EinfGen6 - aaa-proteins.uni-graz.ataaa-proteins.uni-graz.at/Vorlesungen/EinfGen/EinfGen6-6.pdf · 22.05.17 5 Drosophila melanogaster-Balancer Durch die Balancer kann die letale Mutation

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Das Hauptinteresse des Menschen gilt sich selbst. Daher sollte bei der genetischen Forschung die menschliche Genetik im Vordergrund stehen, dazu besonders die Genetik wichtiger Nutztiere und -pflanzen. Tatsächlich ist es aber meist günstiger, grundlegende Erkenntnisse an besonders „forschungsfreundlichen“ Organismen als „Modellen“ zu machen und diese Erkenntnisse auf den Menschen zu übertragen. Die verschiedenen Modelle haben unterschiedliche Vorteile und Schwächen, und werden für verschiedene Forschungsrichtungen eingesetzt.

Genetische Modelle

- Escherichia coli u. a. Bakterien, Bakteriophagen- zur Aufklärung grundlegenden zellulärer Prozesse

(Replikation, Rekombination) und mutagener Stoffe(Ames-Test)

- Bäckerhefe S. cerevisiae- Modell der eukaryontischen Zelle: Zellzyklus,

intrazellulärer Transport, eukaryontische Proteinmodifikation, Signaltransduktion (Rezeptoren,Proteinkinasekaskaden)

- Fruchtfliege Drosophila melanogaster- Entwicklungsprozesse (vom Embryo zum

Erwachsenen, Regulation der Organentstehung,Funktion und Genetik einzelner Organe, z.B. Auge)

Beliebte Modellorganismen

- Menschliche Zellen in Kultur- Arzneimitteltests, Mutagenese und Infektions-

experimente, humane Krankheiten (Krebs,Arterosklerose)

- Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana- Modell für pflanzliche Systeme (Entwicklung von

Sproß und Wurzel, Xylem und Phloem, Abwehr-mechanismen bei Viren- und Pilzinfektion)

Beliebte Modellorganismen

Die Fruchtfliege frißt Hefezellen auf faulendem Obst. Sie ist3 mm lang und entwickelt sich in nur 10 Tagen (bei 25°C)vom Ei zum geschlechtsreifen Tier.An Drosophila wird schon seit fast 100 Jahren genetischgearbeitet, dadurch sind für über 4.000 Gene über 9.000Mutanten verfügbar und es wurden sehr effiziente Hilfsmittelfür die Forschung entwickelt.Das Genom ist vollständig sequenziert.

Nobelpreis für Medizin 1995 an Christiane Nüsslein-Volhard, Eric Wieschaus und Edward Lewis für Entwicklungsstudien an Drosophila.

Drosophila melanogaster

Entwicklung: Im befruchteten Eiwerden zunächst 13 Mitosen ohneZellteilung durchlaufen. Es entsteht einSyncytium mit tausenden Zellkernen.

Die ersten Teilungen laufen sehr schnell und synchron ab. Mit einer Dauer von ca. 9 min sind sie die kürzesten bekannten Teilungszyklen und bestehen nur aus M- und S-Phasen.

Drosophila melanogasterNach 7 Teilungen sind 128 Kerne in der zentralen Region des Embryos entstanden. Die meisten Kerne wandern jetzt nach außen und teilen sich weiter. Einige Kerne bleiben zurück und bilden die Dotterkerne. Nach der neunten Kernteilung haben die meisten Kerne die Nähe der Zellmembran erreicht.Am posterioren Ende bilden etwa 15 Kerne die Polzellen aus, die sich früher als alle anderen Zellen zellularisiert haben. Die Polzellen bilden die Keimbahn.


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Die meisten anderen Kerne bilden jetzt eine einlagige Schicht unter der Zellmembran; dieses Stadium bezeichnet man als syncytielles Blastoderm.

Dann erst bilden sich interneMembranen, und es entstehen etwa6.000 Zellen um einen Dottersack

Drosophila melanogasterNach der 13. Teilung zellula-risiert das Blastoderm: Die Zellmembran invaginiert zwischen den Kernen und umschließt sie allmählich. Es entsteht ein Embryo, der aus einer epithelialen Zell-schicht besteht, welche eine vielkernige Dottermasse umgibt: das zelluläre Blastoderm. Die Zellularisierung erfolgt durch Einstülpung der Zellmembran zwischen den Kernen.Wenn die Membran den Dotter erreicht hat, verschmelzen die Einstülpungen lateral miteinander und bilden so die Membranen der jetzt abgeschlossenen Zellen des Epithels und die Membran des Dotters aus.

