E chinos t om a ho r t e ns e의 체항원 및 분비 배설

항원으로 자극한 마우스 비장세포에서 T h 2

c y t ok in e 발현에 관한 연구

연세대학교 대학원

임상병리학과

성 호 중

E chinos t om a ho r t e ns e의 체항원 및 분비 배설

항원으로 자극한 마우스 비장 세포에서 T h 2

c y t ok in e 발현에 관한 연구

지도 양 용 석 교수

이 논문을 석사 학위논문으로 제출함

200 1년 12월 일

연세대학교 대학원

임상병리학과

성 호 중

성호중의 석사 학위논문을 인준함

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

연세대학교 대학원

200 1년 12월 일

감사의 글

이 논문이 완성되기까지 전폭적인 지지를 아껴주시 않으신 지도 교수님과 여

러 교수님들께 감사의 말씀을 드립니다. 그리고 지난 28년 동안 언제나 믿어 주시

고 부족한 아들을 사랑으로 감싸주신 부모님께도 이 글을 빌리어 감사의 말씀을

드립니다.

대학원 석사 과정의 생활은 또다른 인생의 경험이었습니다. 인내하는 것을 배

웠고 노력의 의미를 알았습니다. 힘들었던 가운데 즐거운 추억도 있었고, 작은 일

에도 약해지는 모습에서 나의 존재를 돌아볼 수 있었던 기간이었습니다. 이런 모

든 것들이 앞으로의 삶에 큰 도움이 되리라 믿어 의심치 않으며, 앞으로 시작될

박사 과정에 있어서도 큰 힘이 되리라 생각합니다.

글을 마치며 지난 2년간 많은 도움을 주신 선배님들과 동기들 그리고 후배들

에게 다시금 감사의 말씀을 드리며, 항상 곁에서 큰 힘이 되어 준 사랑하는 사람

김정연에게 감사의 말을 전합니다.

2001년 12월

목 차

그 림 목 차 ........................................................................................................................iii

표 목 차 .......................................................................................................................v

약 기 호 표 ........................................................................................................................v i

국 문 요 약 ........................................................................................................................v ii

제 1 장 서 론 ...........................................................................................................1

제 2 장 재료 및 방법 .......................................................................................................3

1. m ou se splen ocyt es의 분리 및 배양 ................................................................. 3

2. E chin os tom a hortens e의 체항원 및 배설 항원의 제조 .............................. 3

3. E chin os tom a hortens e의 체항원 및 배설 항원의 세포 독성 측정 ......... 4

4. T otal RNA 의 분리 ................................................................................................4

5. Rev er se tr an script ion polym erase chain reaction (RT - P CR )의 실시..... 5

6. ELISA를 이용한 cyt okin e의 측정 ............................................6

제 3 장 연구 성적 및 결과..............................................................................................10

1. E chin os tom a hortens e 체항원 및 배설 항원의 세포 독성..........................10

2. Lipopoly saccharide (LP S )의 자극에 의한 IL - 4, IL - 5 m RNA의 발현

................................................................................................................................. 12

3. E chin os tom a hor tens e 체항원의 자극에 의한 IL - 4, IL - 5 mRNA의 발현

...................................................................................................................................14

4. E chin os tom a hortens e 배설 항원의 자극에 의한 IL - 4, IL - 5 m RNA의 발

현 ................................................................................................................................16

5. ELISA법에 의한 IL - 4의 발현 농도의 측정 ................................................ 18

6. ELISA법에 의한 IL - 5의 발현 농도의 측정 ................................................ 20

- i -

제 4 장 고 찰 ..................................................................................................................22

제 5 장 결 론 ..................................................................................................................24

참 고 문 헌 ........................................................................................................................26

A b str act ...............................................................................................................................36

- ii -

그 림 목 차

F igure 1. Cyt otoxicity of E chin os tom a hor tens e crude ant ig en and E .S .P . t o

m ou se splen ocyt es ................................................................................11

F igure 2. In du ct ion of IL - 4 an d IL - 5 m RNA in m ou se splen ocyt es by

tr eatm ent w ith lipopoly saccharide (250 ng/ ㎖) ............................13

F igure 3. Elav ation of IL - 4 and IL- 5 m RNA in m ou se splen ocyt es by

tr eatm ent w ith E chinos tom a hor tens e crude antigen (50 ㎍/ ㎖)

....................................................................................................................15

F igure 4. Increase of IL - 4 and IL- 5 m RNA in m ou se splen ocyt es by

tr eatm ent w ith E chinos tom a hor tens e E .S .P .(50 ㎍/ ㎖) ..........17

F igure 5. Ex pres sion of IL - 4 in m ou se splen ocytes by treatm ent w ith

E chin os tom a hortens e cru de ant ig en an d E .S .P . ......................19

F igure 6. Ex pres sion of IL - 5 in m ou se splen ocytes by treatm ent w ith

E chin os tom a hortens e cru de ant ig en an d E .S .P . ........................21

- iii -

표 목 차

T able 1. Cyt okine prim er sequences and am plified fragm ent sizes ..............9

- iv -

약기호표

A b : antibody

BSA : bovine serum album in

DEP C: diethyl pyrocarbon at e

DMEM : Dulbecco ' s m odified Eagle ' s m inim um es sential m edium

DM S O: dim ethy sulfoxide

ELISA : enzym e- linked im m un osorbent as say

F BS : fet al bovine serum

Ig : imm unoglobulin

IL : int er leukin

LP S : lipopoly saccarides

MT T : 3- (4,5- dim ethythiazol- 2- yl)- 2,5- diphenyl- t et razolium brom ide

P BS : ph osphat e buffer ed salin e

P BST : phosph ate buffered saline- T w een 20

RBC : red blood cell

m RNA : m es sen ger RNA (ribonucleic acid )

RT - P CR : rev er se tran script ion polym era se chain reaction

T BE : T ris - borat e/ EDT A

- v -

국문 요약

E chinos t om a ho r t e ns e의 체항원 및 분비 배설

항원으로 자극한 마우스 비장 세포에서 T h 2

c y t ok in e 발현에 관한 연구

6주령된 BALB/ c mouse의 spleen을 적출 하여 primary cell culture를 통해

splenocytes를 배양한 다음 Echinos toma hortense 의 체항원 (crude extract

antigen)과 배설 항원 (excretory- secretory product ; E.S.P.) 및 lipopolysaccharide

(LPS)로 자극을 준 splenocytes에서 Th2 cytokine 발현 여부를 시간별로 알아보

았다. Th2 cytokine은 IL- 4 와 IL- 5를 측정하는 한편, β- actin을 house keeping

gene으로 측정하여 대조 군으로 하였다. 측정 방법으로는 RT - PCR 기법을 이용하

여, Th2 cytokine mRNA의 발현 유무를 알아보았다. 그리고 체항원과 배설 항원으

로 자극한 splenocytes의 배양 상층 액에 대한 cytokine 유무를 ELISA 기법으로

정량적인 측정을 하였다.

