642 K.D. VOmT, U. VOLKWEIN U. J. T A ~ : Methode zur Bestimmung der Testosteron-Ausseheidung im Urin Klinische Wochenschrl ft

Die Ents~ehung der sog. Pseudohyperka l i~mie bei Thromboey tose 1/~$t sieh somit zwanglos mi t der Ver- te i lung des Thromboey tenka t iums im Serum wghrend der Ger innung erkl/~ren, worauf berei ts H A n s e A t i c u. Mi tarb . (1958) e rs tmal ig hingewiesen haben. Sic betonen, dab berei ts einige Sekunden naeh Ablauf der Gerinnung eine t iefgreifende Xnderung bzw. weit- gehende Zers tSrung tier T h r o m b o e y t e n eintri~t, was zu e inem Fre iwerdeu des Zel l inhal tes f i ihren mug.

U n t e r Zugrundelegung eines P1/~ttehenvotumens yon 0,5% des Gesamtb lu tes muff auf Grund ibres Ka l iumgeha l t e s bei e inem Zerfal l t i e r T h r o m b o e y t e n die K o n z e n t r a t i o n an K a l i u m im Serum bzw. P la sma um 0,9 mXq/t zunehmen. Beim normalen Mensehen fanden wir 1959 im Mit te l eine Differenz yon 0,7 mXq K a l i u m je L i te r Serum und f i ihr ten dies damMs sehon auf einen P1/~ttehenzerfall m i t F re iwerden des Ka l i um- gehal tes w/~hrend der Ger innung zurfiek ( P s L E D ~ I ~ , OTTO und Ha~DSG~ 1959). Du tch die j e t z t vorl iegen- den Messungen lfi~Bt sich diese damals aufgeste l l te H y p o t h e s e best~t igen. Bei e inem AnsCeigen de r Th romboey tenzah l auf W e r t e yon fiber 1 Mil l . /mm s, d .h . also auf ca. das Vierfaehe der Norm, m u g sieh dieser W e r t des Ka l iumzuwaehses im Serum logiseher- weise ebenfal ls vervierfaehen, so d a g W e r t e yon fiber 7 mXq/1 zu e rwar ten sind. Wie berei ts e ingangs be tont , wurden derar t ige W e r t e bei en t sp rechendem AusmaB einer Thrombocy tose in der L i t e r a t u r mi t - getei l t .

Zusammen]a~sung. Bei 40 normalen Menschen wurde der Ka l iumgehMt in T h r o m b o e y t e n bes t immt . E r be t rug im Mit te l 89,7 mXq/kg Thromboey ten feuch t -

gewieht. Der P lasmafehter wurde mi t Hilfe der jlsl_ A lbuminme thode korr ig ier t . Nach Stehenlassen des p lg t tchenre iehen P lasmas bei Z i m m e ~ e m p e r a t u r fiber mehrere S tunden sank der Ka l iumgeha l t der Thrombo- cy t en deut l ieh ab und be t rug noah ca. ein bis zwei Dr i t - tel des Ausgangswertes . Die bei einer Thrombocy tose beschriebene Pseudohyperka l i~mie wird auf ein Fre i - werden des Thromboey tenka ] iums bei der Blutger in- hung zurfickgefi ihrt .

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Anschri]t: Tm PFLEID~I~, 69 Heidelberg, Medizinische Universitatsklinik (Ludolf Krehl-Ktinik)

Eine Methode zur Bestimmung der Testosteron-Ausscheidung im Urin* Von

K. D. VOmT, U. VOLKWEIN und J . T ~

Aus dem Hormonlabor der II. Medizinlschen Universit/ttsklinik, Hamburg-:Eppendorf (Direktor: Prof. Dr. A. J'ORES)

I n j i ings ter Zei t s ind eine Reihe yon Methoden zur Bes t immung der Tes tos te ronaussche idung im Urin publ iz ie r t worden ~-5. D a diese Verfahren auf der Ver- wendung yon i so topenmark ie r t em Tes tos te ron basie- ran, k6nnen sic yon Labo ra to r i en ohne en tspreehende Megeinr ieh tungen n ich t ohne weiteres e ingesetz t warden. Die En twick lung einer r e l a t iv einfachen Methode zur Tes tos t e ron-Bes t immung im Urin , die aueh ohne Zusa tz yon m a r k i e r t e m Tes tos te ron aus- re iehend genaue W e r t e liefert, ersehien daher ange- brach t .