Drosophila melanogasterVon der Eizelle zur Larve - Animation von http://gdt-silver-server.biol.biologie.uni-tuebingen.de:8080/Modul1/modul1_05.htm

Drosophila melanogaster22 h nach der Befruchtung des Eis schlüpft eine Made (1.Instar), die sich nach 1 Tag (>2. Instar), 2 Tagen (>3. Instar)und 4 Tagen (>Puppe) häutet. Nach weiteren 4 Tagen(Metamorphose in der Puppe)schlüpft das fertige Insekt.Bis zur Geschlechtsreifevergehen nochca. 12 (mindestens 10)Stunden.

Eine eindrucksvolle Einführung in die Entwicklungvon Drosophila (Filme, interaktive Schemata) findet man unterhttp://gdt-silver-server.biol.biologie.uni-tuebingen.de:8080/modul1.htm

Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster

Drosophila besitzt 4 Chromosomen im haploiden Satz, 1 ist das Geschlechtschromosom/Heterosom (X und Y), 2 und 3 sind große, 4 ein winzig kleines Chromosom. Das Geschlecht wird vom Chromosomenverhältnis X:Autosomen (Nicht-Geschlechtschromosomen) bestimmt. X/X (Verhältnis 1) ist weiblich (ebenso XXY), X/Y (0,5) männlich (ebenso X/-).

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Drosophila melanogaster Drosophila melanogasterEine Besonderheit der Diptera (Fliegen, Mücken) sind die polytänen Chromosomen. Bei der Larvenentwicklung nimmt die Zahl der Zellen nicht zu, während sich die DNA mehrfach repliziert. Alle Kopien bleiben miteinander verbunden und bilden einen dicken Strang. Die dicksten Bündel sind die Riesenchromosomen in den Speicheldrüsen (wohl, weil diese die Puppe bilden und dazu sehr viel Hüllprotein bilden müssen, ist das Genom besonders hoch vermehrt).Auf den Chromosomen ist nach Giemsa-Anfärbung ein Bandenmuster zu sehen. Das Muster ist bei Deletionen, Inversionen, Transpositionen verändert, diese lassen sich leicht erkennen.

Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster

Die Speicheldrüsen werden aus Larven im 3. Instar-Stadium isoliert.

Drosophila melanogaster - genetische NomenklaturFür jeden Organismus haben sich die entsprechenden Genetiker ihre spezielle Nomenklatur überlegt, in die sich der Neuling mühsam einarbeiten muß.In Drosophila hat jedes Gen einen Namen und ein Kürzel, daß kein Leerzeichen enthält und kursiv geschrieben wird. (white eyes, Kürzel w; curly, Kürzel Cy). Rezessive Mutantenallele werden klein geschrieben, dominante Allele mit großem Anfangsbuchstaben. Bestimmte Allele werden durch hochgeschriebene Buchstaben oder Zahlen identifiziert: per0

und perS sind zwei rezessive Mutantenallele für das period Gen, das die innere Uhr von Drosophila steuert.

Drosophila melanogaster - genetische Nomenklatur

Homozygote Wildtypgene werden bei Aufzählungen nicht erwähnt. Heterozygote werde so geschrieben: w/+ oder . Wird nur das Mutantenallel aufgezählt, bedeutet das eine homozygote Mutante: w entspricht also w/w (im Weibchen, es ist ja X-Chromosom codiert, ein Männchen hat immer nur eine Kopie).Also hat eine w-Fliege weiße Augen, eine w/+-Fliege den Wildtypphänotyp rote Augen; Cy und Cy/+-Fliegen haben den Mutantenphänotyp, gebogene Flügel.

