86 Won~aa~ M~LLEI~.: Eine einfaehe Pr~cipi~ationsreaktion Klinisehe Woehenschrift

z. B. aueh nieht m6gIieh, etwa durch CMeiuminfusionen eine Mangelraehitis zu heilen. Hierzu ist vielmehr eine besondere Aktivit~t erforderlieh, die die eharakteristi- sehe Eigensehaft des ,,Vitamin D" darstellt und deren Anwesenheit allein das Auftreten einer l~aehitis ver- hindert. Zur Entfaltung dieser spezifischen (antirachi- tischen) Wirkung genfigen jedoeh im Gegensatz zu der weniger spezifisehen ~ eMeiumresorptionsfSrdern- den bzw. blutkalksteigernden Aktivit~t sehon reeht geringe Quantit~ten eines entsprechenden Agens, und dies ist ja aueh der Grund, weshalb man das ,,anti- raehitische Prinzip" den Vitaminen zuordnet ~a.

3. Wenn abet aueh zttr Verhfitung einer Raehitis bei Menseh nnd Tier bereits Bruehteile yon Milli- grammen genfigen, so wird das Tempo einer t~aehitis- heilung doeh mM~geblieh yon der zugefiihrten Vit- amin D-Menge beeinfiuftt n. Diese Tatsaehe bildet die Grundlage der sog. Vitamin D-Stofttherapie, und ihre Erfolge sind naeh heutigem Wissen darauf zurfiekzu- ffihren, daft auf Grund der dabei zur Anwendung ge- langenden Vitaminmengen sich die antiraehitisehe und die ealeiumresorptionsfSrdernde V~irkung so erg~nzen, dag nieht nut der spezifisehe Ossifizierungsfaktor zur Geltung gelangt, sondern aueh entspreehend reiehlieh Calcium an die KnochenbaupI~tze herangesehafft wird.

4. Diese letztgenannte Transportfunktion vermag nun aueh das Dihydrotaehysterin auszufiben (voraus- gesetzt, dag es in ,,Stoftdosen" verabreicht wird), ja bei peroraler Zufuhr sogar noeh st/~rker als Vitamin D a. ~¥enn abet eine entspreehende Anlieferung yon Cat- eium erfolgt, dann mfissen naeh allen heutigen Vor- stellungen~% ~ sehon geringe Mengen des ,,antiraehi- tisehen tb:inzips" genfigen, um seine geordnete Ver- wertung zu erm6gliehen.

Die zun~chst fiberrasehende Tatsa, ehe, daft sieh Dihydrotaehysterin in kleinen Quantit~ten als anti- raehitiseh weitgehend unwirksam, in gr6fteren Dosen hingegen Ms ebenso wirksam wie Vitamin D erweist, liege sieh also ohne weiteres damit erkl£ren, dag unter den letztgenannten Umst~nden seine (relativ starke) eMcinmresorptionsfSrdernde ~¥irksamkeit die an sieh

nur schwache antirachitische Aktivit~t entsprechend erg~nzt.

Wir sind uns durchaus darfiber im klaren, dab zur Sicherung eines so bedeutsamen Befundes eine Einzel- beobachtung nieht genfigt. Wit haben darum weitere einsehl~gige Untersuchungen begonnen, fiber deren Ergebnis wir zu gegebener Zeit beriehten werden. Gleiehwohl seheint uns der Tatbestand so wiehtig, daft wir schon jetzt eine vorl~ufige Mitteilung fiir gereehtfertigt halten. Dies um so mehr als sieh daran denken ]iefte, gewisse mit der Vitamin D-StoBtherapie der gachitis verbundene I~isiken in der Zukunft da- dutch zu verringern, dal3 man an Stelle yon Vitamin D Dihydrotachysterin verwendet, das erfahrungsgem~ft weniger zur Kumu]ierung neigt und damit aueh eine geringere Intoxikationsgefahr bieten dfirfte.

Zusa~nmenJassung. Dihydrotachysterin galt im Gegensatz zum Vitamin D bisher als antiraehitisch kanm ~drksam. Es wird nun fiber eine Vitamin D- Mangelrachitis bei einem 23 Monate alten M&dehen beriehtet, die dutch Gaben yon 2ram 15 mg Dihydro- taehysterin s hdst. in 51iger L6sung per os praktiseh ebenso wie durch Vitamin D beinfluBt werden konnte. Der Meehanismus dieses Effektes wird er6rtert und die sieh eventuelI dgraus ergebenden Folgerungen auf- gezeigt.

Literatur. ~ HOLTZ, F., u. E. S e ~ I ~ , : ttoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 191, 1 (1930). -o-- e WEanER. t~. V.: Hoppe- Seylers Z. physiol Chem. ~60, 119 (1939). -o- a WERDER, F. ¥. : Naturwiss. 411, 380 (]956). - - t VLIERVO1~T, J. L. J. VAN DE, P. W~ST~lZHO~, J. A. K~v~I~LI~a-BtJIS~ u. E. A. HAvn~a.a: Ree. Tray. ehim. Pyas-Bas 25, 1179 (1956). - - ~ JESSEItER, H. : Klin. Wsehr. 1958, 263. - - ~ JESSEREtt. I-I.: Dtsch. reed. Wsehr. 1958, 492. - - v EAR,art, G. O. : Mschr. Kinderheilk. 611, 262 (1935). - - s SImL, A. T., C. H. Y ~ and S. FAI~:EI~: Prec. Soc. exp. Biol. (N.Y.) 4~, 529 (1939). - - ~ S~AP~EI~, I. : Medical clinics on bone diseases, 2. Aufi. New York 1949. - - ~o SWO~ODA, W. : Die genuine Vitamin D-resistente R~ehit.is. Wien 1956. - - n JESSE]~ER, H.: OsteomMazie; Doeumenta rheuma~ologica Geigy, It. 14, 1958. - - ~ RVDDEg, B. DE: Ergebn. inn. Ned. u. Kinderheilk. 69, 275 (1941). - - ~ Gva- (~Nlt~D~, M.: Experientia (B~seI) 2, 48 (1946). - 14 JoEs* SElCEI~, tI.: Ther. d. Gegenw. 97, 131 (1958).