Th2 cytokine에 대한 mRNA의 발현을 RT - PCR로 확인한 결과는 다음과 같다.

즉, splenocytes를 E. hortense 체항원 50 ㎍/ ㎖로 자극하였을 때 IL - 4는 30분

에서 발현한 후 다시 감소하다가 1시간 이후에서 사라졌고, IL - 5는 30분에

서 발현한 후 6시간까지 감소를 계속하다가 사라지는 것을 관찰하였다.

배설 항원 50 ㎍/ ㎖의 농도로 자극한 splenocytes의 경우 IL- 4는 30분에서 최고치

를 나타내며 6시간까지 감소가 지속되는 것이 관찰되었으며, IL- 5는 30분에서 발

현하여 12시간까지 감소가 지속되는 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로 LPS 250

ng/ ㎖의 농도로 자극한 경우 IL- 4는 30분에서 나타나며 3시간까지 감소가 지속되

었고, IL- 5는 30분과 6시간에서 발현하며 24시간까지 감소되는 것을 관찰하였다. 위

- v i -

의 실험 외에 체항원과 배설 항원의 splenocytes에 대한 세포 독성 실험은 MTT

방법을 통하여 실시한 결과 체항원의 경우 0.5 mg/ ㎖, 배설 항원의 경우 0.3 mg/ ㎖

까지 세포 독성 능이 나타나지 않았다.

ELISA기법을 이용한 cytokine의 측정은 체항원과 배설 항원으로 자극시킨

splenocytes의 배양 상층 액을 시간별로 모아 실시하였다. 체항원으로 자극한 경우

IL - 4는 배양 시간 9시간에서 증가하는 결과를 나타내었고, IL - 5의 경우에

는 9시간에서 증가하는 결과를 보였으나 체항원으로 자극하여 유도한

cyt okine양의 증가 비율은 IL - 4가 IL - 5보다 높았다. 배설 항원의 경우에는

IL - 4, IL - 5 모두 배양 시간 1시간에서 36시간까지 변화가 없었다.

위의 실험 결과로 볼 때 m ou se splenocyt es에서 E. hortense의 체항원이

cyt okine을 유도하는 자극 원으로 작용하고 있었고, 체항원의 자극 시 IL - 5

보다는 IL - 4의 발현 양이 현저히 증가함을 알 수 있었다.

핵심되는 말 : E chin os tom a hortens e , 체항원, 배설 항원, splen ocytes ,

RT - P CR, ELISA

- v ii -

제 1 장 서 론

E chinos tom a hor tens e는 1926년 A sada (1)에 의하여 처음으로 알려진

장흡충으로서 1974년 T ani 등(2)에 의해 최초로 인체 감염 예가 보고되었

고, 우리 나라에서는 1983년 서 등 (3)이 21세의 남자에서 인체 감염 예를

보고한 이후 감염 예가 꾸준히 증가하고 있다 (4).

E. hortense는 두관 (head w orm ) 및 두극 (collor spine )의 존재 와 좌축

방향으로 치우친 난소 (ov ary ), 충체 중심부에 위치한 전·후 고환 (t estes ),

구흡반에서 시작한 인두, 식도로 연결된 후 두 갈래의 맹장 (caecum )으로

나뉘어 충체 말단으로 이어지는 특징적인 구조를 보인다. 기생 부위는 종숙

주에서 소장 상부에 기생한다(1). 이 장흡충은 우리 나라, 일본 및 동남아시

아 지역에서 주로 분포하며 쥐, 개 등 포유동물이 자연계의 종숙주이다

(1,5,6,). 담수산 패류인 물 달팽이(R adix auricular ia )가 제 1 중간 숙주로

알려져 있으며 미꾸리, 버들치, 얼룩동사리 등을 비롯한 담수어나 개구리,

올챙이 등 양서류가 제 2 중간 숙주로 알려져 있다 (6- 8).

E. hortense의 인체 감염시 소화불량, 하복부 통증, 설사 등의 증상을 일

으키며 장기간 감염시 만성 흡수 장애를 초래한다는 보고도 있다 (9). 또한

감염된 사람은 상복부가 거북한 증상을 보이며, 근래에는 십이지장 궤양이

생긴 것을 보고한 예도 있다(4).

기생충의 인체 감염시 유도되는 면역 반응의 현상으로는 혈청 내의 IgE

의 항체가의 변화 (10- 15) 및 조직 내에서의 호산구의 침윤 현상을 (16- 18)

들 수 있다. 또한 실험적으로 기생충에 감염된 동물의 혈청 내에서도 IgE

의 항체가가 현저히 상승됨이 보고된 바 있다 (19- 23). 밝혀진 바에 의하면

im m un oglobulin의 변화나 조직에서의 변화는 cytokine과 직접적인 관련이

있는데 (24- 28) cyt okin e은 미생물, 기생충, 기타 다른 항원의 침입시 면역

반응이나 여러 염증 반응에 관여하는 단백질로서 림프구의 분화와 성장에

관여, 미생물이나 기타 항원들을 제거할 수 있도록 자극하는 역할을 한다

- 1 -

(29- 34). Cyt okine은 크게 선천적인 면역 반응을 유도하고 정형화하는 것과

적응성의 면역 반응을 유도하고 정형화하는 것, 조혈 기전을 자극하는 것으

로 크게 종류를 나룰 수 있다. 그 중에서 적응성의 면역 반응을 유도하는

cyt okine을 다시 T h 1과 T h2로 나눌 수 있는데 T h 1 cyt okin e으로는 IL - 2,

IF N - γ, T NF - α등을 들 수 있고 T h2 cyt okine으로는 IL - 4, IL - 5 및

IL - 13 등이 있다. T h2 cyt okin e 중 IL - 4 는 면역 반응에 있어서 B 림프구

를 자극하고 IgE 의 isotype sw itchin g에 관여한다 (35- 38). 기생충의 감염

시 감염 환자에서 IgE의 항체가가 현저히 상승됨이 보고된 바 있으며, 실

험적으로 기생충에 감염된 동물의 혈청 내에서도 IgE의 항체가가 현저히

증가됨이 보고되고 있다(19- 23). IL - 5는 호산구의 활성화를 유도하고 T 림

프구의 활성과 호산구성 질환에 관여한다 (39- 42). 기생충의 감염 및 알레르

기성 질환의 환자에서 호산구의 역할이 밝혀져 왔고 조직 내에서 호산구의

침윤 현상 또한 보고되고 있다 (43- 46).

