Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die ... fileEinfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die

Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die interbakterielle

Kommunikation von Pseudomonas aeruginosa

Vom Fachbereich für Biowissenschaften und Psychologie

der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina

zu Braunschweig

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

(Dr.rer.nat.)

genehmigte

D i s s e r t a t i o n

von Florian Bredenbruch

aus (Geburtsort) Langenhagen

1. Referent: Professor Dr. Jürgen Wehland

2. Referent: Professor Dr. Dieter Jahn

eingereicht am: 10.10.2005

mündliche Prüfung (Disputation) am: 12.01.2006

Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung des Fachbereichs für

Biowissenschaften und Psychologie, vertreten durch die Mentorin oder den Mentor/die

Betreuerin oder den Betreuer der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:

Publikationen

Bredenbruch,F., Nimtz,M., Wray,V., Morr,M., Muller,R., and Haussler,S. (2005)

Biosynthetic pathway of Pseudomonas aeruginosa 4-hydroxy-2-alkylquinolines J

Bacteriol 187: 3630-3635.

Wehmhoner,D., Haussler,S., Tummler,B., Jansch,L., Bredenbruch,F., Wehland,J.,

and Steinmetz,I. (2003) Inter- and intraclonal diversity of the Pseudomonas aeruginosa

proteome manifests within the secretome J.Bacteriol. 185: 5807-5814.

Tagungsbeiträge

Florian Bredenbruch, Robert Geffers, Manfred Nimtz, Jan Buer and Susanne

Häussler

The Pseudomonas quinolone signal is a powerful iron chelator: link between the iron- and

the quinolone signal-regulons in Pseudomonas aeruginosa (Poster) 2. DGHM-VAAM

Jahrestagung in Göttingen (2005)

Florian Bredenbruch, Manfred Nimtz, Susanne Häußler (2003) Biosynthetic Pathway

of extracellular metabolites (4-hydroxyquinoliens) of Pseudomonas aeruginosa (Poster)

55. DGHM Jahrestagung in Dresden (2003)

I. INHALTSVERZEICHNIS

I

I. Inhaltsverzeichnis

I. INHALTSVERZEICHNIS ...................................................................................................I

II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .......................................................................................... 1

III. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................... 3

IV. TABELLENVERZEICHNIS ........................................................................................... 6

1. EINLEITUNG .................................................................................................................. 7

1.1. Taxonomie von Pseudomonas aeruginosa............................................................ 7

1.2. Allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa ...................................................... 9

1.3. P. aeruginosa: ein bedeutsamer opportunistischer Krankheitserreger.................. 9

1.4. Pseudomonas aeruginosa Virulenz Faktoren...................................................... 12

1.5. Quorum Sensing .................................................................................................. 16

1.5.1. Überblick ..................................................................................................... 16

1.6. Pseudomonas Quinolon Signal (PQS)................................................................. 19

1.7. Zielsetzung .......................................................................................................... 21

2. MATERIAL UND METHODEN ....................................................................................... 22

2.1. Nährmedien ......................................................................................................... 22

2.1.1. Vogel-Bonner Minimalmedium .................................................................. 22

2.1.2. Luria Bertani Medium (LB) ........................................................................ 23

2.1.3. Brain Heart Infusion Medium (BHI)(BD-Diagnostic Systems).................. 23

2.1.4. Columbia-Blut-Agar (Becton Dickinson) ................................................... 23

2.2. Anzucht, Stammerhaltung und Entsorgung von Bakterien ................................. 24

2.3. DNA Arbeitstechniken ........................................................................................ 25

2.3.1. Isolierung chromosomaler DNA ................................................................. 25

2.3.2. Isolierung von Plasmid DNA ...................................................................... 25

2.3.3. Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................... 25

2.3.4. Transposon Mutagenese .............................................................................. 26

2.3.5. Y-Linker Ligation........................................................................................ 27

2.4. RNA Arbeitstechniken und Techniken für Transkriptom Analysen ................... 30

2.4.1. Isolierung von bakterieller Gesamt-RNA.................................................... 30


II

2.4.2. Reverse Transkription ................................................................................. 31

2.4.3. Realtime PCR .............................................................................................. 33

2.4.4. Affymetrix Micro-Array-Analyse ............................................................... 35

2.5. Sonstige Methoden .............................................................................................. 37

2.5.1. Das Screening nach HAQ-negativen Transposonmutanten ........................ 37

2.5.2. HAQ Extraktion........................................................................................... 37

2.5.3. Dünnschichtchromatographie...................................................................... 38

2.5.4. Fütterung von markierten Substraten .......................................................... 38

2.5.5. GC/MS......................................................................................................... 39

2.5.6. Elektrospray Ionisations MS (ESI).............................................................. 41

2.5.7. NMR ............................................................................................................ 41

2.5.8. Bestimmung von Eisenkonzentrationen ...................................................... 41

2.5.9. Bestimmung der RhlR Promotoraktivität mit Hilfe einer rhlR-lacZ Fusion

auf dem Plasmid pMAL.V [Latifi et al., 1996] ........................................................... 42

2.5.10. In vitro DNA-Fragmentierung durch PQS .................................................. 42

2.5.11. Live/Dead Färbung ...................................................................................... 43

2.5.12. Anfärbung extrazellulärer DNA .................................................................. 43

3. ERGEBNISSE ................................................................................................................ 44

3.1. Biosynthese von 4-Hydroxy-2-alkylquinolonen (HAQs) bei P. aeruginosa ...... 44

3.1.1. Transposonmutagenese und Screen nach HAQ-negativen Mutanten ......... 44

3.1.2. Fütterungsexperimente mit möglichen HAQ Vorstufen ............................. 47

3.1.3. Rhamnolipide und HAQs haben einen gemeinsamer Fettsäurepool ........... 50

3.2. Effekt von PQS auf P. aeruginosa: Transkriptionelle Analyse .......................... 52

3.2.1. Realtime-PCR von P. aeruginosa nach Zugabe von PQS ........................... 53

3.2.2. Arrays von PAO1 nach 5, 12 und 20 h unter Zugabe von 40 µM PQS ...... 54

3.2.2.1. PQS und Eisen regulierte Gene ........................................................... 55

3.2.2.2. Durch PQS und durch oxidativen Stress regulierte Gene.................... 57

3.2.2.3. PQS und MvfR regulierte Gene .......................................................... 60

3.2.2.4. Sonstige PQS-regulierte Gene............................................................. 62


III

3.3. Vergleich der durch PQS-Zugabe regulierten Gene mit anderen P. aeruginosa

Transkriptionsstudien ...................................................................................................... 63

3.4. PQS Effekt auf die Eisenkonzentration............................................................... 64

3.5. PQS komplexiert Fe(III) in vitro ......................................................................... 66

3.6. Das Rhl-QS-System wird durch Eisenmangel induziert ..................................... 69

3.7. Die HAQ-Biosynthese wird eisenunabhängig durch PQS verstärkt ................... 70

3.8. Multiple Funktionen von PQS............................................................................. 70

3.8.1. Computermodell der Interaktion von PQS und DNA ................................. 71

3.8.2. PQS verstärkt die DNA Fragmentierung durch Fe(II) in vitro.................... 73

3.8.3. PQS fragmentiert in vivo DNA.................................................................... 74

3.9. PQS induziert einen bakteriellen Zelltod und die Bereitstellung von

extrazellulärer DNA ........................................................................................................ 75

3.10. PQS vermittelt morphologische Diversität in der späten Wachstumsphase.... 76

4. DISKUSSION ................................................................................................................. 78

4.1. HAQ Biosynthese................................................................................................ 79

4.2. Transkriptom Analyse unter Einfluss von PQS................................................... 81

4.2.1. PQS regulierte Gene: Eine Transkriptionsstudie......................................... 81

4.3. Molekulare Wirkmechanismen von PQS ............................................................ 84

4.4. Biofilme, Adaption und Überleben ..................................................................... 85

4.5. Ausblick............................................................................................................... 87

5. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................... 89

6. SUMMARY .................................................................................................................... 91

Anhang .............................................................................................................................. 105

Sequenzen der Transposonmutanten ............................................................................. 105

Ergebnisse des rhlR-lacZ Promotor Aktivitätstests....................................................... 111

Lebenslauf ......................................................................................................................... 115

II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

II. Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius µF Mikrofarad µg Mikrogramm µl Mikroliter µM Mikromolar AG Arbeitsgruppe bidest. zweimal destilliert Bp Basenpaar bzw. beziehungsweise cDNA komplementäre DNA CF Cystische Fibrose DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alteri (lat.) und andere Fe(II) zweifach positiv geladenes Eisen Fe(III) dreifach positiv geladenes Eisen g mittlere Erdbeschleunigung: 9,81 m/s2 ggf. gegebenenfalls h Stunde H2O Wasser HAQ 2-Alkyl-4-hydroxyquinolin HCl Salzsäure HHQ 2-Heptyl-4-hydroxyquinlin K2HPO4 Di-Kaliumhydrogenphosphat kV Kilovolt LB Luria-Bertani M Molar MBp Megabasenpaare MgSO4 Magnesiumsulfat min. Minute(n) ml Milliliter mM Millimolar mRNA Messenger Ribonukleinsäure ms Millisekunde N Normal NaCl Natriumchlorid NaNH5PO4 Natriumamoniumhydrogenphosphat NaOH Natriumhydroxid ng Nanogramm

II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

OD optische Dichte PBS Phosphat-gepufferte Natriumchlorid Lösung PQS Pseudomonas Quinolon Signal; 2-Heptyl-3-hydroxy-4-

quinolon ps Pikosekunde RNA Ribonukleinsäure rRNA ribosomale Ribonukleinsäure s Sekunde t Zeit TAE Tris-Acetat-EDTA Puffer Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U Einheit u.a. unter anderem u.s.w. und so weiter V Volt w/v Gewicht pro Volumen z.B. zum Beispiel Ω Ohm

III. ABBILDUNGSVERZEICHNIS

III. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1 Pseudomonas Arten in rRNA Gruppen aufgeteilt. (Abbildung aus [Bergey

et al., 1989]

7

Abbildung 1-2 Diversität von P. aeruginosa a: Mucoider Typ

b: SCV; c: „normaler Phänotyp“

11

Abbildung 1-3 Schema der Virulenzfaktor-Produktion von P. aeruginosa und deren

Lokalisation aus [van Delden und Iglewski, 1998]

16

Abbildung 1-4 QS-System von Vibrio fischeri aus [Miller und Bassler, 2001] 17

Abbildung 1-5 Schematische Darstellung der hierarchisch aufgebauten QS-Systeme von P.

aeruginosa (Las und Rhl) und der Interaktion mit PQS (Mitte) aus

[McKnight et al., 2000]

19

Abbildung 1-6 a: 2-Heptyl-3,4-dihydroxyquinolin (PQS) b: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin

(HHQ) c: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin-N-oxid

20

Abbildung 1-7 Postulierter Biosyntheseweg von HAQs und PQS in P. aeruginosa [Deziel

et al., 2004]

21

Abbildung 2-1 A: Y-Linker mit Linkerprimer. B: Der Linkerprimer kann erst nach dem

ersten Zyklus an die DNA Matrize binden, was unspezifischen PCR

Fragmenten vorbeugt

28

Abbildung 2-2 Beispiel von verschiedenen spezifischen Y-Linker PCR Produkten 29

Abbildung 2-3 Typisches Muster der isolierten und gereinigten RNA im RNA

BioAnalyzer. Das 16 S rRNA Signal sollte ca. die halbe Intensität des 23 S

rRNA Signals haben

31

Abbildung 2-4 Typische chromosomale DNA Kontroll PCR mit cDNA als DNA Matrize

(Spur 2, 4 und 6) und den zugehörigen Negativkontrollen ohne reverse

Transkriptase (Spur 3, 5 und 7) im cDNA Ansatz.

32

Abbildung 2-5 1: 50 Bp Leiter 2: cDNA 3: DNaseI fragmentierte cDNA 36

Abbildung 2-6 Typischer Versuchsaufbau der Array Versuche von der Kultivierung der

Bakterien unter verschiedenen Bedingungen (Oben und Unten) über die

RNA bis zur Hybridisierung der cDNA auf dem Chip

36

Abbildung 2-7 Typische SCV 20265 Kolonie mit HAQ-abhängigen Kristallstrukturen 37

Abbildung 2-8 HAQ-negative-Mutante mit Koloniemorphologie ohne Kristallstrukturen

(M1)

37


Abbildung 2-9 oben: Typisches Gaschromatogramm eines trimethylsylisierten total-HAQ

Extraktes von P. aeruginosa 1: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin (EI

Massenspektrum im unteren Bild) 2: 2-Heptyl-3,4-dihydroxyquinolin

(PQS) 3: 2-Nonyl-4-hydroxyquinolin 4: 2-Nonyl-3,4-dihydroxyquinolin 5:

2-Nonyl-2,4-dihydroxyquinolin 6: 2-Undecenyl-4-hydroxyquinolin; Unten:

EI Massenspektrum des trimethylsylilierten 2-Heptyl-4-hydroxyquinolins

mit typischem Fragmentierungsmuster

40

Abbildung 3-1 Ausschnitt aus dem Pyrimidin-Stoffwechselwegs 46

Abbildung 3-2 Dünnschitchromatographie von HAQ-Extrakten von Mutanten mit

Defekten im Pyrimidin oder Purin Stoffwechsel im Vergleich zur SCV

20265, die in LB, LB mit Uridine-5-Monophosphat, LB mit Inosine-5-

Monophosphat und LB mit Orotat angezogen wurden

47

Abbildung 3-3 A: Postulierter Biosyntheseweg von PQS: Kondensation von Anthranilat

und einer aktivierten β-keto Fettsäure zu PQS [Calfee et al., 2001]; B:

Mögliche Alternative der PQS Biosynthese in der Anthranilat und Orotat

als Vorstufen dienen.

48

Abbildung 3-4 A: Bei Fütterung mit markiertem Aspartat bleibt das MS

Fragmentionenmuster von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin unverändert mit

stärkstem Fragmention bei 231 m/z; B: Bei Fütterung mit markiertem

Anthranilat gibt es, entsprechend der Markierung, eine Verschiebung des

intensivsten Signals im Fragmentionenmuster von 2-Heptyl-4-

hydroxyquinolin um + 1 m/z auf 232 m/z

49

Abbildung 3-5 A: MS2 des 319 [m/z] Fragmentions von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin nach

Markierung mit [13C-1] Acetat; B: MS2 des 320 [m/z] Fragmentions von 2-

Heptyl-4-hydroxyquinolin nach Markierung mit [13C-2] Acetat

50

Abbildung 3-6 Vergleichende Dünnschichtchromatographie mit-HAQ Extrakten aus

verschiedenen Zeitpunkten von Kulturen der rhlG Mutante und dem PAO

Wildtyp

51

Abbildung 3-7 links: PAO1 Kultur in 10 ml BHI mit 40 µM PQS nach 12 h Wachstum mit

deutlicher Pyocyanin Grünfärbung verglichen zu der Kultur ohne PQS

(rechts)

52

Abbildung 3-8 Wachstumskurven von PAO1 mit unterschiedlichen PQS Konzentrationen 53

Abbildung 3-9 Relative Änderung der Transkription von rhlA und rhlR nach 5 h durch

PQS Zugabe

54

Abbildung 3-10 Schematische Abbildung der Fur abhängige Genregulation 55


Abbildung 3-11 Eisenkonzentration im BHI Kulturen in Abhängigkeit von Zeit und

zugegebenen PQS oder 2,2-Bispyridyl

65

Abbildung 3-12 A: ESI des PQS/ Fe(III) Präzipitat B: MS2 des 831,50 m/z Signals [3 PQS-

2H+Fe]+; Das Fragmention zerfällt leicht unter Abspaltung eines PQS in

[2PQS-2H+Fe] C: MS2 des 572,32 [m / z] Signals [2PQS-2H+Fe]+. Vom

stabilen Komplex werden CH2 bzw. CH3 Gruppen der Heptyl Ketten der

PQS Moleküle abgespalten. Der Komplex mit Eisen bleibt dagegen stabil.

68

Abbildung 3-13 Relative rhlR Promotor Aktivität nach 4 h und 7 h von PAO1, PAO1 mit 40

µM PQS und PAO1 mit 500 µM 2,2-Bispyridyl; Die Regulation war nach 4

h bei den Kolben mit 2,2-Bispyridyl und nach 7 h bei den Kolben mit 40

µM PQS signifikant (T-Test p-value < 0,05)

69

Abbildung 3-14 PQS-DNA Interaktion im Computermodell 72

Abbildung 3-15 HHQ interagiert nicht mit der DNA 72

Abbildung 3-16 verstärkte DNA Fragmentierung durch Fe(II) und PQS 1:Smart Leiter 2

und 3: λ-DNA 4: λ-DNA mit PQS 5: λ-DNA mit HHQ 6: λ-DNA mit Fe(II)

7: λ-DNA mit Fe(II) und PQS 8: λ-DNA mit Fe(II) und HHQ

73

Abbildung 3-17 Vergleichende DNA Fragmentierungsmuster von PAO1 und pqsA Mutante

nach 4 und 5 Tagen 1:PAO1 4Tage; 2: pqsA Mutante 4 Tage; 3: PAO1 5

Tage; 4: pqsA Mutante 5 Tage

74

Abbildung 3-18 SCV 20265 TOTO-1 Färbung der extrazellulären DNA nach zwei Tagen 75

Abbildung 3-19 M1(pqsA negative Mutante) TOTO-1 Färbung der extrazellulären DNA

nach zwei Tagen

75

Abbildung 3-20 SCV live and dead Färbung nach einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne

Bakterien leben

76

Abbildung 3-21 M1 live and dead Färbung nach einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne

Bakterien leben

76

Abbildung 3-22 a: ursprünglicher Morphotyp, b: durchsichtiger Morphotyp, c: kleiner

Morphotyp (keine SCV)

77

Abbildung 4-1 Möglicher Komplex von PQS und Fe(III) 82

IV. TABELLENVERZEICHNIS

IV. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Die fünf rRNA Ähnlichkeitsgruppen von Pseudomonas mit den zugehörigen Arten 8

Tabelle 2 Primer Sequenzen für die Realtime PCR 34

Tabelle 3 Liste der gefundenen HAQ negativen Mutanten: PA Nummern und Gen Namen von

www.pseudomonas.com

45

Tabelle 4 PQS-regulierte Gene, die in mindestes einer von zwei Transkriptionsstudien als

eisenabhängig reguliert identifiziert wurden [Ochsner et al., 2002; Palma et al.,

2003]

56

Tabelle 5 PQS-regulierte Gene, die in mindestens einer von zwei Transkriptionsstudien als

durch oxidativen Stress reguliert identifiziert wurden [Palma et al., 2004; Salunkhe

et al., 2005]

58

Tabelle 6 Durch PQS regulierte Gene, die auch in der Transkriptionsstudie einer mvfR

negativen Mutante reguliert erschienen [Deziel et al., 2005]

60

Tabelle 7 PQS-regulierte Gene, die weder in Transkriptionsstudien unter Eisenmangel, H2O2

Stress noch in einer mvfR negativen Mutante als differentiell reguliert identifiziert

wurden

62

Tabelle 8 Vergleich von zuvor in verschiedener Transkriptomstudien als reguliert

identifizierten Genen, mit den Genen, die in dieser Studie als durch PQS reguliert

identifiziert wurden

64

1. EINLEITUNG

- 7 -

1. Einleitung

1.1. Taxonomie von Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonaden wurde erstmals 1894 von Migula als eine phylogenetisch sehr heterogene

Gruppe gram-negativer Stäbchen mit polarer Begeißlung beschrieben. Nachdem sich in

den 30er Jahren eine Einteilung der Bakterien in Europa nach morphologischen Kriterien

und eine physiologische Taxonomie in den USA durchgesetzt hatten, wurden 1960 bis zu

60 Arten in die Gattung Pseudomonas eingeordnet. Erst die Einführung von DNA-DNA

und rRNA-DNA

Hybridisierungen brachte

weitere Fortschritte. Durch

die Möglichkeit der

Sequenzierung von DNA

[Fox et al., 1980] und der

Verwendung der gesamten

Sequenz von 16S rRNA als

phylogenetischer Marker

[Woese et al., 1985] ist es

heute möglich,

Pseudomonas

verwandtschaftlich korrekt

zu typisieren. Es gibt fünf

rRNA Homologie Gruppen

(siehe Abbildung 1-1 und

Tabelle 1). Heute wird P.

aeruginosa in die große

phylogenetische Gruppe der Proteobacteria, genauer in die Subgruppe der γ-Proteobacteria

und da in die Ordnung Pseudomonadales und in die Familie der Pseudomonadaceae

Abbildung 1-1: Pseudomonas Arten in rRNA Gruppen aufgeteilt.

(Abbildung aus [Bergey et al., 1989]

1. EINLEITUNG

- 8 -

eingeordnet. Es gehören nur noch 17 Arten zur eigentlichen Gattung Pseudomonas (rRNA

Gruppe I). Darunter befinden sich die fluoreszierenden Pseudomonaden wie P. flourescens

und P. aeruginosa, sowie pflanzenpathogene Arten wie P. syringae (pv. tomato DC3000,

6,4 MBp), P. cichorii, P. putida (KT2440, 6,18 MBp) und die nicht fluoreszierenden Arten

P. stutzeri und P. mendocina. In der rRNA Gruppe II finden sich Pathogene wie

Burkholderia cepatia, B. pseudomallei und B. mallei.

Tabelle 1: Die fünf rRNA Ähnlichkeitsgruppen von Pseudomonas mit den zugehörigen Arten

RNA

Gruppe Arten

I

Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. chlororaphis, P.

syringae, P. stutzeri, P. mendocina, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes,

P. agarici, P. angulata, P. fragi, P. synxantha, P. taetrolens, P. mucidolens,

P. oleovorans, P. resinovorans

II

Burkholderia cepacia, B. gladioli, B. caryophylli, B. pseudomallei, B.

mallei, Ralstonia solanacearum, R. pickettii, B. pyrrocinia, B.

andropogonis

III

Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, P. saccharophila,

Acidovorax facilis, A. delafieldii, P. alboprecipitans, Hydrogenophaga

palleronii

IV Brevundimonas diminuta, B. vesicularis

V Stenotrophomonas spp. incl. S. maltophilia, P. geniculata, P. gardneri

1. EINLEITUNG

- 9 -

1.2. Allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa ist ein gram-negatives, stabförmiges Bakterium von 1,5 – 3,0

µm Länge und 0,5 – 0,8 µm Breite und mit einer polaren Geißel beweglich. Neben der

Fähigkeit, eine Vielzahl an Kohlenstoffquellen aerob zu verstoffwechseln, kann P.

aeruginosa anaerob wachsen, indem nicht fermentativ NO3 und NO2 anstelle von O2 als

teminale Elektronen Akzeptoren für die Atmung genutzt werden (Denitrifikation). Arginin

kann für die Aufrechterhaltung der biologischen Systeme und damit für das

Langzeitüberleben der Bakterien unter anaeroben Bedingungen über eine Pyruvat Gährung

verstoffwechselt werden [Eschbach et al., 2004]. P. aeruginosa ist sehr anpassungsfähig

und kommt ubiquitär in wässrigen Habitaten und im Boden vor [Spiers et al., 2000]. Die

Genomgröße des sequenzierten Stamms PAO1 beträgt 6,26 MBp und teilt sich in 5570

mögliche offene Leserahmen auf [Stover et al., 2000]. Damit befindet sich das Genom in

der Größenordnung von einzelligen Hefen. Über 9 % der möglichen Leserahmen von P.

aeruginosa codieren für beschriebene oder vorhergesagte transkriptionelle Regulatoren

oder 2-Komponenten Systeme [Stover et al., 2000]. Das könnte ein Hinweis auf die große

Anpassungsfähigkeit von P. aeruginosa an unterschiedlichste Umweltbedingungen sein.

