13 (3)) sollten Mutanten mit Defekten in der

Glutaminverwertung gesucht werden. Diese Selektion beruhte auf dem Einsatz des

toxischen Glutaminanalogen γ-Glutamylhydrazid. Wenn dieses Substrat abgebaut wird,

werden toxische Hydraziniumionen freigesetzt, die zum Tod der Zellen führen. Dabei

war es möglich, sowohl Mutanten mit einem Glutamat-Abbau-Defekt, als auch

Transport-Mutanten zu identifizieren. Aufgrund der Tatsache, daß außer der Pf-GA

nichts über Glutamin-verwertende Enzyme bekannt war, hatte auch diese Selektion

Mängel. In Abbildung 5.7 sind die verschiedenen Möglichkeiten schematisch

dargestellt, die bei dieser Selektion berücksichtigt werden müssen.

Da nicht genau bekannt ist, ob Hydraziniumionen über einen Transporter oder über

Diffusion in die Zelle gelangen, kann es sich bei Zellen, die überleben (Abb. 5.7 (1)),

um Transport-Mutanten (defekter Transporter für Hydraziniumionen) handeln.

Bei der Möglichkeit Abb. 5.7 (2) können nur Mutanten identifiziert werden, wenn die

beim Abbau entstandenen Hydraziniumionen in die Zelle gelangen. Ob Defekte in der

Pf-GA vorliegen, wurde mit einem AHA-Test untersucht. Bei der Möglichkeit in

Abb. 5.1 (3)) wird vorausgesetzt, daß keine Defekte in der Pf-GA vorliegen und die

Hydraziniumionen nicht in die Zelle gelangen. In diesem Fall würden die Bakterien nur

überleben, wenn die Zellen Defekte in einem Glutamin-Transportsystem besitzen. Dies

ist allerdings eher unwahrscheinlich. Ob ein solcher Defekt vorliegt, kann unter der

Voraussetzung, das Glutamin und Glutamat von demselben Transportprotein in die

Zelle transportiert werden, mit dem Glutamat-Test untersucht werden. Die meisten

Aminosäure-Transporter sind Bindeprotein-abhängige Transportsysteme, bei denen der

Transport mit der Hydrolyse von ATP gekoppelt ist [Zheng & Haselkorn, 1996; Jacobs

et al., 1995, Krämer, 1999]. Außerdem gibt es durch die protenmotorische Kraft

angetriebene Transportproteine. Die Bindeprotein-abhängigen Systeme transportieren

Abb. 5.6: Selektionsstrategie für die Suche nach Mutanten mit Defekten in der Asparaginverwertung

Asparagin im Periplasma

kein Abbau

Pf-GA-defizienteMutante

Transport in Cytosol

keinAbbau

Abbau

Tn5 insertiert nureinmal pro Genom.

Deshalb könnendiese Mutanten

überleben, da keinTransporter defektsein kann. Pf-GA-Mutation nur mit

AHA-Testfeststellbar

Zellen leben

Defekt incytosol.

Asparaginase o.a.Asn-

abbau-endenEnzym

da Pf-GA funktions-fähig überleben die

Zellen

Zellenleben

kein Transportins Cytosol

wenn Pf-GA undder Asp-Trans-porternichtdefekt

Zellen leben

Pf-GA ok,aber ein

Transporterfür

Asp/Asndefekt

keinTransport

von Asn/Aspins Cytosol

Zellen sterben

Abbau

NH4+ + Asp

Transportkein Transport

Abbau kein Abbau

Zellenleben

Defekt im Asp-abbauendenEnzymenZellen sterben

Asp-TransportMutante

Diskussion

132

meistens mehr als eine Aminosäure. Bekannt sind Transporter, die entweder

Glutamin/Glutamat, Asparagin/Aspartat, Asparagin/Glutamin oder Aspartat/Glutamat

transportieren. Das ist möglich, da diese Transportsysteme für die einzelnen

Aminosäuren jeweils ein Bindeprotein besitzen. Die integralen Membranproteine, die

den eigentlichen Transport bewirken, sind für die beiden Bindeproteine identisch.

