Einfluss der Lipidzusammensetzung der Membran auf die ...nbn:de:gbv:700... · membran verankert ist und ein Molekulargewicht von 59 kDa besitzt, eine Rolle bei der Bindung und dem

Einfluss der Lipidzusammensetzung der

Membran auf die Expression des

kdpFABC-Operons in Escherichia coli

Dissertation

zur Erlangung des Grades

Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

des Fachbereiches Biologie/Chemie

an der Universität Osnabrück

Maren Schniederberend

Osnabrück 2009

Inhaltsverzeichnis

2

Inhaltsverzeichnis Danksagung......................................... ..................................................................... 4 Abkürzungen........................................ ..................................................................... 5 Nomenklatur........................................ ...................................................................... 6 1. Einleitung ......................................... .............................................................. 7

1.1. K+-Transportsysteme von Escherichia coli ........................................................................... 7 1.2. Das Signaltransduktionssystem KdpD / KdpE von E. coli................................................... 9 1.3. Reiz und Reizaufnahme von KdpD in E. coli ....................................................................... 14 1.4. Die Zytoplasmamembran und ihre Phospholipide ....... ...................................................... 17 1.5. Einfluss der Membranzusammensetzung auf Membranprot eine durch die Interaktionen

mit Phospholipiden ................................. ............................................................................... 20 1.6. Aufgabenstellung ................................... ................................................................................ 21 2. Material und Methoden.............................. .................................................. 23

2.1. Materialien........................................ ....................................................................................... 23 2.2. Stämme, Plasmide und Oligonukleotide............... ............................................................... 24 2.3. Medien und Anzuchtverfahren........................ ...................................................................... 27 2.3.1. Mediumshift .............................................................................................................................. 28 2.3.2. Bestimmung der Lebendzellzahl .............................................................................................. 28 2.4. Molekularbiologische und genetische Methoden ....... ........................................................ 29 2.4.1. Plasmidisolierung ..................................................................................................................... 29 2.4.2. Isolierung genomischer DNA.................................................................................................... 29 2.4.3. DNA-Modifikation...................................................................................................................... 29 2.4.4. Elektrophoretische Auftrennung von DNA................................................................................ 30 2.4.5. Extraktion von DNA aus Agarosegelen .................................................................................... 30 2.4.6. Herstellung kompetenter Zellen ............................................................................................... 30 2.4.7. Transformation von kompetenten Zellen.................................................................................. 31 2.4.8. Polymerasekettenreaktion........................................................................................................ 31 2.4.9. DNA-Sequenzanalyse .............................................................................................................. 32 2.4.10. Isolierung von RNA................................................................................................................... 32 2.4.11. cDNA Synthese ........................................................................................................................ 32 2.4.12. Quantitative real-time RT-PCR................................................................................................. 32 2.4.13. P1-Phagenlysatpräparation und P1-Transduktion ................................................................... 33 2.5. Biochemische und analytische Methoden.............. ............................................................. 34 2.5.1. Herstellung von SDS-Proben aus ganzen Zellen..................................................................... 34 2.5.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese...................................................................................... 35 2.5.3. Immunoblot ............................................................................................................................... 35 2.5.4. Herstellung von multilamellaren Liposomen ............................................................................ 36 2.5.5. Präparation von invertierten Membranvesikeln........................................................................ 37 2.5.6. Reinigung von KdpD-6His ........................................................................................................ 37 2.5.7. Rekonstitution von KdpD-6His ................................................................................................. 37 2.5.8. Fusion von Membranvesikeln mit synthetischen Liposomen................................................... 39 2.5.9. Proteinbestimmung nach Lowry ............................................................................................... 39 2.5.10. Proteinphosphorylierung mit [γ−32P] ATP ................................................................................. 39 2.5.11. Lipid-Extraktion aus ganzen Zellen .......................................................................................... 40 2.5.12. Dünnschichtchromatographie................................................................................................... 41 2.5.13. Kopfgruppenanalyse der Phospholipide mittels 32P-Markierung.............................................. 41 2.5.14. Fettsäure-Extraktion aus ganzen Zellen................................................................................... 42 2.5.15. Fettsäureanalyse der Phospholipide mittels Gaschromatographie.......................................... 42 2.5.16. Flammenphotometrische Bestimmung des extrazellulären K+- und Na+-Gehaltes.................. 42 2.5.17. β-Galaktosidase-Aktivitätstest .................................................................................................. 43

Inhaltsverzeichnis

3

3. Ergebnisse ......................................... .......................................................... 44

3.1. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli K12 Wildtyp ...................... 44 3.1.1. Totale Phospholipidzusammensetzung.................................................................................... 44 3.1.2. Neusynthetisiertes Cardiolipin nach K+-„downshift“ ................................................................. 45 3.1.3. Fettsäurezusammensetzung unter K+-Limitation ..................................................................... 46

3.2. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli „Kalium-Stämmen“.......... 47 3.2.1. Totale Phospholipidzusammensetzung.................................................................................... 47 3.2.2. Neusynthetisiertes Cardiolipin nach K+-„downshift“ ................................................................. 48

3.3. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli „Lipid-Stämmen“ ............. 50 3.4. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli C43(DE3) / pEcb1............. 53 3.5. Cardiolipin-Anstieg unter K +-Limitation........................................ ....................................... 54 3.5.1. cls-Expression in verschiedenen E. coli Stämmen .................................................................. 54 3.5.2. Cardiolipin-Gehalt in einem ∆cls-Stamm.................................................................................. 56

3.6. Überprüfung eines gemeinsamen kch-cls Transkripts ....................................... ............... 58 3.7. Einfluss der Zusammensetzung der Zytoplasmamembran auf das Kdp-System ........... 60 3.7.1. Kinaseaktivität von KdpD-6His in Membran-Lipid-Fusionen.................................................... 60 3.7.2. Kinaseaktivität von KdpD-Derivaten in Membran-Lipid-Fusionen............................................ 62 3.7.3. kdpFABC-Expression unter K+-Limitation in Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung .. 63 3.8. Einfluss von Procain auf die kdpFABC-Expression ........................................ ................... 65 3.8.1. Q-RT-PCR in „Lipid-Stämmen“ ................................................................................................ 65 3.8.2. β-Galaktosidase-Aktivitäten von KdpD-Derivaten .................................................................... 67

3.9. Suche nach Kontaktstellen von KdpD mit Phospholipid en der Zytoplasmamembran... 68 3.10. Novobiocin-Resistenz in Abhängigkeit von KdpD...... ........................................................ 72 4. Diskussion......................................... ........................................................... 76

4.1. Einfluss der Lipidzusammensetzung auf das Kdp-Syste m ............................................... 76 4.2. Modell für den Anstieg von Cardiolipin ............. .................................................................. 81 4.3. Hypothesen zur Interaktion von KdpD................ ................................................................. 86 4.4. Ausblick........................................... ........................................................................................ 94 5. Zusammenfassung .................................... .................................................. 98 6. Summary ............................................ .......................................................... 99 7. Literaturverzeichnis............................... .................................................... 100 Eidesstattliche Erklärung.......................... ........................................................... 111

Danksagung

4

Danksagung Viele Menschen haben mich bei der Realisierung meiner Doktorarbeit unterstützt. Obwohl

diese Auflistung nicht vollständig sein kann, so möchte ich dennoch folgende Personen

hervorheben, die mich besonders unterstützt haben:

Herrn Professor K. Altendorf für die Möglichkeit an einem interessanten Thema zu

forschen und die guten Arbeitsbedingungen, die diese Arbeit erst möglich gemacht haben.

Besonders auch für sein Vertrauen, mich nach Houston in die Arbeitsgruppe von Professor

W. Dowhan zum Erlernen neuer Methoden und an zwei wunderbare Gordon-Konferenzen an

die amerikanische Ostküste zu entsenden, mit der Möglichkeit Kontakte zu knüpfen. Und

schließlich danke ich ihm für die kritische Durchsicht und die Begutachtung dieser Arbeit.

Herrn Professor G. Unden für die Begutachtung meiner Arbeit.

Dr. Petra Zimmann für ihre unermüdlichen Diskussionen, ihre Hilfsbereitschaft beim

Verfassen von meinem Manuskript, die kritische Durchsicht meiner Dissertation und ihrem

Verständnis für alles.

Monika, Knut, Kerstin und Eva für Eure tägliche Unterstützung als meine engsten

Mitstreiter im Labor 115/116, wenn Ihr alle leider auch nicht während meiner kompletten Zeit

dabei sein konntet, war es eine tolle Zeit mit Euch!

Allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Mikrobiologie für

das angenehme Arbeitsklima, die hilfreichen Ideen und die konstruktive Kritik. Insbesondere

seien hier meine Mitstreiter Dorthe, Inga und Heidi genannt.

Herrn Professor William Dowhan in Houston, Texas für die Aufnahme in seine Arbeits-

gruppe. Dabei gebührt ein besonderer Dank Dr. Mikhail „Misha“ Bogdanov für die Betreuung

und das Interesse an meinen Ergebnissen. Vielen Dank an beide auch für die Diskussionen

bezüglich des Manuskripts für meine Veröffentlichung.

Frau Professor Janet Wood in Guelph, Kanada für ihr Interesse am Fortschritt meiner

Arbeit und für Ihre konstruktiven Diskussionen.

Den Vorsitzenden der FAZIT- und der Hans Mühlenhoff-Stiftung für die finanzielle Unter-

stützung durch die Vergabe eines Stipendiums.

Meiner Schwester Tanja und ihrem Mann Ingo für die permanente Unterstützung und

Motivation während meiner Arbeit. Ohne sie hätte ich das alles nicht geschafft. Dazu hat

auch Geli einen wesentlichen Teil getragen. Danke!

Zu guter letzt bedanke ich mich bei all den lieben Menschen, die während der letzten

Jahre an meiner Seite waren. Ohne Euch hätte ich nur halb so viel Kraft und Spaß gehabt!

Abkürzungen

5

Abkürzungen AP Alkalische Phosphatase

Ap r Ampicillinresistenz

AS Aminosäure

bp Basenpaare

CA catalytic ATP-binding

cDNA komplementäre DNA

CL Cardiolipin

CMC “critical micelle concentration”

cpm “ Counts per minute”

CT “cycle threshold”

DC Dünnschichtchromatographie

DDM n-Dodecyl-β-Maltosid

DHp “ dimerization histidine phosphotransfer”

FAME Fettsäure Methyl Ester

HPt Histidin-enthaltende Phosphotransfer-Proteine

kdp „K+-dependent“

LDAO Lauryldimethylaminoxid

MV Membranvesikel

Ni2+-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure

ODx Optische Dichte der Wellenlänge x nm

OG Octylglycosid

PC Phosphatidylcholin

PE Phosphatidylethanolamin

PG Phosphatidylglycerol

Pi anorganisches Phosphat

Q-RT-PCR Quantitative real-time Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion

rpm „rounds per minute“

RT Raumtemperatur

TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

TG Tris/Glycerol

TM Transmembrandomäne

Usp “universal stress protein“

WT Wildtyp

Nomenklatur

6

Nomenklatur In der vorliegenden Arbeit werden Stämme von Escherichia coli mit einer Mutation in

den Genen, welche für Enzyme kodieren, die in die Biosynthese der Phospholipide

involviert sind, der Einfachheit halber als „Lipid-Stämme“ bezeichnet. Des Weiteren

werden Stämme mit einer Mutation in den Genen, welche für K+-Aufnahmesysteme

kodieren, der Einfachheit halber als „Kalium-Stämme“ bezeichnet.

1. Einleitung

7

1. Einleitung

1.1. K+-Transportsysteme von Escherichia coli

Bakterien sind in ihrer Umgebung ständig wechselnden Umwelteinflüssen ausgesetzt

und müssen daher über viele verschiedene Mechanismen zur Anpassung an diese

Bedingungen verfügen. Von großer Bedeutung ist dabei die Aufrechterhaltung von

Ionengradienten über der Zellmembran. Hierbei spielen die monovalenten Kalium-

Ionen (K+) und Natrium-Ionen (Na+) eine entscheidende Rolle. Dabei werden Kalium-

Ionen meistens intrazellulär angereichert (Harold et al., 1974), während Natrium-

Ionen aus der Zelle ausgeschleust werden (Bakker, 1993). Die intrazelluläre K+-

Konzentration liegt bei 200-500 mM, wobei fast die Hälfte frei im Zytoplasma vorliegt.

Bei diesen K+-Konzentrationen ist die Aktivierung von Enzymen (Suelter, 1970), die

Regulation des intrazellulären pH-Wertes (Booth, 1985) und die Regulation des Zell-

turgors gegeben. Um die intrazelluläre K+-Konzentration in Antwort auf Änderungen

der Umgebung anzupassen, hat Escherichia coli verschiedene Transportsysteme

etabliert, die unterschiedliche Affinitäten für Kalium aufweisen (Abb. 1.1).

Abb. 1.1: K +-Transportsysteme von E. coli (verändert nach Helmer et al., 1982).

K+-Limitation

1. Einleitung

8

In E. coli sind bislang für den Export von K+ die KefB/KefC-Systeme (Bakker et al.,

1987; Booth et al., 1996) und ein K+/H+-Antiporter bekannt. Kalium kann aber auch

durch die mechanosensitiven Kanäle (Msc) aus der Zelle transportiert werden.

Dieses ist z.B. bei einem hypoosmotischen Schock der Fall, wenn K+-Ionen mit

anderen kleinen Molekülen über die unspezifischen Kanäle aus der Zelle exportiert

werden. Für die Aufnahme von Kalium bei einer Konzentration über 200 µM in der

Umgebung gibt es die niedrigaffinen TrkG/TrkH- und Kup-Systeme, deren Gene

konstitutiv exprimiert werden. Wenn diese Aufnahmesysteme bei niedrigeren K+-

Konzentrationen nicht mehr in der Lage sind, den Bedarf der Zelle an K+ aufrecht zu

erhalten (Epstein, 1992), synthetisiert E. coli ein Notfallsystem, um K+ aufzunehmen.

Dabei handelt es sich um den hochaffinen K+-Transporter KdpFABC, dessen

Genexpression über eine spezifische Induktion reguliert wird. Der KdpFABC-

Komplex ist eine K+-abhängige P-Typ ATPase und wird von dem kdpFABC-Operon

kodiert (Altendorf & Epstein, 1996).

Der hochaffine Transportkomplex besteht aus den vier Untereinheiten KdpF, KdpA,

KdpB und KdpC (Laimins et al., 1981; Hesse et al., 1984; Gaßel et al., 1998), die bei

der Aufnahme von K+-Ionen unterschiedliche Funktionen erfüllen. Es konnte gezeigt

werden, dass KdpA, welches mit zehn Transmembranhelices in der Zytoplasma-

membran verankert ist und ein Molekulargewicht von 59 kDa besitzt, eine Rolle bei

der Bindung und dem Transport von Kalium spielt (Buurmann et al., 1995). KdpA

stellt einen K+-Kanal vom MPM-Typ (membrane helix - P-loop - membrane helix) dar

(Durell et al., 2000). Die mit 72 kDa größte Untereinheit des Komplexes bildet KdpB,

welches die Membran vermutlich mit sieben Transmembrandomänen durchspannt

(Altendorf et al., 1998) und die notwendige Energie für den Transport liefert (Siebers

& Altendorf, 1989; Siebers & Altendorf, 1993). Dabei ist es unter den bakteriellen P-

Typ ATPasen einzigartig, dass die ATP-Hydrolyse und Substrattranslokation auf zwei

Untereinheiten verteilt ist (Bramkamp et al., 2007). Es wird vermutet, dass diese

beiden Vorgänge über die fünfte Transmembrandomäne von KdpB mit den hoch-

konservierten geladenen Aminosäuren D583 und K586 miteinander verbunden

werden (Bramkamp & Altendorf, 2003). Becker et al. (2007) konnten zeigen, dass

dieser Dipol für die Kopplung des K+-Ions und für den K+-Translokationsschritt

entscheidend ist. Die 20 kDa große KdpC-Untereinheit ist essentiell für den

Transport und sorgt für die korrekte Assemblierung des Komplexes (Gaßel, 1999).

Auch eine Funktion von KdpC bei der Energieübertragung von KdpB und KdpA wird

1. Einleitung

9

diskutiert (Gaßel & Altendorf, 2001). Des Weiteren wird vermutet, dass KdpC eine

katalytische Rolle bei dem Reaktionszyklus des KdpFABC-Komplexes spielt (Ahnert

et al., 2006). Möglicherweise könnte KdpC auch als katalytisches Chaperon fun-

gieren, welches durch Interaktion mit ATP die schwache ATP-Bindeaffinität der hoch-

konservierten Phosphorylierungsstelle von KdpB erhöht (Greie & Altendorf, 2007).

Der mit 3.1 kDa kleinsten Untereinheit des Komplexes, KdpF, wird eine Funktion bei

der Stabilisierung zugewiesen, wobei das Peptid für den Transport in vivo nicht

essentiell ist (Gaßel et al., 1999).

1.2. Das Signaltransduktionssystem KdpD / KdpE von E. coli Die Synthese des KdpFABC-Systems wird durch die membrangebundene Sensor-

kinase KdpD und den zytoplasmatischen Antwortregulator KdpE reguliert

(Walderhaug et al., 1992). Diese beiden Proteine stellen ein typisches Sensor-

kinase / Antwortregulator System dar. Solche Signaltransduktionssysteme sind bei

Prokaryoten und Eukaryoten weit verbreitet und weisen einen ähnlichen Mecha-

nismus der Reizwahrnehmung und Signalweiterleitung auf. Diese Systeme können

verschiedene externe Parameter wie Nährstofflimitation, Temperatur, Sauerstoffge-

halt, pH-Wert, Osmolalität, Anhäufung toxischer metabolischer Produkte und andere

Faktoren detektieren. Die Adaptation auf diese Variationen löst meist eine Änderung

der Genexpression oder der Motilität aus (Stock et al., 1990; Bourret et al., 1991;

Parkinson & Kofoid, 1992; Parkinson, 1993; Stock et al., 2000). Bei Bakterien

bestehen diese Systeme in der Regel aus zwei Proteinkomponenten (Abb.1.2). Die

Funktion des jeweiligen bakteriellen Zweikomponentensystems kann dabei ganz

unterschiedlich sein, denn diese Systeme werden sowohl für die Chemotaxis als

auch für den Metabolismus, die Pathogenität und den Transport benötigt (West &

Stock, 2001).

Abb. 1.2: Schematische Darstellung der Funktionswei se von Sensorkinase / Antwort-regulator Systemen anhand ihrer Domänenstruktur (ve rändert nach Laub & Goulian, 2007). Die direkt an der Phosphorylierungskaskade beteiligten Aminosäurereste Histidin und Aspartat sind durch die Buchstaben „H“ und „D“ gekennzeichnet.

1. Einleitung

10

Die bislang untersuchten Sensorkinasen sind überwiegend in der Zytoplasma-

membran verankert, wo sie einen oder mehrere Reize wahrnehmen können. Je

nachdem, ob sie den Reiz im Periplasma, in der Transmembranregion oder im

Zytoplasma wahrnehmen, können sie in verschiedene Gruppen eingeteilt werden

(Maschner et al., 2006). Ein typischer Antwortregulator liegt in löslicher Form im

Zytoplasma vor und kann so eine Zellantwort auslösen. Sensorkinasen und Antwort-

regulatoren sind in der Regel jeweils aus zwei funktionellen Domänen aufgebaut. Mit

Hilfe dieser Domänen findet die Reizwahrnehmung und Reizweiterleitung über eine

Phosphorylierung statt. Dabei besteht die Sensorkinase aus einer N-terminalen

“Input“-Domäne und einer C-terminalen “Transmitter“-Domäne. Der Antwortregulator

lässt sich in eine N-terminale “Receiver“-Domäne und eine oder mehrere C-terminale

“Output“-Domänen unterteilen (Parkinson, 1995). Nach der Wahrnehmung eines

Reizes durch die “Input“-Domäne der Sensorkinase kommt es zu einer Autophos-

phorylierung der Sensorkinase durch die γ-Phosphorylgruppe eines ATP-Moleküls an

einem hochkonservierten Histidinrest in der “Transmitter“-Domäne. Im Anschluss

erfolgt der Transfer dieser Phosphorylgruppe auf einen hochkonservierten Aspartat-

rest in der “Receiver“-Domäne des Antwortregulators. Der phosphorylierte Antwort-

regulator kann dann mittels seiner “Output“-Domäne die Adaptation der Zelle

bewirken (Stock et al., 1989; Parkinson & Kofoid, 1992; Stock et al., 2000). Dabei

führt meistens die Phosphorylierung des Antwortregulators zu einer Änderung der

Transkription spezifischer Gene (Laub & Goulian, 2007).

Die “Transmitter“-Domäne der Sensorkinase besteht aus zwei Subdomänen. Die

erste Subdomäne, welche den hochkonservierten Histidinrest beinhaltet, wurde als

“DHp“-Domäne (“dimerization histidine phosphotransfer“) bezeichnet. Aufgrund der

Phosphorylierung des Histidinrestes während der Signaltransduktion werden diese

Sensorkinasen auch Histidinkinasen genannt. Die andere Subdomäne, die “CA“-

Domäne (“catalytic ATP-binding“), enthält konservierte Sequenzmotive, die eine

Rolle bei der ATP-Bindung und bei der Translokation der Phosphorylgruppe zu

spielen scheinen (Tanaka et al., 1998).

Im Fall des Signaltransduktionssystems KdpD / KdpE kommt es unter K+-Limitation

(und bei hoher Osmolalität im deutlich geringeren Ausmaß) zur Autophos-

phorylierung von KdpD am hochkonservierten Histidinrest H673 in der “Transmitter“-

Domäne (Nakashima et al., 1992; Voelkner et al., 1993). Nach der Phosphorylierung

1. Einleitung

11

von KdpD erfolgt der Transfer der Phosphorylgruppe auf den Aspartatrest D52 in der

“Receiver“-Domäne des zytoplasmatischen Antwortregulators KdpE (Nakashima et

al., 1993; Jung et al., 1997; Lucassen, 1998). Diese Übertragung wird vermutlich

durch KdpE katalysiert, da KdpE in vitro auch durch Acetylphosphat phosphoryliert

wird (Lucassen, 1998). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung

von KdpE zur Bildung eines Homodimers führt (Lucassen, 1998). Dieses

phosphorylierte KdpE-Homodimer ist in der Lage, mit hoher Affinität stromaufwärts

an die kdpFABC-Promotorregion zu binden und die Transkription des kdpFABC-

Operons zu induzieren (Nakashima et al., 1993). Das Schema der Signaltransduktion

zwischen KdpD und KdpE ist in Abbildung 1.3 gezeigt.

Abb. 1.3: Modell der Signaltransduktion von KdpD / KdpE in E. coli (verändert nach Hamann, 2008). Dargestellt sind die Autophosphorylierung von KdpD und der Phospho-transfer von KdpD auf KdpE, durch welchen die kdpFABC-Expression induziert wird (links). Daneben ist auch gezeigt, wie KdpD phosphorylieres KdpE dephosphoryliert (rechts), wobei die Phosphorylgruppe als „P“ gekennzeichnet ist.