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Drosophila melanogaster - genetische NomenklaturHat eine Fliege mehrere Mutationen, werden diese in der Reihenfolge der Chromosomen aufgezählt, die Chromosomen werden durch Semicolon (;) getrennt, also X/Y; 2; 3; 4. Meist wird Chromosom 4 (samt seinem Semicolon) bei Stammbeschreibungen einfach weggelassen, weil nur selten mit den wenigen Genen des Chromosoms gearbeitet wird.Für die genaue Positionsangabe auf dem Genom gibt es eine numerische Skala von 1-102: 1-20 unterteilt X, 21-60 Chromosom 2 (21-40 2L, 41-60 2R), 61-100 Chromosom 3 (61-80 3L, 81-100 3R), 101/102 entfallen auf das winzige Chromosom 4. Genauere Angaben können durchDezimalzahlen erfolgen (w liegt an 1,5), daneben werden die Abschnitte auch durch Buchstaben (A-F) unterteilt.

Drosophila melanogaster - Balancer

Es gibt große Stammsammlungen von Fliegen, in denen die vielen Mutationen erhalten werden. Die Fliegen können nicht, wie Bakterien oder Hefe, durch Einfrieren lebend gelagert werden, jeder Stamm wird daher ständig durch Inzuchtkreuzung vermehrt. Dabei ist die meiotische Rekombination ein großes Problem: interessante Genkombinationen werden dadurch wieder aufgelöst.


Ein weiteres Problem sind letale Mutationen. Sie lassen sich heterozygot halten (letal/+ ist lebensfähig). Bei der Inzuchtkreuzung verschwinden sie aber allmählich gegenüber Wildtypen. (Aus letal/+ entsteht das tote letal/letal, 2x letal/+ und 1x +/+).


Abhilfe schaffen Balancer-Chromosomen. Diese enthalten alle wichtigen Gene eines Chromosoms, aber durch Inversionen und Rekombinationen in völlig anderer Reihenfolge. Dadurch sind Rekombinationen zwischen „normalem“ und Balancer-Chromosom nicht möglich. Außerdem tragen sie mindestens einen rezessiven letalen Marker, daneben, zur leichteren Erkennung, mindestens einen dominanten Marker mit gut sichtbarem Phänotyp.Jeder Balancer hat einen Namen, sein Aufbau läßt sich im Internet (FlyBase, http://fly.ebi.ac.uk:7081/) nachsehen.


Die zur Entstehung dieser “umgemischten” Chromosomen notwendigen Inversionen und Rekombinationen entstehen nur selten. Die Isolierung solcher Veränderungen und damit die Konstruktion der Balancer-Chromosomen wird aber durch das Vorkommen der Riesenchromosomen sehr erleichtert. Nach Giemsa-Färbung und Bandenvergleich sieht ein geübtes Auge sofort Tiere mit größeren Umsortierungen des Genoms.


Balancer TM6B (In(3LR)TM6B, Hu Tb e) hat folgenden Aufbau (das “richtige” Chromosom 3 hat 61A-100F): 61A[!]87B-86C[!]84F-86C[!]84B-84F[!]84B-75C[!]94A-100F[!]92D-87B[!]61A- 63B[!]72E-63B[!]72E-75C[!]94A-92E[!]100F-100F.

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Durch die Balancer kann die letale Mutation stabil erhalten werden. letal/Bal (wobei die Letalmutation auf dem Balancer jedenfalls in einem anderen Gen als dem letal-Gen auf dem homologen Chromosom sein muss) gibt als Nachkommen letal/letal, 2x letal/Bal und Bal/Bal. Lebensfähig sind dabei nur die letal/Bal, also der Ausgangstyp.


Mit Hilfe der Balancer lassen sich auch leicht homozygot letale Mutationen auf dem X-Chromosom identifizieren und isolieren:Männchen (X/Y) werden durch Bestrahlung mutagenisiert. In einigen Fällen entstehen dabei Lethalmutationen auf X. Die Tiere werden mit Weibchen gekreuzt, die X-Balancer ClB (dominanter Marker „Bar“, Balkenauge) tragen.G0: X*/Y x +/ClBIsoliert werden F1-Weibchen mit Bar-Auge, Genotyp also X*/ClB.

Drosophila melanogaster - BalancerDiese (X*/ClB) werden individuell mit unbestrahlten Männchen gekreuzt.F1: X/Y x X*/ClB

Die möglichen F2-Genotypen sindWeibchen X*/X und ClB/XMännchen X*/Y und ClB/Y

Trägt X* eine Letalmutation, sind beide Männchentypen nicht lebensfähig, es entstehen nur Weibchen. Die Weibchen mit normalem Auge sind heterozygot für die Letalmutation.