Wie diese Ausführungen zeigen, war mit dieser Selektion auch keine eindeutige

Identifizierung von Mutanten möglich. Der Glutamat-Test sollte nur dann Mutanten

identifizieren, wenn ein Transporter für Glutamat und Glutamin vorliegt, bei dem die

integrale Membrandomäne defekt ist. Ein weiteres Problem war die Instabilität des γ-

Glutamylhydrazids. Im Falle des spontanen Zerfalls (vgl. Abb. 5.7 (4)), würden die

Zellen nur überleben, wenn die freigesetzten Hydraziniumionen nicht in die Zelle

gelangen. Bei der Selektion in Abb. 4.13 (2) wurden einige Mutanten gefunden, die

nicht mehr auf Asparagin wuchsen, obwohl sie eine spezifische ansB-Bande und AHA-

Aktivität zeigten. Diese Zellen müssen näher charakterisiert werden, um zu klären, ob

sie Transportdefekte besitzen.

Abb. 5.7: Selektionsstrategie für die Suche nach Mutantenmit γ-Glutamylhydrazid

γ-Glu im Periplasma

Abbau

Glutamat + Hydraziniumionen

Transportins Cytosolhierbei ohneBedeutung,da in den

Selektions-platten auchNH4Cl undGlucose ist.

Transportins

Cytosol

keinTransport

insCytosol

Zellensterben Zellen

überleben

kein Abbau

(1)

Pf-GA-Mutante

oderMutationin einemanderen

Gln-abbau-endenEnzym

Transport insCytosol

keinAbbau

imCytosol

Abbauim

Cytosol

Gln-Abbau-Mutante

Zellensterben

kein Abbau imPeriplasma + kein

Transport vonHydraziniumionen ins

Cytosol

defekterGln/Glu-Trans-porter

Transportvon γ-Glu

insCytosol

Zellenleben

Transport-Mutante

Abbau keinAbbau

Zellensterben

Zellenüber-leben

Abbau-Mutante

spontaner Zerfall von γ-Glu

Glu + Hydraziniumionen

Transport

Zellen sterben

keinTransport

Transport-Mutante oder es

gibt keinenTransporter für

diese Ionen

Zellen sterben

(2) (3) (4)

Diskussion

134

5.5 Identifizierung eines extrazellulären Endonukleasegens - endX

In dem Genbankklon, der das unvollständige ansB-Gen aus P. fluorescens enthielt, lag

stromabwärts ein weiterer offener Leserahmen. Die abgeleitete Amonisäuresequenz

dieses ORF ergab eine gute Übereinstimmung zu extrazellulären Nukleasen, DNasen

und Endonukleasen (vgl. Alignment in Abb. A2). Aminosäurereste, die in diesen

Enzymen hochkonserviert sind, sind auch im P. fluorescens-Protein konserviert.

Deswegen wurde das gefundene Gen mit endX (eine Endonuklease mit nicht genau

bekannter Funktion) bezeichnet. Das vorhandene Signalpeptid deutet auf eine Sekretion

des Enzyms ins Periplasma oder den Extrazellulärraum hin.

Endonukleasen, Nukleasen und DNasen sind Enzyme, die meistens unspezifisch

doppelsträngige und einzelsträngige, sowie zirkuläre DNA in Oligonukleotide spalten.

In einigen prokaryotischen Spezies wurden bereits extrazelluläre bzw. periplasmatische

DNasen identifiziert. Zu ihnen gehören die extrazelluläre Nuclease (NucM) aus dem

phytopathogenen Enterobakterium E. chrysanthemi [Moulard et al., 1993], die extra-

zelluläre DNase aus Aeromonas hydrophila [Ming Chung Chang et al., 1992], sowie die

extrazelluläre DNase I aus Vibrio cholerae [Focareta et al., 1991]. Auch bei weiteren

Vertretern der Vibrionaceae, wie z. B. V. parahaemolyticus, V. fluvialus, V. mimicus

und V. costicolus wurden solche Enzyme gefunden [Focareta et al., 1991]. Außerdem

wurde die periplasmatische Endonuklease von E. coli (EndoI) untersucht [Jekel et al.,

1995]. Obwohl die Gene für diese Enzyme kloniert und charakterisiert wurden, ist noch

nichts über ihre genaue biologische Funktion bekannt. Viele Gram-negative Bakterien

besitzen die Fähigkeit, bestimmte Proteine, unter anderem Proteasen und Cellulasen, in

den Extrazellulärraum zu sezernieren. Ein Grund für die Abgabe dieser Enzyme könnte

die Bereitstellung weiterer Nahrungsquellen sein. Die extrazellulären DNasen ver-

hindern auf jeden Fall die Aufnahme von Fremd-DNA. Das wurde durch die

Bestimmung der Transformationsraten von Nuclease-negativen V. cholerae-Mutanten

bewiesen [Focareta et al., 1991]. Bei E. chrysanthemi wird vermutet, daß eine höhere