Methoden und Material Die im folgenden angegebenen LSsungsmi t te l

waren yon ana ly t i s ehem Re inhe i t sg rad n n d wurden 'vor Benu tzung redest i l l ier t .

Hydrolyse. Ein aliquoter Teil des 24 Std-Urins wurde dureh Zusatz yon 70%iger Schwefels~Lure auf pH 4,62 ein- gestellt. Bei Mgnnern soil das Aliquot mindestens 250 ml, bei Frauen mindestens 500 ml betragen. Das /?-Glucuronidase- Pr~parat Ketodase® wurde in Acetat-Puffer (pH 4,62) gel6st (1000 IE Enzym/ml). Der Urin wnrde mit tier Enzs-nd6sung versetzt (1000 IEfl-Glucuronidase/ml Urin) und 48 Std bei 370 C inkubiert.

* Diese Arbeit wurde durctt Mittel der Deutsehen :For- sehungsgemeinschaft unterstfitzt. Ketodase® (Warner-Chil- cott) wi lde dankenswerterweise yon GSdecke & Co., Berlin, zur Verffigung gestellt.

Extraktion. Naeh der Hyd.rolyse wurde der Urin dreimM mit dem gleiehen Volumen Athvliither extrahiert. Die ver~ einigten J[therextrakte wurden im Vakuum auf 100 ml ein- geengt, einmM mlt, 0,1 Vol. I n NaOH und viermal mit 0,25Vol. redestiliiertem Wasser gew~..sehen. Nach Trocknung fiber Natriumsulfat wurde der Atherextrakt im VM~uum zur Troekne gebra.eht..

Sgulenchromatographie an Florisil. Die Aktivierung des Florisils (Florosil ,,Crown Brand", 60--90 mesh, H. Bens- mann, Bremen) and die Besehickung der S~Lule erfolgten, naeh den Angaben yon MIG~o~ und PI~AGElZ s. Der trockene Ather- extrakt wurde in 5 ml Chloroform aufgenommen and auf die FlorisiI-S~iule gebracht. Die Elution des Testosterons erfolgte mit 25 ml Chloroform und 25 ml 4% Athanol in Chloroform. Beide Eluate wurden kombiniert and zur Trockne eingedampft.

Di~nnschieht-Chromatographie. 35g Silieagel G (Merck, Darmstadt) wurden in 70 ml redestilliertem Wasser auf- gesehwemmt and auf entlettete Glasplatten mit Hilfe eines Applikators (Desaga, Heidelberg) gebracht. Die Sehieht- dieke beirut 0,25 ram. Ansehliegend wurden die Platten 20 min bei 1200 C getrocknet und in einem Spezia]-Exsieeator (Desaga, Heidelberg) fiber Kieselgel aufbewahrt.

1. Diinnsehicht-Chromatographie: System Chloroform: Methanol, (99:1 v/v). Der dutch Florisil-Chromatographie gereinigte Extrakt und ein Testosteron-Standard wurden jeweils in 0,02 ml Chloroform:Methanol (I :1, v/v) aufgenom- men und auf die Platten gebraeht. Der Testosteron-Standard lief parallel zum Urinextrakt. Die Entwieklung der Chromato- gramme erfolgte nach aufsteigender Teehnik entsprechend den Vorschriften yon STA~ 7. Die Laufzeit betrug 30 rain bei ca. 32 ° C. Die Lokalisation des Testosteron-Standards wurde mit Hilfe eines p-Totuonsulfons~ure-Sprays durchgeffihrt. Die

.lg. 42, ?left ~3 K.D. VOIGT, U. VOLKW)3IN U. J. TAMM : Methods zur Bestimmung der Testosteron-Ausscheidung im Urin 643 L Juli 1964

entsprechende Zone des Urinextraktes wurde sorgfaltig yon der Gl~splatte ge:schabt und dutch Sehiitteln (20 rain) mit 25 ml absohItem Athanol eluiert. Nach Zentrifugieren wurde der fiberstehende Athanol abgehebert, in einem rotierenden Evaporator konzentriert und sehlieBlich unter einem Stiek- stoffstrom getrocknet.

