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Abteilung für Experimentelle Pneumologie
der
Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. Albrecht Bufe
Evaluation eines Pseudomonas aeruginosa Real-Time PCR Assays in vitro
und im Sputum von Patienten mit Mukoviszidose
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Anna-Lena Terzenbach
aus Bochum
2013
Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla
Referent: Prof. Dr. med. A. Bufe
Korreferent: Prof. Dr. med. U. Schauer
Tag der Mündlichen Prüfung: 10. April 2014
Abstract
Terzenbach, Anna-Lena
Evaluation eines Pseudomonas aeruginosa Real-Time PCR Assays in vitro und im Sputum
von Patienten mit Mukoviszidose.
Problem: Die Mukoviszidose ist die häufigste autosomal-rezessive Erbkrankheit der kaukasischen Rasse,
die in vielen Fällen bereits im jungen Erwachsenenalter einen letalen Ausgang nimmt. Der
Krankheitsverlauf sowie die Prognose von Patienten mit Mukoviszidose hängen vor allem von der
Besiedlung und Infektion der Atemwege durch P. aeruginosa ab. Das Bakterium wächst bevorzugt auf
der Schleimhaut der oberen und unteren Atemwege und führt dort zu einer Entzündungsreaktion mit
konsekutiver Zerstörung des respiratorischen Gewebes. Daher werden sensitive Verfahren zum
frühzeitigen Nachweis von P. aeruginosa benötigt.
Methode: Es wurde ein Fluoreszenz-basierter, quantitativer PCR Assay (qPCR) zum Nachweis von P.
aeruginosa etabliert. Dabei wurde das hoch spezifische ecfX Gen als einziges Target gewählt. Die
Spezifität wurde anhand nah verwandter Keime mit großer genomischer Sequenzhomologie ermittelt. Zur
Bestimmung der Sensitivität des PCR Assays wurde die konventionelle Methode der mikrobiologischen
Kultur mit der qPCR verglichen. Dabei sind in vitro Monokulturen des Bakteriums und in vivo 91
Sputumproben von 31 Patienten mit Mukoviszidose eingesetzt worden.
Ergebnis: Der qPCR Assay wies eine hohe Spezifität für P. aeruginosa auf und anhand von
Monokulturen konnte eine hundertmal höhere Sensitivität gegenüber der konventionellen Methode
aufgezeigt werden. Es ergab sich eine Sensitivität von 100 % sowie eine Spezifität von 79 %, verglichen
mit der konventionellen Kultur als diagnostischem Standard. Die Konzentrationen an P. aeruginosa DNS,
mittels qPCR Assay gemessen, lagen auf einer Standardkurve zwischen 0,001 und 100 ng/µl und wiesen
damit eine sehr niedrige Detektionsschwelle auf. In den Patientenproben konnte eine Konzentration von
P. aeruginosa spezifischer DNS von 0,0004 bis 68,19 ng/µl Sputum (Mittelwert = 6,54 ± 12,68 ng/µl)
nachgewiesen werden. Die Konzentration an humaner genomischer DNS lag zwischen 22,1 und 3204,3
ng/µl Sputum (Mittelwert = 819,0 ± 712,4 ng/µl). In den Sputumproben korrelierte die bakterielle
Belastung positiv mit der Menge an genomischer DNS (r = 0,248, p = 0,018).
Diskussion: Der TaqMan basierte qPCR Assay kann bei Patienten mit Mukoviszidose ein Verfahren zum
frühzeitigeren Nachweis einer bakteriellen Besiedelung mit P. aeruginosa in klinischen Sputumproben
darstellen. Somit könnte eine unmittelbare Intervention bei beginnender P. aeruginosa Infektion im
Rahmen des Therapiemanagements bei Mukoviszidose Patienten ermöglicht werden. Die Beantwortung
der Frage, inwieweit die frühe Eradikation aufgrund eines P. aeruginosa positivem qPCR Assays einen
prognostischen Vorteil für die Patienten birgt, bleibt zukünftigen Studien vorbehalten.
MEINEN ELTERN
1
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ................................................................................................................. 9
1.1. Mukoviszidose ................................................................................................... 9
1.1.1. Definition und Epidemiologie ................................................................. 9
1.1.2. Genetik und Pathophysiologie ................................................................ 9
1.1.3. Klinisches Krankheitsbild ..................................................................... 11
1.1.3.1. Pulmonale Manifestation ................................................................... 11
1.1.3.2. Pulmonales Erregerspektrum ............................................................. 14
1.1.4. Diagnostik ............................................................................................. 16
1.1.5. Therapie ................................................................................................. 17
1.2. Bakterieller Nachweis von Pseudomonas aeruginosa bei CF-Patienten ......... 18
1.2.1. Definition und Epidemiologie ............................................................... 18
1.2.2. Pathogenität ........................................................................................... 19
1.2.3. Genotypische und phänotypische Aspekte ............................................ 20
1.2.4. Initiale und persistierende Infektionen bei Patienten mit
Mukoviszidose ...................................................................................... 22
1.2.5. Mikrobiologischer Nachweis von Pseudomonas aeruginosa ............... 23
1.2.6. Molekularbiologischer Nachweis von Pseudomonas aeruginosa ........ 23
1.3. Quantitative Real-Time PCR ........................................................................... 24
2. Zielsetzung der Arbeit .......................................................................................... 26
3. Methodik ................................................................................................................ 27
3.1. Material ............................................................................................................ 27
3.1.1. Chemikalien und Reagenzien ................................................................ 27
3.1.2. Verbrauchsmaterial ............................................................................... 27
3.1.3. Geräte .................................................................................................... 28
3.1.4. Kulturmedien ......................................................................................... 28
3.1.5. Puffer und Lösungen ............................................................................. 29
3.1.6. Kits ........................................................................................................ 30
3.1.7. Bakterienstämme und DNS Präparationen ............................................ 30
3.1.8. Primer und Sonden ................................................................................ 31
3.1.9. Software ................................................................................................ 31
3.2. Methoden.......................................................................................................... 32
2
3.2.1. Patientenkollektiv und respiratorische Proben ...................................... 32
3.2.2. Mikrobiologische Quantifikation von P. aeruginosa im
Patientensputum .................................................................................... 34
3.2.3. DNS-Extraktion aus klinischen Sputumproben .................................... 34
3.2.4. Bakterienstämme und eingesetzte DNS ................................................ 35
3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese von DNS ................................................... 36
3.2.6. Primer und Sonden für die P. aeruginosa und humanes IFN-α8
spezifischen quantitativen Real-Time PCR-Assays .............................. 36
3.2.7. Quantitative Real-Time PCR ................................................................ 38
3.2.8. Kommerzielles Kit für P. aeruginosa Real-Time PCR ........................ 39
3.2.9. In vitro Vergleich des Real-Time PCR-Assays mit dem kulturellen
Nachweis von P. aeruginosa aus bakteriellen Monokulturen .............. 39
3.2.10. Statistische Analyse .............................................................................. 40
4. Ergebnisse .............................................................................................................. 41
4.1. Bakterielle Referenz-DNS zur Etablierung der P. aeruginosa spezifischen
Real-Time PCR ................................................................................................ 41
4.2. Evaluation des quantitativen Real-Time PCR (qPCR) Assays ........................ 42
4.3. Kommerzieller PCR Assay .............................................................................. 45
4.4. Vergleich des qPCR Assays mit der konventionellen Kultur in vitro ............. 46
4.5. Konzentration an humaner genomischer DNS in den Sputumproben ............. 48
4.6. Vergleich des qPCR Assays mit der konventionellen Kultur anhand von
Sputumproben von CF-Patienten ..................................................................... 50
4.7. Bezug der Ergebnisse des qPCR Assays und der konventionellen Kultur
auf die erhobenen klinischen Daten ................................................................. 54
5. Diskussion .............................................................................................................. 59
5.1. Molekulare Nachweisverfahren von P. aeruginosa in Bezug zum neuen
etablierten qPCR Assay .................................................................................... 59
5.2. Vorteile und Nachteile im Nachweis von P. aeruginosa mittels PCR
gegenüber der konventionellen Kultur ............................................................. 63
5.3. Spezifität und Sensitivität des etablierten qPCR Assays ................................. 63
5.4. Sputum als geeignetes Probenmaterial ............................................................. 65
5.5. Detektion beginnender Infektionen .................................................................. 66
3
5.6. Korrelation der bakteriellen Belastung in Sputumproben mit dem Alter
und der Lungenfunktion der Patienten ............................................................. 66
5.7. Gehalt an humaner DNS im Sputum als Marker für Inflammation ................. 68
5.8. Therapeutischer Nutzen ................................................................................... 69
6. Zusammenfassung ................................................................................................ 71
7. Literaturverzeichnis ............................................................................................. 72
8. Anhang ................................................................................................................... 87
4
Verzeichnis der Abkürzungen
ADP Adenosindiphosphat
AES-1 Australien Epidemic Strain 1
Aqua bidest. Aqua bidestillata
Aqua dest. Aqua destillata
ATCC American Type Culture Collection
ATS American Thoracic Society
BAL Bronchoalveoläre Lavage
B. cepacia Burkholderia cepacia
bp Basenpaare
CA California
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
CBAV kongenitale bilaterale Abwesenheit des Vas deferens
CF Cystische Fibrose
CrP C-reaktives Protein
Ct Cycle threshold
DNS Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
ECF extracytoplasmatic function
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ENaC epithelialer Natriumkanal
FEV1 forciertes expiratorisches Volumen nach einer Sekunde
(Einsekundenkapazität)
FVC forcierte Vitalkapazität
g Erdbeschleunigung
gDNS genomische DNS
HCO3-
Hydrogenkarbonat
IFN-α Interferon alpha
IL Illinois
i. v. intravenös
kb Kilobasenpaare
KBE Kolonie bildende Einheiten
5
LB Luria Bertani
log Logarithmus
M Marker
ME Maine
mRNS messenger Ribonukleinsäure
MRSA Methicillin-resistenter Staphylokokkus aureus
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
neg. negativ
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
PBS Phosphate buffered saline
P. chlororaphis Pseudomonas chlororaphis
P. fluorescens Pseudomonas fluorescens
pH Potentia hydrogenii
pos. positiv
P. putida Pseudomonas putida
qPCR quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion
rel. relativ
rpm rounds per minute
Rx Reaktion
S. aureus Staphylokokkus aureus
S. maltophilia Stenotrophomonas maltophilia
TBE Tris-Borat-EDTA
TE Tris-EDTA
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
USA Vereinigte Staaten von Amerika
UV utraviolett
6
Verzeichnis der Gene
algG GDP mannose alginate alpha-L-guluronate Guanosine-5'-triphosphate
mannose
algU sigma factor E
CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
ecfX extracytoplasmic function sigma factor
ETA encoding exotoxin A
fliC filament protein
gyrB gyrase subunit B
IFN-α8 interferon alpha 8
oprI outer membrane lipoprotein I
oprL outer membrane lipoprotein L
mucA algU anti-sigma factor
toxA exotoxin A
16S-23S rDNS ITS 16S-23S ribosomal DNA internal transcribed spacer
16S rRNS 16S ribosomal RNA
7
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Prozentuale Verteilung bakterieller Erreger von Atemwegsinfektionen
bei Patienten mit Mukoviszidose ................................................................ 16
Tabelle 2: Sequenzen verwendeter Primer und Sonden .............................................. 37
Tabelle 3: Berechnung der Effizienz des qPCR Assays anhand des ΔCt-Wertes ....... 43
Tabelle 4: Experiment zur Messung definierter Kopienzahlen ................................... 45
Tabelle 5: Berechnung der Effizienz des kommerziellen PCR Assay anhand der
ΔCt-Werte ................................................................................................... 45
Tabelle 6: Keimzahl der P. aeruginosa Monokulturen ............................................... 47
Tabelle 7: Vergleich von konventioneller Kultur Methode und qPCR Assay
in vitro ......................................................................................................... 47
Tabelle 8: Vierfeldertafel ............................................................................................. 51
Tabelle 9: Nachweis von P. aeruginosa mittels konventioneller Methode und
qPCR Assay über die Zeit ........................................................................... 53
8
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Das CFTR-Gen und sein kodierendes Polypeptid .............................. 10
Abbildung 2: Circulus vitiosus zwischen viskösem Sekret, Sekretretention und
rezidivierenden Infektionen ................................................................ 14
Abbildung 3: Altersspezifische Prävalenz der Erreger von Atemwegsinfektionen
bei Patienten mit Mukoviszidose in den USA im Jahre 2010 ............ 16
Abbildung 4: Drei-Ösen-Ausstrich ........................................................................... 34
Abbildung 5: Nachweis der eingesetzten DNS auf Agarosegel ............................... 41
Abbildung 6: Referenzstandardgerade mit Standardabweichungen des
P. aeruginosa qPCR Assays ............................................................... 43
Abbildung 7: Amplifikationskurven ......................................................................... 44
Abbildung 8: Standardgerade des kommerziellen P. aeruginosa qPCR Assays ...... 46
Abbildung 9: Korellation P. aeruginosa qPCR Assay mit Drei-Ösen-Ausstrichen
in vitro ................................................................................................. 48
Abbildung 10: Referenzstandardgrade mit Standardabweichungen für den IFN-α8
qPCR Assay ........................................................................................ 49
Abbildung 11: Korrelation P. aeruginosa qPCR Assay mit genomischer DNS ........ 50
Abbildung 12: Korrelation P. aeruginosa qPCR Assay mit Drei-Ösen-Ausstrichen
anhand von Sputumproben ................................................................. 54
Abbildung 13: Korrelation Alter der Patienten mit Drei-Ösen-Ausstrichen .............. 55
Abbildung 14: Korrelation Alter der Patienten mit P. aeruginosa qPCR .................. 56
Abbildung 15: Korrelation CrP-Wert mit genomischer DNS ..................................... 56
Abbildung 16: Korrelation Drei-Ösen-Ausstriche mit FVC ....................................... 57
Abbildung 17: Korrelation P. aeruginosa qPCR mit FVC ......................................... 58
9
1. Einleitung
1.1. Mukoviszidose
1.1.1. Definition und Epidemiologie
Die Mukoviszidose (Synonym: zystische Fibrose, englisch: Cystic Fibrosis, CF) ist eine
autosomal-rezessiv vererbte syndromale Erkrankung der exokrinen Drüsen. Sie ist bei
Neugeborenen mit einer Inzidenz von 1:2500 bis 1:3500 die häufigste angeborene
Stoffwechselerkrankung der weißen Bevölkerung und weist in den überwiegenden
Fällen immer noch einen frühletalen Ausgang auf (Gershman et al., 2006). In
Deutschland ist ca. jeder 20. - 30. heterozygot für das aberrante Gen, d. h., er ist ein
gesunder Merkmalträger mit einer CF-Mutation und somit ein potentieller Überträger
(Tümmler und Lindemann, 2004). Während noch vor einigen Jahren die Patienten
gerade das Erwachsenenalter erreichten, ist die Lebenserwartung in Deutschland und
den USA mit einem durchschnittlichen Lebensalter von rund 40 Jahren deutlich
gestiegen (Yankaskas et al., 2004; Stern et al., 2008). Die Erkrankung ist daher längst
nicht mehr die alleinige Domäne der Pädiater (Yankaskas et al., 2004; von der Hardt et
al., 2012). Unter den erwachsenen Patienten überwiegt aus bisher nicht erforschten
Gründen das männliche Geschlecht mit einem Anteil von 53,9 % gegenüber dem
weiblichen mit 46,3 % (Yankaskas et al., 2004).
1.1.2. Genetik und Pathophysiologie
Die Stoffwechselerkrankung wird verursacht durch 2 defekte Allele des Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Gens. 1985 wurde erstmalig die
Position auf dem langen Arm des Chromosoms 7 in der Region 7q31.2 beschrieben
(Wainwright et al., 1985, Tsui et al., 1985). Vier Jahre später gelang die genaue
Lokalisierung des Gens (Riordan et al., 1989). Es weist 27 Exons auf und erstreckt sich
über 250 kb. Im Rahmen der Transkription wird das Gen in 6.5 kb lange mRNS
umgeschrieben (Riordan et al., 1986). Es kodiert für ein 1480 Aminosäuren langes
Glykoprotein, welches als ein cAMP regulierter Chlorid-Kanal fungiert (Gershman et
al., 2006). Zudem wird ihm eine regulierende Funktion über die Aktivität von
epithelialen Natriumkanälen zugeschrieben (Tümmler und Lindemann, 2004).
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Gens und der primären Struktur.
10
Im unteren Teil ist die Zellmembran mit dem reifen, gefalteten und glykosilierten
Protein dargestellt (Tsui and Durie, 1997; Gibson et al., 2003).
Abbildung 1: Das CFTR-Gen und sein kodierendes Polypeptid
Geändert nach: Tsui, L.-C. and Durie, P. (1997). Genotype and Phenotype in Cystic Fibrosis. Hosp Pract
32, 115–134
Heutzutage sind weltweit über 1500 Genmutationen im CFTR-Gen bekannt, die zu
einer verminderten Stabilität des Proteins mit konsekutiv verminderter
Chloridleitfähigkeit bis hin zu einem vollständigen Verlust des Genproduktes führen. In
Deutschland dominiert mit einem Anteil von > 70 % die Mutation delta-F-508 (World
Health Organization, 2004). Diese Mutation wird hervorgerufen durch den Verlust von
drei Basenpaaren, der zu einer Deletion der Aminosäure Phenylalanin an der Position
508 führt. Als Folge liegt eine Proteinreifungsstörung vor. Das Protein wird missgefaltet
und unvollständig glykosiliert, so dass es im endoplasmatischen Retikulum
zurückgehalten und schließlich im Proteasom abgebaut wird. Der Chlorid-Kanal wird
folglich exprimiert; jedoch kommt es zu keinem Einbau in die Zellmembran (Gibson et
al., 2003; Ward et al., 1995).
Ein defekter Kanal, bzw. ein Fehlen des Kanals, der normalerweise apikal in vielen
epithelialen Zellen, einschließlich der Schweißdrüsen sowie der Atemwege exprimiert
wird, führt zu einer epithelialen Transportstörung von Chlorid und anderen Elektrolyten
über die Zellmembran (Stern, 1997). Diese Regulationsstörung verursacht eine
11
pathologische Elektrolytzusammensetzung der Sekrete vieler exokriner Drüsen und
Organe. Es resultiert ein zäher und hyperviskoser Schleim, der zu einer Sekretretention
führt und Drüsenausführungsgänge obstruiert (Gershman et al., 2006).
1.1.3. Klinisches Krankheitsbild
Die Mukoviszidose stellt eine komplexe Multiorganerkrankung dar und manifestiert
sich klinisch in einer Kombination von Symptomen aus dem Respirations-,
Gastrointestinal- und Reproduktionstrakt. Nur Homozygote und Compound-
Heterozygote erkranken, wobei die klinische Symptomatik stark variiert.
Eine exokrine Pankreasinsuffizienz mit Malabsorption von Fetten und Proteinen liegt
bei 90 % der CF Patienten vor. Sie tritt in Folge einer verminderten Sekretion von
HCO3-
und pankreatischen Enzymen auf, wobei die Retention der Enzyme zu einer
Selbstandauung (Autodigestion) des Pankreas mit einer Fibrosierung des Gewebes
führt. Die Erkrankten leiden an einer Steatorrhoe, Mangelernährung und rezidivierenden
abdominalen Schmerzen (Gershman et al., 2006). Bis zu 20 % der betroffenen
Neugeborenen werden mit einer intestinalen Obstruktion geboren und fallen in den
ersten Lebenstagen mit einem Mekoniumileus auf (World Health Organization, 2004).
Des Weiteren liegt eine Beteiligung der Lunge vor, die sich an quälendem Husten und
zunehmender Dyspnoe zeigt. Aufgrund einer Retention von zähem Schleim und der
unzureichenden Selbstreinigungsfunktion der Alveolen durch die Zilien (mukoziliäre
Clearance) kommt es zu rezidivierenden, bakteriellen Infektionen und konsekutiver
endogener Entzündung, die im Verlauf zu Bronchiektasien bis hin zu einer
Lungeninsuffizienz führen (siehe 1.1.3.1.) (Griese et al., 2004).
Das männliche Geschlecht weist in 95 % der Fälle eine Infertilität aufgrund einer
kongenitalen bilateralen Abwesenheit des Vas deferens (CBAV) auf.
1.1.3.1. Pulmonale Manifestation
Auch heute stellt die chronische obstruktive Lungenerkrankung, die charakterisiert ist
durch eine chronische Infektion und eine exzessive Inflammation, den häufigsten
Lebenszeit limitierenden Faktor bei Patienten mit Mukoviszidose dar (Chmiel and
Davis, 2007; Goss and Burns, 2007; Hoiby et al., 2010).
Histologische Studien haben gezeigt, dass die Lunge von Neugeborenen mit
Mukoviszidose postnatal im Vergleich zu einem Kontrollkollektiv bis auf eine
Dilatation der Azini submuköser Drüsen keine Anomalien aufweist (Sturgess and Imrie,
12
1982). Zunächst zeigt sich eine Beteiligung der Atemwege und submukösen Drüsen, die
eine hohe Expression von CFTR aufweisen. Erst im späteren Verlauf sind aufgrund von
Infektionen, die mit einer intensiven neutrophilen Reaktion einhergehen (s. u.), das
Interstitium sowie die alveolären Zwischenräume beteiligt (Engelhardt et al., 1992). In
einer retrospektiven Autopsiestudie zeigten sich v. a. entzündliche Veränderungen in
den Alveolarwänden und eine Umorganisation der Alveolen mit Granulationsgewebe
(Engelhardt et al., 1992; Tomashefski et al., 1989). Aufgrund dieser Beobachtungen
besteht die Erwartung, dass eine frühe postnatale aggressive Therapie der pulmonalen
Manifestation der konsekutiven Morbidität und Mortalität vorbeugen kann (Davis,
2006).
Noch immer ist es ein Thema der aktuellen Forschung, wie Mutationen im CF-Gen zur
Erkrankung der Atemwege führen. Dabei stehen die Veränderungen des
transepithelialen Ionenflusses sowie die abnorme Menge des Oberflächenfilmes
(englisch: airway surface liquide, ASL) im Vordergrund (Gibson et al., 2003). In der
gesunden Lunge besteht dieser Film, der sich auf dem Epithel der Atemwege bildet, aus
zwei Schichten. Die erste stellt eine Flüssigkeitsschicht im Bereich der Zilien dar, die
eine niedrige Viskosität für einen suffizienten Zilienschlag aufweist (Matsui et al.,
1998; Matsui et al., 2000). Die zweite bildet sich oberhalb der Zilien und besteht aus
Schleim, der Partikel bindet und zur Clearance beiträgt (Knowles and Boucher, 2002).