Transformations- und Elektroporationsrate mit der Inaktivierung der DNasen

zusammenhängt. Welche Vorteile die Bakterien erhalten, wenn sie keine Fremd-DNA

aufnehmen, ist noch nicht geklärt. Es wird vermutet, daß sich die Bakterien durch

Verhinderung der Aufnahme von Fremd-DNA vor zu häufigen Veränderungen ihres

Genoms schützen. Obwohl die natürliche Transformation für die Anpassung der

Bakterien an sich ändernde Umweltbedingungen notwendig ist, würden zu häufig

Diskussion

135

auftretende Transformationen bzw. Rekombinationen eher schaden als nützlich sein.

Durch ein Vorkommen der Endonukleasen im Periplasma könnten sich die Bakterien

außerdem vor dem Eindringen von Bakteriophagen-DNA schützen.

Untersuchungen an V. cholerae weisen auf eine weitere mögliche Funktion der

extrazellulären DNasen hin. Für die Pathogenese von V. cholerae ist es notwendig, daß

die Bakterien die Dünndarmschleimhaut effizient besiedeln. Einen möglichen

Besiedelungsvorteil könnten die Cholerabakterien durch extrazelluläre DNasen erhalten.

Die Dünndarmschleimhaut enthält nämlich sehr viel DNA, die von abgestorbenen

Dünndarmepithelzellen stammt und eine sehr gute Stickstoff- und Kohlenstoffquelle

darstellt. Durch Sekretion der DNase in den Extrazellulärraum sind die Bakterien in der

Lage, die DNA abzubauen und die Nukleotide als Nahrungsquelle zu nutzen [Focareta

et al., 1991].

Für Biokontroll-Bakterien ist eine effiziente Besiedelung der Rhizosphäre ebenfalls

unerläßlich. Dazu müssen sie unter anderem um Nahrung mit anderen Mikroorganismen

konkurrieren. In der Ectorhizosphäre befinden sich neben dem Wurzelschleim auch

abgestorbene Wurzelkappenzellen. Wenn die Pseudomonaden durch Sekretion von

EndX die DNA der abgestorbenen Zellen als Nahrung nutzen könnten, besäßen sie

einen Besiedelungsvorteil. Ob EndX ein bedeutender Faktor für die Biokontrolle ist

kann allerdings nicht gesagt werden. Dazu müßte die Aktivität und Regulation dieses

Proteins genauer untersucht werden.

5.6 Ausblick

Bei den bisher durchgeführten Selektionen wurden noch keine eindeutigen Mutanten

festgestellt. Die Vermutung, daß es sich bei den durch die Selektion auf M9--

Glutamatplatten (vgl. Abb. 4.13 (2)) identifizierten Mutanten, um Transport-Mutanten

handelt, muß erst noch bestätigt werden. Dazu ist es zunächst notwendig ein Verfahren

zur einfachen Bestimmung der Aufnahme der einzelnen Aminosäuren zu entwickeln.

Da, wie bereits erwähnt, viele Aminosäure-Transporter mehr als eine Aminosäure

transportieren, kommt daher der Einsatz weiterer toxischer Substratanaloga von

Asparagin, Aspartat und Glutamat, in Frage. Toxische Substrate könnten auch helfen,

weitere Enzyme, die auch an der Verwertung der genannten Aminosäuren beteiligt sind,

zu erkennen. Am sinnvollsten wäre es aber, zunächst eine „knock-out“-Mutante des

Diskussion

136

P. fluorescens ansB-Gens herzustellen. Die Untersuchung solch einer Mutante könnte

zeigen, ob es im Periplasma weitere Enzyme für den Abbau von Glutamin und

Asparagin gibt. Dies würde auch eine etwas sicherere (differenziertere) Selektion nach

weiteren Mutanten ermöglichen. Außerdem würde die Konstruktion einer Pf-GA

„knock-out“-Mutante die Voraussetzung für Besiedelungsstudien schaffen. Durch einen

Vergleich der Besiedelungsfähigkeit des P. fluorescens WT und der Pf-GA-Mutante

kann dann auch geklärt werden, ob die Pf-GA für die Besiedelung und damit für die

Biokontrolle von Bedeutung ist. Da die Biokontrollfunktion von P. fluorescens Pf-5

bereits bewiesen wurde, wäre es auch sinnvoll, die genannten Untersuchungen vor allem

mit diesem Stamm fortzuführen. Weiterhin wäre es sinnvoll die Promotorstruktur des

ansB-Gens durch Deletionsmutagenese zu untersuchen. Dadurch könnten auch

Hinweise auf die genaue Regulation dieses Gens erhalten werden.