이번 연구에서는 E. hortense의 면역 기전에 관한 연구가 아직까지 부

족한 현실이고 특히 cyt okin e에 연관된 연구가 미흡한 상황이어서 in vit ro

실험을 통하여 E. hortense의 체항원과 배설 항원을 자극 원으로 하여 세포

배양 상태에서의 각각의 IL - 4와 IL - 5의 변화를 연구하였다.

- 2 -

제 2 장 재료 및 방법

1 . M ou s e s plen ocy t e s 의 분리 및 배양

대한 실험 동물 센터에서 공급받은 6주령된 fem ale BALB/ c (SPF )에서

비장을 적출 하였다. 적출한 비장은 DMEM (Gibco BRL, Hercules , CA ,

U .S .A )성장 배지에서 5㎖ syring e (Dong shin M edi- t ech , Korea )로

perfu sion을 실시하였다. 비장에서 세포의 분리후 RBC ly sis 용액 (Sigm a ,

St . Louis , M O, U .S .A )을 사용하여 RBC를 제거하였고 1200 rpm , 5 min 으

로 원심 분리를 실시하였다. 원심 분리된 splenocyt es는 DMEM 배지로 두

차례 세척 단계를 거쳤으며, 마지막 세척 단계에서 cham ber를 이용하여 세

포 수를 측정하였다. 측정된 세포는 10% F BS (fetal bovine serum ) (Gibco

BRL, Hercules , CA , U .S .A )가 첨가된 DMEM 배지에 분주하였고, 실험에

들어가기 전에 24시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 항습기 (NAP CO 6001,

W in chest er , VA , U .S .A )에서 안정화하였다. 실험에 사용된 세포의 수는

1X106 개로 하였다.

2 . E chinos t om a hor t ens e의 체항원 및 배설 항원의

제조

체항원의 제조는 E. hortense의 성충을 0.01 M PBS (ph osphat e buffered

salin e)에 3회 이상 수세한 후 충체를 0.01 M PBS 에 넣고 조직 마쇄기로

충체를 충분히 마쇄한 뒤 얼음이 담긴 용기에서 초음파 발생기

(u lt r asonocat or )로 100 w att에서 30초간 분쇄시키고 30초간 냉각시키는 과

정을 5회 되풀이하여 균질화 시켰다. 균질화된 검체를 4℃에서 하루 동안

방치한 후 4℃에서 15,000 rpm 으로 1시간 원침하여 상층 액을 얻고 이를

정량 하여 체항원으로 사용하였다. 체항원의 단백질 정량은 Low ry (47)의

- 3 -

방법에 따라 측정하였다.

배설 항원의 제조는 100 m l의 0.01 M sodium phosphat e buffer에 실험

동물에서 회수된 200개의 성충을 넣고 37℃ 항온 항습기 (JEIO T ECH ,

Korea )에서 12시간 방치하였고, 4℃에서 24시간 동안 투석을 (0.01M

T ris - HCl pH 7.4) 실시한 뒤, 4℃에서 15,000 rpm 으로 15분간 원침하여

상층 액을 얻었다.

3 . E chinos t om a hor t ens e의 체항원 및 배설 항원의

세포 독성 측정

M ou se splenocytes에 대한 E. hortense의 체항원 및 배설 항원이 세포

독성 능을 가지는지 알아보기 위해 MT T 법을 실시하였다. 먼저 t ryphan

blu e ex clu sion법을 통해 확인된 생존 세포 5X 104 개를 96 w ell m icroplat e

에 w ell당 100㎕씩 분주하였다. 체항원과 배설 항원의 농도를 0 m g/ ㎖,

0.025 m g/ ㎖, 0.05 m g/ ㎖, 0.1 m g/ ㎖, 0.3 m g/ ㎖, 0.5 m g/ ㎖, 0.7 m g/ ㎖, 1

m g/ ㎖가 되게 DMEM 성장 배지로 희석한 뒤 37℃, 5% CO2 항온 항습기

에서 24시간 동안 배양하였다. 다음으로 MT T 용액 (1 m g/ ㎖, Sigm a , St .

Louis , M O, U .S .A ) 50 ㎕를 각 w ell에 첨가하여 4시간 동안 항온 항습기에

다시 배양한 후, 1200 rpm에서 5분으로 원침한 뒤 배지를 완전히 제거하고

PBS (ph osphat e buffer ed salin e)으로 세척한 후 DM S O (Sigm a, St . Louis ,

M O, U .S .A )를 150 ㎕씩 분주하였다. 그 후 540 nm에서 ELISA

Reader (M olecular Devices , CA , U .S .A )로 흡광도를 측정하였다. 각 대조 군

과 실험 군은 동일한 것으로 3개씩 준비하여 3번 실험해서 나온 모든 값의

평균을 구해 이를 실험 값으로 취하였다. 세포 독성 능은 대조 군의 흡광도

에 대한 체항원과 배설 항원을 농도별로 처리한 실험 군의 흡광도를 %

surv iv al로 환산하였다.

- 4 -

4 . T ot al RN A 의 분리

체항원과 배설 항원 및 lipopoly sacch arides (Sigm a, St . Louis , M O,

U .S .A )로 자극한 splen ocyt es는 1200 rpm으로 5분간 원침한 뒤 상층 액을

제거하였다. RNA 분리 용액 (Intron , Korea )을 1 m l 처리한 뒤

chloroform :isoam ylalcohol (24:1, Sigm a, St . Louis , M O, U .S .A ) 200 ㎕ 과

혼합하고 4℃에서 13,000 rpm으로 15분 동안 원심 분리한 후 상층 액을

400 ㎕ 취하였다. 얻어진 상층 액과 isopropanol (M erck , Dam st adt ,

Germ any ) 400 ㎕를 조심스럽게 혼합한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분

동안 원심 분리를 실시한 후 상층 액을 제거하였다. 멸균한 0.01% DEP C

(Sigm a, St . Louis , M O, U .S .A )D.D .W .로 희석된 70% alcohol 400 ㎕를 넣

은 뒤 4℃에서 13,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리를 실시하였고 상층 액

을 완전히 제거하였다. 분리된 t ot al RNA 는 20 ㎕의 멸균된 0.01% DEP C

D.D.W .로 용해시킨 뒤 - 70℃에서 보관하였다.

