284

Dfinnschichtchromatographischer Nachweis kiinstlicher SiiSstoffe in Lebensmitteln

II . Mitteilung

p-Methoxy-o-benzoyl-benzoes~iure, Dulcin, Suosan und Ultrasiifl

H. WOIDmH, H. G~Auv.R und J. TU~KA

Mitteilung aus dem Forschungsinstitut der Ern~ihrungswirtschaft, Wien* (0sterreieh) Eingegangen am 2. August 1971

Thinlayer-Chromatographic Detection of Artificial Sweeteners in Foods.

I I . p-Methoxy-o-Benzoyl-Benzoic Acid, Dulcine, Suosane and Ultra-Sweet. Summary. For the detection of artificial sweeteners in the presence of preservatives, the

sample is ethered in a basic and then in an acid medium. The thus obtained two extracts are separated by thin layer chromatography on polyamide layers with addition of colouring agents and the several substances are determined under UV light by using a 4-dimethylaminobenzal- dehydsolution as spray reagent.

Zusammen/assung. Zum Nachweis der kiinstlichen Sfil3stoffe p-Methoxy-o-benzoyl-benzoe- s~ure (Produkt 23/46), p-~_thoxyphenylharnstoff (Dulcin), l~-p-Nitrophenyl-N-carboxy~thylen- harnstoff (Suosan), 1-Propoxy-2-amino-4-nitrobenzol (P 4000, UltrasfiB), Saccharin und Cycla- mat in Gegenwart yon Konservierungsmitteln (Sorbins~ure, Benzoes~ure, p-Hydroxybenzoe- si~ure, deren Methyl-, Athyl-, Propyl- und Butylester sowie Salicyls~ure) wird die Probe zun~chst in basisehem und anschlieBend in saurem Milieu ausge~thert. Die auI diese Weise erhaltenen zwei Extrakte werden mittels Diinnschichtchromatographie auf Polyamidschichten mit Leueht- stoffzusatz getrennt und die einzelnen Substanzen unter UV-Lieht und dureh Besprfihen mit 4- DimethylaminobenzaldehydlSsung naehgewiesen.

Einleitung In For~setzung einer frfiheren Publikation [1] fiber den Nachweise der in 0ster-

reich zugelassenen kfinstlichen SfiBstoffe wurden physiologiseh bedenkliche Produkte, die als SfiBstoffe bekannt sind, untersueht. Zicl der Arbeit ist, diese Stoffe neben Saccharin und Cyclamat zu erfassen.

Die bisherige Literatur (siehe auch Mitt. I [1]) befal~t sich vorwiegend mit dem Iqaehweis bzw. der Bestimmung einzelner Sfil~stoffe. So arbeitete M6hler [2] fiir das Produkt 23/46 einen auf Reaktion mit Schwefels~ure beruhenden Naehweis aus; derselbe Autor [3] wies Ultrasfil~ durch Kupplung mit a-Naphthol nach. Waldi [4] ffihrte die Trennung Dulein-Saccharin auf Kieselgelsehichten dutch.

Seltcner sind Arbeiten, in denen mehr als zwei Sfii~stoffe naehgewiesen werden. Korbelak [5] gab eine Methode an, die zur Identifizierung yon Saccharin, Cyclamat, Dulcin und P 4000 in Fruchtsaftgetr~nken geeignet ist. Nach Ausschfitteln aus stark saurer L6sung wird die Trennung auf Kieselgelschicht durehgefiihrt. Saccha- rin ist unter kurzwclligem UV-Licht sichtbar, die anderen Sfi~stoffe werden mit drei Sprfihreagentien entwickelt, Suosan und p-Methoxy-o-benzoyl-benzoes~ure werden nicht berficksichtigt.