Zusammenfassung

137

6 Zusammenfassung

Die fluoreszierenden Pseudomonaden gehören zu Bodenbakterien, die als Biokontroll-Stämme eingesetzt werden. Ihr Habitat ist die Rhizosphäre vieler Getreide- und Gemüsearten.Die Wurzelexsudate dieser Pflanzen sind reich an Aminosäuren, dabei machen dieAminosäuren Asparagin, Aspartat, Glutamin und Glutamat bis zu 50 % aus.. In dem Wildtyp-Stamm P. fluorescens sollten Enzyme, die an der Verwertung der genannten Aminosäurenbeteiligt sind, identifiziert, kloniert und charakterisiert werden. In der vorliegenden Arbeitwurde ein Gen, das für eine Glutaminase-Asparaginase kodiert, aus dem P. fluorescens WT-Stamm kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte signifikanteHomologien zu bereits bekannten L-Asparaginasen-Glutaminasen des Typs II. Dabei war dieÜbereinstimmung auf Proteinebene mit der PGA aus Pseudomonas sp. 7A mit 88 % amgrößten. Das Gen wurde in Anlehnung an andere Asparaginasen des Typs II mit ansB, dasdavon abgeleitete Protein mit Pf-GA bezeichnet. Die Identifizierung eines Signalpeptidsdeutete auf eine periplasmatische Lokalisierung des Enzyms hin. Ein Aminosäurese-quenzvergleich der ersten 10 Aminosäuren, mit einer aus dem Periplasma des gleichenStammes nativ gereinigten Glutaminase-Asparaginase ergab eine 100 %ige Übereinstim-mung. Das Gen konnte als His8-tag-Protein in E. coli überexprimiert und überAffinitätschromatographie bis zur Homogenität gereinigt werden. Das gereinigte Enzymkonnte L-Glutamin, L-Asparagin und D-Asparagin als Substrate nutzen. DieseSubstratspezifität entsprach der Spezifität des nativ gereinigten Enzyms. Der Transkriptions-startpunkt wurde 79 bp stromaufwärts vom ATG-Startcodon identifiziert. Der Bereich um -24

und -12 zeigte eine völlige Übereinstimmung mit Consensus-Sequenzen von σ54-abhängigen

Promotoren. Daß das ansB-Gen unter Kontrolle eines σ54-abhängigen Promotors steht, wurdedurch Aktivitätsvergleiche der Glutaminase -Asparaginase mit einer RpoN-defizientenMutante von P. putida KT2440 bewiesen. Die Pf-GA wird durch Glutamat als einziger C-und N-Quelle im Medium induziert und durch NH4Cl und Glucose reprimiert. Während derWT P. putida KT2440 diese Regulation im Aktivitätstest zeigte, war diese Regulation bei derRpoN-Mutante vollständig ausgeschaltet. 447 bp stromabwärts vom ansB-Gen wurde einweiterer offener Leserahmen von 687 bp gefunden. Dieser ORF zeigte Übereinstimmungenzu extrazellulären DNasen bzw. Endonukleasen verschiedener Bakterien. Die Proteinsequenzdieses Enzyms zeigte ebenfalls ein Signalpeptid. Durch Northernblot-Analyse konntebewiesen werden, daß das ansB-Gen monocistronisch transkribiert wird. Die Regulation desansB-Gens konnte durch Northernblot-Analyse bestätigt werden. Dabei ergab die RNA, dieaus einer Kultur gewonnen wurde, die in Minimalmedium mit Glutamat als einziger C- undN-Quelle angezogen worden war, ein starkes Hybridisierungssignal mit einer spezifischenansB-Sonde, während die RNA aus einer M9-Glucose-NH4Cl-Kultur nur ein sehr schwachesSignal zeigte. Weiterhin wurde eine Glutaminase - Asparaginase aus dem BiokontrollstammP. fluorescens Pf-5 kloniert und sequenziert. Die DNA-Sequenz dieses Genes stimmte zu82 %, die Proteinsequenz zu 92 % mit dem ansB-Gen aus dem P. fluorecens WT überein.