1.3. P. aeruginosa: ein bedeutsamer opportunistischer

Krankheitserreger

P. aeruginosa ist ein opportunistisches Bakterium und verfügt über ein sehr breites

Wirtsspektrum, zu dem Pflanzen, Tiere und Menschen zählen [Chastre und Fagon, 2002;

Hutchison und Govan, 1999; Lyczak et al., 2000]. Besonders kritisch sind P. aeruginosa

Infektionen im Krankenhausbereich. Die Bakterien können durch direkten

Patientenkontakt oder über unzureichend sterilisierte Materialien und das Pflegepersonal

übertragen werden. Zur Ausbildung von schweren Krankheitsverläufen beim Menschen

kommt es nach einer Infektion bei Mukoviszidose (Cystische Fibrose; CF) Patienten und

1. EINLEITUNG

- 10 -

bei immunsuprimierten Menschen, wie z.B. Transplantationspatienten,

Verbrennungsopfern oder Personen mit AIDS.

16 % aller nosokomialen Pneumonien gehen auf P. aeruginosa Infektionen zurück [Wiblin

und Wenzel, 1996]. Ein besonderes Risiko für eine Infektion stellt eine Beatmung der

Patienten dar. Die Ansteckungsgefahr nimmt mit der Dauer des Krankenhausaufenthalts zu

und die Mortalitätsrate ist, bei durch P. aeruginosa hervorgerufenen Pneumonien,

besonders hoch. Neben Pneumonien sind Harnwegsinfekte bei katheterisierten Patienten,

Wundinfektionen (besonders bei Brandwunden) und Infektionen der verletzten Kornea

häufig und können Ausgangspunkt für eine Sepsis sein. Auch hier ist die Mortalitätsrate

besonders hoch: bei AIDS Patienten enden 50 % der P. aeruginosa Septikämien tödlich

[Mendelson et al., 1994] und bei P. aeruginosa Infektionen von Verbrennungsopfern steigt

die Mortalitätsrate auf 60 % [Richard et al., 1994].

Eine besondere Bedeutung hat die P. aeruginosa Infektion für CF Patienten. Die CF wird

durch einen autosomal rezessiv vererbten Gendefekt hervorgerufen, bei dem das Gen,

welches für den CFTR Rezeptor kodiert (cystic fibrosis transmenbrane conductance

regulator), eine Mutation trägt, die zu einer fehlerhaften Chloridsekretion der Epithelien

führt. Dadurch sekretieren alle exokrinen Drüsen ein sehr zähflüssiges und wasserarmes

Sekret. Während früher die gastrointestinale Beteiligung (z.B. Pankreasinsuffizienz) im

Vordergrund stand, ist die CF heute vornehmlich eine Lungenerkrankung. Durch die

Bildung des schleimigen Sekrets in der Lunge von CF Patienten können Krankheitserreger

nicht ausreichend abtransportiert werden. In frühen Lebensjahren werden die Lungen der

CF-Patienten mit Keimen wie Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae und

Streptococcus pneumoniae besiedelt, die zwar akute Infektionen auslösen, die aber mit

Hilfe der heutigen Antibiotikatherapien effektiv therapiert werden können. Im späteren

Verlauf dominieren P. aeruginosa und B. cepacia als Ursache von Pneumonien. P.

aeruginosa stellt insgesamt den häufigsten Erreger bei chronisch infizierten CF Patienten

dar und ist die Ursache von schweren Lungenentzündungen. Diese Infektionen sind sehr

schwerwiegend, können durch Antibiotika nicht erfolgreich behandelt werden, und führen

in über 90 % der Fälle zum Tod. Ein Hauptgrund für die Persistenz von P. aeruginosa ist -

1. EINLEITUNG

- 11 -

neben der Produktion einer Vielzahl von Virulenzfaktoren - die Fähigkeit, in der Lunge so

genannte Biofilme auszubilden [Singh et al., 2000; Yoon et al., 2002]. Innerhalb dieser

dreidimensionalen und hochgradig organisierten Strukturen sind die Bakterien eingebettet

in eine extrazelluläre Matrix aus Alginat und DNA [Whitchurch et al., 2002], die einen

wirkungsvollen Schutz vor Antibiotika [Hentzer et al., 2001; Mah et al., 2003; Mah und

O'Toole, 2001] und vor Angriffen der Zellen des Immunsystems bietet [Pier et al., 2001].

Bakterien, die in Biofilmen wachsen, zeigen eine um den Faktor 100 - 1000 höhere

Antibiotika Resistenz im Vergleich zu planktonisch wachsenden Erregern. Eine Therapie

mit Antibiotika führt daher bei chronisch infizierten CF Patienten in der Regel nur zu einer

Reduktion der Keimzahl und nicht zu einer vollständigen Eradizierung der Bakterien.

Deshalb ist heute die Nachfrage nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten von

chronischen Infektionen sehr hoch.

P. aeruginosa passt sich während des Infektionsverlaufs gut an heterogene Habitate an und

belegt verschiedene Nischen [Oliver et al., 2000]. Mit fortlaufender Infektionsdauer

können aus einer bronchoalveolären Lavage verschiedene Varianten eines Klons isoliert

werden [Romling et al., 1994], die sich unter anderem in Ihrer Koloniemorphologie

unterscheiden .

Neben dem normalen Typ

können insbesondere der

mucoide Typ, der

aufgrund vermehrter

Alginat-Produktion

schleimige Kolonien

ausbildet, und

Mikrokolonie-Bildner

(small colony variants;

SCV) isoliert werden

(Abbildung 1-2). Für

SCVs konnte gezeigt

Abbildung 1-2: Diversität von P. aeruginosa a: Mucoider Typ

b: SCV; c: „normaler Phänotyp“

1. EINLEITUNG

- 12 -

werden, dass das Auftreten im Patienten mit einem schlechterem Algemeinzustand und

schlechteren Lungenfunktionsparametern korreliert [Haussler et al., 1999]. Die

morphologische Varianz finden wir nicht nur typischerweise im Respirationstrakt von

chronisch infizierten CF Patienten, sondern auch in in vitro Biofilm Kulturen [Boles et al.,

2004]. Der Mechanismus der morphologischen Varianz wird kontrovers diskutiert. Eine

Phasenvariation ist als Ursache postuliert worden [Drenkard und Ausubel, 2002; Dybvig,

1993], aber auch Mutation und Selektion kommen als Auslöser für die phänotypische

Variation in Frage [McLean et al., 2004; Rainey, 1999; Rainey und Cooper, 2004; Spiers

et al., 2000]. Varianz kann durch Hypermutator Stämme beschleunigt werden [Macia et

al., 2005; Oliver et al., 2000]. Auch eine stressabhängige, fehlerbehaftete DNA

Doppelstrang Reparatur durch homologe Rekombination wurde in E. coli als möglicher

Motor der Evolution postuliert [Ponder et al., 2005].

1.4. Pseudomonas aeruginosa Virulenz Faktoren

Pathogene Bakterien zeichnen sich dadurch aus, dass sie in geeigneten Wirten in der Lage

sind, Krankheiten hervorzurufen. Ein Maß der Pathogenität ist die Virulenz eines

Bakteriums. Zu den Virulenzfaktoren zählen z.B. hydrolytische Proteine, Toxine und

Oberflächen Proteine, die das Anhaften der Bakterien an Oberflächen erlauben oder sie

schützen.

Pseudomonas aeruginosa verfügt über eine Vielzahl an Virulenzfaktoren, die vorwiegend

unter der Kontrolle der Quorum Sensing (QS) Systeme stehen (siehe dazu unter 1.5.) und

zum größten Teil über drei verschiedene Sekretionssysteme sekretiert werden.

Im Typ I Sektretionssystem von P. aeruginosa werden z.B. alkalische Proteasen (aprA)

über ABC-Transporter sekretiert. Diese spalten extrazellulär eine große Bandbreite an

Substraten, darunter Zytokine wie IL-1, IL-2, IFN-γ, TNF, Immunoglobuline und

Komplementsystem-Bestandteile [Suter, 1994]. Es handelt sich um ein Protein mit zwei

Domänen, die beide ca. 230 Aminosäuren lang sind. Der N-Terminale Teil ist die

1. EINLEITUNG

- 13 -

katalytische Domäne, und der C-Terminus wird als Transportsignal für das Typ I

Sekretionssystem gebraucht, der das Protein durch das Periplasma in den extrazellulären

Raum sezerniert [Baumann et al., 1993].

Das Typ II Sekretionssystem ist vom Sec Translokationsapparat abhängig. Exotoxin A

wird mittels Typ II Sekretion transportiert und inhibiert in der Wirtszelle die

Proteinbiosynthese, indem der Elongationsfaktor-2 durch eine ADP-Ribolysierung

inaktiviert wird [Armstrong et al., 2002; Wedekind et al., 2001; Yates und Merrill, 2001;

Yates und Merrill, 2004]. Dieser Mechanismus ist identisch mit dem des Corynebacterium

diphtheriae Toxins. LasA (lasA) [Kessler et al., 1993; Kessler et al., 1998] und LasB

(lasB) sind Elastasen, die ebenfalls über das Typ II System sekretiert werden und die beide

ähnliche proteolytische Eigenschaften haben. Sie spalten z.B. Elastin, Kollagen,

Transferrin, Immunglobuline, sowie einige Bestandteile des Komplementsystems und

verursachen damit Gewebeschäden.

Über das Typ III Sekretionssystem werden ein oder mehrere der P. aeruginosa

Effektormoleküle (ExoS, ExoT, ExoU und ExoY) bei Zellkontakt durch einen Kanal direkt

in die Wirtstelle injiziert. Exoenzym S (exoS) und Exoenzym T (exoT) sind in der Struktur

homolog [Garrity-Ryan et al., 2000; Garrity-Ryan et al., 2004; Geiser et al., 2001]. Sie

verhindern über die Aktivierung der GTPase Aktivität von Rho, Cdc42 und Rac die

Phagozytose der Bakterien durch Makrophagen [Goehring et al., 1999]. Neben dieser GAP

Aktivität (GTPase Activating Protein) werden zwei Adapter Proteine (Crk-1 und Crk-2),

die Src homologe 2-3 Domänen besitzen und an der Signaltransduktion für lokale

Anheftung und Phagozytose beteiligt sind, durch eine ADP-Ribosyltransferase Aktivität

inaktiviert [Ganesan et al., 1998; Ganesan et al., 1999; Riese et al., 2002]. Diese Aktivität

ist bei dem Exoenzym S vom wirtseigenen 14-3-3 Protein FAS abhängig [Coburn et al.,

1991; Fu et al., 1993]. Bei dem Exoenzym U (exoU) handelt es sich um eine

Phospholipase, die die Membranen der Wirtszellen schädigten. Exoenzym Y (exoY) wird

ebenfalls über das Typ III System sekretiert und beeinflusst über eine Adenylatzyklase-

Aktivität wahrscheinlich den intrazellulären Spiegel an cAMP in den Wirtszellen [Yahr et

al., 1998].

1. EINLEITUNG

- 14 -

P. aeruginosa produziert darüber hinaus eine Phospholipase C (PLC) (plcH), die auf der

Oberfläche der Alveolar-Zellen die Phospholipide degradiert. Die Phospholipide sind dafür

verantwortlich, dass die Oberflächenspannung herab gesetzt wird, so dass die Alveolen

nicht beim Atmen kollabieren [Songer, 1997; Terada et al., 1999]. Die Zugänglichkeit der

Phospholipide wird durch ein weiteres Exoprodukt von P. aeruginosa, den Rhamnolipiden,

erhöht. Diese tensidisch wirkenden Moleküle werden aus Thymidine-diphospho-L-

Rhamnose und Produkten der Fettsäure-Biosynthese gebildet und sind ein

Hauptvirulenzfaktor von P. aeruginosa.

Die Anheftung an Oberflächen stellt eine weitere und sehr wichtige Eigenschaft von P.

aeruginosa dar, die zur erhöhten Virulenz beiträgt. Flagellen sind dabei notwendig, um

einen Zielort durch Schwimmen zu erreichen. 30 Genprodukte sind an der Ausbildung und

Funktion von Flagellen beteiligt [Adamo et al., 2004; Feldman et al., 1998]. Typ IV Pili

sind für die Anheftung an Oberflächen (z.B. Wirtszell Epithelien) und für das Bewegen auf

ihnen verantwortlich. P. aeruginosa bildet außerdem zwei Lipopolysaccharid-Formen aus,

wobei die A-Form ein Homopolymer aus α verknüpften D-Rhamnose Molekülen ist,

während die B-Form des LPS ein Heteropolymer ist. LPS Moleküle scheinen an CFTR

Proteine zu binden [Lyczak et al., 2000; Schroeder et al., 2002].

Ein weiterer wichtiger Virulenzfaktor, und Bestandteil des Biofilms in der CF Lunge, ist

Alginat. Es ist ein Polymer aus β-D-Mannuronsäure und α-L-Guluronsäure, die β -1,4

glykosidisch verknüpft sind. Alginat schützt die Bakterien vor Phagozytose [Pier et al.,

2001].

Eisen ist ein unverzichtbarer Kofaktor für Cytochrome und Eisen-Schwefel-Proteine der

Bakterien und wird in mikromolaren Konzentrationen benötigt. In wässrigen und aeroben

Habitaten liegt die Konzentration von freiem Fe(III) nur bei ca. 10-9 M bei pH 7.0. Im Wirt

dagegen steht nur noch Fe(III) in der Konzentration 10-18 M ungebunden zur Verfügung. P.

aeruginosa verfügt über zwei Siderophore zur Eisenaufnahme. Pyochelin bindet Fe(III)

und ist eine Substanz mit verhältnismäßig niedriger Affinität zum Eisen (5 X 105 M-1). Es

ist ein Produkt aus Salicyl-Säure und zwei Cysteinyl-Resten. Pyochelin bindet Fe(III) in

einer Stoichometrie von 2:1. P. aeruginosa exprimiert den Rezeptor FptA, der für den

1. EINLEITUNG

- 15 -

Transport von Eisen gebundenem Pyochelin ins Periplasma gebraucht wird [Ankenbauer et

al., 1985; Ankenbauer et al., 1988; Ankenbauer und Quan, 1994; DeWitte et al., 2001]. Im

Unterschied zu E. coli werden die eisengebundenen Siderophore bei P. aeruginosa nicht

ins Zytoplasma transportiert [Poole und McKay, 2003]. Pyochelin vermag auch Mo(IV)

und Co(II) zu binden.

Pyoverdin hat eine höhere Affinität zu Fe(III), als Pyochelin. Es ist ein Di-

Hydroxyquinolon, an das mit einer nicht ribosomalen Peptid-Synthase Aminosäuren

angehängt werden. Die Sequenz dieses Restes kann variieren. Dieses Siderophor hat eine

für P. aeruginosa typische grün-gelbe Farbe. Es bindet Fe(III) in einer Stoichometrie von

1:1 und wird über den spezifischen Rezeptor FpvA erkannt und transportiert [Meyer et al.,

1996; Shen et al., 2002]. Der alternative Sigmafaktor PvdS wird über das Eisen reguliert

und steuert die Synthese und den Transport von Eisen in die Bakterien [Poole und McKay,

2003]. Beide beschriebenen Siderophore können Eisen von Transferrin lösen [Xiao und

Kisaalita, 1997].

Pyocyanin ist das Pigment von P. aeruginosa, welches den Kulturen die charakteristische

blau-grüne Farbe verleiht. Es handelt sich hierbei um einen modifizierten Phenanzin-Ring.

Pyocyanin ist Teil eines Redox-Systems. Es kann offensichtlich Elektronen aus der

Atmungskette aufnehmen und sie auf Sauerstoff oder auf Fe(III) übertragen. Wenn das

Pyocyanin Elektronen aus der Atmungskette aufgenommen hat, wird es farblos. Man

spricht dann von Leukopyocyanin. Auf diese Weise kann z.B. Fe(III) von Transferrin

abgelöst werden [Cox, 1986]. Bei der Reduktion entstehen reaktive Spezies wie

Wasserstoffperoxid und Superoxid, die negativen Einfluss auf den Wirt haben und kritisch

für die Aufrechterhaltung der Infektion durch P. aeruginosa, z.B. in Mäuselungen, ist [Lau

et al., 2004; Ran et al., 2003].

1. EINLEITUNG

- 16 -

1.5. Quorum Sensing

1.5.1. Überblick

Ein Hauptunterschied zwischen eukaryotischen und prokaryotischen Lebewesen ist, dass

nur eukaryotische Zellen multizelluläre Organismen, und damit höhere Lebensformen,

ausbilden können. Das erfordert ein streng reguliertes Wachstumsverhalten der beteiligten

Zellen und oft auch eine Spezialisierung und Aufgabeteilung. Dazu ist eine

Kommunikation zwischen den Zellen notwendig. Diese Kommunikation wird mit Hilfe

von niedermolekularen Signalmolekülen, Hormonen, geführt. Wenn diese Verbindung

zwischen den Zellen abreißt, kann es dazu kommen, dass sich diese Zellen ungehemmt

teilen und dem gesamten Organismus schaden oder sogar seinen Tod zur Folge haben.

Abbildung 1-3: Schema der Virulenzfaktor-Produktion von P. aeruginosa und deren Lokalisation

aus [van Delden und Iglewski, 1998]

1. EINLEITUNG

- 17 -

Seit ca. 30 Jahren wird bei immer mehr Bakterienarten ein koordiniertes Verhalten

beobachtet, welches seit 1994 Quorum Sensing genannt wird [Fuqua et al., 1994]. Dabei

produzieren und sezernieren die Bakterien Signalmoleküle (Autoinducer), die, wenn eine

kritische Konzentration erreicht ist, einen transkriptionellen Regulator aktivieren. Auf

diese Weise können innerhalb einer Population zelldichteabhängig Gene reguliert werden.

QS ist bei gram-positiven und gram-negativen Bakterien beschrieben worden. Bei gram-

positiven Spezies, wie beispielsweise Staphylococcus aureus, werden artspezifische,

modifizierte Oligopeptide als Signale für zwei Komponenten Systeme verwendet. Die

Peptide akkumulieren in der Umgebung und werden als Signal für die Populationsdichte

über eine membrangebundene Histidin-Kinase erkannt, welche das Signal an einen

traskriptionellen Regulator (Respose Regulator) weiterleitet [Kleerebezem et al., 1997;

Kleerebezem und Quadri, 2001]. Besser untersucht wurde QS bei gram-negativen

Bakterien. Bei den meisten gram-negativen Arten, die QS Systeme haben, werden Alkyl-

Homoserinlaktone (AHL) als Signalmoleküle sezerniert. Dabei variieren die Moleküle in

Alkylkettenlänge und Substituenten bei den unterschiedlichen Arten [Miller und Bassler,

2001]. Für den Autoinducer-2 wurde gezeigt, dass er sowohl von gram-positiven, als auch

von gram-negativen Spezies gebildet und erkannt wird. Es wird deshalb vermutet, dass es

sich hierbei um ein Signalmolekül für universelle bakterielle Kommunikation handelt, ein

„Esperanto der Bakterien“ [Winans, 2002].

Quorum Sensing wurde zuerst bei dem

marinen Bakterium Vibrio fischeri

entdeckt, welches in den Leuchtorganen

der Tintenfischart Euprymna scolopes

lebt. Die Autoinducer Synthase LuxI

produziert ein N-3-(oxohexanonyl)

Homoserinlakton. Wenn die bakterielle

Population, und damit die Autoinducer,

eine bestimmte Konzentration erreicht

haben, binden diese AHL Moleküle

Abbildung 1-4: QS-System von Vibrio fischeri aus

[Miller und Bassler, 2001]

1. EINLEITUNG

- 18 -

intrazellulär an das LuxR Protein und aktivieren die transkriptionelle Aktivität des lux

Operons. Ein Teil des Operons ist auch das luxI Gen, so dass eine Autoinduktion der AHL

Produktion stattfindet (Abbildung 1-4). Bei sehr vielen gram-negativen Bakterien sind

LuxI/R QS-Systeme beschrieben worden.

P. aeruginosa besitzt zwei LuxI/R homologe QS-Systeme, die hierarchisch angeordnet

sind (Abbildung 1-5). Das Las-System dominiert dabei über das Rhl-System. Wenn in der

logarithmischen Phase das Las System aktiviert wird, produziert LasI ein N-(3-

oxododecanoyl) Homoserinlakton (3-O12 HSL; PAI-1) [Pearson et al., 1994]. Wenn ein

bestimmter Schwellwert erreicht wird, bindet der PAI-1 an LasR und aktiviert damit die

Transkription des LasR-Regulons [Gambello und Iglewski, 1991; Passador et al., 1993;

Passador et al., 1996; Pearson et al., 1997; Toder et al., 1991]. Neben Elastase, Alginat

und Biofilmbildung wird auch die Synthese des Pseudomonas Quinolon Signals (PQS) und

RhlI induziert. RhlI produziert den Rhl-System spezifischen Autoinducer Butyryl

Homoserinlakton (C4-HSL; PAI-2) [Pearson et al., 1995].

Dieser wiederum aktiviert durch seine Bindung an den transkriptionellen Aktivator RhlR

das Rhl-QS-Regulon. Unter der Kontrolle des Rhl-Systems stehen z.B. Virulenzfaktoren

wie Rhamnolipide, Pyocyanin und alkalische Proteasen [Pearson et al., 1997].

Die Regulation der QS abhängigen Gene ist ein sehr filigranes System, wobei nicht nur die

aktivierten Regulatoren des jeweiligen Systems, sondern auch andere abiotische Faktoren,

eine Rolle spielen können (z.B. Eisen und Sauerstoffgehalt)[Bollinger et al., 2001; Pearson

et al., 1997]. Des Weiteren gibt es Virulenzfaktoren, die von beiden QS Systemen aktiviert

werden (z.B. LasB), wogegen andere nur unter der Kontrolle von einem speziellen

Regulator stehen.

1. EINLEITUNG

- 19 -

1.6. Pseudomonas Quinolon Signal (PQS)

Neben den beschriebenen und sehr gut charakterisierten Autoinducer-Molekülen der

beiden QS Systeme Las und Rhl, wurde 1999 von Pesci et al. ein drittes Signal-Molekül

identifiziert, welches mit den QS Systemen interagiert [Pesci et al., 1999]. Dieses Molekül

unterscheidet sich strukturell von den AHL. Es handelt sich um ein 2-Heptyl-3-hydroxy-4-

qiunolon [Pesci et al., 1999] und gehört zu der Gruppe der 4-Hydroxy-2-alkylquinolinen

(HAQs) (Abbildung 1-6) [Deziel et al., 2004].

Abbildung 1-5: Schematische Darstellung der hierarchisch aufgebauten QS-Systeme von P.

aeruginosa (Las und Rhl) und der Interaktion mit PQS (Mitte) aus [McKnight et al., 2000]

1. EINLEITUNG

- 20 -

Die Strukturen unterscheiden sich durch

Substituenten am heterozyklischen Ringsystem

oder in der Alkylkettenlänge.

PQS wird in der späten logarithmischen Phase

gebildet [McKnight et al., 2000]. Die

Biosynthese von HAQs - wie PQS und der

biologisch inaktiven Vorstufe 2-Heptyl-4-

hydroxyquinolin (HHQ) - wird durch das

LasIR-QS System reguliert [McKnight et al.,

2000]. Weiterhin konnte mit Promotor-lacZ-

Fusionsstudien gezeigt werden, dass PQS

positiv auf die Transkription von rhlI und in

geringerem Maße auf lasR und rhlR wirkt

[McKnight et al., 2000]. Andere HAQs (2-

Heptyl-4-quinolon-N-Oxid und 2-Hydroxy-3-

heptyl-4-qionolon) wiesen diese Aktivität nicht auf [Pesci et al., 1999].

Da PQS erst in späten Wachstumsphasen gebildet wird, wurde diskutiert, dass PQS nicht

direkt für die Wahrnehmung der Zelldichte verantwortlich ist, sondern vielmehr für die

Modulation des Rhl-QS-Systems in der stationären Phase [McKnight et al., 2000].

Offensichtlich sind die Enzyme des Operons PA0996 – PA1000 (pqsA-E) für die

Biosynthese des PQS Moleküls verantwortlich. Auch die Produkte der Genloci PA1001 –

PA1003 (phnAB und pqsR(mvfR)), sowie PA2587 (pqsH) sind an der Synthese und der

Aktivität beteiligt [Diggle et al., 2003; Gallagher et al., 2002]. Scheinbar werden 4-

Hydroxy-2-heptylquinolin Moleküle (HHQs) in Abhängigkeit von PqsA-D synthetisiert,

aber nur PQS induziert das Rhl-QS-System. Dabei scheint PqsH für die Konversion von

HHQs zu PQS verantwortlich zu sein (Abbildung 1-7) [Deziel et al., 2004].