Prinzlp der Methode Vor Durchffihrung der Dfinnschichtchromatographie die zu untersuchenden Substanzen aus

der Probe abtrennen und anreichern; am besten dureh Aus~ithern in 2 Stufen ; Neutralstoffe (UltrasiiB, Hauptmenge des Duleins) aus schwaeh alkaliseher LSsung, Saccharin, Suosan, Pro- dukt 23/46 und den Rest des Dulcins aus saurer L6sung extrahieren. Die wgBrige Phase enthi41t Cyelamat (naeh der in Mitt. I [1] angegebenen Vorsehrift nachzuweisen) sowie noeh einen ge- ringen Teil yon Saccharin. Bei diesem Veffahren gelangen eventuell vorhandene Konservierungs- mittel (Sorbinsgure, Benzoes~ure, p-Hydroxybenzoesgure und deren Ester) gleichfalls in die Extrakte ; auf diese Stoffe wurde daher bei der Ausarbeitung der Analysenvorschrift Riicksieht genommen. Beide Atherextrakte getrennt einengen, Riickstando in _~thanol aufnehmen und

* Diese Arbeit wurde aus Mitteln des Forschungsf6rderungsfonds der Gewerblichen Wirt- sehaft 0sterreichs gefSrdert.

285

Tabelle 1. Trennung von S~fisto//en

Substanz L6sung Farbe unter UV-Licht hRf-Wert ~achweis- 254 nm 350 nm FM I F ~ I I .grenze

m pg

Dulcin UltrasiiB Suosan Saccharin Produkt 23/46 Cyclamat PHB-Methylester PHB-~thylester PItB-Propylester PHB-Butylester p-Hydroxy-benzoesi~ure Salieyls~ure Benzoes£ure Sorbins~ure

1+2 dunkel - - 38 62 0,5 1 dunkelbraun gelb 94 77 0,5 2 - - dunkel O 17 0,5 2+3 hellblau - - 3 40 1 2 dunkel - - 36 69 1 3 - - - - 22 31 1 1 dunkel - - 30 44 0,5 1 dunkel - - 37 50 0,5 1 dunkel - - 40 54 0,5 1 dunkel - - 45 58 0,5 2 dunkel - - 3 26 0,5 2 hellblau hellblau 9 47 0,5 2 dunkel - - 45 70 5 2 dunkel - - 56 75 0,5

ehromatographieren. Sorptionsmittel: Polyamid mit Leuchtstoffzusatz, Ifir die Trennung aller genannten Substanzen besser als das bei der Chromatographie yon Saccharin und Cyclamat allein verwendete Gemisch aus acetylierter Cellulose und Polyamid nach Salo [6]. Einwan4freie Trennung der SfiBstoffe mit Xylol/n-Propanol/Eisessig/Ameisens~ure-Flieflmittel (FM II) (Tab. 1); vorher dutch Chromatographie in einem Benzol/Aceton/Propions~uregemisch (FM I) auf Ab- wesenheit yon Benzoes~ure priifen, die den Naehweis yon p-Methoxy-o-benzoyl-benzoes~ure unter Umst~nden st6rt. Auch zur Unterscheidung gewisser Inhaltsstoffe, die aus einzelnen Le- bensmitteln mitextrahiert werden und auf die Platte gelangen, yon den Sfiflstoffen ist Chromato- graphic in diesem FlieBmittel n6tig.

Sind neben den Sfii~stoffen mehrere Konservierungsmittel vorhanden, Trennung dureh zwei- dimensionalo Chromatographic in den genannten FlieBmitteln durehffihren. Auswertung der Chromatogramme unter UV-Licht ; in Tab. 1 eine Zusammenstellung der Farben, in denen die SiiBstoffe und Konservierungsmittel bei den Wellenl£ngen 254 und 350 nm auf der fluorescie- renden Platte erscheinen. Dulein und UltrasfiB darfiber hinaus durch Bespriihen mit p-Dimethyl- aminobenzaldehyd, Cyclamat mit 4,5-- Dichlorfluorescein (1) sichtbar maehen.

Dieses Verfahren wurde mit Erf01g an verschiedenen Lebensmitteln (Fruchts~fte und Frucht- sirupe, Marmeladen, Weine, Gurken-, Paprika- und Sauerkrautlaken, Laken yon ~ischerzeug- nissen, Ketchup) getestet.