Anhang

138

7 Anhang

PSGA 2 1441 CGCTACACATTCCCCGCGCGACACCCGCTGTCTGAATGGACCGTCAAAACCAACTGGCTT 1501 GATTTTAATAAGTTGCGAAATTCGTAACAGTTAAATACTGTATGCACGTACAGCACAGTA 1561 AGGAATATTCCGTGGCAACGTCTTCTTCCGCAGCGCAAACCTCGCCTGACGCCTATACGC 1621 GACTCGCCGTTCGTGTGCAAAAAATCATCAATTCGACCAACGCCCAGAAAGCCAAGGCCG 1681 CCCTGATCTTCCGTTTGCCGGACGAGCCAGAGGAGGAATGGGGGCGCTTGCTGGAAGAAA 1741 TAGCCGAGAACGACAACGTCACCCTCGCCTATCGGGATGATGGCGGCGTGCAGATATTCT

RBS 1801 GGGTTGTGCCGAAGGAAGATTGATTCAATGAGTGCCCGTTTTATTGCTGTTTTTTGCTTG G L C R R K I D S M S A R F I A V F C L 11

1861 TTTTTTACCGTTACCGCTCATGCTCAGGCGCCCCGAACCTTCAGTGAAGCCAAGAAAGTC F F T V T A H A Q A P R T F S E A K K V 31

1921 GCCTGGAAGCTCTACGCACCACAGTCCACGGAGTTCTACTGCGGCTGCAAATACAATGGC A W K L Y A P Q S T E F Y C G C K Y N G 51

1981 AACCGTGTGGATTTGAAAGCCTGCGGTTACGTCCCACGCAAAAATGCCAACCGCGCTGAC N R V D L K A C G Y V P R K N A N R A D 71

2041 GCATCGAATGGGAACACATCGTCCCGGCCTGGCAGATCGGGCATCAGCGCCAGTGCTGGC A S N G N T S S R P G R S G I S A S A G 91

2101 AAGCCGGTGGGCGCAAAAACTGTACGCGCTACGACGACGTGTTCAAGCGCGCCGAGGCGG K P V G A K T V R A T T T C S S A P R R 111

2161 ACCTGCACAACCTGGTGCCGAGCATCGGTGAGGTCAATGGCGACCGTAACAACTTCAGTT T C T T W C R A S V R S M A T V T T S V 131

2221 TTGGATGGCTGCCGGTGCAACGTGGGCAAGTACGGGTCATGCCTGACCCAGGTGGACTTC L D G C R C N V G K Y G S C L T Q V D F 151

2281 AAGGCCAAGAAGGTCATGCCCCGCCCATCCATTCGCGGGATGATCGCCCGGACCTATTTC K A K K V M P R P S I R G M I A R T Y F 171

2341 TATATGAGCAAACAATACGGCTTGCGCCTCTCCAAACAGGACCGCCAACTGTATGAAGCC Y M S K Q Y G L R L S K Q D R Q L Y E A 191

2401 TGGAACAAGACCTACCCCGTGCAACCTTGGGAGCGTCAGCGCAACCAGACCGTGGCGTGT W N K T Y P V Q P W E R Q R N Q T V A C 211

2461 GTGATGGGCCGCGGTAACGAGTTTGTCGGCCCGGTGAACCTGAAAGCCTGCGGCTGAAAA V M G R G N E F V G P V N L K A C G * 229

2521 TGGGCGGGACTGCCGCCCAACCTGCCGGTTACTGCGCAGTCTTGTGCTCGATAACCTGCG 2581 ACTCGGTATCATTTTTCTTGGCGCGTGCCAGTTTTTCGGTCAACAGGGCCTGCTTGGCTT 2641 CAGCTTCGGCCTTGCTCGCGAACGGGCCCAGCAAAACCTCGTCCTTGCCGTCGGTCTTCA 2701 CGATATAAAAATTGAAACCATGTTCCAGCAGCCAGGCGGTCAAGTCGGTGATCGCCTGCA 2761 GTTTGTGGTCTGGCGGGCCCACCCACACGTCCCACTCCTGAGCGGCAATCACCCCGGTTT 2821 GAGGCTGGTTCTCGGTCACGGCAGGCTTGGCCT

Abb. A1: DNA- und Proteinsequenz des Endonukleasegens (endX) aus P. fluorescens WT

Die DNA-Sequenz beginnt mit der Sequenzreihe, mit der der Primer PSGA2 hybridisiert (vgl. Abb. 4.1)