Doz. Dr. It. J:~ss]~l~IL I. Med. Univ.-Klinik Wien und Doz. Dr. W. Swo~oI)A, Univ.-Kinderklinik Wien.

EINE EINFACHE PRXCIPITATIONSREAKTION ZUM QUALITATIVEN 3~ACHWEIS DES .RHEUMAFAKTORS "~

Von

WOLFGANG MULLER

Aus der hiedizinischen UniversitAtsklinik Freiburg i . B r . (Direktor: Prof Dr. Dr. h. c. L . HI~I],MEYEII)

Seit der Beob~chtung W ~ 4 n ~ s 14 fiber das hgufige Vorkommen einer Agglutination sensibilisierter Sehafs- erythroeyten im Serum ehroniseher Polyarthritiden, die I~osE u. Mitarb. n als Charakteristicum dieser Erkrankung erkannten, sind versehiedene ~e~hoden zum Naehweis des Faktors, der das Agglutinations- phi~nomen auslSst und heute meist Ms ,,I~henma- faktor" (1~. F.) bezeiehnet wird, ausgearbeitet worden. Die ursprfingliehe Methode, die Differentialagglu- tination, wurde yon I:[ELL]~I~ u. Mitarb. s sowie SVA~TZ und SCELOSSM~SN I3 dutch Absorption der aueh im Normalserum vorkommenden tteteroantik6rper modi- fiziert und spezifiseher gestaltet. Spgtere Unter- suehnngen ergaben, dab nieht nur antikgrperbeladene Sehafserythroeyten, sondern aueh tanninvorbehan-

* Z{it Unterstiitzung der Deutsehen Forsehungsgemein- seh~ft.

delte mensehliehe Erythroeyten, die mit der Frak- tion I I des Humanserums beladen sind 7 und ferner mit inkompletten t~h-AntikSrpern ~,15 und inkom- plet ten~grmeautoantikSrpern 1° behaftete mensehliehe Erythroeyten dutch Seren ehroniseher Potyarthri- tiden zur Agglutination gebraeht werden k6nnen. Die Beobaehtung fiber die Agglutination der mit nor- malem 7-Globulin des mensehliehen Serums beladenen Erythroeyten im Serum ehroniseher Polyarthritiden 7 deutet darauf hin, dM3 die t{amagglutination im l~heumatikerserum bei all den erw/~hnten Methoden urs~ehlieh auf eine Reaktion des R. F. mit y-Globulin, oder einer seiner Fraktionen, zu denen aueh die er- wi~hnten AntikSrper reehnen, zurfickzuffihren ist. Auf einer solehen l~eaktion beruht anch der yon SINOm¢ und PLOTZ s entwiekelte Latexfixationstest, der noeh besser Ms die Hamagglutinationsreaktionen das Vet-

JR. 37, Heft2 WOL~'~A~G ~ i ~ L ~ : Nine eirffaehe Pri~eipitutionsreuktion 87 15. Januar 1959

k o m m e n des R . F . im Serum er fur t . Naeh den Un te r suehungen yon E~STEIN U. Mitarb . ~ a n d eigenen ]3eobgehtungenS, 9 f f ihr t d ie R e a k t i o n zwisehen y- Globul in und R. F. auch zu einer P rec ip i t a t ion , deren St~rke yore Gehal t des Serums an t~. t~. abhgngig ist. D u t c h die ]3est immung des St iekstoffgehal tes des Prge ip i t a t es a oder dureh S t reu l ieh tmessungen im GrenzseMehtreakt iometerS,S, ~ is t daher eine quan- t i t a t i v e Er fassung des R . F . auch ohne Zwisehen- schal tung agglu t in ie render Xorpuske l mSglieh.

D u t c h eine zuf~tlige ]3eobaehtung wurde yon FnANXL~ U. N i t a rb . s festgestel l t , dag die Pri~cipi- r a t ion zwisehen t~. F . a n d y -Globu l in dann besonders deu t l ieh zutage t r i t t , wenn das y -Globul in bere i ts i~lter is t odor kurzf r i s t ig auf 630 C erh i tz t wurde. An- seheinend neigen die dmoeh Lagerung oder E rh i t zung a l t e r i e r t en y-Globul inmolek i i l e in s t~rkerem MaBe zur Aggregat ion , so dab eine P rec ip i t a t i on bei B indung dieser Molekiile an andere Snbs tanzen deu t l i eher bzw. ve r s t~ rk t wird. Un te r Ausm~tzung dieses Phi~- nomens h a b e n EPSTEIN u. Mi tarb . ~ einen qna l i t a t iven P rgc ip i t a t i ons t e s t zum N~ehweis des R.. F. aus- gearbei te t , der wesent l ieh e infacher als die erw/ihnten Agg lu t ina t ions reak t ionen a n d q u a n t i t a t i v e n Pr~ci- p i t a t i ons t e s t e ist, die zudem serologisehe Er fah rungen voraussetzen. D a a b e r auch der yon EPSTEIN u. Mi ta rb . ~ en twieke l te qua l i t a t ive P r~c ip i t a t ions t e s t noeh einen gr6Beren Arbe i t s au fwand ver langt , haben wir versueht , d ie Methode noch wei ter zu vereinfaehen, u m die B e s t i m m u n g des g . F . in grSl3erem Umfang zu ermSgliehen. Zu d iesem Zweck wurde die R e a k t i o n zwisehen S e r u m a n d e rh i t z t em y-Globu l in in Glas- eapi l la ren ab laufen lassen und das Auf t r e t en yon P r~c ip i t a t en beobaeh te t . I n ghn]ieher Weise wurden schon yon F ~ N ~ L I N U. Mi ta rb . a einige Seren un te r - sueht .