Der vielversprechende Ansatz die abnormen Verhältnisse in den Atemwegen der CF-
Lunge zu erklären, ist die auf in vitro Experimenten basierende „Hypothese des
geringen Volumens“ (Goss, 2007). Mall und seine Mitarbeiter zeigten 2004, dass das
CFTR-Protein ebenfalls eine Rolle als Regulator epithelialer Natriumkanäle (ENaC)
spielt (Mall et al., 2004). Diese Kanäle resorbieren in normaler Funktion Natrium und
Flüssigkeit vom Atemwegsepithel auf die Blutseite, so dass es bei defekten Kanälen zu
einer Dehydratation an der Oberfläche der Atemwege kommt. Demnach wird postuliert,
dass ein aberranter CFTR-Kanal zu einer verringerten Chloridsekretion, wie auch zu
einer ENaC-vermittelten Flüssigkeitsresorption führt, die ein vermindertes Volumen des
periziliären Flüssigkeitsfilmes hervorrufen, was mit einem Kollaps der Zilien
einhergeht. Dieser Mechanismus bewirkt eine Abschwächung der mukoziliären
Clearance, welcher eine signifikante Rolle in der Pathogenese der Lungenerkrankung
bei CF Patienten beigemessen wird (Mall et al., 2004).
13
Eine chronische Atemwegsobstruktion stellt einen Nährboden für Infektionen dar, die
eine ausgeprägte neutrophilengesteuerte peri- und endobrochiale Entzündungsreaktion
nach sich ziehen (Khan et al., 1995; Griese et al., 2004). Dabei ist v. a. die Produktion
von Elastase aus neutrophilen Granulozyten zu erwähnen, die zu einer Zerstörung von
Strukturproteinen der Bronchialwand führt. Interessanterweise konnte in mehreren
Studien gezeigt werden, dass eine Inflammation der Atemwege sowohl bei CF-
Patienten mit positiver wie auch negativer pulmonaler bakterieller Besiedelung
nachzuweisen war (Gibson et al., 2003). Rezidivierende bzw. persistierende Infektionen
führen zu einer fortschreitenden Destruktion der bronchialen Schleimhaut, die
Bronchiektasien begünstigt. Diese gehen mit einem konsekutiven Stabilitätsverlust der
Bronchialwände einher und erhöhen das Risiko eines Kollapses der Bronchialwände,
der wiederum einen Sekretstau fördert (Gershman et al., 2006). Durch einen Zerfall der
Neutrophilen werden große Mengen an DNS freigesetzt, die wiederum zu einer
Zunahme der Viskosität endobronchialer Sekretionen führen (Shak et al., 1990). Es
bildet sich, wie von Griese und Mitarbeitern beschrieben, ein Circulus vitiosus mit
viskösem Sekret, Sekretretention und rezidivierenden respiratorischen Infektionen
(siehe Abbildung 2, geändert nach Griese et al., 2004). Eine zunehmende respiratorische
Insuffizienz ist im Verlauf die weitere und zumeist Lebenszeit limitierende Folge.
Vereinzelt tritt eine pulmonale Hypertonie hinzu (Gibson et al., 2003).
14
Abbildung 2: Circulus vitiosus zwischen viskösem Sekret, Sekretretention und rezidivierenden
Infektionen
Geändert nach: Griese, M., Hüls, G., Lindemann, H. (2004). Atemwege und Lunge.
in Lindemann, H., Tümmler, B., Dockter, G. (Hrsg.). Mukoviszidose - Zystische Fibrose. 4. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart New York, 35
Mit zunehmendem Lebensalter zeigt sich eine chronische Progression der
Lungenerkrankung mit so genannten intermittierenden, akuten Exazerbationen. Diese
präsentieren sich klinisch in verstärktem Husten, erhöhter Sputumproduktion sowie
Kurzatmigkeit und erfordern therapeutische Interventionen (Flume et al., 2009). Bis
heute existiert kein Konsens zur Klassifizierung pulmonaler Exazerbationen in
Stärkegrade bei CF-Patienten (Goss and Burns, 2007).
In der Routinediagnostik dominiert die mikrobiologische Untersuchung von
Rachenabstrichen und Sputum. Dabei hat sich gezeigt, dass induziertes Sputum, auch
wenn es im klinischen Alltag zeitaufwendiger ist und höhere diagnostische Kosten
verursacht, sensitiver mikrobiologische CF-Pathogene der unteren Atemwege nachweist
(Al Saleh et al., 2010).
1.1.3.2. Pulmonales Erregerspektrum
“Understanding the genetic defect underlying cystic fibrosis is only half the battle.
Identifying the specific bacterium infecting CF-patients is just as important.“
(Hearst and Elliot, 1995)
15
Die CF-Lunge weist, geprägt durch die veränderte Zusammensetzung der Sekrete, die
mit dem Defekt im CFTR-Gen einhergehen und des bereits vulnerablen Lungengewebes
aufgrund vorhergegangener Infektionen, einen speziellen Lebensraum für potentielle
Pathogene auf (Govan and Deretic, 1996). Interessanterweise ist das Erregerspektrum
bei CF-Patienten altersspezifisch und insgesamt auf wenige Keime begrenzt.
Virale Infektionen der oberen und unteren Atemwege finden sich bei CF-Kindern wie
bei gesunden Kindern auch und unterscheiden sich nicht in der Häufigkeit, jedoch in
ihrer stärker ausgeprägten klinischen Symptomatik, wie z. B. im Kontext einer RSV
Infektion (Davis, 2006). Die Effizienz und Sicherheit einer Chemoprophylaxe mit
Pavalizumab bei Kindern mit CF wird diskutiert (Robinson et al., 2010).
Bronchopulmonale Infektionen der Atemwege bei CF-Patienten sind zudem häufig
polybakteriell bedingt und manifestieren sich bereits in jungen Jahren (Goss and Burns,
2007; Zermanik et al., 2010). Zu denen am häufigsten nachgewiesenen bakteriellen
Organismen bronchopulmonaler Infektionen bei CF-Patienten zählen Staphylococcus
aureus und Haemophilus influenzae, seltener auch Burkholderia cepacia (Dinwiddie,
2000; Kolak et al., 2003; Zermanik et al., 2010). Die bakterielle Kolonisation mit
Pseudomonas aeruginosa (siehe 1.2) wird erst im zeitlichen Verlauf der
Lungenkrankheit beschrieben und ist bei Weitem das signifikanteste Pathogen (Goss
and Burns, 2007; Dinwiddie, 2000; Fick, 1989). Sie hat mit zunehmendem Lebensalter
eine hohe Prävalenz, wird im Laufe der Zeit persistent und ist mit einer höheren
Mortalität bei CF-Patienten verbunden (Fick, 1989; Pitt, 1986; Hull et al., 1997).
Infektionen mit Stenotrophomonas maltophilia stellen ebenfalls einen Risikofaktor
schwerer pulmonaler Exazerbationen dar, wobei eine chronische Infektion mit einem
dreifach höheren Risiko für die Notwendigkeit einer Lungentransplantation und
letztendlich dem Tod einhergeht (Waters et al., 2013).
Weitere gram-negative Nonfermenter wie Achromobacter xylosoxidans, Ralstonia
pickettii und andere Pseudomonaden wie P. putida werden vereinzelt in respiratorischen
Sekreten von CF-Patienten nachgewiesen, wobei ihre pathogene Relevanz noch nicht
abschließend geklärt ist (Wellinghausen et al., 2007; Coenye et al., 2002). Abbildung 3
und Tabelle 1 zeigen die altersspezifische Prävalenz und die Gesamtprävalenz im Jahr
2010 der Erreger von Atemwegsinfektionen bei Patienten mit Mukoviszidose in den
USA.
16
Abbildung 3: Altersspezifische Prävalenz der Erreger von Atemwegsinfektionen bei Patienten mit
Mukoviszidose in den USA im Jahre 2010 Geändert nach: Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry. (2011). 2010 Annual Report, Bethesda,
Maryland. © 2011 Cystic Fibrosis Foundation, 18
Tabelle 1: Prozentuale Verteilung bakterieller Erreger von Atemwegsinfektionen bei Patienten mit
Mukoviszidose
Aus: Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry. (2011). 2010 Annual Report, Bethesda, Maryland. ©
2011 Cystic Fibrosis Foundation, 18
Anteile der speziellen Keime im Jahre 2010 in den USA
P. aeruginosa 51,2 %
S. aureus 67,0 %
Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA) 25,7 %
H. influenza 17,2 %
S. maltophilia 13,8 %
Multiresistenter P. aeruginosa 8,9 %
Achromobacter xylosoxidans 6.2 %
B. cepacia 2,9 %
1.1.4. Diagnostik
Kinder mit einer Mukoviszidose Erkrankung fallen häufig bereits früh durch eine
Kombination pulmonaler und enteraler (Steatorrhoe und Mekoniumileus) Beschwerden
auf (Gibson et al., 2003). Häufig liegt eine Gedeihstörung vor. Als wichtigster
diagnostischer Test gilt der Schweißtest nach Gibson und Cooke (Lindemann et al.,
2004). In einem durch Pilocarpin-Iontophorese gewonnenen Schweiß wird der Natrium-
und Chloridgehalt bestimmt. Die Produktion von Primärschweiß durch cholinerge
Stimulation unterscheidet sich bei CF-Erkrankten und Gesunden nicht. Jedoch bestehen
entscheidende Unterschiede in der Bildung des Sekundärschweißes. Bei Vorliegen einer
Mutation im CFTR-Gen wird Chlorid nicht zurück resorbiert und auch Natrium kann
Pro
zen
t d
er
Pati
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n
80
60
40
20
0 Alter (Jahre)
< 2 2 – 5 6 – 10 11 – 17 18 – 24 25 – 34 35 – 44 45 +
17
aufgrund des fehlenden Gradienten kaum intrazellulär wieder aufgenommen werden
(Lindemann et al., 2004). Daher besteht eine erhöhte Konzentration von NaCl im
Endschweiß. Pathologisch ist eine Ionenkonzentration > 60 mEq/l. Dabei ist die
Bestimmung der gesonderten Chlorid-Ionen Konzentration am zuverlässigsten, die
jedoch nur in gut der Hälfte aller CF-Zentren in Deutschland zur Verfügung steht
(Lindemann et al., 2004). Eine erhöhte Ionenkonzentration ist nahezu beweisend für das
Vorliegen einer Mukoviszidose. Differenzialdiagnostisch kommen in Einzelfällen z. B.
ein renaler Diabetes insipitus, eine Nebenniereninsuffizienz sowie eine ektodermale
Dysplasie mit Beteiligung der Schweißdrüsen in Betracht (Davis and di Sant'Agnese,
1984).
In den letzten Jahren ist zunehmend die genomische Diagnostik in den Vordergrund
gerückt. Neben der Mutation delta-F-508 werden bis zu 35 - 40 der in Deutschland
häufigsten Mutationen im CFTR-Gen in spezialisierten Zentren bestimmt (Lindemann
et al., 2004).
Weitere hinweisende Tests sind die Bestimmung des Trypsinogens im Blut von
Neugeborenen sowie die Messung der transepithelialen Potenzialdifferenz.
Der 1998 festgelegte Konsensus der Cystic Fibrosis Foundation ist weltweit anerkannt
und legt als Kriterien zur Diagnosestellung a) einen charakteristischen Phänotyp, b) eine
CF bei einem Geschwisterkind oder c) ein positives Neugeborenen-Screening und
zusätzlich das Vorliegen a) eines pathologischen Schweißtests, b) eines genetischen
Nachweises oder c) abnormer Ionentransporte am Nasenepithel fest (Rosenstein and
Cutting, 1998).
In der Bundesrepublik Deutschland ist bis heute keine Screeninguntersuchung etabliert,
die allen Neugeborenen angeboten werden kann. Eine Kostenübernahme wird derzeit
von den Kostenträgern abgelehnt.
1.1.5. Therapie
Eine konsequente symptomatische Therapie ist essentiell, denn auch heute noch sind
keine kausalen Therapieoptionen verfügbar. Die Therapiewahl richtet sich nach dem
Grad der Organbeteiligung.
Viele CF-Patienten sind aufgrund einer Maldigestion mangelernährt, leiden an
Untergewicht und Gedeihstörungen. Deshalb sind eine hochkalorische Kost sowie die
Zufuhr fettlöslicher Vitamine ein essentieller Bestandteil der Therapie. Patienten, die
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eine Pankreasinsuffizienz aufweisen, erhalten zusätzlich eine Substitution
pankreasspezifischer Enzyme.
Zur Verbesserung der mukuziliären Clearance und Elimination des hochviskösen
Schleims hat sich eine regelmäßige und intensive Physiotherapie bewährt.
Medikamentös werden Mukolytika und Bronchodilatatoren eingesetzt. Bakterielle
Infektionen werden antibiotisch nach erregerspezifischem Antibiogramm behandelt.
Dabei erschweren polybakterielle Infektionen und Resistenzen die Wahl des
Antibiotikums. Bei Infektionen mit P. aeruginosa und S. aureus werden am häufigsten
Cephalosporine der 3. Generation, Aminoglykoside oder Carbapeneme in hohen
Dosierungen für eine Dauer von 2 bis 3 Wochen gewählt (Gershman et al., 2006). Die
Applikation bei akuten Exazerbationen erfolgt i. v. um möglichst hohe Wirkspiegel zu
erlangen. Zusätzlich wird bei P. aeruginosa Infektionen inhalatives Tobramycin oder
Colistin verabreicht (Gibson et al., 2003).
Einen bahnbrechenden Erfolg verspricht die Therapie mit CFTR-Potentiatoren. Im Juli
2012 und im März 2013 erfolgte von der europäischen Kommission und in Deutschland
durch den Gemeinsamen Bundesausschuss die Zulassung für Ivacaftor. Dieses neue
Medikament moduliert die Funktion von CFTR mit der Mutation G551D, indem es die
Offenwahrscheinlichkeit des aberranten CFTR-Ionenkanals erhöht (Aaron et al., 2004).
Allerdings weisen schätzungsweise nur 4 % der Patienten in Europa diese Mutation auf
und werden möglicherweise von Ivacaftor profitieren. In zwei Phase-III-Studien konnte
bereits eine Reduktion pulmonaler Exazerbationen nachgewiesen werden.
Medikamente, die auf die Mutation delta-F-508 zielen und somit für den überwiegenden
Teil der CF-Patienten einen Gewinn erbringen könnten, befinden sich in klinischer
Erprobung.
1.2. Bakterieller Nachweis von Pseudomonas aeruginosa bei CF-
Patienten
1.2.1. Definition und Epidemiologie
Die Lunge von CF-Patienten ist besonders anfällig für P. aeruginosa, einem Bakterium,
das erstmalig Ende des neunzehnten Jahrhunderts vom deutschen Professor Walter
Migula aus Karlsruhe beschrieben wurde (Palleroni, 2010). Es ist ein gram-negatives
Stäbchenbakterium mit Haftpili. Da es Glukose nur oxidativ verwerten kann, wird es
zur Gruppe der Nonfermenter gezählt. Das Bakterium ist zum einen gewöhnlich im
19
Wasser und Erdreich zu finden, zum anderen steht es häufig im Zusammenhang
nosokomialer Infektionen. Es stellt im Rahmen der Mukoviszidose den wichtigsten
opportunistischen Keim dar, der zu einer progressiven Zerstörung der Atemwege führt
(Fick, 1989; Pitt, 1986). Dabei ist eine pulmonale Infektion durch P. aeruginosa
klinisch nicht von Infektionen zu unterscheiden, die durch andere gram-negative Keime
verursacht werden; eine Chronifizierung (s. u.) geht jedoch mit einer erhöhten
Morbiditäts- und Mortalitätsrate einher (Jaffe et al., 2001).
Näherungsweise sind 61 % aller Patienten mit Mukoviszidose chronisch mit P.
aeruginosa infiziert. Die Inzidenz nimmt mit dem Lebensalter stetig zu. Während die
Rate an Patienten in den USA unter einem Lebensjahr ca. 21 % beträgt, weisen bei über
26-Jährigen bereits 80 % eine persistierende Infektion auf (FitzSimmons, 1993).
P. aeruginosa verursacht eine chronische und neutrophilengesteuerte, endobronchiale
Infektion. Das Bakterium wächst in Biofilmen, wodurch es die eigene Körperabwehr an
der Phagozytose hemmt sowie einer antibiotischen Therapie sehr schwer zugänglich ist
(Costerton, 2001; Il'ina et al., 2004). Eine manifeste Infektion in der CF-Lunge ist
nahezu nicht mehr zu eradizieren. Studien haben gezeigt, dass nur eine frühe und
aggressive antibiotische Therapie eine chronische Besiedlung verhindern kann und sich
somit positiv auf die Lungenfunktion auswirkt (Davidson et al., 2012; Ferderikson et
al., 1997; Koch, 2002; Lee, 2009; Marchetti et al., 2004). Daher bewegt sich die
derzeitige Therapiestrategie von der supportiven Therapie chronischer Infektionen hin
zu dem Versuch der möglichst frühzeitigen Eradikation; ein allgemeingültiges
Therapieschema hinsichtlich der eingesetzten Medikamente, des Applikationsweges
(i. v., inhalativ oder oral) und der Therapiedauer steht bis heute noch nicht fest
(Schelstraete et al., 2013).
1.2.2. Pathogenität
Das Bakterium produziert zwei verschiedene ADP-Ribosyltransferase Toxine; Exotoxin
A und das Exoenzym S, welche zu signifikanten Schäden am Lungengewebe führen
(Khan and Cerniglia, 1994). Eine Translokation des Exoenzyms S in Epithelzellen
moduliert die Zellfunktion auf unterschiedliche Weise, z. B. durch Veränderungen der
Zellmorphologie sowie des Zellwachstums (Fraylick et al., 2002). Das hoch toxische
Exotoxin A wirkt über eine Inhibierung der eukariotischen Proteinbiosynthese ähnlich
dem Diphtherie Toxin (Woods and Iglewski, 1983).
20
Des Weiteren ruft die endogene Inflammation eine Schädigung des Wirts selbst hervor.
Die inflammatorische Antwort auf eine bronchopulmonale Infektion mit P. aeruginosa
ist im Vergleich zum infektiösen Stimulus unverhältnismäßig stark (Gu et al., 2009;
Muhlebach and Noah, 2002). Karp und seine Mitarbeiter stellten 2004 als mögliche
Ursache fest, dass die Konzentration von Lipoxin, einem anti-inflammatorischen
Lipidmediator, in Sekreten der Atemwege bei CF-Patienten im Vergleich zu Patienten
mit anderen inflammatorischen Lungenerkrankungen deutlich gemindert ist (Karp et al.,
2004). Interessanterweise ruft das Bakterium bei Patienten mit Mukoviszidose
außerhalb des Respirationstraktes keine weiteren häufigen Infektionen oder von der
Lunge ausgehende Bakteriämien hervor (Fick, 1989).
1.2.3. Genotypische und phänotypische Aspekte
Besonders im Mikrobiom der CF-Lunge, das charakterisiert ist durch eine gestörte
mukoziliäre Clearance, eine ineffektive Immunabwehr des Wirtes und dem
Nebeneinander weiterer bakterieller Infektionen, weist P. aeruginosa eine hohe
genotypische und phänotypische Plastizität auf (Oliver et al., 2000). Möglicherweise
besteht aufgrund der Vielzahl von Regulationsgenen im Genom des P. aeruginosa die
große Variabilität dieses Organismus (Lavenir et al., 2007). Einige dieser Gene
kodieren Faktoren der Sigma 70 Familie, welche in die Wiedererkennung des
Promotors sowie den Start der Transkription durch die RNS-Polymerase involviert sind
(Lavenir et al., 2007). Eine Subgruppe stellen die ECF (extracytoplasmatic function)
Sigma Faktoren dar, die die Transkription als Antwort auf extrazytoplasmatische
Stimuli koordinieren (Ishihama, 2000). Lavenir und seine Mitarbeiter beschrieben 2007
das ecfX Gen, welches sie auf Grund von Sequenzvergleichen als hochspezifisch für P.
aeruginosa klassifizierten. Es kodiert einen alternativen (ecf) Sigma Faktor, der
möglicherweise in der Aufnahme von Häm (Bestandteil zahlreicher Enzyme) sowie an
der Virulenz des Organismus beteiligt ist (Lavenir et al., 2007).
Bakterielle CF-Isolate weisen häufig spezielle phänotypische Charakteristika auf, die
eine Identifikation des Organismus über klassische mikrobiologische Methodik
erschweren können. Dazu zählen z. B. die mangelnde Fähigkeit zur Pigmentproduktion
sowie Veränderungen in den Lipopolysacchariden (Anuj et al., 2009; Speert et al.,
1990). Lipopolysaccharide, die in der Außenmembran des Bakteriums enthalten sind,
bestehen beim P. aeruginosa aus drei Domänen: dem Lipid A, dem Kern-
21
Oligosaccharid als Bindeglied sowie dem O-Antigen (Lam et al., 2011; Rocchetta et al.,
1999). Veränderungen, die z. B. mit einem Verlust des O-Antigens einhergehen, sind
nicht mehr serumsensitiv und folglich mit konventionellem Antiserum, das gegen das
O-Antigen gerichtet ist, schwer typisierbar.
Des Weiteren weisen CF-Isolate häufig die Befähigung zur Produktion des
Exopolysaccharides Alginat auf und werden als P. aeruginosa vom mukoiden bzw.
Alginat-positivem Typ bezeichnet (Speert et al., 1990; Qin et al., 2003). Alginat führt
zu einer Verkapselung des Bakteriums, wodurch es der endogenen Immunantwort sowie
einer antibiotischen Therapie schwer zugänglich ist. Diese Form wird in anderen
Lebensräumen außerhalb der CF-Lunge kaum beobachtet und ist mit einer besonders
hohen Mortalität sowie einer Verschlechterung der Lungenfunktion assoziiert (Davies
and Geesey, 1995; Parad et al., 1999). Bei Patienten mit erstmaligem P. aeruginosa
Kontakt sind überwiegend nicht-mukoide Stämme nachzuweisen, im Verlauf verschiebt
sich das Verhältnis zu Gunsten des mukoiden Stammes. In vitro konnte gezeigt werden,
dass die Umwandlung in mukoide Stämme durch Hypoxie sowie Kohlenstoff-,
Phosphat- und Stickstofflimitierung begünstigt wird (Terry et al., 1991; Worlitzsch et
al., 2002). Die Transkription der Gene für die Alginatbiosynthese unterliegt einer
komplexen Kaskade (Hershberger et al., 1995). Das algU hat sich bereits vor längerer
Zeit als ein Schlüsselgen herausgestellt, das für einen alternativen Sigmafaktor (Sigma
E) kodiert (Hershberger et al., 1995; Boucher et al., 1997). Mutationen im algU selbst
oder einem seiner Regulatoren, dem mucA, waren im Mausmodell nachweislich
verantwortlich für die Konversion in den mukoiden Stamm.