분리된 t ot al RNA의 확인은 T BE buffer (T ris - b orat e/ EDT A

electrophoresis buffer , pH 8.0)를 사용하였으며, RNA sam ple 10 ㎕와 6X

loadin g buffer (Bio- Rad, U .S .A ) 4 ㎕를 섞어 100V , 1시간 동안 전기영동

을 실시하였으며, 1% agarose g el (In tron , Korea )을 사용하였다. 영동이 끝

난 gel은 자외선 광원 (Vilbert - Lourm at , M am e La V alle, F rance)위에 두

고 P olaroid film이 들어 있는 Phot o- Docum entation Cam era (F isher

S cient ific , PA , U .S .A )를 이용하여 254 nm에서 촬영하였다.

5 . R ev ers e tran s cription po ly m eras e ch ain

re ac tion (R T - P CR ) 의 실시

분리한 tot al RNA는 A ccuP ow er RT - P reMix (Bion eer , Korea ) 및 oligo

(dT )15 (Bion eer , Korea ) 200 pm ole을 사용하였고, 반응은 57 ℃에서 10 분,

42℃에서 60분, 94℃에서 5분 실시하여 cDNA를 합성하였다.

P CR 반응은 합성한 cDNA 5㎕ 에 dAT P , dGT P , dT T P , dCT P를 각각

- 5 -

2.5 m M 이 되도록 혼합한 dNT P (Intron , Korea )를 4 ㎕ 넣었다. 그 후

10X buffer (50m M KCl, 10 mM T ris - H Cl) (Intron , Korea ) 5㎕, 25 mM

M gCl2 (In tron , Korea ) 5㎕, prim er set 20 pm ole/ ㎕ (T able 1)를 각각 5

㎕, T aq polym erase 0.025 U (Intron , Korea )를 첨가하고, 멸균 증류수로

최종 반응하는 양이 50 ㎕가 되도록 하여 th erm al cy cler (MJ Reaserch ,

CA , U .S .A )에서 증폭하였다. 사용한 각각의 prim er는 β- act in , IL - 5 는 상

용화된 제품 (Bioneer , Korea )을 사용했고, IL - 4는 기존의 연구에서 사용된

것(48)을 주문하여 (Bioneer , Korea ) RT - P CR을 실시했다. 또한 M gCl2 의

경우 IL - 4는 β- act in , IL - 5의 경우에 사용된 양의 두배를 사용했다. P CR

반응은 β- act in의 경우 25 cy cle, IL - 4, IL - 5는 35 cy cle을 시행하였다. 반

응시 첫 cy cle 이 시작하기 전에 94℃에서 3분간 가온 한 후에 매 cy cle

당 94℃에서 1분간 denaturat ion , 60℃에서 1분 동안 annealing , 72℃에서

2분 동안 ex ten sion 반응을 시행하였고, 완전한 ex ten sion을 위해 72℃에서

7분 동안 지속하였다. 반응이 종료된 후에 0.5 ㎕/ m l 의 ethidium brom ide

(Bio- Rad, U .S .A )를 첨가한 1.5% agrose g el를 이용 100 V con stant로 전

기 영동 하여 cyt okin e의 발현을 확인하였고, 영동이 끝난 g el은 자외선 광

원 (Vilbert - Lourm at , M am e La V alle, F ran ce)위에 두고 P olaroid film이

들어 있는 Ph ot o- Docum ent ation Cam era (F ish er S cientific, PA , U .S .A )를

이용하여 254nm에서 촬영하였다.

6 . ELIS A 를 이용한 cy tokin e의 측정

M ou se splen ocytes를 체항원 및 배설 항원으로 자극하여 배양한 상층

액을 1 ㎖ 취하여 측정한 방법은 다음과 같다. IL - 4는 san dw it ch법을 이용

하여 측정하였으며, m on oclon al anti - m ou se IL- 4 Ab (R&D sy st em , MN ,

U .S .A )의 농도를 250 n g/ 100㎕가 되도록 PBS로 희석하여 poly styren

m icroplate (Costar , NY , U .S .A )의 각 w ell 에 100 ㎕씩 주입하여 4℃에서

24시간 반응시켰다. 이 m icroplat e를 PBST (phosph at e buffer ed

- 6 -

salin e- 0.05% T w een 20)로 5분간 3회 세척한 후 1% BSA (bovin e serum

album in )/ PBS 로 w ell 당 200 ㎕씩 분주한 후 실온에서 90분 동안 반응시

킨 후 m on oclonal ant i- m ou se IL - 4 Ab가 부착되지 않은 부위를 차단한 후

5분간 3회 세척하였다. 여기에 준비한 상층 액을 w ell당 100 ㎕씩 분주하고

실온에서 2시간 반응시켰다. Cyt okine 대조 w ell의 경우 IL - 4 cytokin e

(R&D sy st em , MN , U .S .A )을 1 ng/ 100 ㎕에서 18.75 pg/ 100 ㎕ 로 1%

BSA/ PBS로 단계별 희석하여 w ell 당 100㎕씩 분주하였다. 이것을 PBST

로 5분간 3회 세척하고 anti - m ou se IL - 4 poly clonal Ab (R&D sy st em ,

MN , U .S .A )의 농도를 20 ng/ 100 ㎕ 가 되도록 1% BSA/ PBS 로 희석하여

w ell 당 100 ㎕씩 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이것을 P BST 로 5

분간 3회 세척하고 hor seradish perox idase- r abbit anti - goat Ig G (Up st at e,

NY , U .S .A )와 P BST 에 1:3000으로 희석하여 w ell당 100 ㎕씩 분주하여 3

7℃에서 30분간 방치한 후 5분간 3회 세척하였다. 기질 액으로는 OPD

(orth o- ph enyleneediam in e) (Sigm a, St . Louis , M O, U .S .A ) 8 m g과 30%

H 2 O2 (F luk a , St . Louis , M O, U .S .A ) 5 ㎕를 0.1M ph osphat e cit r ate buffer

(pH 5.0) 12 m l 에 녹여 w ell당 100㎕씩 첨가하여 실온에서 빛을 차단한

후 20분 동안 방치하였다. 2N H 2S O4를 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시

키고 ELISA 광량계 (M olecular Dev ices , CA , U .S .A )를 사용하여 파장 490,

650nm에서 흡광도를 측정하였다.