Untersuchungsgut und Methodik Znm Naehweis des 1~. F. dureh die Pr~eipitationsreaktion

zwischen Patientenserum and y-Globulin in Glaseapillaren, die hier Ms Capillarpr~eipitationstest (CPT) bezeiehnet werden solI, ~ r d e n benutzt:

1. Glascupfllaren mi~ einer L~inge yon 8 em und einer liehten Weite yon etwa 5 ram.

2. Einf&ehe Capillarst~nder, Me sie aueh bei der Be- stimmung des C-reaktiven Proteins verwendet werden.

3. y-Globnlin]6sungen versehiedener Konzentr~tionen. Diese ~-arden aus einer kommerziellen 16%igen ~-Globulin- 16sung* dureh Verdfirmung mit Borat-Kochsulzpufferl6sung hergestellt. Ffir den Test kam eine 0,5%ige, 1,0%ige und 2,5%igey-GlobulinlSsung zur Anwendung. Vor dem Gebraneh wurden diese L6sungen versehieden lunge auf 63 ~ C erhibzt. Nine Inkub&tionsdauer yon 10 rain reieht zum Nachweis des R. F. bereits aus. Da jedoch fiir die Grenzsehiehtreaktion eine 30 rain uuf 630 C erhitzte y-GlobulinlSsung verwendet wurde, wurde diese Zeitdaner der Erhitzung auch ffir die im CPT benutzten y-GlobulinlSsungen zu Vergleichszweeken beibe- ha, lten.

4. Klare, m6glichst frische Patientenseren. Nine Inuktivie- rung dieser Seren erwies sieh nicht als erforderlieh.

Der Test se]bsg ~u~rde folgenderma.Ben durchgeffihrt: Die Capillaren warden zun~ehst zu etw~ ~/a mit einer

der erwiihnten y-Globulinl6sungen geffillt und ansehlieBend die gleiehe Menge Patientenserum in die Capillare aufgesogen. Nine Trennung des Serums yon der y-Globulint6sung durch Lnftblasen ist zu vermeiden, da hierdureh eine Vermisehung der beiden Reak~unten verhindert wird. Dureh Drehen der Capit]~,ren ~drd eine Durehmischung des Serums und der y-Globulinl6sung angestrebt, anschliegend die Flfissigkeit etws~ in die Mitre der Capillare gebraeht nnd diese dann in einen C~pitla, rst~nder gestellt. Naeh 2stfindiger Inkubation

* Den Behring-Werken, M~rburg, sind wir ffir die ~ber- lassung des y-Globulins zu groBem Dank verpfliehtet.

im Brutsehrunk bei 370 C und weiterem AufenthMt im Eis- sehrunk fiber Naeht erfolgt die Ablesung der Prfi.cipitation. Entspreehend der Menge des aufgetretenen Pr/~eipitates wird die Reaktion mi~ ,0- -+ + + + bezeiehnef,.

In Paralleluntersuehungen zu dem CPT wurde die H~m- agglutinationsreuk~ion naeh WAALE~ ~4 und ROSE u. Mitarb. n in der Nodifika.tion yon SvA~Tz und Se~Loss~,I~t~-~ ~3 sowie der Latex-Fixationstest in der OriginMmethode yon SI~OE~ and PLOTZ 1~ durehgeffihrt. Zur Bestimmung der quantita- riven Precipitation zwisehen y-Globulin und Sermn wurde die GrenzsehiehtreaktionS,S. ~ unter Verwendung einer 0,5%igen, 30 rain bei 63 o C erbitzten y-Globulinl6sung and einer Ver- diinnung des Patientenserums yon 1:6 angewa.ndt. Auf Einzelheiten soll in dieser Arbeit nieht eingegangen werden, sondern lediglieh der Ausfatl dieser Reaktionen dem Resultut des CPT gegentibergestell~ werden.

Insgesamt warden Seren yon 224 Patienten, die an rbeu- mutisehen Erkr~nkungen unter Einschlug yon Arthrosen litten, untersueht **. Zu Vergleiehszweeken wurden die Seren yon 40 Patienten mit akuten und ehronisehen Entzfindungen, die nieht dem rheumatisehen Formenkreis zuzuordnen wuren und solehe yon 20 gesunden Blutspendern zur Untersuehung herangezogen. Bei einem Teil der Patienten mit rheumati- sehen Erkrankungen wurden im Vertauf der Erkrankung mehrfache Untersuebungen durehgefiihrt, so dug sieh die Zahl der insges~mt untersuehten Seren auf 329 belauft.

Ergebnisse

Bei de r Durehf i ih rung des Capi l la rprge ip i ta t ions- tes tes (CPT) wurden in or ien t ie renden Vorversuehen versehiedene K o n z e n t r a t i o n e n der y-Globu] inl5sung angewandt , die aueh verschieden lunge e rh i tz t worden waren. Schon bei Verwendung einer n ich t e rh i tz ten y-Globul in lSsung in einer K o n z e n t r a t i o n yon 0,5 bis 5,0% konn te bei Seren, die hohe T i t e rwer te in de r t t ~ m a g g l u t i n a t i o n s r e a k t i o n und d e m L a t e x - F i x a - t ions tes t sowie hohe Megwer tans t iege im Grenz- sch ieh t reak t iomete r ergaben, gelegentt ieh eine gering- fiigige Pr/~eipitat ion im CPT beobaeh te t werden. Dureh E rh i t zung der 7-Globul in]Ssung w~hrend 5 rain auf 63 o C st ieg die Zahl der Fi~lle, bei denen der CPT pos i t iv ausfiel, e rhebl ich an. Die sti~rksten Pr~i- eiloitationen wurden dann erhal ten , wenn die y -Globu- l inlSsungen 1 0 - - 3 0 r a i n bei 63°C erh i tz t worden waren. Bei de r Vei~,endung so vo rbehande l t e r L6- sungen wird, wie aus Tabel le I hervorgeht , d ie dureh

Tabelle 1. Vergleichende Untemuchungen iiber den Aus/all des Capillarpriic@itationstestes bei 250 Seren unter Beriiclcsichtigung

der Stiirke der Priicipitation

AusfalI des Capillar- pr/~cipicaMonstestes 0,5 % 1,0 % 2,5 %

neg'ativ (+) +

+ + + + +

+ + + +

Gesamtzahl der positiven Teste

176 4I 27

6 0 0

74

174 41 25 7 3 0

76

175 23 22 14

9 7

75

die R e a k t i o n zwisehen 1%. F. a n d y-Globul in auf- t r e t e n d e Pr/~eipitat ion im CPT mi t s te igender y -Globu- l i nkonzen t ra t ion s ta rker . W ~ h r e n d z. ]3. bei de r Un te r suehung yon 250 Seren m i t 0 ,5%iger y-Glo- bul in lSsung dreffaeh pos i t ive Pr~e ip i t a t ions reak- t ionen im CPT n ieh t beobaeh te t wurden, t r a t e n sie bei l % i g e r y-Globul in lSsung in 3 u n d bei Be- nu tzung yon 2 ,5%iger in 9 F~l len auf. E ine vierfaeh

** Die Seren warden urLs gr61~t~nteils yon IIerrn Dr. SeHvPP, Staatliches Rheumakrankenhaus ,,Landesbad" Baden-Baden zur Verffigung gestellt, dem wit hierfiir bestens danken.