Neueste Studien haben gezeigt, dass auch die Invasivität mancher Bakterienstämme in
epitheliales Lungengewebe, wie z. B. des Australien Epidemic Strain 1 (AES-1) im
Laufe der Erkrankungszeit und unabhängig von Virulenzfaktoren signifikant zunimmt.
Die zugrunde liegenden Mechanismen sind derzeit noch nicht bekannt. Der AES-1 ist
ein hochvirulenter und multiresistenter Stamm, dessen klonale Verbreitung ein
zunehmendes Problem im Osten von Australien hervorruft (Harmer et al., 2012;
Williams et al., 2010).
Interessanterweise legen Studien an homozygoten und dizygoten Zwillingen nahe, dass
dem Auftreten sowie dem Zeitpunkt der persistierenden Infektion mit P. aeruginosa bei
Patienten mit Mukoviszidose neben dem CFTR Genotyp und ihrer Umgebung eine
weitere genetische Disposition zugrunde liegt (Green et al., 2012).
22
1.2.4. Initiale und persistierende Infektionen bei Patienten mit
Mukoviszidose
Warum die Atemwege bei Patienten mit Mukoviszidose schwerpunktmäßig durch
bestimmte Pathogene besiedelt werden, v. a. durch P. aeruginosa, ist noch immer
unklar. Es gibt noch keine Erklärung, die die anormale Zusammensetzung des Sputums
bei CF-Patienten mit der Präferenz der einzelnen Pathogene in Verbindung setzt
(Gibson et al., 2003). Jedoch helfen verschiedene Hypothesen, die bereits 2003 von
Gibson et al. zusammengestellt wurden, zu verstehen, welche Veränderungen in der CF-
Lunge die Prädominanz von P. aeruginosa verursachen könnten. Dazu zählt zum einen
eine erhöhte bakterielle Adhärenz an die Epithelzellen. Die Erstinfektion kann durch
eine erhöhte Dichte an epithelialen Rezeptoren für P. aeruginosa bedingt sein (Gibson
et al., 2003). Es konnte gezeigt werden, dass eine Mutation im CFTR-Gen eine
qualitativ und quantitativ veränderte Glykosylierung der Membranproteine im
Atemwegsepithel hervorruft (Saiman and Prince, 1993). Zahlreihe Studien haben
belegt, dass das Asialogangliosid-1, eine Klasse von Glykolipiden, eine apikale
Bindungsdomäne für P. aeruginosa aufweist und in einer erhöhten Anzahl in CF-Zellen
gefunden wird. Zudem wird dieser Rezeptor ebenfalls in regenerativen
Atemwegsepithelien gefunden, welcher in der CF-Lunge aufgrund der chronischen
Inflammation vermehrt vorhanden ist (Gibson et al., 2003; de Bentzmann et al., 1997).
Da das Asialogangliosid-1 nur als Rezeptor für P. aeruginosa Stämme mit Pili und
Flagellen fungiert, ist eine Besiedlung durch mukoide Stämme des Pathogens, die v. a.
in der Spätphase chronischer Infektionen zu finden sind, nicht erklärt (Schroeder et al.,
2001). Dahingegen zeigte Plotkowski mit seinen Mitarbeitern 2001, dass Heparansulfat-
Proteoglykane in epithelialen Zellen des Respirationstraktes als Rezeptor für P.
aeruginosa Stämme dienen können, die keine Fimbrien aufweisen (Plotkowski et al.,
2001).
Das zähe Sekret scheint eine wesentliche Rolle bei den Überlebensstrategien des P.
aeruignosa in der CF-Lunge zu spielen (Cattoir et al., 2012). Cattoir und seine
Mitarbeiter zeigten in vitro, dass im Mukus der CF-Lunge unter anderem eine
gesteigerte Expression von Virulenzfaktoren stattfindet (Cattoir et al., 2012). Im
Mausmodell konnte bestätigt werden, dass es zu einer gesteigerten Produktion des
Proteins T6SS kam, das durch Sekretion von Effektor-Proteinen (TseI, TseII, TseIII),
die zur Hydrolyse von Peptidoglykanen der Zellwand gram-negativer Bakterien führten,
einen absterbenden Mechanismus gegenüber anderen Bakterien induzierte (Cattoir et
23
al., 2012; Russell et al., 2011). Somit wird eine weitere Erklärung für die Prädominanz
des P. aeruginosa in der CF-Lunge geboten.
1.2.5. Mikrobiologischer Nachweis von Pseudomonas aeruginosa
Heutzutage zählt der mikrobiologische Nachweis von P. aeruginosa mittels
konventioneller bakteriologischer Kultur auf selektiven/ nicht-selektiven Kulturmedien
zum Goldstandard der Diagnostik (Xu et al., 2004). Dabei werden die Infektionserreger
auf meist festen Kulturmedien angezüchtet und biochemisch analysiert. Als
respiratorische Proben werden oropharyngeale Abstriche, induziertes Sputum sowie
Sekrete der tiefen Atemwege, gewonnen durch die Bronchoalveoläre Lavage (BAL),
eingesetzt.
Auch wenn die Identifikation von P. aeruginosa normalerweise keine Probleme
bereitet, sind CF-Isolate mit verändertem Phänotyp häufig schwierig nachzuweisen
(Spilker et al., 2004). Koinfektionen mit anderen nah verwandten gram-negativen
Bakterien wie Stenotrophomonas maltophilia und Pseudomonas putida in
respiratorischen Sekreten können zur Missidentifikation von P. aeruginosa führen
(Dinwiddie, 2000). Die starke Viskosität des Sputums bei CF-Patienten erschwert
zusätzlich den mikrobiologischen Nachweis (Goss and Burns, 2007). Nachteilig wirkt
sich ebenfalls die Zeitspanne der Methode von 48 Stunden bis zur Identifikation des
Keims aus (Jaffe et al., 2001). Des Weiteren gilt sie als weniger sensitiv im Vergleich
zu einem möglichen molekularbiologischen Nachweis.
Dennoch ist die konventionelle Kultur in der heutigen Zeit weiterhin essentiell für die
Testung antibiotischer Resistenzen (Saiman and Siegel, 2004).
1.2.6. Molekularbiologischer Nachweis von Pseudomonas aeruginosa
Im Laufe der letzten Jahre wurden molekularbiologische Methoden entwickelt, mit dem
Ziel eines sensitiveren und schnelleren Nachweises von P. aeruginosa in
Atemwegssekreten von Patienten mit Mukoviszidose.
Eine Möglichkeit ist der Nachweis von DNS mittels der Polymerasen Kettenreaktion
(PCR), eine enzymatische in vitro Replikation der gewünschten DNS Produkte. Es
wurden bisher zehn Gene als genetische Ziele des P. aeruginosa für PCR Assays, z. T.,
bereits auch für quantitative Real-Time PCR Assays (siehe Abschnitt 1.3) untersucht:
gyrB (1), das für die DNS Gyrase Subunit B kodiert, toxA (2), das für die Exotoxin A
Vorstufe kodiert und ETA (3), das für das Exotoxin A kodiert, oprL (4), das für das
24
Pepdidoglycan assoziierte Lipoprotein in der äußere Membran kodiert, oprI (5), das für
das Lipoprotein I kodiert, fliC (6), das für das C-Terminus des Flagellins kodiert, ecfX
(7), das für einen extraplasmatischen Sigmafaktor kodiert, algG (8), das für die GDP-
Mannose-Dehydrogenase kodiert, 16S rRNS (9), sowie der intern transkribierte 16S-
23S rDNS Spacer (ITS) (10) (Deschaght et al., 2011).
Die Spezifität einer PCR basierenden Diagnostik hängt v. a. von der Wahl
hochspezifischer Primer ab, die auf das bestimmte genetische Ziel optimal abgestimmt
sind. Zusätzlich beeinflussen eine Reihe weiterer Faktoren im Reaktionssetting der PCR
wie die Konzentrationen an Magnesium-und Natriumionen, putative Inhibitoren und
Annealing Temperaturen die Spezifität dieser Methodik maßgeblich (Deschaght et al.,
2011).
Die Sensitivität hingegen kann von der jeweilig eingesetzten Probe und der Methode
der DNS Extraktion beeinflusst werden. Insbesondere der Nachweis von P. aeruginosa
aus Sputum von CF-Patienten stellt eine große Herausforderung dar, weil es sehr zäh ist
und daher eine effektive DNS Extraktion gewählt werden muss. Bei einer hohen
Bakterienlast ist die Sensitivität gewöhnlich immer hoch. Interessant sind für die
Testung der Sensitivität daher Proben mit einer niedrigen bakteriellen Last (Deschaght
et al., 2011).
1.3. Quantitative Real-Time PCR
Eine Weiterentwicklung der Standard PCR, die in den 80 Jahren von Kary Mullis und
seinen Mitarbeitern entwickelt wurde und für die Mullis 1993 mit dem Nobelpreis in
Chemie ausgezeichnet wurde, stellt der quantitative Real-Time PCR Assay dar (Kubista
et al., 2006). Dieser, im Folgenden als qPCR bezeichnet, wurde erstmalig 1992 von
Higuchi und seinen Mitarbeitern beschrieben und ermöglicht eine Echtzeit-Detektion
des entstandenen Amplikons durch eine Fluoreszenzerhöhung von Farbstoffen oder
Sonden in jedem PCR Zyklus, die proportional von der Produktmenge abhängt (Higuchi
et al., 1992). Somit entfällt die Charakterisierung des PCR Produktes im letzten Schritt
der Standard PCR durch die Gelelektrophorese. Die qPCR gewährt eine schnelle und
akkurate Quantifizierung der bakteriellen Belastung der eingesetzten Probe auch mit
sehr geringen Volumina. Die Sichtbarmachung der Amplifikationssequenz erfolgt durch
zwei grundlegend verschiedene Detektionssysteme, denen gemeinsam ein Anstieg eines
Fluoreszenzfarbstoffes in jedem Zyklus ist.
25
Das einfachere und unspezifische Detektionssystem beinhaltet einen interkalierenden
Fluoreszenzfarbstoff wie z. B. Ethidiumbromid oder SYBR Green™, der spezifisch an
doppelsträngige DNS bindet und nach Anregung mit energetischem Licht fluoresziert
(Jaffe et al., 2001; Huguchi et al., 1992; Morrison et al., 1998). Am Ende jedes
Elongationsschrittes wird die zunehmende Menge an amplifizierter DNS durch
Messung der Fluoreszenz ermittelt. Die Spezifität des Assays wird somit ausschließlich
durch die Primer bestimmt (Bustin, 2000). In einer anschließenden
Schmelzkurvenanalyse erfolgt die Quantifizierung, in dem der Schmelzpunkt der
spezifischen Fragmentlänge bestimmt wird. Da spezifische Produkte eine höhere
Schmelzpunkttemperatur aufweisen, kann zwischen ihnen und unspezifisch
amplifizierten Primerdimeren unterschieden werden (Morrison et al., 1998).
Spezifische Detektionssysteme beruhen auf der Verwendung sequenzspezifischer
fluorogener Sonden, die zusätzlich neben den Primern die Spezifität des Assays erhöhen
und die Gefahr von falsch positiven Ergebnissen reduzieren. Dazu werden Sonden
eingesetzt, die spezifisch mit der Template-DNS hybridisieren, und im Zuge der PCR-
Produktentstehung Fluoreszenz emittieren. Häufig finden dabei sogenannte double dye
Sonden (TaqMan Sonden) Verwendung. Diese sind an ihrem 5’ Ende mit einem
Reporterfarbstoff, wie z. B. FAM (6-Carboxy-Fluorescein), markiert und enthalten an
ihrem 3’ Ende einen Quencher, wie z. B. den Fluoreszenzfarbstoff TAMRA (6-
Carboxy- Tetramethylrhodamin) (Heid et al., 1996). Die intakte Sonde liegt zwischen
den Oligoprimern an der Zielsequenz und ihre Emission der Reporterfluoreszenz wird
zunächst vom naheliegenden Quencher absorbiert. Nachdem die TaqMan Polymerase
während der Elongationsphase aufgrund ihrer 5’->3’ Exonukleaseaktivität die TaqMan
Sonde fragmentiert hat, wird jedoch das Reportermolekül räumlich vom Quencher
gelöst und emitiert bei entsprechender Bestrahlung mit einer Anregungswellenlänge
eine Fluoreszenz. Dabei steigt die Fluoreszenz proportional zur Menge an
amplifiziertem DNS Produkt an, so dass die Quantifizierung während des PCR
Ablaufes erfolgt. Eine Endpunktanalyse der gebildeten PCR-Produkte in Form einer
gelelektrophoretischen Auftrennung ist somit nicht mehr erforderlich (Heid et al., 1996;
Gibson et al., 1996).
26
2. Zielsetzung der Arbeit
Die Mukoviszidose ist eine autosomal-rezessiv vererbte Multiorganerkrankung, deren
Lebenszeit limitierender Faktor v. a. die pulmonale Manifestation darstellt. Ein
besonderer Problemkeim im Rahmen rekurrierender Infektionen der unteren Atemwege
ist das gram-negative Stäbchenbakterium Pseudomonas aeruginosa. Für die spezifische
Erregerdiagnostik sind sowohl schnelle als auch sensitive Nachweismethoden
wünschenswert. Das Ziel der Arbeit ist die Etablierung und Evaluation eines neuen
hoch sensitiven und spezifischen quantitativen PCR Assays zum Ausschluss bzw. zum
schnellen Nachweis von P. aeruginosa im Sputum von Patienten mit Mukoviszidose.
Dazu wurde als einzelnes genetisches Ziel das keimspezifische ecfX Gen ausgewählt,
welches in der Literatur als hoch spezifisch für P. aeruginosa beschrieben ist (Lavenir
et al., 2007). Die experimentellen Arbeiten wurden 2008 aufgenommen, als in der
Literatur nur wenige quantitative PCR Assays für P. aeruginosa beschrieben worden
waren. Darunter befand sich keiner mit dem ecfX Gen als alleiniger genetischer Marker.
Die Evaluation des quantitativen PCR Assays erfolgte im unmittelbaren Vergleich zum
konventionellen Nachweis mittels einer mikrobiologischen Kultur (semiquantitativer
Nachweis von P. aeruginosa im Drei-Ösen-Ausstrich). Zum einen wurden die beiden
Methoden mittels eines in vitro Versuchs anhand einer Verdünnungsreihe von P.
aeruginosa DNS einer Reinkultur getestet. Zum anderen erfolgte die Evaluation an
Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose, die im Rahmen einer bundesweiten
Studie rekrutiert wurden.
Des Weiteren wurde die bakterielle Last der Patientenproben mit klinisch relevanten
Markern wie laborchemischen und Lungenfunktionsparametern korreliert. Als Marker
für den Gehalt an humaner DNS und der Zellzahl in den Sputumproben wurde die
Veränderung des zellulärem IFN-α8 DNS Gehaltes in den Sputumproben gemessen.
27
3. Methodik
3.1. Material
3.1.1. Chemikalien und Reagenzien
Agarose FMC BioProducts, Rockland, ME, USA
Aqua dest. Apotheke Bergmannsheil Bochum
Aqua bidest. B. Braun, Melsungen, Hungen-Inheiden
Bromphenolblau Riedel-de Haen, Seelze
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth, Karlsruhe
DNS-Leiter, 3 kb, 10 kb Fermentas, St. Leon-Rot
Ethanol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Amresco, Solon, Ohio
FastStart Taq Man® Probe Master, Rox Roche Diagnostics, Mannheim
Glycerin Carl Roth, Karlsruhe
Natriumacetat Merck, Darmstadt
PBS PAA, Pasching
Proteinase K Qiagen, Hilden
qPCR Mastermix plus dTTP Eurogentec, Seraing, Belgien
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Applied Biosystems, Darmstadt
3.1.2. Verbrauchsmaterial
Cell Strainer Nylonfilter,
Porengröße 70 μM Falcon, Heidelberg
Sterile Impfösen, 1 μl, 10 μl Sarstedt, Nümbrecht
Küvetten für Spektrophotometrie Eppendorf, Hamburg
MicroAmp® Fast Optical 48-Well
Reaction Plate Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
Mikroreaktionsgefäße in versch. Größen Webers GmbH, Oberhausen
Petrischalen Greiner Bio One, Frickhausen
Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht
Sterile Probenbecher mit Schraubdeckel,
50 ml Sarstedt, Nümbrecht
28
Reagenzgläser Hecht-Assistent, Sondheim
3.1.3. Geräte
Brutschrank ThermoFisher Scientific, Langeselbold
Bunsenbrenner Campingaz
Fotoapparat für Agarosegel Polaroid (Direct Screen Instant Camera)
Gel-Elektrophorese-Kammer BioRad, München
Spannungsquelle, PowerPack BioRad, München
Gefrierschrank -20°C Liebherr, Biberach an der Riss
Gefrierschrank -70°C Haereus, Hanau
Real-Time PCR System StepOneTM
Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
Photometer, Ultraspec 3100 pro Amersham Biosciences, München
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Schüttelinkubator Gesellschaft für Labortechnik mbH,
Burgwedel
Sterilbank Heraeus, Hanau
UV-Tisch NeoLab GmbH, Heidelberg
Vortex-Schüttler,
Agitatuer Top Mix 11118 Bioblock Scientific, Schwerte
Waage (Sartorius BP221S) Sartorius, Göttingen
Zentrifuge, Megafuge 1.0 RS Haereus, Hanau
Zentrifuge, Multifuge 3S-R Haereus, Hanau
3.1.4. Kulturmedien
Columbia Blutagar Basis der Firma Oxoid, Wesel
23 g/l Oxoid- Spezialpepton
10 g/l Agar mit Zusatz von 4 g/l defibrinisiertem Schafsblut (Oxoid)
5 g/l NaCl
1 g/l Stärke
pH 7,3 ± 0,2
29
CLED-Agar (Cystine Lactose Electrolyte Deficient-Agar) der Firma Oxoid, Wesel
Pepton 4 g/l
Fleischextrakt ‘Lab-Lemco’ 3,0 g/l
Caseinpepton 4,0 g/l
Lactose 10,0 g/l
L-Cystein 0,128 g/l
Bromthymolblau 0,02 g/l
Agar 15,0 g/l
pH 7,3 ± 0,2
LB Bouillon (Luria Bertani), 25 g ad 1l Aqua dest, AppliChem, Darmstadt
10 g Caseinpepton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
pH 7,0 ± 0,2
Aerobe Anzüchtung der Agarkulturen im Brutschrank und der Flüssigkulturen im
Schüttelinkubator bei 37°C.
3.1.5. Puffer und Lösungen
Sputumaufarbeitung
DTT in PBS 0,2 % (w/v)
50 ml PBS
0,1 g DTT
Agarose - Gelelektrophorese von DNS
TBE-Puffer:
45 mM Tris-borat
1 mM EDTA
Aqua bidest.
pH 8
30
Ladepuffer:
25 mg Bromphenolblau
3,3 ml 150 mM Tris pH 7,6
6 ml Glycerin
0,7 ml Aqua dest.
Molekularbiologische Testung
TE Puffer:
100 mM Tris
1 mM EDTA
Aqua dest.
pH 8
3.1.6. Kits
QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)
ATL Lysepuffer
Proteinkinase K
AL Puffer
AW1 und AW2 Waschpuffer
AE Puffer
QIAamp spin Säule
BACIdent Kit für P. aeruginosa (Eurofins Genescan GmbH, Freiburg)
Mastermix für 100 PCR Reaktionen für die spezifische Detektion von P. aeruginosa
3.1.7. Bakterienstämme und DNS Präparationen
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 oder DSM 117), „Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH“ (Braunschweig)
Escherichia coli DH5, Experimentelle Pneumologie, (Ruhr-Universität
Bochum, Bochum)
31
Klinische Isolate von Pseudomonas putida und Stenotrophomonas
maltophilia, Institut für medizinische Mikrobiologie und Virologie, (Ruhr-
Universität Bochum, Bochum)
Genomische DNS Isolationen aus Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli DH5, Pseudomonas putida und Stenotrophomonas maltophilia
Genomische DNS aus humanen Blutzellen als Positivkontrolle für den
IFN-α8 Assay
Genomische P. aeruginosa DNS mit definierter Kopienzahl (100 Kopien/
µl, Eurofins Genescan GmbH, Freiburg)
3.1.8. Primer und Sonden
Spezifische Primer und Sonden für die quantitative Real-Time PCR von P. aeruginosa
und IFN-α8
Die in dieser Arbeit verwendeten Primer und Sonden wurden von der Invitrogen GmbH
(Karlsruhe) in der höchsten Reinheitsstufe bezogen.
3.1.9. Software
Primer ExpressTM
(Version 1.0) Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
Graphpad Prism (Version 3.0) Graphpad Software, La Jolla, CA, USA
SPSS (Version 16) IBM, Chicago, IL, USA
StepOne Software (Version 2.0) Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
32
3.2. Methoden
3.2.1. Patientenkollektiv und respiratorische Proben
Diese Arbeit war Teil einer randomisierten, Placebo kontrollierten Doppelblind-Studie
zur Erfassung der Effektivität einer 24-wöchigen inhalativen Therapie mit Glutathion
bei CF-Patienten. Die Patienten wurden deutschlandweit rekrutiert. Die Studie wurde
von der zuständigen Ethikkommission und dem Bundesinstitut für Arzneimittel und
Medizinprodukte am 20.10.2006 genehmigt. Die Sputen und klinischen Daten der
Patienten sind uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt worden. Eine
Vertraulichkeitserklärung über die Einsicht in die Studiendokumentation wurde in
einem Vertrag vom 02.06.2009 festgehalten.