Die Sensorkinase KdpD (98.7 kDa) besteht aus einer zytoplasmatischen N-

terminalen und einer zytoplasmatischen C-terminalen Domäne, die durch vier Trans-

membrandomänen miteinander verbunden sind (Zimmann et al., 1995). Die mit

ungefähr 660 Aminosäuren ungewöhnlich große „Input“-Domäne von KdpD, welche

1. Einleitung

12

für die Reizwahrnehmung verantwortlich ist, wird aus der N-terminalen Domäne, den

vier Transmembrandomänen mit dem Arginincluster und ungefähr 140 Aminosäuren

der zytoplasmatischen C-terminalen Domäne gebildet (Abb. 1.4). Die anderen 230

Aminosäuren der zytoplasmatischen C-terminalen Domäne bilden eine für Histidin-

kinasen typische „Transmitter“-Domäne, welche die konservierten Sequenzmotive

“H“, “N“, “G1“, “F“ und “G2“ beinhaltet (Parkinson & Kofoid, 1992). In der “Input“-

Domäne fällt die 400 Aminosäuren große zytoplasmatische, hydrophile N-terminale

Domäne auf, welche bislang einzigartig unter den Sensorkinasen ist. In dieser N-

terminalen Domäne kommen zwei Sequenzmotive vor, die den “Walker A“- und

“Walker B“-Motiven ähneln, welche für eine ATP-Bindung charakteristisch sind. Bei

dem abgewandelten “Walker A“-Motiv “GXXXGXGKT“ liegt eine zusätzliche Amino-

säure zwischen den beiden ersten Glycinresten im Vergleich zum klassischen Motiv

“GXXGXGKT“ vor (Jung & Altendorf, 1998b).

Abb. 1.4: Schematische Darstellung der Domänen von KdpD aus E. coli (verändert nach Zimmann, 2007). Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz. Der für die Signaltransduktion konservierte Histidinrest 673 ist durch das umkreiste “P” dargestellt. Das positiv geladene Arginincluster ist mit “+” eingezeichnet.

Aufgrund von Strukturmodellierungen wurde, neben den beiden “Walker“-ähnlichen

Motiven, eine weitere, potentielle ATP-bindende Domäne entdeckt. Diese Domäne

kommt in allen Mitgliedern der Familie der Usp-Proteine (“universal stress protein“)

vor, deren Synthese bei vielen wachstumshemmenden Stresssituationen erhöht ist

(Van Bogelen et al., 1990). Meist kommen in den Organismen viele verschiedene

Usp-Domänen vor, wobei diese entweder alleine oder mit mehreren anderen

1. Einleitung

13

Domänen ein Protein bilden (Siegele, 2005). Letzteres ist z. B. bei der Sensorkinase

KdpD von E. coli der Fall. Eine weitere in der „Input“-Domäne vorkommende Region

ist aufgrund der Sequenz möglicherweise eine GAF-Domäne, die zwischen dem

Arginincluster und einem „Coiled-coil“ Linker liegt, welcher die „Input“-Domäne mit

der „Transmitter“-Domäne verbindet. Aravind & Ponting (1997) vermuten, dass an

GAF-Domänen Liganden binden, welche eine Rolle bei der Reizwahrnehmung

spielen. Da die Aminosäuren 549-644 von KdpD Homologien zu den GAF-Domänen

aufweisen und eine Deletionsmutante zeigte, dass dieser Bereich für KdpD essentiell

ist (Hüging, 2006), könnte diese Domäne ebenfalls eine Rolle bei der Reizwahr-

nehmung bzw. bei der Signalkaskade spielen.

Für eine funktionelle Signalkaskade ist die korrekte Faltung der Sensorkinase und

des Antwortregulators von entscheidender Bedeutung. Da es sich bei KdpD um ein in

die Membran verankertes Protein handelt, ist der richtige Einbau in die Lipiddoppel-

schicht ebenfalls wichtig. Facey & Kuhn (2003) zeigten, dass die Insertion von KdpD

in die Zytoplasmamembran unabhängig von der Sec Translokase und YidC erfolgt.

Maier et al. (2008) konnten beobachten, dass eine amphiphile Region der N-

terminalen Domäne von KdpD (AS 22-48) für die Insertion in die Membran notwendig

zu sein scheint. Diese Aminosäuresequenz konnte von Signalerkennungspartikeln

(SRP) erkannt und folglich zur Membran gebracht werden (Maier et al., 2008). Diese

Beobachtung deckt sich mit der Theorie, dass die hydrophobe Aminosäuresequenz

an den Positionen 27-43 von KdpD für die Anlagerung der N-terminalen Domäne an

die Membran verantwortlich sein könnte (Zimmann, 1995). Des Weiteren ist es für die

Funktionalität von KdpD notwenig, dass das Protein im dimerisierten Zustand in der

Zytoplasmamembran vorliegt (Heermann et al., 1998). Dass der homooligomere

Zustand einer Sensorkinase häufig von entscheidender Bedeutung für die

Funktionalität ist, konnte bereits für viele Sensorkinasen gezeigt werden (Ninfa et al.,

1993; Swanson et al., 1993; Hidaka et al., 1997).

Wie viele Histidinkinasen ist auch KdpD bifunktional, da es in vitro nicht nur eine

Kinase- und Transferaktivität aufweist, sondern aufgrund seiner Phosphataseaktivität

auch in der Lage ist, phosphoryliertes KdpE zu dephosphorylieren (Jung et al.,

1997). Es konnte gezeigt werden, dass die Dephosphorylierung von KdpE~P

ausschließlich durch die Phosphataseaktivität der Sensorkinase KdpD erfolgt (Jung

et al., 1997). Brandon et al. (2000) stellten die Hypothese auf, dass die Initiation der

1. Einleitung

14

Signaltransduktion mittels KdpD durch die Inhibierung der phospho-KdpE spezi-

fischen Phosphataseaktivität herbeigeführt wird. Es wird vermutet, dass dieser

Wechsel zwischen Kinase- und Phosphataseaktivität von elektrostatischer Natur ist

(Jung & Altendorf, 1998).

1.3. Reiz und Reizaufnahme von KdpD in E. coli Obwohl die Bedingungen, unter denen die kdpFABC-Expression induziert wird,

bekannt sind, ist die Natur des Reizes immer noch ungeklärt. Während das

kdpFABC-Operon unter K+-limitierenden Bedingungen im Medium sehr effektiv und

kontinuierlich induziert wird, findet nur ein kleiner, transienter Anstieg der Expression

bei hoher Osmolalität statt (Hamann et al., 2008). Dabei ist es für die Induzierbarkeit

des Kdp-Systems von Bedeutung, durch welches Osmolyt die hohe Osmolalität im

Medium verursacht wird. Gowrishankar et al. (1985) konnten beobachten, dass eine

Erhöhung der Osmolalität im Medium und damit eine Verminderung des Turgor-

drucks nur dann eine kdpFABC-Expression auslöst, wenn es sich bei der osmotisch

wirksamen Substanz um ein Salz und nicht um einen Zucker handelt. In Salmonella

enterica konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Expression des kdpFABC-

Operons deutlich geringer durch Sucrose als durch NaCl ausfällt (Balaji et al., 2005).

Hamann et al. (2008) beobachteten, dass sich das Niveau und der Zeitraum der

kdpFABC-Expression unter K+-Limitation und hoher Osmolalität deutlich voneinander

unterscheiden. Unter K+-Limitation kam es zu einem tausendfachen Induktions-

verhältnis, welches schon Sekunden nach einem K+-„downshift“ gemessen wurde

und über den gesamten Zeitraum andauerte. Hingegen konnte durch Zugabe von

NaCl im Medium beobachtet werden, dass nur eine transiente Synthese des

KdpFABC-Systems mit einem hundertfachen Induktionsverhältnis erst Minuten nach

Zugabe des Salzes erfolgte. Wurde allerdings KCl als Salz zum Medium hinzugefügt,

so konnte keine kdpFABC-Expression ermittelt werden. Des Weiteren wurde bei

einem durch Zucker induzierten Stress nur eine transiente Expression mit einem

zehnfachen Induktionsverhältnis Minuten nach der Zugabe bestimmt. Aufgrund

dieser Ergebnisse vermuten Hamann et al. (2008), dass KdpD diese Reize unter-

schiedlich wahrnimmt. Heermann et al. (2009) konnten zeigen, dass das Stress-

protein UspC die Signalkaskade von KdpD / KdpE durch Interaktion mit der Usp-

Domäne von KdpD unter Salzstress stimuliert. Des Weiteren wurde von Jung &

1. Einleitung

15

Altendorf (2003) postuliert, dass KdpD wahrscheinlich eine Mischung verschiedener

Parameter wahrnimmt: Änderungen des Turgors, der Phospholipidzusammen-

setzung der Membran, der extra- und / oder intrazellulären K+-Konzentration, der

Osmolalität des Mediums, der Ionenstärke des Zytoplasmas und der internen ATP-

Konzentration. Allerdings zeigen die Ergebnisse von Hamann et al. (2008) deutlich,

dass weder die Änderung des Turgors noch die Änderung der Konzentration einiger

zytoplasmatisch gelöster Substanzen wie K+, ATP, Putrescine, Spermidine, Treha-

lose, Glutamat und Prolin der Stimulus für KdpD sein kann. Die Möglichkeit, dass der

K+-Gradient über der Zytoplasmamembran eine Rolle bei der Reizwahrnehmung

spielt, kann ebenfalls ausgeschlossen werden, da die kdpFABC-Expression von der

Anwesenheit anderer K+-Transportsysteme abhängig ist. Ein Wildtypstamm, welcher

die konstitutiven und niedrig affinen K+-Aufnahmesysteme Trk und Kup besitzt,

nimmt z. B. bei K+-Konzentrationen von 20 mM im Medium Kalium-Ionen über die

Trk- und Kup-Systeme auf, während der KdpFABC-Komplex nicht synthetisiert wird.

Hingegen synthetisiert unter denselben K+-Konzentrationen bereits ein Stamm, der in

den Genen dieser niedrig affinen K+-Aufnahmesystemen deletiert ist, den KdpFABC-

Komplex, um K+-Ionen aufnehmen zu können. Folglich kommt es im ersten Falle zu

keiner und im letzteren zu einer Induktion der kdpFABC-Expression, obwohl derselbe

K+-Gradient über der Zytoplasmamembran vorliegt (Abb. 1.5).

Abb. 1.5: kdpFABC-Expression in Abhängigkeit der niedrig affinen K +-Aufnahme-systeme in E. coli (verändert nach Hamann, 2008). In A ist ein Wildtypstamm dargestellt, der keine Mutation in den Genen der niedrig affinen K+-Aufnahmesystemen Trk und Kup aufweist, in B ein Stamm, der die Gene, welche für diese K+-Transportsysteme kodieren, deletiert hat. Obwohl der K+-Gradient über der Zytoplasmamembran in beiden Stämmen identisch ist, kommt es nur in einem der Stämme zur kdpFABC-Expression.

Bereits früher wurde die Hypothese aufgestellt, dass das positiv geladene Arginin-

cluster hinter der vierten Transmembranhelix mit den anionischen Phospholipiden

durch elektrostatische Wechselwirkung interagiert (Jung & Altendorf, 1998).

A) B)

1. Einleitung

16

Zimmann et al. (2007) konnten zeigen, dass einzelne Aminosäureaustausche nur in

diesem Arginincluster und der vierten Transmembrandomäne von KdpD zu einem

(semi-)konstitutiven Phänotyp in Bezug auf die kdpFABC-Expression unter K+-Limi-

tation führen, was vermutlich durch eine verringerte Phosphataseaktivität verursacht

wird. Deshalb ist es vorstellbar, dass solche Derivate von KdpD einen „locked-on“

Zustand annehmen (Zimmann et al., 2007). Des Weiteren konnte ein stimulierender

Einfluss von negativ geladenen Phospholipiden auf die Kinaseaktivität von KdpD in

vitro demonstriert werden (Stallkamp et al., 1999).

Darüber hinaus könnte der Aktivierung der Kinaseaktivität von KdpD eine Interaktion

mit einem anderen Protein zugrunde liegen. Für Mycobacterium tuberculosis konnte

von Steyn et al. (2003) gezeigt werden, dass die Lipoproteine LprF und LprJ mit dem

N-terminalen zytoplasmatischen Teil der Sensorkinase KdpD wechselwirken und so

die kdpFABC-Expression modulieren können.

Es gibt verschiedenen Hypothesen, welcher Bereich der Sensorkinase KdpD von

E. coli den Reiz wahrnimmt. Während von Heermann et al. (2003) der N-terminale

Bereich vorgeschlagen wird, wird von Rothenbücher et al. (2006) angenommen,

dass die zytoplasmatische C-terminale Domäne von KdpD als K+-Sensor fungiert.

Diesen Theorien liegen Ergebnisse verschiedener Konstrukte, die Teile der Sensor-

kinase deletiert haben, zugrunde. Heermann et al. (2003) zeigten mit einem

Konstrukt, dass nur die ersten 395 Aminosäuren (KdpD/1-395) von KdpD aus-

reichen, um die Bindung von KdpE an die DNA zu stabilisieren und somit die

Expression des kdpFABC-Operons zu induzieren, wobei die Phosphorylierung von

KdpE vermutlich durch niedermolekulare Phosphodonoren stattfindet. Die N-

terminale Domäne weist einen semi-konstitutiven Phänotyp in Bezug auf die

kdpFABC-Expression auf, obwohl die N-terminale Domäne aufgrund der fehlenden

Phosphorylierungsstelle im C-Terminus nicht in der Lage ist, das Kdp-System über

die normale Signalkaskade anzuschalten. In vitro konnte KdpD/1-395 weder

phosphoryliert noch der Phosphotransfer auf den Antwortregulator KdpE gezeigt

werden. Auch die Dephosphorylierung von KdpE~P durch KdpD/1-395 konnte in vitro

nicht gezeigt werden (Heermann et al., 2003a). Die N-terminale Domäne ist trotz der

fehlenden Transmembrandomänen an die Zytoplasmamembran assoziiert (Heer-

mann, 2001). Ein möglicher Grund für diese Anlagerung an die Membran könnte die

hydrophobe Aminosäuresequenz an den Positionen 27-43 von KdpD sein. Im

1. Einleitung

17

Gegensatz dazu wurde von Rothenbücher et al. (2006) beobachtet, dass ein aus den

Aminosäureresten 499-894 (C-terminale Domäne) bestehendes KdpD-Derivat eben-

falls wie das Konstrukt von Heermann et al. (2003) einen semi-konstitutiven Phäno-

typ aufweist und somit unter normalerweise nicht-kdpFABC-induzierenden

Bedingungen die Expression von kdpFABC induziert. Da jedoch die kdpFABC-

Expression im Fall der aus der C-TD bestehendes Derivat sehr niedrig ist, ist die

Aussage dieser Untersuchung der zytoplasmatischen C-TD von KdpD eine Funktion

als K+-Sensor zuzuschreiben (Rothenbücher et al., 2006) mehr als zweifelhaft. Diese

kritische Bewertung steht im Einklang mit der Beobachtung, dass die intrazelluläre

K+-Konzentration als Stimuli unwahrscheinlich ist (Malli & Epstein, 1998; Hamann et

al., 2008).

1.4. Die Zytoplasmamembran und ihre Phospholipide

Da gezeigt werden konnte, dass solubilisiertes KdpD in vitro keine Kinaseaktivität

aufweist (Zimmann, 1995), scheint die Zytoplasmamembran der Zelle eine wichtige

Rolle für die Funktionalität der Sensorkinase KdpD zu spielen. Die Zellhülle von

E. coli besteht aus drei verschiedenen Typen von Phospholipiden, welche über den

typischen „Kennedy Syntheseweg“ hergestellt werden (zum Überblick siehe Dowhan

et al., 2004). Das häufigste Phospholipid ist das zwitterionische Phosphatidylethanol-

amin (PE), die zwei anderen sind die anionischen Phospholipide Phosphatidyl-

glycerol (PG) und Cardiolipin (CL oder Diphosphatidylglycerol). Die hydrophilen Kopf-

gruppen der Phospholipide bilden die Oberfläche einer Lipiddoppelschicht, während

sich die hydrophoben Fettsäureketten im Inneren dieser Schicht befinden. Folglich

bestimmen die Kopfgruppen viele der strukturellen und chemischen Eigenschaften

der Oberfläche und die Fettsäuren die physikalischen Eigenschaften der Membran.

Das zwitterionische PE und das einfach negativ geladene PG besitzen zwei Fett-

säureketten, während das zweifach negativ geladene CL unter anderem aus vier

Fettsäureketten besteht, welche den hydrophoben Teil des Lipids bilden. Der Aufbau

der Phospholipide von E. coli ist in Abbildung 1.6 dargestellt. Die Phospholipide

haben verschiedene Fettsäureketten, welche innerhalb jedes Phospholipidtyps auch

unterschiedlich häufig vorkommen. Die häufigsten Fettsäuren von E. coli sind 16:0

und 16:1 cis 9 (Cronan, 1968). Die Zusammensetzung der Fettsäuren in der

Membran wird unter anderem durch die Temperatur beeinflusst. Die Erniedrigung der

1. Einleitung

18

Wachstumstemperatur führt in vielen Organismen zum Anstieg des Anteils der

ungesättigten Fettsäuren der Phospholipide (de Mendoza & Cronan, 1983). Dadurch

können Funktionen wie z.B. die Fluidität der Membran bei niedrigeren Temperaturen

aufrecht erhalten werden.

Abb. 1.6: Aufbau der Phospholipide. In A ist die Struktur der Phospholipide schematisch dargestellt (Quelle: www. bioteach.ubc.ca). In B sind die Strukturen der drei Hauptphospho-lipide PE, PG und CL von E. coli gezeigt (verändert nach Bogdanov et al., 2008). Das Rückgrad der Kopfgruppe ist fett hervorgehoben. Außerdem sind die mit „R“ gekenn-zeichneten Fettsäureketten in ihrer Länge und mit bzw. ohne Doppelbindungen variabel.

Die Phospholipidzusammensetzung von E. coli beträgt im Vollmedium circa

75 % PE, 20 % PG und 5 % CL (Cronan, 1968; Randle et al., 1969). Damit sind etwa

25 % der Lipide (PG und CL) negativ geladen. Außerdem konnten die oben ge-

nannten Arbeitsgruppen zeigen, dass in der stationären Wachstumsphase die Menge

von CL auf Kosten von PG um das 2-3 fache ansteigt, wodurch der Gehalt der

anionischen Phospholipide konstant bleibt (Cronan, 1968; Randle et al., 1969). Die

Phospholipide bilden in Gram-negativen Bakterien die Lipiddoppelschicht der

Zytoplasmamembran und die innere Schicht der äußeren Membran.

Die Biosynthese der drei Phospholipide von E. coli findet in 2-3 Schritten aus dem-

selben Vorstufenmolekül CDP-Diacylglycerol statt (Abb. 1.7). Das zwitterionische PE

wird durch die Herstellung von Phosphatidylserin (PS), welches als kurzzeitiges

Zwischenprodukt fungiert, synthetisiert. Die PS-Synthese erfolgt durch das Gen-

produkt des pssA-Gens und die PE-Synthese durch das des psd-Gens. Das

A) B)

1. Einleitung

19

anionische PG wird ebenfalls wie PE in zwei Schritten synthetisiert, während

Phosphatidylglycerol-3-Phosphat als Zwischenprodukt von PG fungiert. Das Gen-

produkt des pgsA-Gens katalysiert dabei den ersten Schritt, während das Enyzm mit

dem dazugehörigen Gen für die Synthese von PG bis jetzt noch unbekannt ist. Alle

Schritte dieses Syntheseweges in E. coli sind homolog zu dem Biosyntheseweg in

eukaryotischen Zellen mit Ausnahme der CL-Synthese. In E. coli wird CL produziert,

wenn das Enzym CL-Synthase (kodiert durch das cls-Gen) die Kondensation von

zwei PG Molekülen katalysiert und dabei Glycerol freisetzt.

Abb. 1.7: Biosyntheseweg der Phospholipide von E. coli (verändert nach Cronan, 2003). Dabei sind die Phospholipide rot, die Gene, deren Produkte den jeweiligen Schritt katalysieren, blau und benötigte zusätzliche bzw. freigesetzte Produkte grün dargestellt.

Des Weiteren sind die Auswirkungen von Mutationen in diesem Syntheseweg

drastisch und die Phänotypen der Stämme charakteristisch. Wenn eine Deletion des

psgA-Gens vorliegt, so dass kein PG mehr synthetisiert werden kann, kann ebenfalls

kein CL gebildet werden, was zu einer Phospholipidzusammensetzung ohne jegliche

anionische Lipide führt. Damit dieser Stamm ohne PG und CL überhaupt lebensfähig

ist, ist eine weitere Deletion des lpp-Gens essentiell, welches für das häufigste

Lipoprotein in E. coli kodiert (Shiba et al., 2004). Lpp ist in der aktiven Form mit der

Peptidoglycanschicht verbunden und fungiert so als Stabilisator und sorgt für die

Integrität der Zellhülle (Cascales et al., 2002). Um Lpp zu synthetisieren, benötigt die

Vorstufe (proLpp) den Diacylglyceryl-Rest von PG. In einem ∆pgsA lpp+ Stamm ist

1. Einleitung

20

dieser Syntheseschritt aufgrund der Abwesenheit von PG nicht möglich, so dass

proLpp größtenteils in der Zytoplasmamembran verbleibt und über den C-terminalen

Lysinrest das Peptidoglycan bindet, welches dadurch die innere mit der äußeren

Membran auf eine ungewöhnliche Weise verbindet, was letztendlich zur Zelllyse führt

(Shiba et al., 2004).

1.5. Einfluss der Membranzusammensetzung auf Membra nproteine durch die Interaktionen mit Phospholipiden

Stämme mit Mutationen in den Genen, welche für Enzyme kodieren, die in die

Biosynthese der Phospholipide involviert sind, resultieren in einer modifizierten

Phospholipidzusammensetzung. Dabei ist zu erwähnen, dass Änderungen in dieser

Zusammensetzung signifikante Effekte auf den gesamten Metabolismus der Zelle

haben. Die Bedeutung der Phospholipide konnte dadurch gezeigt werden, dass das

Fehlen des Hauptlipids PE zu Defekten essentieller Prozesse wie z.B. der Zellteilung

oder zu Konformationsänderungen von Membranproteinen führt (zum Überblick

siehe Dowhan et al., 2004). So konnte eine spezifische Rolle der Phospholipide für

die Topologie und die damit verbundene Aktivität für mehrere Membranproteine

gezeigt werden. Für die Lactose Permease LacY von E. coli konnte eine PE-ab-

hängige Topologie beobachtet werden (Xie et al., 2006). Die Abwesenheit von PE in

der Zytoplasmamembran führte neben einer Konformationsänderung des Proteins in

der Membran auch zum Verlust seiner Transportaktivität von Lactose und H+-Ionen

(Bogdanov et al., 1996). Die Topologie und die Transportaktivität der Permeasen

PheP und GabP werden ebenfalls von PE beeinflusst (Dowhan et al., 2004). Auch für

andere Bakterien konnten solche Interaktionen gezeigt werden. In Lactococcus lactis

interagiert der „multidrug-transporter“ LmrP mit den Kopfgruppen von PE

(Hakizimana et al., 2008). Bogdanov et al. (2008) stellten daher unter Einbezug der

„positive-inside rule“ (Von Heijne, 1986) die Theorie auf, dass PE die negative

Ladung von Aminosäureresten neutralisiert und dadurch die zytoplasmatische

Orientierung dieser Bereiche favorisiert wird, während in Abwesenheit von PE diese

Bereiche aufgrund ihrer stärker negativ wirkenden Ladungen und der „Proton motive

force“ (Pmf) in das Periplasma gelangen.