Rezessive Mutationen lassen sich (im heterozygoten Zustand) nicht am Phänotyp erkennen.Als Abhilfe kombiniert der Forscher die rezessive Mutation mit einer dominanten (in einem anderen Gen natürlich) auf dem selben Chromosom, und nimmt als Homologes einen Balancer. Weil keine Rekombination möglich ist, sind das rezessive Gen und der Phänotyp des dominanten Gens fest gekoppelt, das rezessive Gen läßt sich dadurch bei Kreuzungen verfolgen.


Eine weitere Hilfe für die Drosophila-Genetiker ist der Umstand, daß männliche Drosophilas keine meiotische Rekombination durchführen. Daher werden Mutations-experimente meist an Männchen gemacht, so werden die Mutationsorte nicht in der Meiose durchgemischt.

Drosophila ist damit (und mit den nicht-rekombinierenden Balancern) ein Beispielorganismus, bei dem Meiose ohne jedes crossing-over stattfinden kann!!

Drosophila melanogaster - P-ElementeP-Elemente sind Transposone (Aufbau genau wie bakterielle IS-Elemente: Transposasegen flankiert von inverted repeats) von Drosophila. Die Forscher benutzen Varianten mit dominanten Markern, aber ohne Transposase, und geben das Transposasegen auf einem extra DNA-Stück („D2-3“) zu. Beides wird in das Embyo dort eingespritzt, wo die Geschlechtsorgane entstehen (Hinterende).Die Transposase sorgt für den Einbau des P-Elements an zufälliger Stelle und verschwindet dann, weil das D2-3 nicht vermehrt wird. Auf diese Weise lassen sich markierte Mutationen im ganzen Genom erzeugen.

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Drosophila melanogaster - P-Elemente

P-Elemente lassen sich zur Suche nach Promotoren und Regulatoren im Genom verwenden. Dazu sitzt auf dem P-Element ein lacZ-Gen mit schwachem Promotor. Springt das Element hinter einen starken Promotor oder einen Aktivator der Transkription, wird b-Galactosidase gebildet und die Zelle mit X-Gal blau. So läßt sich auch ermitteln, wann (in welcher Phase der Entwicklung) der Regulator aktiv wird. Das Verfahren wird „Enhancer Trapping“ genannt.

Drosophila melanogaster - Einfacher Genotyp

cv1; sp1; th1

Der Stamm ist homozygot für die rezessiven Mutationen crossveinless 1 auf dem X-Chromosom 1, speck 1 auf Chromosom 2, und thread 1 auf Chromosom 3.

Drosophila melanogaster - Komplexer Genotypy1 w1118 P{ry+t7.2=hsFLP}1; ;TM3, ryRK Sb1 Ser1/TM6B, ryCB Tb1 ca1

Der Stamm trägt homozygot Mutantenallele von yellow und white auf Chromosom X, dazu ein P-Element Transposon {}, das mit einem funktionellen WT-Allel von rosy markiert ist und ein Hefe-FLP Gen enthält.Die Homologen von Chromosom 3 sind jeweils Balancer, TM3 und TM6B, die beide (unterschiedliche) Allele von rosy (neben anderen Markern) tragen, dadurch wird ja das rosy+ P-Element detektierbar.

Aus Flybase: “The rules of Drosophila nomenclature are well defined and reasonably straightforward.”

Drosophila melanogaster Praktische Hinweise:

Der größte Feind der Drosophilas sind Milben, die Eier und die Fliegen fressen. Die Forscher müssen daher alle paar Wochen die Fliegen in neue Gefäße umsetzen.

Weibliche Fliegen können sich mit mehreren Männchen paaren. Für genetische Experimente ist das schlecht. Um Jungfrauen zu isolieren, trennt man Fliegen von Larven/Puppen/Eiern und setzt nur Tiere ein, die in den nächsten 8 Stunden schlüpfen (und in dieser Zeit ja noch nicht geschlechtsreif sind).

Drosophila melanogaster - Homeotische Gene

Bei Drosophila wurde eine Klasse von Genen gefunden, die die Identität der verschiedenen Körpersegmente bestimmen.Es handelt sich um Transkriptionsfaktoren. Sie wurden homeotische Gene genannt, der ihnen gemeinsame konservierte Bereich (ca. 180 Bp) Homeo-Box.