In dieser Arbeit wurden Sputumproben von 31 Patienten im Alter von 8 bis 43 Jahren
aus neun CF-Zentren untersucht. 21 der Studienteilnehmer waren weiblich, 10
männlich. Alle Probanden wiesen eine gesicherte Mukoviszidose Diagnose auf. Die
Diagnose war dabei klinisch gesichert aufgrund der Anamnese, des klinischen
Krankheitsverlaufes und eines positiven Schweißtests mittels Pilocarpin Iontophorese
mit einer positiven Konzentration von Chlorid im Schweiß von mindestens 60 mEq/l
und/oder einer genetischen Untersuchung mit zwei identifizierbaren Mutationen im
CFTR-Gen, begleitet von ein oder mehreren klinischen phänotypischen Merkmalen.
Einschlusskriterien für die Patienten waren eine akzeptable Spirometrie nach ATS
Standards (American Thoracic Society) und ein FEV1 > 40 % und < 90 %. Des
Weiteren mussten die Studienteilnehmer in einer klinisch stabilen Verfassung sein und
sollten keine Hinweise auf einen akuten Infekt der oberen oder unteren Atemwege
innerhalb der letzten vier Wochen vor Studienbeginn aufweisen. Ein weiteres
Ausschlusskriterium waren pulmonale Exazerbationen innerhalb der letzten vier
Wochen vor dem Screening der Patienten, die eine intravenöse, orale oder inhalative
antibiotische Therapie oder orale Kortikosteroide erforderten. Begleitende und feste
Medikationen wurden während der gesamten Studienzeit unverändert weiter fortgeführt.
Insgesamt konnten 106 Sputumproben von 31 in die Studie aufgenommenen Patienten
gesammelt werden. Die Patienten stellten sich in der Regel viermalig im Rahmen der
Studie im jeweiligen CF-Zentrum vor. Die Sputumproben wurden zwischen Dezember
2007 und Juli 2009 gewonnen, wobei mindestens 3 Wochen zwischen 2 Visiten eines
33
individuellen Patienten lagen. Zum Ausschluss oder qualitativen und quantitativen
Nachweis von P. aeruginosa wurden 91 der Sputumproben mittels des im Rahmen
dieser Arbeit neu etablierten qPCR Assays analysiert, 81 der Proben mittels der
konventionellen mikrobiologischen Kultur untersucht und 66 Proben sind mittels beider
Methoden getestet worden.
Zur Gewinnung von Sekret aus den unteren Atemwegen erfolgte im Krankenhaus eine
Induktion von Sputum mittels hypertoner Kochsalzlösung (NaCl 10 %). Diese wurde
nach der jeweiligen individuellen morgendlichen Inhalation (z. B. mit
Bronchodilatatoren, hypertoner Kochsalzlösung, Pulmozyme®) und nach der
Spirometrie und Inhalation eines ß-Agonisten im Krankenhaus wie folgt durchgeführt:
Ausspülen des Mundes mit Leitungswasser/Trinkwasser zur Reduktion der
Normalflora
Inhalation mit 2,5 ml einer sterilen 10 %-igen NaCl-Lösung über einen
Vernebler
Temperatur der Lösung 37 - 40°C
Auffangen des Auswurfes jeweils nach 5, 10 und 15 minütiger Inhalation in
einem sterilen Probenbecher
Gewöhnlich wurde von jeder 5-Minuten-Sputumprobe ein Aliquot von 500 μl für die
mikrobiologische Testung entnommen. 100 μl Sputum (zusammengeführt aus 10 und
15 min Sputen, siehe 3.2.3) sind jeweils für die PCR Messung bei -70°C eingefroren
worden. Die mikrobiologische Testung des Sputums war nur zur ersten und letzten
Visite von einem Patienten obligatorisch, erfolgte jedoch bei suffizienter Menge an
Sputum auch während der weiteren Vorstellungen.
Zur Messung der Lungenfunktion wurde zu jeder Vorstellung des Patienten eine
Spirometrie durchgeführt. Des Weiteren erfolgte die Dokumentation der aktuellen
Körpermaße (Länge und Höhe), begleitender Erkrankungen und der jeweiligen
Medikation. Am Tage der ersten und letzten Visite eines Patienten fand eine
laborchemische Routineuntersuchung, inklusive der Bestimmung von Blutbild, CrP,
Serumimmunglobulinen und Albumin, statt.
34
3.2.2. Mikrobiologische Quantifikation von P. aeruginosa im
Patientensputum
81 Proben der 5-Minuten Sputen wurden unverzüglich mittels der konventionellen
mikrobiologischen Kultur im Labor der jeweiligen CF-Zentren getestet. Dabei ist zum
Vereinzeln der Bakterienkolonien von jeder Probe unverdünnt ein Drei-Ösen-Ausstrich
mit einer 1 μl Impföse auf Columbia Blutagarplatten (mit 4 % defibrinierte
Schafserythrozyten, Oxid, Wesel) angefertigt worden. Der Ausstrich erfolgte, wie in
Abbildung 4 dargestellt, in drei Schritten. Zunächst wurde mit der Öse Material der
auszuplatierenden Probe entnommen und im Zick-Zack auf das erste Drittel der Platte
vom Rand bis zur Mitte aufgetragen. Durch den ersten Ausstrich ist nun das zweite
Drittel im Zick-Zack beimpft worden, bis dann der dritte Ausstrich durch den zweiten
geführt und im letzten Drittel aufgetragen wurde. Es erfolgte die Inkubation der Platten
für 16 Stunden bei 37°C, bis anschließend die Menge an P. aeruginosa semi-quantitativ
mit Werten von 0, +, ++, +++ bewertet wurde. Dabei stellte 0 keinen Kolonienachweis
dar. Mit + bewertete Platten wiesen Kolonien nur in der ersten Ausstrichfraktion auf,
mit ++ in der ersten und zweiten Ausstrichfraktion und folglich mit +++ auch in der
dritten Ausstrichfraktion.
Abbildung 4: Drei-Ösen-Ausstrich
3.2.3. DNS-Extraktion aus klinischen Sputumproben
91 der Sputumproben, die von Patienten nach zehn- und fünfzehnminütiger Inhalation
produziert worden waren, wurden in unserem Labor zusammengeführt. Von einer
1 2
3
35
solchen gepoolten Probe wurden 100 μl mit 1,1 ml 0,2 % (w/v) DTT in PBS verdünnt.
Die Lösung wurde gemischt (Vortex) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend erfolgte die Filtration des verdünnten Sputums durch einen
Nylonfilter mit einer Porengröße von 70 μm. Von diesem Filtrat wurden 600 μl für 5
Minuten bei 9503 x g und 18°C zentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand verworfen
und das Pellet in 180 μl ATL Lysepuffer (Qiagen, Hilden) resuspendiert. Die enthaltene
DNS wurde dann mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden) gemäß
Herstellerprotokoll extrahiert. Zum besseren zellulären Aufschluss insbesondere der
bakteriellen Komponenten wurde das Lysat zusätzlich mit 20 μl Proteinase K (600
mAU/ml Lösung) versetzt und für 20 Minuten bei 56°C inkubiert. Im Anschluss wurden
200 μl AL Puffer zugesetzt und die darin gelösten chaotropen Salze stellten die
optimalen DNS-Bindungsbedingungen ein. Nun wurde das Gemisch auf eine QIAamp
spin Säule pipettiert und bei 6082 x g für eine Minute zentrifugiert. Aufgrund des hohen
Salzgehaltes adsorbierte die DNS reversibel an die Silikatmatrix in der Säule. In zwei
Waschschritten mit je 500 μl AW1 und AW2 Waschpuffer und Zentrifugation bei 6082
x g bzw. 16060 x g wurde anschließend die gebundene DNS weiter von Kontaminanten
befreit. Zur Elution der aufgereinigten DNS erfolgte im letzten Schritt die Zugabe von
200 μl AE Puffer auf die QIAamp spin Säule und ein Zentrifugationsschritt bei 6082 x g
für 1 Minute. Das resultierende Eluat wurde direkt bei -20°C bis zur weiteren
Verwendung eingefroren.
3.2.4. Bakterienstämme und eingesetzte DNS
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 oder DSM 117) wurde von der „Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH“ (Braunschweig) bezogen.
Escherischia coli DH5α wurde aus der experimentellen Pneumologie (Ruhr-Universität
Bochum, Bochum) bereitgestellt. Pseudomonas putida und Stenotrophomonas
maltophilia stammten aus der Sammlung klinischer Isolate vom Institut für
medizinische Mikrobiologie und Virologie (Ruhr-Universität Bochum, Bochum). Die
Verifikation der klinischen Isolate erfolgte durch 16S rDNS Sequenzierung.
Die DNS Isolation wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden) gemäß
Herstellerprotokoll durchgeführt. Anschließend wurde die DNS Konzentration
spektrophotometrisch bei 260 und 280 nm Wellenlänge bestimmt (Ultraspec 3100 pro,
Amersham Bioscience, München).
36
3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese von DNS
Zur visuellen Kontrolle der gemessenen DNS Konzentrationen und Überprüfung der
Integrität der isolierten DNS aus den Referenzstämmen (siehe 3.2.4) wurde eine
Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Mittels der Gelelektrophorese wird die
aufgrund ihrer Phosphatgruppen negativ geladene DNS in einer Gelmatrix im
elektrischen Feld aufgetrennt. Die Laufweite im Gel hängt dabei nur von der Länge der
DNS-Fragmente ab. Die Größe der Fragmente in den Proben kann anhand von DNS-
Markern bekannter Größenzusammensetzung abgeschätzt werden.
Das Agarosegel wurde aus 0,5 g Agarose in 50 ml TBE Puffer erstellt und mit 3 μl
Ethidiumbromid versetzt. Die Geltaschen wurden mit je 300 ng DNS von E. coli, P.
aeruginosa, P. pudia oder S. maltophilia in TBE-Puffer mit 3 μl Lade-Puffer
(Gesamtvolumen 15 µl) beladen. Zur Größenbestimmung wurden ein 3 kb und ein 10
kb Marker eingesetzt. Die Auftrennung der DNS-Fragmente erfolgte in einer
Elektrophoresekammer mit 1x TBE-Puffer unter einer Spannung von 50 V um das
Einlaufen der Proben in das Gel zu gewährleisten. Die eigentliche Auftrennung erfolgte
im Anschluss bei einer Spannung von 100 V. Die Photodokumentation des
Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels wurde unter UV-Durchlicht mit einer Polaroid
Kamera (Direct Screen Instant Camera) durchgeführt.
3.2.6. Primer und Sonden für die P. aeruginosa und humanes IFN-α8
spezifischen quantitativen Real-Time PCR-Assays
Als Ausgangsbasis für die Etablierung eines P. aeruginosa spezifischen, quantitativen
Real-Time PCR-Assays wurden die Forward- und Reverse-Primer einer
konventionellen PCR mit dem P. aeruginosa spezifischen ecfX Gen als Target aus der
Publikation von Lavenir et al., 2007 entnommen. Der Reverse-Primer wurde
beibehalten, und der Forward-Primer wurde innerhalb des kodierenden
Sequenzabschnittes verschoben und neu entworfen um diese PCR an das quantitative
TaqMan System zu adaptieren. Weiterhin wurde mittels der Primer Express Software
(Primer ExpressTM
Version 1.0; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) eine
zusätzliche Sondensequenz generiert. Damit wurde eine Fluoreszenz gemessen, die
proportional mit der Menge an vervielfältigen PCR Produkten zunahm.
Um Informationen über mögliche Variationen in der Sputumqualität hinsichtlich der
Menge und Zusammensetzung an humanen Zellen und DNS Material zu erzielen,
37
wurde zusätzlich in jeder Patientenprobe die Menge an humaner DNS gemessen. Diese
wurde mittels eines TaqMan PCR-Assays quantifiziert, der das humane IFN-α8 Gen als
Zielsequenz aufweist (Loeseke et al., 2003).
Die verwendeten Primer- und Sondensequenzen sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Sequenzen verwendeter Primer und Sonden Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden für den P. aeruginosa sensitiven qPCR Assay mit dem ecfX
als Zielgen und für den IFN-α8 spezifischen qPCR Assay.
For = Forward Primer, REV = Reverse Primer, P = TaqMan Sonde, CDS = Kodierende Sequenz.
Gen 5’-3’ Sequenz Länge
(bp)
Amplicon
Länge (bp)
Position
im CDS
ecfX
For:
GCGTTCGTCCTGCACAAGT 19 144
385 –
403
Rev:
TCATCCTTCGCCTCCCTG
18
511 –
528
P:
ATGGTGGAAAAGCACATCGCCAGC
24
457 –
480
IFN-
α8
For:
CCTTCTAGATGAATTCTACATCGAACTTG 29 86
309 –
337
Rev:
ACTCTATCACCCCCACTTCCTG
22
394 –
416
P:
CAGCTGAATGACCTGGAGTCCTGTGTG
27
343 –
369
Alle Sonden waren am 5’ Ende mit dem Reporter Fluoreszenzfarbstoff 6-
Carboxyfluorescein (FAM) und am 3’ Ende mit 6- Carboxytetramethylrhodamin
(TAMRA) als Quenscher markiert. Das 3’ Ende war zusätzlich mit einer Phosphatgrupp
behaftet, das die Elongation der Sonde blockierte.
Die Sensitivität und Spezifität der P. aeruginosa spezifischen Primer- und
Sondenkombination wurden in einer initialen Etablierungsphase experimentell
verifiziert. Zur Feststellung der Sensitivität wurde DNS von P. aeruginosa (ATCC
27853) in unterschiedlichen Konzentrationen (von 100 bis 10-3
ng/Reaktion) als
Template DNS eingesetzt. Zum quantitativen Vergleich wurde eine kommerziell
erhältliche Präparation von genomischer P. aeruginosa DNS (Eurofins Genescan
GmbH, Freiburg) mit einer definierten Genomkopiezahl (100 Kopien/µl) eingesetzt. Zur
Überprüfung der Spezifität des PCR-Assays wurde DNS von E. coli sowie von den
Bakterien wie P. putida und S. maltophilia in unterschiedlichen Konzentrationen (von
38
20 bis 100 ng/Reaktion) eingesetzt, die in sehr naher phylogenetischer Verwandtschaft
mit P. aeruginosa klassifiziert werden.
3.2.7. Quantitative Real-Time PCR
Sämtliche PCR Reaktionen wurden in optischen 48-well Reaktionsplatten (Applied
Biosystems, Carlsbad, CA, USA) durchgeführt. Das finale Reaktionsvolumen betrug
25 μl und beinhaltete 200 nM der Sonde, jeweils 300 nM beider Primer und 5 μl der
extrahierten DNS im Mastermix FastStart TaqMan® Probe Master/Rox (Roche
Diagnostics, Mannheim). Die PCR Reaktion (Real-Time PCR System StepOneTM
,
Applied Biosystems, Carlsbad) begann mit einem singulären Aktivierungsschritt der
FastStart Taq DNA-Polymerase für 10 Minuten bei 95°C. Jeder der weiteren folgenden
40 zweischrittigen PCR-Zyklen bestand aus einem Denaturierungsschritt für 15
Sekunden bei 95°C sowie dem zweiten Schritt einer kombinierten Primer/Sonden
Hybridisierung und Elongation für 1 Minute bei 60°C. Bei allen durchgeführten PCR-
Ansätzen wurden jeweils eine Negativkontrolle und ein Positivstandard mitgeführt. Der
Positivstandard bestand aus gereinigter P. aeruginosa DNS. Die Negativkontrolle
wurde mit sterilem, destilliertem Wasser durchgeführt, um DNS Kontaminationen
auszuschließen.
Als Maß zur Quantifizierung der Zielsequenz wurde der Ct-Wert bestimmt. Er ist der
Punkt, an dem die Amplifikationskurve die Threshold-Linie schneidet und damit
erstmalig signifikant die Hintergrundfluoreszenz übersteigt (Gibson et al., 1996; Heid et
al., 1996).
Zur exakten Quantifikation der P. aeruginosa DNS in den Sputumproben der Patienten
wurde eine valide Referenz-Standardkurve für den PCR Assay erstellt. Dafür erfolgte
initial die Bestimmung der Konzentration der isolierten P. aeruginosa (ATCC 27853)
DNS in einer Stammlösung mittels spektrophotometrischer Messung (Ultraspec 3100
pro, Amersham Biosience, München) bei einer Wellenlänge von 260 und 280 nm.
Ausgehend von der Stammlösung wurde eine Verdünnungsreihe in einem Bereich von
20 bis 2x10-4
ng/μl DNS hergestellt, aliquotiert und bei -80°C gelagert. In zehn
unabhängigen PCR Experimenten wurde die Verdünnungsreihe eingesetzt und aus den
Mittelwerten eine universale Standardkurve ermittelt, die der Quantifizierung der
bakteriellen Belastung von P. aeruginosa im Sputum der Patienten diente.
Zur exakten Quantifizierung des Gehaltes an humaner DNS in den Sputumproben der
Patienten wurde ebenfalls eine Referenz-Standardkurve erstellt. Humane genomische
39
DNS wurde aus Blutzellen extrahiert, spektrophotometrisch quantifiziert und dann für
die Herstellung einer Verdünnungsreihe in einem Bereich von 100 bis 10-3
ng/μl
eingesetzt. Aus den Mittelwerten von zehn unabhängigen PCR-Experimenten wurde
eine universale Standardkurve ermittelt, die für die Quantifizierung der genomischen
DNS im Sputum der Patienten verwendet wurde.
3.2.8. Kommerzielles Kit für P. aeruginosa Real-Time PCR
Zur weiteren Evaluation und Absicherung der Inhouse-PCR wurde diese mit dem
kommerziellen Real-Time PCR-Kit BACIdent für P. aeruginosa (Eurofins Genescan
GmbH, Freiburg) verglichen. Dieses PCR-Kit verwendet das algX Gen von P.
aeruginosa als genetisches Target. Die Sequenzen der verwendeten Primer waren durch
den Hersteller nicht angegeben.
3.2.9. In vitro Vergleich des Real-Time PCR-Assays mit dem kulturellen
Nachweis von P. aeruginosa aus bakteriellen Monokulturen
Um einen Vergleich des PCR-basierten und des klassischen mikrobiologischen
Nachweises bezüglich Spezifität und Sensitivität zu erhalten, wurden beide Methoden
parallel aus identischen P. aeruginosa Monokulturen durchgeführt. Dafür wurden drei
unabhängige Übernachtkulturen von P. aeruginosa (ATCC 27853) in einer LB-
Bouillon (AppliChem, Darmstadt) angesetzt und anschließend daraus neun dekadische
Verdünnungsstufen erstellt (900 μl Aqua bidest. + 100 μl Bakteriensuspension). Von
jeder Verdünnungsstufe wurde ein Drei-Ösen-Ausstrich mit einer 1 μl Öse auf
Columbia Blutagarplatten mit 4 % defibrinierten Schafsblut (Oxid, Wesel)
durchgeführt. Mit weiteren 100 μl wurden CLED-Agar Platten (Oxid, Wesel) beimpft
und mit einer sterilen Impföse (10 μl) ausplattiert. Alle Kulturplatten wurden aerob für
16 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Anzahl an Bakterienkolonien
semi-quantitativ mit einem Wert von 0, +, ++ oder +++ auf den Blutagarplatten
bestimmt. Quantitativ erfolgte die Berechnung der Bakterienmenge anhand der
ausgezählten Koloniezahlen auf den CLED-Agarplatten (Koloniezahl x Verdünnung x
Verdünnungsstufe) (Monroe et al., 1969). Die dargestellten Ergebnisse sind die
Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten.
Für den Real-Time PCR-Assay wurde aus jeder bakteriellen Kulturverdünnung 799 μl
(899 μl von der höchsten Verdünnungsstufe) für die DNS Isolation eingesetzt. Dazu
40
wurde das Probenvolumen der jeweiligen Verdünnungen für 10 Minuten bei 10,000 x g
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die verbleibenden bakteriellen
Pellets wurden in 180 μl Lyse-Lösung (Qiagen, Hilden) resuspendiert. Anschließend
wurde die DNS mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden) nach
Herstellerprotokoll (siehe 3.2.3) isoliert. Die bakterielle DNS wurde bei -80°C bis zur
weiteren Verwendung gelagert.
3.2.10. Statistische Analyse
Die Rohdaten des StepOneTM
Real-Time PCR Gerätes wurden mittels der StepOne
Software (Version 2.0) bearbeitet und die Ct-Werte, Standardkurven und DNS-
Konzentrationen berechnet.
Sämtliche Daten und Assay- wie Diagnostikergebnisse wurden als Datenpunkte in
anonymisierter Form in einer primären Datei (Excel) erfasst und durch doppelte
Dateneingabe verifiziert. Die weiterführende Datenanalyse und Darstellung wurde mit
der Graphpad Prism 3.0 (Prism) und SPSS Version 16.0 (SPSS) Software an einem mit
Windows XP operierenden System durchgeführt. Die folgenden statistischen
Testprozeduren wurden verwendet, um die quantitativen Mengen an P. aeruginosa im
Sputum und in vitro anhand von Bakterienreinkulturen mit der konventionellen
bakteriellen Kultur und klinischen Daten zu korrelieren:
Kruskal Wallis
Mann Whitney U
Unpaired T-Test
Kolmogorow-Smirnow
Spearman und Pearson Korrelationskoeffizient
Für alle Tests wurde ein Signifikanzlevel von 95 % gewählt.
41
4. Ergebnisse
4.1. Bakterielle Referenz-DNS zur Etablierung der P. aeruginosa
spezifischen Real-Time PCR
Als Referenz-DNS zur Testung der Spezifität und Sensitivität der neuen Primer/Sonden
Kombination wurde die bakterielle DNS aus Monokulturen von P. aeruginosa (ATCC
27853), P. putida, S. maltophilia und E. coli (DH5) isoliert. Nach anschließender
spektrophotometrischer DNS-Konzentrationsbestimmung wurde die Integrität und
Vergleichbarkeit der verschiedenen DNS-Isolate visuell mittels Agarose-
Gelelektrophorese überprüft. Dazu wurden jeweils 300 ng DNS gelelektrophoretisch
aufgetrennt. Das Ergebnis der Überprüfung ist in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 5: Nachweis der eingesetzten DNS auf Agarosegel
Überprüfung der eingesetzten bakteriellen DNS Präparationen mittels Gelelektrophorese auf einem 1 %
Agarosegel. M1 = 3 kb Marker, M2 = 10 kb Marker. 1 = P. aeruginosa (ATCC 27853), 2 = P. putida,
3 = S. maltophilia, 4 = E. coli (DH5).