Für das Phospholipid CL konnte ebenfalls ein Zusammenhang mit verschiedenen

Membranproteinen beobachtet werden. Für die Glycosyltransferase MurG aus E. coli

1. Einleitung

21

konnte mittels einer Co-Reinigung gezeigt werden, dass eine erhöhte Bindeaffinität

zu CL besteht (Van den Brink-van der Laan et al., 2003). Des Weiteren konnte

beobachtet werden, dass CL die polare Lokalisation des Osmosensors ProP in

E. coli kontrolliert (Romantsov et al., 2008). Es konnte gezeigt werden, dass die

Zytoplasmamembran von E. coli und anderen Bakterien heterogen zusammen-

gesetzt ist (zum Überblick siehe Matsumoto et al., 2006). Domänen von CL konnten

mit einem spezifischen Farbstoff am Septum und an den Zellpolen lokalisiert werden

(Mileykovskaya & Dowhan, 2000). Es wird sogar vermutet, dass einige Membran-

proteine diese CL-Domänen stabilisieren (Matsumoto et al., 2006). Möglicherweise

könnte auch KdpD eine solche stabilisierende Funktion auf die CL-Domänen haben.

Ebenfalls konnte für das anionische PG ein Einfluss auf weitere Membranproteine

festgestellt werden. Für den Betaintransporter BetP aus Corynebacterium

glutamicum konnte beobachtet werden, dass neben der Osmolalität und der

Temperatur auch die Zusammensetzung der Phospholipide die Aktivität moduliert

(Özcan et al., 2007). Derivate von BetP wurden in ihrer inaktiven Konformation durch

das anionische PG stabilisiert (Schiller et al., 2006). Folglich sind Wechselwirkungen

zwischen den Kopfgruppen der Phospholipide und den Membranproteinen wahr-

scheinlich von der Ladung der jeweiligen Kopfgruppe abhängig.

1.6. Aufgabenstellung Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Bestimmung der physiologischen

Zusammensetzung der Phospholipide von E. coli unter K+-Limitation. K+-limitierende

Wachstumsbedingungen sind am effektivsten, um eine permanente kdpFABC-

Expression zu erzeugen und stellen den Hauptreiz für die Sensorkinase KdpD dar

(Hamann et al., 2008). Wenn eine Änderung der Kopfgruppen in der exponentiellen

Wachstumsphase unter K+-Limitation beobachtet werden könnte, dann würden die

Reize, die das kdpFABC-Operon induzieren, auch einen Einfluss auf die Lipid-

zusammensetzung der Membran haben. Es konnte bereits gezeigt werden, dass bei

hoher Osmolalität im Medium der Gehalt von CL auf Kosten von PE bereits in der

exponentiellen Wachstumsphase ansteigt (Tsatskis et al., 2005). Folglich könnte

auch unter K+-Limitation im Medium der CL-Gehalt variieren. Ein Zusammenhang

zwischen der Lipidkomposition der Membran und der Aktivität der Sensorkinase

KdpD wäre demzufolge vorstellbar. Stallkamp et al. (1999) konnten bereits zeigen,

1. Einleitung

22

dass anionische Phospholipide einen stimulierenden Einfluss auf die Kinaseaktivität

der Sensorkinase KdpD haben.

Für diesen Ansatz sollte die Phospholipidzusammensetzung verschiedener E. coli

Stämme, die Neusynthese von CL und die Expression des dazugehörigen Gens

unter K+-Limitation bzw. direkt nach einem K+-„downshift“ sowie die Aktivität von

KdpD in verschiedenen Membranumgebungen untersucht werden, um ihre

Bedeutung für die kdpFABC-Expression zu ermitteln.

2. Material und Methoden

23


2.1. Materialien Für diese Arbeit wurden folgende Materialien verwendet:

Restriktionsenzyme New England Biolabs (Frankfurt)

T4 DNA-Ligase New England Biolabs (Frankfurt)

Taq DNA-Polymerase New England Biolabs (Frankfurt)

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs (Frankfurt)

“GeneRuler DNA Ladder Mix“ MBI Fermentas (St. Leon-Rot)

GelStar Lonza (Basel)

PeqGold Universal Agarose PeqLab (Erlangen)

“DNeasy-Tissue-Kit” Qiagen (Hilden)

“QIAprep-Spin-Miniprep Kit” Qiagen (Hilden)

“QIAquick-Gel-Extraction Kit” Qiagen (Hilden)

“RNeasy Mini Kit” Qiagen (Hilden)

DNAse I (RNase free) New England Biolabs (Frankfurt)

“RevertAid First Strand cDNA Synthesis

Kit” Fermentas (St. Leon-Rot)

IQ Sybr Green Supermix BioRad (München)

“PageRuler Prestained Protein Ladder“ MBI Fermentas (St. Leon-Rot)

Antiserum α-KdpD Zimmann et al. (1995)

Ziege-anti-(Kaninchen-IgG)-Antikörper-AP Rockland (Gilbertsville, Pennsylvania)

Protran Nitrocellulose-Membran Schleicher & Schüll (Dassel)

Filterpapier Schleicher & Schüll (Dassel)

Magermilchpulver Roth (Karlsruhe)

5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) Biomol (Hamburg)

O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid

(o-NPG) Sigma-Aldrich (Taufkirchen)


24

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-

galactopyranosid (X-Gal) Biomol (Hamburg)

32P-Phosphat Hartmann Analytic (Braunschweig)

[γ-32P] ATP Hartmann Analytic (Braunschweig)

Isopropyl-1-thio-β-D-Galactosid (IPTG) PeqLab (Erlangen)

„E. coli total lipid extract“ Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA)

1,1´,2,2´-Tetraoleoyl Cardiolipin

(synthetisches CL) Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA)

1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidyl-

ethanolamin (synthetisches PE) Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA)

1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidyl-

cholin (synthetisches PC) Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA)

L-α-Phosphatidylcholin (Egg PC) Sigma-Aldrich (Taufkirchen)

DC-Platten Sil G-25 (20 x 20 cm) Macherey-Nagel (Düren)

Molybdänblau Reagenz Sigma-Aldrich (Taufkirchen)

Ni2+-NTA Qiagen (Hilden)

n-Dodecyl-β-Maltosid (DDM) Glycon (Luckenwalde)

Bio-Beads AM-2 BioRad (München)

Alle hier nicht aufgeführten Materialien wurden von den Firmen Amersham

Biosciences (Freiburg), AppliChem (Darmstadt), Bayer (Leverkusen), Biomol

(Hamburg), BioRad (München), Biozym Diagnostics (Hess. Oldendorf), Fluka (Neu-

Ulm), Gibco/BRL (Eggenstein), Invitrogen (Karlsruhe), E. Merck (Darmstadt),

Riedel-de Häen (Seelze), Roche Diagnostics (Mannheim), Roth (Karlsruhe), Serva

(Heidelberg) und Sigma-Aldrich (Taufkirchen) im Reinheitsgrad “pro analysis“

bezogen.

2.2. Stämme, Plasmide und Oligonukleotide

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten E. coli Stämme sind in der Tabelle 2.1

aufgelistet. Die verwendeten Plasmide sind in Tabelle 2.2 und die verwendeten

Oligonukleotide in Tabelle 2.3 aufgeführt.


25

Tab. 2.1: Verwendete E. coli Stämme

Stamm Genotyp Referenz

K12 WT Tatum (1945)

JM109 recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44 relA1 ∆(lac-

proAB) / F´ [traD36 proAB* lacI

q lacZ∆M15]

Yanish-Perron et al. (1985)

TKR2000 ∆kdpFABCDE thi rha lacZ nagA trkA405 trkD1 atp706 Kollmann & Altendorf (1993)

HAK006 ∆kdpFABC::neo ∆kdpD161-726 kdpFABC::lacZ ∆(lac-pro) ara thi

Nakashima et al. (1993)

TK2240 kdp+ trkA405 trkD1 nagA thi rha lacZ Polarek et al. (1988)

TKV2208 ∆kdpD128-894 trkA405 trkD1 nagA thi rha lacZ Voelkner (1991)

TKV2209 ∆kdpD128-894 ∆kdpE trkA405 trkD1 nagA thi rha lacZ Voelkner (1991)

TK2281 ∆kdpFABCDE81 trkA405 trkD1 nagA thi rha lacZ Polarek et al. (1988)

RH002 kdp+ kdpFABC::lacZ ∆(lac-pro) ara nagA thi Heermann (2001)

RH003 ∆kdp81 nag+ kdpFABC::lacZ ∆(lac-pro) ara thi Heermann (2001)

FRAG-1 gal lacZ rha thi Epstein & Davis (1970)

AD93 pss93::kan recA srl::Tn10 nadB+ DeChavigny et al. (1991)

N3024 (lambda)- uvrC279 ::Tn10 IN (rrnD-rrE)1 Heacock & Dowhan (1987)

HDL1001 pgsA30::kan Φ(lacOP-pgsA+)1 lacZ´ lacY::Tn9 recA srl::Tn10

Heacock & Dowhan (1989)

W3899 F+ nadB7 supE DeChavigny et al. (1991)

WC3899 F- nadB7 supE rfbD1 cls::Tc Dowhan, pers. Gabe

SOH92 ara ∆(lac-proAB) thi Φ(cls-lacZ+) bla kan T14 lacY+ lacA+ imm21

Heber & Tropp (1991)

UE54 lpp-2 ∆ara714 rcsF::mini-Tn10 cam ∆pgsA::FRT-kan-FRT

Shiba et al. (2004)

DG10 F- ompT hsdSB(r-B m

-B) dcm gal (DE3) cls::Tn10dTet3

ybhO::kan Guo & Tropp (2000)

JW0452-3 ∆(araD-araB)567 ∆lacZ4787(::rrnB-3) ∆acrA748::kan

LAM- rph-1 ∆(rhaD-rhaB)568 hsdR514

CGSC

C43 (DE3) F- ompT gal hsdSB (r-B m-

B) dcm lon DE3 pLys-S Miroux & Walker (1996)

KM12 K12 mit P1 Φ(cls-lacZ+) diese Arbeit

TKM2240 TK2240 mit P1 Φ(cls-lacZ+) diese Arbeit

WCM3899 WC3899 mit P1 Φ(cls-lacZ+) diese Arbeit


26

Tab. 2.2: Verwendete Plasmide

Plasmid Resistenz Genotyp Referenz

pKK223-3 Apr IPTG-induzierbarer Expressionsvektor mit tac Promotor

Amersham Pharmacia Biotechnology

pBAD18 Apr Arabinose-induzierbarer Expressions-vektor

Guzman et al. (1995)

pMT101 Cmr Expressionsvektor mit temperatur-sensitivem Replikon

P. Schimmel

pMW172 Apr Expressionsvektor mit T7 Promotor und veränderter Polylinkerregion

Way et al. (1990)

pBD Apr kdpD in pBAD18 Jung et al. (1998)

pBD/1-395 Apr kdpD1-395 in pBAD18 Heermann (2001)

pBD/∆TM1-4 Apr kdpD ∆G401-V498 in pBAD18 Fohrmann (2001)

pBD5-9 Apr kdpD in pBAD18 mit einzelner EcoRV-Restriktionsschnittstelle (562) und zusätzlichen Schnittstellen XhoI (395), SacI (843), SpeI (1291), NotI (1395), AatII (1603), KpnI (1587), MluI (1715), BsuI (1767) und HindIII (2869)

Zimmann et al. (2007)

pBD5-9/E509K Apr kdpDE509K in pBD5-9 Zimmann et al. (2007)

pBD/∆Arg1 Apr kdpD ∆V498-D530 in pBD5-9 Eisenbarth (2006)

pKJ2-6His Apr kdpD-6His in pKK223-3 mit zusätzlicher Restriktionsschnittstelle HindIII (2869)

Jung et al. (1997)

pDD72 Cmr pssA in pMT101 DeChavigny et al. (1991)

pEcb1 Apr atpF in pMW172 Arechaga et al. (2000)

Tab. 2.3: Verwendete Oligonukleotide

Oligonukleotide Sequenz Verwendungszweck KdpDstart sense 5´ - ATGAATAACGAACCCTTACGT - 3´ PCR von kdpD1-894

KdpDstop antisense 5´ - TCACATATCCTCATGAAATTC - 3´ PCR von kdpD1-894

KdpDIforw 5´ - GTCAACATTGTTGAACTCAA - 3´ Sequenzierung von kdpD

KdpDIIforw 5´ - ACATTTTTTCCGCAAAGGTA - 3´ Sequenzierung von kdpD

KdpDIIIforw 5´ - TTTATGGACGCTGGCCTTCA - 3´ Sequenzierung von kdpD

KdpDIVforw 5´ - GCAAGCGAACGTGAACAGAT - 3´ Sequenzierung von kdpD

KdpCD forw 5´ - CGCAAGCGGCGGCCTGGC - 3´ PCR von kdpDE

KdpE anti 5´ - CCGGTGAATCACGCGGGCGGC - 3´ PCR von kdpDE

KdpErev1 5´ - TCAAAGCATAAACCGATAGCC - 3´ PCR von kdpDE

KdpAfor2 5´ - GCCGCCAGCGGGATTGCGG - 3´ Q-RT-PCR für kdpFABC


27

KdpArev2 5´ - CTTCAACGGTATTCACAGCCTG - 3´ Q-RT-PCR für kdpFABC

GapAfor1 5´ - CTCCACTCACGGCCGTTTCG - 3´ Q-RT-PCR für gap

GapArev1 5´ - CTTCGCACCAGCGGTGATGTG -3´ Q-RT-PCR für gap

Clsfor2 5´ - ATGACAACCGTTTATACGTTG - 3´ PCR von cls1-486

Clsrev2 5´ - TTACAGCAACGGACTGAAGAA - 3´ PCR von cls1-486

Clsfor-35 5´ - TTTGCCAGATGAATCCATAT - 3´ Seq. der cls-lacZ Fusion

Clsfor+870 5´ - CAATATTATGCCGTTTGAAC - 3´ Seq. der cls-lacZ Fusion

LacZrev 5´ - CCGCTTCTGGTGCCGGAAACC - 3´ PCR der cls-lacZ Fusion

Cls-out at start 5´ - TCACCAACGTATAAACGGTTGTCAT - 3´ RT-PCR für cls-kch

Kch-out at end 5´ - CAGTAAAGAATCGGCGCAAAAATAG - 3´ RT-PCR für cls-kch

2.3. Medien und Anzuchtverfahren

Die Anzucht der in Tabelle 2.1 aufgeführten E. coli Stämme erfolgte in KML-Medium

(1 % KCl; 1 % Trypton; 0.5 % Hefeextrakt) nach Epstein & Kim (1971). Als Minimal-

medien wurden phosphat-gepufferte Medien, ebenfalls nach Epstein & Kim (1971),

eingesetzt, die 0.4 % Glucose als C-Quelle enthielten. Der E. coli Stamm AD93

wurde anstelle des phosphat-gepufferten Minimalmediums in GM56-Medium (Nes-

meyanova et al., 1991) kultiviert, welches durch verschiedene K+-Konzentrationen

modifiziert wurde. Die Bezeichnung der Minimalmedien erfolgte gemäß ihrer K+-Kon-

zentration in mM.

Bei Stämmen, die eine Deletion im pro- oder thi-Gen besaßen, wurde den Minimal-

medien zusätzlich 10 mg/l Prolin oder 1 mg/l Thiamin zugesetzt. Komponenten wie

Casaminosäuren (0.2 %), Bactopepton (0.145 %), Nicotinsäure (2 µg/ml) und Trypto-

phan (1 mM) wurden in den entsprechenden Konzentrationen bei Bedarf ebenfalls zu

den Minimalmedien zugesetzt. Andere Komponenten wie zum Beispiel IPTG

(0.7 mM oder 1 mM) oder MgCl2 (50 mM) wurden bei Bedarf zu allen Medien

hinzugefügt.

Zur Anzucht für die β-Galaktosidase-Aktivität wurden Minimalmedien mit ent-

sprechend angegebenen Konzentrationen von K+ verwendet. Nährböden wurden

durch Zugabe von 1.5 % Agar hergestellt. Für die Herstellung von Agarplatten mit

Minimalmedien wurde zuvor 3.8 % Agar mit 6 % NaCl versetzt und dreimal mit

H2OBidest gewaschen, um K+-Ionen aus dem Agar zu entfernen.


28

Antibiotika wurden in Konzentrationen von 100 µg/ml (Ampicillin, Carbenicillin,

Novobiocin, Erythromycin), 50 µg/ml (Kanamycin), 34 µg/ml (Chloramphenicol) bzw.

12.5 µg/ml (Tetrazyklin) zugesetzt. Die Anzucht der Zellen erfolgte aerob bei 37°C.

Die Optische Dichte wurde bei einer Wellenlänge von 600 nm in einem Shimadzu

UV-1202 Spektralphotometer (Shimadzu, Duisburg) bestimmt.

2.3.1. Mediumshift

Um die Einflüsse von schnellen Veränderungen der Wachstumsbedingungen (ins-

besondere kdpFABC-induzierende Bedingungen) zu ermitteln, wurden wachsende

Zellen nach dem Protokoll von Hamann et al. (2008) filtriert und in neuem Medium

resuspendiert. Dafür wurden zunächst Zellen über Nacht im 5 ml des ent-

sprechenden Mediums inkubiert und am nächsten Tag in 50 ml frisches Medium

überführt. Wenn die Zellen die exponentielle Wachstumsphase (OD600 von ~0.5)

erreicht hatten, wurden sie durch eine 0.45 µm Nitrocellulose-Membran vakuum-

filtriert. Die filtrierten Zellen wurden einmal mit Minimalmedium mit nominal keinen

K+-Ionen gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mitsamt dem Filter in neues,

vorgewärmtes Medium mit der gewünschten K+-Konzentration und mit dem gleichen

Volumen überführt. Die Zellen wurden erneut im Wasserbad bei 37°C und 200 rpm

inkubiert, so dass sie weiterwachsen konnten. Diese Prozedur dauert zwischen 30

und 60 Sekunden. Der Moment, in dem der Filter mitsamt den Zellen in den neuen

Schüttelkolben überführt wurde, wurde als Zeitpunkt Null des Wachstums in dem

neuen Medium definiert. Abhängig von den gemessenen Parametern wurde die erste

Probe zwischen 30 und 60 Sekunden nach dem Zeitpunkt Null genommen. Als

Kontrolle wurden die Zellen in vorgewärmtes Medium mit derselben K+-Konzentration

wie zuvor überführt, um einen möglichen Einfluss der Filterprozedur auf die

gemessenen Parameter zu beobachten.

2.3.2. Bestimmung der Lebendzellzahl

Um das Resistenzverhalten verschiedener E. coli Stämme gegenüber dem

Antibiotikum Novobiocin zu untersuchen, wurden die Stämme über Nacht in den zu

testenden Flüssigmedien angezogen und am nächsten Tag mit frischem Medium so


29

verdünnt, dass die Bakterienkonzentration bei 1000 Keime / ml lag. Anschließend

wurde die Verdünnung der jeweiligen Übernachtkultur auf Selektionsplatten mit

verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums ausplattiert, so dass auf jeder

Agarplatte die gleiche Gesamtzellzahl von 100 Keimen ausplattiert wurde. Die

Selektionsplatten wurden dann für 1 - 2 Tage bei 37°C inkubiert und die Kolonien

ausgezählt. Für die Auswertung wurde jeweils die Anzahl der Kolonien auf Platten

ohne Antibiotikum als 100 % definiert, um den prozentualen Anteil lebender Zellen in

Abhängigkeit des Antibiotikums zu bestimmen.

2.4. Molekularbiologische und genetische Methoden

2.4.1. Plasmidisolierung

Die DNA von Plasmiden wurde aus 5 ml Übernachtkultur mittels des „QIAprep Spin

Miniprep Kits“ der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert.

2.4.2. Isolierung genomischer DNA

Genomische DNA wurde aus 1 ml Übernachtkultur mittels des “DNeasy Tissue-Kits“

der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert. Es wurde dabei

nach dem empfohlenen Protokoll für Gram-negative Bakterien gearbeitet.

2.4.3. DNA-Modifikation

Die Standard-DNA-Techniken wurden, falls nicht anders beschrieben, nach Maniatis

et al. (1989) und Ausubel et al. (1987) durchgeführt. Die in vitro-Veränderungen von

DNA-Molekülen wie Restriktionen und Ligationen wurden unter den vom jeweiligen

Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Linearisierte Vektoren wurden

zur Verhinderung einer Religation mit Alkalischer Phosphatase behandelt. Bei neu

konstruierten Plasmiden wurde die Korrektheit durch Kontrollrestriktionen mit ent-

sprechenden Restriktionsendonukleasen und DNA-Sequenzanalyse verifiziert.


30

2.4.4. Elektrophoretische Auftrennung von DNA

Die analytische und präparative Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte mittels

Agarose-Gelelektrophorese. Dafür wurden Gele mit 0.7 - 1.5 % (w/v) Agarose in

TAE-Puffer (40 mM Tris; 40 mM Essigsäure; 1 mM EDTA) verwendet, die mit GelStar

(5 µl der 10.000-fachen Stocklösung in 50 ml TAE Puffer) versetzt waren. Ein

anderes Färbeverfahren war das Nachfärben der Agarosegele mit GelStar (5 µl in

50 ml TAE Puffer) für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Vor dem Lauf

wurde zu den Proben 10 x DNA-Probenpuffer (50 % Glycerin; 0.1 M EDTA; 1 %

SDS; 0.1 % Bromphenolblau) gegeben. Zur Bestimmung der DNA-Fragment-Größen

diente der „GeneRuler DNA Ladder Mix“ der Firma MBI Fermentas (St. Leon-Rot).

Der Gellauf wurde in einer “Mini Sub DNA Cell“-Agarosegel-Laufkammer (BioRad,

München) bei konstant 100 V für 30 - 60 min durchgeführt. Die Detektion der

aufgetrennten DNA erfolgte auf einem UV-Transilluminator bei 304 nm und die Doku-

mentation der Gele mit einer Gel-Dokumentationsanlage von Herolab (Wiesloch).

2.4.5. Extraktion von DNA aus Agarosegelen

DNA-Fragmente wurden mittels des “QIAquick Gel Extraction Kits“ von Qiagen

(Hilden) nach Angaben des Herstellers aus Agarosegelen extrahiert.

2.4.6. Herstellung kompetenter Zellen

Die Transformation von E. coli Zellen mit Plasmid-DNA erfolgte nach einer modifi-

zierten RbCl-Methode (Promega Technical Manual, 1994). Zur Präparation von

kompetenten Zellen wurde eine Übernachtkultur 1 : 100 in frisches Medium überimpft

und aerob bei 37°C bis zu einer Optischen Dichte vo n 0.3 - 0.5 angezogen.

Anschließend wurden die Zellen bei 5.000 rpm für 10 min zentrifugiert und in dem

halben Volumen kalter Lösung A (10 mM MOPS, pH 7.0; 10 mM RbCl) resus-

pendiert. Nach erneuter zehnminütiger Zentrifugation bei 5.000 rpm wurden die

Zellen im gleichen Volumen kalter Lösung B (100 mM MOPS, pH 6.5; 50 mM CaCl2;

10 mM RbCl) resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren

Zentrifugationsschritt wurden die Zellen in Lösung B (10 % des Ausgangsvolumens)

aufgenommen und dann direkt für Transformationen verwendet. Für eine längere


31

Aufbewahrung wurden die kompetenten Zellen mit 10 % Glycerin versetzt und nach

Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei -80°C g elagert.

2.4.7. Transformation von kompetenten Zellen

Für die Transformation wurden 200 µl kompetente Zellen mit 100 - 200 ng Plasmid-

DNA (1 µl) oder einem kompletten Ligationsansatz mindestens eine Stunde auf Eis

inkubiert. Nach einem Hitzeschock (1.5 min bei 42°C ) und 10 minütiger Inkubation

auf Eis wurde zu jedem Ansatz 0.8 ml KML-Medium gegeben und für mindestens

eine Stunde aerob bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf geeig-

neten Selektionsnährböden ausplattiert. Bei Plasmidtransformationen wurden 100 µl

des Transformationsansatzes und bei Transformationen mit Ligationsansätzen wurde

der gesamte Ansatz ausplattiert. Es folgte eine Inkubation der Platten über Nacht bei

37°C.