Abbildung 1-6: a: 2-Heptyl-3,4-

dihydroxyquinolin (PQS) b: 2-Heptyl-4-

hydroxyquinolin (HHQ) c: 2-Heptyl-4-

hydroxyquinolin-N-oxid

1. EINLEITUNG

- 21 -

1.7. Zielsetzung

Das Ziel dieser Arbeit war es, den Biosyntheseweg des neuen und sehr interessanten P.

aeruginosa Signal Moleküls PQS aufzuklären, und den molekularen Mechanismus der

Wirkung von PQS auf P. aeruginosa zu untersuchen.

Abbildung 1-7: Postulierter Biosyntheseweg von HAQs und PQS in P. aeruginosa [Deziel et al., 2004; Firoved und Deretic, 2003; Frisk et al., 2004]

2. MATERIAL UND METHODEN

- 22 -

10 x Puffer

10,5 g Citrat x H2O

29,3 g NaNH5PO4 x 4 H2O

42,2 g K2HPO4 x 3 H2O

ad 500 ml Wasser bidest., pH 7,2

2. Material und Methoden

2.1. Nährmedien

Die Anzucht der Stämme von P. aeruginosa fand entweder in Minimal oder in

Vollmedium statt. Zur Herstellung fester Nährmedien wurde vor dem Autoklavieren, Agar

in Konzentrationen von 0,3 – 1,5 % (w/v) zugegeben. Antibiotika wurden in der benötigten

Menge zum erkalteten Medium bzw. zum 45 °C warmen Festmedium gegeben und gut

gemischt.

2.1.1. Vogel-Bonner Minimalmedium

Als Minimalmedium wurde modifiziertes Vogel-Bonner Medium verwendet [Vogel und

Bonner, 1956]. Das Medium wurde aus konzentrierten Stammlösungen frisch vor dem

Gebrauch angesetzt.

Die Pufferstammlösung und die Gluconat-Lösung wurden sterilfiltriert. Gebrauchsfertiges

Vogel-Bonner Minimalmedium wurde durch Vermischung der Stammlösungen

entsprechend ihrer Konzentrationen angesetzt, mit Wasser bidest. aufgefüllt und bei 4 °C

aufbewahrt. Für die Durchführung von Markierungsexperimenten wurde das Gluconat als

Kohlenstoffquelle teilweise durch das jeweilige markierte Substrat ersetzt.

50 x Magnesiumsulfat

4,1 g MgSO4 x 7 H2O

ad 100 ml H2O bidest., steril filtriert

5 x Gluconat-Lösung

62,5 g Kalium- D- Gluconat

ad 250 ml H2O bidest., steril filtriert


- 23 -

2.1.2. Luria Bertani Medium (LB)

Das LB Medium wurde als Standardmedium für die Anzucht von P. aeruginosa und E.

coli verwendet.

2.1.3. Brain Heart Infusion Medium (BHI)(BD-Diagnostic Systems)

Das BHI Medium wurde für die Array-Versuche benutzt, weil die PQS induzierte

Pyocyanin Produktion hier besonders deutlich zu sehen war.

2.1.4. Columbia-Blut-Agar (Becton Dickinson)

Die Columbia-Blut-Agarplatten wurden zur Anzucht von P. aeruginosa als Alternative

zum LB-Agar verwendet. Auf Columbia-Blut-Agar kann besonders gut der für P.

aeruginosa typische, metallische Glanz und die Hämolyse beobachtet werden.

LB-Medium

10 g Bacto Trypton

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl


- 24 -

2.2. Anzucht, Stammerhaltung und Entsorgung von Bakterien

Die in dieser Arbeit verwendeten Stämme wurden, wenn nicht anders beschrieben, auf 1,5

% LB-Agarplatten kultiviert. Bei Bedarf wurde der LB-Agar mit entsprechenden

Antibiotika Konzentrationen versetzt. Oft verwendete Stämme wurden auf Agarplatten bis

zu zwei Wochen bei 4°C aufbewahrt. Häufiges Passagieren eines Stamms über mehrere

Agarplatten wurde vermieden. Von den Agarplatten konnten Vorkulturen in

Flüssigmedium angeimpft werden. Von diesen Übernachtkulturen wurden Hauptkulturen

mit einer OD600 von 0,05 angeimpft. Für die dauerhafte Lagerung von Bakterienstämmen

wurden Glycerin-Dauerkulturen in sterilen 1,5 ml Schraubdeckelgefäßen angelegt. Dazu

wurden fünf ml LB-Medium in einem sterilen Röhrchen mit einer vereinzelten Kolonie

inokuliert und über Nacht bei 37°C und 180 upm inkubiert. Bei Bedarf wurde dem

Medium Antibiotikum zugefügt. 500 µl Kultur wurden mit 500 µl sterilem Glycerin in den

Schraubdeckelgefäßen gemischt und sofort in flüssigen Stickstoff gegeben. Die Lagerung

erfolgte bei –70 °C. Dauerkulturen wurden aufgetaut, indem 10 µl der Kulturen auf

geeigneten Agarplatten ausplattiert und bei 37 °C inkubiert wurden.

Nicht mehr benötigte beimpfte Medien, Agarplatten und Dauerkulturen wurden bei 121 °C

für 30 Minuten autoklaviert und entsorgt.


- 25 -

2.3. DNA Arbeitstechniken

2.3.1. Isolierung chromosomaler DNA

Chromosomale DNA wurde aus Bakterien, mit Hilfe des DNA Tissue Kit von Qiagen,

nach Herstellerangaben isoliert. Dazu wurde 1 ml aus einer 5 ml Übernachtkultur 5

Minuten bei 5000 upm zentrifugiert und das Pellet dreimal mit 1 ml H2O gewaschen.

Zwischen den Waschschritten, wurde jeweils 1 Minute bei 13000 upm zentrifugiert. Durch

das Waschen sollte möglichst viel extrazelluläre Matrix entfernt werden, die bei der

Aufreinigung der DNA stören könnte. Die Bakterien wurden mit einem Lysis-Puffer

aufgeschlossen und die DNA durch Zentrifugation auf einer Affinitätssäule gebunden.

Durch Waschen mit ethanolhaltigen Waschlösungen wurde die Reinheit der DNA auf der

Säule erhöht. Die Säule wurde kurz getrocknet und die DNA mit H2O eluiert. Die Qualität

der DNA wurde auf einem 1 % Agarosegel überprüft.

2.3.2. Isolierung von Plasmid DNA

Plasmid DNA wurde mit Hilfe des Plasmid Minipräparation oder Maxipräparation Kits

von Qiagen nach den Angaben des Herstellers isoliert. Die richtige Größe und Reinheit der

Plasmide wurde in Agarosegelen getestet, wobei die Plasmide zuvor mit einem geeigneten

Restriktionsenzym linearisiert wurden. Die Größe wurde anhand eines DNA

Längenstandards ermittelt.

2.3.3. Agarose-Gelelektrophorese

Agarose-Gelelektrophoresen wurde nach Sambrook et al. durchgeführt [Sambrook et al.,

1989]. Je nach aufzutrennender DNA Fragmentgrößen wurde eine Agarosekonzentration

im TAE Puffer von 1-2 % gewählt.

Als Längenstandards wurden die SmartLadder von Eurogentec und die GeneRuler 50 Bp

Leiter von MBI Fermentas verwendet.


- 26 -

2.3.4. Transposon Mutagenese

Elektrokompetente P. aeruginosa: Für die Herrstellung von elektrokompetenten P.

aeruginosa SCV 20265 wurden zwei LB-Agarplatten von einer frischen SCV 20265 Platte

beimpft. Eine Platte wurde bei 37 °C, und die zweite bei 42 °C, über Nacht inkubiert. Die

Bakterien wurden in einem 1,5 ml Gefäß in 1 ml H2O vereinigt und gut gemischt. 500 µl

der Bakteriensuspension wurden in ein neues 1,5 ml Gefäß überführt und mehrfach durch

Zentrifugation, Abnehmen des Überstandes und erneutes Zugeben von 500 µl H2O von

extrazellulärer Matrix getrennt. Das Pellet wurde in 20 µl H2O resuspendiert und ergab ein

Endvolumen von ca. 40µl.

Transposon Präparation: In das Transposon aus dem pMOD-3 Plasposons (Epicentre)

wurde eine Gentamycin-Resistenzkassette kloniert. Für die Mutagenese wurde das

Transposon aus einer Plasmidpräparation des pMOD-3 Plasposons mit dem

Restriktionsenzym PvuII 2 h bei 37 °C ausgeschnitten und über ein präparatives

Agarosegel aufgereinigt. Die Fragmentgröße betrug 1.276 Bp. Die DNA wurde in der

Speedvac auf eine Konzentration von ca. 160 ng/µl eingeengt.

Vorbereitung der Transposon DNA: 0,25 μl gelöste Transposon-DNA (ca. 160 ng/µl),

0,5 μl Transposase (1 U/µl) und 0,25 μl 100%iges Glyzerin wurden zusammen in ein 0,5

ml Mikroreagiergefäß vorsichtig gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

TAE

0,4 M Tris

0,01 M EDTA Na-Salz

0,2 M Acetat


- 27 -

Elektroporation: Die vorbereitete Transposon DNA wurde mit den kompetenten

Bakterien in einer neuen Elektroporationsküvette vorsichtig gemischt und 5 min auf Eis

inkubiert. Als Negativkontrolle wurde, anstelle des Transposonansatzes, H2O pipettiert.

Die Elektroporation erfolgte bei 2,5 kV und 200 Ω und 25 µF. Die Elektroporationsdauer

betrug ca. 5 ms.

Direkt nach der Elektroporation wurden die Bakterien in der Küvette mit 1 ml eiskaltem

LB-Medium resuspendiert und in ein 1,5 ml Gefäß überführt. Dieses wurde 1 h, bei 37 °C

und 180 upm, geschüttelt. Danach wurden 50 oder 100 µl der Bakteriensuspension auf LB-

Agar-Selektionsmedium (40 µg/ml Gentamycin) ausplattiert und bei 37 °C inkubiert.

2.3.5. Y-Linker Ligation

Um die Transposon-flankierende DNA-Sequenz effizient amplifizieren und sequenzieren

zu können, wurde die genomische DNA der Transposonmutante mit HAQ-negativem

Phenotyp mit dem Restriktionsenzym NlaIII geschnitten, wobei an den Schnittstellen

jeweils 4 Basenpaare lange, überhängende Enden entstanden. Der Restriktionsansatz von

50 μl wurde eine Stunde bei 37 °C inkubiert und anschließend 20 Minuten, bei 65 °C,

inaktiviert.

Zur Herstellung des Y-Linkers [Kwon und Ricke, 2000] wurden 9 μl Linker 1 (350 ng/μl)

und 9 μl Linker 2 (350 ng/μl) mit 11 μl H2O für 4 Minuten, bei 95 °C, erhitzt und

anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.

Der Y-Linker dient als bekannte Sequenz, die neben der Transposon Sequenz als 2.

flankierende Bindestelle für PCR Primer die Grundlage für eine Amplifikation und damit

Sequenzierung der DNA Region darstellt, in die das Transposon inseriert ist. Dazu hat der

Y-Linker einen 4 Basen Überhang - komplementär zu NlaIII Schnittstellen - und kann an

jede NlaIII Schnittstelle ligiert werden. Der Linker 2 hat am 5´ Ende eine

Phosphorylierung. Am 5´ Ende des Y-Linkers befindet sich eine 19 Basen Sequenz, die

nicht doppelsträngig ist. Da der Linker PCR Primer nicht direkt an den Y-Linker binden


- 28 -

kann, sondern erst nach dem ersten PCR Zyklus eine passende DNA Grundlage geschaffen

wird, ist es die Amplifikation, trotz eines hohen Y-Linker Überschusses an sehr vielen

DNA Fragmenten, spezifisch für das Primer Paar Linker Primer/ Transposon Primer

(Abbildung 2-1).

Die Ligation wurde mit 5 µl verdauter, chromosomaler DNA und mit 5 µl Y-Linker in 20

µl Endvolumen über Nacht mit 40 U T4-Ligase bei Raumtemperatur durchgeführt. Der

Reaktionsansatz wurde auf 200 µl mit H2O aufgefüllt und bei –20 °C gelagert.

Die PCR Reaktion zur Amplifikation der unbekannten Sequenz, in die das Transposon

inserierte, wurde nach einem Standard PCR Protokoll durchgeführt. Dabei konnte der Y-

Abbildung 2-1: A: Y-Linker mit Linkerprimer. B: Der Linkerprimer kann erst nach dem ersten

Zyklus an die DNA Matrize binden, was unspezifischen PCR Fragmenten vorbeugt


- 29 -

Linker Primer in zwei Kombinationen mit unterschiedlichen Sequenzierprimern SqFP1

und SqRP1 eingesetzt werden.

Das PCR Produkt wurde mit Hilfe eines PCR

Aufreinigungs Kits von Nukleotiden und

anderen PCR Bestandteilen getrennt und im

Agarosegel auf Reinheit kontrolliert (Abbildung

2-2). Wenn die PCR eine definierte Bande

ergab, wurde das gereinigte Produkt zur

Sequenzierung an GATC-Biotech (Konstanz)

geschickt. Als Sequenzierprimer wurden die

gleichen Primer verwendet, die auch auf der

Transposonseite für die PCR eingesetzt wurden (SqFP1/SqRP1).

Die erhaltenen Sequenzen wurden auf die NlaIII Schnittstelle überprüft. Diese durfte nur

einmal pro Sequenz auftreten und sich 5´ von der Y-Linker Sequenz befinden. Mit der

Sequenz vor dieser Schnittstellensequenz konnte in der Pseudomonas aeruginosa

Datenbank nach Sequenzhomologien gesucht werden. Dazu wurden BLAST-N und

BLAST-X Suchalgorithmen verwendet.

Abbildung 2-2: Beispiel von verschiedenen

spezifischen Y-Linker PCR Produkten

Mastermix:

34,8 µl H2O

3 µl dNTP Mix (je 2 µM)

5 µl 10 x Puffer

1 µl Y-Primer (10 µM/µl)

1 µl SqFP1/SqRP1 (10 µM/µl)

5 µl Ligationsansatz

0,2 µl Taq Polymerase (5 U/µl)

PCR Programm :

3 min 95 °C Initiale Denaturierung

30 Zyklen:

1 min 95 °C Denaturierung

1 min 58 °C Annealing

1 min 72 °C Elongation

5 min 72 °C Finale Elongation


- 30 -

2.4. RNA Arbeitstechniken und Techniken für Transkriptom

Analysen

Für Transkriptomanalysen ist es essentiell, dass eine reproduzierbar qualitativ gute RNA

den Versuchen zu Grunde liegt. Die Materialien dürfen nicht mit RNase kontaminiert sein,

und das Arbeiten hat generell auf Eis und sehr zügig zu erfolgen, damit die RNA nicht

durch Degradation unbrauchbar wird oder die Ergebnisse verfälscht. Deshalb wurden,

wenn möglich, Einweg-Artikel verwendet und in Lösungen sowie auf Glaswaren RNasen

mit DEPC inhibiert.

2.4.1. Isolierung von bakterieller Gesamt-RNA

Die RNA Isolierung aus P. aeruginosa wurde mit einem modifizierten Qiagen Protokoll

durchgeführt. Dabei wurden die RNA der Bakterien aus der jeweiligen Wachstumsphase,

mit Hilfe von RNA Protect, stabilisiert und Aliquots (109 Bakterien/ Lysis-Ansatz) in

flüssigen Stickstoff eingefroren. Der Lysozym Aufschluss erfolgte nach Protokoll des

Herstellers. Um die Konzentration der RNA zu erhöhen, wurden zwei bis drei Lysisansätze

über eine RNeasy Säule (Qiagen) vereinigt und aufgereinigt. Die Elution erfolgt im

Maximal-Volumen von zwei mal 50 µl RNase freiem H2O. Im Gesamtvolumen von 200 µl

wurde 30 min die chromosomale DNA mit DNaseI verdaut. Die RNA wurde erneut über

RNeasy Säulen aufgereinigt und in zweimal mit 30 µl H2O eluiert. Die Konzentration der

RNA wurde im Eppendorf Photometer bestimmt. Qualität und mögliche Degradation

wurde im Agarosegel und im 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) überprüft

(Abbildung 2-3). Um Degradation zu verhindern, wurde die reverse Transkriptionsreaktion

in cDNA sofort im Anschluss durchgeführt.


- 31 -

2.4.2. Reverse Transkription

Es wurden standardmäßig 10 µg RNA in einer cDNA Synthese Reaktion eingesetzt, die

maximal in einem Volumen von 20 µl gelöst sein durften. Dazu wurden 2 µl Random

Primer Hexamere (300 ng/ µl) gegeben und im Thermocycler vorinkubiert:

Abbildung 2-3: Typisches Muster der isolierten und gereinigten

RNA im RNA BioAnalyzer. Das 16 S rRNA Signal sollte ca. die

halbe Intensität des 23 S rRNA Signals haben

Programm:

10 min 70 °C

10 min 25 °C


- 32 -

Die Proben wurden anschließend sofort auf Eis gestellt, vorsichtig mit 28 µl Mastermix

gemischt und weiter im Thermocycler mit folgendem Programm inkubiert. Ein Ansatz

ohne Reverse Transkriptase diente als Kontrolle auf chromosomale Verunreinigung

(Abbildung 2-4).

Nach Ende des cDNA Synthese Programms wurden die Proben mit 10 µl H2O auf ein

Endvolumen von 60 µl aufgefüllt. Durch Zugabe von 20 µl NaOH (1N) und 30 min bei 65

°C wurde die RNA denaturiert. Mit 20 µl HCl

(1N) wurde die Probe neutralisiert und danach

über eine PCR Aufreinigungssäule (Qiagen)

nach Herstellerangaben aufgearbeitet. Bei der

cDNA Synthese für Micro-Array-Experimente

wurden bis zu 3 cDNA Synthesen parallel

durchgeführt und zur Konzentrierung über

eine Säule aufgereinigt. Die Konzentration der

cDNA wurde photometrisch bei 260 nm

bestimmt. Für Realtime-PCR-Analysen

genügten 10 – 100 ng cDNA. Die

Gesamtmenge an cDNA für einen Affymetrix

DNA Chip sollte zwischen 3 und 7 µg liegen.

Programm:

10 min 25 °C

60 min 37 °C

60 min 42 °C

15 min 70 °C

Mastermix:

10 µl 5 x First Strand Buffer

5 µl DTT (100 mM)

3 µl dNTP (jedes 10 mM)

5 µl H2O

5 µl Superscript II

Abbildung 2-4: Typische chromosomale DNA

Kontroll PCR mit cDNA als DNA Matrize

(Spur 2, 4 und 6) und den zugehörigen

Negativkontrollen ohne reverse Transkriptase

(Spur 3, 5 und 7) im cDNA Ansatz.


- 33 -

2.4.3. Realtime PCR

Die Realtime PCR stellt eine Methode dar, die es ermöglicht, transkriptionelle Regulation

in ausgewählten Genen zu analysieren. Zur Normalisierung der Daten wurde ein nicht

reguliertes Gen, ein so genanntes housekeeping Gen, verwendet. Die Realtime PCR hat

den Vorteil, dass für etablierte Primerpaare von potentiell regulierten Genen

vergleichsweise schnell eine Regulation in cDNA Proben festgestellt werden kann. Für

häufig wechselnde Zielgene ist dagegen die Etablierung der Primer ein sehr hoher

Aufwand, weil für jedes neue Primerpaar zuerst eine Primermatrix erstellt werden muss,

um die optimalen Primerkonzentrationen zu ermitteln.

Generell wird bei jedem Realtime-PCR-Lauf im 96-Well-Format nach jedem PCR-Zyklus

die Leuchtintensität des SybrGreen Farbstoffes in jedem Reaktionsgefäß gemessen. Es gibt

eine lineare Beziehung zwischen zunehmender Leuchtintensität und Zunahme der

doppelsträngigen DNA. Je früher dabei das Signal aus dem Hintergrundrauschen oder

einem bestimmten Schwellenwert heraustritt, desto höher war die anfängliche

Konzentration einer bestimmten mRNA Spezies in der Bakterien-Population. Der

Zeitpunkt wird in Ct angegeben (Zyklus). Um verschiedenen cDNA Proben innerhalb eines

Laufs vergleichen zu können, wurden die Verdünnungen eines Gemischs von allen

gemessenen cDNAs für die Erstellung von Messgeraden für die verschiedenen Primerpaare

verwendet. Die Ct Werte wurden mit dem nicht regulierten housekeeping Gen in

Beziehung gesetzt. Eine Änderung von zweifach wurde als Regulation gewertet.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Realtime-PCR dazu verwendet, cDNA Proben darauf

zu überprüfen, ob das Rhl-QS System unterschiedlich reguliert wurde. Dazu wurden

Primerpaare etabliert, die homolog zu den rhlR (PA3477) und rhlA (PA3479) Genen von

P. aeruginosa sind. Als nicht reguliertes housekeeping Gen wurde PA1580 verwendet,

welches für die Citratsynthase kodiert. Die Anlagerungstemperatur der Primer wurde so

gewählt, dass alle drei PCR Reaktionen bei 60 °C, und damit in einem Lauf, stattfinden

konnten. Auch die Fragmentlänge, die bei der PCR generiert wird, wurde auf ca. 200 Bp


- 34 -

angepasst, damit die Bedingungen für die verschiedenen PCR Reaktionen vergleichbar

waren.

Primer für die Realtime PCR:

Tabelle 2: Primer Sequenzen für die Realtime PCR

Primer Sequenz Gen PA1580FP1RT TCC AAG GGC GAG CCG ATG ATG TA gltA (PA1580) PA1580RP1RT AGG CGA TGC AGG CGA ACG GAT TG gltA (PA1580) RhlAFP2RT TGG CGC TCA ACG ATC GGG GCT ACT rhlA (PA3479) RhlARP2RT GGG CGT CCT CGG CGG TGG TGT rhlA (PA3479) RhlRFP2RT CGG CGC CTG GGC TTC GAT TAC TAC rhlR (PA3477) RhlRRP2RT GAG GAG CGC AGG CCG TTG AGG AT rhlR (PA3477)

Primer Matrix: Bei der Erstellung einer Primer Matrix kommt es darauf an, dass die

Primer eines Primerpaars in verschiedenen Konzentrationen zueinander eingesetzt werden.

Als Template für die PCR wurde chromosomale DNA eingesetzt. Als zugehörige

Negativkontrolle wurde, anstelle von DNA, H2O verwendet. Alle Proben wurden als

Doppelbestimmung pipettiert. Bei der Auswertung wurde darauf geachtet, welche

Primerkonzentrationen das beste Verhältnis von Proben mit DNA, gegenüber Proben ohne

DNA, hatte. Am Ende der PCR wurde eine Dissoziationskurve aufgenommen, bei welcher

das entstandene Produkt langsam von 60 °C ansteigend aufgeschmolzen wird. Bei dieser

Aufschmelzung der doppelsträngigen DNA sollte ein definiertes Signal zu sehen sein, das

einer dem Fragment und der Sequenz entsprechenden Temperatur zuzuordnen ist.


- 35 -

2.4.4. Affymetrix Micro-Array-Analyse

Die gereinigte cDNA, die aus RNA von Bakterien aus unterschiedlichen Kulturen revers

transkribiert wurde, musste für die Hybridisierung mit den Affymetrix DNA Chips weiter

aufgearbeitet werden. Dieses erfolgte nach den Vorgaben aus den Affymetrix Protokollen

für P. aeruginosa DNA Chips. Dazu wurde die cDNA mit DNase I fragmentiert und die

Fragmentgröße im Agarosegel überprüft. Sie sollte zwischen 50 und 200 Bp liegen

(Abbildung 2-5). Die Fragmente wurden terminal mit Biotin-dUTP markiert. Die

Markierungseffizienz wurde im Agarosegel überprüft, indem StreptAvidin mit der

markierten cDNA vorinkubiert wurden, so dass sich durch die Bindung von StreptAvidin

an Biotin das Laufverhalten änderte. Die Markierungseffizienz ist sehr wichtig für eine

gute Auswertbarkeit der Chips, weil zu viele nicht markierte Fragmente die Oligomere auf

dem Chip blockieren, was zu einer falsch negativen Aussage über das Vorhandensein von

Genen führen kann. Die Hybridisierung und Waschschritte erfolgten nach

Herstellerangaben in der Arrayfacility der GBF Braunschweig (Dr. Robert Geffers, AG

Prof. Dr. Jan Buer). Die Auswertung erfolgte über MAS 5.0 Software (Microarray

Software) von Affymetrix.

