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Nachweis intestinaler Parasiten - Anreicherungsmethode

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Bei Verdacht auf einen Parasitenbefall des Magen-Darm-Traktes wird zunächst ein mikroskopischesDirektpräparat angefertigt. Bei niedrigen Konzentrationen kommen Anreicherungsmethoden zum Einsatz. Ichbeschreibe im Folgenden die Formol-Ether-Methode, ein klassische und leicht durchzuführendeparasitologische Untersuchungstechnik. Anlass war eine Durchfallerkrankung unserer Hauskatzen.

Material/Geräte:

Objektträger, Deckgläser, spitze Holzstäbchen, Impföse, Tropfpipetten, Reibschale, Trichter, kleinesBecherglas, Verbandmull, Zentrifugengläser, Zentrifuge (elektrische oder Handzentrifuge), Mikroskop________

Katzenkot

Chemikalien:

Lugol‘sche Lösung zur Mikroskopie (2 g Kaliumiodid und 1 g Iod in 300 ml Aqua dest.)

physiologische Kochsalzlösung (0.9% Natriumchlorid)

Formaldehydlösung 35 % (C, T)

Diethylether (F, Xi)

alternativ:Ethylacetat (F, Xi)

Artikel im Web: http://illumina-chemie.de/nachweis-intestinaler-parasiten---anreicherungsmethode-t3712.html

Copyright illumina-chemie.de, Autor: lemmi, Geschrieben am 16.02.2014 1 von 9


Sicherheitshinweise:

Beim Umgang mit Stuhl oder Tierkot sind Handschuhe zu tragen, da er humanpathogene Erreger (hier:Lamblien!) enthalten kann.

Versuchsdurchführung:

1. Direktpräparat:

Zur Anfertigung eines Direktpräparates verrührt man eine sehr kleine Menge der Kot- resp. Stuhlprobe vonca. 1-2 mg (Anfänger nehmen meistens viel zu viel Material!) auf einem Objektträger in einem Tropfenphysiologischer Kochsalzlösung und einem Tropfen Lugol’scher Lösung. Klassischerweise wird dazu einspitzes Holzstäbchen verwendet, das nach Gebrauch weggeworfen wird, oder alternativ eine kleine Impföse,die nach Gebrauch in einer Bunsenbrennerflamme ausgeglüht wird. Die Suspension wird mit einemDeckgläschen abgedeckt, unter dem sich die Flüssigkeit eben bis zum Rand ausbreiten soll, um ein Präparatmit möglichst geringer Schichtdicke zu erhalten. Wenn Flüssigkeit über den Rand des Deckgläschens quilltist das Präparat erneut, mit weniger Kochsalzlösung, anzufertigen.Das Präparat wird dann zunächst beigeringer Vergrößerung (Objektiv 10 x- Gesamtvergrößerung 100 x) mikroskopiert. Dabei muss derKondensor stark abgesenkt werden, damit ein kontrastreiches Bild resultiert. Wenn man scharf eingestellt hatmustert man das gesamte Präparat systematisch von der linken oberen bis zur rechten unteren Eckemäanderförmig durch. Interessierende Stellen werden zur genaueren Betrachtung mit dem 40er-Objektiv(Gesamtvergrößerung 400 x) betrachtet. Dabei ist der Kondensor etwas anzuheben, weil das mikroskopischeBild sonst nicht ausreichend ausgeleuchtet wird.

In der Kochsalzlösung lassen sich Wurmeier (Spulwurm Ascaris lumbricoides, Peitschenwurm Trichuristrichiura, Zwergbandwurm Hymenolepis nana resp. diminuta, Hakenwurm Necator americanus oder Acylostoma duodenale um die häufigsten zu nennen) oder Larven (z.B. Strongyloides stercoralis oderHakenwurmlarven) einfach bereits bei geringer Vergrößerung erkennen, da diese Objekte mit 50-120 µmrelativ groß sind. Die Trophzoiten und Zysten der Protozoen (z.B. Entamoeba histolytica, oder die hiergefundene Giardia intestinalis) sind mit 8-12 µm viel kleiner und besser mit dem 40er-Obektiv zuidentifizieren, wenngleich auch sie dem Untersucher mit etwas Übung bereits in der Übersichtsvergrößerungauffallen. Im mit Iod gefärbten Präparat (in der Lugol’schen Lösung) lassen sich die Protozoen besser erkennen, da diesubzellulären Strukturen – insbesondere die Zellkerne – deutlich angefärbt werden. Giardia intestinalis bildetovale, 8-12µm lange und ca. 6 µm breite Zysten aus, die eine S-förmige Geißelanlage sowie vier Zellkerneenthalten, von denen meist immer nur einer oder zwei in einer Schärfenebene sichtbar sind.