2.4.8. Polymerasekettenreaktion

Die Amplifikation verschiedener Gene (kdpFABC, kdpDE oder cls) erfolgte mit der

Polymerasekettenreaktion (PCR). Als Matrize wurde chromosomale DNA oder

Plasmid-DNA eingesetzt und als Primer dienten jeweils zwei synthetisierte Oligo-

nukleotide, die beide komplementär zu gewünschten Abschnitten der Sequenz der

jeweiligen DNA-Fragmente bzw. in dem entsprechenden DNA-Abschnitt lokalisiert

sind. Die jeweils zwischen den Primern liegende Sequenz wurde mit der thermo-

stabilen Phusion-High-Fidelity DNA-Polymerase (für Konstruktionen) oder der eben-

falls thermostabilen Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (für Kontrollen)

amplifiziert. Im Einzelnen bestanden die PCR-Ansätze aus folgenden Komponenten:

10 ng Matrize, 15 pmol Primer sense und 15 pmol Primer antisense, 10 pmol dNTP,

1/10 des Endvolumens 10 x PCR-Puffer, 1/10 des Endvolumens Taq-Polymerase

und H2OBidest. Die Denaturierung der doppelsträngigen DNA erfolgte dabei pro

Reaktionszyklus für 0.8 min bei 96°C, das Anlagern der Primer für 0.8 min bei

Temperaturen entsprechend der Primer und die DNA-Amplifikation bei 72°C für

x Minuten (1000 bp / min) in Abhängigkeit der bp-Länge des gewünschten PCR-

Produktes. Nach 30 Zyklen wurde die Reaktion beendet und die Reaktionsansätze

bis zur Weiterbearbeitung bei 4°C gekühlt.


32

2.4.9. DNA-Sequenzanalyse

Die Sequenzierung von doppelsträngiger DNA erfolgte nach dem Prinzip des “Cycle

Sequencing”, welches auf dem nach Sanger et al. (1977) beschriebenen Ketten-

abbruchverfahren mit Didesoxynukleotiden basiert. Als Primer fanden verschiedene

synthetische Oligonukleotide (Operon, Köln) Verwendung, welche komplementär zu

gewünschten Abschnitten der Sequenz der jeweiligen DNA-Fragmente waren.

Die Sequenzierung der entsprechenden Plasmide oder PCR-Fragmente wurde durch

die Firma GATC Biotech AG (Konstanz) mit den passenden Primern durchgeführt

und mit der Software Chromas (Version 1.43) und SE Central (Clone Manager,

Version 8) ausgewertet.

2.4.10. Isolierung von RNA

Die Isolierung von RNA erfolgte aus dem Pellet von 1 ml Zellkultur (bei verschie-

denen Optischen Dichten) mittels des „RNeasy Mini Kits“ der Firma Qiagen (Hilden)

nach Angaben des Herstellers. Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte mit

dem BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg). Zur weiteren Verwendung wurde die

isolierte RNA mit RNAse-freiem Wasser auf eine Konzentration von 20 µg/ml ein-

gestellt.

2.4.11. cDNA Synthese

Für die Synthese von cDNA wurde zunächst die isolierte RNA für 1 Stunde bei 37°C

und anschließend 10 min bei 70°C mit DNAse I (New E ngland Biolabs, Frankfurt)

inkubiert, um restliche Verunreinigungen von DNA zu entfernen. Anschließend

erfolgte die Synthese der cDNA mittels des „RevertAid First Strand cDNA Synthesis

Kits“ der Firma Fermentas (St. Leon-Rot) nach Angaben des Herstellers.

2.4.12. Quantitative real-time RT-PCR

Um die kdpFABC-Expression zu bestimmen, wurden die Primer kdpAfor2 und

kdpArev2 für die Q-RT-PCR genommen. Als interner Standard wurden die Primer


33

gapAfor1 und gapArev1 für das E. coli „housekeeping“-Gen gap benutzt. Die

spezifische Bindung der Primer für die Q-RT-PCR und die Amplifikation des

gewünschten PCR-Produktes, welche einen spezifischen 200 bp großen Teil von

kdpA bzw. gap vervielfältigt, wurde zuvor durch eine herkömmliche PCR in allen

Stämmen kontrolliert. Das Q-RT-PCR-Programm mit 2 min bei 95°C, der Zyklus

15 sec bei 95°C, 30 sec bei 62°C und 30 sec bei 72° C wurde für alle Primerpaare im

iCycler (BioRad, München) 40-mal durchgeführt und zum Schluss folgte einmalig

eine 5-minütige Inkubation bei 72°C.

Um Fehlerabweichungen zu vermeiden, wurde das Niveau der Expression von kdpA,

welches durch den Cycle threshold (CT) bestimmt wurde, gegen das Expressions-

niveau des „housekeeping“-Gens gap mit Hilfe eines Excel-Datenblattes der Firma

BioRad normalisiert. Für die statistische Auswertung wurden die Daten von mehreren

Messungen gemittelt. Die Induktion der kdpFABC-Expression ist in dem Verhältnis

der normalisierten Werte unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen (0.1 mM K+)

dividiert durch die normalisierten Werte unter nicht-kdpFABC-induzierenden

Bedingungen (115 mM K+) angegeben. Es ist dabei anzumerken, dass, obwohl die

Induktionsverhältnisse aufgrund der extrem niedrigen Werte bei nicht-kdpFABC-

induzierenden Bedingungen schwankten, die allgemeine Größenordnung der CT-

Werte konstant war und deshalb nur die Tendenz der Induktionsverhältnisse

berücksichtigt wurde. Des Weiteren wurden Reaktionen ohne Zugabe einer cDNA als

Matrize als negative Kontrolle für die Aussagekräftigkeit der CT durchgeführt.

2.4.13. P1-Phagenlysatpräparation und P1-Transdukti on

Die Präparation von P1-Lysaten verschiedener E. coli Stämme und die

anschließende Transduktion der Phagen in E. coli Stämme wurden gemäß dem

Protokoll von Arber et al. (1960) durchgeführt. Zur Präparation des P1-Lysates

wurden über Nacht 5 ml Zellkultur des „Quellstammes“ kultiviert und am nächsten

Tag davon 100 µl in 5 ml frisches KML-Medium überimpft, bis eine OD600 von 0.5

erreicht worden war. Dann wurde je 1 ml Zellkultur mit 10 mM CaCl2 und

verschiedenen Volumina P1-Phagensuspension (0 µl, 1 µl, 5 µl, 20 µl, 50 µl, 100 µl,

200 µl, 500 µl) für 20 min bei 37°C inkubiert. Ansc hließend wurde zu jedem Ansatz

7 ml vorgewärmtes KML-Medium mit 7 mM CaCl2 hinzugefügt und die Kulturen für

3 - 6 h bei 37°C aerob inkubiert, bis eine totale L yse der Zellen erfolgt war. Es wurde


34

nur mit der Phagenkonzentration weitergearbeitet, welche die späteste Lyse erzielte,

um möglichst viele der neugebildeten Phagen zu erhalten. Das Lysat wurde mit

0.5 ml Chloroform versetzt, kurz gevortext und 10 min bei 5.000 rpm bei 4°C

zentrifugiert. Der das Phagenlysat enthaltende Überstand wurde erneut mit 0.5 ml

Chloroform versetzt, gevortext, zentrifugiert und bis zur Weiterverwendung bei 4°C

gelagert. Um ein genetisch homogenes Phagenlysat zu erhalten, wurde ein zweiter

Infektionszyklus durchgeführt, indem die beschriebene Prozedur wiederholt wurde.

Zur Transduktion der Lysate wurden E. coli Stämme, in die das jeweilige P1-Lysat

transduziert werden sollte, über Nacht in 5 ml KML-Medium angezogen und am

nächsten Tag in KML-Medium bis zu einer OD600 von 0.5 aerob bei 37°C kultiviert.

Anschließend wurden die Zellen von 1 ml Kultur durch Zentrifugation bei 5.000 rpm

geerntet, zweimal in dem gleichen Volumen Transduktionsmedium (100 mM NaCl;

10 mM CaCl2; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2) gewaschen und so in Transduktionsmedium

resuspendiert, dass eine OD600 von ~ 0.1 eingestellt wurde. Danach wurden je 100 µl

der Zellsuspension mit verschiedenen Volumina des P1-Phagenlysats (0 µl, 1 µl,

5 µl, 20 µl, 100 µl) für 20 min bei 37°C ohne Schüt teln inkubiert. Anschließend

wurden die Ansätze mit 0.1 ml 1 M Natriumcitrat versetzt, um die Transduktion zu

beenden. Der gesamte Ansatz wurde mit 3 ml flüssigem Top-Agar (KML-Medium mit

0.6 % Agar) gemischt, auf entsprechenden Selektivnährböden ausplattiert und 1 - 2

Tage bei 37°C inkubiert. Die Transduktanten wurden anschließend auf ihren

korrekten Phänotyp getestet.

2.5. Biochemische und analytische Methoden

2.5.1. Herstellung von SDS-Proben aus ganzen Zellen

Jeweils 1 ml Zellsuspension einer OD600 von 0.5 - 2 wurde abzentrifugiert (5 min;

14.000 rpm) und das Pellet mit 2x SDS-Probenpuffer (50 mM Tris/HCl pH 6.8; 2 %

SDS; 10 % Glycerin; 5 % Mercaptoethanol; 0.1 % Bromphenolblau) auf eine Protein-

konzentration von 2 mg/ml eingestellt. Das Pellet wurde gründlich resuspendiert und

anschließend 5 min bei 60°C erhitzt.


35

2.5.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte mittels SDS-PAGE nach

Laemmli (1970). Dazu wurden 0.75 mm dicke Flachgele der Größe 7 x 10 cm

verwendet. Die Acrylamidkonzentration betrug im Sammelgel 4.9 % und im Trenngel

9 %. Die SDS-Gele wurden mit Hilfe von Rotiphorese-Fertiglösung (30 % (w/v)

Acrylamid; 0.8 % (w/v) Bisacrylamid) (Roth, Karlsruhe) hergestellt. Die Proteinproben

wurden vor dem Lauf mit SDS-Probenpuffer versetzt, so dass eine Endkonzentration

von 50 mM Tris/HCl, pH 6.8, 10 % Glycerol (v/v), 2 % SDS (w/v), 5 % β-Mercapto-

ethanol (v/v) und 0.1 % Bromphenolblau (w/v) erzielt wurde. Als Proteinstandard

wurde “PageRuler Prestained Protein Ladder“ verwendet. Der SDS-Laufpuffer be-

stand aus 0.025 M Tris, 0.19 M Glycin und 0.1 % SDS. Der Gellauf wurde in einer

“Mini-Protean“-Laufanlage (BioRad, München) für Minigele bei konstant 200 V durch-

geführt.

Die aufgetrennten Proteine wurden anschließend mit Serva Blau G-250 (Coomassie-

Blau) nach Weber & Osborn (1969) detektiert, wobei die Färbelösung zur Fixierung

der Proteine neben 0.25 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue und 50 % (v/v) Methanol

zusätzlich 10 % TCA (w/v) enthielt. Die Entfärbung der Gele erfolgte in 5 % Methanol

(v/v) und 7.5 % Essigsäure (v/v).

2.5.3. Immunoblot

Der Elektrotransfer von Proteinen aus SDS-Gelen auf Nitrocellulose (Porengröße

0.45 µm) erfolgte mit Hilfe einer “Trans-Blot SD semi dry“-Anlage (BioRad, München)

für 20 min bei 20 V. Dafür wurde, nach Angaben des Herstellers, ein Puffer mit

125 mM Tris/HCl, pH 8.3; 192 mM Glycin und 20 % Methanol (v/v) verwendet.

Anschließend wurde die Nitrocellulose für eine Stunde bei 37°C in Puffer A (0.9 %

NaCl (w/v); 50 mM Tris/HCl, pH 7.4) + 5 % Magermilch (w/v) inkubiert, um die

Membran mit Protein abzusättigen und somit eine unspezifische Bindung der

Antikörper auf der Blotmembran zu verhindern. Mit Hilfe des Antiserums αKdpD

(1 : 2.500 verdünnt in Puffer A + 5 % Magermilch) konnte KdpD nachgewiesen

werden (Zimmann, 1995). Nach der Behandlung mit dem ersten Antikörper (über

Nacht bei 4°C) wurde die Membran dreimal für 10 min in Puffer A gewaschen.


36

Daraufhin wurde die Membran für 10 min mit Puffer A und 5 % Magermilch

gequencht. Anschließend erfolgte die Bindung des zweiten Antikörpers für 1 Stunde

bei RT. Dazu wurde, gemäß dem Protokoll nach Zimmann (1995), Ziege-anti-

(Kaninchen-IgG) konjugiert mit Alkalischer Phosphatase für die Detektion von KdpD

verwendet. Vor der Detektion wurde die Membran wieder dreimal für 15 min mit

Puffer A gewaschen. Die Entwicklung des Immunoblots erfolgte durch Inkubation in

Substratlösung (45 mM Natriumcarbonat, pH 9.5; 0.01 % Nitro-Blue-Tetrazolium

(w/v); 0.045 % 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (w/v)).

2.5.4. Herstellung von multilamellaren Liposomen

Die Herstellung von multilamellaren Liposomen erfolgte in Anlehnung an das

Protokoll von Knol et al. (1998). Es wurde zunächst „E. coli total lipid extract“ von

Avanti aufgereinigt und anschließend mit Phosphatidylcholin (PC) aus Eiern (EggPC)

in einem Verhältnis von 3 : 1 (w/w) gemischt (Hänelt, pers. Gabe). Alternativ wurden

auch Liposomen bestehend aus synthetischen Lipiden (100 % CL bzw. 50 % PE und

50 % PC) für die Fusion mit Membranvesikeln hergestellt. Die Lipide wurden in

einem Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur getrocknet. Der Lipidfilm wurde in

dem gleichen Volumen 96 %-iges Ethanol resuspendiert und die Lipide erneut einge-

dampft. Die Lipide wurden dann so in 50 mM KPi-Puffer, pH 7.0 aufgenommen, dass

eine Konzentration von 10 mg/ml eingestellt wurde. Die homogene Lösung wurde mit

dem Ultraschallgerät Sonifer B-15 (Branson) 4 - 6 mal für 15 sec kontinuierlich unter

Stickstoffgas und im Eiswasser beschallt, wobei zwischen den Wiederholungen

immer eine 45 sec Pause eingehalten wurde. Anschließend wurde die Liposomen-

lösung (kleine Vesikel) in flüssigem Stickstoff eingefroren und langsam wieder bei

Raumtemperatur aufgetaut. Dieser Einfrier-Auftau-Schritt wurde insgesamt dreimal

durchgeführt, um große multilamellare Liposomen zu erhalten, die heterogen in ihrer

Größe und Anzahl der Lamellaren waren. Die Liposomen wurden bis zum Gebrauch

in flüssigem Stickstoff gelagert. Vor dem Gebrauch wurden die Liposomen 11-mal

durch einen Polycarbonat-Filter mit einer Porengröße von 400 nm extrudiert, um eine

homogene Lösung an unilamellaren Liposomen zu erhalten. Die Überprüfung der

richtigen Formation der Leerliposomen erfolgte im SLM-Aminco 8100 Spektrofluoro-

meter (SLM-Aminco) nach Elferink et al. (1992).


37

2.5.5. Präparation von invertierten Membranvesikeln

Invertierte Membranvesikel wurden nach dem Protokoll von Siebers & Altendorf

(1988) hergestellt. In Abwandlung zu diesem Protokoll wurde ein Aufschlusspuffer

verwendet, der nicht Hepes/Tris, sondern Tris/HCl, pH 7.5 enthielt. Aufgeschlossen

wurden die Zellen am Aufschlussgerät Basic-Z (Düse: 0,18 mm, Aufschlussdruck:

1,35 kbar). Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer wurden durch einen

niedertourigen Zentrifugationsschritt für 10 min bei 10.000 rpm und 4 °C entfernt. Die

invertierten Membranvesikel wurden bei 42.000 rpm in einer Beckman L-80 XP

Ultrazentrifuge pelletiert, einmal in niederionischem Puffer (1 mM Tris/HCl, pH 7.5;

3 mM EDTA, pH 7.5; 0.5 mM PMSF) gewaschen und anschließend in TG-Puffer

(50 mM Tris/HCl, pH 7.5; 10 % Glycerol (v/v)) aufgenommen. Die Lagerung der

Vesikel erfolgte in flüssigem Stickstoff.

2.5.6. Reinigung von KdpD-6His

Die Reinigung von KdpD-6His erfolgte mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie im

Batchverfahren nach dem Protokoll von Jung et. al (1997). Aus invertierten

Membranvesikeln (Endkonzentration 5 mg/ml) wurde KdpD-6His in Gegenwart von

0.6 M NaCl durch schrittweise Zugabe von Lauryldimethylaminoxid (LDAO) bis zu

einer Endkonzentration von 2 % solubilisiert. Nach 30 min Rühren auf Eis wurde der

Solubilisationsansatz zentrifugiert (70.000 rpm, 1 h, 4°C). Der Überstand wurde

anschließend zu der gewaschenen und equilibrierten Ni-NTA Agarose (Qiagen,

Hilden) gegeben und für 30 min bei 4°C auf einer Wi ppe inkubiert. Die Reinigung von

KdpD-6His erfolgte durch dreimaliges Waschen mit Equilibrierungspuffer (50 mM

Tris/HCl, pH 7.5; 0.04 % Dodecylmaltosid; 10 mM Imidazol; 0.5 M NaCl; 10 mM β-

Mercaptoethanol; 10 % Glycerin). KdpD-6His wurde mit Equilibrierungspuffer mit

einer Konzentration von 100 mM bzw. 250 mM Imidazol eluiert. Die Reinigung wurde

mittels Immunoblot und Proteinbestimmung überprüft.

2.5.7. Rekonstitution von KdpD-6His

Die Rekonstitution von KdpD-6His erfolgte gemäß dem Protokoll von Jung et al.

(1997). Die Liposomen wurden wie unter 2.5.8 beschrieben hergestellt und vor der


38

Rekonstitution wurde 0.64 % Triton X-100 hinzugefügt. Das gereinigte KdpD-6His

wurde im Verhältnis Lipid zu Protein 25 : 1 (w/w) hinzugefügt und unter Rühren bei

RT für 10 min inkubiert. Zur Entfernung des Detergenz wurden Bio-Beads im

Verhältnis von 5 : 1 (w/w) zum Detergenz eingesetzt. Die Bio-Beads wurden zuvor

mit Methanol und H2OBidest nach dem Protokoll von Holloway (1973) gewaschen und

in H2OBidest bei 4°C gelagert. Nach einer Stunde Inkubation bei RT auf der Wippe

erfolgte die erneute Zugabe derselben Menge an Bio-Beads. Es folgte eine

Inkubation über Nacht bei 4°C. Dann wurde die doppe lte Menge an Bio-Beads hinzu-

gefügt und erneut für 1 h bei RT inkubiert. Zum Entfernen der Bio-Beads wurden die

Proteoliposomen über Polyproylensäulen (Qiagen, Hilden) gegeben und der Durch-

fluss aufgefangen. Die Bio-Beads wurden mit TG-Puffer gewaschen, um den Verlust

von Proteoliposomen zu minimieren. Der Durchfluss wurde zentrifugiert (70.000 rpm,

1 h, 4°C), das Pellet in TG-Puffer resuspendiert un d erneut wie zuvor zentrifugiert.

Die Proteoliposomen wurden in TG-Puffer aufgenommen und in flüssigem Stickstoff

gelagert.

Alternativ wurde die Rekonstitution von KdpD-6His gemäß dem Protokoll von Knol et

al. (1998) durchgeführt. Die wesentlichen Unterschiede zu dem herkömmlichen

Rekonstitutionsprotokoll für KdpD bestehen darin, dass das Verhältnis von Lipid zu

Protein 100 : 1 beträgt und dass andere Mengen der Bio-Beads (jedes Mal Zugabe

von 40 mg/ml) und andere Zeitintervalle (15 min, 15 min, 30 min, über Nacht,

1 Stunde) verwendet wurden. Außerdem wurden die Liposomen jeweils so titriert,

dass sie partiell solubilisiert waren, welches eine Tritonkonzentration von nur 0.18 %

zur Folge hatte.

Eine weitere Rekonstitutionsmethode erfolgte durch Verdünnen des Detergenz unter

die CMC („critical micelle concentration“) direkt nach der Reinigung von KdpD-6His

nach dem Protokoll von Heuberger et al. (2001). Dazu erfolgte zunächst bei der

Standardreinigung von KdpD (siehe 2.5.6) ein Detergenzwechsel von DDM

(Dodecylmaltosid) zu OG (Octylglycosid) auf der Ni-NTA, da das Detergenz DDM

nicht so verdünnt werden kann, dass es unterhalb seiner CMC liegt, weil es einen

sehr kleinen CMC-Wert (0.17 mM) aufweist. Hingegen kann OG so verdünnt werden,

dass es unterhalb seiner im Vergleich zu DDM höheren CMC (25 mM) liegt. Die an

die Ni-NTA gebundene Probe wurde mit dem 10-fachen Säulenvolumen mit OG-

Puffer (1.25 %) gewaschen, um das restliche Detergenz DDM vom gebundenen

Protein zu entfernen. Die Elution von KdpD-6His von der Ni-NTA erfolgte mit 100 mM


39

Imidazol in Anwesenheit von OG. Die Rekonstitution erfolgte sofort nach der Protein-

bestimmung, da die Micellen aus OG instabil sind. Dazu wurde OG durch die Zugabe

von OG-freiem Puffer und Lipid so verdünnt, dass die OG-Konzentration unter der

CMC von 25 mM lag, um die Bildung von Liposomen mit zufällig eingebautem KdpD

zu erzielen.

2.5.8. Fusion von Membranvesikeln mit synthetischen Liposomen

Um die Lipidzusammensetzung bzw. den anionischen Anteil an Phospholipiden zu

variieren, wurden multilamellare Liposomen aus synthetischen Lipiden in ver-

schiedenen Verhältnissen mit invertierten Membranvesikeln gemischt. Dafür wurden

zum Einen Liposomen bestehend aus 100 % anionischem CL und zum Anderen

Liposomen bestehend aus 100 % zwitterionischen Lipiden (50 % PE und 50 % PC)

hergestellt und benutzt. Die Fusion dieser Liposomen mit den Membranvesikeln

erfolgten in Anlehnung an das Protokoll von Özcan et al. (2007). Abweichend zu der

in der Literatur beschriebenen Methode wurde ohne die Zugabe von PEG und ohne

Extrusion gearbeitet, da beobachtet werden konnte, dass die Kinaseaktivität von

KdpD-6His nach dem Extrudieren bereits in den invertierten Membranvesikeln

reduziert war.

2.5.9. Proteinbestimmung nach Lowry

Proteinbestimmungen wurden in Abwandlung des Protokolls von Lowry et al. (1951)

nach Peterson et al. (1977) durchgeführt. Als Standardprotein für die Erstellung von

Eichgeraden wurde BSA (2 mg/ml) in den Konzentrationen von 0 µg bis 25 µg ver-

wendet. Die Messung der Extinktion erfolgte im Shimadzu UV-1202 Spektralphoto-

meter (Shimadzu, Duisburg) bei einer Wellenlänge von 750 nm.