IL - 5는 in dir ect법으로 실시하였으며, 측정 방법은 대조 w ell의 경우

IL - 5 cyt okin e (R&D sy st em , MN , U .S .A )을 1 ng/ 100 ㎕에서 18.75

pg/ 100 ㎕ 로 PBS에 단계별 희석하여 w ell 당 100 ㎕씩 분주하였고 다른

w ell에는 준비된 상층 액을 100 ㎕씩 poly styren m icroplate의 각 w ell에 주

입하여 4℃에서 24시간 반응시켰다. 이 m icroplate를 PBST (phosphate

buffer ed saline- 0.05% T w een 20)로 5분간 3회 세척한 후 1% BSA

(bovine serum albumin )/ P BS로 w ell 당 200 ㎕씩 분주한 후 실온에서 90

분 동안 반응시킨 후 5분간 3회 세척하였다. 여기에 ant i- m ou se IL - 5

poly clon al Ab (R&D sy st em , MN , U .S .A )의 농도를 20 ng/ 100 ㎕ 가 되게

- 7 -

1% BSA/ PBS 로 희석하여 w ell당 100㎕씩 분주하고 실온에서 2시간 반응

시켰다. 이것을 PBST 로 5분간 3회 세척하고 hor seradish peroxida se- r abbit

ant i - g oat IgG (Up st at e, NY , U .S .A )와 PBST 에 1:3000으로 희석하여 w ell

당 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 30분간 방치한 후 5분간 3회 세척하였다.

기질 액으로는 OPD (ortho- phenyleneediam in e) 8 m g과 30% H 2O2 5㎕ 를

0.1M ph osphat e cit r ate buffer (pH 5.0) 12 m l 에 녹여 w ell당 100 ㎕씩 첨

가하여 실온에서 빛을 차단한 후 20분 동안 방치하였다. 2N H 2S O4를 100

㎕씩 첨가하여 반응을 정지시키고 ELISA 광량계 (M olecular Devices , CA ,

U .S .A )를 사용하여 파장 490, 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.

- 8 -

T able 1. Cytokine prim er sequ en ces and am plified fr agm ent sizes

u sed in th is stu dy

Cyt okin e P rim er s equ ence (5 '→3 ' )

Am plified

fr agm ent

s ize (bp )

β - act in

S en s e

A ntis en s e

A GG CT G T GC T GT CCC T GT A T C C

A CC CA A GAA GGA A GG CT G GA A A

395

IL - 4

S en s e

A ntis en s e

T CT CT A GA T CA T GGG CA T T T T GA A CGA GGT C

T GC A T G A T G CT C T T T A GG CT T T CC

306

IL - 5

S en s e

A ntis en s e

A T G A CT GT G CCT CT G T GC CT G GA G C

CT G T T T T T C CT G GA G T A A A CT GGG G

243

- 9 -

제 3 장 연구 성적 및 결과

1 . E chinos t om a hor t ens e 체항원 및 배설 항원의

세포 독성

E. hortense의 체항원 및 배설 항원이 m ou se splenocyt es에 나타나는 세

포 독성을 MT T 법으로 조사하였다. 먼저 t ryphan blue ex clu sion법을 통

해 확인된 생존 세포 5x 104 개를 96 w ell m icroplat e에 w ell당 100 ㎕씩 분

주하였고 체항원과 배설 항원의 농도를 0 m g/ ㎖에서 1 m g/ ㎖ 로 조정하여

각각 처리하였다. 처리 후 24시간이 경과한 뒤에 MT T 법을 실시하여 540

nm에서 흡광도를 측정하고 이를 % surviv al로 환산하여 나타냈다 (F ig . 1).

체항원의 경우 0.5 m g/ ㎖까지, 배설 항원의 경우 0.3 m g/ ㎖까지 surv iv al

r ate가 감소하지 않는 결과를 보였다.

- 10 -

F igure 1. Cyt ot oxicity of E chin os tom a hortens e crude ant ig en and

E .S .P . t o m ou se splenocytes

- 11 -

2 . Lipopo ly s ac ch aride s (LP S )의 자극에 의한 IL - 4 ,

IL - 5 m RN A 의 발현

10% F BS를 첨가한 DMEM 성장 배지로 24시간 배양한 1x 106개의

m ou se splenocyt es에 LP S 250 ng/ ㎖을 처리하였고 시간별로 splen ocytes

를 모아 t ot al RNA를 분리한 뒤 RT - P CR을 실시하였다. LP S로 자극한

splen ocyt es에서의 IL - 4 와 IL - 5의 발현 양상은 IL - 4는 30분에서 나타나며,

3시간까지 감소가 지속되었고, IL- 5는 30분과 6시간에서 발현하며, 24시간까지 감소

되는 것을 관찰하였다 (Fig. 2). 여기서 사용된 LPS의 농도는 농도별 실험을 통하

여 IL- 4와 IL- 5의 발현이 일어나는 농도로 하였다.

- 12 -

F igure 2. In du ct ion of IL - 4 and IL - 5 m RNA in m ou se splenocytes

by tr eatm ent w ith lipopoly sacch arides (250 ng/ ㎖).

T ran script ion of IL - 4 an d IL - 5 w ere an aly zed after

incubat ing th e splen ocytes in the presen ce of v ariou s

am ount of LP S (a ) and at v ariou s t im e point s (b ).

- 13 -

(a)

(b)

IL-5

(243 bp)

beta-actin (395 bp)

IL-4 (306 bp)

M 0 0.5 1 3 6 9 12 24hM 0 0.5 1 3 6 9 12 24h

beta-actin (395 bp)

beta-actin

(395 bp)

IL-5

(243 bp)

beta-actin (395 bp)

IL-4 (306 bp)

M 0 100 250 350 500 ng/mL M 0 100 250 350 500 ng/mL

3 . E chinos t om a hor t ens e 체항원의 자극에 의한

IL - 4 , IL - 5 m RN A 의 발현

10% F BS를 첨가한 DMEM 성장 배지로 24시간 배양한 1x 106개의

m ou se splen ocytes에 체항원 50 ㎍/ ㎖을 처리하였고 시간별로 splenocyt es

를 모아 tot al RNA를 분리한 뒤 RT - P CR을 실시하였다. 처리한

splen ocyt es를 각각 시간별로 모아서 tot al RNA를 분리하였고 RT - P CR을

실시하였다. 처리된 splenocytes에서 IL - 4 와 IL - 5의 발현 양상은 IL - 4의

경우 자극 후 30분에서 발현하며, 다시 감소하다가 1시간 이후에 사라짐을 관찰할

수 있었고 IL- 5 역시 30분에서 발현하여 6시간까지 감소하다가 사라지는 결과를

보였다 (Fig. 3). 여기에서 사용된 체항원의 농도는 농도별 실험을 통해 확인된 결

과를 적용하였다.