~Yachweisgrenze Nachweisgrenzen auf der Platte zwischen 0,5/~g (Suosan, Dulcin, UltrasfiI3) und 1/~g (Saccha-

rin, Produkt 23/46). Cyclamat, durch Ionenaustauscher-Aussehiittelung [1] aus der w~Brigen L6sung isoliert, ist mit einer Empfindliehkeit yon 1 gg auf der Platte naehzuweisen. Dement- spreehend sind unter den angegebenen Bedingungen 2--6 rag/1 Probe yon jeder der angeffihrten Substanzen noch nachweisbar. Diese Werte liegen nach den Angaben der Literatur [7, 8] welt unter den jeweiligen Gesehmackssehwellen.

StSrungsmSglichkeiten Es b le ib t die F r a g e zu bean twor ten , ob dieser chromatographische Nachweis

durch aus der Probe s t a m m e n d e Beglei ts toffe gestSr t wird. L ieg t Benzoes£ure in grSBerer Menge vor, so ergeben sich Schwier igkei ten be im Nachweis der p -Methoxy- o-benzoyl-benzoes~ure, deren R , - W e r t sigh in F M I n ieh t s t a rk und in F M I I k a u m yon dem der Benzoes~ure unterseheide t . S te ig t das Verh~ltnis Benzoesiiure :p-Me- thoxy-o-benzoyl -benzoes~ure fiber 5 : 1 , so werden die beiden Subs tanzen bei der Chromatograph ic n ich t mehr ge t rennt . Es empf ieh l t sieh desh~lb, bGi al len Proben, die bei Anwesenhei t yon BenzoesKure a u f Vorhandense in yon p-Methoxy-o-benzoyl - benzoesi~ure un te r such t werden sollen, die Benzoes£ure abzu t rennen . Dies kann in e infaeher Weise durch Wasse rdampfdes t i l l a t i on nach dGr angegebenen Vorschrfft erfolgen. Bei Model lversuchen gelang es selbst bGi ex t r em hohem Benzoes~uregehal t (2500 mg/1), dig t t a u p t m e n g e des Konse rv ie rungsmi t t e l s abzudes t i l l i e ren ; der zu- r f ickble ibende Res t s t6 r t den Nachweis yon p-Methoxy-o-benzoyl-benzoes i iure night mehr . Bei dieser Des t i l l a t ion werden aueh Sorbins~ure und e twa vorhandene Es te r 19"

286

der p-Hydroxybenzoes/~ure entfernt , die allerdings den ehromatographischen l~aeh- weis tier SiiSstoffe nicht behindern. Aueh natfirliehe Farb- u n d Aromastoffe gelangen gemeinsam mi t den Siil3stoffen und Konserv ierungsmi t te ln in die i ther i sehen Aus- ziige. I n der Mehrzahl tier F~lle wandern sic mi t der LSsungsmit te l f ront oder bleiben in der Gegend des S ta r tpunktes zuriiek. Ausnahmen bi lden Weine u n d Marmeladen, bei denen manehmal aueh Subs tanzen mit anderen R~-Werten beobaehtet wurden. Sit sind jedoeh dureh den Rf-Wert zumindest in einem der beiden FlieBmittel sowie du tch Fluorescenzverhal ten bzw. dutch die Spri ihreaktion deutl ieh yon den SiiSstof- fen zu unterseheiden.

Arbeitsvorsehrift

Gerdite: Grundausriistung ffir die Diinnschichtchromatographie (Streichger~t, Tr~gerplatten 20 x 20 cm, Trennkammer, Auftragpipette) Destillationsapparatur (beschrieben in IFU-Ana- lyse Iqr. 5. - - Bestimmung der flfiehtigen Siuren [9, 10] : Wasserbad, Sehfitteltriehter, UV-Lampe (Spektralbereich 254 nm und 350 nm).

l~eagentien: Polyamidpulver (Macherey, Nagel & Co MN-Polyam..id DC 11). - - Leuehtstoff ZS Super (Riedel de Haen AG). - - _Ather peroxidfrei. - - 96% iges A t h a n o h - Xylol reinst. - - n-Propanol pro anal. - - Propions~ure purism pro anal. - - retd. HC1 (1 : 1 v/v). - - retd. H2S04. - - verd. NaOtt. - - 40°/oige lqaOH. - - Eisessig pro anal. - - 98---100°/oige Ameisens~ure pro anal. - - Benzol pro anal. - - Aceten pro anal. - - Natrinmsulfat wasseffrei.