2.5.10. Proteinphosphorylierung mit [ γγγγ−−−−32P] ATP

Für die Messung der Kinaseaktivität von KdpD-6His wurden invertierte Membran-

vesikel aus dem Stamm TKR2000 (atp-) verwendet. Das radioaktive Phosphat kann

folglich nicht durch die ATPase abgebaut werden. Die invertierten Membranvesikel

wurden mit TG-Puffer auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml eingestellt. Die Kinase-


40

aktivität wurde in Phosphorylierungspuffer (25 mM Tris/HCl, pH 7.5; 2 mM DTT;

0.01 mM MgCl2; 0.5 M NaCl; 5 % Glycerin) bei Raumtemperatur gemessen. Die

Reaktion wurde durch Zugabe von 20 µM [γ-32P]-ATP (2.38 Ci/mmol) gestartet. Nach

verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und die Reaktion durch

Zugabe von 2 x SDS Probenpuffer im Verhältnis 1 : 2 abgestoppt. Die Proben

wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt (11 % Gel; 200 V;

60 min). Als Standard wurden der ,,Page Ruler Prestained Protein Ladder“ und

0.702 pmol [γ-32P]-ATP eingesetzt. Die SDS-Gele wurden anschließend für 60 min

bei 80°C getrocknet und über Nacht auf einem ,,Stor age Phosphor Screen“

exponiert. Die phosphorylierten Proteine konnten mittels „Phosphoimager Storm 820“

(Molecular Dynamics) detektiert werden. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe der

Software ,,Image Quant 5.2“ von Molecular Dynamics.

2.5.11. Lipid-Extraktion aus ganzen Zellen

Um die Kopfgruppenzusammensetzung der Phospholipide bestimmen zu können,

wurden zunächst die Lipide aus ganzen Zellen extrahiert. Das Protokoll erfolgte in

Anlehnung an Wikström et al. (2004). Dafür wurden Zellen des jeweiligen Stammes

über Nacht im entsprechenden Minimalmedium mit 25 µCi/ml 32P-Orthophosphat

kultiviert und am nächsten Tag in frisches, radioaktives Medium derselben K+-

Konzentration überimpft. Wenn die Zellen die frühe exponentielle Wachstumsphase

(OD600 ~0.5) erreicht hatten, wurden Zellen von 5 ml Kultur durch Zentrifugation

(1 min, 13.000 rpm) vom Medium getrennt und bis zur Weiterverarbeitung bei 4°C

gelagert.

Um die Einflüsse von schnellen Veränderungen der Wachstumsbedingungen

(insbesondere kdpFABC-induzierenden Bedingungen) zu ermitteln, wurden wach-

sende Zellen wie unter 2.3.1 beschrieben filtriert und in neues, ebenfalls radioaktiv-

markiertes Medium resuspendiert. Anschließend wurden zu verschiedenen Zeit-

punkten der Wachstumskurve Proben genommen.

Die polaren Lipide wurden mittels Chloroform/Methanol extrahiert, wie bei Tsatskis et

al. (2005) beschrieben. Das Pellet wurde in 0.2 ml Puffer N (0.5 N NaCl; 0.1 N HCl)

resuspendiert und für 5 min gevortext. Danach wurde 0.6 ml Chloroform-Methanol

(3 : 1) zu der Suspension hinzugefügt und für mindestens 30 min gevortext. Ab-

schließend wurde erneut 0.2 ml Puffer N dazugegeben, für 10 min gevortext und


41

1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, so dass sich die Suspension in zwei Phasen

trennte. Die obere Phase wurde verworfen und die extrahierten Lipide der unteren

Phase in ein neues Eppendorfgefäß überführt, um Verunreinigungen durch den

ebenfalls radioaktiven Überstand zu vermeiden.

2.5.12. Dünnschichtchromatographie

Damit für die Quantifizierung der Dünnschichtchromatographie (DC) sicher gestellt

wurde, dass jede Spur die gleiche Menge an Radioaktivität enthielt, wurden die

flüssigen Proben zunächst im Szintillationszähler Tri-Carb 2300 TR (Packard

Bioscience) analysiert. Dafür wurden je 5 µl der Probe mit 4 ml Szintillationsflüssig-

keit versetzt und die Radioaktivität mit einem Programm zur Detektion von 32P be-

stimmt. Diese Werte geben die gemittelte Radioaktivität pro Minute in „counts per

minute“ (cpm) für eine 10-minütige Messung an. Die Kalibrierung des Szintillations-

zählers fand anhand interner Eichstandards des Herstellers statt.

Die DC wurde gemäß des Protokolls von Tsatskis et al. (2005) durchgeführt. Für die

Auftrennung der Phospholipide wurden entsprechende Kieselgel-Platten verwendet.

Es wurde jeweils eine maximale Radioaktivität von 8.000 - 10.000 cpm (4 - 5 nCi) pro

Spur aufgetragen. Damit ebenfalls das aufgetragene Volumen der Proben bei

gleicher Radioaktivität identisch war, wurden die Proben - falls nötig - mit ent-

sprechenden Mengen Chloroform gemischt. Als Laufmittel wurde Chloroform-

Methanol-Essigsäure im Verhältnis 68 : 25 : 8 verwendet. Nach Auftrennung und

entsprechender Trocknung der DC-Platten wurden diese über Nacht unter einem

„Storage Phosphor Screen“ exponiert.

2.5.13. Kopfgruppenanalyse der Phospholipide mittel s 32P-Markierung

Die radioaktiv-markierten Phospholipide konnten mittels „Phosphoimager Storm 820“

(Molecular Dynamics) detektiert werden. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe der

Software ,,Image Quant 5.2“ von Molecular Dynamics. Der Gehalt jedes Lipids wurde

in mol % angegeben und zuvor an den jeweiligen PO4-Gehalt des Lipids angepasst.

Als biochemische Kontrolle wurde nicht-radioaktiv-markiertes Phospholipid-Extrakt

mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Die DC-Platte wurde mit Molybdän-

blau Reagenz angesprüht, um die Phospholipide zu detektieren. Die Spots der


42

Phospholipide wurden klassifiziert, indem parallel verschiedene synthetische Lipide

ebenfalls auf die DC-Platte aufgetragen wurden.

2.5.14. Fettsäure-Extraktion aus ganzen Zellen

Zellen des E. coli Stammes K12 wurden in Minimalmedien mit verschiedenen K+-

Konzentrationen kultiviert und bei verschiedenen Optischen Dichten durch Zentrifu-

gation geerntet und für die Fettsäure-Extraktion verwendet. Das Protokoll für die

Extraktion von Fettsäure Methyl Estern (FAMEs) aus ganzen Zellen erfolgte in An-

lehnung an Sasser (1990). Dabei fand nach Zellernte eine Verseifung durch eine

Natronlauge statt, gefolgt von einer Methylierung der Fettsäuren, damit diese flüchtig

werden. Die Fettsäuren wurden anschließend mittels eines Hexan-Ether-Gemisches

extrahiert und mit Natronlauge gewaschen.

2.5.15. Fettsäureanalyse der Phospholipide mittels Gaschromatographie

Die Identifizierung der FAMEs wurde mittels Gaschromatographie-Massenspektro-

metrie (GC-MS) nach Lipski & Altendorf (1997) bestimmt. Die Auswertung der Werte

erfolgte mittels eines mitgeführten Standards (9 : 0 Fettsäure-Leiter). Dazu wurden

zunächst die gemessenen RT-Werte des Standards zu den Fettsäuren im Standard

zugeordnet. Anhand einer eigenen ECL-Datenbank (A. Lipski, Universität Osna-

brück) wurden dann die umgerechneten Werte der Proben (von RT auf ECL) auto-

matisch zu einer bestimmten Fettsäure zugeordnet. Die Auswertung der nicht

identifizierten Fettsäuren erfolgte anhand des jeweiligen Massenspektrums mit Hilfe

der Software „Enhanced ChemStation“ (Agilent Technologies) durch den Vergleich

mit einer anderen Fettsäure-Datenbank („FAME“). Die Zuordnung erfolgte über

typische Merkmale verschiedener Fettsäuren. Der Anteil jeder Fettsäure wurde in %

von der gesamten Fettsäurezusammensetzung angegeben.

2.5.16. Flammenphotometrische Bestimmung des extraz ellulären K +- und Na +-

Gehaltes

Die flammenphotometrische Bestimmung des extrazellulären Kalium- oder

Natriumgehaltes wurde nach dem Protokoll von Bakker et al. (1993) durchgeführt.


43

1 ml der zu testenden Zellsuspension wurde 5 min bei 13.000 rpm zentrifugiert und

vom Überstand des Zentrifugates 750 µl abgenommen. Bei Kaliumgehalten über

100 µM wurde die Probe mit H2OBidest verdünnt. Die gegebenenfalls verdünnte Probe

wurde 1 : 1 mit einer 10 mM CsCl / 2.5 % TCA-Lösung gemischt und der Kalium-

bzw. Natriumgehalt am Flammenphotometer der Marke Eppendorf ELEX 6361 mit

Hilfe von Standardlösungen bestimmt.

2.5.17. ββββ-Galaktosidase-Aktivitätstest

Die Expression von kdpFABC oder cls in vivo wurde mittels des Reportergens lacZ

(kdpFABC- bzw. cls-Promotor/lacZ-Genfusion) nachgewiesen. Die mit dem β-

Galaktosidase-Aktivitätstest nach Miller (1972) bestimmte Aktivität der vom lacZ-Gen

kodierten β-Galaktosidase diente als indirektes Maß für die Expression von kdpFABC

bzw. cls. Für den Test wurden Zellen des Stammes E. coli HAK006 (kdpFABC-lacZ

∆kdpD161-726) mit einem entsprechenden Plasmid (kodierend für KdpD-Derivate) in

Minimalmedien nach Epstein & Kim (1971) bis zu einer OD600 von etwa 1.0

angezogen. Für den Test der cls-Expression wurden Zellen des Stammes E. coli

SOH92 (cls-lacZ) in Minimalmedien nach Epstein & Kim (1971) angezogen und bei

verschiedenen Optischen Dichten der Wachstumskurve wurden Proben für den β-

Galaktosidase-Aktivitätstest genommen.

Anschließend wurde 1 ml jeder Zellkultur für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert und

in 1 ml Phosphatpuffer (200 mM, pH 7.0) resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte

durch Zugabe von 100 µl Chloroform und 50 µl SDS (0.1 % (w/v)). Zur Bestimmung

der Aktivität wurden 200 µl ortho-Nitrophenyl-β-D-Galaktosid (4 mg/ml) zu den

Proben gegeben. Die Reaktionen wurden nach 4 min durch Zugabe von 500 µl

Natriumcarbonat (1 M) gestoppt. Zelltrümmer konnten durch Zentrifugation bei

13.000 rpm für 10 min entfernt werden. Die Intensität der durch die Reaktion hervor-

gerufenen Färbung wurde photometrisch bei einer Absorption von 420 nm bestimmt.

Die Aktivität konnte mit Hilfe folgender Formel berechnet werden:

Aktivität [units] = (A420 x 1000) / (t x V x OD600)

Dabei ist A420 als die Absorption der Reaktionslösung, OD600 als die Optische Dichte

der Zellsuspension, t als die Reaktionszeit [min] und V als das Reaktionsvolumen

[ml] definiert.

3. Ergebnisse

44

3. Ergebnisse

3.1. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli K12 Wildtyp

3.1.1. Totale Phospholipidzusammensetzung

Um den Einfluss der K+-Limitation auf die Zusammensetzung der Kopfgruppen der

Phospholipide zu untersuchen, wurden Zellen von E. coli K12 in phosphat-gepuff-

erten Minimalmedien mit verschiedenen K+-Konzentrationen bis zum Erreichen der

exponentiellen Wachstumsphase (OD600 ~0.5), wie unter 2.5.11 beschrieben, ange-

zogen. Für die Bestimmung der totalen Phospholipidzusammensetzung wurden die

Zellen somit kontinuierlich den entsprechenden Wachstumsbedingungen ausgesetzt.

Abb. 3.1: Kopfgruppenzusammensetzung des polaren Li pidextraktes von E. coli K12. Die Lipidzusammensetzung in der exponentiellen Wachstumsphase wurde, wie unter 2.5.11-13 geschrieben, bestimmt. A: Bild eines repräsentativen Chromatogramms, welches die relativen Positionen und Intensitäten der Spots der Hauptphospholipide eines polaren Lipidextraktes zeigt. Der PE-Gehalt (B), der PG-Gehalt (C) und der CL-Gehalt (D) sind in Prozent der totalen Lipidzusammensetzung in K0.02 (rote Balken), K20 (blaue Balken) und K115 (grüne Balken) angegeben. Die Standardabweichungen wurden von vier voneinander unabhängigen Messungen ermittelt. Die kleineren Abbildungen von B und D weisen eine andere Skalierung der Y-Achse auf, um die Unterschiede in der Kopfgruppenzusammen-setzung deutlicher hervorzuheben.

3. Ergebnisse

45

Die Daten zeigen, dass nach kontinuierlichem Wachstum unter K+-Limitation der CL-

Gehalt auf Kosten von PE erhöht ist, während der PG-Gehalt mit 15 % konstant

bleibt (Abb. 3.1). Der Vergleich der Zusammensetzung der Kopfgruppen von Zellen,

die mit 0.02 mM K+, und Zellen, die mit 115 mM K+ angezogen wurden, zeigt, dass

eine 1.44-fache CL-Erhöhung beobachtet werden konnte, wenn kdpFABC-

induzierende Bedingungen (0.02 mM K+) vorlagen (Abb. 3.1D).

3.1.2. Neusynthetisiertes Cardiolipin nach K +-„downshift“

Des Weiteren wurde untersucht, ob der beobachtete CL-Anstieg nach

kontinuierlichem Wachstum unter K+-Limitation (siehe 3.1.1) auch sofort nach einem

K+-„downshift“ zu detektieren war. Dazu wurden Zellen von E. coli K12 in Minimal-

medium mit 20 mM K+ angezogen und der Mediumshift auf nominal 0 mM K+ bzw.

20 mM K+ wie unter 2.3.1 beschrieben durchgeführt.

Abb. 3.2: CL-Gehalt von E. coli K12 während eines Mediumshifts. Zellen wurden in K20 bis zu einer OD600 von 0.5 angezogen und zum Zeitpunkt 0 in frisches K0-Medium (A) oder in K20 (B und C) transferiert. Die Bestimmung der neusynthetisierten CL-Moleküle (rot) wurde wie unter 2.5.11-13 beschrieben durchgeführt. Die Wachstumskurve jeder Kultur ist in schwarz gezeigt. Die X-Achsen von B und C weisen eine andere Skalierung der Zeit auf, um die exponentielle mit der stationären Wachstumsphase vergleichen zu können. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen.

A) B)

C)

3. Ergebnisse

46

Wie Abbildung 3.2A zeigt, wurde der CL-Anstieg von Zellen auch sofort nach einem

Shift (30 sec) in Medium mit nominal keinen K+-Ionen beobachtet, wobei dieser An-

stieg die Proportion von neusynthetisiertem CL widerspiegelt. Eine solche Änderung

der Zusammensetzung der Kopfgruppen wurde hingegen nicht ermittelt, wenn die

Zellen in frisches Medium mit derselben K+-Konzentration überführt wurden (Abb.

3.2B). Unabhängig von einem Wechsel des Mediums, stieg der CL-Gehalt auf

Kosten von PG an, wenn die Zellen die stationäre Wachstumsphase erreicht hatten

(Abb. 3.2C). Dieser Effekt in der stationären Wachstumsphase konnte bereits früher

beobachtet werden (Cronan, 1968; Randle et al., 1969).

3.1.3. Fettsäurezusammensetzung unter K +-Limitation

Da bereits gezeigt werden konnte, dass sich unter K+-Limitation die Zusammen-

setzung der Kopfgruppen der Phospholipide der Zellhülle von E. coli ändert (siehe

3.1.1-2), wurde untersucht, ob sich auch die Zusammensetzung der Fettsäureketten

der Phospholipide unter K+-Limitation ändert. Die Zusammensetzung der Fettsäure-

ketten wurde mittels Gaschromatographie bestimmt. Dazu wurden Flüssigkulturen

von E. coli K12 in Minimalmedium mit 0.1 mM K+ oder 115 mM K+ angezogen und

nach Zellernte bei verschiedenen Optischen Dichten die Fettsäuren extrahiert und

analysiert.

Tab. 3.1: Fettsäurezusammensetzung der Phospholipid e von E. coli K12.

Zellen wurden in K0.1 oder in K115 angezogen. Der Gehalt jeder Fettsäure ist in Prozent angegeben und wurde wie unter 2.5.14-15 beschrieben bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen. Die Werte für die Fettsäurezusammensetzung sind in Tabelle 3.1 dargestellt. Die

prozentualen Anteile der häufigsten Fettsäuren von E. coli in K0.1 sind 16:0 mit

38.8 % (bzw. 36.4 % in K115) und 16:1 cis 9 mit 29.8 % (bzw. 34.8 % in K115).

Fettsäure [%] in K0.1 K115

12:0 2.6 3.1 14:0 6.5 7.4 16:0 38.8 36.4 16:1 cis 9 29.8 34.8 18:0 0 0 18:1 cis 11 11.0 10.4 17:0 cyclo 9-10 6.1 3.7 19:0 cyclo 11-12 0 0 Andere 5.2 4.2

3. Ergebnisse

47

Sowohl in K0.1 als auch in K115 sind die prozentualen Anteile der Fettsäuren

vergleichbar mit denen in Vollmedium ermittelten Werten (Cronan, 1968).

3.2. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli „Kalium-Stämmen“

3.2.1. Totale Phospholipidzusammensetzung

Um den Einfluss von verschiedenen K+-Transportern auf die Zusammensetzung der

Kopfgruppen zu untersuchen, wurden entsprechende „Kalium-Stämme“ verwendet.

Der E. coli Stamm TK2240 (kdp+ trk– kup–) wurde getestet, um den Einfluss der

niedrig affinen K+-Aufnahmesysteme Trk und Kup zu untersuchen. Der Stamm

RH003 hingegen ist für die Gene, die für das komplette KdpFABCDE-System

kodieren, deletiert. Der Stamm HAK006, der unter anderem für die Konstruktion von

RH003 verwendet wurde, weist nur eine Teildeletion des kdpD-Gens in den Basen-

paaren auf, welche für die Aminosäuren 161-726 von KdpD kodieren. Als Referenz

wurden die gewonnenen Ergebnisse aus 3.1.1 von E. coli K12 genommen. Dieser

Vergleich ist besonders im Falle von TK2240 wichtig, da die kdpFABC-Expression

davon abhängig ist, ob auch andere K+-Transportsysteme wie Trk und Kup in der

Zelle vorhanden sind (siehe Abb. 1.5). Die Stämme wurden in verschiedenen Mini-

malmedien mit 32P-Orthophosphat angezogen und die Zusammensetzung der Kopf-

gruppen nach kontinuierlichem Wachstum während der exponentiellen Wachstums-

phase (OD600 ~0.5) bestimmt.

Tab. 3.2: Zusammensetzung der Kopfgruppen verschied ener E. coli „Kalium-Stämme“.

Kopfgruppengehalt [%] in K0.1 Stamm Relevanter

Genotyp PE PG CL

Anteil anionischer Phospholipide

K12 trk+ kdp+ 75.1 (77.3) 15.1 (16.5) 9.8 (6.2) 24.9 (22.7)

TK2240 trk- kdp+ 77.3 14.1 8.6 22.7

RH003 trk+ kdp- 78.8 17.3 3.9 21.2

HAK006 trk+ kdpD- 78.6 17.9 3.5 21.4

Die Zusammensetzung der Kopfgruppen ist angegeben in Prozent und wurde wie unter 2.5.11-13 beschrieben bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei - drei voneinander unabhängigen Messungen. Der Anteil anionischer Lipide ist durch die Summe von PG und CL angegeben. Bei den Werten in Klammern handelt es sich um die Werte des Referenzstammes K12 in K115.

3. Ergebnisse

48

Während den Versuchen zeigte sich, dass die Werte für die jeweilige Kopfgruppe in

den getesteten „Kalium-Stämmen“ in K0.1 und K115 gleich waren. Daher wurden die

Prozente aus den beiden Minimalmedien zusammengefasst und gemeinsam ausge-

wertet. Obwohl alle getesteten „Kalium-Stämme“ keine Änderung der Kopfgruppen-

zusammensetzung unter K+-Limitation aufwiesen, zeigte sich, dass das Niveau ihres

CL-Gehalts unterschiedlich im Vergleich mit dem Wildtypstamm E. coli K12 ist

(Tabelle 3.2). Der Stamm TK2240 zeigte in Minimalmedium mit 0.1 mM K+ (bzw.

115 mM K+) einen höheren CL-Gehalt als der Stamm K12 in K115. Allerdings war

der Anteil an anionischen Lipiden der beiden Stämme vergleichbar. Im Gegensatz

dazu zeigten der Stamm RH003 sowie der Stamm HAK006 einen niedrigeren CL-

Gehalt als der Wildtypstamm K12. Diese Beobachtung konnte unabhängig von der

K+-Konzentration im Medium gemacht werden. Des Weiteren hatten beide kdp--

Stämme eine ähnliche Zusammensetzung der Kopfgruppen.

3.2.2. Neusynthetisiertes Cardiolipin nach K +-„downshift“

In Anlehnung an die Experimente mit E. coli K12 Wildtyp wurde ebenfalls untersucht,

ob in den „Kalium-Stämmen“ ein CL-Anstieg sofort nach einem K+-„downshift“ zu

detektieren war. Dazu wurden Zellen von E. coli TK2240 bzw. RH003 in Minimal-

medium mit 115 mM K+ angezogen und der Mediumshift wie unter 2.3.1 beschrieben

durchgeführt.

Abb. 3.3: CL-Gehalt von E. coli „Kalium-Stämmen“ nach K +-„downshift“. Zellen wurden in K115 bis zu einer OD600 von 0.5 angezogen und zum Zeitpunkt 0 in frisches K0.1-Medium transferiert. Die Bestimmung der neusynthetisierten CL-Moleküle wurde wie unter 2.5.11-13 beschrieben durchgeführt. Der CL-Gehalt von TK2240 (trk–, rot) und RH003 (kdp–, grün) ist dargestellt. Die Wachstumskurve jeder Kultur ist mit einer gestrichelten Linie angedeutet. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen.

3. Ergebnisse

49

Der CL-Gehalt stieg nicht sofort nach einem Shift in Medium mit niedriger K+-

Konzentration (kdpFABC-induzierenden Bedingungen) an (Abb. 3.3). Es konnte auch

keine andere Änderung der Kopfgruppenzusammensetzung beobachtet werden.

Obwohl die beiden „Kalium-Stämme“ keine Änderung der Kopfgruppenzusammen-

setzung aufwiesen, zeigte sich erneut, dass das Niveau ihres CL-Gehalts unter-

schiedlich im Vergleich mit dem des Wildtypstamms E. coli K12 ist.

Um zu ermitteln, warum die „Kalium-Stämme“ keinen CL-Anstieg unter K+-Limitation

aufweisen, wurden die ursprünglichen Stämme, aus denen TK2240 bzw. RH003

entstanden sind, auf die Zusammensetzung ihrer Kopfgruppen untersucht. Es sollte

ebenfalls analysiert werden, ob der unterschiedlich hohe CL-Gehalt der „Kalium-

Stämme“ von der Anwesenheit der K+-Aufnahmesysteme beeinflusst wird. Der

Stamm RH003 ist aus RH002 entstanden. Dieser Stamm ist im Gegensatz zu RH003

kdp+, weist aber ansonsten den gleichen genetischen Hintergrund auf. Der Stamm

TK2240 ist aus dem Stamm FRAG-1 entstanden, der im Gegensatz zu TK2240 trk+

ist, aber ansonsten den gleichen genetischen Hintergrund aufweist.