Eine Mutation im homeotischenGen bithorax erzeugt ein zweites Flügelpaar (verwandelt Segment 3 in Segment 2):

Drosophila melanogaster - Homeotische Gene

Homologe der homeotischen Gene kommen auch inVertebraten vor („Hox-Gene“) und haben eine analoge Funktion. Die Konservierung in der Homeo-Box ist sehr hoch, viele sind zu >90% mit der von antennepedia (dessen Fehlexpression Kopfantennen an den Beinen von Drosophila erzeugt) identisch (Hedgehog-Gene). Mutationen führen zu schwersten Mißbildungen, besonders im Schädelbereich (z.B. einzelnes „Zyklopenauge“ auf der Stirn).

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Drosophila melanogaster -Homeotische Gene

Die homeotischen Gene liegen alsCluster in der Reihenfolgehintereinander, der ihrer Expressionund Wirkung in der Fliege von vorn(anterior) nach hinten (posterior)entspricht. Auch diese Anordnungist bei den Säugern konserviert.

Homo sapiens - Geschlechtsdifferenzierung

Der Mensch besitzt 46 Chromosomen, 22 Autosomenpaare und die Geschlechtschromosomen. Ein dominantes Gen (SRY) auf dem Y-Chromosom legt das männliche Geschlecht fest.Auch beim weiblichen Geschlecht ist in jeder Zelle nur eins der beiden X-Chromosomen aktiv, das andere ist als „Barr-Körperchen“ kondensiert. Diese Kondensation geschieht im Embryo um den 14. Tag nach der Befruchtung. Die Wahl des X-Chromosoms ist zufällig (väterliche oder mütterliche Kopie), alle Nachkommen der Zelle übernehmen dieKondensation.

Homo sapiens - Geschlechtsdifferenzierung

Das kondensierte Chromosom ist nicht völlig inaktiv, der distale Bereich des kurzen Arms bleibt funktionell. Auch der Phänotyp von Klinefelter-Patienten (XXY) und Ullrich-Turner-Patienten (X0) läßt sich nur mit einer Aktivität des 2. X-Chromosoms erklären.Klinefelter-Syndrom: ca. 10 cm größer, Aspermie,vermindertes Körperhaar, meist leicht verminderte IntelligenzHäufigkeit: 1/1.000Turner-Syndrom: kleinwüchsig, Sterilität, AortenverengungHäufigkeit: 1/10.000

Homo sapiens - AneuploidieDurch „non-disjunction“, ausbleibende Homologentrennung in der ersten meiotischen Teilung, können auch Autosomen fehlverteilt werden. Das führt in den meisten Fällen zum Tod des Embyos. 8% der befruchteten Eizellen tragen Chromosomenabnomalien, aber nur 0,5% der Lebendgeburten.Lebensfähig sind nur Trisomie 21 (Down-Syndrom) Patienten mit einer Häufigkeit von 1:700 Lebendgeburten. Die Intelligenz ist stark vermindert, dazu kommen weitere charakteristische Fehlbildungen.Selten kommt es zu Lebendgeburten mit Trisomie 13 (Pätau-Syndrom: Hexadaktylie = 6 Finger, Anophthalmie -Augenlosigkeit) und Trisomie 18 (Edwards-Syndrom), die Patienten sterben meist in den ersten Lebenswochen.

Homo sapiens -Amniocentese

Aneuploidie und andere größere Chromosomen-aberrationen lassen sich durch Fruchtwasser-analyse (Amniocentese) früh in der Schwangerschaft nachweisen.

Homo sapiens - Amniocentese

Embryonale Zellen aus dem Fruchtwasser werden weitergezüchtet, durch Colchizin-Behandlung in der Metaphase blockiert (Colchizin verhindert die Ausbildung der Spindel), und die Chromosomen nach Giemsa- (o.ä.) Färbung ausgezählt und ihr Bandenmuster mit Standardchromosomen verglichen.Aneuploidie nimmt mit dem Alter der Mutter stark zu (>6% bei Frauen über 45 Jahren), die - nicht risikolose (Abortrate ca. 0,6%) - Amniocentese ist daher besonders bei älteren Müttern sinnvoll.

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Homo sapiens - Gendiagnostik

Heutzutage lassen sich auch Genmutationen durch DNA-Sonden nachweisen. So lassen sich Erbkrankheiten frühzeitig erkennen.Die vorgeburtliche Diagnostik führt zu moralischen und psychischen Konflikten.Auch was als Grund für eine Abtreibung angesehen wird, hängt z.B. vom Kulturkreis ab: über 90% der abgetriebenen Foeten in Indien sind weiblich!!