- 14 -

F igure 3. Elav at ion of IL - 4 an d IL - 5 m RNA in m ou se splenocytes by

tr eatm ent w ith E chin os tom a hor tens e cru de ant igen (50 ㎍/

㎖).

T ran scription of IL - 4 and IL - 5 w ere analy zed aft er

in cubating the splenocytes in the presen ce of v ariou s

am ount of E chinos tom a hor tens e cru de ant ig en (a ) an d at

v ariou s t im e point s (b ).

- 15 -

(a)

beta-actin (395 bp)IL-4 (306 bp)

M 0 0.5 1 6 9 12h

beta-actin (395 bp)IL-4 (306 bp)

M 0 25 50 100 250 500 ㎍/mL

beta-actin

(395 bp)IL-5

(243 bp))

M 0 0.5 1 6 9 12h

beta-actin

(395 bp)IL-5

(243bp)

M 0 25 50 100 250 500 ㎍/mL

(b)

4 . E chinos t om a hor t ens e 배설 항원의 자극에 의한

IL - 4 , IL - 5 m RN A 의 발현

1x 106개의 m ou se splen ocytes에 배설 항원의 농도를 50 ㎍/ ㎖로 처리

하여 자극을 주었다. 처리한 splen ocyt es를 각각 시간별로 모아서 RT - P CR

을 실시하였다. 배설 항원으로 자극한 m ou se splenocytes에서 IL - 4, IL - 5의

발현 양상은 IL - 4의 경우 30분에서 최고치를 나타내며, 6시간까지 감소가 지속되

는 것이 관찰되었으며, IL- 5는 30분에서 발현하여 12시간까지 감소가 지속되는 것

을 확인할 수 있었다 (Fig. 4). 여기에서 사용된 배설 항원의 농도 역시 농도별 실

험을 통해 확인된 결과를 적용하였다.

- 16 -

F igure 4. Increase of IL - 4 an d IL - 5 mRNA in m ou se splen ocytes by

tr eatm ent w ith E chinos tom a hor tens e E .S .P . (50 ㎍/ ㎖).

T ran scription of IL - 4 and IL - 5 w ere analy zed aft er

in cubating the splenocytes in the presen ce of v ariou s

am ount of E chin os tom a hor tens e E .S .P . (a ) an d at

v ariou s t im e point s (b ).

- 17 -

(a)

(b)

beta-actin (395bp)

IL-4

(306 bp)

beta-actin

(395bp)IL-5 (243 bp)

M 0 25 50 100 250 350 500 ㎍/mL M 0 25 50 100 250 350 500 ㎍/mL

beta-actin (395bp)

IL-4

(306 bp)

beta-actin

(395 bp)

IL-5 (243 bp)

M 0 0.5 1 3 6 9 12h M 0 0.5 1 3 6 9 12h

5 . ELIS A 법에 의한 IL - 4의 발현 농도의 측정

1x 106개의 m ou se splen ocyt es에 체항원과 조항원을 각각 50 ㎍/ ㎖로 처

리하여 자극을 준 뒤 배양 시간별로 배지의 상층 액을 취하여 ELISA법을

실시하였다. ELISA법은 sandw it ch m ethod 방식으로 하였다. 체항원과 배

설 항원에 의한 자극 후 배양과 관찰을 30분에서 36시간까지 하였다. 그 결

과 체항원으로 자극한 경우 9시간 이후부터 발현된 IL - 4의 양이 증가하는

것을 알 수 있었고, 배설 항원의 경우에는 배양 뒤 1시간에서 36시간까지

측정하였으나 발현된 cytokin e양의 변화를 관찰할 수 없었다 (F ig . 5).

- 18 -

F igure 5. Ex pres sion of IL- 4 in m ou se splenocyt es by

tr eatm ent w ith E chinos tom a hortens e cru de antigen and

E .S .P . (50 ㎍/ ㎖).

- 19 -

IL-4

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 3 6 9 12 24 36h

Hours after stimulation

Dose

of cyt

okine (pg/m

L)

crude antigen

E.S.P.

6 . ELIS A 법에 의한 IL - 5의 발현 농도의 측정

1x 106개의 m ou se splen ocyt es에 체항원과 배설 항원을 각각 50 ㎍/ ㎖로

처리하여 자극을 준 뒤 배양 시간별로 배지의 상층 액을 취하여 ELISA법

을 실시하였다. ELISA법은 indirect m ethod 방식으로 하였다. 체항원과 배

설 항원에 의한 자극 후 배양 시간은 30분에서 36시간까지 하였으며, 체항

원으로 자극한 결과 9시간 이후부터 발현된 IL - 5의 양이 증가하는 것을 알

수 있었고, 배설 항원의 경우에는 배양 뒤 1시간에서 36시간까지 발현양에

변화를 관찰할 수 없었다 (F ig . 6).

- 20 -

F igure 6. Ex pres sion of IL- 5 in m ou se splenocyt es by

tr eatm ent w ith E chinos tom a hortens e cru de antigen and

E .S .P . (50 ㎍/ ㎖).

- 21 -

IL-5

0

20

40

60

80

100

0 1 3 6 9 12 24 36h

Hours after stimulation

Dose

of cyt

okine (p

g/m

L)

crude antigen

E.S.P.

제 4 장 고 찰

E chinos tom a hortens e의 인체 감염 예가 꾸준히 증가 (4)하고 있음에도

불구하고 아직까지 명확한 면역기전의 연구가 이루어지지 않았으며, 또한

cyt okine에 대한 연구 역시 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 기생충의 감

염시 체내의 면역 반응에 있어서 관련이 있는 것으로 알려지고 있는

IgE (10- 15)와 조직 내의 eosinophil (16- 18)기능과 작용 기전에 중요한 요인

으로 작용한다고 보고된 T h2 cyt okine 중 IL - 4와 IL - 5에 역점을 두었다.