Die Testung verifiziert visuell eine vergleichbare Quantität der analysierten DNS.
Zudem bestätigt sich eine gute Qualität an hoch molekularer DNS ohne einen
signifikanten Abbau oder eine Fragmentierung der DNS. Daher ist von einer
vergleichbaren Qualität zwischen den DNS-Präparationen auszugehen.
M1 1 2 4 3 M2
10 kb
3 kb
1 kb
42
4.2. Evaluation des quantitativen Real-Time PCR (qPCR) Assays
Vor Aufnahme der Testung an den klinischen Proben wurde zunächst die neu etablierte
Primer-/Sondenkombination des P. aeruginosa spezifischen Real-Time PCR Assays auf
seine Spezifität, Sensitivität und Linearität bzw. Effizienz der Quantifizierung innerhalb
des gesamten Messbereiches evaluiert.
Zur Bestimmung des Messbereiches des qPCR Assays wurde ausgehend von einer
bekannten Menge von P. aeruginosa DNS (ATCC 27853) eine Verdünnungsreihe mit
einer Konzentration von 20 bis 2x10-4
ng/µl hergestellt. Ausgehend von dieser
Verdünnungsreihe wurden die qPCR-Reaktionen in einem Konzentrationsbereich von
100 ng bis 0,001 ng P. aeruginosa DNS pro Reaktion durchgeführt. Sämtliche Ct-
Ergebnisse aus 10 unabhängigen PCR-Läufen wurden gemittelt und basierend auf
diesen Mittelwerten wurde eine Referenzstandardgerade erstellt und für die
Quantifizierung der Patientenproben verwendet. In Abbildung 6 ist diese
Referenzstandardgerade dargestellt. Dabei zeigt sich, dass der Assay über einen sehr
breiten Messbereich von 5 log-Stufen verfügt und erkennbar an den geringfügigen
Standardabweichungen nur diskrete inter- und intraassay Schwankungen aufzeigt.
Reproduzierbar konnte eine untere stabile Nachweisgrenze von P. aeruginosa DNS bis
zu 0,001 ng erzielt werden. Die nächste niedrigere Konzentrationsstufe von 0,0001 ng
war nicht mehr verlässlich innerhalb der 40 PCR-Zyklen detektierbar. Um einen Anhalt
über die Effizienz des Assays zu erzielen, wurden die ΔCt-Werte bestimmt, die die
Differenz der Ct-Werte zwischen den einzelnen Verdünnungsstufen darstellen (siehe
Tabelle 3). Die Effizienz der PCR-Reaktionen bleibt über den gesamten Messbereich
um einem ΔCt-Wert von 4 zwischen den jeweiligen Verdünnungsstufen konstant und
liegt nahe bei einer 100 % -tigen Effizienz der PCR-Reaktion, die durch einen ΔCt-Wert
zwischen zwei dekadischen Verdünnungsstufen von 3,3 gekennzeichnet ist.
43
Tabelle 3: Berechnung der Effizienz des qPCR Assays anhand des ΔCt-Wertes
Verdünnungsstufe ΔCt
Ct (Verdünnung 2) – Ct (Verdünnung 1) 4,00
Ct (Verdünnung 3) – Ct (Verdünnung 2) 4,32
Ct (Verdünnung 4) – Ct (Verdünnung 3) 4,44
Ct (Verdünnung 5) – Ct (Verdünnung 4) 4,56
Ct (Verdünnung 6) – Ct (Verdünnung 5) 4,62
Abbildung 6: Referenzstandardgerade mit Standardabweichungen des P. aeruginosa qPCR Assays
Erstellt anhand von dekadisch verdünnter P. aeruginosa DNS von 100 bis 0,001 ng/PCR-Reaktion. Die
Referenzgerade errechnet sich aus den Mittelwerten von 10 unabhängigen Experimenten, wobei die
Ansätze pro PCR-Lauf in Doppelbestimmung durchgeführt wurden.
Regressionslinie: f(x) = -1,9125ln(x) + 24,734.
Die Spezifität bzw. die Diskriminierungseigenschaften der Primer wurden durch die
Verwendung von hohen Konzentrationen an bakterieller DNS getestet. Als Testmaterial
wurde aus Monokulturen extrahierte DNS von E. coli und den phylogenetisch zu P.
aeruginosa nahe verwandten Bakterien Stenotrophomonas maltophilia und eines
weiteren Pseudomonaden wie P. putida eingesetzt. Wie der Abbildung 7 zu entnehmen
ist, kam es selbst bei einer hohen Konzentration von bis zu 100 ng bakterieller DNS pro
Reaktion zu keiner falsch positiven Amplifikation durch den P. aeruginosa spezifischen
Ct-
Wer
t
Pseudomonas aeruginosa log DNS [ng/Rx]
44
PCR-Assay. Alle PCR-Reaktionen mit E. coli, P. putida und S. maltophilia blieben im
gesamten PCR-Verlauf deutlich unterhalb der Threshold-Linie.
Abbildung 7: Amplifikationskurven Amplifikationskurven für P. aeruginosa (1 ng/Rx), S. maltophilia (100 ng/Rx) und P. putida (100 ng/Rx)
bei Verwendung des P. aeruginosa spezifischen qPCR Assays. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives
Ergebnis nach 40 PCR-Zyklen. Die Ansätze wurden jeweils in Doppelbestimmung durchgeführt. Die
Threshold-Linie liegt bei 0,05.
Des Weiteren wurde zum quantitativen Vergleich eine kommerziell erhältliche
Präparation von genomischer P. aeruginosa DNS mit einer definierten Genomkopiezahl
(100 Kopien/µl) eingesetzt. Es erfolgten drei Experimente in Doppelbestimmung in
denen 500, 100 und 50 Kopien gemessen und die ermittelten Ct-Werte in ng übertragen
wurden. Es zeigte sich, dass auch bei 500 eingesetzten Kopien pro Reaktion eine sehr
geringe Menge gemessen wurde und bei nur 50 eingesetzten Kopien noch eine
zuverlässige, reproduzierbare Messung erfolgte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4
zusammengestellt.
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 40 38 42
PCR Zyklus
Flu
ore
szen
z-I
nte
nsi
tät
Δ R
n
S. maltophilia 100 ng/Rx
P. aeruginosa 1 ng/Rx
E. coli 100 ng/Rx
P. putida 100 ng/Rx
45
Tabelle 4: Experiment zur Messung definierter Kopienzahlen
Experiment zur Messung definierter Kopienzahlen und Bestimmung der Konzentration von P. aeruginosa
DNS (ng/Rx).
Kopienzahl Ct Experiment 1 Ct Experiment 2 Ct Experiment 3 Mittelwert ng/Rx
500 K/Rx 32,38 32,46 32,65 32,50 0,0172
100 K/Rx 35,90 35,97 36,55 36,14 0,0026
50 K/Rx 37,45 37,24 37,42 37,37 0,0014
4.3. Kommerzieller PCR Assay
Zur Evaluation und Absicherung des qPCR Assays wurde dieser mit dem
kommerziellen Real-Time PCR-Kit BACIdent für P. aeruginosa verglichen. Zunächst
wurde eine Verdünnungsreihe in einem Konzentrationsbereich von 100 ng bis 0,001 ng
P. aeruginosa DNS pro Reaktion gemessen. Die Standardgrade ist in Abbildung 8
dargestellt. Dabei zeigte sich eine ebenfalls gute Effizienz des kommerziellen Kits mit
stabilen ΔCt-Werten um 3,45 bis 4,39 (siehe Tabelle 5). Bei identisch eingesetztem
Probenmaterial zeigten sich jedoch im Vergleich zu unserem PCR Assay höhere Ct-
Werte, die somit eine niedrigere Sensitivität im Vergleich zum hauseigenen Assays
belegten.
Tabelle 5: Berechnung der Effizienz des kommerziellen PCR Assay anhand der ΔCt-Werte
ΔCt-Werte der Verdünnungsreihe, die mit dem kommerziellen PCR Assay gemessen wurden.
Verdünnungsstufe ΔCt
Ct (Verdünnung 2) – Ct (Verdünnung 1) 4,39
Ct (Verdünnung 3) – Ct (Verdünnung 2) 3,60
Ct (Verdünnung 4) – Ct (Verdünnung 3) 3,74
Ct (Verdünnung 5) – Ct (Verdünnung 4) 3,80
Ct (Verdünnung 6) – Ct (Verdünnung 5) 3,45
46
Abbildung 8: Standardgerade des kommerziellen P. aeruginosa qPCR Assays
Erstellung anhand von dekadisch verdünnter P. aeruginosa DNS von 100 bis 0,001 ng/PCR-Reaktion in
Doppelbestimmung. Regressionslinie: f(x) = -1,639ln(x) + 26,969.
4.4. Vergleich des qPCR Assays mit der konventionellen Kultur in
vitro
Hinsichtlich der Sensitivität des qPCR Assays wurde dieser direkt mit den Ergebnissen
der konventionellen mikrobiologischen semiquantitativen Methode verglichen, die als
Standardnachweis von P. aeruginosa in der klinischen Diagnostik gilt. Dazu wurden in
drei unabhängigen Experimenten aus P. aeruginosa (ATCC 27853) Monokulturen
Verdünnungsreihen mit jeweils 9 dekadischen Verdünnungsstufen erstellt und mittels
Drei-Ösen-Ausstrich auf Columbia Blutagarplatten ausgestrichen. Die
semiquantitativen Ergebnisse wurden dann in die Kategorien + (positiver Nachweis von
P. aeruginosa im ersten Drittel der Nährbodenplatte), ++ (positiver Nachweis im ersten
und zweiten Drittel der Nährbodenplatte), +++ (positiver Nachweis in allen Dritteln)
oder 0 (negativer Befund) eingestuft. Eine exakte quantitative Bestimmung der
bakteriellen Keimzahl der Monokulturen erfolgte durch Ausplattierung von 100 μl der
einzelnen Verdünnungen auf CLED-Agarplatten. Zur Auswertung wurden diejenigen
Verdünnungsstufen von zwei Experimenten herangezogen, die ausplattiert zwischen 1
Ct-
Wer
t
Pseudomonas aeruginosa log DNS [ng/Rx]
47
und 100 eindeutig voneinander abgrenzbare Kolonien aufwiesen. Die Berechnung der
bakteriellen Zellzahl basierte dann auf der Keimzahlbestimmung (Koloniezahl x
Verdünnung x Verdünnungslevel). Im Experiment 3 war die Keimzahl aufgrund einer
verunreinigten Platte nicht zu bestimmen. Die Mittelwerte der Keimzahlbestimmung
zeigt Tabelle 6.
Tabelle 6: Keimzahl der P. aeruginosa Monokulturen
KBE = Kolonie bildende Einheiten.
Experiment Keimzahl
1 1,4 x 109
KBE/ml
2 6,8 x 108
KBE/ml
Parallel zu den mikrobiologischen Bestimmungen wurde aus jeder Verdünnung die
DNS isoliert und mittels qPCR-Assay quantitativ getestet. Alle 27 Verdünnungen
zeigten in der PCR spezifische DNS Amplifikationen. Im Gegensatz dazu ergab die
konventionelle Kulturmethode schon ab der 7. Verdünnungsstufe keinen positiven P.
aeruginosa Nachweis mehr (siehe Tabelle 7). Damit zeigte sich, dass die Sensitivität
des qPCR Assays bis zu 100-fach höher ausfiel als die der konventionellen Methode.
Selbst die erzielten Ct-Werte der qPCR in der neunten Verdünnungsstufe lagen gerade
noch am unteren Ende des ermittelten Messbereiches des qPCR Assays.
Tabelle 7: Vergleich von konventioneller Kultur Methode und qPCR Assay in vitro Vergleich der konventionellen Kultur Methode (Drei-Ösen-Ausstrich auf Columbia Blutagarplatten: 0, +,
++, +++) mit dem qPCR-Assay, berechnet als P. aeruginosa DNS in ng/PCR Reaktion, anhand von
dekadischen Verdünnungsreihen von drei P. aeruginosa Monokulturen in vitro.
Verdünnung Kultur (3+, 2+, 1+, 0) Mittelwert (± Std.)
qPCR (ng/Reaktion) Mittelwert (± Std.)
10-1
3 (± 0) 199,896 (± 93,681)
10-2
3 (± 0) 19,981 (± 7,009)
10-3
2 (± 0) 2,208 (± 0,841)
10-4
1,67 (± 0,58) 0,229 (± 0,091)
10-5
1 (± 0) 0,024 (± 0,007)
10-6
1 (± 0) 0,005 (± 0,001)
10-7
0 (± 0) 0,002 (± 0,001)
10-8
0 (± 0) 0,002 (± 0,001)
10-9
0 (± 0) 0,00090 (± 0,00040)
48
Es bestand, wie in Abbildung 9 gezeigt, eine signifikante Korrelation zwischen der
Menge an nachgewiesenen viablen P. aeruginosa Zellen durch die Bakterienkultur und
der mittels qPCR Assay gemessenen P. aeruginosa DNS Menge.
Abbildung 9: Korellation P. aeruginosa qPCR Assay mit Drei-Ösen-Ausstrichen in vitro Korrelation der Konzentration an P. aeruginosa DNS (ng/Rx), gemessen durch den qPCR Assay, mit den
semi-quantitativen Ergebnissen, ermittelt durch Drei-Ösen-Ausstriche, anhand von 3 unabhängigen
Monokulturen von P. aeruginosa. Gezeigt sind die Regressionsgerade (Spearman
Korrelationskoeffizient r = 0,97, p < 0,0001) und zusätzlich das 95 % Konfidenzintervall.
4.5. Konzentration an humaner genomischer DNS in den
Sputumproben
Die Sputen von Patienten mit Mukoviszidose sind in ihrer Konsistenz insbesondere im
Hinblick auf die Viskosität, welche maßgeblich durch freie genomische DNS
beeinflusst wird, relativ heterogen. Daher wurde parallel zur Messung der bakteriellen
Belastung in den klinischen Proben mittels qPCR der Gehalt an humaner DNS
bestimmt. Diese Messwerte sollten zur Kontrolle dienen, ob und in welchem Maße der
Gehalt an humaner DNS einen Einfluss auf die P. aeruginosa Messung hat. Zudem
sollten die Daten im Hinblick auf die Frage analysiert werden, ob eine Beziehung
zwischen der Höhe des bakteriellen Loads und dem DNS-Gehalt des Sputums besteht.
Zur PCR basierten Quantifizierung der genomischen DNS wurde ebenfalls eine
Referenzstandardkurve ermittelt. Als Zielsequenz für die qPCR wurde das humane
IFN-α8 Gen verwendet. Dazu wurde eine dekadische Verdünnungsreihe mit
qP
CR
[n
g/R
x]
Kultur [rel. Einheiten]
0 + ++ +++
1000
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
49
genomischer DNS aus humanen Blutzellen über einen Konzentrationsbereich von 500
bis 5x10-3
ng/μl erstellt. Abbildung 10 zeigt das Ergebnis der ermittelten
Referenzstandardgerade, die auf gemittelten Messwerten aus 10 unabhängigen PCR
Durchläufen basiert.
Abbildung 10: Referenzstandardgrade mit Standardabweichungen für den IFN-α8 qPCR Assay Erstellung anhand von verdünnter genomischer DNS von 500 bis 0,05 ng/Reaktion und den Mittelwerten
von 10 unabhängigen Experimenten. Regressionslinie: f(x) = -1,5308ln(x) + 31,107.
In 91 Sputumproben wurde mittels Real-Time PCR Assay der Gehalt an humaner DNS
quantifiziert. Dazu wurde als Zielgen das humane IFN-α8 verwendet und anhand der
Referenzstandardkurve der Gehalt an Gesamt-DNS bestimmt. Die Daten der PCR-
Messungen ergaben, dass die Konzentrationen an humaner genomischer DNS in einem
Bereich von 22,1 bis 3204,3 ng/µl mit einem Mittelwert von 819,0 ng/µl
(Standardabweichung +/- 712,4 ng/µl) lagen. Die so ermittelten Werte wurden im
Anschluss mit den Ergebnissen des P. aeruginosa qPCR Assays korreliert. Im
Vergleich der Konzentrationen an humaner IFN-α8 DNS mit den enthaltenen Mengen
an P. aeruginosa DNS konnte ein niedriger, jedoch signifikanter Korrelationskoeffizient
aufgezeigt werden (Pearson Korrelationskoeffizient: r = 0,248, p = 0,018, Abbildung
11). Die Korrelation mit diesem sehr niedrigen Korrelationskoeffizienten ist fraglich.
Die Ergebnisse vermitteln eine variable Relation zwischen der humanen Zellzahl bzw.
Ct-
Wer
t
Log IFN-α8 DNS bezogen auf ng humane genomische DNS [ng/Rx]
50
freien genomischen DNS und der bakteriellen Belastung an P. aeruginosa im Sputum.
Der überwiegenden genomische DNS Gehalt streut zwischen 1 und 100 ng/µl.
Abbildung 11: Korrelation P. aeruginosa qPCR Assay mit genomischer DNS Korrelation der Konzentration an P. aeruginosa (ng/Rx), gemessen durch den qPCR Assay, mit der
Konzentration an genomischer DNS (ng/Rx), gemessen durch den IFN-α8 qPCR Assay. N = 91. Gezeigt
ist die Regressionsgerade (Pearson-Korrelationskoeffizient r = 0,248, p = 0,018) mit dem 95 %
Konfidenzintervall.
4.6. Vergleich des qPCR Assays mit der konventionellen Kultur
anhand von Sputumproben von CF-Patienten
Insgesamt 106 Sputumproben von 31 Mukoviszidose Patienten wurden vergleichend
mittels qPCR Assay (n = 91) und konventioneller Methode (n = 81) auf den Gehalt von
P. aeruginosa untersucht. Von 91 getesteten klinischen Proben mittels PCR wurden 59
positiv als P. aeruginosa identifiziert (64,84 %). Von den 81 klinischen Proben, die
mittels konventioneller Kultur untersucht wurden, waren 46 positiv (57 %). Von den
Sputen wurden 66 Proben parallel mittel PCR und konventioneller Kultur getestet. Von
diesen Proben ergaben 46 einen positiven P. aeruginosa Nachweis in der PCR und 40
Proben einen positiven P. aeruginosa Nachweis in der Kultur. Bei der vergleichenden
Analyse aller positiven und negativen P. aeruginosa Testungen aus beiden
angewendeten Methoden über eine Vierfeldertafel lässt sich bezogen auf die
P.
aer
ugin
osa
lo
g D
NS
[n
g/R
x]
Log IFNα8 DNS bezogen auf ng humane genomische DNS [ng/Rx]
1000
100
10
1 0,1 0,01 0,001 10
10000
100
51
konventionelle Methode als Goldstandard in der Diagnostik eine Sensitivität des qPCR
Assays von 100 % und eine Spezifität von 79 % ableiten (Tabelle 8). Die bei der
direkten Gegenüberstellung auffallende, geringere Spezifität der PCR ergibt sich
dadurch, dass 6 Proben in der konventionellen Methode, die als Goldstandard
hinzugezogen wurde, einen negativen Befund aufwiesen, während diese in der qPCR
einen positiven Nachweis für P. aeruginosa erbrachten. Von diesen diskrepanten
Proben weisen 5 nur einen sehr niedrigen Gehalt an P. aeruginosa auf. Diese
Beobachtung legt nahe, dass die positiven Befunde nicht falsch positiv sind, sondern
dass der PCR Assay noch P. aeruginosa detektiert, das nicht mehr in der Kultur zu
messen ist. Somit liegt tatsächlich eine höhere Sensitivität des qPCR Assays im
Vergleich zur konventionellen Methode vor.
Tabelle 8: Vierfeldertafel
Vierfeldertafel des positiven (pos.) und negativen (neg.) Nachweises von P. aeruginosa in 66
Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose, ermittelt anhand der konventionellen Methode und des
qPCR Assays. In Prozent angegeben sind die Anteile, in denen die Proben positiv bzw. negativ mit der
jeweiligen Methode gemessen wurden.
Kultur
pos. neg.
qPCR pos. 38 6 44 (86 %)
neg. 0 22 22 (100 %)
38
(100 %)
28
(79 %)
66
Alle Einzelergebnisse der Sputumproben, die mittels qPCR und konventioneller
Methode analysiert wurden, sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Dabei wurden die
Ergebnisse der Patientensputen in 4 Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe beinhaltete
die Patienten, deren Sputumproben mit beiden Methoden stets einen negativen Befund
für P. aeruginosa vorwiesen. Zu dieser Negativ-Level Gruppe zählten acht Patienten
(26 % aller Patienten). Die Niedrig-Level Gruppe beinhaltete alle diejenigen Patienten,
die keinen oder nur einfach positive Befunde für P. aeruginosa in der Kultur und/oder
einen positiven Nachweis mittels qPCR Assay bei mindestens einer der vier klinischen
Visiten vorzuweisen hatten. Zu dieser Gruppe zählten sieben Patienten (23 %). Vier
Patienten (13 %) gehören zu der Mittel-Level Gruppe, die immer einen positiven
Nachweis in der Kultur und PCR hatten und mindestens einen zweifach positiven Wert
52
in der konventionellen Methode in einer der vier klinischen Visiten aufwiesen. Zwölf
Patienten (39 %) befanden sich schließlich in der Hoch-Level Gruppe, die durch
mindestens einen dreifach positiven Befund in der konventionellen Kultur in einer der
vier klinischen Visiten gekennzeichnet waren.
In der Studiengruppe zeigten die Patienten einen relativ konstanten Verlauf. 8 Patienten
wiesen stets negative Ergebnisse auf. In der Niedrig-Level Gruppe mit keinem oder nur
einfach positivem Befund in der Kultur zeigten sich v. a. sehr niedrige Ergebnisse in der
PCR. Ein Patient, der zunächst negativ in der Kultur, jedoch positiv in der PCR war,
wies schließlich auch einen einfach positiven Befund in der letzten Visite in der Kultur
auf. Hier liegt eventuell die Detektion einer sehr frühen Phase einer beginnenden
Besiedlung vor. Auch in der Mittel-Level Gruppe waren die PCR Ergebnisse eher
niedrig. In der Hoch-Level Gruppe wiesen die Patienten überwiegend dreifach positive
Befunde in der Kultur auf. Nur 2 Patienten in diese Gruppe wurden in einer Visite im
Verlauf einfach positiv getestet.