7*

8 8 WOLI~GANG ~/IiJLL]~3R-" Eine einfache Pr/~eipitationsreaktion Klinische Wochenschrift

positive Reaktion wurde nur bei Verwendung der 2,5%igen y-GlobulinlSsung festgesteltt. Die ZaM der positiven Reaktionen steigt dagegeh mit zunehmender y-GIobulinkonzentration nieht nennenswert an. In einzelnen Fgllen wurden aber divergierende Ergeb- nisse im CPT bei Benutzung der verschiedenen y-Globulinkonzentrationen festgesteUt, indem der Test einmal nur mit sehwaeh konzentriei~en, ein anderes Mal nur mit einer sti~rker konzentrierten- y-GlobulinlSsung positiv ausfiel.

Eine auf 63 o C erhitzte 5,0%ige y-Globulinl6sung, wie sie EPSTEIN U. Mitarb. I in dem yon ihnen ent- wiekelten qualitativen Pr~eipitationstest anwenden, wurde fiir den CPT nieht benutzt, da bei Gebraueh einer solchen IAfsung Spontanaggregationen des y- Globulins auftreten k6nnen, die leieht mit Pr/~eipi- ta ten verweehselt werden k6nnen. Aueh mit den erhitzten y-Globulinl6sungen in niedrigerer Konzen- trat ion treten im CPT selten pr~eipitat~hnliche Aus- f/~llungen auf, die sieh yon echten Praeipitaten aber meist dadurch unterseheiden, dab sie sich nicht am unteren Ende der Fliissigkeitssgule absetzen oder fiber die Capillare naeh un~en zu verteil~ sind, sondern sieh vor- wiegend im oberen Bereieh der Flfissigkeitssgu]e, meist an ihrem oberen Rand ansammeln. Diese Ausfgllungen kamen bei unseren Untersuehungen um so hgufiger vor, je h6her die y-Globulinkonzentration war. Ferner bestand eine Abhi~ngigkeit yon der Dauer der Er- hitzung des benutzten y-Globulins. Uber l~ngere Zeit erhitzte y-Globulinl6sungen zeigten eine st~rkere Neigung zur Spon~anaggregation als kurzfristig er- hitzte. Die Dauer der Inkubat ion der y- Globulinl6sung kann deshalb noeh yon 30 rain bis auf 10 rain redu- ziert werden. Auch bei Benutzung alter Seren fiir den CPT treten Spontanaggregationen eher auf als bei frisehen Seren, weshalb nur frisehe Seren ftir den Test verwendet werden sollen.

Die vergleiehenden Untersuehungen zwischen dem Ausfall des CPT bei Benutzung erhitzter 0,5%iger, 1,0%iger und 2,5%iger y-Globulinl6sung und dem- jenigen der tt/~magglutinationsreaktion, des Latex- Fixationstestes und der Grenzsehiehtreaktion sind in Tabel le2 zusammengefaBt. In den drei oberen Spalten dieser Tabelle sind die Ergebnisse der H~m- agglutinationsreaktion, des Latex-Fixat.ionst~estes und der Grenzsehiehtreaktion, soweit sie positiv waren, einzeln in ihrer Beziehung zum Ausfall des e P T auf- gefiihrt. Da aueh die It/imagglutinationsreaktion, der Latex-Fixationstest und die Grenzsehiehtreaktion nieht immer gleiehat~ige Resultate ergeben, wurde in den unteren Spalten ein Vergleieh des CPT mit den an Einzelseren beobaehteten versehiedenartigen Kom- binationen der Resultate der drei iibrigen Reaktionen durehgefiihrt.

}Vie aus der Tabelle hervorgeht, bes~eht in der fiberwiegenden Zahl der Fglle ein gleiehartiger Ausfall yon H/imagglutinationsreaktion, Latex-Fixationstest und Grenzsehiehtreaktion mit dem CPT. Am deut- liehsten ist die Parallelit~t zwisehen Ergebn~s des CPT und dem der Grenzsehiehtreaktion, die ja praktiseh auf dem gleiehen Prinzip wie der CPT beruht, jedoeh empfindlieher Ms dieser ist. Bei Ver- wendung der 0,5%igen y-Globulinl6sung fiir den CPT zeigten 68 yon 84 Seren mit positiver Grenzsehieht- reaktion einen positiven Ausfall aueh im CPT. Dureh Benutzung hSherprozentiger y-GlobutinlSsungen ftir

Tabelle 2. Aus]atl des Capillarpr&ipitation.stestes unter Ver- wendung verschiedener y-Globuh:nkonzentratio~en in Beziehunff zur Hiimagglutinations-t~ea~tion nach ~ E I ~ und RosE, dem Z, atex-Fixationstest nach SrNGER und PLO:rZ und der Grenz-

sddchtreaktion

Ausfall des Capillar- pr~cilaitationstestes

llimagglutinations - Reaktion(HAg)

nach ~VAaLE~ U. ROS~ positiv . . . . .

Latex-Fixationstest

(LFT) naeh SINGEI~ U. PLOTZ positiv .

Grenzsehiehtreaktion (GR) loositiv . . . .

lIAR, LFT und GR positiv . . . . . .

LFT und Gt~ positiv, HARnegativ . . .

HAg und LFT positiv, Gt~ negativ . . . .

HAg positiv, LFT und GR nega~iv . . . .

LFT positiv, HAR und GR negativ . . . .

HAR und GR positiv, LFT negativ . . .

Gt~ positiv, HAR und LFT negal~iv . . .