Die Stämme RH002 und FRAG-1 wurden in verschiedenen Minimalmedien mit 32P-

Orthophosphat angezogen und die Zusammensetzung der Kopfgruppen nach

kontinuierlichem Wachstum während der exponentiellen Wachstumsphase (OD600

~0.5) bestimmt.

Tab. 3.3: Zusammensetzung der Kopfgruppen der E. coli Stämme, aus denen die „Kalium-Stämme“ hervorgehen, während der exponentie llen Wachstumsphase.

Kopfgruppengehalt [%] in K0.1 Stamm Relevanter Genotyp PE PG CL


FRAG-1 trk+ kdp+ 78.0 13.2 8.8 22.0

RH002 trk+ kdp+ 78.3 17.8 3.9 21.7

Die Zusammensetzung der Kopfgruppen ist angegeben in Prozent und wurde wie unter 2.5.11-13 beschrieben bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei Messungen. Der Anteil anionischer Lipide ist durch die Summe von PG und CL angegeben.

Während den Versuchen zeigte sich, dass die Werte für die jeweilige Kopfgruppe in

K0.1 und K115 gleich waren. Daher wurden die Prozente aus den beiden Minimal-

medien zusammengefasst und gemeinsam ausgewertet. Beide ursprünglichen Stäm-

me zeigten keinen Anstieg des CL-Gehaltes unter K+-Limitation während der expo-

3. Ergebnisse

50

nentiellen Wachstumsphase und einen vergleichbaren Anteil an CL im Vergleich mit

den jeweiligen Stämmen, die aus ihnen konstruiert wurden (Tabelle 3.2 vgl. Tabelle

3.3). Der Stamm FRAG-1 (bzw. TK2240) hat mit 8.8 % (8.6 %) einen höheren CL-

Gehalt als der Stamm RH002 (RH003 und HAK006) mit 3.9 % (bzw. 3.5 %).

3.3. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli „Lipid-Stämmen“

Um den Einfluss der K+-Limitation auf die Zusammensetzung der Kopfgruppen von

„Lipid-Stämmen“ zu untersuchen, wurden entsprechende Stämme analysiert. Solche

„Lipid-Stämme“ mit einer veränderten nativen Zusammensetzung der Kopfgruppen

sind bereits detailliert charakterisiert worden (zum Überblick siehe Dowhan et al.,

2004). Auch die Zusammensetzung der Kopfgruppen, der in der vorliegenden Arbeit

untersuchten Stämme UE54, WC3899, HDL1001 und AD93, wurde bereits für das

Wachstum in Vollmedium beschrieben. In dieser Arbeit wurde das Wachstum unter

K+-Limitation untersucht, da bislang für diese Wachstumsbedingung keine Werte

vorlagen. Als ein Extrem wurde der Stamm AD93, der nur anionische Phospholipide

enthält, und als ein anderes Extrem der Stamm UE54, der nur zwitterionische

Phospholipide enthält, getestet.

Zunächst wurde ein biochemischer Nachweis erbracht, dass es sich bei den

verschiedenen E. coli „Lipid-Stämmen““ jeweils um die in der Literatur für Vollmedium

beschriebene Phospholipidzusammensetzung handelt. Dafür wurden Zellen von den

Stämmen AD93 und K12 in Minimalmedium mit 115 mM K+ und in KML-Medium

angezogen und die Lipide extrahiert. Neben den Extrakten der Lipide der verschie-

denen Stämme wurde ein synthetisches Gemisch von PE, PG und CL auf die DC-

Platte aufgetragen, um die Phospholipide identifizieren zu können. Anschließend

wurde die DC-Platte mit einem speziellen Farbstoff für Phospholipide (Molybdänblau)

angesprüht (siehe Abb. 3.4A). Des Weiteren wurden alle untersuchten „Lipid-

Stämme“ in den verschiedenen Minimalmedien mit radioaktivem 32P-Orthophosphat

angezogen, die Lipide extrahiert und die Zusammensetzung der Kopfgruppen

bestimmt (siehe 2.5.11-13), um diese untereinander vergleichen zu können.

Mit dem Vergleich von Abbildung 3.4A mit 3.4B konnten die radioaktiven Spots den

jeweiligen Phospholipiden zugeordnet werden. Mit dieser Methode konnte bestätigt

werden, dass alle untersuchten Stämme die beschriebenen und keine weiteren

3. Ergebnisse

51

Phospholipide aufweisen. Des Weiteren wurde eine dem Vollmedium ähnliche

Tendenz der prozentualen Anteile der Kopfgruppen bei der Zusammensetzung der

Phospholipide des jeweiligen Stammes anhand der Intensitäten der Spots ange-

deutet. Die genaue Quantifizierung der Zusammensetzung der Kopfgruppen erfolgte

wie unter 2.5.13 beschrieben.

Abb. 3.4: Identifizierung der Phospholipide. Der biochemische Nachweis der Zusammen-setzung der Kopfgruppen ist in A und im Vergleich der radioaktive Nachweis von [32P]-eingebauten Phospholipiden in B nach Auftrennung mittels 1-Dimensionaler Dünnschicht-chromatographie dargestellt. Die Besonderheiten in der Zusammensetzung des jeweiligen Stammes sind durch die roten bzw. grünen Kreise gekennzeichnet, je nachdem, ob es sich um den Anteil von anionischen oder zwitterionischen Phospholipiden handelt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei - drei voneinander unabhängigen Messungen.

Die Zusammensetzung der Kopfgruppen der Phospholipide der einzelnen Stämme

ist in Tabelle 3.4 dargestellt. Während den Versuchen zeigte sich, dass die Werte für

die jeweilige Kopfgruppe der „Lipid-Stämme“ in K0.1 und K115 gleich waren. Daher

wurden die Prozente aus den beiden Minimalmedien zusammengefasst und gemein-

sam ausgewertet. Unter K+-Limitation zeigte der Stamm AD93, der eine Deletion des

pssA-Gens beinhaltet, eine Zusammensetzung der Kopfgruppen ohne PE, welche in

eine ausschließliche Zusammensetzung aus anionischen Kopfgruppen, haupt-

sächlich aus PG und CL bestehend, resultiert. Die Transformation des Stammes mit

dem Plasmid pDD72, welches das pssA-Gen kodiert, führte zu einer Zusammen-

setzung der Kopfgruppen, die vergleichbar mit der des Wildtypstamms K12 ist.

CL

PG

PE

Start

Stamm K12 HDL1001 AD93 W3899 DG10 IPTG + - WC3899 UE54 pDD72 - +

CL

PG

PE

synthetische AD93 Lipide K12

A) B)

3. Ergebnisse

52

Tab. 3.4: Zusammensetzung der Kopfgruppen verschied ener E. coli „Lipid-Stämme“ während der exponentiellen Wachstumsphase.

E. coli Stamm Phospholipidgehalt [%]

in verschiedenen K + Medien

PE

K0.1 K115

PG

K0.1 K115

CL

K0.1 K115

anionisch a

K0.1 K115

Ursprüngliche Stämme

K12 75.1 77.3 15.1 16.5 9.8 6.2 24.9 22.7

W3899 73.7 77.1 15.3 16.4 11.0 6.5 26.3 22.9

SOH92 74.7 80.1 11.7 12.0 13.6 7.9 25.3 19.9

„Lipid-Stämme“ AD93 0.0 50.4 49.6 100.0

AD93/pDD72 78.4 18.1 3.5c 21.6

WC3899 74.1 25.0 0.9 25.9

HDL1001 + 1 mM IPTG 81.9 13.9 4.2 18.1

HDL1001 (- IPTG) 96.2 2.7 1.1 3.8

UE54 100.0 0.0 0.0 0.0

Die Zusammensetzung der Kopfgruppen ist angegeben in Prozent und wurde wie unter 2.5.11-13 beschrieben bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen nach Wachstum in K0.1. Dabei bildet der Stamm AD93 und AD93/pDD72 eine Ausnahme, da dieser in GM56-K0.1 kultiviert wurde. a: Der Anteil anionischer Lipide ist durch die Summe von PG und CL angegeben.

Im Falle des E. coli Stammes WC3899 wurde unter K+-Limitation ein restlicher Anteil

von CL gefunden, obwohl das cls-Gen deletiert ist. Für andere cls- Stämme wurden

ähnliche CL-Gehalte in Vollmedium beobachtet (Nishijima et al., 1988). Der Stamm

WC3899 beinhaltet einen ähnlich hohen Anteil an anionischen Phospholipiden wie

der Wildtypstamm K12, welcher sich in der Zusammensetzung von PG und CL durch

einen höheren PG-Gehalt unterscheidet. Der E. coli Stamm HDL1001, der das pgsA-

Gen unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors hat, zeigt in Ab-

wesenheit von IPTG ein reduziertes Niveau an anionischen Phospholipiden, während

dieses in Anwesenheit von IPTG dem des Wildtypstammes K12 gleicht. Der Stamm

UE54, der eine komplette Deletion des pgsA-Gens beinhaltet, wies auch unter K+-

Limitation nicht die beiden wichtigsten anionischen Phospholipide PG und CL,

sondern ausschließlich das zwitterionische PE auf. Somit beinhalten diese Stämme

ein breites Spektrum an verschiedenen PE-, PG- und CL-Anteilen unter K+-Limi-

tation, wie bereits vorher in Anwesenheit von K+ beschrieben wurde. Es konnten aber

3. Ergebnisse

53

keine signifikanten Änderungen in der Zusammensetzung der Kopfgruppen während

der exponentiellen Wachstumsphase unter K+-Limitation festgestellt werden.

Im Gegensatz dazu zeigte der Stamm SOH92, der eine cls-lacZ Fusion zum

Nachweis der cls-Expression aufweist, einen CL-Anstieg unter K+-Limitation. Dieser

Stamm beinhaltet jedoch keine Mutation in den Genen, welche für Enzyme, die in die

Biosynthese der Phospholipide involviert sind, kodieren, und eine regulatorische

Auswirkung auf die Phospholipidzusammensetzung haben.

3.4. Einfluss der K +-Limitation auf die Phospholipide von E. coli C43(DE3) / pEcb1

Um einen genaueren Aufschluss über die Wechselwirkung von KdpD und den

Phospholipiden in der Zytoplasmamembran zu erlangen, wurde der E. coli Stamm

C43(DE3), welcher bei Überproduktion der b-Untereinheit der ATP-Synthase eine

Proliferation der Zytoplasmamembran aufweist (Arechaga et al., 2000), auf seine

Zusammensetzung der Phospholipide untersucht. Die Kopfgruppen der Phospho-

lipide im Stamm C43(DE3) und C43(DE3) / pEcb1, kodierend für die b-Untereinheit

der ATP-Synthase, wurden nach Kultivierung in verschiedenen Minimalmedien mit 32P-Orthophosphat bestimmt.

Tab. 3.5: Zusammensetzung der Kopfgruppen von E. coli C43(DE3) und C43(DE3) / pEcb1 während der exponentiellen Wachstu msphase.

Kopfgruppengehalt [%] in K0.1 Stamm Relevanter Genotyp PE PG CL


C43(DE3) WT 78.1 19.0 2.9 21.9

C43(DE3)/pEcb1 atpF ↑ 79.4 14.6 6.0 20.6

Die Zusammensetzung der Kopfgruppen der exponentiellen Wachstumsphase ist angegeben in Prozent und wurde wie unter 2.5.11-13 beschrieben bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen. Der Anteil anionischer Lipide ist durch die Summe von PG und CL angegeben.

Die Zusammensetzung der Kopfgruppen ist in Tabelle 3.5 dargestellt. Während den

Versuchen zeigte sich, dass die Werte für die jeweilige Kopfgruppe in K0.1 und K115

gleich waren. Daher wurden die Prozente aus den beiden Minimalmedien zu-

sammengefasst und gemeinsam ausgewertet. Sowohl bei C43(DE3) als auch bei

C43(DE3) / pEcb1 konnte keine Änderung der Kopfgruppen während der exponen-

tiellen Wachstumsphase unter K+-Limitation im Vergleich zur Kultivierung mit hohen

3. Ergebnisse

54

K+-Konzentrationen beobachtet werden. Beim Vergleich von C43(DE3) mit

C43(DE3) / pEcb1 hingegen führte die Proliferation der Zytoplasmamembran zu

einer veränderten Zusammensetzung der Kopfgruppen. Der Stamm C43(DE3) hat

mit 2.9 % ein niedrigeres CL-Niveau, aber mit 21.9 % einen höheren Anteil

anionischer Phospholipide als C43(DE3) / pEcb1, wobei diese Beobachtung unab-

hängig von der K+-Konzentration im Medium war. Der CL-Anstieg infolge der

Proliferation der Zytoplasmamembran wurde bereits für Vollmedium beobachtet

(Arechaga et al., 2000).

3.5. Cardiolipin-Anstieg unter K +-Limitation

3.5.1. cls-Expression in verschiedenen E. coli Stämmen

Die unter 3.1.1 beobachtete Erhöhung des CL-Gehalts unter K+-Limitation könnte auf

eine erhöhte cls-Expression oder auf eine erhöhte Enzymaktivität der CL-Synthase

unter K+-Limitation zurückzuführen sein. Deswegen wurde der Einfluss der K+-

Limitation auf die Induktion der cls-Expression untersucht, indem Zellen von E. coli

SOH92 in phosphat-gepufferten Minimalmedien mit verschiedenen K+-Konzen-

trationen kultiviert wurden. Mit diesem Stamm kann die cls-Expression indirekt

anhand der chromosomalen cls-lacZ Fusion mittels eines β-Galaktosidase-Aktivitäts-

test bestimmt werden, da das Gen der CL-Synthase an ein Reportergen gekoppelt ist

(vgl. auch Heber & Tropp, 1991). Ansonsten hat der Stamm keine Beeinträchtigung

in der Synthese der K+-Transportsysteme oder bei der Biosynthese der Phospho-

lipide. Der Stamm SOH92 ist vom CL-Gehalt (8 – 13 % in Abhängigkeit der K+-

Konzentration) und vom Gehalt an negativen Phospholipiden (20 – 25 %) vergleich-

bar mit dem Wildtypstamm E. coli K12 (genaue Werte siehe Tabelle 3.4). Zu

verschiedenen Zeitpunkten während des kontinuierlichen Wachstums der Kulturen in

K0.1 bzw. K115 wurden Proben für den β-Galaktosidase-Aktivitätstest entnommen.

In Abbildung 3.5 wird deutlich, dass zu jedem Zeitpunkt der Wachstumskurve der

Zellen in Medium mit 0.1 mM K+ die cls-Expression höher war als in Medium mit

115 mM K+. Während der exponentiellen Wachstumsphase waren die β-Galakto-

sidase-Aktivitäten in beiden Minimalmedien höher als in der stationären Wachstums-

phase der jeweiligen Kultur. Das Induktionsverhältnis (K0.1 / K115) für die cls-

3. Ergebnisse

55

Expression anhand der β-Galaktosidase-Aktivitäten war hingegen während des ge-

samten Wachstums relativ konstant. Unter K+-Limitation kam es im Vergleich zu

nicht-kdpFABC-induzierenden Bedingungen zu einer 2 - 3 fachen Erhöhung der cls-

Expression.

Abb. 3.5: ββββ-Galaktosidase-Aktivitäten von E. coli SOH92 unter K +-Limitation. Die Miller units geben indirekt das Niveau der cls-Expression wieder und sind wie in 2.5.18 beschrieben ermittelt worden. Dargestellt sind die cls-Induktion (Linien) und die Wachstums-kurve (gestrichelte Linien) von Zellen in K0.1 (rot) bzw. K115 (grün). Die Daten repräsen-tieren den Durchschnitt von drei voneinander unabhängigen Messungen.

Um die Ursache für den CL-Anstieg unter K+-Limitation genauer zu analysieren,

sollten weitere E. coli Stämme, die eine cls-lacZ Fusion tragen, untersucht werden.

Dazu wurden zunächst neue Stämme hergestellt, indem die cls-lacZ Fusion aus dem

E. coli Stamm SOH92 (cls-lacZ) mittels P1-Transduktion übertragen wurde. Die

Stämme wurden ausgewählt, weil sie entweder eine veränderte native Phospholipid-

zusammensetzung aufwiesen oder weil sie bereits aufgrund ihrer Phospholipid-

zusammensetzung unter K+-Limitation untersucht wurden. Der E. coli Stamm K12

(mit cls-lacZ Fusion als KM12 benannt), der Stamm TK2240 (mit cls-lacZ Fusion als

TKM2240 benannt) und der Stamm WC3899 (mit cls-lacZ Fusion als WCM3899

benannt) wurden erfolgreich mit dieser Methode, wie unter 2.4.13 beschrieben,

verändert. Anhand einer PCR mit anschließender Sequenzierung wurde die cls-lacZ

Fusion in den dadurch Kanamycin-resistent gewordenen Klonen dieser Stämme

3. Ergebnisse

56

0.1 mM K+ 115 mM K+

kontrolliert. Die Proben für den β-Galaktosidase-Aktivitätstest wurden während des

kontinuierlichen Wachstums der Kulturen in K0.1 bzw. K115 bei einer OD600 von ~1

entnommen.

Abb. 3.6: ββββ-Galaktosidase-Aktivitäten von verschiedenen E. coli Stämmen mit einer cls-lacZ Fusion. Bei den Aktivitäten handelt es sich um die Mittelwerte von drei voneinander unabhängigen Messungen bei einer OD600 von 1. Dargestellt ist die cls-Induktion von Zellen in K0.1 (rote Balken) bzw. K115 (grüne Balken).

In allen Stämmen wurde die β-Galaktosidase-Aktivität nach Kultivierung in verschie-

denen Minimalmedien gemessen und es konnte ein Anstieg der cls-Expression unter

K+-Limitation beobachtet werden (Abb. 3.6). Dieser Anstieg war unabhängig davon,

ob die niedrig affinen K+-Aufnahmesysteme anwesend (KM12) oder abwesend

(TKM2240) waren. Ebenfalls konnte eine Erhöhung der β-Galaktosidase-Aktivität

unter K+-Limitation gemessen werden, wenn nur Spuren von CL in der Zusammen-

setzung der Kopfgruppen der Phospholipide (WCM3899) vorhanden waren.

3.5.2. Cardiolipin-Gehalt in einem ∆∆∆∆cls-Stamm

Es konnte bereits gezeigt werden, dass das Protein des ybhO-Gens in vitro in der

Lage ist, restliche Mengen an CL zu synthetisieren (Guo & Tropp, 2000). Bei ybhO

handelt es sich um ein dem cls-Gen homologes Gen und das resultierende Protein

YbhO beinhaltet 2 HKD Motive mit der Aminosäuresequenz „HxKxxxxD“, welche für

Proteine des Phospholipase D-Typs charakteristisch sind (Guo & Tropp, 2000).

3. Ergebnisse

57

Romantsov et al. (2007) stellten aufgrund dieser Tatsachen die Hypothese auf, dass

YbhO zu der CL-Synthese in der stationären Wachstumsphase beiträgt, da das CL-

Niveau auch in einem ∆cls-Stamm in dieser Wachstumsphase ansteigt, obwohl die

cls-kodierte CL-Synthase nicht vorhanden ist. Daher sollte die Kopfgruppenzusam-

mensetzung der Phospholipide des ∆cls ∆ybhO Stamms DG10 mittels 32P-Mar-

kierung unter verschiedenen K+-Konzentrationen bestimmt werden, um die Ursache

für den restlichen Anteil von CL in einem Stamm mit einer cls-Deletion aufzuklären

(wie für WC3899 in Kapitel 3.3.1 gezeigt).

Die Stämme WC3899 und DG10 wurden in Minimalmedien mit verschiedenen K+-

Konzentrationen und 32P-Orthophosphat angezogen und die totale Lipidzusammen-

setzung nach kontinuierlichem Wachstum wie unter 2.5.11-13 bestimmt. Die Zusam-

mensetzung der Phospholipide dieser Stämme ist in Tabelle 3.6 dargestellt.

Tab. 3.6: Zusammensetzung der Kopfgruppen der E. coli Stämme, die eine Mutation in Genen, welche für Enzyme zur CL-Synthese kodieren, aufweisen.

Relevanter Genotyp Kopfgruppengehalt [%] in K0.1 Stamm

Wachstums-phase

PE PG CL

Exponentiell 74.1 25.0 0.9 WC3899 cls::TcR Stationär 72.2 26.4 1.4

Exponentiell 78.1 21.4 0.5 DG10 cls::TcR ybhO::KnR Stationär 71.5 23.5 5.0

Die Zusammensetzung der Kopfgruppen ist angegeben in Prozent und wurde wie unter 2.5.11-13 beschrieben bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen.

Es konnte neben dem restlichen Anteil von CL auch ein Anstieg des CL-Niveaus in

der stationären Wachstumsphase in beiden Stämmen detektiert werden (Tabelle

3.6). Dieses war unabhängig von der K+-Konzentration im Medium. Während den

Versuchen zeigte sich, dass die Werte für die jeweilige Kopfgruppe in K0.1 und K115

gleich waren. Daher wurden die Prozente aus den beiden Minimalmedien zusam-

mengefasst und gemeinsam ausgewertet. Der CL-Gehalt in dem ∆cls ∆ybhO Stamm

DG10 steigt von 0.5 % auf 5 % des totalen Phospholipidgehaltes an. Bei dem Stamm

DG10 fällt auf, dass in der stationären Phase der CL-Gehalt nicht durch PG-

Abnahme sondern durch die PE-Abnahme erfolgt. In dem Stamm WC3899 (ybhO+)

steigt hingegen der CL-Gehalt nur von 0.9 % auf 1.4 % an, weshalb das Produkt des

ybhO-Gens nicht alleine für die CL-Synthese in der stationären Wachstumsphase

verantwortlich sein kann.

3. Ergebnisse

58

3.6. Überprüfung eines gemeinsamen kch-cls Transkripts

Bei der Betrachtung der Lage des cls-Gens im Chromosom fiel auf, dass direkt

neben dem cls-Gen das kch-Gen lokalisiert ist. Das kch-Gen kodiert für einen funk-

tionalen K+-Kanal (Kuo et al., 2003). Dies ist erwähnenswert, da zytoplasmatisches

K+ eine Rolle für die cls-Expression und für die Aktivität der CL-Synthase spielt.

Obwohl diese zwei Gene vor ihrem Transkriptionsstart eine eigene Promotorsequenz

haben, wäre es denkbar, dass sie ebenfalls gemeinsam über ein kch-cls mRNA

Transkript exprimiert und/oder reguliert werden. Dem cls-Gen geht eine Shine-

Dalgarno-Sequenz und ein σ70-Promotor voraus (Ivanisevic et al., 1995). Es wird

vermutet, dass das kch-Gen über einen wahrscheinlich σ54-abhängigen Promotor

exprimiert wird, der durch Computeranalyse identifiziert wurde (Reitzer & Schneider,

2001). Jedoch ist der Abstand zwischen der vermeintlich σ54 bindenden Stelle und

dem Translationsstart für kch mit 264 bp größer als für alle anderen bekannten σ54-

abhängigen Promotoren, die Abstände zwischen 34 und 136 bp aufweisen (Reitzer &

Schneider, 2001). Dieser potentielle σ54-Promotor war nicht in der Lage kch zu über-

exprimieren, wodurch es nicht möglich war, die Funktion von Kch genauer zu unter-

suchen (Kuo et al., 2003). Es wäre trotzdem denkbar, dass zusätzlich beide Gene

gemeinsam über ein Transkript exprimiert und evtl. auch gemeinsam reguliert

werden, da für beide Genprodukte K+ eine entscheidende Rolle spielt (Abb. 3.7).