Um zwei verschiedene Zustände miteinander zu vergleichen, wurden folgende

Versuchsparameter festgelegt:

• Es wurden drei Kulturen eines Zustandes parallel inkubiert und vor der RNA-

Isolierung vereinigt, um wachstumsabhängige Varianzen in der Genexpression zu

minimieren (Abbildung 2-6).

• Um ausreichende RNA und cDNA Konzentrationen zu erhalten, wurden bis zu drei

parallele Reaktionsansätze mit identischem Material vereinigt, die bei der

Aufreinigung über Affinitätschromatographiesäulen ankonzentriert wurden (2.5.1.

und 2.5.2.)

• Pro Zustand wurden zwei unabhängige Arrays durchgeführt


- 36 -

Ein Gen wurde als reguliert angesehen, wenn:

i) es in allen vier Paarvergleichen von der Software als reguliert bezeichnet wurde

ii) die Signalintensität nicht in allen Fällen als „abwesend“ bewertet wurde

iii) es einen Signal-Log-Ratio von durchschnittlich mindestens > 1 oder < -1 hat

(zweifache Regulation)

Durch diese Versuchsparameter war es möglich, die falsch-positiven Aussagen der Array

Versuche auf ein Minimum zu reduzieren und mit den allgemeinen Vorgaben von

MIAME (minimum informations about a microarray experiment) konforme Versuche

durchzuführen.

Abbildung 2-6: Typischer

Versuchsaufbau der Array Versuche

von der Kultivierung der Bakterien

unter verschiedenen Bedingungen (Oben

und Unten) über die RNA bis zur

Hybridisierung der cDNA auf dem Chip

Abbildung 2-5: 1: 50

Bp Leiter 2: cDNA 3:

DNaseI fragmentierte

cDNA


- 37 -

2.5. Sonstige Methoden

2.5.1. Das Screening nach HAQ-negativen Transposonmutanten

Das Screening nach HAQ-negativen Transposonmutanten erfolgte nach drei Tagen direkt

auf den Selektionsagarplatten, indem unter dem Mikroskop (10 – 100 fache Vergrößerung)

in den Kolonien nach Abwesendheit von typischen HAQ-abhängigen Kristallstrukturen

gesucht wurde (Abbildung 2-7 und 2-8). Diese Kolonien wurden vereinzelnd angezogen

und für weitere Untersuchungen in Glycerin-Dauerkulturen bei –70 °C gelagert. Die

Überprüfung der Mutanten erfolgte in der Dünnschichtchromatographie.

2.5.2. HAQ Extraktion

Für die Analyse von Transposonmutanten, sowie die Durchführung von

Fütterungsexperimenten mit stabil markierten Vorstufen von HAQ in P. aeruginosa, war

es notwendig, eine Methode zu etablieren, mit der verschiedenen HAQ Spezies aus P.

aeruginosa Kulturen isoliert werden konnten. Die sehr hydrophoben HAQ wurden mit

Hilfe von Methanol- oder Dichlormethan-Extraktionen vom Medium getrennt. Dabei

wurden 1 Volumen Lösungsmittel zur Kultur oder der Agarplatte gegeben und nach 5-

Abbildung 2-7 Typische SCV 20265

Kolonie mit HAQ-abhängigen

Kristallstrukturen

Abbildung 2-8 HAQ-negative-Mutante mit

Koloniemorphologie ohne Kristall-

strukturen (M1)


- 38 -

minütiger Inkubation und guter Durchmischung zentrifugiert. Das Methanol musste

abgedampft werden und konnte nur in der Extraktion von Festmedien verwendet werden.

Das Dichlormethan bildet dagegen mit wässrigen Medien zwei Phasen und kann leicht

nach der Zentrifugation abgenommen werden, bevor es abgedampft wird. Die Proben

wurden dann in einem definierten Volumen Methanol aufgenommen und für weitere

Analysen verwendet.

2.5.3. Dünnschichtchromatographie

Die HAQ Extrakte wurden für quantitative Aussagen und Qualitätsbestimmung

dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Als Laufmittel wurde ein 10 Teile Methyl-

tertiär-butyl-ether : 1 Teil n-Hexan Gemisch verwendet. Die mit Kiselgel beschichteten

Glasplatten wurden unter UV Licht ausgewertet. Als Standard Substanzen wurden

synthetisiertes 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin und PQS verwendet. Die Substanzen wurden

von Dr. Michael Morr an der GBF Braunschweig synthetisch hergestellt. 2-Heptyl-4-

hydroxyquinolin-N-Oxid wurde von Sigma Aldrich verwendet.

2.5.4. Fütterung von markierten Substraten

Um den Biosyntheseweg von HAQs in P. aeruginosa aufzuklären, wurden verschiedenen

stabil-markierte Substrate zu den Bakterien gegeben, um danach die HAQ zu extrahieren

und den eventuellen Einbau zu überprüfen. Dazu wurden je 5 mg des zu testenden

Substrats in 7 ml Vogel-Bonner Medium mit 0,2 % Agarose gegeben. Die Bakterien

wurden mit einer Impföse auf die Mitte einer kleinen Kulturplatte (50 mm Durchmesser)

gegeben und drei Tage wachsen gelassen. Der bewachsene Nährboden wurde komplett für

die HAQ Extraktion eingesetzt.


- 39 -

2.5.5. GC/MS

Die für diese Arbeit notwendeigen ESI, GC/MS und MS/MS Analysen wurden in der

Strukturbiologischen Abteilung der GBF Braunschweig von Dr. Manfred Nimtz

durchgeführt.

Im Prinzip wurden die abgedampften HAQ Extrakte eine Stunde mit 50/50 Pyridin +

(BSTFA (N,O-bis-(Trimethylsilyl)trifluoroacetamide) + 1% TMC (Trichlormethan)) bei

70 °C derivatisiert. Dabei wurden alle funktionellen Gruppen mit einer

Trimethylsilylgruppe substituiert. Dadurch wird die Polarität erniedrigt und somit eine

bessere Auftrennung. Die Molekular-Ionen-Masse wurde damit um 72 Da pro

Trimethylsilylgruppe erhöht.

Die Auftrennung erfolgte auf einem Thermo-Finnigan GCQ Gaschromatographie-

Ionenfallenmassenspektrometer (Finnigan MAT corp., San Jose, CA) welches im positiven

EI (electron impact) Modus betrieben wurde. Die trimethylsilylierten HAQ-Derivate

wurden, mittels Vergleich mit synthetischen Standardsubstanzen und anhand ihres

charakteristischen Fragmentierungsmusters, identifiziert (Abbildung 2-9).

Für die MS/MS-Analyse wurden Eltern Ionen von Interesse selektiert und durch collision

induced dissociation (CID) in der Ionenfalle in Tochterionen fragmentiert

(Kollisionsenergie ca. 0.7 eV). Auf diese Weise war es möglich, die Einbauorientierung

von unterschiedlich markierten Acetat-Molekülen anhand des Fragmentierungsmusters der

Molekularionen in MS/MS zu bestimmen (3.1.2.).


- 40 -

Abbildung 2-9 oben: Typisches Gaschromatogramm eines trimethylsylisierten total-HAQ

Extraktes von P. aeruginosa 1: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin (EI Massenspektrum im unteren

Bild) 2: 2-Heptyl-3,4-dihydroxyquinolin (PQS) 3: 2-Nonyl-4-hydroxyquinolin 4: 2-Nonyl-3,4-

dihydroxyquinolin 5: 2-Nonyl-2,4-dihydroxyquinolin 6: 2-Undecenyl-4-hydroxyquinolin;

Unten: EI Massenspektrum des trimethylsylilierten 2-Heptyl-4-hydroxyquinolins mit

typischem Fragmentierungsmuster.


- 41 -

2.5.6. Elektrospray Ionisations MS (ESI)

Für die Bestimmung des Fe(III)/PQS Komplexes wurden 3 µl einer 2:1 Methanol: H2O

Lösung, mit einer Endkonzentration von ca. 10-100 pmol/µl, auf eine Nanospray Gold

beschichtete Glaskapillare gegeben, die orthogonal zur Eingangsöffnung eines QTOF-II

Gerätes (Micromass, Manchester, U.K.) platziert wurde. Durch Anlegung einer Spannung

von ca. 1000 V an die Kapillare wurde ein Spray erzeugt, die darin enthaltenen Ionen ins

Gerät geleitet, und über ein „time-of-flight“ (TOF, Flugzeitmassenspektrometer)

aufgetrennt. Für das anschließende MS/MS wurden Eltern Ionen von Interesse durch einen

vorgeschalteten Quadropol-Massenfilter ausgewählt und danach durch „collision induced

dissociation“ (CID) in Tochterionen fragmentiert. Diese wurden dann im

Flugzeitmassenspektrometer aufgetrennt.

2.5.7. NMR

13C Nuclear Magnetic Resonace (NMR) wurde als ergänzende Methode zur GC/MS

Analyse verwendet, um den Einbaur der markierten Acetate zu untersuchen. Die Analysen

wurden unter der Aufsicht von Dr. Victor Wray an der GBF Braunschweig durchgeführt.

2.5.8. Bestimmung von Eisenkonzentrationen

Zur Bestimmung von Eisenkonzentrationen in Lösungen wurde das Spectroquant® Fe

Bestimmungskit von der Firma Merck benutzt.


- 42 -

2.5.9. Bestimmung der RhlR Promotoraktivität mit Hilfe einer rhlR-lacZ

Fusion auf dem Plasmid pMAL.V [Latifi et al., 1996]

Die Aktivität des Rhl-QS-Systems wurde mit Hilfe des Plasmids pMAL.V bestimmt,

welches in PAO1 transformiert wurde. Das Plasmid enthält eine transkriptionelle Fusion

des rhlR Promotors mit einem lacZ-Gen, so dass die Promotoraktivität anhand eines β-

Galactosidase Tests nach Miller 1972 photometrisch bestimmt werden konnte. Dazu

wurden 50 - 200 µl der Bakteriensuspension mit 800 - 950 µl Z-Puffer [Miller, 1972] auf

ein Gesamtvolumen von 1 ml aufgefüllt und gut gemischt. 5 µl 0,1 % SDS und 10 µl

Chloroform wurden für die Lyse der Bakterien zugesetzt, und das Gemisch wurde 15 min

bei 30 °C inkubiert. Durch Zugabe von 200 µl einer 4 mg/ml ONPG Lösung (in PBS) als

Substrat wurde die Reaktion gestartet. Eine Gelbfärbung wurde photometrisch bei OD420

nm bestimmt. Eventuelle Zellkontaminationen wurden bei OD550 gemessen. Zusammen

mit der OD600 der eingesetzten Bakteriensuspension, des eingesetzten Volumens [v] und

der Inkubationszeit des Tests bis zum Farbumschlag [t], konnten die Miller Einheiten [U]

berechnet werden, die ein Maß der Promotoraktivität sind.

2.5.10. In vitro DNA-Fragmentierung durch PQS

Um zu überprüfen, ob PQS in vitro einen Einfluss auf die DNA hat, wurden 500 ng λ-

DNA mit PQS vorinkubiert und dann mit 100 nMol Fe2SO4 in 10 µl Endvolumen versetzt.

Es wurde keine PQS-Methanol-Lösung verwendet, weil das Methanol die Interaktion von

Eisen und DNA inhibiert. Nach 15 min, bei 37 °C, wurde die Probe mit DNA Ladepuffer

versetzt und in einem Agarosegel aufgetrennt. Als Negativkontrolle wurden Fe2SO4 und

die nicht aktive Substanz 2-Heptyl-4-quinolon verwendet.

U= 1000*[(OD420)-(1.75*OD550)] t * v * OD600


- 43 -

2.5.11. Live/Dead Färbung

Für die differentielle Anfärbung von lebendigen und toten Bakterien wurde das

LIVE/DEAD BacLight Kit von Molecular Probes nach Herstellerangaben verwendet. Dazu

wurden Bakterien aus einer Kolonie auf einem Objektträger verteilt und mit den

Fluoreszenzfarbstoffen SYTO-9 (grün; Anregung bei 480 nm/ Emission 500 nm) und

Propidiumiodid (rot; Anregung bei 490 nm/ Emission 635 nm) inkubiert. Dabei färbt

SYTO-9 Nukleinsäuren aller Bakterien an. Propidiumiodid durchdringt nur defekte

Membranen und färbt die DNA von toten Bakterien an. Dadurch wird gleichzeitig die

Fluoreszenz von SYTO-9 reduziert. Die Auswertung erfolgte am Fluoreszenzmikroskop.

2.5.12. Anfärbung extrazellulärer DNA

Extrazelluläre DNA wurde mit einem TOTO-1 „dimeric cyanine“ Nukleinsäure

Fluoreszenzfarbstoff von Molecular Probes nach Herstellerangaben angefärbt. Dazu

wurden Bakterien einer Kolonie auf einem Objektträger verteilt und mit dem Farbstoff

inkubiert. Die extrazelluläre DNA wurde spezifisch angefärbt und konnte bei einer

Anregungsenergie von 512 nm und einer Emission von 533 nm im Fluoreszenzmikroskop

dargestellt werden.

3. ERGEBNISSE

- 44 -

3. Ergebnisse

3.1. Biosynthese von 4-Hydroxy-2-alkylquinolonen (HAQs) bei

P. aeruginosa

3.1.1. Transposonmutagenese und Screen nach HAQ-negativen Mutanten

Die Aufklärung der Biosynthese von HAQ-Molekülen in P. aeruginosa ist ein erster und

wichtiger Schritt zum besseren Verständnis dieser neu entdeckten Signalmoleküle. Um

Hinweise auf Gene zu bekommen, deren Produkte an der Biosynthese von HAQs beteiligt

sind, wurde eine Transposonmutagenese mit dem klinischen Isolat P. aeruginosa SCV

20265 durchgeführt. Die SCV 20265 produziert große Mengen an HAQ abhängigen

kristallinen Strukturen (Abbildung 2-7) und ist deshalb besonders gut für einen Screen

nach HAQ-negativen Mutanten geeignet. Ca. 15000 Mutanten wurden vereinzelt und mit

Hilfe eines Mikroskops auf HAQ abhängige, kristalline Strukturen untersucht (siehe 2.5.1.

Abbildung 2-7 und 2-8). 26 Mutanten, die keine kristallinen Strukturen in ihren Kolonien

aufwiesen, wurden isoliert und für weitere Untersuchungen in Dauerkulturen gelagert.

Um zu überprüfen, ob auch in der Dünnschichtchromatographie keine oder deutlich

weniger HAQs zu sehen waren, wurden die 26 Mutanten drei Tage auf LB-Weichagar

inkubiert. Die HAQs wurden mit Methanol extrahiert. Alle Mutanten zeigten, verglichen

zum Wildtyp SCV 20265, eine deutlich geringere HAQ-Produktion in der

Dünnschichtchromatographie. Die chromosomale DNA der 26 Mutanten wurde mit NlaIII

verdaut, und mit Hilfe der Y-Linker Ligations Methode wurde der Übergang vom

Transposon zu chromosomaler DNA, mittels PCR, amplifiziert und sequenziert (siehe

2.3.5.). Die Sequenzen befinden sich im Anhang.

Diese Sequenzen wurden auf der Internet-Seite des Pseudomonas-Genom-Projekts

(www.pseudomonas.com) mit den Genom-DNA-Sequenzen von P. aeruginosa verglichen.

Dazu wurden BLAST-X (Nucleotidsequenz wird im Programm translatiert und mit

3. ERGEBNISSE

- 45 -

Proteinsequenzen des Projekts verglichen) und BLAST-N (Nucleotidsequenz wird mit

Nucleotidsequenzen verglichen) Homologie-Suchalgorithmen verwendet.

In der Tabelle 3 sind die identifizierten Mutanten aufgelistet, die durch die

Transposoninsertion eine beeinträchtigte HAQ Produktion hatten.

Neben Genen, die dem PQS-Operon angehören (M1, M6 und M16 mit Defekten in pqsA

und PA1003) wurden fünf Mutanten gefunden, die eine Insertion im carB Gen haben (M 8,

M18, M20, M23 und M26). Zwei unabhängige Mutanten hatten eine Transposoninsertion

im pyrB (M9 und M25) und eine im pyrD (M21) Gen. Vier mal inserierte das Transposon

in purL (M4, M5, M10 und M11).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein intakter Pyrimidin-Stoffwechsel essentiell für

die Synthese von HAQs ist. Obwohl über das gesamte Genom verteilt, wurden die Gene

carB, pyrB, pyrD und pyrE jeweils mindestens einmal getroffen. Wie Abbildung 3-1 zeigt,

Tabelle 3: Liste der gefundenen HAQ negativen Mutanten: PA-Nummern und Gen-Namen von

www.pseudomonas.com

Mutante PA Nummer Gen Mutante PA Nummer GenM8 PA4756 carB M5 PA3763 purLM18 PA4756 carB M11 PA3763 purLM20 PA4756 carB M10 PA3763 purLM23 PA4756 carB M13 PA0447 gcdHM26 PA4756 carB M14 PA0447 gcdHM9 PA0402 pyrB M7 PA1417M25 PA0402 pyrB M3 PA1421 speB2M21 PA3050 pyrD M22 PA1583M17 PA5331 pyrE M12 PA0794M6 PA0996 pqsA M2 keine ÜbereinstimmungM1 PA0996 pqsA M19 keine ÜbereinstimmungM16 PA1003 mvfR M24 keine ÜbereinstimmungM4 PA3763 purL

3. ERGEBNISSE

- 46 -

sind die Produkte an der Synthese von Orotat als wichtige Vorstufe im Pyrimidin-

Stoffwechsel beteiligt.

Deshalb wurde versucht, in einer Flüssigkultur die Mutanten mit Defekten in den carB,

pyrB, pyrD und pyrE Genen mit externer Orotat-Zugabe so zu komplementieren, dass sie

wieder HAQs produzieren können. Mit diesem Versuch sollte untersucht werden, ob das

Produkt des Biosynthesewegs oder die Proteine selbst wichtig für die Bildung der HAQs

ist.

Das Wachstum in Flüssigkultur verdeutlichte zweierlei:

• Orotat Zugabe führte zur Komplementation der HAQ-Biosynthese in den

Pyrimidin-Stoffwechselmutanten carB, pyrB und pyrD. Die pyrE Mutante konnte

nur bedingt komplementiert werden.

• Die Kulturen ohne Orotat erreichten nur eine OD600 von 0,6, wogegen die

komplementierten (außer die pyrE Mutante) deutlich höher als OD600 2,0 wuchsen

und nun wieder dem Wachstum der SCV 20265 glichen.

Weiterhin wurde Uridine-5-Monophosphat (UMP) - als Vorstufe von Pyrimidin - und

Inosin-5-Monophosphat (IMP) - als Vorstufe von Purin - exogen zu LB-Flüssigkulturen

der Mutanten gegeben. Mit Uridine-5-Monophosphat in der Kultur konnten alle Pyrimidin-

Stoffwechselmutanten wieder HAQs produzieren. Die purL Mutante dagegen nicht. Bei

Zugabe von Inosin-5-Monophosphat war es nur die purL Mutante, die mehr HAQ

Abbildung 3-1: Ausschnitt aus dem Pyrimidin-Stoffwechselwegs

3. ERGEBNISSE

- 47 -

synthetisierte, als die anderen Mutanten, aber nicht so viel, wie die SCV 20265 (Abbildung

3-2).

Da sich die HAQ-Produktion der Mutanten mit Defekten in Genen der Pyrimidin- und

Purin-Stoffwechselwege durch exogene Zugabe von Vorstufen dieser Stoffwechselwege

komplementieren ließ, scheint offenbar ein Wachstumseffekt der Grund dafür zu sein, dass

diese Mutanten keine HAQs produzierten.

3.1.2. Fütterungsexperimente mit möglichen HAQ Vorstufen

Unter Berücksichtigung der in diese Studie gefundenen HAQ-negativen Mutanten, mit

Defekten in der Pyrimidin-Biosynthese, wurden Experimente durchgeführt, die zeigen

sollten, dass es sich bei der fehlenden HAQ-Biosynthese tatsächlich um einen

Wachstumseffekt handelte und dass nicht Vorstufen der Uridine-5-Monophosphat (UMP)

Biosynthese direkt an der HAQ-Bildung beteiligt sind. Ein alternativer Weg zur zuvor

propagierten Biosynthese [Calfee et al., 2001], in der Anthranilat und eine ß-Keto-

Fettsäure als Vorstufen von PQS dienen (Abbildung 3-3 A), wäre nämlich, dass

Anthranilat und Orotat als Vorstufen der HAQ-Biosynthese zu einer kynurenischen Säure

Abbildung 3-2: Dünnschitchromatographie von HAQ-Extrakten von Mutanten mit Defekten im

Pyrimidin oder Purin Stoffwechsel im Vergleich zur SCV 20265, die in LB, LB mit Uridine-5-

Monophosphat, LB mit Inosine-5-Monophosphat und LB mit Orotat angezogen wurden

3. ERGEBNISSE

- 48 -

reagieren und an diese nachträglich ein aliphatischer Rest angehängt wird (Abbildung 3-3

B).

Zur Überprüfung beider möglicher Biosynthesewege wurden folgende

Markierungsexperimente durchgeführt:

Stabile Isotope von möglichen Vorstufen der PQS Biosynthese (Anthranilate, Acetat,

Aspartate) wurden zu den auf Vogel-Bonner Weichagar wachsenden SCV 20265 Bakterien

gegeben. Nach drei Tagen wurden die HAQs mit Ethyl-Acetat oder Dichlormethan

extrahiert und mit GC/MS und NMR analysiert.

Es wurde versucht, durch Fütterung von nicht markierten Vorstufen (Orotat, Acetat, ß-

Dekan-Fettsäure, kynurenische Säure) der möglichen Biosynthesewege, die Markierung

anderer, markierter Vorstufen abzuschwächen.

Dabei konnte eindeutig gezeigt werden, dass markierte Bestandteile von Anthranilat

(Abbildung 3-4 B) und vom Acetat (als Vorstufe der Fettsäure) (Abbildung 3-5 A und B)

in HAQ eingebaut werden [Bredenbruch et al., 2005]. Es war dagegen nicht möglich, zu

zeigen, dass markiertes Aspartat als Vorstufe von Orotat zur Synthese von HAQs

Abbildung 3-3 A: Postulierter Biosyntheseweg von PQS: Kondensation von Anthranilat und einer

aktivierten β-keto Fettsäure zu PQS [Calfee et al., 2001; Juhas et al., 2004; Juhas et al., 2005]; B: Mögliche

Alternative der PQS Biosynthese in der Anthranilat und Orotat als Vorstufen dienen.

3. ERGEBNISSE

- 49 -

verwendet wird (Abbildung 3-4 A). Des Weiteren wurde der Einbau von markierten

Atomen von Acetat und Anthranilat, weder durch gleichzeitige Fütterung von nicht

markiertem Orotat, noch durch kynurenische Säure abgeschwächt. Nicht markierte

Fettsäure konnte dagegen die Markierung durch Acetat deutlich verringern.

Der Biosyntheseweg von HAQ verläuft damit über eine Kondensation von Anthranilat und

einer ß-Dekan-Fettsäure unter Abspaltung von CO2.

Durch NMR Analysen von HAQ Isolaten aus SCV 20265, die mit verschieden markierten

Acetaten gefüttert wurden ([13C-1] Acetat; [13C-2] Acetat), konnte weitergehend gezeigt

werden, dass es sich bei dieser Reaktion um eine „head to head“ Kondensation handelt.