2. Dfinnsehicht-Chromatographie : System Athylgther: Benzol (9:1, v/v). Der Testosteron enthMtende Extrakt nach der ersten Dfinnschieht-Chromatographie wurde parallel zu einem Testosteron-Standard erneut ehromatographiert (Tech- nik, Indicator und Elutionsverfahren wie oben besehrieben. Laufzeit 30--35 rain bei ca. 32 o C).

Papierchromatographie. Systeme Bush B a oder BA s. (Papier: Sehleicher & Schfill 2043b, Streifenbreite 1,5 em). Der getrocknete Extrakt naeh der zweiten Diinnschieht- Chromatographic wurde in 0,05 ml absolutem ~viethanol auf- genommen und auf die Streifen gebracht. Ein Testosteron- Standard lief parallel. Die Entwicklung des Chromatogramms erfolg~e naeh absteigender Teehnik (Laufzeit des B s ca. 5 Std, des BA ca. 2~/2--3 Std). Die Papierstreifen wurden fiber Naeht luftgetroeknet. Die Lokalisation der Steroidfleeken eriolgte unter der UV-L~mpe. Die Testosteron enthaltende Zone wurde ausgesehnitten und dutch Sehiitteln (60rain) mit 25 ml 80%igem Aethanol eluiert.

Quantitative Bestimmung. Die quantitative Bestimmung des Testosterons im trockenen Extrakt nach Papierchromato- graphie erfolgte mit Hilfe der Mikro-Isonicotins~ure-Hydracid- Reaktion. Als Blankwert diente der Extrakt aus redestillier- tern Wasser, der jeweils durch die gesamte Methode mit- geffihrt wurde. Einzelheiten der Farbreaktion wurden friiher beschrieben%

Ergebnisse Charakterisierung yon Testosteron. Die jeweil igen

R/-Wel%e und die Sehwefels~ure-Chromogene yon re inem Tes tos te ron sowie des S te ro idmate r i a l s aus dem Ur in s ind in Tabel le 1 angegeben. Sowohl die Bezugssubs tanz Tes tos te ron wie das Mater ia l aug dem Ur in wurden schr i t tweise einer Chromatograph ic in den angegebenen Sys temen, einer Aee ty l i e rung und einer Messung der Sehwefe ls£ure-Spekt ra un te r - worfen. Wie aus Tabel le 1 e n t n o m m e n werden kann,

Tabelle 1. Charakterisierung yon Testosteron, (DS = Diinnschicht

~faterial Standard aus dem

Urin

R -Wer~ in DS-System 1 ] . . . . . .

R/-Wert in DS-System 2 . . . . . . R/-Wert in Bush B a . . . . . . . . R/-Wert in Bush BA . . . . . . . . Rt-Wert in Bush BA nach A cetylierung Schwefels~ure-Chromogenc

(Maxima in m#) . . . . . . . . .

0,3 0,47 0,55 0,3 0,68

298

0,3 0,47 0,55 o,3 0,68

299

s t i m m t e n die phys iko-ehemisehen D a t e n des re inen Tes tos terons m i t denen des Ur inex t r ak t e s v611ig t iberein.

Wieder/indungsversuche. Die Wieder f indungs ra te yon Testosteron wurde nntersucht an einer reinen Testosteron-L6sung und an Urin, dem bekannte Mengen Testosteron zugesetzt worden waren. Ta- belle 2 g ib t die Resu l t a t e de r Ur inexper imen te wieder.

Tabelle 2. Wieder]indungsversuche yon Testosteror~ aus Urin

Sammelurin

250 mt Urin

250 ml Urin

Genuine]~on- zen t ra t ion yon

Tes tos teron ~g

27,1

10,2 9,4

12,7 12,2

Zugesetzte Menge Testo-

steron /*g

95,0

33,9

12,4

Gefundene Gesamtkon- zentration

~g

119,3

43,3 42,9

22,1 22,3

96

I00 98

76 81

Tabelle 3. fl-Glucuronidase-Hydrolyse (250 mI Aliquots eines Sammelurins)

Testosteronkonzentra~ion Enzymmenge arid Art der (in pg) Inkuba t ion (Doppelbestimmungen)

1000 IE/ml Urin, 24 Std Schiitteln bei 370 C I000 IE/mt Urin, 48 Std Bei 37 o C ohne Schiitteln 1000 IE/ml Urin, 72 Std Bei 37 ° C ohne Schfitteln 750 IE/ml Urin, 72 Std Bei 370 C ohne Schii~te]n

13 16 19 21 15 t4 18 17

Wie zu ersehen ist, wurden 76 - -100% des zugesetz ten Steroids wiedergefunden. Der Gesamtve r lus t wahrend der Di innscb ieh t -Chromatograph ie / ibers t ieg n iemals 9 - - 1 0 % .