Homo sapiens - X-gekoppelte VererbungAuf dem X-Chromosom plazierte rezessive Mutationen können sich bei Männern immer ausprägen, da diese ja nur ein X-Chromosom besitzen (dieseForm der Homozygotie wirdauch „hemizygot“ genannt).Bekanntestes Beispiel ist dieBluter-Krankheit Hämophilie A(Mutation von Gerinnungsfaktor VIII), die z.B. die europäischenFürstenhäuser heimsuchte.„Stamm-Mutter“ der Krankheitwar Königin Victoria.

Homo sapiens - Erbgang Haemophilie A Homo sapiens - X-gekoppelte Vererbung

Bei Hämophilie A läßt sich voraussagen, daß Töchter kranker Väter symptomlose heterozygote Träger des defekten Allels sind, während die Söhne alle gesund sind (ihr X stammt von der Mutter). Töchter einer heterozygoten Trägerin und einem Bluter werden zu 50% selbst homozygot und damit Bluter (die übrigen sind heterozygote Merkmalsträgerinnen).

Homo sapiens - X-gekoppelte Vererbung

Andere X-gekoppelte Krankheiten werden nie bei Frauen manifest, weil sie homozygot vor der Geschlechtsreife zum Tode führen: „Letalfaktoren“. Dazu gehört die Duchenne´sche Muskeldystrophie (1:5.000 bei Männern), die betroffenen Jungen erkranken mit ca. 6 Jahren an progredientem Muskelschwund und sterben jung.

Homo sapiens - Autosomale GeneWichtige Erbkrankheiten, die autosomal codiert sind:Rezessive Allele bei- Cystische Fibrose, Mukoviscidose (1:2.000; eigentlich funktionelles CFTR-Genprodukt (ein ABC-Transporter) wird im ER zurückgehalten und abgebaut, dadurch fehlerhafter Ionentransport, zäher Schleim, Sekundärinfektionen)

- Hoffnung auf Gentherapie oder Medikament, das den Weitertransport des Proteins bewirkt- Albinismus (Enzym Tyrosinase fehlt - keine Melaninbildung, Pigmentmangel in Haut und Augen)- Phenylketonurie (1:5.000, Enzym Phenylalanin-Hydroxylase fehlt

- Phenylpyruvat häuft sich an und führt zu geistiger Behinderung. Früherkennung durch Urintest, Diät mit wenig Phenylalanin erlaubt normale Entwicklung)

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Homo sapiens - Autosomale Gene

Wichtige Erbkrankheiten, die autosomal codiert sind:Dominante Allele bei- Chorea Huntington, Veitstanz (Häufigkeit 1:10.000, ab 40. Lebensjahr Neuronenabbau, motorische Defekte, Persönlichkeitsänderung). Durch vorgeburtliche Diagnose vorhersagbar.

Homo sapiens - Zellkulturen

Für Mikroorganismen ist die Vermehrung der Zelle der Normalzustand, für das Unterbrechen des Zellzyklus bedarf es eines Signals, z.B. Hunger oder Paarungspheromon bei Hefe.Für Zellen eines Vielzellers ist die G0-Phase, Ausscheiden aus dem Zellzyklus der Normalzustand, für das Einleiten der Proliferation sind dagegen chemische Signale notwendig, die Wachstumsfaktoren. Das gilt auch für Zellen in Zellkultur, damit sie proliferieren, brauchen sie ein Signal.


Viele Wachstumsfaktoren sind spezifisch für einen Zelltyp (neuronal growth factor - wirkt nur auf Nervenzellen). Für eine allgemeine Anwendung hat sich der “platelet derived growth factor” (PDGF) als günstig erwiesen. Er wird bei der Blutgerinnung von den Blutplättchen freigesetzt und stimuliert die Vermehrung fast aller Zelltypen. Das macht als Reaktion auf eine Verletzung ja auch Sinn.Zugegeben wird zu Zellkulturen meist foetales Kälberserum, das (Serum - Blutflüssigkeit nach Blutgerinnung) PDGF enthält.