Das konnte auch in GC/MS-MS Analysen bestätigt werden, wo unter Fragmentierung der

Fragmentionen 319 [m/z], bei [13C-1] Acetat gefütterten Proben, und 320 [m/z], bei [13C-2]

Acetat gefütterten Proben von 2-heptyl-4-hydroxyquinolin, die Orientierung der Acetate

anhand der Massen der abgespaltenen CH2 Gruppen festgestellt werden konnte. Der

Abbildung 3-4 B: Bei Fütterung mit

markiertem Anthranilat gibt es entsprechend

der Markierung eine Verschiebung des

intensivsten Signals im Fragmentionenmuster

von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin um + 1 m/z

auf 232 m/z

Abbildung 3-4 A: Bei Fütterung mit markiertem

Aspartat bleibt das MS Fragmentionenmuster von

2-Heptyl-4-hydroxyquinolin unverändert mit

stärkstem Fragmention bei 231 m/z

3. ERGEBNISSE

- 50 -

postulierte Biosyntheseweg A (Abbildung 3-3 A) konnte mit diesen Methoden bewiesen

und die Ergebnisse von Ritter 1971 nachvollzogen werden [Ritter und Luckner, 1971a].

Es konnte weiter gezeigt werden, dass nicht nur die 4-Hydroxy Variante, sondern auch

PQS, sowie die längerkettigen Nonyl-Derivate die Markierung enthielten. Das weist auf

eine gemeinsame Biosynthese vieler HAQ Spezies in P. aeruginosa hin und entspricht der

Veröffentlichung von Deziel et al. [Deziel et al., 2004].

3.1.3. Rhamnolipide und HAQs haben einen gemeinsamer Fettsäurepool

Bei der Auswertung der GC/MS Daten für die Aufklärung der Biosynthese von HAQs in

P. aeruginosa wurde festgestellt, dass mit verlängerter Inkubationszeit der Kulturen, die

Länge der aliphatischen Kette der HAQ-Moleküle prozentual zunimmt. Dabei wurde auch

bemerkt, dass die Fettsäure-Kettenlänge bei Rhamnolipiden im gleichen Maße zunimmt.

Diese Beobachtungen legten nahe, dass bei den Biosynthesen von HAQs und

Rhamnolipiden auf den gleichen Fettsäurepool zurückgegriffen wird.

Um diese Theorie zu prüfen, wurden Versuche mit eine rhlG Mutante durchgeführt, die

verglichen zum Wildtyp, nur noch 1-10% der Menge an Rhamnolipiden produziert

230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]

Rel

ativ

e A

bund

ance

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 275

260

246

289232 304

[13C-1] acetate

MS2 of 319

N

OSi(CH

3)

3

230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]

Rel

ativ

e A

bund

ance

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 275

260

246

289232 304

[13C-1] acetate

MS2 of 319

N

OSi(CH

3)

3

Rel

ativ

e A

bund

ance

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 275

260

246

289232 304

[13C-1] acetate

MS2 of 319

N

OSi(CH

3)

3

Abbildung 3-5 A: MS2 des 319 [m/z] Fragmentions

von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin nach Markierung

mit [13C-1] Acetat

275

230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

261

246

290233 304

[13C-2] acetate

MS2 of 320

N

OSi(CH

3)

3

275

230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

261

246

290233 304

[13C-2] acetate

MS2 of 320

N

OSi(CH

3)

3

Abbildung 3-5 B: MS2 des 320 [m/z]

Fragmentions von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin

nach Markierung mit [13C-2] Acetat

3. ERGEBNISSE

- 51 -

[Campos-Garcia et al., 1998]. Die Mutante wurde aus der Arbeitsguppe von Dr. Gloria

Soberon-Chavez zur Verfügung gestellt. Der Defekt dieser Mutante befindet sich in einem

Stoffwechselweg, der für die Bereitstellung von Fettsäuren für die Rhamnolipid

Biosynthese essentiell ist [Campos-Garcia et al., 1998].

Die HAQ- und Rhamnolipid-Produktion der rhlG Mutante wurde mit der Produktion des

Wildtyps verglichen. Die differentielle Rhamnolipid-Produktion war mit GC/MS Analyse

indirekt gezeigt worden, indem die Rhamnolipidextrakte mit methanolischer HCl

hydrolysiert und danach die Rhamnose und die Lipidreste getrennt voneinander gemessen

und verglichen wurden. Die Messungen ergaben im Einklang mit der Literatur, dass die

Rhamnolipid-Produktion in der rhlG Mutante deutlich reduziert ist. In der

Dünnschichtchromatographie (Abbildung 3-6) war auch bei der HAQ-Produktion eine

Reduktion bei der rhlG Mutante zu erkennen. Die Produktion war auf ca. 60% reduziert,

was dafür spricht, dass die HAQ-Produktion, im Gegensatz zur Rhamnolipid-Produktion,

nur teilweise von RhlG abhängt [Bredenbruch et al., 2005].

Abbildung 3-6: Vergleichende Dünnschichtchromatographie mit-HAQ Extrakten aus verschiedenen

Zeitpunkten von Kulturen der rhlG Mutante und dem PAO Wildtyp

3. ERGEBNISSE

- 52 -

Abbildung 3-7 links: PAO1 Kultur in 10 ml BHI

mit 40 µM PQS nach 12 h Wachstum mit

deutlicher Pyocyanin Grünfärbung verglichen

zu der Kultur ohne PQS (rechts)

3.2. Effekt von PQS auf P. aeruginosa: Transkriptionelle

Analyse

PQS ist als ein Signalmolekül beschrieben worden, das es bei exogener Zugabe einen

positiven Effekt auf das Rhl-QS-System hat [McKnight et al., 2000]. Um einen Einblick in

die regulatorische Wirkung von PQS auf P. aeruginosa zu bekommen, wurde PQS in der

Konzentration 40 µM zu Beginn einer PAO1-Kultur gegeben und die transkriptionelle

Änderung im Vergleich zu Kulturen ohne PQS-Zugabe an verschiedenen Zeitpunkten

gemessen. Dazu wurden Realtime-PCR und Microarray-Experimente kombiniert

durchgeführt. Pyocyanin wurde mit Chloroform ausgeschüttelt und eine differentielle

Produktion wurde als ein Marker für eine gesteigerte Aktivität des Rhl-QS-Systems

betrachtet. Diese war bei 40 µM PQS,

verglichen mit der Kultur ohne PQS, nach

12 h zu sehen (Abbildung 3-7).

Eine weitere generelle Beobachtung war,

dass Kulturen mit 40 µM PQS nicht ganz

die gleiche OD600 erreichten, wie die

Kultur ohne exogene PQS Zugabe

(Abbildung 3-8).

Außerdem bildete sich bereits nach 2 h in

den Kulturen mit 40 µM ein roter

Niederschlag und ein Biofilm an der

Kolbenwand nach 4 h.

3. ERGEBNISSE

- 53 -

3.2.1. Realtime-PCR von P. aeruginosa nach Zugabe von PQS

Mit Realtime-PCR wurde überprüft, ob auf transkriptioneller Ebene eine Regulation von

rhlR und rhlA (Rhamnolipid Synthase A) im Vergleich zum housekeeping Gen PA1580 zu

sehen ist, wenn PQS zu der Kultur gegeben wird. Dazu wurden Kulturen ohne, mit 4 und

mit 40 µM PQS angesetzt und RNA von P. aeruginosa in diversen Wachstumsphasen

isoliert. Eine differentielle Regulation bei den getesteten Genen konnte bereits nach 5 h

gezeigt werden, wobei nur mit 40 µM PQS eine deutliche Induktion der Gene um den

Faktor 2-3,5 zu sehen war (Abbildung 3-9).

0,01

0,1

1

10

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Zeit [min]

OD

600 0 PQS

4 µM PQS40 µM PQS

Abbildung 3-8: Wachstumskurven von PAO1 mit unterschiedlichen PQS Konzentrationen

3. ERGEBNISSE

- 54 -

3.2.2. Arrays von PAO1 nach 5, 12 und 20 h unter Zugabe von 40 µM PQS

Die Microarray-Analysen sollten einen Überblick darüber geben, welche Gene in P.

aeruginosa, durch PQS Zugabe, transkriptionell reguliert werden. Dazu wurden 40 µM

PQS zu Beginn der Kultur zugesetzt. Um die globale Transktiption unter homogenen

Kulturbedingungen testen und vergleichen zu können, wurden alle Experimente in 50 ml

Kolben mit 10 ml BHI Medium durchgeführt. Der Kolben ohne PQS wurde mit der

gleichen Menge Methanol versetzt, um einen Effekt durch das Methanol auszuschließen.

Die RNA wurde nach 5, 12 und 20 h isoliert und revers transkribiert. Die cDNA wurde

fragmentiert, markiert und mit den Oligonukleotiden auf den Affymetrix Chip hybridisiert.

0

50

100

150

200

250

300

ohne PQS 4 µM PQS 40 µM PQS

Rel

ativ

e Tr

ansk

ript

ion

(%)

PA1580RhlARhlR

Abbildung 3-9: Relative Änderung der Transkription von rhlA und rhlR nach 5 h

durch PQS Zugabe

3. ERGEBNISSE

- 55 -

Abbildung 3-10: Schematische Abbildung der Fur

abhängige Genregulation

Die als reguliert gefundenen Gene (siehe 2.4.4.) aller drei Experimente sind in den

folgenden Tabellen zusammengefasst.

Insgesamt wurden 93 Gene durch PQS-Zugabe als reguliert gefunden. Das sind 1,6 % des

P. aeruginosa Genoms. Davon wurden 66 Gene induziert und 27 geringer transkribiert.

KatA ist als einziges Gen nicht eindeutig einer Regulationsrichtung zuzuordnen, weil es

nach 5 h und nach 11 h gegensätzlich reguliert erschien.

3.2.2.1. PQS und Eisen regulierte Gene

31 der 93 PQS regulierten Gene wurden zuvor in zwei Transkriptionsstudien als

eisenreguliert beschrieben [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]. Sie sind in der

Tabelle 4 aufgeführt.

Sehr deutlich war, dass die Gene der beiden Eisenaufnahme-Systeme von P. aruginosa,

Pyoverdin (pvdA, D und J) und Pyochelin (pchA-G, fptA), in allen Versuchen vermehrt

abgelesen wurden. Von bfrB

(Bacterioferritin) war dagegen bereits

nach 5 h 50-fach weniger Transkript

vorhanden. Bacterioferritine binden

intrazellulär Fe(II) und sind ein

Marker für den Eisengehalt in den

Bakterien. Unter Eisenmangel-

Bedingungen werden Bacterioferritine

weniger exprimiert. Darüber hinaus

wurden weitere Gene, die zuvor in

anderen Transkriptionstudien als

eisenreguliert beschrieben wurden,

auch unter PQS Einfluss differentiell

reguliert. Alkalische Proteasen (aprF

3. ERGEBNISSE

- 56 -

und aprA) und das sodM (sodA) (manganabhängige Superoxid Dismutase) - fumC1 Operon

wurden durch PQS induziert.

Der Eisengehalt der Bakterien wird über Fur (Ferric Uptake Regulator) reguliert.

Zusammen mit Fe(II) als Korepressor bindet und inhibiert Fur die Transkription von

verschiedenen Genen, die wichtig für die Eisenaufnahme sind (Abbildung 3-10). Fur

reguliert aber nicht nur die Gene, deren Produkte für die Eisenaufnahme wichtig sind,

sondern auch eisenabhängige Faktoren, wie z.B. SodB.

Auch wenn bfrB direkt keine Fur-Box in der Promotor-Region besitzt, wird dennoch

diskutiert, dass es über PA4570, welches eine Fur-Box aufweist, indirekt durch Fur

reguliert wird.

Tabelle 4: PQS-regulierte Gene, die in mindestes einer von zwei Transkriptionsstudien als

eisenabhängig reguliert identifiziert wurden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]

PA- Nummer Gen 5 h 11 h 20 h Bezeichnung nach www.pseudomonas.com

PA0848 +76,11 probable alkyl hydroperoxide reductase

PA1245 +4,86 +16,22 hypothetical protein PA1248 aprF +2,31 Alkaline protease secretion outer membrane

protein AprF precursor PA1249 aprA +7,26 +3,20 alkaline metalloproteinase precursor PA2384 +2,89 hypothetical protein PA2386 pvdA +4,44 +2,58 L-ornithine N5-oxygenase PA2399 pvdD +2,57 pyoverdine synthetase D PA2400 pvdJ +9,32 PvdJ PA2402 +3,89 probable non-ribosomal peptide synthetase PA2405 +9,38 hypothetical protein PA2412 +3,53 +2,99 conserved hypothetical protein PA2427 +5,68 hypothetical protein PA3531 bfrB -50,40 bacterioferritin PA4218 +10,13 +8,00 probable transporter PA4220 +18,38 +18,77 hypothetical protein PA4221 fptA +10,22 +4,17 +4,56 Fe(III)-pyochelin outer membrane receptor

precursor PA4222 +14,32 +4,23 probable ATP-binding component of ABC

transporter

3. ERGEBNISSE

- 57 -

PA4223 +6,41 +3,78 probable ATP-binding component of ABC transporter

PA4224 pchG +9,08 +8,51 +9,85 pyochelin biosynthetic protein PchG PA4225 pchF +20,51 +39,67 +17,15 pyochelin synthetase PA4226 pchE +10,34 +16,22 dihydroaeruginoic acid synthetase PA4228 pchD +24,22 +5,24 +3,97 pyochelin biosynthesis protein PchD PA4229 pchC +18,67 +7,26 +3,36 pyochelin biosynthetic protein PchC PA4230 pchB +9,91 +7,89 +12,47 salicylate biosynthesis protein PchB PA4231 pchA +18,88 +7,89 +5,98 salicylate biosynthesis isochorismate synthase PA4467 +5,66 hypothetical protein PA4468 sodM +5,98 +9,85 superoxide dismutase PA4469 +5,58 +5,54 hypothetical protein PA4470 fumC1 +5,24 +3,14 fumarate hydratase PA4471 +7,11 +22,94 hypothetical protein PA4570 +5,46 hypothetical protein

Fettschrift: Diese Gene wurden gleichzeitig auch in Transkriptomstudien unter H2O2 Stress als

reguliert gefunden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005] Kursiv: Diese Gene wurden gleichzeitig

auch in Transkriptomstudie mit MvfR Mutante als reguliert gefunden [Deziel et al., 2005]

3.2.2.2. Durch PQS und durch oxidativen Stress regulierte Gene

Da der Eisenhaushalt von Bakterien immer ein Balanceakt zwischen Eisenmangel und

Radikalbildung durch zu viel Eisen ist, ist es nicht verwunderlich, dass viele Gene, die

eisenabhängig reguliert werden, auch durch oxidativen Stress transkriptionell reguliert

werden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005]. Umgekehrt werden durch oxidativen

Stress auch viele Gene reguliert, die für die Eisenaufnahme wichtig sind. Das spricht für

eine sehr enge Koregulation von Genen unter Eisenmangel und unter oxidativem Stress. In

der Tabelle 5 sind Gene aufgelistet, die sowohl PQS-abhängig als auch unter oxidativem

Stress durch H2O2 differentiell transkribiert wurden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al.,

2005].

3. ERGEBNISSE

- 58 -

Tabelle 5: PQS-regulierte Gene, die in mindestens einer von zwei Transkriptionsstudien als durch

oxidativen Stress reguliert identifiziert wurden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005]


PA0139 ahpC +9,19 +4,20 alkyl hydroperoxide reductase subunit C PA0140 ahpF +17,03 alkyl hydroperoxide reductase subunit F PA0201 +9,85 hypothetical protein PA0250 +13,36 conserved hypothetical protein PA0449 +6,92 hypothetical protein PA0848 +76,11 probable alkyl hydroperoxide reductase PA0849 trxB2 +5,06 thioredoxin reductase 2 PA1174 napA -3,27 -2,62 periplasmic nitrate reductase protein NapA PA1245 +4,86 +16,22 hypothetical protein

PA1248 aprF +2,31 Alkaline protease secretion outer membrane protein AprF precursor

PA1249 aprA +7,26 +3,20 alkaline metalloproteinase precursor PA1902 +3,43 phenazine biosynthesis protein PhzD PA1999 -2,99 probable CoA transferase subunit A PA2008 fahA -9,13 fumarylacetoacetase PA2009 hmgA -2,46 homogentisate 1,2-dioxygenase PA2330 +2,33 hypothetical protein PA2384 +2,89 hypothetical protein PA2386 pvdA +4,44 +2,58 L-ornithine N5-oxygenase PA2405 +9,38 hypothetical protein PA2412 +3,53 +2,99 conserved hypothetical protein PA3032 +2,93 cytochrome c Snr1 PA3237 +34,06 +25,63 hypothetical protein PA3287 +18,9 +2,99 conserved hypothetical protein PA3363 amiR -2,08 aliphatic amidase regulator PA3531 bfrB -50,40 bacterioferritin PA3822 -9,08 conserved hypothetical protein PA4131 -3,01 probable iron-sulfur protein PA4218 +10,13 +8,00 probable transporter PA4220 +18,38 +18,77 hypothetical protein

PA4221 fptA +10,22 +4,17 +4,56 Fe(III)-pyochelin outer membrane receptor precursor



3. ERGEBNISSE

- 59 -

PA4224 pchG +9,08 +8,51 +9,85 pyochelin biosynthetic protein PchG PA4225 pchF +20,51 +39,67 +17,15 pyochelin synthetase PA4226 pchE +10,34 +16,22 dihydroaeruginoic acid synthetase PA4228 pchE +24,22 +5,24 +3,97 pyochelin biosynthesis protein PchD PA4229 pchC +18,67 +7,26 +3,36 pyochelin biosynthetic protein PchC PA4230 pchB +9,91 +7,89 +12,47 salicylate biosynthesis protein PchB PA4231 pchA +18,88 +7,89 +5,98 salicylate biosynthesis isochorismate synthase PA4236 katA -4,21 +2,41 catalase PA4377 -3,63 hypothetical protein PA4468 sodM +5,98 +9,85 superoxide dismutase PA4469 +5,58 +5,54 hypothetical protein PA4470 fumC1 +5,24 +3,14 fumarate hydratase PA4471 +7,11 +22,94 hypothetical protein PA4613 katB +3,39 catalase PA4655 hemH +12,64 ferrochelatase

PA4811 fdnH -6,50 nitrate-inducible formate dehydrogenase, beta subunit

PA4812 fdnG -2,83 formate dehydrogenase-O, major subunit PA4881 +4,92 +2,62 hypothetical protein PA5460 +4,20 hypothetical protein

Fettschrift: Diese Gene wurden gleichzeitig auch in Transkriptomstudien unter Eisenmangel als

reguliert gefunden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003] Kursiv: Diese Gene wurden gleichzeitig

auch in der Transkriptomstudie der MvfR Mutante als reguliert gefunden [Deziel et al., 2005]

3. ERGEBNISSE

- 60 -

3.2.2.3. PQS und MvfR regulierte Gene

Der “multiple virulence factor regulator” MvfR (PqsR) wurde als wichtiger Faktor in der

Regulation der QS-Systeme und der Virulenzfaktor-Produktion bei P. aeruginosa

beschrieben [Deziel et al., 2005] und ist gleichzeitig für die Kontrolle der PQS-

Biosynthese verantwortlich, wobei PQS als Koinduktor diskutiert wurde [Wade et al.,

2005]. Da MvfR der transkriptionelle Regulator des PQS-Biosynthese-Operons ist, würde

man erwarten, dass sowohl in einer Transkriptionsstudie von einer mvfR negativen

Mutante, als auch in einer Studie, in der exogen PQS zu PAO1 Kulturen dazugegeben

wurde, PQS abhängige Gene als reguliert gefunden werden.

Wir haben 20 Gene gefunden, die sowohl durch PQS Zugabe differentiell transkribiert

wurden und die auch in der Transkriptionsstudie mit der mvfR negativen Mutante als

reguliert erschienen (siehe Tabelle 6) [Deziel et al., 2005]. Darunter fallen neben 8

hypothetischen Proteinen auch mexG und mexH Gene, die von Aendekerk et al.

[Aendekerk et al., 2005] als wichtige Faktoren beschrieben wurden, um Wachstum und

Antibiotika Sensitivität zu regulieren. Des Weiteren wurde rsmA als reguliert gefunden,

wobei es sich im einen post-transkriptionalen negativen Regulator von

Sekundärmetaboliten handelt und der ein Gegenspieler von GacA ist. PhzS, welches für ein

Enzym kodiert, das an der Pyocyanin-Biosynthese aus Phenazin-1-carboxyl Säure beteiligt

ist, wurde genauso durch PQS und MvfR reguliert, wie vier mögliche Hitzeschockproteine

(clpB, ibpA, hslU und hslV). Auch bfrB und das mögliche Bakterioferritin PA4880 wurden

sowohl in der mvfR negativen Mutante, als auch unter exogener Zugabe von PQS

differentiell reguliert.

Tabelle 6: Durch PQS regulierte Gene, die auch in der Transkriptionsstudie einer mvfR negativen

Mutante reguliert erschienen [Deziel et al., 2005]


PA0200 +6,96 hypothetical protein PA0284 +8,51 hypothetical protein PA0905 rsmA +2,60 RsmA, regulator of secondary metabolites PA0997 pqsB -2,38

3. ERGEBNISSE

- 61 -

PA2126 +2,35 conserved hypothetical protein PA2274 +3,03 hypothetical protein PA2331 +2,39 hypothetical protein PA3126 ibpA +4,76 heat-shock protein IbpA PA3520 +2,85 hypothetical protein PA3531 bfrB -50,40 Bacterioferritin PA4141 +7,30 +4,14 +5,17 hypothetical protein PA4205 +11,39 hypothetical protein

PA4206 mexH +8,22 probable Resistance-Nodulation-Cell Division (RND) efflux membrane fusion protein precursor

PA4217 phzS +3,66 flavin-containing monooxygenase PA4542 clpB +4,99 ClpB protein

PA4587 ccpR -2,23 -3,18 cytochrome c551 peroxidase precursor

PA4880 -2,55 probable bacterioferritin PA5053 hslV +2,95 heat shock protein HslV PA5054 hslU +2,48 heat shock protein HslU PA5170 arcD +2,31 arginine/ornithine antiporter

Fettschrift: Diese Gene wurden gleichzeitig auch in Transkriptomstudien mit Eisenmangel als

reguliert identifiziert [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003] Kursiv: Diese Gene wurden gleichzeitig

auch in Transkriptomstudien unter oxidativem Stress als reguliert gefunden [Palma et al., 2004;

Salunkhe et al., 2005]

3. ERGEBNISSE

- 62 -

3.2.2.4. Sonstige PQS-regulierte Gene

In diesem Abschnitt sind die Gene zusammengefasst, die durch PQS transkriptionell

reguliert wurden, aber in keiner der anderen oben genannten Transkriptionsstudien als

reguliert gefunden wurden [Deziel et al., 2005; Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003;

Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005]. Aber auch in der Tabelle 7 sind Gene

differentiell exprimiert, die wahrscheinlich für eisenabhängige Faktoren kodieren, wie

SodB (eisenabhängige Superoxid Dismutase), PA4430 (mögliches Cytochrom b) und

PA4431 (mögliches Eisen Sulfat Protein). Ebenso sind Gene hoch reguliert, deren

Produkte für die Anpassung gegenüber Stress wichtig sind. Darunter fallen dnaK (DnaK

Protein) und grpE (Hitzeschock-Protein) sowie das mögliche DNA-Binde-Stress Protein

PA0962.

Tabelle 7: PQS-regulierte Gene, die weder in Transkriptionsstudien unter Eisenmangel, H2O2 Stress

noch in einer mvfR negativen Mutante als differentiell reguliert identifiziert wurden

PA -Nummer Gen 5 h 11 h 20 h Bezeichnung nach www.Pseudomonas.com

PA0359 -2,03 hypothetical protein PA0721 -2,83 hypothetical protein of bacteriophage Pf1 PA0753 -3,11 hypothetical protein PA0962 +3,10 probable dna-binding stress protein PA1582 sdhD -12,38 succinate dehydrogenase (D subunit) PA2674 -5,47 probable type II secretion

system protein PA2868 +10,34 hypothetical protein PA3524 gloA1 -2,34 lactoylglutathione lyase PA3815 +3,63 conserved hypothetical protein PA4263 rplC -2,58 50S ribosomal protein L3 PA4366 sodB -4,03 -3,01 -4,38 superoxide dismutase PA4430 -7,73 probable cytochrome b PA4431 -3,01 -3,53 probable iron-sulfur protein PA4761 dnaK +2,48 DnaK protein PA4762 grpE +3,14 heat shock protein GrpE PA5100 hutU -4,61 Urocanase

3. ERGEBNISSE

- 63 -

Zusammenfassend konnte in unserer Transkriptionsstudie festgestellt werden, dass die

Gene, die unter Zugabe von 40 µM PQS reguliert wurden in großen Teilen dem Fur

Regulon entsprachen. Ebenso gab es viele Gene, die sowohl durch PQS als auch unter

H2O2 Stress reguliert wurden. Allerdings ist auch deutlich geworden, dass es PQS

regulierte Gene zu geben scheint, die nicht mit Eisenmangel in Verbindung gebracht

werden können. Zu diesen Genen zählen rsmA, pqsB und mexGH. Sie zeigten sich sowohl

in dieser Studie als PQS abhängig reguliert, als auch in der Transkriptionsstudie mit der

mvfR negativen Mutante als differentiell transkribiert und unterliegen damit offensichtlich

einer PQS spezifischen Regulation.