2. Formol-Ether-Anreicherung:

Man verdünnt die übliche 35 %ige Formalinlösung im Verhältnis 1+9 mit physiologischer Kochsalzlösung (1ml Formaldehydlösung und 9 ml Kochsalzlösung). In einer Reibschale verreibt man eine etwa bohnengroßeProbe des Untersuchungsmaterials mit 10 ml der Formol-Kochsalz-Lösung und gießt die Mischung durcheinen kleinen Trichter, den man mit einer Lage Verbandmull ausgelegt hat, in ein kleines Becherglas. Dastrübe Filtrat schüttelt man in einem Zentrifugenröhrchen mit 3-4 ml Ether gut durch und zentrifugiertanschließend bei etwa 3000 UpM für 3-4 Minuten in der elektrischen Zentrifuge oder für 5 Minuten in einerHandzentrifuge. Nach der Zentrifugation erkennt man im Röhrchen vier Schichten:Oben befindet sich der Ether. An der Grenze zwischen Ether und wässriger Phase sind lipophile organischeStuhlbestandteile angereichert. Darunter findet sich die wässrige Phase (Formol-Kochsalzlösung) undschließlich ein meist recht geringer Bodensatz, der die interessierenden Wurmeier und Parasiten (-zysten)enthält. Man rührt den oberen Anteil vorsichtig mit einem Glasstab um, um die Grenzschicht Ether/wässrigePhase von der Wandung zu lösen, und gießt dann die oberen drei Schichten vollständig, aber vorsichtig (umdas Sediment nicht mitzureißen) ab. Das Sediment wird schließlich in dem letzten verbleibenden TröpfchenFormol-Kochsalz durch Klopfen gegen den Boden des Röhrchens resuspendiert. Mit einer Impföse odereiner Pipette entnimmt man ein Tröpfchen der Suspension und vermischt auf dem Objektträger mit etwasKochsalzlösung bzw. Lugol´scher Lösung, legt ein Deckglas auf und mikroskopiert wie oben beschrieben. Indiesem Präparat sind die Parasiten und Wurmeier konzentriert und die übrigen, die Beurteilungerschwerenden, Stuhlbestandteile weitgehend abgetrennt, so daß die Erkennung erleichtert wird.




Entsorgung:

Die gebrauchten Objektträger und die überschüssigen Proben werden in geeigneten geschlossenenBehältern für biologisches Material mit dem Hausmüll entsorgt.Die mit den Proben kontaminierten Glasgeräte werden über Nacht in verdünnte (0,5 %ige)Natriumhypochloritlösung gelegt und dann wie üblich gereinigt.

Erklärungen:

Die Interpretation von Stuhlpräparaten ist für den Anfänger schwierig, weil die Proben eine Vielzahlmorphologischer Bestandteile enthalten, die im Einzelfall von den interessierenden Strukturen - Wurmeiernund Parasiten bzw. deren Zysten – unterschieden werden müssen. Es können Stärkekörner, unverdauteMuskelfasern, Pflanzenfasern, Gewebefetzen tierischer und pflanzlicher Nahrung, Fetttröpfchen oderKlümpchen von Fettsäuren, mineralische Bestandteile wie Oxalatkristalle neben den zahlreichen intestinalenBakterien und ggf. apathogenen Einzellern (z.B. Hefen) unterschieden werden. Die Anreicherungsmethodenutzt die unterschiedliche Größe und Dichte der verschiedenen Stuhlbestandteile aus. Nachdem grobeBestandteile (über 200 µm) mittels Filtration durch grobmaschigen Mull entfernt wurden, werden diespezifisch leichteren und lipophilen Bestandteile durch Ausschütteln mit Ether und anschließendesZentrifugieren von den spezifisch schwereren Parasiten und Wurmeiern getrennt. Der Formolzusatz machtdie Verarbeitung hygienischer und gibt die Möglichkeit, die Probe vor der Auswertung eine Weileaufzubewahren ohne dass sie sich – vor allem in warmem Klima - verändert. Anstelle von Ether kanngenauso gut Ethylacetat verwendet werden.

Giardia intestinalis (früher Giardia lamblia) ist ein parasitäres Protozoon, das den oberen Dünndarm vonbestimmten Säugetieren – darunter der Mensch, der Hund und die Katze – besiedelt. Lamblien wurdenbereits von Leuvenhoek, dem Erfinder des Mikroskopes, 1681 (im eigenen Stuhl) beobachtet, und nacherneuten Beschreibungen durch den französischen Biologen Alfred Mathieu Giard (1846 – 1908) und denböhmischen Kinderarzt Vilém Dusan Lambl (1824 – 1895) von dem amerikanischen Zoologen Charles W.Stiles (1867-1941) als Giardia lamblia benannt.