Herstellen tier Platteu: 12 g Polyamidpulver (genfigt fiir 5 Platten) mit 0,3 g Leuchtstoff zu- nichst trocken, dann mit 60 ml Methanol ira Mixer gut riihren, anf die Platten aufstreichen (Schichtdicke 0,25 mm) und mindestens ll/2 Std bei Zimmertemperatur trocknen.

D4nnsehiehtchromatographie: FlieSmittel I: Benzol/Aceton/Propionsiure (60 ~- 3 + 1 ). - - FlieS- mittel I I : Xylol/n-Propanol/Eisessig/Ameisens~ure (45-t-6+7+1). - - Tanks~ttigung: Kammer mit 100 ml FlieBmittel 30 rain lang s~ttigen. Auf diehten Verschlu6 des Tankes aehten. - - Steig- h6he: 15 em yore Startounkt an. Laufzeit: 2---21/2 Std. Sprfihreagens: 1% 4-Dimethylamino- benzaldehyd in 2 n-HC1/Athanol (1-4-1).

Behandlung der Probe: 50 ml bei fliissigen Proben; Konzentrate naeh Verdiinnen; 1(}--50 g bei festen Proben verreiben und mehrmals mit Wasser (evtl. unter Erwirmen) digerieren. Extrakte wie fliissige Proben behandeln. Nun mit verd. l~aOH (bei sehr stark sauren Proben 40°/oige l~'aOH) auf pH 9 einstellen und in einem Schiitteltrichter 3 real mit je 40 ml •ther kriftig schfit- teln. Atherisehe Auszfige vereinigen, mit Na2S04 troeknen, filtrieren, auf dem Wasserbad abdamp- fen und Rfickstand in 1 ml ~_thanol aufnehmen (L5sung 1). AnschlieBend Probe mit HCI auf pH 2 bringen, neuerlieh 3 real mit je 40 ml/~ther aussehiitteln, gtherische Phasen vereinigen, frock- hen und wie oben behandeln. (LSsung 2). Aus der w~grigen LSsung mittels Ionenaustauseheraus- sehfittelung [1] Cyclamat isolieren (LSsung 3).

Chromatographie: Auf der Platte Startpunkte 1,5 em vom unteren Rand und mindestens 1,5 cm voneinander entfernt marlderen. Auf einen Startpunkt 5 #l LSsung 1, auf zwei weitere 5 ~ul LSsung 2 bzw. 3 auftragen, daneben Vergleichssubstanzen. bTaeh Si~ttigung bis zu einer SteighShe yon 15 cm in FlieBmittel II chromatographieren. Auswertung unter UV-Licht (vgl. Tab. 1). Dulcin und Ultrasi~B naeh Besprfihen mit 4-DimethylaminobenzaldehydlSsung: gelbe Flecke auf weiBem Grund.

Zweidimensionale Chromatographic: Auf einer Platte 1,5 cm yore unteren sowie vom reehten Rand ein Startpunkt marlderen, entspreehende Menge von LSsung 2 auftragen; in FlieBmittel I bis zur Steigh5he yon 15 cm chromatographieren, anschlieBend 30 min bei 50 ° C troeknen, unter UV-Lieht Punkte markieren und die Platte um 90 ° im Uhrzeigersinn drehen, in FlieBmittel II gleichfalls his zu einer SteighShe yon 15 cm entwiekeln. Auswertung wie bei der eindimensionalen Chromategraphie.