Alle geaktionen negativ . . . . . .

den CPT stieg die Zahl der F~,lle mit konkordant positivem Ergebnis beider Reaktionen auf 71 an. Trotz einer positiven Grenzsehiehtreaktion (die z .T . allerdings nur sehwaeh positiv war, wie aus Abb. 1 ersiehtlieh) blieb der Capillartest bei 13 bzw. 16 yon 84 F/~llen negativ. Ein umgekehrtes Verhalten: Pr/~- eipitation im CPT bei negativer Grenzsehiehtreaktion wurde in 5 bzw. 4 und 3 derjenigen F/~lle beobaehtet, bei denen die Hgmagglutinationsreaktion und/oder der Latex-Fixationstest positiv waren.

Gegen/iber dem Ausfall der H~magglutinationsreak- tion und des La~ex-Fixationstestes zeigt der CPT etwas stgrkere Abweiehungen, als sie zwisehen Grenzsehieht- reaktion und OPT vorhanden sin& Dies kann z. T. damit erklgrt werden, dab die Fi~lle mit positiver I-Igmagglu- tinationsreaktion und/oder positivem Latex=Fixations- test, abet normaler Grenzsehiehtreaktion meist nu t niedrige Titerwerte in den Agglutinationsreaktionen aufwiesen, der R . F . also nur in geringer Konzen- trat ion im Serum vorhanden war, die nicht ausreiehte, um eine Prgeipitation auszulSsen. Bei einem Teil dieser F~lle muB aueh ein falseh positiver Ausfall besonders der H~magglutination angenommen werden, worauf an anderer Stelle (9a) u ther eingegangen ist. Dort ist aneh dargelegt, dab in seltenen ~:gllen Un~ersehiede der die t tgmagglutination und Precipitation aus- 15senden Faktoren die divergenten Ausfglle der ent- spreehenden Teste erkl/~ren k6nnen.

Seren, die sowohl mit der Hiimagglutinations- reaktion wie aueh mit dem Latex-Fixationstest und der Grenzsehiehtreaktion positive Resultate ergaben, wiesen noeh in etwa 16% einen negativen CPT auf. Da naeh den Ergebnissen der drei erstgenannten Reaktionen wie aueh auf Grund yon Untersuehungen

Jg . 37, H e f t 2 W O L ~ ' G A N G IV[~LL:ER: E i n e e i n f a e h e P r i ~ e i p i ~ a t i o n s r e a k t i o n 89 15. 7%nuar 1959

der aus den Seren gewonnenen Ki~Itepr~eipitate als sieher angenommen werden konnte, dag diese Seren den 1~. F. enthielten, ist der CPT bei diesen F~tlten als falseh negativ zu bezeiehnen. Je hSher die Titerwerte der Agglutinationsi'eaktionen und die N[el3- wertanstiege in der Grenzsehiehfreaktion yon diesen Seren waren, desto seI~ener kam ein soleh Ialsch negativer CPT vor. Die Ursaehe der falsch negativen Result~te kann abet nieht allein mit einer geringen Konzentration des l~. F. im Serum erkl~rt werden, da einzelne Seren bei Kontrolluntersuchungen unter Ver- wendung der gteiehen oder einer anderen y-Globulin- konzen~ration einen posigiven CPT ergeben. Um daher falsch negative Resultate mSgtiehst zu vermeiden, sind Doppelbestimmungen des CPT, eventuell mit y-GlobutinlSsungen versehiedener Konzentration rat- sam, da in einigen F~llen wohl die Konzentration der Reaktanten ffir den weehselnden A usfall des CPT vera.ntwortlieh zu maehen ist.

Ein positiver CPT kann, wie aus Tabelle 2 hervor- geht, aueh noch bei einem Tell derjenigen Seren erziel~ werden, die nur mit einem der drei / ibrigen Teste positiv reagieren. Nur selten wird dagegen mit Seren, in denen diese drei Teste negativ sind, eine Priieipitation im CPT beobachtet. Da diese FNle vorwiegend bei solehen Erkrankungen vorkamen, bei denen das Auftreten des P~. F. im Serum nieht zu erwarten ist, ist anzunehmen, dab es sie h hierbei um falseh positive CPT handelt. Ob die Ausf~llungen bei diesen CPT z. T. Spontanaggregationen des erhitzten y-Globulins entspraehen, l~6t sich nieht entseheiden.

Wie sehon kurz erw~hnt, kann man bei Verwen- dung einer 2,5%igen y-Globulinl6sung im CPT eine gewisse Beziehung zwischen Menge des gebildeten Precipitates und den Titerwerten der I{~Inaggluti- nationsreaktion und des Latex-Fixationstestes sowie den Megwertanstiegen bei der Grenzsehichtreaktion beobaehten. Dies geht aus Abb. 1 hervor, in der die Titerwerte des Latex-Fixationstestes sowie die Me6- wertanstiege bei der Grenzschiehtreaktion in Be- ziehung zu der Menge der im CPT bei Verwendung einer 2,5%igen y-GlobulinlSsung aufgetretenen Pre- cipitate aufgezeichnet sind.

Benutzt. man eine 0,5% oder 1,0%ige y-Globulin- 15sung ffir den CPT, so kSnnen solehe Beziehungen, die aueh auf Grund des CPT allein gewisse quantita- tive Aussagen fiber den R . F . ermSgliehen, nieht mehr sicher festgestellt werden.

Die Paralleliti~t zwisehen Ausfall des CPT und dem der tIiimagglutinationsreaktion, des Latex- Fixationstestes und der Grenzsehiehtreaktion sprieht daffir, dal] die in den Capillaren auftretenden Pr~- eipitationen in der fiberwiegenden Zahl der F~lle dureh den Gehalt des Serums an R. F. bedingt sind. Ent- spreehend der Parallelit~t zwisehen den einzelnen Testen ist zu erwarten, dab der CPT bei den gleiehen Krankheitsgruppen positiv ausfiillt, bei denen aueh die fibrigen drei ge~ktionen positiv sind, also vor- wiegend bei der prim~ir ehronisehen Polyarthritis, ffir die das Vorkommen des R . F . im Serum ja kenn- zeiehnend ist. Tabelle 3 gibt einen Uberblick fiber die Ergebnisse des CPT im Vergleieh zur Hiimaggluti- nationsreaktion, dem Latex-~ixationstest und der Grenzsehiehtreaktion bei 20 gesunden Personen und 264Pa~ienten, unter denen 224 an rheumatisehen Erkrankungen in weiterem Sinne litten.

Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, ist der OPT wie die fibrigen lZeaktionen arr~ h/iufigsten bei der primgr ehronisehen Polyarthritis positiv, and zwar bei 75% der Patienten. Die anderen Reaktionen zeigen bei dieser Erkra.nkung in einem etw&s hSheren Prozentsatz positive Ergebnisse. Von der prim/~r ehrolfisehen Potyarthritis mit kontinuiertieh pro- gredientem Verlauf wurden in Tabelle 3 diejenigen ehronischen PolyaI~hritisformen abgetrennt, die einen

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% lYesswer/ansh'e# &bb. 1~ u. b. Ausfall des CPT bei Benutzung einer 2 ,5%igen y-Globulin-

15sting im Vergleich zu a den Ti te rwer ten des La tex-Fixa t ions tes tes , b zu den MieBwert~astiegen bei der Grenzschichtreakt ion

cyclis(hen Krankheitsverlauf mit Exaeerbationen und z. T. jahrelang anhaltenden Remissionen zeig- ten. Bei dieser Krgnkheitsgruppe sind die einzel- nen ]~eaktionen meist negativ. Der CPT ist hierbei wie bei den sog. sekundar ehronischen Al~hritiden noch seItener positiv als die anderen l~eaktionen, die bei diesen Erkrankungen meist nut sctiwaeh positive Werte erkennen liegen. Auch bei den iibrigen auf- geffihrten Gelenkerkrankungen sind negative Re- sul~ate der zur Diskussion stehenden Reaktionen die Regel. Soweit der CPT bei diesen F~llen positiv aus- riel, zeigte er hgufiger eine Diskordanz mit den Ergeb- nissen der Itgmagglutinationsreaktion, des Latex- Fixationstestes und der Grenzsehiehtreaktion als bei der primer ehronischen Polya~hritis. Solehe dis- kordanten Ergebnisse fanden sieh aueh bei nieht- rheumatiset/en Erkrankungen und bei gesunden Per- sonen. Es ist anzunehmen, dab es sieh bei diesen F~Ilen um falseh positive CPT handelte, da die iibrigen

9 0 WOLFGANG MiJLLER: E i n e e i n f a e h e Pr~cipitationsreaktion Klinisohe Woehensehrift

l~eaktionen negativ waren and einige der Patienten bei sp~teren Kontrollen einen negativen CPT zeigten. Bei der prim/it chronisehen Polyarthrit is bleibt ein eimnal positiver CPT ~hnlich wie die anderen drei Reaktionen im Ver]auf der Erkrankung meist dauernd positiv.

Tabelle 3. A~us/all des Capillarpr~ic@itationstestes im Vergleich zu der Hiimagglutinationsreaktion, dem Latex-Fixationstest and der Grenzschichtrealction bei den verschiedenen Erlcranlcungen des

rheumatiseher~ Pormenlcreises sowie nicht-rheumatischen Erlcrankungen und gesunden Personen

Diagnose Zahl KPT der

F~ille +

Primer chronische Polyarthritiden Chronische Polyarthritiden mit

eyelisehen Verlauf . . . . . Sog. sekundar chronisehe Poly-

a.rthritiden . . . . . . . . . Rheuma~oide . . . . . . . . . Morbus Beehterew . . . . . . Chronisehe Gelenkerkrankungen

versehiedener anc[erer Genese (Psoriatische Arthrop~thie, Gieht, Lupus erythematosus disseminatus usw.) . . . . .

Arthrosen . . . . . . . . . . Nieht-rheumatisehe akute und

ehronisehe Erkrankungen . . Gesunde Personen . . . . . .

62

81

10 1 6

21

29 15

40 2O

t t~magglu. Latex- t inations- Fixations-

test + test + (ab 1:32) (ab 1:160)

52 56

7

2 1 0

v-Globulins, die sich im Gegensatz zu echten Pri~ei- pi taten meist in den oberen Partien der Fliissigkeits- sgnle in der Capillare ansammeln, fglsehlieherweise als eehte Pr~eipitationen angesehen werden.

Die ?¢[enge des gebildeten Precipitates im CPT ist nieht atMn veto Gehalt des Serums an 1%. F. ab-

hi~ngig, sondern aueh yon der Konzentration and Vorbehandlung der ffir diesen Test benntz-

Grenz- Konkordanz zwischen KPT ten y- Globulinl6sung.

sehieht- und e inem oder V I I I eindeutige Resultate reaknon ÷ (ab 10 E) mei~reren der

fibrigen Teste ZU erhalten, mug die y- Globulin]6sung vor Ge-

56 45 braueh 10--30 min auf 630 C erhitzt werden.

5 6 3 Dureh die Erhitzung 2 3 1 n immt anseheinend die 0 1 - - Aggregationsneigung der 0 I 0 y- Globulinmolekfile zu,

daneben t r i t t naeh un- seren Untersuehungen aueh eine vermehrte Bin-

3 3 3 dung des R. F. an das 0 0 7-Globulin ein, wenn das 1 1 1 letztere vorher erhitzt 0 0 0 wurde. Bei der Unter-

snehung R.F . -ha l t iger Seren n immt Iernerhin die Menge der gebildeten Pr~.eipi- tare gewShnlieh um so mehr zu, je hSher die 7-Globu- linkonzentration ist. Bei Verwendung einer 2,5 %igen y-Globulinl6snng flit den CPT sind gewisse Beziehun- gen zwisehen der ~enge des gebildeten Prgeipitates und den Titerwerten der Agglutinationsreakt, ionen sowie den MeBwertanstiegen in der Grenzsehieht- reaktion vorhanden. Infolgedessen sind aneh mittels des CPT allein grob quantitative Sehgtzungen fiber den Gehalt eines Serums an t~. 1~. mSglieh. In einer Kon- zentration yon 5% nnd mehr ist die y-GlobulinlSsung fiir den CPT nieht mehr empfehlenswert, da bei einer solehen Konzentrat ion die Tendenz der erhitzten y-GlobulinlSsung zur Spontanaggregation grSl3er wird und dann eventuell falseh positive I~esultate erhalten werden kSnnen.