~-Glucuronidase-Hydrolyse. 2 5 0 m t Al iquots aus einer gr6geren Menge Sammelur in wurden un te r versehiedenen Bedingungen inkub ie r t (s. Tabel]e 3). Die bes ten Ergebnisse w a r d e n erzielt , wenn der Ur in mi t 1000 I E / m l fiir 48 S td bei 370C ohne Seh/ i t te ln i nkub ie r t ~warde. Eine l~ngere Behand lung Ini t der gleiehen E n z y m m e n g e ff ihrte zu einer ger ingeren Tes tos te ron-Ausbeute .

Die Konzentration yon Testosteron ira Urin. Die E inze lda ten s ind in Tabel le 4 anfgeffihrt . Der Mittel- wef t der Tes tos te ron-Aussehe idung des normalen

T~belle 4. Testosteronausscheldung im Urin yon Normalpersonen (in ~g/24 Std)

M~inner ~ o p p e l b e s t i m m u n g e n Mittelwert

Fr. 23

KI. 21

]~'~. 30

Ba. 35

m. 1__2_s Frauen

Pa. 35

Ti. 22

Fa, 30

Pau. 35

64 44

L Tag 58 53

2. Tag 69

48 46

68 65

32

18

3 5

7 9

10 10

Mittel

Mittel

54

56 69

47

67

32 54

18

4

8

10 10

erwachsenen Mannes be t rug 54#g /24 S td m i t e iner Schwankungsbre i te yon 32 - -69 t tg /24 Std. Gesunde erwachsene F r a u e n sehieden im Mit te l 10#g/24 S td Tes tos teron aus (Schwankungsbre i te 4- -18/~g/24 Std). Bei e inem m~nnl ichen P a t i e n t e n (28 J a h r e alt) m i t Gyn~komas t i e l a n d sich eine Tes tos te ron-Aussche idung yon 128 bzw. i33 #g/24 S t d (Gesamt-17-Ketos te ro ide im Urin 23,0 und 25,3 mg/24 Std, davon D t I A 5,40 bzw. 9,40, Andros t e ron 10,38 und 9,21, • t iocholanolon 4,82 und 3 ,39mg/24 S td ; Gesamtoes t rogene 2 1 # g / 24 Std). TumorSse Ver/~nderungen der Test ikel oder der Nebennie ren be s t anden nicht .

644 K.D. VOmT, U. VOI~](WFX~- u. J. Tam~: Methode zur Bestimmung der Testosteron-Ausseheidung im Urin Klinische Wochensch rift

Diskussior~ Obgleich die beschriebene Methode noeh rel~tiv

zeJ£raubend ist, k6nnen yon einer einge~rbeiteten Kraf t acht P~r~llelbestimmungen yon Testosteron pro ~ o e h e durchgeffihrt werden. Die Spezifit~t der Methode kann Ms gut bezeichnet wcrden, da im Endex t r ak t n~eh Chromatogruphie Test~)steron yon den fibrigen C 19-Steroiden sauber getrennt ist und da die Farbreak- t ion nur S teroide mi t einer Ketogruppe an C 3 erf~Bt. Eine siehere T remmng des epi-Testosterons vom Testo- steron erlaubt dies Verfahren jedoch nicht. Ein gravierender Nachtei l ist hierin nicht zu sehen, da die Ausscheidung yon epi-Testosteron im menschliehen Urin vergleiehsweise goring ist. Von den bisher publi- zierten Methoden ist eine T renmmg yon Testosteron und seinem C 17-Epimeren such nur mit derjenigen yon K o ~ E N ~ A ~ e t a l . ~,n zu erreiehen. Die oben angegebenen Da ten fiber Doppelbes t immungen lassen erkennen, dab such die Genuuigkeit des beschriebenen Verfat~rens ausreiehend gut. ist. Die untere Empfind- lichkeitsgrenze der INH-Fa rb reak t i on lag bei 1,5/~g Testosteron (A E/ttg Testosteron = 0,035). Die Testo- steron-Ausseheidung im menschliehen Urin s t immte gut mit den Resul ta ten anderer Autoren fiberein s, ~, ~0. Nur R, os~E~ et al. s fanden hShere Normalwerte. Die versehieden hohe Ausseheidung yon Testosteron bei M£nnem und Frauen spiegelt die Untersehiede der Produkt ionsra ten dieses Hormons wieder, wie sie von KOEEN~AN et al. n mitgeteil t wurden.