3.3. Vergleich der durch PQS-Zugabe regulierten Gene mit

anderen P. aeruginosa Transkriptionsstudien

Im Anschluss an die Transkriptionsstudie wurden die durch PQS-Zugabe als differentiell

reguliert gefunden Gene mit den Genen, die in anderen P. aeruginosa

Transkriptionsstudien als reguliert beschrieben wurden, verglichen. Die Anzahl der Gene,

die in jeweils zwei Transkriptionsstudien als reguliert erschienen, wurden in der Tabelle 8

zusammengefasst, um einen Überblick über die bisher veröffentlichten P. aeruginosa

Transkriptionsstudien zu bekommen.

3. ERGEBNISSE

- 64 -

3.4. PQS Effekt auf die Eisenkonzentration

Da nach der externen PQS-Zugabe, die Gene in den transkriptionellen Analysen so

reguliert waren, als würde ein Eisenmangel vorliegen, wurde untersucht, ob PQS direkt

einen Eisenmangel in der Kultur hervorruft. Dazu wurde in P. aeruginosa Kulturen mit

und ohne PQS der Eisengehalt gemessen, und mit dem Gehalt in Kulturen verglichen,

denen 2,2-Bispyridyl als Eisenchelator in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt wurde.

Die Untersuchungen der Eisenkonzentration im Verlauf der Kultivierungen ergaben, dass

bei den Kulturen mit 40 µM PQS die Eisenkonzentration im Medium viel schneller sank,

[H t t l 2003 Whit l t l 2001 W lf t l 2004]

Tabelle 8: Vergleich von zuvor in verschiedener Transkriptomstudien als reguliert identifizierten

Genen mit den Genen, die in dieser Studie als durch PQS reguliert identifiziert wurden

3. ERGEBNISSE

- 65 -

als in den Kulturen ohne PQS. Nach 1 h waren in den Kontrollkulturen noch 0,47 mg/l

Eisen vorhanden, wogegen in den Kulturen mit PQS nur noch 0,25 mg/l und damit gut die

Hälfte des Eisens messbar war. Im Vergleich dazu sank der messbare Eisengehalt in den

Kulturen ohne PQS nach 5 h nur auf 0,36 mg/l (Abbildung 3-11).

Die Vergleichswerte mit 2,2-Bispyridyl zeigten einen konzentrationsabhängigen Effekt auf

die Konzentration von freiem Eisen im Medium. Die Eisenkonzentration sank in dem

Kolben mit PQS schneller als in den Kolben mit 2,2-Bispyridyl, so dass in der PQS-

haltigen Kultur der Eisengehalt nach einer Stunde mit 0,25 mg/l der Konzentration

entsprach, welche die 200 µM 2,2-Bispyridyl Kultur nach einer Stunde zeigte. Nach 2 h

war der Wert aber bereits vergleichbar mit der 500 µM 2,2-Bispyridyl Kultur. Das setzte

sich fort, so dass nach 5 h, wo nur noch 0,07 mg/l messbares Eisen in der PQS Kultur war,

die Eisenkonzentrationen nahezu mit der Konzentration der 1 mM 2,2-Bispyridyl Kultur

übereinstimmte (0,05 mg/l).

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50

1,0 2,5 4,0 5,0Zeit (h)

Eis

en K

onze

ntra

tion

(mg/

l) PAO1 Kontrolle

PAO1 + 40 µM PQS

PAO1 + 100 µM 2,2-Bispyridyl




Abbildung 3-11: Eisenkonzentration im BHI Kulturen in Abhängigkeit von Zeit und zugegebenen

PQS oder 2,2-Bispyridyl

3. ERGEBNISSE

- 66 -

3.5. PQS komplexiert Fe(III) in vitro

Um Hinweise darauf zu bekommen, auf welche Weise PQS zum Eisenmangel führt, wurde

versucht, ob PQS dem BHI Medium auch im bakterienfreien System Eisen entziehen kann,

oder ob P. aeruginosa dafür nötig ist. Neben einem direkten PQS Effekt könnte eine

Überproduktion an Siderophoren eine Erklärung für die schnell sinkende

Eisenkonzentration sein.

Schüttelkolben wurden mit BHI Medium und PQS versetzt und ohne Bakterien bei 37 °C

geschüttelt. Als Kontrolle wurde der Eisengehalt in BHI Medium bestimmt. In den Kolben,

die zusätzlich PQS enthielten, war nach 1 h Schüttelinkubation bei 37 °C ein roter

Niederschlag abzuzentrifugieren. Das war weder bei den Kontrollkolben der Fall, noch

direkt nach der PQS-Zugabe möglich. Das Prezipitat wurde mit Dichlormethan extrahiert

und mit DC auf PQS untersucht. Als Vergleich wurde aus dem gleichen Kolben der

Überstand extrahiert und ebenfalls aufgetragen. PQS war eindeutig in dem roten

Niederschlag nachweisbar.

Nach der Inkubation bei 37 °C wurde die Eisenkonzentration im Medium bestimmt. Die

Konzentration an freiem Eisen sank im Medium mit PQS deutlich. Die Ergebnisse waren

vergleichbar mit den P. aeruginosa Schüttelkulturen mit PQS.

Dieser Versuch zeigte, dass PQS alleine in der Lage ist, das Eisen aus dem Medium zu

binden. Bakterien bzw. andere Metaboliten waren nicht erforderlich. Bemerkenswert dabei

war, dass die Bindung ein Schütteln des Mediums erforderte, um den roten Niederschlag

zu bilden. Der Versuch, das Eisen aus dem BHI Medium in einem geschlossenen 2 ml

Reaktionsgefäß mit PQS zu entziehen, gelang nicht. Ein Sauerstoffeintrag schien für die

Reaktion unerlässlich zu sein.

Um einen weiteren Einblick in die Bindereaktion von PQS und Eisen zu bekommen, wurde

PQS mit Fe2SO4 und mit Fe3SO4 gemischt. Dabei wurde das Eisensulfat mit 250 mM im

deutlichen Überschuss zu PQS (2 mM) eingesetzt und im 2 ml Reaktionsgefäß gemischt.

Beim Fe3SO4 wurde das Gemisch sofort rötlich und es ließ sich ein roter Niederschlag

zentrifugieren. Das Fe2SO4 musste dagegen offen mehrere Minuten gemischt werden,

3. ERGEBNISSE

- 67 -

damit ebenfalls ein roter Niederschlag entstand, der nicht so stark war, aber sich dennoch

zentrifugieren ließ. Die als biologisch inaktiv beschriebene Vorstufe von PQS 2-Heptyl-4-

hydroxyquinolin (HHQ) bildete weder mit Fe2SO4 noch mit Fe3SO4 einen zentrifugierbaren

Niederschlag. Alle vier Proben wurden in ESI analysiert.

Bei der Fe3SO4/ PQS Probe stellte sich heraus, dass zwei PQS Moleküle mit einem Fe(III)

Atom einen Komplex ausbilden, der so stabil war, dass bei einer anschließenden MS2

Analyse die kovalenten Bindungen der Alkyl-Seitenketten des PQS nacheinander

abgespalten wurden (Abbildung 3-12). Der Komplex zwischen PQS und Eisen blieb stabil.

Von anderen gefundenen Komplexen, wie z.B. zwei PQS Moleküle oder drei PQS und ein

Fe(III) ließ sich dagegen mit sehr wenig Energie ein PQS abspalten, so dass einzelne PQS

Moleküle oder ein stabiler Komplex aus zwei PQS und einem Fe(III) entstanden.

Bei eingesetztem Fe2SO4/ PQS wurde ebenfalls ein stabiler Komplex aus zwei PQS und

einem Fe(III) nachgewiesen. Fe(II) haltige PQS Komplexe wurden dagegen nicht

gefunden. Für die Oxidation des Fe(II) zu Fe(III) war der Sauerstoffeintrag durch das

mischen unerlässlich. Deshalb war es auch nicht möglich, ohne gute Durchmischung und

Sauerstoffeintrag PQS/ Eisen Komplexe aus BHI Medium zu erhalten.

Mit 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin konnte weder mit Fe(II) noch mit Fe(III) Komplexe

nachgewiesen werden. Das zeigt, dass nur die als aktiv beschrieben HAQ Substanz PQS

[McKnight et al., 2000; Pesci et al., 1999] Eisen komplexieren kann und die als inaktiv

beschriebenen HHQs [McKnight et al., 2000; Pesci et al., 1999] als Vorstufe von PQS

keine Komplexe mit Eisen bilden können.

3. ERGEBNISSE

- 68 -

Abbildung 3-12 A: ESI des PQS/ Fe(III) Präzipitat B: MS2 des 831,50 m/z Signals [3

PQS-2H+Fe]+; Das Fragmention zerfällt leicht unter Abspaltung eines PQS in [2PQS-

2H+Fe] C: MS2 des 572,32 [m / z] Signals [2PQS-2H+Fe]+. Vom stabilen Komplex werden

CH2 bzw. CH3 Gruppen der Heptyl Ketten der PQS Moleküle abgespalten. Der Kompex

mit Eisen bleibt dagegen stabil.

3. ERGEBNISSE

- 69 -

3.6. Das Rhl-QS-System wird durch Eisenmangel induziert

Es wurde beschrieben, dass exogene PQS Zugabe zu einer Hochregulation des Rhl-QS

Systems führt [McKnight et al., 2000]. Nachdem gezeigt werden konnte, dass exogene

PQS-Zugabe sehr schnell zu Eisenmangel im Medium führt, stellte sich die Frage, ob die

Regulation des Rhl-Systems auf PQS oder auf Eisenmangel zurückzuführen ist. Dazu

wurde die Aktivität des rhlR Promotors in Kulturen mit PQS und mit 2,2-Bispyridyl,

mittels einer lacZ Fusion, die auf dem pMAL.V Plasmid lokalisiert ist [Latifi et al., 1996],

verglichen. Durch die LacZ Aktivität konnten Rückschlüsse auf die Promotor-Aktivität

während der Kultivierung gezogen werden.

In den Versuchen wurde gezeigt, dass sich die rhlR Promotoraktivität eindeutig sowohl

durch PQS Zugabe, als auch durch Eisenentzug mit Hilfe von 500 µM 2,2-Bispyridyl

signifikant steigern ließ. Dabei erreichte die Aktivierung mit 2,2-Bispyridyl bereits nach 4

Abbildung 3-13: Relative rhlR Promotor Aktivität nach 4 h und 7 h von PAO1,

PAO1 mit 40 µM PQS und PAO1 mit 500 µM 2,2-Bispyridyl; Die Regulation

war nach 4 h bei den Kolben mit 2,2-Bispyridyl und nach 7 h bei den Kolben

mit 40 µM PQS signifikant (T-Test p-value < 0,05)

0

50

100

150

200

250

300

350

4 7Zeit (h)

rela

tive

rhlR

Akt

ivitä

t (%

)

PAO1 Kontrolle

PAO1 + 40 µM PQS


3. ERGEBNISSE

- 70 -

h ihr Maximum. PQS zeigte nach dieser Zeit noch keine Wirkung auf das Rhl-QS-System.

Diese war erst nach 7 h deutlich zu erkennen (Abbildung 3-13), die Aktivität des rhlR

Promotors in der Kultur mit 2,2-Bispyridyl, im Vergleich zur Kontrolle, dagegen schon

wieder sank.

3.7. Die HAQ-Biosynthese wird eisenunabhängig durch PQS

verstärkt

Ganz offensichtlich ließ sich eine rhlR Promotor Aktivierung auch durch Eisenmangel

ohne PQS Zugabe erreichen. Es ist allerdings denkbar, dass die PQS Produktion durch

Eisenmangel verstärkt wird und dass eine erhöhte PQS Konzentration zur Induktion des

Rhl-QS Systems führt und nicht der Eisenmangel als direktes Signal. Um dies zu

überprüfen, wurden gesamt HAQ Extrakte aus Kulturen mit und ohne 500µM 2,2-

Bispyridyl gewonnen und mit GC/MS analysiert.

Bei den vergleichenden Untersuchungen von PAO1 Kontrollkulturen, mit 40 µM PQS

versetzen Kulturen und Kulturen mit 500 µM 2,2-Bispyridyl wurde festgestellt, dass nur

bei den PQS Kulturen auch die HAQ Produktion verstärkt war. Bei den 2,2-Bispyridyl

Kulturen konnte dagegen, im Vergleich zu den Kontrollen, kein Unterschied in der HAQ

Produktion festgestellt werden.

Das bedeutet zusammenfassend, dass es bei exogener PQS Zugabe zu einer Autoinduktion

des PQS Biosynthese Operons kommt und dass dieser PQS Effekt unabhängig vom

Eisengehalt des Mediums ist.

3.8. Multiple Funktionen von PQS

Die Ergebnisse, die belegen, dass PQS ein eisenbindender Sekundärmetabolit von P.

aeruginosa ist, welches, wenn extern zu einer Kultur gegeben wird, zu Eisenmangel in der

3. ERGEBNISSE

- 71 -

Kultur und zu einer transkriptionellen Regulation der Gene führt, die für die

Aufrechterhaltung des Eisenhaushalts wichtig sind, sind sehr interessant und bieten einen

neuen Ansatzpunkt für die Erklärung des bisher beschriebenen Wirkmechanismus von

PQS. Dennoch lassen sich nicht alle PQS Effekte auf Eisenmangel reduzieren. Einige

Gene, wie z.B. das PQS Operon selbst, werden durch PQS und nicht durch Eisenmangel

reguliert.

Die Frage, die sich nun stellte, war, in welcher Weise PQS noch auf die P. aeruginosa

Kultur Einfluss nehmen kann.

3.8.1. Computermodell der Interaktion von PQS und DNA

Auf Grund der Struktur von PQS wurde vermutet, dass PQS mit DNA interagieren könnte,

und es wurde eine Interaktion zwischen PQS und einem 141 Bp langen DNA Fragment im

Computermodell simuliert. Die Simulation wurde von Dr. Joachim Reichelt an der GBF

Braunschweig mit Hilfe des Programms BRAGI durchgeführt [Reichelt et al., 2005]. Da

die Rechnungen sehr viel Zeit in Anspruch nehmen (ca. 1 Monat CPU Rechenzeit für 500

ps) und bei Raumtemperatur die Reaktionen zu langsam ablaufen, wurden die Rechnungen

bei 510 °K durchgeführt.

Im Modell lagerte sich das PQS in der großen Furche an die DNA so an, dass sich einzelne

Basen aus der Doppelhelix heraus zum PQS drehen (siehe Abbildung 3-14). Durch diese

Interaktion wurde die DNA teilweise einzelsträngig. Strangbrüche wurden im Modell

durch das PQS nicht herbeigeführt.

Die gleiche Rechnung wurde auch mit dem inaktiven HHQ [Pesci et al., 1999]

durchgeführt. Im Modell hatte das HHQ nicht den gleichen Effekt auf die DNA, wie das

PQS. Es gab zwar Wechselwirkungen, die aber nicht zur Entwindung der Doppelhelix und

auch nicht zur Generation von Einzelsträngen führte (siehe Abbildung 3-15).

3. ERGEBNISSE

- 72 -

Abbildung 3-14: PQS-DNA Interaktion im Computermodell

Abbildung 3-15: HHQ interagiert nicht mit der DNA

3. ERGEBNISSE

- 73 -

3.8.2. PQS verstärkt die DNA Fragmentierung durch Fe(II) in vitro

Anhand des Computermodells wurde gezeigt, dass PQS mit DNA interagiert. Deshalb

wurde in vitro λ-DNA mit PQS und HHQ inkubiert. Es war keine Veränderung im

Laufverhalten der DNA im Agarosegel zu sehen (Abbildung 3-16) Spur 2 und 3 λ-DNA;

Spur 4: λ-DNA mit PQS und Spur 5: λ-DNA mit HHQ). Wenn PQS nur eine strukturelle

Veränderung der DNA bewirkt, ist dies auch nicht zu erwarten gewesen. Wir haben daher

im nächsten Schritt getestet, ob eine strukturelle Veränderung zu einer größeren

Empfindlichkeit der DNA gegenüber

oxidativem Stress führt. Daher wurde die λ-

DNA mit Fe(II) (Spur 6) und PQS (Spur 7)

bzw. HHQ (Spur 8) inkubiert. Wir konnten

zeigen, dass offensichtlich die DNA Struktur

durch PQS so verändert wird, dass die DNA

deutlich stärker fragmentiert. Die HHQ

Zugabe zeigte dagegen keinen Effekt. Es sind

also keine weiteren lytischen Enzyme wie z.B.

DNasen für eine PQS induzierte

Fragmentierung der DNA notwendig.

Abbildung 3-16: verstärkte DNA

Fragmentierung durch Fe(II) und PQS

1:Smart Leiter 2 und 3: λ-DNA 4: λ-DNA mit

PQS 5: λ-DNA mit HHQ 6: λ-DNA mit Fe(II)

7: λ-DNA mit Fe(II) und PQS 8: λ-DNA mit

Fe(II) und HHQ

3. ERGEBNISSE

- 74 -

3.8.3. PQS fragmentiert in vivo DNA

Um die Art der Wechselwirkung von

PQS und DNA in vivo besser zu

verstehen, wurde chromosomale

DNA von PAO1 und einer pqsA

negativen Mutante - die kein PQS

mehr produziert, weil das erste Gen

des pqs Operon defekt ist - nach 4

und 5 Tagen Wachstum in

biofilmähnlichen Bedingungen auf

Weichagarplatten isoliert und das

Laufverhalten im Agarosegel

verglichen.

Die Laufmuster unterschieden sich

deutlich (Abbildung 3-17). Die pqsA

negative Mutante zeigte kaum eine

DNA Fragmentierung nach 4 und 5 Tagen (Abbildung 3-17; Spuren 2 und 4) verglichen

mit dem PQS produzierenden PAO1, dessen DNA mit zunehmender Inkubationszeit

deutlich mehr fragmentiert ist (Abbildung 3-17; Spuren 1 und 3).

Es konnte damit auch in vivo gezeigt werden, dass PQS an der DNA Fragmentierung

beteiligt ist.

Abbildung 3-17: Vergleichende DNA Fragmnetierungs-

muster von PAO1 und pqsA Mutante nach 4 und 5 Tagen

1:PAO1 4Tage; 2: pqsA Mutante 4 Tage; 3: PAO1 5 Tage;

4: pqsA Mutante 5 Tage

3. ERGEBNISSE

- 75 -

3.9. PQS induziert einen bakteriellen Zelltod und die

Bereitstellung von extrazellulärer DNA

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PQS in vitro und in vivo an einer DNA

Fragmentierung beteiligt ist. Als Konsequenz daraus findet sich deutlich mehr

extrazelluläre DNA in einer Kultur der PQS produzierenden SCV 20265 (Abbildung 3-18)

im Vergleich zu einer PQS-negativen Mutante M1 mit einer Transposoninsertion im PQS

Biosynthese-Operon (Abbildung 3-19). Die extrazelluläre DNA wurde spezifisch mit dem

TOTO-1 Farbstoff aus zwei Tage alten Kolonien auf Columbia-Blut-Agar angefärbt.

Als nächstes wurde mit Hilfe von einer „life and dead“ Färbung überprüft, welchen

Einfluss die PQS Produktion auf die Überlebensrate der Bakterien in einer Kolonie hat.

Dazu wurden die Bakterien aus SCV 20265- und M1 (pqsA negativen Mutante)-Kolonien

nach einem Tag gefärbt und im Fluoreszenz Mikroskop analysiert. Es ist eindeutig zu

sehen, dass nach einem Tag fast 90 % der Bakterien in der SCV 20265 Kolonie tot sind

(Abbildung 3-20), wogegen deutlich mehr Bakterien in der Kolonie der pqsA negativen

Mutante noch leben (Abbildung 3-21).

Abbildung 3-19: M1 (pqsA negative Mutante)

TOTO-1 Färbung der extrazellulären DNA nach

zwei Tagen

Abbildung 3-18: SCV 20265 TOTO-1 Färbung

der extrazellulären DNA nach zwei Tagen

3. ERGEBNISSE

- 76 -

Es gibt bei P. aeruginosa folglich einen Zusammenhang zwischen PQS Produktion, DNA

Fragmentierung, Lyse der Bakterien und Bereitstellung von extrazellulärer DNA.

3.10. PQS vermittelt morphologische Diversität in der späten

Wachstumsphase

Typischerweise bildet P. aeruginosa im Biofilm in der späten stationären Phase

verschiedene Koloniemorphotypen aus [Boles et al., 2004]. Die Ausbildung dieser

morphologischen Diversität ist auch als „insurance effect“ bezeichnet worden, da eine

heterogene Population größere Chancen hat, verschiedene Stressbedingungen zu

überleben, als eine homogene Kultur. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass diese

Diversität RecA abhängig ist [Boles et al., 2004].

Wir haben den PAO1 Wildtyp, eine recA Mutante und eine pqsA negative Mutante 4 und 5

Tage auf Weichagar inkubiert und die Koloniemorphotypen auf Columbia-Blut Agar

überprüft. Der PAO1 Wildstamm zeigte mindestens drei verschiedenen Kolonie

Morphotypen (Abbildung 3-22), die in gleicher Verteilung auftraten, wogegen weder die

Abbildung 3-20: SCV live and dead Färbung

nach einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne

Bakterien leben

Abbildung 3-21: M1 live and dead Färbung nach

einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne

Bakterien leben

3. ERGEBNISSE

- 77 -

recA noch die pqsA Mutante deutlich von der ursprünglichen Kolonieform abweichende

Kolonien ausbildeten.

Abbildung 3-22 a: ursprünglicher Morphotyp, b: durchsichtiger Morphotyp, c:

kleiner Morphotyp (keine SCV)

4. DISKUSSION

- 78 -

4. Diskussion

P. aeruginosa ist ein fakultativ pathogener Keim, der eine wichtige Rolle als Erreger bei

nosokomialen Infektion und bei Patienten mit CF spielt. Maßgeblich für die Pathogenität

von P. aeruginosa ist ein Arsenal von Virulenzfaktoren, welche zum großen Teil durch

Quorum Sensing reguliert werden. Die interbakterielle Kommunikation wird durch

Signalmoleküle (Autoinducer) vermittelt, deren Konzentration mit steigender Zelldichte

der Bakterien Population zunimmt. Haben die Autoinducer einen gewissen Schwellenwert

überschritten, dann binden sie intrazellulär an den transkriptionellen Regulator und

aktivieren diesen und damit eine Gruppe von Genen, welche unter der Kontrolle des

Regulatorproteins steht. Dieses System ermöglicht es in Abhängigkeit von der Zelldichte,

Gene koordiniert zu regulieren. P. aeruginosa verfügt über zwei QS Systeme, die in einer

Hierarchie angeordnet sind. Das Las-QS-System dominiert dabei über das Rhl-QS-System.

Beide Systeme bestehen aus einer Autoinducer-Synthase (LasI, RhlI) und einem

transkriptionellen Regulatorprotein (LasR, RhlR), welches durch die Bindung des

spezifischen Autoinducers aktiviert wird. Bei den Autoinducern handelt es sich um n-Acyl-

Homoserinlaktone.