Wie sehon BUS tier Parallelitgt der einzelnen t~eaktionen zu vermuten, zeigt der CPT bei den ver- sehiedenen Krankheiten des rheumatisehen Formen- kreises ghnliehe l~esultate wie die drei fibrigen Reak- tionen. Sehr hgufig findet sieh ein positiver CPT bei der typisehen primgr ehronisehen Polyarthritis, jedoeh sind die anderen Reaktionen bei dieser Erkrankung in einem noeh etwas h6heren Prozentsatz positiv als der CPT. Bei den fibrigen rheumatisehen Krankheits- gruppen werden nut selten positive geakt ionen beob- aehtet. In Einzelfgllen war wie aueh bei nieht-rheuma- tisehen Erkrankungen nnd gesunden Personen nut der CPT positiv. Es ist anzunehmen, dab es sieh bei diesen FglIen um falseh positive CPT handelte.

Da der CPT aueh trotz Kontrollen, die in zweifel- ha.ften Fgllen immer anzustreben sind, in einem hSheren t~ozentsatz als die iibrigen drei l~eaktionen falseh positive und falseh negative Resultate ergibt und dieser Test aueh keine siehere quanti tat ive Be- st immung des R . F . erlaubt, vermag er nieht, die bekannten Verfahren zum Naehweis de s I~ . F., die aueh quantitative Aussagen fiber diesen Faktor erm6g-

Besprechung der Ergebnisse Wie bereits einleitend bemerkt , konnten sehon

HELLE~ U. Mitarb. ~ naehweisen, dab Seren ehroni- selaer Arthritiden entspreehend ihrem Gehalt an R . F . die F~higkeit besitzen, tanninvorbehandelte, mi t mensehliehem y-Globulin beladene Erytbroeyten zu agglutinieren, ein Ph~nomen, das auf einer geakt ion des normalen y 'Gl°bulins mit dem 1~. F. beruht. Wie die Untersuehungeu yon EPSTEIN U. Mitarb.1, 2 und eigene Beobaehtungen s,9 gezeigt haben, fiihrt diese Reaktion aueh zu einer Precipitation, die eine quanti- ta t ive Erfassung des R. F. ermSglieht. Der qualitative Naehweis gelingt naeh den angefiihrten Ergebnissen relativ gut mit Hilfe des sehnell und einfaeh aus- zufiihrenden CPT unter Benutzung erhitzter y- Globulinl5sungen in best immten Konzentrationen. Vergleiehende Untersuehungen mit der H~magglu- tinationsreaktion naeh ~ \ ~ L ~ ~5 und R.os~ n in der Modifikation yon SVA~TZ und SCHLOSSMA~ ~, dem Latex-Fixationstest naeh SI~GEa und I%oTz ~2 und der Grenzsehiehtreaktion unter Benutzung erhitzter y-Globulinl6sung zeigten in der iiberwiegenden Mehr- zahl der F/~lle eine Parallelit~t der Ergebnisse. A1]er- dings konnte bei etwa 16% der nntersuchten Seren, die positive t~esultate mit si~mtliehen der drei ]etzt- genannt.en I~eaktionen ergaben, keine Praeipitation im CPT mehr festgestellt werden. Da diese Seren mit grSBter Wahrseheinliehkeit den R. F. enthielten, muB angenommen werden, dal~ es sieh hier um falseh negative CPT bandelte. Andererseits war der CPT mit 13 yon 26 Seren, in denen nur eine oder zwei der drei anderen I~eaktionen posit, iv ausfielen, noeh posi- tiv. Waren alle diese drei Reaktionen negativ, so zeigte tier CPT in maximal 7 % einen positiven AusfalI. Hier- bei handelt es sieh wohl um falseh positive Resultate. Bei der Beurteilung der Pr/~cipitation im CPT ist darauf zu achten, dag m5gliehst nicht die gelegentlieh vor- kommenden unspezifisehen Aggregationen des erhitzten

ag. at, Hetg 2 C.G. Scream)T: Erniedrigung der DPN- (Diphosphopyridinnueleotid-) Konzentration i~ Tumoren 91 15. J-anuar 1959

lichen, zu ersetzen. Er bedeutet jedoeh eine gate Erggnzungsmethode, mit der ein raseher ~berbliek fiber das Vorkommen des 1~. F. gewonnen werden kann. Die Untersuehung fiber das Anftreten des g . F. im Serum mit Hilfe des CPT allein ist iiberall dort zu beffirworten, wo kompliziertere serologisehe Verfahren aus arbeitsteehnisehen Grfinden nieht angewandt werden kSnnen, der Naehweis des lg. F. aber angezeigt erscheint. Dureh die Anwendung des CPT auf breiter Basis kann das Vorkommen des R. F. bei einer Vielzahl yon Patienten erfagt werden. Unter Berfieksichtigung der Fehlerbreite der Methode kSnnen hierbei mSg- lieherweise tiefere Einblieke in die Beziehungen des R. F. zu den versehiedenen Formen der ehronisehen Polyarthritis, ihren Verlanf und ihrer Prognose gewonnen werden.

Zusammen/assung. Es wird fiber eine einfaehe Pr~eipitationsmethode zum Naehweis des Rheuma- faktors berichtet, ttierbei wird in eine Glascapillare zu gleiehen Teilen Serum und erhitzte 7-Globu]in- 15sung bestimmter Konzentration geffillt und das Resultat naeh einer gewissen Reaktionsdauer abgelesen. Bei Anwesenheit des Rheumafaktors im Serum tri t t dureh eine geakt ion zwisehen diesem und dem y- Globulin eine Praeipitation auf, die durch die vorherige Erhitzung des y-Globulins deutlieh siehtbar wird. Naeh Paralleluntersuehungen des geschilderten Testes mit der I-Igmagglutinationsreaktion nach WAAL~ und Rosv~, dem Latex-Fixationstest naeh SI:~SER und PnOTZ sowie der Grenzsehichtreaktion ist es m6g-

Iieh, den t~lieumafaktor mit der Capillarpr~eipitation einigermat3en sicher zn erfassen. Bei Anwendung einer 2,5%igen y-GlobulinlSsung fiir den Test sind auf Grund der Menge des gebildeten Prgeipitates neben qualitativen aueh gewisse quantitative Aussagen fiber das Vorkommen des I~heumafaktors im Serum mSglich. Der Ausfatl des Testes entsprieht bei den einzelnen rheumatischen Erkranknngen weitgehend dem der iibrigen genannten Reaktionen, die zum exakten Nachweis des l~heumafaktors abet immer mit herangezogen werden sotlen, da ihre Fehlerbreite geringer ist als die des bier gesehilderten Testes.