(Abbildung aus: Practical Laboratory Manual for Health Centers in Eastern Africa -, s. Literatur)

Der Lebenszyklus der Lamblien umfasst eine vegetative Form, den Trophozoiten, der aktiv mit Geißelnbeweglich ist und sich durch Zweiteilung vermehrt, und eine Dauerform, die Zyste. Die Trophozoitenbesiedeln den Darm - und zwar den Zwölffingerdarm und das obere Jejunum - und ernähren sich vomDarminhalt, dringen aber nicht in die Darmwand ein (weshalb Lamblienbefall in der Regel kaumBauchschmerzen und keine blutigen Stühle bewirkt). Wenn sie sich stark vermehren, behindern die Parasitendie Aufnahme der Nährstoffe durch die Darmwand, was zu Malabsorption und Durchfällen führt. In dieserSituation können mobile Trophozoiten im Kot nachgewiesen werden. Das entsprechende Krankheitsbild wird Lambliasis oder Giardiasis genannt. In der Regel ist der Befall aber nur mäßig, die Symptome sind nur leichtoder fehlen ganz, und in den Darmausscheidungen finden sich ausschließlich die Zysten, welche so




per vias naturales in die Außenwelt gelangen, wo sie bis zu 4 Monaten lebensfähig bleiben und erneut voneinem Wirt aufgenommen werden können. Infektionen mit Lamblien beim Menschen sind in warmen Ländernsehr verbreitet (rund 10% der Weltbevölkerung sollen infiziert sein!) und werden verständlicherweise durchschlechte hygienische Bedingungen (Fehlen einer suffizienten Kanalisation, Zusammenleben auf engemRaum) begünstigt. Auch in Deutschland kommen sie autochthon vor, wenngleich viel seltener als in denTropen. Bei Katzen sind Lamblien ebenfalls häufige Durchfallerreger, wobei mir nicht bekannt wäre, daßKontakt zu Katzen ein Risikofaktor für eine Infektion beim Menschen darstellte (wie das z.B. bei derToxoplasmose durchaus der Fall ist). Wahrscheinlich liegt das daran, daß für Menschen andere Genotypenpathogen sind, als für die Tiere.

Wie oben gezeigt, ist der Nachweis von Lamblien im Stuhl mit einfachen mikroskopischen Technikenmöglich. Bei sehr geringem Befall kann ein Antigennachweis mittels ELISA (enzyme-linked immuno-sorbentassay) weiterhelfen. Die - ästhetisch durchaus ansprechende – Feinmorphologie des Parasiten,insbesondere der vegetativen Formen, kann durch eine Färbung mit Eisenhämatoxylin oder Giemsa-Lösungsichtbar gemacht werden.

(Abbildung aus: Atlas de Parasitología – s. Literatur)

Für die Routinediagnostik ist das aber zu aufwändig und auch gar nicht nötig.

Die Therapie der Lambliasis erfolgt mit dem Imidazolderivat Metronidazol(2-(2-Methyl-5-Nitro-Imidazol-1-yl)-ethanol).

Katzen wird eine Dosis von 15-25 mg / kg Körpergewicht zweimal täglich über 5 Tage verabreicht. Inseltenen Fällen bestehen Resistenzen, und es muß auf andere Wirkstoffe ausgewichen werden. Währendder Kur muss die Katzentoilette gut gereinigt werden, um eine Reinfektion durch lebende Zysten im bereitsabgesetzten Kot zu verhindern. In der Humanmedizin werden 1000-1200 mg Metronidazol pro Tag in 2-3Einzeldosen für 5-7 Tage gegeben.

Literatur:

Myriam Lopez Paéz , Augusto Corredor Ajona und Ruben Nicholls Orejuela : Atlas de Parasitología ; EditorialManual Moderno, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá 2006; ISBN 978-958-9446-17-1Monica Cheeseborough: District Laboratory Practice in Tropical Countries, Part I; Tropical HealthTechnology, Doddington/March, Cambridgeshire 1998; ISBN 0-9507434-4-5Jane Y Carter und Orgenes E.Lema: Practical Laboratory Manual for Health Centers in Eastern Africa;Gesundheitshilfe Dritte Welt / German Pharma Health Fund e.V. Frankfurt am Main (ohne Jahreszahl, ca.1994)




Bilder:

Herstellung eines Direktpräparates. Die Kotprobe befindet sich in dem Spatelröhrchen links.




Herstellung einer Kotsuspension in Formol-Kochsalzlösung und Filtration durch Mull.

Die filtrierte Suspension nach dem Schütteln mit Ether und Zentrifugation.




Effekt der Anreicherung: Zysten von Giardia intestinalis gefärbt mit Lugol´scher Lösung bei 100-facherVergrößerung. Oben: Direktpräparat mit 2 Zysten. Unten: Präparat aus dem Sediment derFormol-Ether-Anreicherung (11 Zysten im Bildausschnitt)




Zysten von Giardia intestinalis im Nativpräparat nach Anreicherung, ebenfalls bei 100-facher Vergrößerung.




Zysten von Giardia intestinalis bei 400-facher Vergrößerung, oben nativ, unten mit Lugol’scher Lösunggefärbt. Beachte die S-förmige Linie (das Axosom, aus dem die Geisseln entspringen), die der Zyste etwasdas Aussehen einer Kaffeebohne verleiht, sowie die Darstellung der Zellkerne (die beiden kleinen hellenPunkte am unteren Pol der mit Iod gefärbten Zyste). Bei genauem Durchfokussieren findet man in jederZyste 2 oder 4 Kerne.



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