Andere zentrale Unterschiede zu Mikroorganismen sind, daß Säugerzellen - eine Unterlage zum Anheften brauchen (im Organismus das Bindegewebe, in Kultur meist eine Kollagenschicht)- die Vermehrung einstellen, wenn sie zu einem dichten Rasen gewachsen sind (Kontakthemmung der Proliferation)- nach einer begrenzten Zahl von Zellzyklen die Vermehrung einstellen (Alterungsprozeß). Zellen aus jungen Tieren oder Menschen können mehr Zellzyklen durchlaufen (Mensch: 50 -80) als solche aus alten (<30).


Diese drei Wachstumsbeschränkungen gehen durch Mutation von Kulturzellen manchmal verloren, meist alle drei auf einmal. Kulturen solcher Zellen, die auch in Suspension wachsen, das Wachstum bei Kontakt nicht einstellen und sich unbegrenzt vermehren, werden “transformierte Zell-Linien” genannt. Bringt man solche Zellen in ein Tier, entwickeln sie sich zum Tumor. Umgekehrt wachsen Krebszellen in Kultur immer ungehemmt, sind also transformiert.


Die Mutationen in transformierten Zellen bewirken, daß Tumorsuppressorgene inaktiv werden, also Gene, die unkontrolliertes Wachstum verhindern, und dass Onkogenedaueraktiv werden, das sind Gene, die die Proliferation vorantreiben (im “gesunden” Zustand heißen sie Protoonkogene).Onkogene finden sich oft auf Viren. Sie stammen ursprünglich aus dem Wirtsorganismus, sind “versehentlich” mitgenommen und verschaffen jetzt dem Virus einen Vorteil, weil sie die Vermehrung seine Wirtszelle (mit ihm darin) bewirken. Nomenklatur: c-src zelluläres Protoonkogen, v-src abgeleitetes virales Onkogen.

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Für die Forschung ist es meist einfacher, mit transformierten Linien zu arbeiten. Es gibt davon viele aus den unterschiedlichsten Geweben und Entwicklungsstufe. Allerdings verhalten sich solche Linien oft anders als “gesunde” Körperzellen. In Kultur verändern sie auch ihre Genomstruktur: die Zellen der bekanntesten Zelllinie, HeLa-Zellen (Cervixkarzinom von Henrietta Lacks), haben unterdessen 120 - 180 Chromosomen pro Zelle.


Für funktionelle Studien benutzt man daher gern Primärzellkulturen, die frisch aus dem zu untersuchenden Organ stammen. Diese müssen aber für jede Experimentreihe neu isoliert werden, was nicht nur Mühe macht, sondern auch Probleme mit der Vergleichbarkeit: jede Präparation stammt aus einem anderen Individuum.

Hefegenetik

Als Hefen werden einzellige Ascomyceten (also Pilze) bezeichnet. Die unterschiedlichen Hefen haben z.T. einen beträchtlichen evolutionären Abstand (z.B. sind die beiden wichtigsten Modellhefe, Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und Spalthefe Schizosaccharomyces pombe trotz ähnlicher Namen (cerevisia und pombe heißen übrigens beide Bier, pombe ist Kisuaheli) sehr unterschiedlich).

Hefegenetik

S. cerevisiae ist die wichtigste Modellhefe. Zu ihren Vorteilen gehört, daß sie haploid und diploid vermehrbar ist, ...

Hefegenetik

...und daß die Zellzyklusphase an der Größe der wachsenden Knospe zu erkennen ist.

Hefegenetik

Haploide Wildtypformen von S. cerevisiae sind nicht stabil, da die Zellen ihren Paarungstyp zwischen MAT a und MAT awechseln und dann paaren (homothallische Hefe). In typischen Laborstämmen ist aber das HO-Gen, das für den Paarungstypwechsel verantwortlich ist, defekt.

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Hefegenetik

Ein Vorteil, die alle Pilze gegenüber den meisten anderen Eukaryonten haben, ist eine nahezu perfekte homologe Rekombination von Fremd-DNA. Während beim Menschen >90% in die Zelle eindringende DNA zufällig integriert wird (und damit meist im „abgeschalteten“ Heterochromatin landet, im schlimmsten Fall sogar einen Tumorsuppressor disrumpieren könnte - ein großes Problem der somatischen Gentherapie), baut Hefe die DNA dort ins Genom ein, wo ihre Randbereiche homolog sind. Dadurch lassen sich z.B. in vitro mutierte Gene für die Wildtypform einbauen. Das Ausschalten von Genen durch homologe Rekombination geht so effektiv, daß für alle gut 6.000 Hefegene Disruptanten produziert wurden und allen Forschern zur Verfügung stehen.