IL - 4는 면역 반응에 있어서 B 림프구를 자극하고 IgE의 isotype sw it ching

에 관여한다고 알려져 있다 (35- 38). 기생충의 감염시 감염 환자에서 IgE의

항체가가 현저히 상승됨이 보고된 바 있으며, 실험적으로 기생충에 감염된

동물의 혈청 내에서도 IgE의 항체가가 현저히 증가됨이 보고되고 있다

(19- 23). IL - 5는 호산구의 활성화를 유도하고 T 림프구의 활성과 호산구성

질환에 관여한다고 밝혀졌다 (39- 42). 기생충의 감염 및 알레르기성 질환의

환자에서 호산구의 역할이 밝혀져 왔고 조직 내에서 호산구의 침윤 현상

또한 보고되고 있다 (43- 46).

기생충의 체항원에 관한 연구로서는 S chis tos om a m ans on i의 체항원

(w orm or egg )으로 splenocyt es를 자극한 경우의 T h2 cytokine발현에 관

한 연구에 의하면 T h 1 cyt okine과 발현 양상에 차이가 있음을 보고하였으

며(49), m icrobial A g으로 CD4+ cell을 자극하여 cyt okine의 발현을 연구한

경우에는 IL - 4의 빠른 발현 양상을 보고하였다 (50). 또한 L eishm an ia

m aj or의 경우 in vitro에서의 연구 결과와 실험 동물에서의 연구결과가 일

정 부분 동일하게 나타났음을 보고하였다(51).

이번 E. hortense를 대상으로 한 연구에서 RT - P CR 로 알아본 m RNA의

발현 양상을 보면, IL - 4 의 경우 체항원으로 자극한 경우는 자극시킨 후 30

분에서 발현하며, 다시 감소하다가 1시간 이후에 사라짐을 관찰할 수 있었고, 배설

항원으로 자극시킨 경우 30분에서 최고치를 나타내며, 6시간까지 감소가 지속되는

- 22 -

것이 관찰되었다. 또한 IL- 5 의 경우 체항원의 자극시 30분에서 발현하여 6시간까

지 감소하다가 사라지는 결과를 보이며, 배설 항원으로 자극한 경우 30분에서 발현

하여 12시간까지 감소가 지속되는 것을 확인할 수 있었다 (Figure 3, 4). 기생충의

체항원 및 기타 다른 자극원에 대한 IL- 4와 IL- 5의 mRNA의 변화에 관한 연구 중

Shis tosoma mansoni에 감염된 rat 에 있어서 splenocytes를 배양하여 Shistosoma

mansoni의 체항원으로 자극한 후 IL- 4와 IL- 5의 발현 양상을 연구한 결과에 있어

서는 각각 cytokine의 발현 시간이 현저히 다름을 보고하였고(52), alveolar

echinococcosis환자 및 대조 군의 peripheral blood mononuclear cells에 E.

m ultilocularis의 체항원으로 자극하여 cytokine의 변화를 관찰한 연구에서는 IL- 4의

경우 24시간 이상 cytokine의 발현이 지속되었다고 보고한 반면, IL- 5의 경우에는

발현이 되지 않았다고 보고하였다(53). 또한 heat- inactivated B rucella abortus를

자극 원으로 하여 CD4+ 와 CD8+ T cells에서의 cytokine mRNA의 변화를 관찰한

연구에 있어서는 IL- 4와 IL- 5 모두 발현이 관찰되지 않았다고 보고하였다(54). 이상

의 결과를 볼 때 기생충 체항원의 자극에 따른 IL- 4와 IL- 5의 mRNA 발현 양상은

숙주 및 감염 상태 그리고 기생충의 종류에 따라 각각 다른 양상을 보이고 있으며,

배양된 세포의 차이나 자극원의 차이에 의해서도 결과가 현저히 차이가 나타남을

알 수 있겠다. 이는 기생충의 체항원과 면역 반응의 관계를 연구함에 있어서 결과

의 다양성을 예상할 수 있다.

이번 연구의 결과에서 E. hortense의 체항원과 배설 항원의 자극에 따른 결과를

보면 각각 IL- 4와 IL- 5의 발현 양상이 다름을 알 수 있는데 이 결과 역시 자극원의

차이에 따른 결과라 할 수 있겠다.

m RNA의 발현 양상을 연구한 후 실시한 cytokine의 발현 양을 ELISA

법으로 측정한 실험에서는 자극원에 따른 cyt okin e의 발현 양이 체항원으로

자극한 경우 IL - 4는 배양 시간 9시간에서 발현하는 cytokin e의 양이 증가

하는 결과를 보였고, IL - 5 역시 9시간에서 발현 양이 증가하는 결과를 나타

내었으나, 자극하였을 경우 증가하는 cyt okin e양의 비율이 IL - 4가 현저히

높았다. 배설 항원의 자극에 의한 결과를 살펴보면 IL - 4, IL - 5 모두 1시간

에서 36시간까지 발현양의 변화를 관찰할 수 없었다 (Figure 5, 6). 기생충

- 23 -

배설 항원에 관한 다른 학자들의 연구를 살펴보면 LP S로 자극한 m urin e

m acrophag e에 대하여 Sp irom etra er inace ieurop ae i 배설 항원을 처리한 결

과 T h 1 cyt okin e중 tum or n ecrosis factor - α 유전자의 발현이 억제되는 연

구가 보고(55)된 바 있으나, IL - 4, IL - 5에 대한 다른 연구 결과는 찾아볼

수 없었다. ELISA 방법으로 측정한 cytokine의 발현 양을 비교한 결과

IL - 4가 IL - 5보다 체항원으로 자극하였을 경우 증가하는 비율이 크게 나타

남으로써 IL - 4가 IL - 5보다 강하게 유도되고 있음을 알 수 있었다.

이번 연구를 통해 얻은 결과는 세포 배양 상태에서 RT - P CR 기법을 이

용하여 E. hortense의 체항원 및 배설 항원에 의한 자극으로 IL - 4 와 IL - 5

가 각각 시간에 따른 m RNA의 발현 양상에 차이가 있음을 알 수 있었다.

또한 ELISA방법을 이용하여 IL - 4와 IL - 5의 양을 측정함으로써 체항원의

자극에 유도되는 IL - 4와 IL - 5의 양에 차이가 있음을 알 수 있었고, 배설

항원으로 자극이 되었을 경우는 cyt okine 발현 양의 차이를 관찰할 수 없었

으며 추후 더 구체적인 연구가 있어야 할 것으로 생각된다. 특히 실험 동물

을 통한 연구가 필요하며, IL - 4와 IL - 5의 발현 양상과 더불어 체내의 IgE

의 변화, 조직 내의 호산구의 변화 및 기타 여러 면역 반응과의 관계를 연

구하는 것이 중요할 것으로 사료된다.