Liieratur. ~ EFST~I~¢, W. V., E. P. E~GL~A~¢ and M. I~oss: Ann. rheum. Dis. 16, 448 (1957). - - 2 EeSTEI~, W. V., A. Jmt~so~r and C. RAGAS: Proe. Soe. exp. Biol. (N. Y.) 91, 235 (1956). - - ~ F~KLrI¢, E.C., It. ]%. I-IoL~x, H.J. }~[i~LLEt~-EBE]aHAIaD and It. G. KI~NKEL: J. exp. Med. 105, 425 (1957). - - ~ G~us~, 1~.: Acta path. microbiol, scan& 89, 195 (1956). - - ~ I-I~TS~E~r, F. : I)iss. Freiburg i. Br. 1959.

I-I~m~E~, G., A.S. J~COBSO~ and M. tI. KOLODSrY: Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 72, 316 (1949). - - ~ I-I~Lr.Ea, G., A. S. JACOBSO~, 1~. I-I. I(OLOD~Y and W.H. KA~ERE~: J. Immunol. 7, °, 66 (1954). - - s KL~I~E, N., W. I~ii~mEa u. M. M~TI~ES: Z. ]%heumaforsch. 17, 206 (1958). - - ~ MffLLE~, W., u. F. H~STE~¢: Z. ges. exp. Med. (ira Druck). - - ~ M OLn~tL W., und E. Sc~u~: Z.]%heumaforseh. (ira Druck).

~0 ~N[~L~ESa, W., u. H. SCHU~OT~E : Unver6ffentlicht. -- ~IIosE, If. M., C. ]%±G±X, E. PEeWeE and M.O. LIP~N: Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 68, 1 (1948). --~2 S~NGE~, J.M., and C. iVf. PLo~z: Amer. J. 1VIed. 21, 888 (1956). - - ~a S v ~ z , N., u. K. S e H L o s s ~ : Acta med. scan& 142, 420 (i952). - - t~ W~V,R, E. : Aeta path. microbiol, scand. 17, 172 (1940). - - ~W~L~I~,M. V., and H. J. V~vaHa~: Proe. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 92, 198 (1956).

ZUR FRAGE DER ERNIEDRIGUNG DER DPN- (DIPHOSPHOPYRIDINNUCLEOTID-) KONZENTRATION IN TUMOREN

DURCH CYTOSTATICA

Von

C. G. SC~MrDT

Aus der Medizinischen Klinik an4 Poliklinik der Universitgt 3iiinster i. Westf. (Direktor: Prof. Dr. W. H. Hxuss)

Carcinostatisch wirkende J~thyleniminverbindun- gen erniedrigen die DPN-Konzentration in Aseites- Tumorzellen and im Jensensarkom ~, 2. Analoge Ver- gnderungen treten naeh intraven6ser Injektion der therapeutiseh wirksamen Dosis yon B 518 Asta (N,N- his- [fl- ehlorgthyl] -N', 0 -propylenphosphorsgureester- diamid) ein e. Da die erwghnten J~thyleniminverbin- dungen wie E 39 Bayer die aerobe und anaerobe Gly- kolyse in Tumoren hemmen a, darf diese %Virkung der Careinost~tiea als wesentlieh flit die Beeinflussung des Tumorwachstums gelten.

Eine Erniedrigung der DPN-Konzentration durch Careinostatiea kann theoretiseh neben einer Beein- fiussung der Synthese dutch wenigstens drei M6glich- keiten erklfixt werden: 1. tgeaktion zwischen Chinonen and ])PIN - tI , wie sie z. B. ffir Eseherichia eo[D gilt.. Dieser Reaktion dfirfte keine entscheidende Bedeutung zukommen, da sie sieh vorzugsweise zwisehen D P N . I{ und den Chinonen abspielt 4 und die D P N . tLKon- zentration in Tumoren nieht mehr als 1/~ 0 des DPN- Wertes ausmacht 5. 2. Aktivierung der DPNase und damit vermehrte Spaltung yon DPN. 3. I temmung der Glykolyse dutch Beeinfiussung glykolytlseher Fermente und damit Verschiebung des Quotienten DPN : DPN • t I zugunsten yon DPN, welches dem An- griff der DPNase leichter unterliegt als D P N . H.

Es lag daher nahe, den EinfluI~ einiger Carcino- statiea auf die Aktivitgt der DPNase in Tumorhomo- genaten zu priifen. Der Abbau yon DPN geselfieht in Tumoren 6-8 ebenso wie im Zentra.lnervensystem 9-n fiberwiegend am Pyridin-N unter Sprengung der Bin- dung z~dsehen Nieotinsgureamid und I~ibose dutch die Diphosphopyridin-mmleotidase (DPNase) trod weniger unter Spaltung der Pyrophosphatbindung dureh die Diphosphopyridin-pyrophosphatase.

Methodik I-Iomogenate (1:20 in 1,15% KC1) yon soliden

Yoshidatumoren warden 1 Std lang bei 37°C mit den Carcinostatica: 3~itomen-Asta (MethyI-bis- [/~-chlor- gt~hyl]-amin-N-oxyd-hydroetllorid), B 518 Asta (End- oxan = N,N-bis-[fi-chlorgthyt]-N', O-propylenlohos- phorsgureesterdiamid) and E 39 Bayer (2,5-Bis-meth- oxygthoxy-3,6-bis-gthyleniminobenzoehinon- 1,4) in- kubiert und die Aktivitgt der DPNase ansehliegend dureh DPN-Bestimmung im OlOtisehen Test naeh WAI~- BV~G mit AlkohoI-I)ehydrogenase 1~ gemessen. Test- euvette d = 1,0 em, V -= 3,0 ml. lVfessung bei Wellen- lange 366 m~ (Photometer ,,Eppendorl") in Alkobol- Tris-Semiearbazid-Puffer mit Zusatz yon 0 ,02m Nieotins~ureamid. Aktivitgtsangaben in Einheiten DPNase: 1 E DPNase ist diejenige Fermentaktivitgt,