Auch wenn die Ergebnisse, die mit der qPCR ermittelt wurden, individuell zwischen
den Patienten variierten, lagen die qPCR und Kulturergebnisse für einen Patienten in
einem engen Rahmen. Es konnte in unserer Studiengruppe gezeigt werden, dass eine P.
aeruginosa Infektion vorlag oder nicht, und wir selten den Beginn einer neuen Infektion
detektierten.
53
Tabelle 9: Nachweis von P. aeruginosa mittels konventioneller Methode und qPCR Assay über die
Zeit Vergleich des Nachweises von P. aeruginosa in Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose (n =
106) mit der konventionellen Methode und dem qPCR Assay über die Zeit. Die Kultur Ergebnisse sind
semi-quantitativ dargestellt (0, +, ++, +++), die qPCR Ergebnisse sind berechnet als P. aeruginosa DNS
in ng/Rx Proben. Die nur in einer Methode positive Befunde aufweisen sind eingerahmt. Leere Felder =
nicht durchgeführt.
Besuch 1 Besuch 2 Besuch 3 Besuch 4 Nr. Alter qPCR Kultur qPCR Kultur qPCR Kultur qPCR Kultur
Negativ-Level 1 22 0 0 0 0 0 0
2 18 0 0 0 0 0 0 0
3 17 0 0 0 0 0 0
4 38 0 0 0
5 16 0 0 0 0
6 25 0 0 0 0 0 0
7 12 0 0 0 0 0 0 0 0
8 17 0 0 0 0
Niedrig-Level
9 17 0,0034 0 0
10 27 0 0 0,0029 0,0005 + 0 0
11 24 0 0 0 0 0 0 1,5225 +
12 18 0,0012 0 0 0 0 0 0,0624 +
13 20 4,8607 0 1,0642 0,8367
14 12 0,0147 0 0,0165 0 0 0
15 19 3,0282 +
Mittel-Level 16 30 + 1,6254 ++
17 32 0,9762 + 1,7765 ++ 1,0559 + 2,1613 +
18 23 3,2582 ++ 2,0728 ++ 1,3500 + 6,4633 ++
19 16 9,3199 ++ 21,2913 + 7,9253 + +
Hoch-Level 20 15 4,5413 +++
21 32 +++ 9,3933 +++ +
22 19 10,1597 +++ 18,1054 +++ 28,9099 +++
23 22 13,2300 + 18,3916 +++
24 41 4,9246 ++ 7,4239 ++ 3,8016 +++
25 26 44,0400 +++ 48,3863 +++ 68,1491 +++ 62,3529
26 25 5,6565 +++ 3,5985 7,8429 9,6170 0
27 42 8,8915 +++ 4,9764 4,6615 4,6615 +++
28 38 13,2646 +++ +++
29 13 18,9282 +++ 6,6868 4,2874 2,5021 ++
30 9 0,0794 +++ 3,8016 0,4634 12,5560 +++
31 12 0,1455 + 17,2280 +++ 16,9599 ++ 33,6434 +
Die gemessenen Konzentrationen an P. aeruginosa DNS in den Sputen korrelierte
signifikant (Spearman Korrelationskoeffizient r = 0,84, p < 0,0001) mit den durch die
konventionelle Kultur ermittelten semi-quantitativen Mengen an P. aeruginosa
(Abbildung 12). Die klare Korrelation der Ergebnisse beider Methoden belegt eindeutig,
54
dass die qPCR Methodik in der Lage ist den Gehalt an P. aeruginosa in den Sputen
quantitativ zu erfassen und im direkten Vergleich zum Goldstandard der Kultur auch
korrekt abzubilden. Zudem weisen die teils positiven PCR Ergebnisse bei negativen
Kulturergebnissen auf eine höhere Sensitivität der PCR-Methodik hin. Im Gegensatz
zur Kulturmethode können auch nicht viable Bakterien mit in die Detektion einbezogen
werden und so möglicherweise schon geringste Besiedelungen in einem frühen Stadium
detektieren. Die hier dargestellten Daten zeigen, dass der neu etablierte qPCR Assay in
einem klinischen Setting im Vergleich zur konventionellen Kultur als Goldstandard
hoch sensitiv ist.
Abbildung 12: Korrelation P. aeruginosa qPCR Assay mit Drei-Ösen-Ausstrichen anhand von
Sputumproben
Korrelation der Konzentration an P. aeruginosa DNS (ng/Rx), gemessen durch den qPCR Assay, mit den
semi-quantitativen Ergebnissen, ermittelt durch Drei-Ösen-Ausstriche, anhand von klinischen
Sputumproben. Gezeigt sind die Regressionsgerade (Spearman Korrelationskoeffizient r = 0,84,
p < 0,0001) und das 95 % Konfidenzintervall.
4.7. Bezug der Ergebnisse des qPCR Assays und der konventionellen
Kultur auf die erhobenen klinischen Daten
Zur Analyse und Interpretation der gemessenen P. aeruginosa Belastungen mittels der
qPCR und mikrobiologischer Kulturmethodik im Hinblick auf eine klinische Relevanz
wurden die Ergebnisse mit den erhobenen klinischen Daten in Beziehung gesetzt. Dabei
war eine Fragestellung, inwieweit die Menge an P. aeruginosa mit klinischen Markern
wie z. B. Lungenfunktionsparametern oder laborchemischen Parametern wie dem CrP-
qP
CR
[n
g/R
x]
Kultur [rel. Einheiten]
0 + ++ +++
1000
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
55
Wert als Entzündungsmarker korrelierten. Das Patientenkollektiv bildeten 31
sputumproduzierende, nicht hospitalisierte Mukoviszidose Erkrankte im Alter von 8 bis
43 Jahren. Das mittlere Lebensalter der Studiengruppe betrug 23,1 Jahre (+/- 8,9). Eine
Übersicht der klinischen Daten ist im Anhang (Tabelle A) zusammengestellt.
Gewicht, Größe sowie die Blutparameter CrP und Leukozyten korrelierten nicht mit der
gemessenen Menge an P. aeruginosa. Dabei war es nicht relevant, welche Methodik zur
Quantifizierung der P. aeruginosa Belastung angewandt wurde. Allerdings bestand eine
positive Korrelation zwischen der Menge an P. aeruginosa, ermittelt durch die
konventionelle Kultur und dem Patientenalter (siehe Abbildung 13, Spearman
Korrelation).
Abbildung 13: Korrelation Alter der Patienten mit Drei-Ösen-Ausstrichen Korrelation der semi-quantitativen Werte für vitale P. aeruginosa (0,+,++,+++ mittels konventioneller
Methode) mit dem Alter der Patienten (in Jahren). N = 80. Gezeigt ist die Regressionsgerade (Spearman
Korrelationskoeffizient: r = 0,26, p = 0,0186).
Es konnte jedoch keine signifikante Korrelation zwischen dem Alter der Patienten und
der Menge an P. aeruginosa festgestellt werden, sofern diese mittels des qPCR Assays
quantifiziert wurde (siehe Abbildung 14).
0 1 2 3 40
10
20
30
40
50
Pseudomonas aeruginosa DNA [ng]
Ag
e [
years
]A
lter
[Jah
re]
0 + ++ +++
40
30
20
10
0
Kultur [rel. Einheiten]
56
Abbildung 14: Korrelation Alter der Patienten mit P. aeruginosa qPCR
Korrelation der Konzentration an P. aeruginosa DNS (ng/Rx), ermittel mittels qPCR Assay, mit dem
Alter der Patienten (in Jahren). N = 66. Gezeigt ist die Regressionsgerade (Pearson
Korrelationskoeffizient: r = 0,03, p = < 0,7979).
Zudem zeigte sich interessanterweise eine schwach positive Korrelation zwischen der
Menge an humaner genomischer DNS im Sputum und dem Entzündungsparameter CrP
im Serum der Patienten (siehe Abbildung 15).
Abbildung 15: Korrelation CrP-Wert mit genomischer DNS
Korrelation der Konzentration an genomischer DNS (ng/Rx), gemessen durch den IFN-α8 qPCR Assay,
und dem Entzündungsparameter CrP im Blut. N = 42. Gezeigt ist die Regressionsgerade (Spearman
Korrelationskoeffizient r = 0,4152, p = 0,0063).
Alt
er [
Ja
hre
]
qPCR [ng/Rx]
57
Somit geht eine erhöhte Zellzahl als Quelle der DNS im Sputum mit einer im Blut
nachweisbaren Inflammation einher.
Bezüglich der erfassten Lungenfunktionsparameter konnte keine signifikante Beziehung
zwischen dem FEV in der ersten Sekunde (FEV1) und der bakteriellen Belastung der
Sputumproben festgestellt werden. Bemerkenswert ist, dass jedoch eine negative
Korrelation zwischen dem Lungenfunktionsparameter der forcierten exspiratorischen
Vitalkapazität FVC (l) und der Konzentration an P. aeruginosa sowohl für die
Messwerte der konventionellen Kultur (Spearman Korrelationskoeffizient: r = -0,38, p =
0,0005, Abbildung 16) als auch für die der PCR (Spearman Korrelationskoeffizient: r =
-0,46, p = < 0,0001, Abbildung 17) vorliegt.
Abbildung 16: Korrelation Drei-Ösen-Ausstriche mit FVC Korrelation der semi-quantitativen Werte für vitale P. aeruginosa (0,+,++,+++ mittels konventioneller
Methode) mit der forcierten exspiratorischen Vitalkapazität (FVC in Litern). N = 81. Gezeigt sind die
Regressionsgerade (Spearman Korrelationskoeffizient: r = -0,38, p = 0,0005) und das 95 %
Konfidenzintervall.
58
Abbildung 17: Korrelation P. aeruginosa qPCR mit FVC Korrelation der Konzentration an P. aeruginosa DNS (ng/Rx), ermittelt mittels qPCR Assay, mit der
forcierten exspiratorischen Vitalkapazität (FVC in Litern). N = 91. Gezeigt sind die Regressionsgerade
(Spearman Korrelationskoeffizient: r = -0,46, p = < 0,0001) und das 95 % Konfidenzintervall.
Beide Messmethoden für die Quantifizierung der P. aeruginosa Belastung kommen hier
zu vergleichbaren Ergebnissen. Mit Zunahme der bakteriellen Belastung kommt es zu
einer messbaren Verschlechterung der Lungenfunktion in Bezug auf die forcierte
exspiratorische Vitalkapazität FVC (l); das bedeutet, dass bei Patienten mit
Mukoviszidose das FVC als ein Parameter für die bronchiale Zerstörung in Beziehung
zu einer Infektion an P. aeruginosa steht und diese wiederum schwach mit einer
zunehmenden bakteriellen Belastung korreliert.
59
5. Diskussion
P. aeruginosa ist das bedeutendste Pathogen im Rahmen der Lungenerkrankung bei
Patienten mit Mukoviszidose. Eine Besiedlung und insbesondere die chronische
Infektion der Atemwege gehen aufgrund der progressiven Verschlechterung der
Lungenfunktion mit einer signifikant erhöhten Mortalität und Morbidität einher
(Deschaght et al., 2009). In der chronischen Phase der Erkrankung, in der v. a. die
mukoide Form des Bakteriums und variable Phänotypen dominieren, ist eine
vollständige Elimination des Bakteriums kaum noch möglich. Daher ist die sensitive
Detektion von P. aeruginosa z. B. durch molekularbiologische Verfahren wie der
quantitativen Real-Time PCR von höchster Bedeutung. Eine sehr sensitive
Detektionsmöglichkeit schon von geringsten Keimzahlen kann zu einer frühzeitigen
Einleitung einer aggressiven Therapie führen, die v. a. bei Erstbesiedlung und Infektion
zur Verhinderung einer Chronifizierung von entscheidender Bedeutung ist (Koch, 2002;
Frederikson et al., 1997; Valerius et al., 1996; Deschaght et al., 2010).
Um dieses Ziel auch unter klinischen Gegebenheiten praktikabel zu machen, wurde in
dieser Arbeit ein neuer quantitativer Real-Time PCR Assay zur Identifikation und zum
hoch sensitiven quantitativen Nachweis von P. aeruginosa im Sputum von Patienten
mit Mukoviszidose etabliert und anschließend evaluiert. Zum ersten Mal wurde dieser
Assay ex vivo wie auch in vitro mit semi-quantitativen Ergebnissen der konventionellen
Kultur verglichen, die seit Jahren die Standardmethode zum Nachweis von P.
aeruginosa darstellt (Monroe et al., 1969).
5.1. Molekulare Nachweisverfahren von P. aeruginosa in Bezug zum
neuen etablierten qPCR Assay
Insbesondere im letzen Jahrzehnt wurden zahlreiche Assays unter Zuhilfenahme der
Polymerase-Kettenreaktion als molekulare DNS Amplifikationsmethoden zum
Nachweis von P. aeruginosa in respiratorischen Proben etabliert (Anuj et al., 2009;
Deschaght et al., 2009; Deschaght et al., 2010; Jaffe et al., 2001; Karpati and Jonasson,
1996; Lavenir et al., 2007; McCulloch et al., 2010; van Belkum et al., 2000; Xu et al.,
2004; Zermanick et al., 2010). Bisher testeten bereits mehrere Gruppen unterschiedliche
Primer hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität. Dabei wurden bislang zehn
verschiedene Gene oder genomische Abschnitte als Zielsequenzen getestet: gyrB, toxA,
60
ETA, oprL, oprI, fliC, ecfX, algG, 16S rRNS, sowie der intern transkribierte 16S-23S
rDNS Spacer (ITS).
Bis auf die Verwendung der fliC Gen PCR, die falsch positive Ergebnisse für diverse
Pseudomonaden, ausgenommen P. fluoreszens und P. chlororaphis erbrachte, und
originär allerdings eingesetzt wurde, um die genetische Vielfalt des Flagellins in P.
aeruginosa CF-Isolaten zu untersuchen und nicht P. aeruginosa selbst unter
verschiedenen Pathogenen zu detektieren, wiesen die meisten PCR Assays hohe
Spezifitäten für P. aeruginosa auf, wobei für die Spezifität der Assays jeweils
unterschiedliche Bakterienstämme als Spezifitäts-Kontrollen getestet wurden
(Deschaght et al., 2011; Lavenir et al., 2007; Spangenberg et al., 1996). In der
vorliegenden Arbeit wurde u. a. P. putida gewählt, der eine 85 % genomische
Sequenzhomologie zu P. aeruginosa aufweist (Wu et al., 2011).
Die überwiegende Anzahl der Assays wies eine höhere Sensitivität gegenüber der
konventionellen Kultur auf. Nicht alle publizierten PCR Assays waren quantitativer
Natur, sondern wurden als konventionelle PCR durchgeführt und lieferten somit nur ein
positiv/negativ Ergebnis in Bezug auf das Vorhandensein von P. aeruginosa.
Interessanterweise wurden in den meisten Studien Proben mit P. aeruginosa negativen
Ergebnissen in der PCR und positiven Ergebnissen in der konventionellen Kultur
ermittelt. Daraus wurde abgeleitet, dass eine maximale Sensitivität nur durch eine
Kombination von Kultur und PCR erreicht werden könne (Deschaght et al., 2011;
Doring et al., 2008). In dieser Arbeit lag die Sensitivität des PCR Assays auch im
klinischen Setting bei 100 %.
Bereits 1996 etablierten Karpati und Jonasson einen PCR Assay mit drei Primerpaaren
für P. aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia und Burkholderia cepacia bei CF-
Patienten, der auf der Detektion der spezies-spezifischen bakteriellen 16S rRNS
Sequenz basierte. Mittels dieser Methodik wurden für den Nachweis von P. aeruginosa
eine Sensitivität von 93 % und eine Spezifität von 90 % erreicht. Die falsch-positiven
Ergebnisse wurden auch hier in Frage gestellt. Es wurde postuliert, dass der
Bakteriengehalt des zähen Sputums bei CF-Patienten aufgrund von Mikrokolonien sehr
heterogen sei und somit einen Nachteil für die kulturelle Anzüchtung darstelle, so dass
ein Vorteil hinsichtlich eines Nachweises von P. aeruginosa mittels des PCR Assays
im Sputum von CF-Patienten propagiert wurde (Karpati and Jonasson, 1996).
61
2001 wurde von Jaffe und Mitarbeitern ein Standard PCR Assay und ein quantitativer
Real-Time PCR Assay mit Primern basierend auf dem universalen bakteriellen 16S
rRNS Gen und zusätzlich unter Einbeziehung der P. aeruginosa spezifischen orpL
Sequenz entwickelt (Jaffe et al., 2001). Getestet wurden 40 klinische P. aeruginosa und
18 klinische nicht - P. aeruginosa Isolate, die allesamt aus Blutkulturflaschen isoliert
wurden. Jede der 40 P. aeruginosa Proben zeigte ein positives DNS Produkt in der
Agarose-Gelelektrophorese für das oprL sowie das 16S rRNS Gen. Somit zeigten sich
eine Sensitivität und Spezifität von 100 % für das oprL Gen im Standard Assay, die im
Real-Time PCR Assay bestätigt wurden. In der Real-Time PCR wurde der
interkalierende Farbstoff SYBR Green™ verwendet, der jedoch nicht sequenz-
spezifisch ist. Der Farbstoff lagert sich zwischen den Nukleotidbasen des Amplicons ein
und fluoresziert nach Anreicherung mit UV-Licht (Bustin, 2000). Interessanterweise
zeigten in der Schmelzpunktanalyse auch nicht P. aeruginosa Isolate Schmelzpunkt-
Temperaturen, die jedoch nicht im P. aeruginosa spezifischen Bereich lagen. Daher ist
dieser doppelsträngige DNS Farbstoff, wie von der Arbeitsgruppe selbst postuliert wird,
für den klinischen Alltag wohl nicht zuverlässig genug (Jaffe et al., 2001). Für unsere
Real-Time PCR wurde eine spezifische TaqMan Sonde etabliert, die sich in der
gewählten Konzentration gut von der Hintergrund-Fluoreszenz abhebt und in vitro wie
auch im klinischen Setting eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweist.
2003 publizierte Qin mit seiner Arbeitsgruppe einen quantitativen Real-Time PCR
Assay mit multiplen genetischen Zielen. Es wurden parallel die gyrB, oprL, Exotoxin A
und algD Gene getestet. Die PCR mit dem oprL Gen als Zielsequenz wies die beste
Kombination aus Sensitivität (98,4 %) und Spezifität (98,9 %) auf. In dieser Studie
wurde geschlussfolgert, dass ein genetisches Ziel nicht ausreichend sei. Obwohl das
gesamte Genom von P. aeruginosa sequenziert worden ist, seien es die von nah
verwandten Organismen noch nicht, so dass inter- und intraspezifische Polymorphismen
in diesen Genen nicht ausgeschlossen werden könnten (Qin et al., 2003).
Sequenzvariationen aufgrund der hoch polymorphen Natur von P. aeruginosa könnten
ebenfalls einen negativen Einfluss auf Assays nehmen, die auf dem toxA und algD Gen
basieren (Qin et al., 2003).
Da falsch positive Ergebnisse mit oprL und 16S rRNS Genen, wie auch falsch negative
Ergebnisse mit dem algG und toxA Gen gesehen wurden, war das Ziel dieser Arbeit
einen PCR Assay mit Primern zu etablieren, der die bisherigen Defizite in der spezies-
62
spezifischen Detektion von P. aeruginosa schließt (Anuj et al., 2009; Cattoir et al.,
2010; Lavenir et al., 2007).
Lavenir und Mitarbeiter veröffentlichten 2007 eine Studie zum ecfX Gen und
beschrieben einen neuen PCR Assay (nicht quantitativ), der sich als zuverlässig für den
Nachweis von P. aeruginosa erwies (Lavenir et al., 2007). Des Weiteren verfügte der
Assay über eine hohe Spezifität bei der Abgrenzung gegenüber anderen
Pseudomonaden. Dennoch existierten bis dato wenige überzeugende Studien über den
Assay. Das Ziel dieser hier vorliegenden Arbeit war es, im Sputum von CF-Patienten
einen quantitativen Real-Time PCR Assay mit ebenso verlässlichen Eigenschaften für
den Nachweis von P. aeruginosa zu etablieren.
Anuj et al. veröffentlichten 2009 eine Studie zur Etablierung und Evaluation einer
duplex Real-Time PCR mit dem ecfX und gyrB Gen von P. aeruginosa als genetische
Ziele, um eine Verbesserung der Sensitivität im Sinne einer Reduktion falsch-negativer
Ergebnisse aufgrund von Sequenzvariationen in einem P. aeruginosa Isolat zu erreichen
und gleichzeitig die positiven Ergebnisse zu bestätigen (Anuj et al., 2009).
In unserer Studie wurden keine falsch-negativen Ergebnisse erzielt. Die Sensitivität im
Rahmen der klinischen Proben lag mit unserem Assay (ecfX Gen als Target) bei 100 %.
Nicht völlig auszuschließen ist, dass weitere erst zukünftig identifizierbare Erreger von
diesem Assay mitdetektiert wurden.
Die von Cattoir et al. 2010 publizierten Daten eines weiteren quantitativen Real-Time
PCR Assays für den Nachweis von P. aeruginosa in Blutkulturen, ebenfalls auf dem
ecfX Gen basierend, bestätigen die Verlässlichkeit dieses Gens in einem anderen
Einsatzbereich (Cattoir et al., 2010).
Wie bereits in den PCR Studien von Cattoir und Lavenir beschrieben, ist das ecfX Gen
ein verlässliches genetisches Ziel für den Nachweis von P. aeruginosa. Der eigene
Real-Time PCR Assay und die mit ihm erhobenen Daten belegen, dass unter den
gewählten PCR-Bedingungen das Target Gen ecfX ausreichend ist, um hoch spezifisch
P. aeruginosa zu detektieren und auch von sehr nahe verwandten Arten abzugrenzen.
Die erzielte Sensitivität ist dabei mindesten genauso hoch wie beim Goldstandard der
Kultur und in Teilen noch darüber hinausgehend, weil mit dem PCR Assay auch nicht
viable Bakterienanteile nachgewiesen werden können. Wie bei den meisten Studien, die
die Sensitivität und Spezifität von Kultur und PCR für den Nachweis von P. aeruginosa
verglichen und neben der Etablierung des PCR Assays auch unter realen klinischen
Bedingungen Patientenproben testeten, handelt es sich in dieser Arbeit um eine
63
Querschnittstudie (Deschaght et al., 2011). Jedoch wurde erstmalig der PCR Assay ex
vivo als auch in vitro bezüglich der Quantität an nachgewiesener Bakterienlast mit der
konventionellen Kultur verglichen.