Abb. 3.7: Schema einer möglichen, gemeinsamen Trans kription von kch und cls. P: Promotor.

Um eine gemeinsame Expression der beiden Gene nachzuweisen, wurde eine

Reverse Transkriptase PCR durchgeführt. Dafür wurde zunächst, wie in 2.4.10-11

beschrieben, RNA aus Zellen von E. coli K12 isoliert und mittels eines Reversen

3. Ergebnisse

59

Transkriptase-Enzyms cDNA hergestellt. Die cDNA wurde als Matrize für die

Expressionsstudie eingesetzt. Die Konstruktion der verwendeten Primer ist in

Abbildung 3.8A schematisch dargestellt.

Abb. 3.8: Überprüfung eines gemeinsamen Transkripts von kch und cls. A) Primerdesign. B) Agarosegel der Reversen Transkriptase PCR. Die Ergebnisse sind exemplarisch von drei voneinander unabhängigen Messungen dargestellt.

Wie in Abbildung 3.8B zu sehen ist, konnte nur bei der Kontrolle mit chromosomaler

DNA eine Bande der passenden Größe (421 bp) detektiert werden (Spur 2). Dies

zeigt, dass die konstruierten Primer an die DNA binden und ein Produkt der beiden

auf dem Chromosom benachbarten Gene wie erwartet möglich ist. Bei der

synthetisierten cDNA konnte jedoch keine Bande der entsprechenden Größe

detektiert werden, was darauf zurückzuführen ist, dass kein gemeinsames Transkript

beider Gene in den Zellen vorhanden war (Spur 3 - 4). Diese Beobachtung war

unabhängig davon, ob kdpFABC-induzierende oder nicht-kdpFABC-induzierende

Bedingungen vorlagen. Um zu überprüfen, ob wirklich cDNA synthetisiert wurde,

wurde als Kontrolle ein Primerpaar für das „housekeeping“–Gen gapA verwendet,

welches kontinuierlich exprimiert wird und folglich ein mRNA-Transkript nachweisbar

ist. Hier zeigte sich, dass intakte cDNA vorhanden war, da eine Bande in der

entsprechenden Größe (200 bp) detektiert werden konnte (Spur 7 - 8).

A) B)

3. Ergebnisse

60

3.7. Einfluss der Zusammensetzung der Zytoplasmamem bran auf das Kdp-System

3.7.1. Kinaseaktivität von KdpD-6His in Membran-Lip id-Fusionen

Stallkamp et al. (1999) konnten zeigen, dass die Aktivierung der Sensorkinase KdpD

durch die Anwesenheit von 50 % anionischer Phospholipide in Liposomen beein-

flusst werden kann. Dieser Einfluss sollte genauer untersucht werden, indem die

Menge an negativ geladenen Phospholipiden variiert wurde. Da in invertierten Mem-

branvesikel von TRK2000 / pKJ2-6His mit [γ-32P]-ATP Kinaseaktivität von KdpD-6His

gemessen werden kann, sollte auf dieser Ebene die Autophosphorylierung von KdpD

untersucht werden, um das Protein in seiner nativen Membranumgebung zu be-

lassen.

Zunächst wurden die „Lipid-Stämme“ mit einer veränderten nativen Phospholipid-

zusammensetzung mit dem Plasmid pKJ2-6His transformiert. Anschließend wurden

Membranvesikel präpariert, um mit diesen eine Aussage über den Einfluss des

Anteils an anionischen Phospholipiden auf die Kinaseaktivität treffen zu können. Es

konnte für die Stämme UE54 / pKJ2-6His (100 % PE), WC3899 / pKJ2-6His (75 %

PE, 24 % PG, 1 % CL) und HDL1001 / pKJ2-6His (mit 1 mM IPTG: 82 % PE, 14 %

PG, 4 % CL bzw. ohne IPTG: 96 % PE, 3 % PG, 1 % CL) allerdings keine Kinase-

aktivität von KdpD-His6 gemessen werden (Daten nicht gezeigt). Dieses ist

vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Stämme nicht atp- sind und somit das

radioaktiv-markierte ATP über die ATPase abgebaut werden kann.

Daraufhin wurden die Membranvesikel von TRK2000/pKJ2-6His, in denen Kinase-

aktivitäten gemessen werden konnten, in verschiedenen Verhältnissen mit Lipo-

somen aus synthetischen Lipiden (50% PE / 50% PC oder 100% CL) gemischt, um

den Anteil an anionischen Phospholipiden zu variieren. Diese Methode wurde bereits

für andere Proteine angewandt (Özcan et al., 2007). Ein Vorteil dabei ist, dass das

Protein in seiner natürlichen Membranumgebung bleibt und nicht durch die

Reinigung und anschließende Rekonstitution möglicherweise funktionell beein-

trächtigt wird.

Mit einem Immunoblot wurde überprüft, dass vergleichbare KdpD-Proteinmengen bei

allen Fusionen von Membranvesikeln mit synthetischen Liposomen eingesetzt

wurden. In den Autoradiogrammen waren neben dem phosphorylierten KdpD-His6

Monomer (KdpD-6His~P) auch das phosphorylierte Dimer und andere phos-

3. Ergebnisse

61

phorylierte Proteine zu sehen (Daten nicht gezeigt). Die Quantifizierung der

Phosphorylierung von KdpD erfolgte anhand der dem Monomer zugeordneten

Banden.

Abb. 3.9: Kinaseaktivitäten von KdpD-6His in invertierten Mem branvesikeln fusioniert mit synthetischen Liposomen bestehend aus CL oder P E / PC. Nach 5 min wurde die Phosphorylierung wie in 2.5.10 beschrieben gestoppt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die Menge an KdpD~P wurde mit einem Phosphoimager und einem [γ-32P]ATP-Standard quantifiziert. Die Aktivitäten wurden von mindestens sechs verschiedenen Messungen gemittelt. Die statistische Standardabweichung lag unter 0.1 pmol.

Die Kinaseaktivität von WT-KdpD in den verschiedenen Fusionen von Membran-

vesikeln und synthetischen Liposomen in Abbildung 3.9 zeigte, dass bei Zugabe von

anionischen Liposomen (CL) die Phosphorylierung von KdpD konstant bleibt,

während bei Zugabe derselben Menge von zwitterionischen Liposomen (PE / PC) die

Phosphorylierungsrate abnimmt. Bei der Fusion mit Liposomen bestehend aus E. coli

„total lipid extract“, wurden wie bei PE / PC Zugabe vergleichbare Kinaseaktivitäten

gemessen (Daten nicht gezeigt). Mit dieser Kontrolle sollte überprüft werden, ob

auch die Krümmung der fusionierten Vesikel eine Bedeutung für die Aktivität der

Sensorkinase KdpD hat, da die Vesikel nach der Fusionierung nicht mehr extrudiert

wurden. Sowohl bei Fusion mit synthetischen Liposomen aus PE / PC als auch bei

MV + CL + PE/PC

3. Ergebnisse

62

der Fusion mit Liposomen aus E. coli Lipidextrakt nahm die Phosphorylierung von

KdpD mit steigendem Anteil an Liposomen ab.

3.7.2. Kinaseaktivität von KdpD-Derivaten in Membra n-Lipid-Fusionen

Da in dem Kapitel 3.7.1 gezeigt werden konnte, dass die Kinaseaktivität von WT-

KdpD in den verschiedenen Fusionen von Membranvesikeln und synthetischen

Liposomen bei Zugabe von anionischen Liposomen (CL) konstant bleibt, während

bei Zugabe von zwitterionischen Liposomen (PE / PC) die Phosphorylierungsrate

abnimmt, wurden auch Derivate von KdpD mit einem veränderten Phänotyp in Bezug

auf die kdpFABC-Expression untersucht.

Von dem Stamm TRK2000 wurden nach Transformation mit dem Plasmid pBD5-

9/E509K bzw. pBD/∆Arg1 Membranvesikel präpariert und die Kinaseaktivitäten der

KdpD-Derivate KdpD/E509K bzw. KdpD/∆Arg1 bei verschiedenen Fusionen mit

synthetischen Liposomen gemessen.

Abb. 3.10: Kinaseaktivitäten von KdpD/E509K in invertierten Me mbranvesikeln fusioniert mit synthetischen Liposomen bestehend au s CL oder PE / PC. Nach 5 min wurde die Phosphorylierung wie in 2.5.10 beschrieben gestoppt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die Menge an KdpD~P wurde mit einem Phosphoimager und einem [γ-32P]ATP-Standard quantifiziert. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen.

MV + CL + PE/PC

3. Ergebnisse

63

Die semi-konstitutive Mutante KdpD/E509K zeigte eine geringere Aktivität im

Vergleich zum Wildtyp-KdpD, aber eine ähnliche Tendenz bei Zugabe von

synthetischen Liposomen. Die Zugabe von anionischen Liposomen führte ebenfalls

zu einem konstanteren Niveau der Kinaseaktivität (Abb. 3.10 vgl. Abb. 3.9). Die K+

insensitive Mutante KdpD/∆Arg1 wies keine Kinaseaktivität auf, unabhängig davon in

welchem Verhältnis synthetische Liposomen mit den Membranvesikeln fusioniert

wurden (Daten nicht gezeigt). Es konnten somit keine unterschiedlichen Einflüsse auf

die Phosphorylierung der Sensorkinase KdpD im Vergleich von Wildtyp und den

Derivaten in Abhängigkeit des Anteils der anionischen Phospholipide gezeigt

werden.

3.7.3. kdpFABC-Expression unter K +-Limitation in Abhängigkeit von der Lipid-

zusammensetzung

Basierend auf den bisher gezeigten Ergebnissen ist es vorstellbar, dass eine

Korrelation zwischen der Aktivität der membrangebundenen Sensorkinase KdpD und

der Zusammensetzung der Kopfgruppen existiert. Um diese Beziehung aufzuklären,

wurden „Lipid-Stämme“ mit einer veränderten nativen Zusammensetzung der Kopf-

gruppen auf die kdpFABC-Expression untersucht. Dafür wurden Zellen der jeweiligen

Stämme in Minimalmedien mit verschiedenen K+-Konzentrationen angezogen und

die RNA wie unter 2.4.10 beschrieben für die Q-RT-PCR extrahiert. Anschließend

wurde mittels einer Reversen Transkriptase aus der DNAse-verdauten RNA cDNA

hergestellt, welche als Matrize für die Q-RT-PCR eingesetzt wurde. Um die

kdpFABC-Expression zu ermitteln, wurde ein Primerpaar in kdpA und als Kontrolle

ein Primerpaar in gap benutzt. Das Produkt jeder PCR betrug 200 bp.

Diese Methode ermöglicht es, die kdpFABC-Expression direkter zu messen als im

Vergleich zu der bereits beschriebenen KdpFABC-Detektion mittels der Immunoblot-

Technik von ganzen Zellen (Stallkamp et al., 1999). Es wurden Proben von Zellen

unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen (0.1 mM K+) und nicht-kdpFABC-

induzierenden Bedingungen (115 mM K+) untersucht. Zuvor wurden die Primer,

welche für die Q-RT-PCR benutzt werden sollten, anhand isolierter chromosomaler

DNA aller untersuchten Stämme und dem Q-RT-PCR-Protokoll mittels einer

standardisierten PCR kontrolliert.

3. Ergebnisse

64

Tab. 3.7: Reaktion der kdpFABC-Expression unter K +-Limitation in verschiedenen E. coli Stämmen in Korrelation zu ihrer Zusammensetzung de r Kopfgruppen.

Stamm Relevanter Genotyp Kopfgruppengehalt [%] in K0.1

kdpFABC Induktions-verhältnis

IPTG CL PG CL + PG PE Minimal- medium

GM56- Medium

UE54 pgsA::KnR - 0.0 0.0 0.0 100.0 640 -

HDL1001 pgsA::KnR lacOP-pgsA - 1.1 2.7 3.8 96.2 365 -

HDL1001 pgsA::KnR lacOP-pgsA + 4.2 13.9 18.1 81.9 2005 -

WC3899 cls::TcR - 0.9 25.0 25.9 74.1 2028 -

K12 WT - 9.8 15.1 24.9 75.1 5870 909

AD93 pss93::KnR - 49.6 50.4 100.0 0.0 - 2325

Zellen wurden in K0.1 bzw. K115 oder in GM56-K0.1 bzw. GM56-K115 bis zur exponen-tiellen Wachstumsphase angezogen. Der Gehalt der Zusammensetzung der Kopfgruppen der Phospholipide wurde in Kapitel 3.3.1. genauer beschrieben. Die aufgelisteten Stämme sind in der Reihenfolge ihres Gehalts an anionischen Phospholipiden (PG und CL) ansteigend angeordnet. Die kdpFABC Induktionsverhältnisse wurden mittels Q-RT-PCR bestimmt. Die Induktionsverhältnisse wurden berechnet anhand der Division der Menge von normalisierter mRNA unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen (0.1 mM K+) durch die Menge unter nicht-kdpFABC-induzierenden Bedingungen (115 mM K+). Jeder Wert der Tabelle repräsentiert den Mittelwert von drei - sechs unabhängigen Messungen.

In Tabelle 3.7 sind die ermittelten Induktionsverhältnisse (K0.1 / K115) für die

kdpFABC-Expression der verschiedenen Stämme gezeigt. Anhand dieser Daten

kann die Menge der synthetisierten kdpFABC mRNA miteinander verglichen werden.

Der Stamm E. coli K12 (Wildtyp für die Gene der Phospholipidbiosynthese) zeigt ein

hohes Induktionsverhältnis, was bedeutet, dass unter K+-Limitation eine mehrere

tausendfache Induktion der kdpFABC-Expression stattfindet. Dieses wurde bereits

von Hamann et al. (2008) gezeigt. Um zu untersuchen, ob der CL-Gehalt bei der

Aktivierung der Signalkaskade, die zur kdpFABC-Expression führt, spezifisch

involviert ist, wurde der Stamm WC3899 im Hinblick auf die kdpFABC-Expression

untersucht, da dieser eine Deletion des cls-Gens aufweist, aber immer noch einen

restlichen Anteil von CL synthetisiert. Das Induktionsverhältnis dieses Stammes war

vergleichbar mit K12 im Hinblick der Größenordung, wie unter 2.4.12 beschrieben.

Um zu untersuchen, ob der Anteil von anionischen Phospholipiden einen Einfluss auf

die kdpFABC-Expression hat, wurden die E. coli Stämme HDL1001, UE54 und AD93

untersucht. Der Stamm HDL1001 hat das pgsA-Gen unter der Kontrolle eines

induzierbaren IPTG-Promoters und zeigt in Abwesenheit von IPTG (3.8 % PG/CL)

ein reduziertes Induktionsverhältnis für die kdpFABC-Expression. In Anwesenheit

3. Ergebnisse

65

von 1 mM IPTG, welches zu einem beinahe restaurierten PG- und CL-Gehalt führte,

konnte ein höheres Induktionsverhältnis in dem Bereich des Wildtypstammes K12

beobachtet werden. Des Weiteren wurde die kdpFABC-Expression unter K+-

Limitation des Stammes UE54, der eine Deletion des pgsA-Gen hat, was in einer

Membran ohne die anionischen Phospholipide PG und CL resultiert, untersucht.

Dieser Stamm zeigte ein niedriges Induktionsverhältnis für die kdpFABC-Expression

wie HDL1001 ohne IPTG, was den Einfluss des Gesamtanteils der anionischen

Phospholipide andeutet. Der Stamm AD93 ist aufgrund des Fehlens des zwitter-

ionischen Phospholipids PE das gegenteilige Extrem von UE54, was zu einer

Zytoplasmamembran bestehend aus 100 % anionischen Phospholipiden führt. Die

Q-RT-PCR Daten dieses Stammes zeigen ein 10-fach höheres Induktionsverhältnis

für die kdpFABC-Expression gemessen in GM56-Medium im Vergleich zu K12, was

ebenfalls den stimulierenden Einfluss der anionischen Phospholipide auf die

kdpFABC-Expression bestätigt. Für den Stamm C43(DE3) konnte mit einer ausge-

stülpten Zytoplasmamembran (C43(DE3) / pEcb1), was zu einem leichten CL-

Anstieg führte, ein höheres Induktionsverhältnis für die kdpFABC-Expression

beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

3.8. Einfluss von Procain auf die kdpFABC-Expression

3.8.1. Q-RT-PCR in „Lipid-Stämmen“

Des Weiteren sollte die Wirkung von Procain auf die kdpFABC-Expression in

Stämmen mit einer veränderten nativen Phospholipidzusammensetzung untersucht

werden. Procain lagert sich in die Zytoplasmamembran ein und bewirkt dadurch eine

Änderung der Membranspannung, welche möglicherweise von KdpD wahrge-

nommen wird. Procain könnte aber auch die Aktivität oder den Einbau der Sensor-

kinase KdpD bzw. des Transportkomplexes KdpFABC in die Zytoplasmamembran

beeinflussen.

In diesem Ansatz sollte die kdpFABC-Expression mit Hilfe von Q-RT-PCR in den

„Lipid-Stämmen“ mit einer veränderten nativen Phospholipidzusammensetzung und

chromosomal-kodiertem Wildtyp-kdpD ermittelt werden. Dafür wurden zunächst die

Stämme AD93 (∆PE), UE54 (∆PG∆CL), WC3899 (∆CL) und K12 (native Lipid-

zusammensetzung) in Minimalmedium mit 0.1 mM K+ bzw. 115 mM K+ angezogen.

Bei einer OD600 0.4 erfolgte die Zugabe von 20 mM Procain. Für die Q-RT-PCR

3. Ergebnisse

66

wurden jeweils zwei Werte (30 min und 60 min) nach Procain-Zugabe und als

Kontrolle ein Wert vor der Zugabe genommen. Die Q-RT-PCR für die Bestimmung

der kdpFABC-Expression wurde mit Primern im kdpA-Gen durchgeführt. Als

Kontrolle diente ein Primerpaar im „housekeeping“-Gen gapA, welches kontinuierlich

auf gleichem Niveau exprimiert wurde.

Tab. 3.8: Reaktion der kdpFABC-Expression in Abhängigkeit von Procain in verschiedenen E. coli Stämmen in Korrelation zu ihrer Zusammensetzung de r Kopf-gruppen.

Stamm Relevanter Genotyp

Kopfgruppengehalt [%] in K0.1

kdpFABC Induktions-verhältnis

[Procain / Kontrolle] CL PG PE K0.1 K115

UE54 pgsA::KnR 0.0 0.0 100.0 4.2 1.6

WC3899 cls::TcR 0.9 25.0 74.1 0.8 0.6

K12 WT 9.8 15.1 75.1 0.4 0.6

AD93 pss93::KnR 49.6 50.4 0.0 0.8 0.3

Die jeweiligen Zellen wurden in K0.1 oder in K115 bis zur exponentiellen Wachstumsphase angezogen und es erfolgte die Zugabe von 20 mM Procain. Der Gehalt der Zusammen-setzung der Kopfgruppen der Phospholipide wurde in Kapitel 3.3.1 genauer beschrieben. Die aufgelisteten Stämme sind in der Reihenfolge ihres Gehalts an anionischen Phospholipiden (PG und CL) ansteigend angeordnet. Die kdpFABC-Induktionsverhältnisse wurden mittels Q-RT-PCR bestimmt. Die Induktionsverhältnisse wurden anhand der Division der Menge von normalisierter mRNA 60 min nach Procain-Zugabe durch die Menge vor der Procain-Zugabe berechnet. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zwei voneinander unabhängigen Messungen. Es konnte für den Stamm UE54, dessen Zellhülle keine anionischen Phospholipide

aufweist, ein signifikanter Einfluss von Procain auf die kdpFABC-Expression in Ab-

hängigkeit der K+-Konzentration beobachtet werden (Tabelle 3.8). Dieser Stamm hat

im Vergleich zum Wildtypstamm K12 unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen

bei Zugabe von Procain ein 10-fach höheres Induktionsverhältnis. Des Weiteren kam

es zu einem geringeren Induktionsverhältnis unter nicht-kdpFABC-induzierenden

Bedingungen als im Vergleich zu kdpFABC-induzierenden Bedingungen. Sowohl für

den Wildtypstamm K12 als auch für die „Lipid-Stämme“ WC3899 und AD93 wurde

hingegen kein Einfluss von Procain ermittelt. Das jeweilige Induktionsverhältnis

(Procain / Kontrolle) dieser drei Stämme betrug in etwa 1. Das bedeutet, dass durch

die Zugabe von 20 mM Procain weder ein Anstieg noch eine Abnahme der durch

WT-KdpD ausgelösten kdpFABC-Expression hervorgerufen wurde. Diese Beob-

achtung war unabhängig davon, ob bei der Procainzugabe kdpFABC-induzierende

oder nicht-kdpFABC-induzierende Bedingungen vorlagen.

3. Ergebnisse

67

3.8.2. ββββ-Galaktosidase-Aktivitäten von KdpD-Derivaten

In einem weiteren Versuch sollte der Einfluss von Procain auf KdpD-Derivate, die

einen veränderten Phänotyp in Bezug auf die kdpFABC-Expression unter K+-

Limitation aufweisen (wie z.B. KdpD/1-395, KdpD/∆Arg1, KdpD/∆TM1-4), untersucht

werden. Dazu wurde der E. coli Stamm HAK006 (PkdpFABC::lacZ ∆kdpD161-726) mit

den entsprechenden Plasmiden transformiert, um dann die β-Galaktosidase-Aktivi-

täten als indirektes Maß der kdpFABC-Expression bei An- und Abwesenheit von Pro-

cain unter kdpFABC-induzierenden und nicht-kdpFABC-induzierenden Bedingungen

vergleichen zu können. Die Zusammensetzung der Phospholipide des E. coli

Stammes HAK006 wurde in 3.2.1 gezeigt, bei der kein Unterschied zwischen den

Medien K0.1 und K115 ermittelt wurde.

Abb. 3.11: Induktion der kdpFABC-Expression durch die Zugabe von 20 mM Procain. Dargestellt sind die Mittelwerte der β-Galaktosidase-Aktivitäten aus drei voneinander unab-hängigen Messungen im E. coli Stamm HAK006 (PkdpFABC::lacZ ∆kdpD161-726) mit den Plasmiden pBD, pBD/1-395, pBD/∆TM1-4 bzw. pBD/∆Arg1. Von jedem KdpD-Derivat wurde sowohl der Wert vor der Zugabe von Procain (grüne Balken), 30 min nach Induktion (hellblau) und 60 min nach Induktion (dunkelblau) dargestellt. Das Diagramm A zeigt die β-Galaktosidase-Aktivitäten unter kdpFABC-induzierenden und B unter nicht-kdpFABC-induzierenden Bedingungen.

Kontrolle 30 min 60 min

A) B)

3. Ergebnisse

68

Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von 20 mM Procain die kdpFABC-

Expression der semi-konstitutiven Mutanten KdpD/1-395 und KdpD/∆TM1-4 signi-

fikant beeinflusst (Abb. 3.11). Unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen stieg die

kdpFABC-Expression dieser KdpD-Derivate durch die Zugabe von Procain an (Abb.