Anhang

139

1 50EndX ...MSARFIA VFCLFFTVTA HAQAPRT FSE AKKVAWKLYA PQSTEFYCGCsDNase_Ah ..MFRPLLSL CLALLVSAPA HADNIQT FRA AKQDLNKLYQ SHPVTFYCGCEndoI_Eco MYRYLSIAAV VLSAAFSGPA LAEGINS FSQ AKAAAVKVHA DAPGTFYCGCNuclM_Ech MLRNLVIFAV LGAGLTTLAA AGQDINN FTQ AKAAAAKIHQ DAPGTFYCGCsDNase_Vc ...MMIFRFV TTLAASLPLL TFAAPIS FSH AKNEAVKIYR DHPVSFYCGC F AK a K p FYCGC

51 100EndX KYN.. GNR.. V DLKACGYVP RKNANRADAS NGNTSSRPGR SGISASAGKPsDNase_Ah NIKFS GKKMA PDWESCGYLP GKQAERASRI EWEHVVPAWE FGHQLQCWQDEndoI_Eco KINWQ GKKGV VDLQSCGYQV RKNENRASRV EWEHVVPAWQ FGHQRQCWQDNuclM_Ech KINWQ GKKGT PDLASCGYQV RKDANRASRI EWEHVVPAWQ FGHQRQCWQDsDNase_Vc EIPWQ GKKGI P DLESCGYQV RKNENRASRI EWEHVVPAWQ FGHQLQCWQQ i Gkk Dl s CGY rK n RAsr ewehvvpaw f Ghq qcwq

101 150EndX V GAKTVRAT. .TTCSSAPRR TCTTWCRASV R.SMATVTTS VLD GCRCNVGsDNase_Ah G GRKNCGKS. DEFNRMEGDM HNLFPAIGEV NGDRANFRFS DWNGKP...NEndoI_Eco G GRKNCAKD. PVYRKMESDM HNLQPSVGEV NGDRGNFMYS QWNGGE...GNuclM_Ech G GRKNCTKD. DVYRQIETDL HNLQPAIGEV NGDRGNFMYS QWNGGE...RsDNase_Vc G GRKNCTRTS PEFNQMEADL HNLTPAIGEV NGDRSNFSFS QWNGVDG..V g Gr Knc e d hnl p ge V ngdr nf S wn G

151 200EndX K YGSCLTQVD FKAKKVMPR. PSI RGMIART YFYMSKQYGL R LSKQDRQLYsDNase_Ah Q YGKCQMLVD FKERQVQPPK GPVRGQIARA YLYMSQQYGL R LAAQQRKLYEndoI_Eco Q YGQCAMKVD FKEKAAEPP. ARA RGAIART YFYMRDQYNL T LSRQQTQLFNuclM_Ech Q YGQCEMKID FKSQLAEPP. ERA RGAIART YFYMRDRYNL N LSRQQTQLFsDNase_Vc T YGQCEMQVN FKERTAMAQ. SVQR.A IART YLYMSEQYGL R LSKAQTQLM YG C m vd FK p Rg IAR t Y YM q Y L Ls Qq QL

201 250EndX E AWNKTYPVQ PWERQRNQTV ACVMGRGNEF VGPVNLKACG ..........sDNase_Ah E AWDRQYPAD RWECERNRRI GKLQGNTN.. .. PFIEKQCQ ..........EndoI_Eco N AWNKMYPVT DWECERDERI AKVQGNHN.. .. PYVQRACQ ARKS......NuclM_Ech D AWNKQYPAT T WECTREKRI AAVQGNHN.. .. PYVQQACS PDAAPYYNGLsDNase_Vc Q AWNNQYPVS EWECVRDQRI EKVQGNSN.. ..LLCACK CP N......... AWn YP WEc R ri q Gn N p C

251 275EndX .......... .......... .....sDNase_Ah .......... .......... .....EndoI_Eco .......... .......... .....NuclM_Ech SLIMIAAVAT VAARWLTPAG HLPSDsDNase_Vc .......... .......... .....

Abb. A2: Alignment der P. fluorescens Endonuklease (EndX) mit bekannten extrazellulärenDNasen, Endonukleasen und Nukleasen

EndX = Endonuklease aus P. fluorescens WT; sDNase_Ah = extrazelluläre DNase aus A. hydrophila;sDNase_Vc = extrazelluläre DNase aus V. cholerae; EndoI_Eco = Endonuklease I aus E. coli; NuclM_Ech =Nuklease aus E. chrysanthemi

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Dissertation - archiv.ub.uni-marburg.de · CCH3 O 2,4-Diacetylphloroglucinol 1.3 Klassifizierung der Pseudomonas-Pflanzen-Wechselwirkung Nach Lugtenberg [Lugtenberg et al., 1992]