본 연구는 in vitro에서 면역 반응 세포중 splenocytes를 배양하여 직접

체항원과 배설 항원을 처리하여 결과를 본 것으로, E. hortense의 체항원 및

분비 배설 항원 특성과 T h 2 cytokin e 유도 유무를 확인하였다.

- 24 -

제 5 장 결 론

E chinos tom a hortens e의 체항원 (cru de antigen )과 배설 항원

(ex cret ory - secretory product ; E .S .P .)이 m ou se splenocyt es에 자극 원으

로 사용되었을 경우 splen ocyte에 세포독성능이 있는지 알아보기 위해

MT T 법을 이용하였다. 각각의 자극원이 작용된 m ou se splenocytes에서

tot al RNA의 분리 및 RT - P CR을 실시하여 IL - 4와 IL - 5의 mRNA 발현 양

상을 확인하였다. 또한 각각의 자극원에 대하여 발현된 cytokine의 양을 측

정하기 위해 ELISA법을 실시하여 IL - 4 와 IL - 5가 유도된 양을 측정하였

다. 본 실험에서 얻은 결과는 다음과 같다.

1. MT T 방법을 통해 확인한 E. hortense의 체항원 및 배설 항원은 체항

원의 경우 0.5 m g/ ㎖까지, 배설 항원의 경우 0.3 m g/ ㎖까지 세포 독

성능이 없음을 확인하였다.

2. LP S (250 ng/ ㎖)로 자극된 splenocyt es에서의 IL - 4, IL - 5의 m RNA

발현 양상은 IL - 4는 30분에서 나타나기 시작하여, 3시간까지 감소가 지

속되었고, IL- 5 는 30분과 6시간에서 발현하며, 24시간까지 감소되는 발현

양상을 알 수 있었다.

3. E. hortense의 체항원 (50 ㎍/ ㎖)으로 자극하였을 경우 IL - 4 m RNA는

자극시킨 후 30분에서 발현하며, 다시 감소하다가 1시간 이후에 사라짐을

관찰할 수 있었고 IL- 5 m RNA 역시 30분에서 발현하여 6시간까지 감소하

다가 사라지는 결과를 보였다.

- 25 -

4. E. hortense의 배설 항원 (50 ㎍/ ㎖)으로 자극한 m ou se splen ocyt es에

서는 IL - 4 mRNA의 경우 30분에서 최고치를 나타내며, 6시간까지 감소가

지속되는 것이 관찰되었으며, IL- 5 m RNA는 30분에서 발현하여 12시간까

지 감소가 지속되는 것을 확인할 수 있었다.

5. 체항원과 배설 항원의 자극시 발현되는 cyt okine의 결과를 살펴보면

체항원의 경우 IL - 4는 배양 시간 9시간에서 발현양이 증가하는 것을

알 수 있었고, IL - 5 역시 9시간에서 발현 양이 증가하는 것을 알 수

있었으며, 자극 후 증가된 cytokine 양의 변화 비율은 IL - 4 가 현저

히 높았다.

6. 배설 항원의 자극에 의한 발현되는 cytokine양의 결과를 살펴보면

IL - 4와 IL - 5역시 1시간에서 36시간까지 변화를 관찰할 수 없었다.

위의 실험 결과로 볼 때 m ou se splenocyt es에서 E. hortense의 체항원과

배설 항원의 자극에 따라 IL - 4, IL - 5 m RNA의 시간에 따른 발현 양상

이 차이가 있음을 관찰하였으며, ELISA로 cyt okine의 양의 측정시 체항

원에 자극에 따른 IL - 4 와 IL - 5의 변화를 관찰하였고, IL - 4 가 IL - 5

보다 강하게 유도됨을 알 수 있었다.

- 26 -

참 고 문 헌

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A b s trac t

Profile s of T h2 Cy tokine Ex pres s ion in

Mouse Splenocytes after Stimulation w ith

E chinos toma hortens e Crude A ntig en and

Ex cretory - S ecretory Product

Sung, Ho Joong

Dept . of Biomedical Laboratory Science

The Graduate School

Yonsei University

In this study, 6 week- old female BALB/ c mice were used to obtain

splenocytes. This splenocytes were examined for the Th2 cytokine expression

after treatment with Echinos toma hortense crude antigen, E.S.P. and

lipopolysaccharide by time- dependent assay . Among the Th2 cytokines, IL- 4 and

IL- 5 were selected and β- actin was used to house keeping gene during

RT - PCR. RT - PCR technique was used to detect Th2 cytokine mRNA

expression in splenocytes and ELISA was used to examine the concentration of

increased cytokine in splenocytes culture supernatant .

- 36 -

The result of Th2 cytokine mRNA expression with RT - PCR, in the cases

of IL- 4 and IL- 5 with treated by crude antigen(50 ㎍/㎕), IL- 4 mRNA

expression was peak at 30 min and continued to 1 hour, and IL- 5 mRNA

expression was peak at 30 min and continued to 6 hour s. And another case of

IL- 4 and IL- 5 with treated by E.S.P.(50 ㎍/ ㎕), IL- 4 mRNA expression was

peak at 30 min and continued to 6 hours, and IL- 5 mRNA expression was peak

at 30 min and continued to 12 hours. The last case of IL- 4 and IL- 5 with

stimulation by LPS(250 ng/ ㎕), IL- 4 mRNA expression was peak at 30 min and

continued to 3 hours, and IL- 5 mRNA expression was peak at 30 min and 6

hours, and continued to 24 hours. MTT assay was used to examine cytotoxic

effect on mouse splenocytes of crude antigen and E.S.P. These stimulator did

not have cytotoxicity to mouse splenocyte. In this case, the result of cytotoxicity

was converted to survival rate of percentage and the optimal doses of crude

antigen and E.S.P. were 0.3 mg/ ㎕ and 0.5 mg/ ㎕.

T o detect the dose of increased cytokine in culture supernatant , ELISA

method was used. The consequence of IL- 4 and IL- 5 with activation by crude

antigen, IL- 4 cytokine was more induced in 9 hours than IL- 5. In other case of

IL- 4 and IL- 5 with activation by E.S.P., both of IL- 4 and IL- 5 was not

increased in 1 hour to 36 hours.

In conclusion, E. hortense crude antigen might have play the roles of

stimulator to mouse splenocytes and IL- 4 was more induced than IL- 5 during

stimulation with crude antigen.

Key w ords : E chinos tom a hor tens e , crude antigen , E .S .P ., splen ocytes ,

RT - P CR, ELISA

- 37 -