Wasserdamp/destillation: 20--25 ml Probe mit einigen Tropfen retd. H~S04 ans~uern und in das innere Gef~B der Apparatur einffillen. Aufteres Gef~B mit Wasser fiillen bis Flfissigkeits- spiegel fiber birnenf5rmigem K51bchen. Mit kriftigem Wasserdampfstrom 300 ml in eine Vorlage fiberdestillieren. W~hrend der Destillation, falls n5tig, dutch das Steigrohr in kleinen Portionen Wasser zugeben. Den im KSlbehen verbleibenden Rest auf urspdingliehes Volumen einengen and normal aufarbeiten.

Literatur

1. Woidieh, H., Gnauer, H., Galinovsky, E.: Diese Z. 189, 142 (1969). 2. MShler, K.: Diese Z. 90, 431 (1950). 3. - - Diese Z. 91, 124 (1950). 4. Waldi, D.: UnverSffentlichte Versuche, ref. E. Stahl: Dfinnsehiehtehromategraphie, S. 377,

Berlin-GSttingen-Heidelberg: Springer 1962. 5. Korbelak, T. : J. Assoc. Offic. Anal. Chemists 52, 487 (1969). 6. Salo, T., Airo, E., Salminen, K.: Diese Z. 125, 20 (1964). 7. Cox, W.S. : J. Assoc, Offic. Anal. Chemists 89, 652 (1956).

287

8. Ullmanns Enzyklop~die der technischen Chemic, 3. Aufl., Band 16, S. 477. Mfinchen-Berlin: Urban mad Schwarzenberg 1965.

9. Internationale Fruchtsaftunion, Analyse Nr. 5 (1968), Bestimmung der fliiehtigen S/¢uren. 10. Woidieh, K.: 0sterr. Chemiker-Ztg. 32, 190 (1929); Mikrochem. VIII 147 (1930); Deut.

Lebonsm, Rundsehau 52, 267 (1956). Dr. H. Woidich Forschungsinstitut der Ern~hrungswirtschaft A-1190 Wien, Blaasstrafle 29

Buchbesprechungen* Die einzelnen Lebensmittel (Chemie, Technologie, Analytik)

E. J. Briskey, R. G. Cassens und B. B. Marsh: Die Physiologic und Bioehemie des Muskels und ihre Beziehung zum Lebensmittel Fleisch. (Tile physiology and biochemistry o~ muscle as a food.) 2843 S. mit Abb. und Tab. Madison: The University of Wisconsin Press 1970. Prois: 95 $.

Im Jahre 1965 fund das 1. Symposium zu obigem Thema statt, die VerSffentlichuug erfolgte 1966 [vgl. diese Z. 138, 230 (1968)]. Nnnmehr liegt in ebenso eleganter und vorzfiglicher Aus- stattung der Band 2 fiber das 2. Symposium vor, das am 14./16. VII. 1969 wiederum in der Universit~t Wisconsin abgehalten wurde. 43 Referenten und eine nicht genannte Zahl yon Teil- nehmern und Diskussionsrednern behandelten das umfangreiche Programm, bei dem die Physiologic und Biochemie des Muskels eindeutig im Vordergrund standen, weshalb darauf ver- zichtet werden sell, die Referate im einzelnen hier anzuffihren. Es ist selbstverst/indlich, dab alles, was an glteren und neuesten Untersuchnngsmethoden zur Verffigung steht, zur Behandlung des Thomas aufgeboten wurde. Eine eingehende Besprechung wfirde allerdings den Rahmen des Referates sprengen, jedoch bieten die reichhaltigen Literaturangaben jedem Intcressenten die MSg- liehkeit, zu den Quellen vorzustoBen. Das Thema beginnt mit der Ent~icklung der Muskelzelle, geht fiber die Unterschiede zwischen rotem und weiflem Muskel (man mfiBte die Bezeichuung "Red and white Muscle" wohl besser mit dunke]- und hellgef~rbtem Muskel fibersetzen) auf die Detailfragen fiber wie: Muskelmembransystem, Myofibrill~re Proteine, Stroma und Sarkoplasma- proteine. Die Ver~nderungen des Muskels und seiner Komponenten in Abh~ngigkeit yon Erngh- rung, Wachstum and Arbeit sowie ihre Abh~ngigkeit veto Lipid- und Kohlenhydratstoff'wechsel werden in den n~chsten Kapiteln behandelt. ])as Wort "food" erscheint erst im 8. Kapitel mit 4 Referaten: R. G. Cassens: Die Morphologie des Muskels als Lebensmitte]; D. Lister: Die Physic- ]ogle der Tiere und die Vorwendung ihrer Muskeln als Lebensmittel; L. L. Kastenschmidt: Die Umsetzungen im Muskel im Hinbliek auf seine Verwendung als Lebensmittel; D. E. Goll u. Mit- u. Mitarb. : Die Chemie der Muskelproteine, soweit sic ffir die Ern~hrung yon Bedeutung sind.