1999 wurde bei P. aeruginosa 2-Heptyl-3-hydroxy-4-quinolon (PQS) als drittes

Signalmolekül beschrieben, welches sich von den zwei Autoinducern strukturell

unterscheidet [Pesci et al., 1999]. Das PQS interagiert mit den zwei QS Systemen von P.

aeruginosa und ist an der Induktion des Rhl-QS-Systems maßgeblich beteiligt. Zahlreiche

Untersuchungen haben ein sehr komplexes regulatorisches Netzwerk um die beiden QS-

Systeme gezeigt, wobei PQS eine zentrale Rolle einnimmt: • PQS wird in der einsetzenden stationären Phase gebildet [Diggle et al., 2003] und

steht unter der Kontrolle des Las QS-Systems [McKnight et al., 2000; Pesci et al.,

1999].

• Ohne PQS Produktion und ohne PqsE, welches als PQS Effektor Molekül

beschrieben wurde [Gallagher et al., 2002], produziert P. aeruginosa nur geringe

4. DISKUSSION

- 79 -

Mengen an Rhl-QS-System abhängigen Exoprodukten wie Pyocyanin, PA-IL

Lectin, obwohl das Rhl-QS-System aktiv ist [Diggle et al., 2003].

• MvfR (PqsR) ist ein Las-QS-System abhängiger transkriptioneller Regulator des

pqsA-E Operons, der phnAB Gene und von sich selbst [Deziel et al., 2005].

• Exogene PQS Zugabe führt zur Aktivierung des Rhl QS Systems und bedingt zur

Aktivierung des Las QS Systems. Verstärkte LasB, Pyocyanin, PA-IL Lectin und

RpoS Produktion sind die Folgen [Diggle et al., 2003; Gallagher et al., 2002;

McKnight et al., 2000]

Allerdings bleibt der molekulare Mechanismus der Wirkung von PQS auf die QS Systeme

von P. aeruginosa unbekannt.

4.1. HAQ Biosynthese

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Biosyntheseweg von PQS untersucht. Calfee et al.

zeigten 2001, dass Anthranilat für die PQS Biosynthese unerlässlich ist und postulierten

einen Biosyntheseweg von PQS über die Kondensation von Anthranilat und β-

Ketofettsäuren [Calfee et al., 2001]. In einer Arbeit von Deziel et al. [Deziel et al., 2004]

konnte gezeigt werden, dass erst eine Vorstufe von PQS - die HHQs – in großen Mengen

synthetisiert werden, aus denen durch die Monoxigenase PqsH PQS gebildet wird [Deziel

et al., 2004]. Auf der Suche nach weiteren Genen, deren Produkte an der Biosynthese von

HAQ beteiligt sind, wurde in dieser Arbeit eine Transposonmutagenese mit dem klinischen

Isolat SCV 20265 [Haussler et al., 1999] durchgeführt und nach HAQ defizienten

Mutanten gescreent. Dieses Isolat produziert HAQ abhängige kristalline Strukturen in

großer Menge und eignete sich deshalb besonders gut für den Screen. Unter den 26

gefundenen HAQ negativen Mutanten hatten über die Hälfte einen Defekt in einem der 4

Gene (carB, pyrB, pyrD, pyrE) des Pyrimidin-Stoffwechselwegs, der an der Bildung von

Orotat beteiligt ist. Die Ergebnisse führten neben dem von Calfee et al. postulierten HAQ

4. DISKUSSION

- 80 -

Biosyntheseweg [Calfee et al., 2001], zu einer alternativen Theorie: die Synthese könnte

auch über eine Reaktion von Anthranilat und Orotat unter der Bildung der Vorstufe

Kynurat verlaufen, an die nachträglich ein Alkyl Rest angehängt wird. Es stellte sich

heraus, dass die Pyrimidin Mutanten unter Zugabe von Substraten, die den

Stoffwechselweg komplementierten, wieder HAQ produzierten und dass eine deutlich

höhere OD600 erreicht wurde, als ohne Substrate. Des Weiteren wurde mit Hilfe von

GC/MS und NMR Analysen von nicht radioaktiv markierten HAQ Extrakten gezeigt, dass

die Synthese der HAQ über eine Kondensation von Anthranilat und eine β-Ketofettsäure

verläuft. Dabei wird die Fettsäurekette über eine „head to head“ Kondensation an das

Anthranilat gebunden. Diese Ergebnisse bestätigten die Arbeit von Ritter und Luckner, die

mit radioaktiv markierten Substraten arbeiteten [Ritter und Luckner, 1971b].

Bei den GC/MS Analysen der markierten HAQ Extrakte konnten wir außerdem zeigen,

dass die Markierung nicht nur im PQS sondern auch in anderen HAQ Derivaten

nachgewiesen werden konnte. Das beweist, dass es einen Biosyntheseweg für die HAQs

von P. aeruginosa gibt und bestätigt die Arbeiten von Lepine und Deziel [Deziel et al.,

2004; Lepine et al., 2004; Lepine et al., 2003].

Bei den Analysen fiel zudem auf, dass die Fettsäurenkettenlänge der HAQ mit

zunehmender Kultivierungsdauer zunahm. Dies war auch der Fall in den Lipidresten von

Rhamnolipiden, die ein bedeutender Virulenzfaktor von P. aeruginosa sind. Die

Vermutung lag nahe, dass P. aeruginosa einen gemeinsamen Fettsäurepool für die

Synthesen von HAQ und Rhamnolipiden verwendet. Wir untersuchten daraufhin eine rhlG

Mutante auf HAQ Produktion. Für diese Mutante konnte gezeigt werden, dass sie durch

einen Defekt in der Fettsäure Bereitstellung nur 10 % der Rhamnolipide produziert

[Campos-Garcia et al., 1998]. Wir konnten zeigen, dass die rhlG Mutante 40 % weniger

HAQs produziert als der Wildtyp. Das bedeutet, dass ein Teil der Fettsäuren für HAQ und

Rhamnolipid Biosynthesen aus dem gleichen Pool bereitgestellt werden. Für die HAQ

Biosynthese scheint es noch andere Bezugsquellen für die Fettsäuren zu geben, die noch

nicht bekannt sind.

4. DISKUSSION

- 81 -

4.2. Transkriptom Analyse unter Einfluss von PQS

PQS wurde als Signalmolekül beschrieben, welches einen Einfluss auf die QS-Systeme

von P. aeruginosa hat [Pesci et al., 1999]. Der positive regulatorische Effekt von exogen

zu den Bakterien gegebenen PQS, wurde mit Hilfe von lacZ Fusionen, hauptsächlich für

rhlI und lasB und in geringerem Maß für rhlR und lasR gezeigt [McKnight et al., 2000].

Wir waren an der transkriptionellen Regulation durch exogenes PQS interessiert. In dieser

Arbeit wurde 40 µM synthetisches PQS zu P. aeruginosa PAO1 Kulturen gegeben. Zuerst

wurde mit Realtime PCR die differentielle Transkription von rhlR und rhlA eruiert. Die

Ergebnisse zeigten, dass es eine Regulation auf transkriptioneller Ebene bereits nach 5 h

gab. Diese war sehr gering, obwohl deutliche PQS abhängige Effekte auf das Rhl-QS-

System in den Kulturen zu sehen waren:

i Pyocyanin wurde in den Kolben mit PQS deutlich verstärkt produziert

ii rhlR-lacZ Promotorfusion zeigte, dass durch PQS Zugabe die Promotoraktivität

signifikant stieg

Darauf folgten Array Experimente nach 5, 11 und 20 h. Dabei wurden insgesamt 93 Gene

als reguliert gefunden.

4.2.1. PQS regulierte Gene: Eine Transkriptionsstudie

Das offensichtlichste Ergebnis der Transkriptionsanalyse war, dass durch PQS Gene

reguliert wurden, die bereits in anderen Transkriptionsstudien unter Eisenmangel als

reguliert gefunden wurden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]. 31 der 93 gesamt

durch PQS reguliert gefundenen Gene waren zuvor als eisenreguliert beschrieben worden.

Z.B. wurde eine erhöhte Expression der Pyoverdin und Pyochelin Eisenaufnahme Systeme

und eine starke Repression der Eisenspeicher Proteine (Bakterioferritin) gefunden, was

dafür spricht, dass in den Kulturen mit PQS ein Eisenmangel herrscht. Die Analyse des

Eisengehalts in den Kulturen zeigte, dass PQS die Konzentration an freiem Eisen deutlich

reduzierte. Wir waren an dem Mechanismus des PQS induzierten Eisenmangels

4. DISKUSSION

- 82 -

interessiert. Deshalb untersuchten wir, ob PQS das auch im zellfreien System Eisen

entziehen konnte und fanden mit ESI Analysen heraus, dass PQS in vitro stabile Komplexe

mit Fe(III) bildet (Abbildung 4-1).

HHQs bildeten dagegen keinen Eisenkomplex

aus. Interessanterweise wurde das PQS, welches

von uns als eisenbindende HAQ Komponente von

P. aeruginosa identifiziert wurde, als die aktive

Substanz in Bezug auf Regulation der QS

Systeme beschrieben [Pesci et al., 1999], die nicht

eisenbindenden HHQs zeigten dagegen keine

Aktivierung des Rhl Systems [Pesci et al., 1999].

Royt et al. [Royt et al., 2001] haben zuvor aus P.

aeruginosa Membranen 4-Hydroxy-2-nonylquinolin isoliert und diese als eine

eisenbindende Substanz beschrieben, obwohl sie – wie in dieser Arbeit - für die

synthetisch hergestellten HHQs keine Eisenbindung zeigen konnten.

Da PQS das freie Eisen im Medium komplexiert und einen Eisenmangel hervorruft, haben

wir mit Hilfe einer lacZ Fusion untersucht, ob rhlR auch durch Eisenmangel an sich

induziert werden kann. Die Ergebnisse zeigten, dass rhlR eindeutig durch Eisenmangel

induziert wird.

Neben den PQS regulierten Genen, die zuvor in anderen Transktiptionsstudien auch als

eisenreguliert gefunden wurden, gab es eine Reihe von Genen, die durch PQS und

oxidativen Stress reguliert wurden [Chang et al., 2005; Palma et al., 2004; Salunkhe et al.,

2005]. Ganz offensichtlich stehen der Eisenhaushalt der Bakterien und oxidativer Stress

durch H2O2 in einer engen Beziehung zueinander. Bei Eisenmangel werden neben den

Eisenaufnahme-Systemen auch Proteine, die in der Abwehr von oxidativen Stress

involviert sind, induziert. Das könnte dadurch erklärt werden, dass bei der Eisenaufnahme

vermehrt freies Eisen im Zytoplasma vorkommt, welches an der Bildung von Radikalen

beteiligt sein kann. Umgekehrt werden auch Eisenaufnahme-Systeme unter oxidativem

Stress mit H2O2 stärker exprimiert [Chang et al., 2005; Palma et al., 2004; Salunkhe et al.,

Abbildung 4-1: Möglicher Komplex

von PQS und Fe(III)

4. DISKUSSION

- 83 -

2005]. Das wurde damit begründet, dass das H2O2 kurzzeitig Fe(II) aus den aktiven

Zentren von Eisen Schwefel Proteinen löst und evtl. Fur inaktiviert und damit, trotz

genügend hoher intrazellulärer Eisenkonzentration, die Eisenaufnahme induziert [Palma et

al., 2004]. Dagegen wurde in einer anderen Arbeit beschrieben, dass unter H2O2 Zugabe

die Gene der Eisenaufnahme Systeme weniger stark exprimiert wurden [Chang et al.,

2005]. Das zeigt die Komplexität des Eisenhaushalts von P. aeruginosa, der offensichtlich

in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren reguliert wird.

Weiterhin hatten wir eine Gruppe von Genen identifiziert, die auch schon in

Transkriptomstudien mit mvfR negativen Mutanten als differentiell reguliert gefunden

wurden. MvfR wurde als transkriptioneller Regulator beschrieben, der als Teil des Las-QS-

Systems von P. aeruginosa reguliert wird. MvfR wirkt positiv transkriptionell auf die

phnAB Gene, das pqsA-E Operons und sich selbst, ohne dass das Las- oder das Rhl-QS-

System modelliert wird [Deziel et al., 2005]. Interessanterweise scheint die MvfR Aktivität

von einem intakten pqsA-E Operon abzuhängen. Von Wade et al. wurde postuliert, dass

PQS selbst ein Koinduktor von MvfR sei [Wade et al., 2005].

MvfR wurde in zwei Transkriptionsstudien unter Eisenmangel Bedingungen als reguliert

gefunden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]. Nachdem wir mit GC/MS Analysen

zeigen konnten, dass die HAQ Produktion unter PQS Zugabe induziert wird, waren wir

daran interessiert, ob ein Eisenmangel die Produktion von HAQs über eine Regulation von

mvfR genauso induzieren kann, wie PQS. Da dies nicht möglich war, kann der Effekt von

PQS auf P. aeruginosa nicht auf den eisenkomplexierenden Effekt reduziert werden.

Diejenigen Gene, die Übereinstimmungen mit den in der mvfR negativen Mutante

regulierten Genen haben, nicht aber in den Transkriptomstudien unter Eisenmandel oder

oxidativem Stress vorkommen, sind Kandidaten für Produkte, die durch PQS, nicht aber

durch den von PQS verursachten Eisenmangel, reguliert werden. Dazu zählen das pqsA-E

Operon, mexGHI-ompD und rsmA.

4. DISKUSSION

- 84 -

4.3. Molekulare Wirkmechanismen von PQS

Die Ergebnisse der Transkriptionsstudien und der Eisenkomplexierungs Versuche zeigten,

dass PQS nach externer Zugabe zum Medium das Eisen komplexiert und damit einen

Eisenmangel Zustand mit entsprechenden transkriptionellen Regulationen zur Folge hat.

Dieser Effekt von PQS wurde bisher noch nicht beschrieben und wirft ein neues Licht auf

die molekularen Wirkmechanismen von PQS. Die Wirkung von PQS auf das Rhl-QS-

System scheint indirekt zu sein, weil auch ein Eisenmangel, der durch 2,2-Bispyridyl

hervorgerufen wurde, rhlR induzierte (siehe 3.4.). Dennoch gibt es ganz offensichtlich

PQS spezifische Effekte, die nicht mit einem Eisenmangel durch 2,2-Bispyridyl zu

simulieren sind. Dazu scheinen die Autoinduktion der HAQ Biosynthese und die

Regulation der MexGHI-OmpD Pumpe, die in engem Zusammenhang mit der Produktion

und der Wirkung von PQS gebracht wird [Aendekerk et al., 2005], zu zählen.

Aufgrund der Struktur des PQS Moleküls wurde eine Interaktion mit DNA postuliert. Eine

Computersimulation der Interaktion von PQS und DNA zeigte, dass sich das PQS Molekül

an die große Furche der DNA anlagert. Durch die PQS-DNA Interaktion wird die DNA an

dieser Stelle einzelsträngig. Interessanterweise wurde in der gleichen Simulation mit der

als biologisch inaktiv beschriebenen Substanz HHQ keine solche Wechselwirkung

beobachtet. Aufgrund dieser Simulation wurde in vitro PQS und HHQ mit DNA inkubiert

und nach verändertem Laufverhalten im Agarosegel geschaut. Es war kein Unterschied zu

sehen. Wenn jedoch Fe(II) als Reaktionspartner hinzugefügt wurde, zeigte nur die PQS

haltige Probe eine deutlich stärkere Fragmentierung der DNA. Dafür sind zwei mögliche

Ursachen denkbar: i) Das PQS verändert die strukturelle Integrität der DNA α-Helix und

macht sie angreifbar für Radikale. ii) Das PQS bindet Fe(III) und katalysiert damit die

Oxidation des Fe(II) und die Bildung von OH• Radikalen. Da HHQs weder eine

Eisenbindung aufweisen, noch im Computermodell die DNA Struktur veränderten, wird

die in vitro Fragmentierung der DNA auch nicht verstärkt.

4. DISKUSSION

- 85 -

Diese PQS abhängig DNA Fragmentierung konnten wir auch in vivo zeigen. Nach vier

Tagen in biofilmähnlichen Bedingungen zeigte der PQS produzierende PAO1 eine

deutliche Fragmentierung der chromosomalen DNA wogegen die PQS negative Mutante

kaum eine Fragmentierung der DNA aufwies. Eine spezifische Anfärbung der

extrazellulären DNA in zwei Tage alten Kolonien zeigte, dass auch deutlich mehr

extrazelluläre DNA in den Kolonien von PQS produzierenden Bakterien ist. Bereits nach

einem Tag konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der PQS produzierenden Bakterien in

einer Kolonie tot waren, wogegen die Bakterien, die kein PQS bildeten, zum großen Teil

noch lebten.

Doch welchen Vorteil hat P. aruginosa davon, eine Substanz zu produzieren, die

offensichtlich in relativ kurzer Zeit zum Sterben eines großen Teils der Population führt?

4.4. Biofilme, Adaption und Überleben

Die Anpassung an wechselnde Umgebungen und verschiedene Arten von Stress ist einer

der größten Herausforderungen, die an Lebewesen gestellt wird. P. aeruginosa hält eine

große Palette an Sensoren und Regulatoren für solche Situationen bereit [Stover et al.,

2000], um auf ein großes Spektrum an wechselnde Umweltbedingungen mit geeigneter

Genregulation reagieren zu können. Da das genetische Repertoire jedoch nicht für

sämtliche Umwelteinflüsse ausgelegt sein kann, ist ein sehr wichtiger Mechanismus, der

das Überleben sichert, Mutation und Selektion [Rainey, 1999]. Des Weiteren ist die

Ausbildung von Heterogenität innerhalb einer Population, insbesondere bei seltenen aber

unregelmäßigen Veränderungen sehr wichtig [Kussell und Leibler, 2005]. Monokultur

Wälder sind z.B. anfälliger gegenüber Insektenbefall als Mischwälder [McCann, 2000].

Dieser Effekt wird als „insurance effect“ bezeichnet [McCann, 2000]. Genauso sind auch

homogene Bakterien Populationen anfälliger gegenüber wechselnden

Umweltbedingungen. In P. aeruginosa konnte gezeigt werden, dass in Biofilmen eine

selbst generierte genetische Diversität ebenfalls zu einem „insurance effect“ führt [Boles et

4. DISKUSSION

- 86 -

al., 2004; Boles et al., 2005]. Dabei wurde gezeigt, dass es hauptsächlich zur Ausbildung

von drei unterschiedlichen Morphotypen kommt und dass dieser Mechanismus RecA

abhängig ist [Boles et al., 2004].

Eine genetische Diversität die auf Mutationen in Stress Situationen zurückzuführen ist,

wird auch stationäre Phase - oder adaptive Mutation genannt. Der Mechanismus wurde

sehr genau in E. coli untersucht, und es wurde gezeigt, dass die Anzahl der adaptiven

Mutationen, die zu der Reversion einer +1 Frameshift Punktmutation eines auf einem

Episom gelegenen lacI führen, maßgeblich von folgenden Faktoren abhängen [Foster,

2004]: i) von RpoS und damit von stationärer Phase und Stress ii) von den DNA-

Doppelstrangbruch-Reparaturproteinen RecABCD und RuvABC und iii) DNA Polymerase

IV der SOS Antwort. Dabei nimmt die durch dinB codierte DNA Polymerase IV eine

zentrale Rolle ein. Diese Polymerase lässt Fehler bei der DNA Replikation zu und führt

vermehrt zu Mutationen [Layton und Foster, 2003; Ponder et al., 2005], die sich von

„normalen“ Mutationen unterscheiden [Foster, 2004]. Bakterien mit „hypermutator“

Eigenschaften wird bei der Ausbildung von adaptiven Mutationen dagegen nur eine

untergeordnete Rolle eingeräumt [Foster, 2004]. Auch bei P. putida wurde gezeigt, dass

DNA Polymerase IV in der stationären Phase an adaptiven Mutationen beteiligt ist

[Tegova et al., 2004].

PQS ist offensichtlich ein Molekül welches mittels Membran Vesikeln zu Nachbarzellen

gelangen kann [Mashburn und Whiteley, 2005; Vlamakis und Kolter, 2005; Winans, 2005]

und dort zur Freisetzung von DNA führt. Der Zelltod von großen Teilen der Population

unter Stressbedingungen könnte für das Überleben der Gesamtpopulation von

entscheidender Bedeutung sein, weil i) DNA eine wichtige extrazelluläre Matrix für

Biofilme darstellt [Whitchurch et al., 2002], ii) die DNA den überlebenden Bakterien als

Nährstoff dienen könnte [Dell'Anno und Danovaro, 2005; Finkel und Kolter, 2001] und iii)

die extrazelluläre DNA als Reparatur Material der beschädigten DNA dienen und so zur

Ausbildung der typischen morphologischen Diversität führen könnte. Wir konnten für P.

aeruginosa klar zeigen, dass die Ausbildung der morphologischen Diversität nicht nur –

4. DISKUSSION

- 87 -

wie bereits beschrieben [Boles et al., 2004] - von RecA sondern auch von der PQS

Produktion abhängt.

Ein PQS gesteuerter Zelltod eines großen Teils der Population könnte entscheidend für das

Überleben von einigen wenigen sichert. Ganz ähnlich zu der beschriebenen Autolyse und

dem programmierten Zelltod von Bakterien als Reaktion auf unterschiedliche Stress

Signale (z.B. Antibiotika) [Lewis, 2000]. Dabei profitieren die Überlebenden [Brooun et

al., 2000; Lewis, 2000; Spoering und Lewis, 2001] von dem altruistischen Verhalten

anderer in der Gemeinschaft. Damit eine Population nicht von „cheatern“ – Individuen, die

vom Altruismus profitieren, aber nichts zum Gemeinwohl beisteuern – übernommen wird,

gibt es Mechanismen, die das altruistische Verhalten direkt an den Vorteil koppeln [Foster

et al., 2004; Travisano und Velicer, 2004; Velicer, 2003]. So wäre denkbar, dass die PQS

Produktion von P. aeruginosa direkt an die Fähigkeit der natürlichen Kompetenz und

damit die Möglichkeit zur Rekombination gebunden ist. In vorläufigen Untersuchungen

weist die pqsA-negative Mutante selbst in einer Kokultivierung mit dem PAO1 Wildtyp

deutlich weniger Varianz auf, obwohl die extrazelluläre DNA nun vorhanden ist. Dieser

pleiotrope Effekt [Foster et al., 2004] ist zu schwerwiegend, als dass sich eine Population

von PQS negativen Mutanten durchsetzen könnte. Besonders die Lunge von CF Patienten

stellt ein sehr heterogenes Habitat mit unregelmäßig wechselnden Bedingungen dar, an die

sich P. aeruginosa wahrscheinlich ständig anpassen muss.

4.5. Ausblick

Obwohl die heutige Diagnostik und Behandlungsstrategien gegen akute Infektionen sehr

gute Ergebnisse erzielen, gibt es noch immer keine wirkungsvolle Methode gegen

chronische P. aeruginosa Infektionen. Das Ausbilden von Biofilmen und die Entwicklung

von resistenten Mutanten macht es nahezu unmöglich, P. aeruginosa mit einer

herkömmlichen Antibiotika Behandlung zu eradizieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt,

dass PQS ein zentrales Molekül bei der Entstehung von genetischen Varianten ist, was der

4. DISKUSSION

- 88 -

Population einen elementaren Vorteil verschafft. Dabei profitieren persistierende Bakterien

im Biofilm davon, dass durch direkte PQS Wirkung ein Großteil der Population lysiert und

damit Nährstoffe und DNA als extrazelluläre Matrix und als genetisches Material für

homologe Rekombination zur Verfügung steht. Das nähere Verständnis dieses

Mechanismus könnte die Grundlage für alternative Behandlungsmethoden sein, die auf der

Unterbindung von interbakterieller Kommunikation und der Verhinderung von

Biofilmbildung, Persistenz und Adaption von P. aeruginosa beruht.

5. ZUSAMMENFASSUNG

- 89 -

5. Zusammenfassung

Florian Bredenbruch

„Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die interbakterielle Kommunikation

von Pseudomonas. aeruginosa“

Die Produktion der meisten Virulenzfaktoren und die Ausbildung von Biofilmen werden

von P. aeruginosa über zwei hierarchisch organisierten Quorum Sensing (QS) Systeme

durch Alkyl-Homoserinlakton-Signalmoleküle reguliert. Kürzlich wurde ein drittes

bakterielles Signalmolekül – das Pseudomonas Quinolon Signal (PQS) – identifiziert,

welches einen Teil der durch QS regulierten Gene positiv beeinflusst.