5.2. Vorteile und Nachteile im Nachweis von P. aeruginosa mittels
PCR gegenüber der konventionellen Kultur
Auch wenn seit den 90er Jahren verschiedene Ansätze genetischer Nachweismethoden
entwickelt wurden, hat sich im klinischen Alltag noch keine dieser PCR-basierten
Nachweismethoden für P. aeruginosa im Sputum von CF-Patienten durchgesetzt. Das
mag an Bedenken vor ineffizienten Kosten oder noch nicht ausreichender klinischer
Evaluation und Validation liegen. Des Weiteren bleibt die konventionelle Kultur
essentiell für die Testung von Antibiotikaresistenzen (Saiman and Siegel, 2004; Qin et
al., 2003). Wünschenswert sind genetische Marker für Antibiotikaresistenzen des P.
aeruginosa, die per PCR zu messen sind.
Faktisch liegt mit der PCR eine schnelle und relativ kostengünstige Methode vor, die
sich in den letzten Jahren mehr und mehr zu einer standardisierten Methodik etabliert
und vermehrt Einzug in den klinischen Alltag gefunden hat. Insbesondere ein sehr
frühzeitiger Nachweis kann bei hospitalisierten Patienten von großer Bedeutung sein, da
bei schnellem Nachweis bzw. Ausschluss von P. aeruginosa eine effektive
Kohortierung stattfinden kann. Da die PCR-Methodik zudem objektiv ist, weil das
Ergebnis keiner menschlichen Interpretation bedarf, können Nachweisfehler vermieden
werden, wie sie bei der konventionellen Methode auftreten können (Williams et al.,
2010). Ein großer Vorteil einer molekulargenetischen Methode kann zusätzlich im
Nachweis klonaler P. aeruginosa Bakterienstämme liegen, wie z. B. dem Liverpool P.
aeruginosa sowie dem australischen epidemischen Stamm, was mit der konventionellen
Methode nicht möglich ist (Deschaght et al., 2011; Panagea et al., 2003; Williams et al.,
2010). Eine klinische Relevanz liegt auch hier in der frühzeitigen Kohortierung der
Patienten und deren Therapie nach raschem Nachweis oder Ausschluss dieser hoch
virulenten und ansteckenden Bakterien.
5.3. Spezifität und Sensitivität des etablierten qPCR Assays
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der neu etablierte qPCR Assay hoch
spezifisch ist. Genetisch sehr nahe verwandte Bakterien wie P. putida und
64
Stenotrophomonas maltophilia, die ebenfalls häufig im Sputum von CF-Patienten
präsent sind, werden nicht detektiert. Weitere seltenere phänotypische und biochemisch
ähnliche Erreger, die eine noch nicht geklärte klinische Relevanz für CF-Patienten
aufweisen, wie z. B. Ralstonia picketti, Ralstonia mannitolytica, Achromobacter
xylosoxidans, könnten noch getestet werden. Nicht gänzlich ausgeschlossen werden
kann, dass andere noch nicht identifizierte Pathogene mit dem qPCR Assay
fälschlicherweise positive Ergebnisse für P. aeruginosa liefern.
Die in dieser Arbeit etablierte PCR detektierte P. aeruginosa in vitro anhand einer
Monokultur mit einer hundertfach höheren Sensitivität im Vergleich zur
konventionellen Kultur. Das könnte daran liegen, dass mit der molekularbiologischen
Methode im Gegensatz zur mikrobiologischen Kultur nicht nur viable Bakterien,
sondern zusätzlich auch DNS Fragmente aus abgestorbenen oder nicht mehr
wachstumsfähigen Zellen nachgewiesen werden können. Insbesondere während des
exponentiellen Wachstums der Keime, z. B. in Monokulturen, nimmt die
Widerstandskraft der Bakterien gewöhnlich ab und es kommt zu einem vermehrten
Absterben der Zellen. Ein weiterer Faktor, der die höhere Sensitivität der PCR erklären
kann, ist der Effekt der sogenannten „limited dilution“. Theoretisch lässt sich mittels der
Bakterienkultur ein einzelnes viables Bakterium in der aufgetragenen Probe noch
nachweisen. In der Praxis allerdings führt bei sehr niedrigen bakteriellen
Konzentrationen die statistische Streuung dazu, dass man Mehrfachbestimmungen
benötigt, um eine positive Probe zu erhalten. Zwar gibt es den Effekt der „limited
dilution“ auch bei der PCR-Methodik, allerdings tritt er bei effizienten PCR-Reaktionen
normalerweise erst bei deutlich höheren Verdünnungen ein.
Interessanterweise wurden die meisten positiven Sputumproben im qPCR Assay, die
jedoch negativ im Nachweis mittels der konventionellen Kultur waren, bei den
Patienten mit Mukoviszidose in der Niedrig-Level Gruppe gefunden. Es liegt nahe, dass
mit einem molekularbiologischen Nachweis wie dem qPCR Assay eine niedrigste
bakterielle pulmonale Besiedelung sehr sensitiv zu detektieren ist. Damit stellt der
qPCR Assay eine hilfreiche Methode für den frühen Nachweis von P. aeruginosa bei
nicht chronisch infizierten Patienten dar, wie bereits von Deschaght und seinen
Mitarbeitern dargestellt wurde (Deschaght et al., 2011).
65
5.4. Sputum als geeignetes Probenmaterial
In der hier vorgestellten Studie wurde induziertes Sputum als respiratorisches
Atemwegssekret gewählt, durch das sich der Besiedlungszustand durch Pathogene in
der Lunge der Patienten abbilden lässt.
Es ist einfach, schnell und aufgrund der wenigen verwendeten Materialien (Vernebler,
steriles Auffanggefäß) kostengünstig zu gewinnen. Wichtig für die Akzeptanz der
Analyse im klinischen Alltag und beim Patienten ist die unproblematische und wenig
belastende Gewinnung des Probenmaterials. Dies ist beim Sputum gegeben. Kinder mit
Mukoviszidose werden bereits im jungen Alter angelernt suffizient Sputum zu
produzieren, da die Mobilisation des Sputums eine wichtige Rolle in der Atemtherapie
spielt. Dennoch ist man bei Kleinkindern auf deren Compliance angewiesen und es gibt
immer wieder Patienten, die keinen Auswurf produzieren können.
Interessanterweise konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass es für den sicheren
quantitativen Nachweis von P. aeruginosa mittels PCR keinen Unterschied macht, zu
welchem Zeitpunkt das induzierte Sputum gesammelt wurde. Hinsichtlich der
gemessenen Menge an P. aeruginosa des nach einer Inhalation von 10 und 15 Minuten
gewonnenen Sputums für die PCR zeigte sich eine hohe Korrelation zu den Ergebnissen
der Kultur, für die 5-Minuten-Sputum verwendet wurde. Das zeigt, dass die Messung
der bakteriellen Belastung von P. aeruginosa im Sputum eine stabile, reproduzierbare
Methode für den klinischen Alltag darstellt. In einer kürzlich publizierten Studie konnte
diese Beobachtung verifiziert werden. Rogers et al. konnten zeigen, dass die bakterielle
Belastung in spontanen Sputumproben mit denen, die mittels sukzessiver Induktion
durch Salbutamol oder hypertoner Kochsalzlösung gewonnen wurden, vergleichbar ist
(Rogers et al., 2010). Somit stellt sich die Frage, ob spontane Sputumproben dem
induzierten Sputum vorzuziehen sind.
Die Lagerung und Asservierung des gefrorenen Sputums für spätere
molekularbiologische Untersuchungen ist problemlos und bietet den Vorteil gegenüber
der Kultur, dass die Probe nicht unmittelbar in Kultur genommen werden muss, um
verfälschte Ergebnisse (zu hoch durch lange ungekühlte Lagerung oder zu niedrig durch
überlange Lagerung) zu verhindern.
Die hier in der Arbeit gängige Homogenisierung des Sputums durch DTT und die für
die PCR-Analytik optimierte DNS-Extraktion haben sich als geeignet für die
Untersuchung erwiesen, und es konnte schon aus geringen Sputummengen (100 µl) mit
66
wechselnder Zähigkeit des Material zuverlässig und reproduzierbar, nicht zuletzt durch
die Verwendung eines kommerziellen Extraktionskits, die DNS für die Untersuchungen
isoliert werden.
Die Vorbehandlung der DNS mit Proteinase K, die der DNS Extraktion vorausgeht,
wirkt sich, wie bereits in einer Studie bestätigt, positiv bezüglich einer Erhöhung der
Menge an bakterieller DNS für einen sensitiven DNS Nachweis aus (Deschaght et al.,
2009).
Insgesamt zeigt sich, dass Sputum von CF-Patienten ein geeignetes Untersuchungsgut
für den Nachweis ist und somit auch für den klinischen Routinealltag einfach zu
gewinnen ist.
5.5. Detektion beginnender Infektionen
In dieser Studie zeigte sich, dass in der gewählten Studiengruppe die meisten Patienten
(55 %) konstant von P. aeruginosa besiedelt waren (positiv in PCR und Kultur). Der
geringere Teil der Patienten (26 %) wies sowohl in der PCR als auch in der Kultur über
den gesamten Beobachtungszeitraum komplett negative Ergebnisse auf. Das mag an der
Tatsache liegen, dass eine neue Infektion der oberen und unteren Luftwege ein
Ausschlusskriterium für die Studienteilnehmer darstellte. Daher konnten nur drei
Patienten mit einer möglichen beginnenden und klinisch inapparenten Infektion
identifiziert werden, die mit der konventionellen Kulturmethode nicht zu detektieren
waren. Für diese drei Patienten ist zu vermuten, dass die PCR eine beginnende Infektion
mit P. aeruginosa einige Wochen früher als die Kultur angezeigt hat. Allerdings ist
diese Anzahl an Patienten zu gering, um daraus einen generellen Trend der PCR im
Hinblick auf eine frühzeitige Infektionsdetektion ableiten zu können.
5.6. Korrelation der bakteriellen Belastung in Sputumproben mit
dem Alter und der Lungenfunktion der Patienten
Zusätzlich zur Korrelation des neuen PCR Assay und der konventionellen Kultur wurde
im Gegensatz zu bereits publizierten Arbeiten die Menge an bakterieller Belastung der
Sputumproben mit klinischen Daten der Patienten (Alter, Lungenfunktion,
Laborparameter) korreliert. In der in dieser Arbeit untersuchten Studiengruppe
korrelierte die bakterielle Belastung mit P. aeruginosa, die mittels konventioneller
Methode semiquantitativ ermittelt wurde, schwach mit dem Alter der Patienten. Diese
67
mit fortschreitendem Alter der Mukoviszidose-Patienten zunehmende bakterielle
Belastung mit P. aeruginosa bestätigt ein repräsentatives Patientenkollektiv (Cystic
Fibrosis Foundation, Anual Data Report, 2010). Auch heutzutage gibt es keine
monokausale Erklärung für die Präferenz des Bakteriums für das Lungengewebe von
CF-Patienten. Die mit dem Alter der Patienten zunehmende Konversion in mukoide
Stämme, die der körpereigenen Abwehr und einer antibiotischen Therapie schwer
zugänglich sind, zeigt die Signifikanz und die damit einhergehende Problematik des
Bakteriums auf. In der CF-Lunge, die sich durch Infektionen und Inflammation einem
ständigen Umbau unterzieht, scheint eine ständige Wirt- und Pathogeninteraktion
stattzufinden. Interessanterweise postulierten Aaron und seine Mitarbeiter, dass der
überwiegende Teil der Patienten einen initial akquirierten Stamm über die Zeit beibehält
und auch akute pulmonale Exazerbationen durch ein und denselben Stamm
hervorgerufen werden (Aaron et al., 2004). Eine kürzlich veröffentlichte retrospektive
Studie über einen Zeitraum von 30 Jahren bestätigt diese Ergebnisse. Wechsel klonaler
Stämme waren auch in dieser Studie eher selten und traten dann v. a. in den ersten zwei
Jahren der Kolonisation auf (Cramer et al., 2012). Sequenzierungen klonaler Stämme
sind erforderlich um die Persistenz des Bakteriums besser zu verstehen (Cramer et al.,
2012).
In dieser Arbeit bestand eine signifikante Korrelation mit dem Alter nicht, wenn die
Bakterienlast quantitativ mittels des qPCR Assays gemessen wurde (Pearson
Korrelation). Insgesamt ist das jedoch am ehesten statistisch bedingt. Die Menge an P.
aeruginosa lag bei allen Proben v. a. zwischen 0 und 20 ng, und es bestand ein nicht
linearer Zusammenhang zwischen dem Alter und der Menge an P. aeruginosa, von der
die Pearson Korrelation jedoch ausgeht. Somit war v. a. durch die Kategorisierung in 0,
+, ++, +++, in der die hohen Werte in der Kategorie +++ zusammengefasst wurden, mit
der nicht parametrischen Korrelation (Spearman) eine Signifikanz darstellbar.
In guter Übereinstimmung mit einer Vielzahl an klinischen Studien (z. B. Emerson et
al., 2002; Parad et al., 1999) konnte in der hier vorliegenden Arbeit ebenfalls eine
negative Korrelation zwischen der Lungenfunktion und der zunehmenden bakteriellen
Besiedlung von P. aeruginosa sowohl durch die PCR als auch durch die konventionelle
Kultur gezeigt werden. Allerdings ergab sich in unserem Kollektiv diese Korrelation
nur bei Betrachtung der forcierten Vitalkapazität (FVC) und nicht bei Bezug auf die
Einsekundenkapazität (FEV1). Damit konnte bestätigt werden, dass chronische
68
Infektionen mit P. aeruginosa zu pulmonalen Zerstörungen, insbesondere der
Bronchialschleimhaut, führen, die mit einer Abnahme der forcierten Vitalkapazität
einhergehen und ein Hauptproblem bei Patienten mit Mukoviszidose darstellen.
Weiterhin belegen die mit dem aktuellen Stand der wissenschaftlichen Literatur
übereinstimmenden Korrelationen der quantitativen Messungen der Bakterienlast mit
den klinischen Parametern, dass die hier gewählte Studienpopulation mit anderen
publizierten und repräsentativen CF-Kollektiven vergleichbar ist.
5.7. Gehalt an humaner DNS im Sputum als Marker für
Inflammation
Um den Gehalt an humaner DNS als möglichen Marker für die Zellzahl in den
Sputumproben zu messen, wurde die Menge an genomischer IFN-α8 DNS mittels PCR
in den Sputumproben quantifiziert. Wie bereits einige Studien zeigen konnten, ist der
Gehalt an genomischer DNS in Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose
aufgrund der Entzündungsreaktion mit konsekutiv freigesetzter DNS v. a. aus
neutrophilen Granulozyten in den Atemwegen erhöht (Griese et al., 1997; Henry et al.,
1998). Weitere Autoren haben demonstriert, dass eine Verbindung zwischen der
Zellzahl im Sputum und der bakteriellen Belastung besteht, die mit einer
inflammatorischen Antwort bei Patienten mit Mukoviszidose einhergeht und das
Lungengewebe selbst zerstört, v. a., wenn die Entzündung durch eine Infektion mit P.
aeruginosa hervorgerufen wird (Gangell et al., 2011). Auf Basis der in der vorliegenden
Arbeit gewonnenen Daten stellt sich interessanterweise heraus, dass ein statistisch
signifikantes Verhältnis zwischen der Menge an IFN-α8 DNS im Sputum und der
bakteriellen Besiedlung mit P. aeruginosa besteht. Des Weiteren ergibt sich aus den
Daten eine positive Korrelation zwischen der Menge an genomischer DNS und dem
laborchemischen Entzündungsparameter CrP im Serum. Somit könnte der in dieser
Arbeit gemessene DNS-Gehalt im Sputum einen hilfreichen zusätzlichen Indikator für
Entzündungen bei Patienten mit Mukoviszidose und Infektionen mit P. aeruginosa
darstellen. Weitere Marker für den Nachweis von Entzündungen wie Zytokine in BALs
von P. aeruginosa infizierten Patienten wurden in anderen Studien charakterisiert
(Hartl, et al., 2006) und stützen unsere Beobachtung, dass in respiratorischen Sekreten
positive Indikatoren für P. aeruginosa Infektionen nachgewiesen werden können.
69
5.8. Therapeutischer Nutzen
Bereits mehrere Studien haben positiv belegt, dass das frühe Eradizieren mittels
intensiver antibiotischer Therapie eine chronische Besiedlung mit P. aeruginosa oder
die Umwandlung in mukoide Stämme verhindern oder wenigstens verzögern kann
(Koch, 2002; Marchetti et al., 2002). Eine aggressive antibiotische Therapie kann zu
einer Stabilisierung bis hin zu einer Verbesserung der Lungenfunktion führen
(Frederiksen et al., 1997). In einer australischen Studie konnte 2009 gezeigt werden,
dass eine Eradikation bei jungen Patienten bis zu einem Alter von fünf Jahren durch
eine kombinierte Therapie von intravenösen, oralen und inhalativen Antibiotika erzielt
werden konnte (Douglas et al., 2009). Zudem waren noch 12 Monate nach Beendigung
der Antibiose ein signifikanter Abfall von Interleukin-1 beta und der neutrophilen
Elastase als Entzündungsmarker in respiratorischen Sekreten, die durch BAL gewonnen
wurden, zu verzeichnen (Douglas et al., 2009). Jüngste Studien konnten belegen, dass
ein Großteil der Exazerbationen nicht durch eine Akquisition eines neuen P. aeruginosa
Stammes, sondern durch bereits in der Lunge des Einzelnen vorhandene Stämme
verursacht werden (Aaron et al., 2004). Insbesondere der Erstnachweis von P.
aeruginosa in nicht chronisch infizierten Patienten könnte somit einen therapeutischen
Vorteil mit sich bringen und den weiteren Krankheitsverlauf positiv beeinflussen.
Döring et al. sind der Ansicht, dass die frühe Eradikationstherapie von P. aeruginosa
einen Meilenstein in der therapeutischen Intervention der CF-Erkrankung darstellt
(Doring and Hoiby, 2004; Doring, 2012). In den zahlreichen, veröffentlichten Studien
wird jedoch nicht auf die Risikofaktoren einer antibiotischen Therapie, v. a. für Kinder
im jungen Alter, eingegangen. Eine der größten randomisierten Studien zur Sicherheit
hinsichtlich vier antibiotischer Therapieregime ist derzeit noch nicht abgeschlossen.
Untersucht wird v. a. die kumulative Toxizität sowie die Manifestation von
multiresistenten Keimen, die in zunehmendem Maße zu verzeichnen sind (Treggiari et
al., 2009; Nagaveni et al., 2009). In einer jüngst publizieirten Studie über die
Auswirkungen einer antibiotischen P. aeruginosa-Therapie während akuten
Exazerbationen in Hinsicht auf nicht - P. aeruginosa Bakterien wurde gezeigt, dass es
auch zu einem signifikanten Anstieg der ko-kolonisierenden Keime kam, die im
Therapieregime von CF-Patienten berücksichtigt werden sollten (Daniels et al., 2013).
70
Der sensitive Nachweis von P. aeruginosa mit dem hier neu etablierten PCR-Assay ist
überzeugend. Es stellt sich somit die Frage, welche Signifikanz und Relevanz ein
Nachweis geringster viabler und auch nicht-viabler Keimzahlen mittels PCR-Assay im
Sputum von CF-Patienten darstellt und ab wann eine aggressive Therapie begonnen
werden sollte (van Belkum et al., 2000). Es bleibt unklar, in wieweit der frühe
Nachweis des Pathogens im PCR-Assay einen positiven Nutzen hinsichtlich der
Therapie und der Infektionskontrolle bei Patienten mit Mukoviszidose aufweist
(McCulloch et al., 2010). Diese Frage lässt sich alleine anhand der hier vorliegenden
Daten noch nicht eindeutig beantworten, so dass weitere prospektive Untersuchungen
notwendig sind.
Xu et al. kommen zu der Aussage, dass der molekularbiologische Nachweis von P.
aeruginosa einen durchschnittlichen diagnostischen Zeitgewinn von 4,5 Monaten mit
sich bringt. Ihre Aussage bezieht sich dabei auf zehn Patienten, deren PCR-Ergebnisse
einen positiven Nachweis für P. aeruginosa aufwiesen, während die Kultur zunächst
negativ blieb. Bei fünf dieser Patienten wurde im Verlauf nach 4-17 Monaten (mit
einem Mittelwert von 4,5 Monaten) auch mittels der konventionellen Kultur P.
aeruginosa detektiert (Xu et al., 2004). Allerdings bleibt bei Follow-up Studien offen,
ob es sich um den genotypisch identischen Stamm handelt, der bereits zuvor mittels
PCR-Assay nachweisbar gewesen ist oder um eine Neuakquisition. Bisher gibt es keine
Studien, in denen bereits bei alleinigem PCR Nachweis eine antibiotische Therapie
begonnen wurde. Es sind also weitere prospektive Untersuchungen notwendig, wie sie
Deschaght und seine Mitarbeiter vorschlagen, die v. a. den klinischen Ausgang einer
frühzeitigen antibiotischen Therapie bei Patienten untersuchen, die ein diskrepantes
Ergebnis in der PCR (+) und der Kultur (-) aufweisen (Deschaght et al., 2011).
Bestätigt sich der positive Nutzten einer Therapie bei PCR-positiven und noch Kultur-
negativen Patienten, könnte ein vermehrter Einsatz der PCR in der Routinediagnostik
einen sinnvollen Beitrag für frühzeitige therapeutische Interventionen zum Nutzen des
Menschen mit Mukoviszidose leisten.
71
6. Zusammenfassung
Die Mukoviszidose ist eine Multiorganerkrankung der exokrinen Drüsen. Während im
letzten Jahrzehnt eine deutliche Steigerung der Lebenserwartung mit einem heutigen
Durchschnittsalter von 40 Jahren zu verzeichnen ist, ist eine kurative Therapie auch in
naher Zukunft nicht zu erzielen. Die chronische obstruktive Lungenerkrankung der
Patienten stellt den häufigsten lebenslimitierenden Faktor dar. Eine Besiedlung und
insbesondere die chronische Infektion der Atemwege mit P. aeruginosa gehen aufgrund
der progressiven Verschlechterung der Lungenfunktion mit einer signifikant erhöhten
Mortalität und Morbidität einher.
In dieser Arbeit wurde ein TaqMan basierter Real-Time PCR Assay mit dem
spezifischen ecfX Gen von P. aeruginosa als genetisches Ziel etabliert und evaluiert.