Da frfihere Exper imente le mi t reinem Tes- tosteron-17-glueuronosid gezeigt haben, dab die enzy- matisehe Hydrolyse mit fl-Glucuronidase keine gerad- linige Kinet ik a.ufwies, wurden die opt imalen Bedin- gungen der enzymatisehen Hydrolyse von Testosteron- Glucuronosid h a Urin untersueht . Aus der Li tera tur waren entsprechende Daten nieht zu entnehmen. Es zeigte sich, dag eine Inkuba t ion des Urins 1000 I E fl- Glucuronidase/ml fiber 48 Std bei 370 C die hSehste Ausbeute an Testosteron ergab. Da die verwendete Leber-Glucuronidase Ketodase® praktiseh frei yon Sutfatase-Aktivit/ i t ist, bes t immt die oben besehrie- bene Methode das freie und das glueuronosid-kon- jugierte Testosteron. An zwei mannl ichen Urin- proben wurde nach Glueuronidase-Hydrotyse und Ex t rak t ion des freigesetzten Testosterons zus/~tzlich eine Dioxan-So]volyse durehgeffihrt. I-Iiernaeh konn- ten weitere Mengen yon Testosteron charakterisiert warden, die 15 bzw. 17 #g/24 Std entspraeben. Auch H e , T o g et a13 s konnten nach Solvolyse eine geringe Menge Testosteron nachweisen, die etwa 0,03% des zugesetztert markier ten Steroids entspraeh. Ob das nach Dioxan-Solvolyse freigesetzte Testosteron als Sul fa t -Konjugat im Urin vorgelegen hat, wird zur Zeit weiter geprfift.

Zusammen/assung. Es wird eine Methode zur Bes t immung des freien und des glucuronosid-kon-

jugierten Testosterons im Urin besehrieben. Nach Hydro]yse wird der E x t r a k t ~n Florisil gereinigt und das Testosteron durch zweimalige Dtinnsehicht- und nachfolgende' Papierehromatographie getrennt . Die quant i ta t ive Bes t immung erfolgt mit Hilfe der Iso- nicotins/~ure-Hydrazid-Re~ktion. Eventuel l vorhan- denes epi-Testosteron geht in die l~e~ktion mi t ein. Die Spezifit~t und die Genauigkeit der Methode sind ausreiehend gut, so d~13 der Zusatz yon markier tem Testosteron nicht erforderlich ist. Die Testosteron- Ausseheidung betrug bei gesunden M/tnnern im Mittel 54 #g/24 Std, bei gesunden Frauen im Mittet 10/~g/ 24 Std. I n zwei Fallen konnte du tch eine zus~tzliehe Diox~n- Solvolyse weitere s Testosteron in einer Gr6gen- ordnung yon 15 bzw. 17/~g/24 Std freigesetzt werden.

Summary. A non-isotopic method for the determination of free and glucuronosid-conjugated testosterone in urine is described. Following hydrolysis with fi-glucuronidase the extract is purified on florisil. Testosterone is separa~ted by chromatography in two ~hin-layer-chromatographic systems and in Bush B~ or BA. The hormone is qnantitated as the isonicotinic aeid-hydrazide. Possibly excreted epi-testosterone is not separated from testosterone. The mean excretion of testosterone in urine yielded the following figures: normM males 54 ttg/24 hours, normal ~emales 10 ttg/24 hours. In two instances additionM dioxan solvotysis liberated further amounts of testosterone from male urine, corresponding to 15 and 17 #g/24 hours.

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