In dieser Arbeit wurde der Biosyntheseweg von 4-Hydroxy-2-alkylquinolinen (HAQs) mit

Hilfe von Fütterung stabil-markierter Vorstufen und anschließender Analyse der HAQ

Extrakte mit GC/MS und NMR aufgeklärt. Außerdem wurde der Einfluss von PQS auf

PAO1 mit Hilfe von Transkriptionsanalysen untersucht. Das durch die exogene Zugabe

von PQS hervorgerufenen Transkriptionsprofil zeigte eine deutliche Induktion von Genen,

die zu den Gruppen der eisenregulierten Gene und den Genen, die durch oxidativen Stress

reguliert werden, gehören. Bemerkenswerterweise konnten nicht nur die meisten der

regulierten Gene, sondern auch die Induktion einer transkriptionellen lacZ-Fusion mit der

Promotorregion von rhlR auf einen starken eisenbindenden Effekt von PQS zurückgeführt

werden. Nichtsdestotrotz gibt es PQS spezifische Effekte, die unabhängig von dem PQS

Effekt auf den P. aeruginosa Eisenhaushalt sind. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass

PQS scheinbar die benachbarten P. aeruginosa Zellen angreift, indem es direkt auf die

bakterielle DNA wirkt. Als Konsequenz daraus reichern sich große Mengen extrazellulärer

DNA in Biofimkulturen an und stellen offensichtlich einen genetischen Pool für einen

horizontalen Gentransfer dar. Auf diese Weise führt die Opferung eines Teils der

Population zu einer genetische Variabilität der überlebenden Bakterien und zu einem

evolutionären Vorteil unter den sich ändernden Umweltbedingungen. Der horizontale

Gentransfer könnte die genetischen Veränderungen, die mit sexueller Reproduktion der

normalerweise klonalen Lebensweise der Bakterien nicht erreicht werden, kompensieren.

5. ZUSAMMENFASSUNG

- 90 -

Von einem evolutionären Standpunkt aus betrachtet offenbaren diese Ergebnisse eine

außergewöhnliche Bedeutung der natürlichen Transformierbarkeit und macht das

Phänomen zu einem biologisch und medizinisch relevanten Thema.

6. SUMMARY

- 91 -

6. Summary

Florian Bredenbruch „The influence of Pseudomonas Quinolon Signal to interbacterial communication of

Pseudomonas. aeruginosa”

Virulence factor production and the development of biofilms in Pseudomonas aeruginosa

have been shown to be regulated by two hierarchically organised quorum sensing (QS)

systems via small acyl-homoserine lactone (AHL) signal molecules. Recently, a third

bacterial signal molecule, the Pseudomonas quinolone signal (PQS), has been identified,

which positively regulates a subset of genes dependent on the QS systems.

In this study we have unraveled the biosynthetic pathway of HAQs by analysing extracted

HAQs by GC/MS and NMR spectroscopy in feeding experiments with isotope labeled

precursors. Moreover, we evaluated the impact of PQS on the QS circuitry using

transcriptome analysis of PAO1 cultures supplemented with PQS. The global

transcriptional profile in response to PQS revealed a marked up-regulation of genes

belonging to the tightly interdependent functional groups of iron acquisition and oxidative

stress response. Remarkably, not only most of the differentially regulated genes but also

the induction of a lacZ transcriptional fusion of rhlR could be traced back to a powerful

iron chelating effect of PQS. Nevertheless, although iron deficiency per se induced rhlR,

there are PQS specific effects that are independent of the PQS effect on P. aeruginosa iron

homeostasis. Moreover we could show that PQS seems to be capable of attacking

neighbouring P. aeruginosa cells by directly targeting bacterial DNA. As a result large

amounts of extracellular DNA accumulate in biofilm cultures and obviously serve as a

genetic pool for horizontal gene transfer. This way the self-sacrificing of parts of the

population promotes genetic variability of survivors providing the bacterial population

with an evolutionary advantage under changing environmental conditions and

compensating for the otherwise clonal mode of prokaryotic life where genetic innovation

cannot be archived by sexual reproduction. From an evolutionary perspective this finding

6. SUMMARY

- 92 -

adds a new dimension to natural genetic transformation and makes this phenomenon a

biological and medical significant event.

LITERATURVERZEICHNIS

- 93 -

Literaturverzeichnis

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ANHANG

- 105 -

Anhang

Sequenzen der Transposonmutanten

M1:

CTTTGGCGCCGATGAGCCTGCGTGCGGCCGCCGGACGCCCTTTGCTCGACGAT

TTCTCGCTGGACGCGCTGGTCGGTCCTGCGGACCTCGATTGGAGTGCCTTCCAT

CGCCAGGACCCGGCGGCAGCCTGTTTCCTGCAATACACCTCGGGTTCCACCGG

GGCGCCCAAGGGGGTGATGCACAGCCTGCGCAACACGCTCGGTTTCTGCCGGG

CGTTCGCTACGGAGTTGCTGGCATTGCAGGCGGGAGACCGGCTGTATTCGATT

CCCAAGATGTTCTTCGGCTATGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGA

ATTTCGAGCAGAAAGTNNNATAGAGC

M2:

ATGAGCTTCAGGTTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGCGTAAGTCTGGGCCATG

TGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAAGTTGGCTAGTGCG

ATANTCGTGTGACAGNNNNNGNNN

M3:

TCTGAATTCCCGCAGATGATTTCCATCGCCTGGATGGTGGTCAGGCCGCCGATT

TCCGGGGTGCCGGTGCCGGGCGCCCAGGCCGGGTCGATGCCGTCGATGTCGAA

GCTCAGGTAGACGGGGCCGCCGCCGACCTTCTCGCGGACCTCGGCCATCAGCG

GCTCCAGCGACTTGTGCCAGCACTCCTCGGCCTGCACCACGCGGAAGCCCTGC

TTGCGGCTCCAGTTGAAGTCCTCGGCGGTGTAGCCCTGGGCGCGCAGGCCGAT

CTGCACAACACGGTCGCAATCCAGCAGGTCTTCTTCCACCGCGCGGCGGAAGG

TGGTGCCGTGGGCGATCTTCTCGCCGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAC

TTGAATTCC

ANHANG

- 106 -

M4:

AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTATAAGACACAGGTTCCGCGCCGTGCAGAATT

CCTGGCGTCCGGACGACTGGCAGGAAGACGGCGGCTGGCTGCGCATGTGTCCC

CGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAAGCNGNNNCGN

M5:

GTATAATACACAGGACTGGCCTGGGCGAACATCATCAGCTCGACGTCGTGCGG

GTTGCGCCCCAGTTCACCGAAGCTCTTCAGCAGGTAGTCGATCTCGTCCTCGGC

CAGGGCCAGGCCCAACTCGACGTTGGCCTTCTCCAGCGCGGCGCGACCGCCGC

CAAGCACGTCGACGGCGGTGAGCGGGCGGGGCTGCGCATGTGTCCCCGTACAT

CGTTAGAAGTNNNATTTCGAGCANNNN

M6:

ACGAGCTTCGTGATTGAGATGCGTATAAGAGACAGGCTCAACAGCTCCCTGGC

CTGCGGACGCAGCGAGGCATAGATGGCCGGCACCCCAAACAGGACCCGGGGG

CGGAAGGCGACCAGGTTCTCCAGAACCCGCTCCGGGCTCGGCCAGGTATCGTC

GAGCAGCGCCGAGGCTCCGCTGAACCAGGGAAAGAACAGGCTGTTGCCCATG

TGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGANAATTCGAGCAGANANNNNNNNN

M7:

AAGAGCTTAGGATTGAGATGTGTATAAGAGACAGGAGCTCTACGGTATGCACG

CCGGGGATGCCGAAGACGGTCTCGACGCCCCAGGCTTCGAGTTGCTTGACGAG

GAATTCGCCGCAGGTGGTCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTC

GAGCAGANNNNGNNNNNGNGN

M8:

GTATAAGAGACAGCCACCGAGGGCCGGCAGTCCATCGCTGACTCCTACTCCAT

TCGTCGAAACGCCCTGCAGCACAAGATCTGCTGCACCACCACCATTGCGGGTG

GGCAGGCGATCTGTGAGGCGCTCAAGTTCGGTCCCGAGAAGACCGTTCGGCGT

CTGCAGGATCTCCACGCAGGAATCAAGGCATGTGTCCCCGTA

ANHANG

- 107 -

M9:

CCACTTCATCTCGCTCGAGGGATTGCCCCGCGAGCTGCTCACCGAAATCCTCG

ATACCGCCGACTCCTTCCTGGAAGTCGGCGCCCGCGCGGTGAAAAAGGTCCCG

CTGCTGCGCGGCAAGACCGTCTGCAACGTGTTCTTCGAGAACTCCACGCGCAC

CCGCACCACCTTCGAGCTGGCCGCCCAGCGGCTGTCGGCCGACGTGATCAGCC

TGAACGTATCCACCTCTTCCACCAGCAAGGGCGAGACGCTCACCGACACCCTG

CGCAACCTGGAGGCGATGGCCGCCGACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGC

TTGAATTCCGAGCANN

M10:

ATACTTCGGATTGAGATGTGTATAAGAGACAGGTCCAACGCCCTGCCGTGAAC

TGATCAACGACGGCGGCCGCGGCAGTCGCTTCGAGCTGCGCGCGGTGCCCAAC

GACGAGCCGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTCGAATTCGAGCAGA

AAGTTGGCTAGTGCGTAGTCGTTGACAAANNNNNNNCNNGN

M11:

CTAGCTTCGGTTTGAGAGTGTATAGAGACAGGTGCTGAGCAGCCGCGACGGCC

GGGTCACCATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAA

AGTTGGCTAGTGCGTAGTCGTTGGCAANNNNNNN

M12:

NACGAGCTTCAGGATTGAGATGCGTATAAGAGACAGGGTCTACATCCCGATGT

TCGACATCACCCACGGCGTAGCGCGAGAAGGTCGACCCGCTCTACGCCTGGCG

CCCGACGAGCACTTACATCCGCCGCCCGCCGTACTGGGAAGGCGCCCTCGCCG

GCGAACGCACCCTGCGCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATT

CGAGCAGAAAGNTGGNTAGTGCGTANNTCGTTGGAAAN

ANHANG

- 108 -

M13:

ATGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGCTTCCAGGTTGACCAGGT

GGCGGGCGATGCCGAATTCGTCGGAGATGCCGTTGCCGCCCAGCATGTGTCCC

CGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGANNNNNNNNTNNN

M14:

NTGAGCTTCCGGTTCGAGCTGCGTATAAGAGACAGAGCTTGTCCTGGGCGACT

GCTGGGCGCTGTCGCGCACCATGTAGTCCCCGTACATCGTTAGCAGCTTGAATT

CGAGCAGAAAGTTGGCTAGTGCGATACTCTTTGAGCAANNNNN

M15:

M16:

AGAGCTTCCAGCTGAATATGTTAAGACACAGCCTCCCTGCACAGATCGCGAGC

CTGGCCAATTACCGGCAGATCAGCCTCGGCAGCCGCTCCGGGCAGCATTCGAA

CCTGCTGCGGCCGGTCAGCGACAAGGTGCTCTTCGTGGAAAACTTCGACGACA

TGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTCGAGCAGAANNNN

M17:

CGAGCTTCCGCTTGAATAGGTTATAGACACGTTCATGCCCTTGTACGCCGGGCC

GAACAGGACGTCTAAGTCGATTCCGCTGTCGATCACCGCCTCGGCGTAGAAGC

GTCCCAGGCGGGCCAGCGCCAGGCCGCTGTCGAACAGGCCGGCATTGAAGAA

ATAGGGGCTGGTGCGCCCGGACTTGAGGGTGAACTCACCGAAGCGCAGAACC

CCGCGCTCGATGGCGAAACGAATGAAATCGCGCTGATACGCCTGCATGTGTCC

CCGTACATCGTTAGAAGCTGNNATTTCGAGCAGAANNNNNNNNNNN

M18:

CGAGCTCGAGTTGAATGTGTATAGAGACCGTCAGACGACAGCGGCGCAGATCT

CTTCGAACTCTTCACGGTTGTAGGCGATACCGCCGCCGGTGCCGCCCATGTGTC

ANHANG

- 109 -

CCCGTACATCGTTAGAGCTTGNAATTCGAGCAGAANNNNNNNNNNNNNNNNG

NNNNNNGNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNGNNNNNNGNN

NNAGNNNNGNGNNNNNGNNGNGNNGGNNGNGGNNGAANGGGGGNNGGNNG

NNNNNNNGGGNNGNNNNNNNGGGGGGNNGGGGGNGGNGGNNGGNGGNGNG

G

M19:

CGACTCCGCTTGTGATGGTATAGAGATGCGATGTCGATTCGATGTCTGCCAGTC

TCGCGCTCATGTGTGCCGTACATCGTTAGAGCTTGAATTCGAGCAGAAANNNN

NNNNNNNNNNNNN

M20:

CGGATCTGATGGCAGTACCGGACTGGTGCCGATGATCGGCACGCCGGCCTCTT

CGAGGGCGCGGCAGAGCTTCAGCGGGGTCTGGCCGCCGTACTGGACGATCAC

GCCCTTGGGCTGCTCGACGCGGACGATCTCAAGGACGTCCTCGAGGGTCACCG

GCTCGAAGTACAGGCGGTCGGAGGTGTCATAGTCGGTGGAGACGGTTTCCGGG

TTGCAGTTGACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTTCGAGCAG

NNNNNNNN

M21:

CTGACCTTCCGTTTGAATAGGTATAAGACACAGTGCCTGGACAAGGTGCTACG

CCGACGCCAGCTACGTCATCCGTCAACGTCAGCTCGCCGAACACGCCCGGCCT

GCGCAGCCTGCAGTTCGGCGATTCGCTCAAGCAACTGCTGGAGGCACTGCGCC

AGCGCCAGGAAGCGCTGGCGCTGCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGC

TGAAATTCGAGCAGAANN

M22:

AAGACTTCGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATGCCGAAGGGCGCAGAGG

AAGGCATCATCAAGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGACTTTGAATTCGAG

CAGAACCCAAGGTCC

ANHANG

- 110 -

M23:

CCATAGAACCTTCATCCATGCGGATCAGCTCGAACACTTCCTCGACGCTCTTGC

CGGCGCGGAAGGCGTCGGCGACGTACCAGACACGCTCGGCGCTGGGCACGGT

CAGCTCGCGCTTGAGGATGCTGTCGGCCTCCGGGTCGTTCAGGTCGAGCTTCG

GATCGAAGCCGGTGGCGCCGACTTCCAGGCCGCGCAAGGCTTTCTGCACCGAC

TCCTGGAAGGTCCGGCCGATGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTGAA

NNNTCCGAGCANNNNN

M24:

M25:

GAAGTTGCAACAGACAGGCTGATCACGTCGGCCGACAGCCGCTGGGCGGCCA

GCTCGAAGGTGGTGCGGGTGCGCGTGGAGTTCTCGAAGAACACGTTGCAGACG

GTCTTGCCGCGCAGCAGCGGGACCTTTTTCACCGCGCGGGCGCCGACTTCCAG

GAAGGAGTCGGCGGTATCGAGGATTTCGGTGAGCAGCTCGCGGGGCAATCCGT

CGAGCGAGATGAAGTGGCGCAGCTGGCCCTGGTCGTTGAGCTGCAGCGGGCGC

TTGGCGTCTGTCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTTCGAGC

AGNNNNNNNN

M26:

AAGAGCTTCGGGTTGAGATGGTATAAGAGAAGTCGGCGCCCAGGGCTGCAAG

GCCCTGCGCGAGGAGGGCTACCGCGTCATCCTGGTGAACTCCAACCCCGCGAC

CATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTCGAGCAGAANNNNNNN

NNNNN

ANHANG

- 111 -

Ergebnisse des rhlR-lacZ Promotor Aktivitätstests

Versuch 1

Zeit MPAO -PQS MPAO + PQS MPAO 500µM 2,2- Bispyridyl

h (1/100 min) OD600 OD600 OD600 4,00 0,68 0,65 0,636 7,17 1,47 1,21 1,24 24,25 4,88 3,82 4,3

MPAO -PQS

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,00 4 0,538 0,015 940,717 0,556 0,016 970,5887,17 1 0,421 0,017 2661,565 0,430 0,021 2675,17024,25 0,5 0,602 0,034 4446,721 0,633 0,037 4657,787 MPAO + 40 µM PQS

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,00 4 0,466 0,018 835,577 0,472 0,018 847,1157,17 1 0,403 0,017 3084,711 0,420 0,024 3123,96724,25 0,5 0,632 0,034 5994,764 0,679 0,047 6248,691 MPAO + 500 µM 2,2-BISPYRIDYL

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,00 4 0,662 0,016 1246,069 0,689 0,017 1295,6967,17 1 0,385 0,023 2780,242 0,402 0,022 2931,45224,25 0,5 0,481 0,036 3888,372 0,525 0,043 4183,721

ANHANG

- 112 -

Versuch 2:

Zeit MPAO -PQS MPAO + PQS MPAO 500µM 2,2- Bispyridyl

h (1/100 min) OD600 OD600 OD600 4,08 0,672 0,638 0,638 7,08 1,3 1,24 1,19 24,25 4,06 3,08 4,16

MPAO -PQS

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,08 4 0,477 0,013 844,959 0,506 0,014 895,6477,08 1,5 0,472 0,010 2330,769 0,497 0,015 2414,103

24,25 0,666 0,510 0,018 3539,254 0,521 0,015 3659,448 MPAO + 40 µM PQS

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,08 4 0,455 0,017 833,170 0,475 0,016 875,7847,08 1,5 0,491 0,010 2545,699 0,477 0,014 2432,796

24,25 0,666 0,566 0,017 5228,443 0,578 0,017 5345,443 MPAO + 500 µM 2,2-BISPYRIDYL

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,08 4 0,698 0,017 1309,267 0,722 0,017 1356,2897,08 1,5 0,483 0,012 2588,235 0,500 0,026 2546,218

24,25 0,666 0,465 0,020 3104,066 0,487 0,021 3250,245

ANHANG

- 113 -

Versuch 3 Zeit MPAO -PQS MPAO + PQS MPAO 500µM 2,2- Bispyridyl

h (1/100 min) OD600 OD600 OD600 4,00 0,64 0,612 0,616 7,00 1,32 1,21 1,27 24,25 4,74 3,5 4,28

MPAO -PQS

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,08 4 0,477 0,013 844,959 0,506 0,014 895,6477,08 1,5 0,472 0,010 2330,769 0,497 0,015 2414,103

24,25 0,666 0,510 0,018 3539,254 0,521 0,015 3659,448 MPAO + 40 µM PQS

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,08 4 0,455 0,017 833,170 0,475 0,016 875,7847,08 1,5 0,491 0,010 2545,699 0,477 0,014 2432,796

24,25 0,666 0,566 0,017 5228,443 0,578 0,017 5345,443 MPAO + 500 µM 2,2-BISPYRIDYL

h (1/100 min)

min Inkubation

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

pMALV OD420

pMALV OD550

ResultatU

4,08 4 0,698 0,017 1309,267 0,722 0,017 1356,2897,08 1,5 0,483 0,012 2588,235 0,500 0,026 2546,218

24,25 0,666 0,465 0,020 3104,066 0,487 0,021 3250,245

DANKSAGUNG

- 114 -

Ich möchte mich besonders bei Prof. Dr. D. Bitter-Suermann für die Überlassung des interessanten Themas und die Aufnahme an seinem Institut bedanken. Mein besonderer Dank gilt auch meinem Mentor Prof. Dr. J. Wehland, der es uns ermöglichte, mit der Pseudomonas Arbeitsgruppe in die Zellbiologie der GBF zu wechseln, der das Referat für dieser Dissertation übernahm und mir mit gutem Rat zur Seite stand. Ich möchte mich herzlichst bei meiner Betreuerin Dr. Susanne Häußler bedanken, die immer für mich da war, mich immer zur rechten Zeit zu motivieren verstand und die, im Gegensatz zu mir, nie den Überblick verlor. Vielen Dank für alles! Ich möchte mich weiter bei all den guten Seelen des A-Gebäudes bedanken, die einem das Arbeiten so unendlich viel leichter machen: vielen Dank Brigitte, Hildegard, Marlies, Petra und Frau Thiem, stellvertretend für alle, die ich aus Platzgründen nicht einzeln nennen kann. Vielen Dank an Amanda für ihre unverwechselbare Art und die nie endende Hilfsbereitschaft. Des Weiteren möchte ich allen Mitarbeitern von ZIB danken, die das Arbeiten so angenehm machten. Natürlich möchte ich mich auch ganz herzlich bei meiner Arbeitsgruppe bedanken: vielen Dank Susanne, Caroline, Tanja, Vanessa, Yusuf und Andree für die wunderschöne Zeit im Labor. Eine bessere Arbeitsgruppe gibt es nicht. Dagmar und Verena danke ich für die schöne Zeit in Hannover. Ich danke Dr. Manfred Nimtz für die nicht endende Hilfe in Sachen GC/MS und ESI, Dr. Jan Buer, Dr. Robert Geffers und Tanja Töpfer für die Hilfe bei den Micro-Arrays, Dr. Michael Morr für die Synthese von PQS und HHQ, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre, Dr. Victor Wray für die NMR-Unterstützung und Dr. Joachim Reichelt für das Computermodell. Ich danke meiner Familie und vor allen meinen geliebten Eltern Anita und Ernst Bredenbruch, die mich immer zu 100% unterstützt haben und immer für mich da sind. Vielen Dank. Diese Arbeit ist für Euch. Und ich danke Bianca für ihre Liebe, die Unterstützung und das grenzenlose Verständnis für den „schusseligen Professor“. Vielen Dank für alles!

- 115 -

Lebenslauf

Persönliche Angaben

Name Ernst Florian Bredenbruch

Adresse Friedrich-Ebert-Platz 18, 31226 Peine Geburtstag/-ort 06.07.1976 in Langenhagen

Familenstand ledig

Schulabschluss

06/1995 Allgemeine Hochschulreife, Integrierte Gesamtschule Langenhagen

Wehrdienst

10/1995-07/1996 4./Panzerbataillion 33, Wilhelmstein-Kaserne Neustadt, (Panzerfahrer)

Hochschulausbildung

10/1996-04/2002 Studium der Biologie (Diplom), Universität Hannover

Diplomarbeit „Untersuchungen zur Deacetylierung von Chitin und Chito-Oligomeren durch Gram-positive Bakterien der Gattungen Streptomyces und Promikromonospora“

07/2002-11/2002 Dissertation „Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die interbakterielle Kommunikation von Pseudomonas aeruginosa“ bei Prof. Dr. D. Bitter-Suermann, Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene in der Medizinische Hochschule, Hannover

seit 11/2002 Fortsetzung der Arbeit bei PD Dr. S. Häußler, Nachwuchsforschergruppe „Chronische Pseudomonas Infektionen“, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig

- 116 -

Vorveröffentlichungen

Pubikationen

Bredenbruch,F., Nimtz,M., Wray,V., Morr,M., Muller,R., and Haussler,S. (2005)

Biosynthetic pathway of Pseudomonas aeruginosa 4-hydroxy-2-alkylquinolines J

Bacteriol 187: 3630-3635.

Wehmhoner,D., Haussler,S., Tummler,B., Jansch,L., Bredenbruch,F., Wehland,J.,

and Steinmetz,I. (2003) Inter- and intraclonal diversity of the Pseudomonas aeruginosa

proteome manifests within the secretome J.Bacteriol. 185: 5807-5814.

Tagungsbeiträge

Florian Bredenbruch, Robert Geffers, Manfred Nimtz, Jan Buer and Susanne

Häussler

The Pseudomonas quinolone signal is a powerful iron chelator: link between the iron- and

the quinolone signal-regulons in Pseudomonas aeruginosa (Poster) 2. DGHM-VAAM

Jahrestagung in Göttingen (2005)

Florian Bredenbruch, Manfred Nimtz, Susanne Häußler (2003) Biosynthetic Pathway

of extracellular metabolites (4-hydroxyquinoliens) of Pseudomonas aeruginosa (Poster)

55. DGHM Jahrestagung in Dresden (2003).

Documents

Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die ... fileEinfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die