Der Referent mSehte keinen Zweifel darfiber aufkommen lassen, dab mit dieser knappen Aufz~hlung der Inhalt des Buches nicht gew/irdigt werdea kann. Wer sich fiber den neuesten Stand der Physiologie und Biochemie des Muskels .- ohne den verstohlenen Seitenbliek auf das Thema "as a food" -- i~ormieren will, wird in den exzellenten einze]nen Kapiteln alles das finden, was er sucht. Im iibrigen kann man sich nicht recht gegen den Eindruck wehren, dab hier nieht das Lebensmittel als gleichberechtigter Partner erscheint, sondern dab die physiologische und bioehemisehe Forschung eindeutig im Vordergrund steht. Ein Generalthema, das immer wieder anklingt, ist der Mifleffolg bei der Zfichtung yon Schweinen mit hSherem Antei] an Magerfleisch. Die Selektionierung hat dazu geffihrt, dab die Tiere gegen Stress besonders empfindlich sind und dab bereits in den ersten Fhasen der Vergnderungen, die mit dem t~igor rnortis, der Totenstarre, verbunden sind, eine abnorme Milchs~urebildung und pH-Wert-Senkung eintreten. Das Fleisch wird blal3 (pale), weich (soft) und wasserl~ssig (exsudativ) und ist als PSE-Fleisch ffir den un- mittelbaren GenuB wie ffir die Vorarbeitung zu Fleischerzeugnissen nur bedingt tauglieh, wenn nicht ungeeignet. Es ist reizvoll, die histologischen, histochemischen und biochemischen Unter- suchungen zu verfolgen, die den Unterschied gegenfiber ,,normalem" Muskel herausstellen.

Die Offenheit, mit der zwischen Wissenschaftlern und Technologen die Diskussion geffihrt und wiedergegeben wird, ist effreulieh und l~Bt keine Zweifel fiber die Schwierigkeiten, die Ten- denzen tier Forsehung mit den Efforderaissen der Praxis (die daffir bezahlt) in ein tragbares Gleichgewicht zu bringen. Zusammenfassung: Band 2 ist wie Band 1 ffir die Wiedergabe der Grundlagenforschung ausgezeichnet und ffir die Zfiehtung im Hinblick auf das PSE-Problem richtungsweisend. Kl. M6hler (Tutzing)

Weitere Studien fiber die Extraktion und L6sliehkeit yon Muskeleiweifl unter Beriieksiehtigung technologiseher Gesiehtspunkte. Dissertation yon A. Fischer unter Leitung yon L. Kotter. Uni- versit~t Mfinchen 1970.

Mit der vorliegenden Dissertation wurden frfihere Arbeiten im Institut yon L. Kotter fort- gesetzt. Dureh Behandlung mit LSsungen yon Salzen, haupts~chlich Kochsalz, wurden globul~re und fibrill~ire Proteine in LSsung gebracht und die Mengen der gelSsten Substanzen bestimmt. Zwischen ihrer ttShe und der Bindef~higkeit des betreffenden Fleisches bestoht eine positive

* EinschlieBlich Besprechungen yon Diplomarbeiten und Dissertationen