Hefegenetik - Gendisruption

Hefegenetik - NomenklaturAlle Gene (außer HO) werden mit drei Buchstaben und einer Zahl bezeichnet. Bei Wildtypallelen und dominanten Mutanten sind die drei Buchstaben großgeschrieben (GEN1), bei rezessiven Mutanten alle klein (gen1).Allelnummern werden angehängt: gen1-17, MAL2-8c exprimiert Maltose konstitutiv, statt von Glucose reprimiert zu werden).Disruptionen werden mit großem Delta bezeichnet oder mit zwei Doppelpunkten, gefolgt vom Disruptionsmarker.Dcdc48, cdc48::URA3Bei diploiden Stämmen werden die Allelpaare durch Querstrich getrennt:CDC48/cdc48::URA3 ist heterozygot disrumpiert.

Hefegenetik - 2-Hybrid-System

Mit Hilfe der Molekulargenetik läßt sich die Hefezelle als winziges Reaktionsgefäß benutzen. Eine wichtige Information, um die vielen Gene Stoffwechselprozessen zuzuordnen, ist es, welches Protein mit welchem wechselwirkt (also in der Natur z.B. einen Komplex bildet). Biochemisch ist das sehr aufwendig, insbesondere müssen die Proteine zuerst (in ihrer nativen = richtigen Konformation) aufgereinigt werden.


Im 2-Hybrid-System werden die Gene der beiden Protein-kandidaten an Genbruchstücke eines Transkriptions-aktivators (meist GAL4) gehängt. Das eine Stück codiert für die DNA-bindende Aktivität, das andere für die Aktivierung der RNA-Polymerase. Es entstehen zwei hybride Proteine. Bei Wechselwirkung der angehängten Proteine kommen beide Domainen zusammen und schalten das Indikatorgen(oft lacZ) an.

Hefegenetik -2-Hybrid-System

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Anwendungen des 2-Hybrid Systems- Bei Vermutung einer Interaktion (z.B. gemeinsamen Proteinkomplex) werden die Gene beider Komponenten aun GA bzw. DB fusioniert. Kommt es zur Bildung blauer Kolonien (X-Gal/lacZ-Expression), ist die Interaktion bestätigt, weisse Kolonien bedeuten „keine Interaktion“- Um zu untersuchen, an welche Partner ein Protein bindet (gemeinsamer Komplex, Enzym/Substrat), wird sein Gen an GA fusioniert und zusammen mit einer Genbank (fast alle Gene des Organismus mit DB fusioniert) in Hefe transformiert. Die (wenigen) blauen Kolonien enthalten Gene, deren Produkt mit dem untersuchten Protein interagieren.

Bakteriengenetik - Ames-Test

Ein Beispiel für die direkte Nützlichkeit und Übertragbarkeit von Test an Bakterien auf den Menschen: Mutagene Stoffe (die beim Menschen Krebs erzeugen können, also carcinogen wirken) verändern die DNA. Ein schnelles Testsystem von Bruce Ames setzt histidinauxotrophe Salmonellen ein (zur Vergleichbarkeit muß immer derselbe Stamm genommen werden). Nach Behandlung mit dem potentiellen Mutagen wird getestet, wieviele Zellen ohne Histidin wachsen können (also zur Histidin-Autotrophie revertiert sind). Je höher die Reversionsrate, desto mutagener ist die getestete Substanz.

Bakteriengenetik - Ames-TestEinige beim Menschen hochcancerogene Stoffe wie Benzpyren sind in diesem einfachen Test völlig unwirksam. Grund ist, daß nicht das Benzpyren mutagen ist, sondern die Moleküle, die die Säugerleber (mit dem Cytochrom P450-System) daraus produziert, wenn sie durch oxidative Prozesse versucht, die Substanz besser wasserlöslich (und damit besser ausscheidbar) zu machen. Um diesen Vorgang nachzuahmen, werden die Testsubstanzen beim verbesserten Ames-Test mit einem Extrakt aus Rattenleber behandelt.Der Test ist sehr aussagekräftig und benötigt nur 1-2 Tage. Der bis dahin verwendete Test an Versuchsratten dauerte über 2 Jahre.

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