Die Evaluation erfolgte in vitro mittels Monokulturen von P. aeruginosa sowie anhand
von Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose.
Es zeigte sich eine signifikante Korrelation zwischen der Menge an nachgewiesenen
viablen P. aeruginosa Zellen durch die Bakterienkultur und der mittels qPCR-Assay
gemessenen P. aeruginosa DNS Menge mit einer unteren stabilen Nachweisgrenze von
bis zu 0,001 ng P. aeruginosa DNS. Die quantitative Methode stellte sich im Vergleich
zur konventionellen Kultur als diagnostischem Goldstandard als bis zu 100-fach
sensitiver heraus. Die in den Sputumproben gemessene Menge an P. aeruginosa
korrelierte zudem negativ mit der Lungenfunktion (FVC) und erwies das
Patientenkollektiv folglich als repräsentativ.
Des Weiteren wurde der Gehalt an genomischer DNS in den Sputumproben gemessen
und es konnte gezeigt werden, dass eine, wenn auch geringe, Korrelation zur
Konzentration an P. aeruginosa besteht. Der IFN-α Gehalt stellte in der hier
vorliegenden Studie einen hilfreichen Indikator für Entzündungen und Infektionen mit
P. aeruginosa bei Patienten mit Mukoviszidose dar.
Der quantitative qPCR Assay könnte in Zukunft die frühe Behandlung von P.
aeruginosa Infektionen, v. a. bei nicht chronisch infizierten Patienten, durch
rechtzeitigen bakteriellen Nachweis sicherstellen. Somit könnte der Einzug in die
Routinediagnostik einen wichtigen Beitrag zur Verbesserung der Therapie pulmonaler
Manifestationen bei Mukoviszidose-Patienten leisten.
72
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8. Anhang
Tabelle A: Klinische Daten
Proben-
Nr. Größe
Ge-
wicht BMI
Ge-
schlecht Alter Genotyp
Erkr.-
Dauer
Organmanifes-
tation Begleiterkrankung
Leuko-
zyten Erytrozyten Hb CrP Albumin IgG IgE
FEV1 %
Norm FVC
FVC/
FVC(Soll)
cm kg kg/m² m = 1
in
Jahren
delta-F508
homozygot
= 1
in
Jahren Hepar = 1 Aspergillus Infektion = 1 /nl Mio./µl g/dl mg/l g/dl g/l IU/ml in % in l in %
w = 2
delta-F508
heterozygot
= 2
Pankreas
(Insuffizienz)= 2 Atopie = 2
others = 3 Testis = 3 Candida Infektion = 3
Referenz-
werte: Referenzwerte:
Referenz-
werte:
Re-
ferenz-
werte:
Re-
ferenz-
werte:
Re-
ferenz-
werte:
Referen
z-
werte:
Pseudomonas aeruginosa = 4 3,8 - 10,5
m= 4,3
- 5,7
w= 3,9
- 5,3 m= 13,5 - 17 <5 3,5 - 5,2 7 - 16 5 - 100
Hämophilus influenza = 5 w= 12 - 16
Staphylokokkus aureus = 6
Stenotrophomonas = 7
0109 V2 164,00 55,30 20,56 2 19,54 1 18,74 2 1 3 4 5,00 4,27 13,20 36,00 3,80 9,90 159,00 83,00 3,11 80,42
0109 V3 164,00 57,80 21,49 19,62 18,81 78,00 2,94 76,07
0109 V4
0109 V5 164,00 57,50 21,38 19,75 18,95 7,40 4,29 13,20 4,20 4,00 10,03 103,00 79,00 2,91 75,36
0111 V2 161,00 52,60 20,29 2 14,87 1 14,84 2 4 8,80 5,09 14,60 4,80 4,20 16,89 11,60 52,00 1,99 65,30
0111 V3 162,00 53,60 20,42 14,94 14,91 58,00 2,35 75,87
0111 V4 163,00 53,90 20,29 15,10 15,07 65,00 2,47 78,64
0111 V5 164,00 57,00 21,19 15,29 15,26 10,90 4,77 13,80 1,00 4,20 16,94 31,40 62,00 2,47 76,66
0112 V2 179,00 67,00 20,91 1 32,30 1 31,78 1 2 3 4 4,00 5,84 16,90 3,80 4,60 14,77 60,90 66,00 4,81 93,75
0112 V3 179,00 68,00 21,22 32,38 31,85 75,00 5,33 103,93
0112 V4 179,00 66,30 20,69 32,53 32,01 72,00 5,08 99,13
0112 V5 179,00 65,00 20,29 32,76 32,24 5,90 5,83 16,70 4,10 4,70 16,46 59,60
88
0113 V2 160,00 73,00 28,52 2 19,11 2 13,77 2 1 2 3 4 6 10,80 4,25 12,50 9,60 4,20 14,06 257,00 80,00 2,96 79,97
0113 V3 160,00 74,10 28,95 19,20 13,86 64,00 2,48 67,05
0113 V4 160,00 72,30 28,24 19,35 14,01 83,00 2,91 78,76
0113 V5 160,00 71,00 27,73 19,59 14,24 62,00 2,40 65,06
0114 V2 178,00 69,00 21,78 1 22,07 2 19,09 1 2 3 4 8,00 5,38 15,20 5,70 4,20 15,45 26,80 65,00 4,41 82,60
0114 V3 177,80 69,00 21,83 22,14 19,17 64,00 4,42 83,00
0114 V4 178,00 69,20 21,84 22,30 19,32 67,00 4,66 87,38
0114 V5 177,80 69,30 21,92 22,53 19,56 6,90 5,76 16,10 7,10 4,40 15,42 31,10 67,00 4,59 86,35
0117 V2 163,00 52,80 19,87 2 41,52 2 41,30 2 1 2 3 4 6,20 5,23 14,20 5,80 4,30 12,91 61,20 46,00 1,91 58,75
0117 V3 163,00 52,00 19,57 41,60 41,37 49,00 2,15 66,17
0117 V4 163,00 53,90 20,29 41,76 41,53 50,00 2,01 61,94
0117 V5 163,00 52,00 19,57 41,99 41,76 6,90 4,94 13,90 1,00 4,50 13,18 54,10 49,00 2,08 64,21
0118 V2 168,00 52,00 18,42 2 29,91 2 29,74 2 3 4 7,70 4,79 12,50 14,90 3,80 22,86 3,30 67,00 3,03 80,27
0118 V3 168,00 52,00 18,42 29,97 29,80 64,00 2,77 73,41
0118 V4 168,00 52,00 18,42 30,16 29,99 65,00 2,69 71,39
0118 V5 168,00 53,00 18,78 30,33 30,17 10,90 5,01 13,20 21,00 4,40 20,22 11,10 66,00 2,91 77,32
0208 V2 189,00 71,70 20,07 1 17,31 2 10,00 1 2 6 15,70 5,51 15,20 4,00 16,00 21,00 70,00 4,55 74,63
0208 V3 190,00 70,50 19,53 17,40 10,09 83,00 5,15 83,72
0208 V4 190,00 69,80 19,34 17,57 10,26 79,00 4,78 77,76
0208 V5 190,00 70,00 19,39 17,76 10,45 11,50 5,33 14,90 17,50 3,60 15,30 22,00 78,00 4,76 77,50
0302 V2 156,00 49,00 20,13 2 25,83 1 25,23 2 4 11,97 5,40 15,80 3,00 3,10 57,00 1,97 58,82
0302 V3 156,00 47,70 19,60 25,92 25,33 56,00 1,91 57,07
0302 V4 156,00 44,60 18,33 26,10 25,50 58,00 2,09 62,53
0302 V5 156,00 44,60 18,33 26,35 25,75 53,00 1,93 57,86
89
0303 V2 163,00 46,80 17,61 2 22,79 1 22,57 2 3 5 6 7 8,66 4,70 14,20 3,00 4,70 12,20 173,00 42,00 2,50 66,87
0303 V3 163,00 46,50 17,50 22,86 22,64 36,00 2,34 62,62
0303 V4 163,00 47,80 17,99 22,99 22,78 27,00 2,00 53,58
0303 V5 163,00 48,80 18,37 23,21 22,99 8,67 4,20 12,90 4,10 10,10 376,00 40,00 2,69 72,17
0304 V2 184,00 66,40 19,61 1 27,24 2 24,85 2 6 16,37 5,40 15,50 57,00 19,70 26,30 59,00 3,92 70,63
0304 V3 183,00 65,20 19,47 27,32 24,92 59,00 3,84 69,94
0304 V4 183,00 69,40 20,72 27,47 25,08 65,00 4,10 74,73
0304 V5 183,00 68,40 20,42 27,68 25,29 9,85 5,40 15,40 18,00 4,30 15,70 79,00 66,00 4,19 76,45
0305 V2 168,00 53,20 18,85 2 32,09 2 21,99 2 1 3 4 7,57 4,40 12,90 3,90 4,30 12,60 131,00 73,00 3,07 82,57
0305 V3 168,00 53,70 19,03 32,17 22,07 69,00 3,17 85,31
0305 V4 168,00 52,50 18,60 32,33 22,22 80,00 3,54 95,37
0305 V5 168,00 52,50 18,60 32,58 22,47 10,08 4,20 12,20 7,60 4,40 11,50 216,00 78,00 3,42 92,30
0306 V2 163,00 55,90 21,04 2 24,67 1 24,66 2 3 56,00 2,37 64,24
0306 V3 163,00 55,10 20,74 24,77 24,76 62,00 2,62 71,06
0306 V4 163,00 56,40 21,23 24,92 24,91 63,00 2,72 73,85
0306 V5 163,00 55,40 20,85 25,15 25,14 12,85 5,00 13,50 5,10 4,30 12,50 435,00 59,00 2,60 70,71
0308 V2 166,00 54,70 19,85 2 18,19 1 17,84 2 3 5 6 3,00 4,60 10,60 10,00 85,00 3,10 77,68
0308 V3 166,00 52,90 19,20 18,27 17,91 82,00 3,27 81,98
0308 V4 166,00 52,60 19,09 18,43 18,07 84,00 3,01 75,54
0308 V5 166,00 53,70 19,49 17,65 17,30 8,49 4,80 14,70 10,90 4,30 14,50 8,00 76,00 3,04 75,91
0310 V2 169,00 48,20 16,88 1 17,38 2 17,00 2 3 6 14,52 5,70 15,20 33,70 4,30 15,30 113,00 49,00 2,83 53,93
0310 V3 169,00 49,00 17,16 17,46 17,08 46,00 2,86 54,52
0310 V4 169,00 49,00 17,16 17,61 17,23 47,00 2,93 55,89
0310 V5 169,00 49,10 17,19 17,84 17,46 10,21 5,60 15,40 79,30 4,30 17,00 78,00 53,00 3,13 59,77
0311 V2 161,00 57,70 22,26 2 22,83 1 19,33 2 3 4 9,88 4,80 12,70 6,40 4,40 62,00 2,46 67,42
90
0311 V3 161,00 55,00 21,22 22,91 19,41 48,00 2,48 68,01
0311 V4 161,00 54,10 20,87 23,07 19,56 65,00 2,61 71,65
0311 V5 161,00 52,50 20,25 23,30 19,79 8,25 4,00 10,80 3,40 4,20 11,40 465,00 64,00 2,64 72,60
0402 V2 172,50 59,90 20,13 2 38,27 3 37,79 1 2 1 7,20 4,60 12,90 2,00 4,21 18,77 11,30 66,00 2,99 79,59
0402 V3 172,50 58,50 19,66 38,34 37,87 69,00 2,94 78,30
0402 V4 172,50 59,60 20,03 38,50 38,02
0402 V5 172,50 59,70 20,06 38,73 38,25 8,20 4,60 15,10 9,00 3,74 16,76 16,50 67,00 3,01 80,38
0416 V2 171,00 59,10 20,21 2 20,46 1 19,72 2 10,50 4,50 12,30 43,00 3,26 28,44 41,00 2,48 59,71
0416 V3 171,00 59,60 20,38 20,54 19,80 42,00 2,57 61,91
0416 V4 171,00 60,80 20,79 20,68 19,95 44,00 2,66 64,13
0416 V5 171,00 60,50 20,69 20,91 20,18 44,00 2,69 64,95
0417 V2 169,00 55,50 19,43 2 16,58 1 16,13 1 2 1 7,70 4,60 13,80 1,00 3,71 14,66 308,00 68,00 2,99 87,36
0417 V3 169,00 53,90 18,87 16,67 16,22 78,00 3,26 95,81
0417 V4 169,00 52,90 18,52 16,82 16,37 67,00 2,92 86,07
0417 V5 170,00 54,00 18,69 17,05 16,60 67,00 3,54 102,55
0602 V2 163,00 55,20 20,78 2 25,67 2 15,34 2 1 3 4 11,01 4,50 11,90 15,00 4,20 40,00 2,03 55,41
0602 V3 163,00 55,20 20,78 25,73 15,40 44,00 2,16 58,98
0602 V4 163,00 57,10 21,49 25,81 15,48 40,00 1,93 52,74
0602 V5 163,00 57,00 21,45 26,03 15,70 8,55 4,22 11,40 9,00 4,00 14,50 5,40 38,00 1,90 52,00
0603 V2 178,00 76,00 23,99 1 25,57 3 25,15 1 2 4 7,10 5,56 15,80 0,00 4,80 17,50 39,70 80,00 4,94 94,13
0603 V3 178,00 76,90 24,27 25,66 25,23 70,00 4,42 84,26
0603 V4 178,00 77,10 24,33 25,77 25,34 82,00 5,09 97,09
0603 V5 178,00 77,70 24,52 25,99 25,57 9,45 5,31 15,10 1,00 15,80 31,50 83,00 5,12 97,77
91
0804 V2 180,00 83,00 25,62 1 42,81 1 25,62 1 2 1 2 4 7,90 5,26 15,40 4,10 4,50 12,90 87,00 51,00 4,33 88,10
0804 V3 180,00 82,30 25,40 42,91 25,71 49,00 4,24 86,31
0804 V4 180,00 83,00 25,62 43,08 25,88 50,00 4,31 87,82
0804 V5 180,00 83,60 25,80 43,25 26,05 7,85 5,28 15,80 10,30 4,50 13,00 7,00 45,00 3,76 76,68
0808 V2 168,00 51,00 18,07 2 38,36 1 37,00 1 4 8,22 4,94 13,90 3,00 4,50 21,40 16,00 55,00 2,69 75,67
0808 V3 168,00 52,00 18,42 38,41 37,06 54,00 2,72 76,54
0808 V4 168,00 51,00 18,07 38,59 37,23 51,00 2,39 67,34
0808 V5 168,00 51,00 18,07 38,80 37,44 10,14 4,66 13,40 15,30 4,30 33,00 50,00 2,47 69,70
0901 V2 138,00 24,50 12,86 2 13,21 1 12,76 2 4 6 14,19 4,85 12,30 19,30 4,43 18,20 20,40 46,00 1,22 64,04
0901 V3 138,50 25,00 13,03 13,31 12,85 44,00 1,26 65,34
0901 V4 138,00 23,70 12,44 13,44 12,99 42,00 1,20 63,30
0901 V5 137,00 24,60 13,11 13,69 13,24 13,18 4,61 12,10 30,00 3,15 20,80 53,60 40,00 1,14 60,28
0903 V2 131,50 28,50 16,48 2 8,91 8,62 4 6 14,78 4,37 11,50 4,90 3,79 12,90 210,00 76,00 1,72 100,78
0903 V3 132,00 29,40 16,87 8,99 8,71 62,00 1,44 83,10
0903 V4 131,50 28,10 16,25 9,14 8,85 56,00 1,30 76,14
0903 V5 133,50 30,80 17,28 9,33 9,05 12,65 4,20 11,60 0,20 3,27 15,10 131,00 68,00 1,57 87,37
1201 V2 166,00 49,00 17,78 2 18,77 1 18,61 2 2 7,90 5,03 13,20 16,00 3,44 152,00 171,00 42,00 2,04 51,31
1201 V3 166,00 49,00 17,78 18,85 18,69 44,00 2,18 54,86
1201 V4 166,00 49,50 17,96 19,00 18,84 38,00 1,85 46,60
1201 V5 166,00 50,00 18,14 19,23 19,07 7,50 5,26 14,20 32,00 149,00 36,00 2,23 56,26
1202 V2 155,00 36,00 14,98 2 12,02 2 12,02 2 1 2 3 4 9,50 4,84 13,10 3,00 4,02 12,61 146,00 63,00 2,13 84,05
1202 V3 156,00 37,00 15,20 12,10 12,10 65,00 2,27 87,91
1202 V4 156,00 38,00 15,61 12,25 12,25 68,00 2,41 92,61
1202 V5 158,00 39,00 15,62 12,48 12,48 13,60 5,02 13,60 6,00 15,90 443,00 61,00 2,52 93,81
92
1203 V2 165,00 68,00 24,98 1 12,22 1 7,66 2 5 10,30 4,42 12,50 3,00 3,94 7,53 180,00 77,00 3,08 81,25
1203 V3 165,00 67,00 24,61 12,30 7,74 74,00 3,08 81,47
1203 V4 167,00 62,00 22,23 12,45 7,89 75,00 3,19 83,83
1203 V5 167,00 73,00 26,18 12,68 8,12 9,70 4,40 12,60 3,00 8,32 188,00 81,00 3,45 87,13
1204 V2 150,00 38,00 16,89 2 12,45 1 11,34 2 1 4 8,40 4,39 12,80 3,00 4,64 133,00 89,00 2,37 97,62
1204 V3 150,00 38,00 16,89 12,52 11,42 88,00 2,28 93,83
1204 V4
1204 V5 151,00 42,00 18,42 12,81 11,71 11,40 4,53 12,09 324,00 69,00 2,03 80,45
1205 V2 164,00 49,00 18,22 1 15,82 1 15,82 1 1 6 10,50 5,33 14,30 6,00 9,20 75,00 2,82 78,87
1205 V3 165,00 51,00 18,73 15,91 15,91 71,00 2,83 77,46
1205 V4 160,00 51,00 19,92 16,05 16,05 76,00 2,88 83,54
1205 V5 167,00 51,00 18,29 16,29 16,29 8,70 4,89 13,20 14,00 3,54 22,00 2,00 69,00 2,92 77,90
1206 V2 169,00 53,00 18,56 1 16,94 1 16,87 2 6 18,60 5,20 14,40 5,00 4,16 15,90
1323,0
0 79,00 4,93 126,86
1206 V3 169,00 53,00 18,56 17,03 16,96 81,00 5,15 104,00
1206 V4 169,00 17,16 17,09
1206 V5 169,00 53,00 18,56 17,43 17,36 10,00 5,54 15,10 8,00 3,95 18,00
2364,0
0 79,00 5,19 105,03
Danksagung
Ich danke Herrn Professor Bufe für die freundliche Überlassung des Themas und seine
motivierende Betreuung auf dem langen Weg zur Erstellung dieser Promotionsarbeit.
Mein großer Dank gilt Herrn Dr. Löseke für die ausgezeichnete Planung und Betreuung
der praktischen Arbeiten sowie die Erstellung dieser Dissertationsschrift. Ein liebevoller
Dank gilt auch Sandra Busse aus der Abteilung der experimentellen Pneumologie der
Ruhr-Universität Bochum für ihre in jeder Hinsicht große Unterstützung. Allen anderen
Mitarbeitern der Abteilung danke ich für das sehr angenehme Arbeitsklima und ihre
stets produktiven Hilfestellungen während meiner praktischen Arbeiten.
Bedanken möchte ich mich bei Frau A. Friedrichs des Institutes für Medizinische
Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum für ihre technische Hilfestellung der
kulturellen in vitro Experimente mit P. aeruginosa.
Des Weiteren danke ich Herrn Dr. Christoph Bühren für sein stets offenes Ohr bei
statistischen Fragestellungen und Herrn Dr. Seithe für seinen fachlichen Dialog.
Ein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir den Lebensweg ermöglichten, den
ich gegangen bin, und mich dort hinführten, wo ich nun stehe. Ich danke ihnen für ihre
aufmunternde Unterstützung und liebevolle Fürsorge in allen Lebenslagen. Meinen
Eltern danke ich zudem für ihr ausdauerndes und geduldiges Korrekturlesen.
Last but not least danke ich meinem Freund Daniel für seine kompetente
computertechnische Hilfe während der Fertigstellung der Dissertationsschrift und von
Herzen dafür, dass er mich auf dem langen Weg geduldig begleitet hat.
Curriculum vitae
Anna-Lena Terzenbach
geb. am 12.03.1985 in Bochum (Deutschland)
Staatsbürgerschaft: deutsch; Familienstand: ledig
Schulbildung
1991 bis 1993 Grundschule Dahlhausen, Bochum
1993 bis 1995 Köllerholzschule, Gemeinschaftsgrundschule, Bochum
1995 bis 2004 Theodor-Körner Schule, Bochum
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
2001/2002 Salisbury School, Maryland (USA)
Hochschulstudium
10/2004 – 08/2006 Ruhr-Universität Bochum, Vorklinik Medizin
Herbst 2006 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
09/2006 – 07/2007 Université Louis Pasteur, Straßburg (F), Klinische Medizin
10/2007 – 8/2009 Ruhr-Universität Bochum, Klinische Medizin
09/2009 – 8/2010 Praktisches Jahr:
- Innere Medizin Bergmannsheil Bochum
- Pädiatrie Universitätskinderspital bei der Basel (CH)
- Chirurgie Bergmannsheil Bochum
Herbst 2010 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Dezember 2010 Approbation als Ärztin
Dissertation
Seit 01/2008 Evaluation eines Pseudomonas aeruginosa Real-Time PCR
Assays in vitro und im Sputum von Patienten mit
Mukoviszidose, Experimentelle Pneumologie, Bergmannsheil
Bochum
Beruf
Seit 02/2011 Assistenzärztin in der Klinik für Neugeborene, Kinder und
Jugendliche des Klinikums Nürnberg Süd, Nürnberg
Veröffentlichung
09/2011 Terzenbach, A., Löseke, S., Ballmann, M., Kopp, M.,
Mellies, U., Nüßlein, T., Rietschel, E., Staab, D., Wagner,
T., Gatermann, S., Griese, M. und Bufe, A. (2011).
Evaluation eines Pseudomonas aeruginosa Real-Time
PCR Assays in vitro und im Sputum von Patienten mit
Mukoviszidose. Poster bei der 107. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Kinder- und Jugendmedizin,
Bielefeld, 2011.