3.11A). Die K+ insensitive Mutante KdpD/∆Arg1 hingegen induzierte auch durch die

Zugabe von Procain keine signifikante kdpFABC-Expression, da die Werte der β-

Galaktosidase-Aktivitäten um 5 Miller units lagen, unabhängig ob kdpFABC-indu-

zierende oder nicht-kdpFABC-induzierende Bedingungen vorlagen. Die Expression

des Wildtyp-KdpD wurde unabhängig ob kdpFABC-induzierende oder nicht-

kdpFABC-induzierende Bedingungen vorlagen ebenfalls durch die Einlagerung von

Procain in die Membran nicht signifkant beeinträchtigt. Des Weiteren führte Procain

dazu, dass die bereits vorhandene kdpFABC-Expression der semi-konstitutiven

Mutanten KdpD/1-395 und KdpD/∆TM1-4 in Minimalmedium mit 115 mM K+ ebenfalls

anstieg (Abb. 3.11B). Somit wurde für KdpD-Proteine mit einem semi-konstitutiven

Phänotyp eine Steigerung der Aktivität von KdpD in Abhängigkeit der Anwesenheit

von Procain in der Membran beobachtet.

3.9. Suche nach Kontaktstellen von KdpD mit Phospho lipiden der Zytoplasmamembran

Für die Untersuchung der Interaktion von Phospholipiden mit der Sensorkinase KdpD

wurde eine Co-Reinigung durchgeführt. Dazu wurden Zellen des Stammes

TKR2000/pKJ2-6His in Vollmedium angezogen, invertierte Membranvesikel

präpariert und KdpD-6His wie unter 2.5.6 beschrieben gereinigt. Als Detergenz für

die Solubilisierung des membrangebundenen Proteins wurde LDAO verwendet.

Anschließend wurden die Phospholipide mittels einer Chloroform-Methanol-

Extraktion (wie unter 2.5.11 beschrieben) vom solubilisierten Protein entfernt. Das

Extrakt wurde auf eine DC-Platte aufgetragen, um die Phospholipide mit einem

speziellen Laufmittel aufzutrennen und schließlich mit Molybdänblau anzufärben. Um

die Phospholipide identifizieren zu können, wurde als Kontrolle ein synthetisches

Gemisch aus PE, PG und CL ebenfalls auf die DC-Platte aufgetragen.

Wie in der Abbildung 3.12 zu erkennen ist, reicht die eingesetzte Menge von

gereinigtem KdpD nicht aus, um die prozentuale Verteilung der Phospholipide genau

bestimmen zu können. Es wurde eine ähnliche Verteilung der Phospholipide im

3. Ergebnisse

69

Vergleich zur natürlichen Phospholipidzusammensetzung der Zellhülle von E. coli

(75 % PE, 20 % PG, 5 % CL) abgeschätzt, wobei bei diesem Nachweis der Spot für

CL kaum sichtbar war und nur mit Hilfe der Software „Image Quant“ quantifiziert

werden konnte.

Abb. 3.12: Biochemischer Nachweis der Phospholipidv erteilung von gereinigtem KdpD-6His. Solubilisiertes KdpD wurde einer Lipid-Extraktion unterzogen und die Lipide anschließend mittels 1-dimensionaler Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Als Kon-trolle wurde ein Gemisch synthetischer Phospholipide aufgetragen.

Um die Kontaktstellen von KdpD mit der Membran genauer charakterisieren zu

können, musste KdpD-6His zunächst funktionell rekonstituiert werden. Zur Ermittlung

einer Wechselwirkung mit einem bestimmten Typ der verschiedenen Phospholipide,

wurden Leerliposomen aus den einzelnen Typen der Phospholipide hergestellt. Um

den Anteil der jeweiligen Phospholipide zu variieren, wurden Leerliposomen mit

verschiedenen Kombinationen von anionischen und zwitterionischen Phospholipiden

synthetisiert. Nachdem KdpD-6His wie unter 2.5.5-6 beschrieben gereinigt wurde,

erfolgte die Rekonstitution wie unter 2.5.7 beschrieben nach dem Protokoll von Jung

et al. (1997). Anschließend wurde mittels Phosphorylierung mit [γ−32P] ATP (siehe

2.5.10) überprüft, ob das Protein KdpD-6His funktionell war. Zur Bestätigung, dass

der Kinaseaktivitätstest korrekt durchgeführt wurde, wurden als Kontrolle die

verwendeten Membranvesikel von TRK2000/pKJ2-6His getestet (Abb. 3.13).

Synthetische Lipid e von Lipide von 2.5 mg gereinigtem KdpD

3. Ergebnisse

70

Abb. 3.13: Autoradiogramm der Kinaseaktivitäten. Als Kontrolle wurden Membranvesikel von TRK2000/pKJ2-6His und als Proteoliposomen mit rekonstituiertem KdpD-6His nach der Methode von Jung et al. (1997) exemplarisch Liposomen aus 100% synthetischem CL dargestellt.

Es konnte allerdings nur bei der Kontrolle eine Phosphorylierung von KdpD detektiert

werden. Nach der Rekonstitution von KdpD-His6 konnte in allen Proteoliposomen

unabhängig von der Lipidzusammensetzung der Liposomen keine Kinaseaktivität

gemessen werden (Abb. 3.13). In Kapitel 3.7.1 konnte bereits gezeigt werden, dass

KdpD-6His in seiner natürlichen Membranumgebung aktiv war. Da unklar war, ob die

nicht vorhandene Kinaseaktivität der rekonstituierten Sensorkinase KdpD auf die

verwendeten Liposomen oder die Rekonstitutionsmethode zurückzuführen war,

wurden zunächst die hergestellten Leerliposomen überprüft. Die richtige Formation

der Liposomen konnte mittels DiSC3-Fluorimeter-Messung bestätigt werden (Daten

nicht gezeigt). Für weitere Versuche wurden dann Liposomen verwendet, die aus

E. coli : EggPC im Verhältnis 3:1 bestehen. Diese Liposomen wurden ebenfalls auf

ihre richtige Formation überprüft. Des Weiteren war es möglich, in diese ein

gewünschtes Zielprotein so zu rekonstituieren, dass es funktionell war (Hänelt, pers.

Mitteilung). Damit sollte ausgeschlossen werden, dass die synthetischen Liposomen

einen möglicherweise negativen Einfluss auf die Funktionalität von KdpD haben. Die

Rekonstitution in diese Liposomen erfolgte zunächst wieder nach dem Protokoll von

Jung et al. (1997). Auch mit diesen Liposomen konnte für KdpD-6His keine Aktivität

gemessen werden (Daten nicht gezeigt). Daraufhin wurden weitere Bedingungen für

die Rekonstitution getestet, um ein funktionelles Protein zu erhalten. Es wurde

3. Ergebnisse

71

A) B)

zunächst ein Protokoll für die Rekonstitution von KdpD-6His angewandt, das für viele

Membranproteine benutzt wird (Knol et al., 1998). Zur Abschätzung der Einbaurate

von KdpD-6His in die Liposomen wurde ein Coomassie-Gel angefertigt. Auf dem mit

Coomassie gefärbten SDS-Gel konnte im Vergleich zum gereinigten KdpD-Protein

nur eine Einbaurate von 0 – 10 % des KdpD-6His in die E. coli : EggPC Liposomen

(3:1) ermittelt werden (Abb. 3.14 B), während nach der Standardmethode für KdpD

von Jung et al. (1997) circa 50 % KdpD-6His in die Liposomen eingebaut zu sein

schien (Abb. 3.14 A).

Abb. 3.14: Coomassie-Gele zur Bestimmung der Einbau rate bei der Rekonstitution von KdpD-His6. Aufgetragen wurde dieselbe Proteinmenge sowohl von gereinigtem als auch von rekonstituiertem Protein nach der Methode von A: Jung et al. (1997) und B: Knol et al. (1998). Die Ergebnisse repräsentieren exemplarisch die Einbauraten von voneinander unabhängigen Versuchsansätzen mit verschiedenen Liposomen.

Das in die E. coli : EggPC Liposomen (3:1) rekonstituierte KdpD-6His wurde einem

Kinaseaktivitätstest unterzogen. Es konnte aber kein phosphoryliertes KdpD detek-

tiert werden (Daten nicht gezeigt). Mit dieser Methode war parallel ein anderes Mem-

branprotein rekonstituiert worden, welches eine bessere Einbaurate (80 %) und vor

allem seine Funktionalität nach der Rekonstitution aufzeigte (Hänelt, pers. Mit-

teilung). Es ist möglich, dass KdpD-6His nicht korrekt in die Membran der Liposomen

eingebaut wurde oder dass das Protein bereits nach der Reinigung nicht mehr aktiv

war. Dies würde den völligen Kinaseaktivitätsverlust erklären. Da auch die Wieder-

holung dieser Rekonstitutionsmethode kein funktionelles KdpD Protein nach der

Rekonstitution brachte, wurde eine alternative Rekonstitutionsmethode durch Ver-

dünnen des Detergenz unter die CMC direkt nach der Reinigung von KdpD-6His

3. Ergebnisse

72

nach dem Protokoll von Heuberger et al. (2001) durchgeführt. Das Coomassie-Gel

und der Immunoblot mit einem Antikörper gegen KdpD zeigten jedoch, dass die

Effizienz der Reinigung von KdpD-6His schlechter als gewöhnlich (ohne Detergenz-

wechsel von DDM zu OG) war (Daten nicht gezeigt). Die Einbaurate von KdpD in die

Liposomen lag mit dieser Methode bei 0 - 10 % und es konnte ebenfalls keine

Phosphorylierung von KdpD detektiert werden (Daten nicht gezeigt).

Für die beiden neu getesteten Rekonstitutionsmethoden wurde auch überprüft, ob

ein Verlust des Proteins beim Extrudieren für die Herstellung uniformer Proteolipo-

somen durch eine unspezifische Anlagerung des Proteins an dem Polycarbonat-

Filter stattfand, da folglich das Protein möglicherweise falsch in oder nur an die

Membran der Liposomen assoziiert war. Der Kinaseaktivitätstest zeigte jedoch, dass

auch ohne das Extrudieren keine Phosphorylierung mit den oben beschriebenen

Rekonstitutionsmethoden ermittelt werden konnte (Daten nicht gezeigt).

3.10. Novobiocin-Resistenz in Abhängigkeit von KdpD Es konnte gezeigt werden, dass ein kdp- Stamm im Gegensatz zu einem kdp+

Stamm eine erhöhte Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Novobiocin hat (Zhou et

al., 2003). Des Weiteren wurde das cls-Gen früher auch als nov-Gen bezeichnet, da

ein ∆cls Stamm sensitiver als ein cls+ Stamm gegenüber Novobiocin ist (Tropp et al.,

1995). Aufgrund dieser beiden Beobachtungen sollte der Zusammenhang genauer

untersucht werden. Dazu sollte die Resistenz gegenüber Novobiocin eines kdp+

Stammes mit der eines kdp- Stammes unter kdpFABC-induzierenden und nicht-

kdpFABC-induzierenden Bedingungen verglichen werden. Der Antibiotikatest von

Zhou et al. (2003) erfolgte nur in Vollmedium, also unter nicht-kdpFABC-indu-

zierenden Bedingungen. Das bedeutet für den in diesem Versuch verwendeten kdp+

Stamm, dass kein KdpFABC-Komplex synthetisiert wird und KdpD / KdpE nur in

geringen Mengen in der Zelle vorkommt, während im kdp- Stamm sowohl kein

KdpFABC als auch kein KdpD / KdpE gebildet wird. Da bei dem in der Literatur

beschriebenen Versuch allerdings ein Unterschied in der Novobiocin-Resistenz

zwischen den beiden Stämmen beschrieben wurde, müsste die Resistenz gegenüber

Novobiocin mit der membrangebundenen Sensorkinase KdpD zusammenhängen.

Folglich wurden die „Kalium-Stämme“ TK2240 und TKV2208 getestet, da beide

Stämme aufgrund der Abwesenheit der niedrig affinen K+-Aufnahmesysteme Trk und

3. Ergebnisse

73

Kup unter niedrigen K+-Konzentrationen K+-Ionen nur über den KdpFABC-Trans-

porter aufnehmen können. Der Stamm TK2240 weist chromosomal alle Gene des

gesamten kdpFABCDE-Regulons auf, während der Stamm TKV2208 (kdpFABC+

kdpE+) eine Teildeletion des kdpD-Gens aufweist. Es ist allerdings möglich, das

chromosomal kodierte Kdp-System in TKV2208 zu komplementieren, wenn der

Stamm mit dem Plasmid pBD, welches das kdpD-Gen kodiert, transformiert wird.

Anschließend ist der Stamm ebenfalls wie TK2240 in der Lage, auf niedrigen K+-

Konzentrationen zu wachsen, indem dieser K+-Ionen über das intakte Kdp-System

aufnehmen kann. Die Stämme wurden über Nacht in den verschiedenen Minimal-

medien angezogen und anschließend so verdünnt, dass wie unter 2.3.2 beschrieben

auf jeder Agarplatte die gleiche Gesamtzellzahl ausplattiert wurde.

Abb. 3.15: Resistenz gegenüber Novobiocin in Abhäng igkeit von KdpD. Dargestellt ist die prozentuale Lebendzellzahl auf K0.1- (Linien) und K115-Agarplatten (gestrichelte Linien) mit verschiedenen Novobiocin-Konzentrationen von drei voneinander unabhängigen Experimenten. Die Farben stellen die Stämme TK2240 (blau), TKV2208 (rot) und TKV2208/pBD (grün) dar. Die Lebendzellzahl auf Agarplatten ohne Novobiocin wurde als 100 % definiert.

Die prozentualen Lebendzellzahlen der Stämme TK2240 und TKV2208 mit und ohne

pBD sind in Abbildung 3.15 dargestellt. Das Wachstum auf hohen Novobiocin-Kon-

zentrationen scheint abhängig von der Anwesenheit eines intakten KdpFABCDE-

Systems zu sein, da der Stamm TK2240 (kdp+) im Vergleich zu dem Stamm

TKV2208 (kdpD-) unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen auf höheren Novo-

biocin-Konzentrationen (500 µg/ml) wächst. Der Stamm TKV2208 (kdpD-) kann nur

lebe

nde

Zel

len

[%]

3. Ergebnisse

74

unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen auf 500 µg/ml Novobiocin wachsen,

wenn das chromosomal kodierte Kdp-System durch ein plasmid-kodiertes kdpD-Gen

komplementiert wird.

Da diese Ergebisse jedoch widersprüchlich zu Zhou et al. (2003) waren, wurde

ebenfalls untersucht, ob die Resistenz gegenüber Novobiocin von der Proteinmenge

der Sensorkinase KdpD oder der Synthese des KdpFABC-Komplexes abhängig ist.

Dazu wurde der Stamm HAK006 (∆kdpFABC ∆kdpD161-726) mit dem Stamm TKV2208

(∆kdpD128-894) verglichen. Beide Stämme können durch Transformation mit dem

Plasmid pBD WT-KdpD synthetisieren und weisen dadurch ein intaktes KdpD / KdpE

Zweikomponentensystem auf. Allerdings wird im TKV2208 (trk-) bei Wachstum auf

K0.1-Agarplatten der KdpFABC-Komplex synthetisiert, um K+-Ionen aufnehmen zu

können, während im HAK006 bei Wachstum auf K0.1-Agarplatten nur die Trk-

Systeme K+-Ionen aufnehmen können, da kein KdpFABC-Komplex synthetisiert

werden kann.

Der Stamm HAK006 und der Stamm HAK006/pBD wurden über Nacht in den

verschiedenen Minimalmedien angezogen und anschließend so verdünnt, dass auf

jeder Agarplatte die gleiche Gesamtzellzahl ausplattiert wurde. Die Lebendzellzahl

bei verschiedenen Novobiocin-Konzentrationen wurde mit den Ergebnissen der

vorher getesteten Stämme TK2240, TKV2208 und TKV2208/pBD verglichen.

Tab. 3.9: Resistenz gegenüber Novobiocin in Abhängi gkeit von KdpFABC unter K +-Limitation.

Dargestellt ist die prozentuale Lebendzellzahl auf K0.1- Agarplatten mit verschiedenen Novobiocin-Konzentrationen von drei voneinander unabhängigen Experimenten. Die Symbole bedeuten: - = 0 % LZZ von 0 µg/ml Antibiotikum, + = 1 – 40 % LZZ von 0 µg/ml Antibiotikum, ++ = 41 – 70 % LZZ von 0 µg/ml Antibiotikum und +++ = 71 – 100 % LZZ von 0 µg/ml Antibiotikum.

Novobiocin [µg/ml]

Stamm

Genotyp 0 12.5 100 200 300 500

TK2240 kdp+ trk- +++ +++ +++ +++ +++ ++

TKV2208 kdpD- trk- +++ +++ +++ ++ + -

TKV2208/pBD kdp+ trk- +++ +++ +++ +++ +++ ++

TK2281 kdp- trk- - - - - - -

HAK006 kdp- trk+ +++ +++ +++ +++ ++ -

HAK006/pBD kdp- trk+ +++ +++ +++ +++ ++ -

3. Ergebnisse

75

Der Stamm HAK006 zeigt nach Transformation mit pBD keine Erhöhung der

Resistenz gegenüber Novobiocin (Tabelle 3.9). Dieses ist gegensätzlich zum

TKV2208/pBD, der eine Erhöhung der Novobiocin-Resistenz unter kdpFABC-indu-

zierenden Bedingungen aufweist. Folglich scheint ein intaktes KdpFABCDE-System

bzw. speziell die Synthese von KdpFABC eine Rolle bei der Novobiocin-Resistenz zu

spielen. Diese Beobachtung widerspricht der von Zhou et al. (2003) aufgestellten

Behauptung, dass ein kdp- Stamm im Gegensatz zu einem kdp+ Stamm eine erhöhte

Resistenz gegenüber Novobiocin aufweist.

Die Beobachtungen der Novobiocin-Resistenz in Abhängigkeit des Kdp-Systems

scheinen spezifisch für Novobiocin zu sein, da bei Erythromycin, einem anderen Anti-

biotikum, das ebenfalls durch das „multi-drug“ Effluxsystem AcrAB aus der Zelle

geschleust wird, kein Unterschied bei dem Wachstum auf verschiedenen Erythro-

mycin-Konzentrationen zwischen den Stämmen TK2240 und TKV2208 ermittelt

werden konnte (Daten nicht gezeigt). Des Weiteren konnte ein Wachstum der

Stämme nur bei Konzentrationen von unter 100 µg/ml Erythromycin beobachtet

werden.

4. Diskussion

76

4. Diskussion

4.1. Einfluss der Lipidzusammensetzung auf das Kdp- System

Es ist bekannt, dass die Lipidzusammensetzung der Zytoplasmamembran von

Bakterien mit der Osmolalität im Medium und mit der Wachstumsphase variiert. In

E. coli steigt der CL-Gehalt auf Kosten von PE in der exponentiellen Wachstums-

phase in Medium mit hoher Osmolalität unabhängig vom Osmolyt um das 2-3 fache

an (Tsatskis et al., 2005). In der stationären Wachstumsphase hingegen steigt der

CL-Gehalt auf Kosten von PG um das 2-3 fache an (Cronan, 1968; Randle et al.,

1969). Hierbei kommt es zu keinem Nettoanstieg des anionischen Phospholipid-

gehaltes. Allerdings ist der Abbau von CL langsamer als der von PG (Kanemasa et

al., 1967), was zu der Vermutung führt, dass CL in wachsenden E. coli Zellen stabiler

ist als PG. Dies bezüglich wurde von Cronan (1968) vorgeschlagen, dass eine solche

Änderung in dem Anteil der anionischen Phospholipide in der stationären

Wachstumsphase möglicherweise ein Schutzmechanismus ist, um die anionischen

Phospholipide gegen Abbau zu schützen.

In dieser Arbeit wurden die Änderungen der Phospholipidzusammensetzung der

Membran unter K+-limitierenden Bedingungen untersucht, um den Einfluss auf die

kdpFABC-Expression in E. coli zu analysieren. Es konnte zum ersten Mal gezeigt

werden, dass sich die Zusammensetzung der Kopfgruppen der Phospholipide von

E. coli K12 ändert, indem der Anteil an CL auf Kosten von PE nicht nur während der

exponentiellen Wachstumsphase nach kontinuierlichem Wachstum unter K+-

Limitation, sondern auch direkt nach einem K+-„downshift“ ansteigt. Bei einem K+-

„downshift“ ist der CL-Anstieg nur auf neusynthetisierte CL-Moleküle zurückzuführen,

während bei kontinulierlichem Wachstum unter K+-Limitation der höhere CL-Gehalt

aus bereits vorhandenen und neusynthetisierten CL-Moleküle resultiert. Für die

Messungen der Phospholipidzusammensetzung nach einem K+-„downshift“ ist dabei

erwähnenswert, dass die Translokation der Phospholipide von der inneren zur

äußeren Membran von E. coli innerhalb von Sekunden stattfindet (Donohue-Rolfe et

al., 1980). Des Weiteren unterscheidet sich die Verteilung der Phospholipide in den

beiden Bilayern der Zellhülle. Es konnte für E. coli und Salmonella typhimurium

beobachtet werden, dass die innere Schicht der äußeren Membran mehr PE und

weniger PG und CL als die Zytoplasmamembran beinhaltet (Osborn et al., 1972;

4. Diskussion

77

Lugtenberg & Peters, 1976). Folglich sollte der ständig steigende CL-Anstieg nach

einem K+-„downshift“ zu einer Änderung des CL-Gehalts in der Zytoplasmamembran

führen, da das neusynthetisierte CL zunächst vollständig in die Zytoplasmamembran

eingebaut wird und davon nur ein kleiner Teil in die innere Schicht der äußeren

Membran verlagert wird.

Interessanterweise konnte der in E. coli K12 beobachtet CL-Anstieg unter K+-

Limitation während der exponentiellen Wachstumsphase jedoch nicht in den Kalium-

oder „Lipid-Stämmen“ gemessen werden. Das unterschiedliche CL-Niveau und der

bis zur stationären Wachstumsphase konstante CL-Gehalt in den „Kalium-Stämmen“

konnten auf den Stammhintergrund bzw. auf andere Mutationen in den „Kalium-

Stämmen“ und nicht auf die Abwesenheit des Kdp-Systems oder der niedrig affinen

K+-Aufnahmesysteme Trk und Kup zurückgeführt werden. In der vorliegenden Arbeit

wurde ebenfalls gezeigt, dass Stämme aus denen die „Kalium-Stämme“ konstruiert

wurden, das gleiche CL-Niveau und einen bis zur stationären Wachstumsphase

konstanten CL-Gehalt aufwiesen. In den „Lipid-Stämmen“ konnte kein CL-Anstieg

unter K+-Limitation während der exponentiellen Wachstumsphase beobachtet

werden. Jedoch zeigte der Stamm W3899, der für die Konstruktion der „Lipid-

Stämme“ WC3899 und AD93 verwendet wurde, und keine Mutation in den Genen

aufweist, welche für Enzyme kodieren, die in die Biosynthese der Phospholipide

involviert sind, einen CL-Anstieg unter K+-Limitation im Gegensatz zu seinen

Derivaten (siehe Tabelle 3.4). Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die genetisch

bedingte Veränderung der ursprünglichen Kopfgruppenzusammensetzung aufgrund

der Mutationen in den entsprechenden Genen der Stämme WC3899 und AD93 den

CL-Anstieg unter K+-Limitation beeinflusst. Des Weiteren konnte der CL-Anstieg nur

beobachtet werden, wenn das pssA-Gen auf dem Chromosom wie im ursprünglichen

Stamm W3899 und nicht wie bei AD93 / pDD72 auf einem Plasmid kodiert ist (siehe

Tabelle 3.4). Diese Beobachtung führt zu der Hypothese, dass das Expressions-

niveau des pssA-Gens möglicherweise einen Effekt auf die Synthese von CL unter

K+-Limitation hat.

Für einige Sensorkinase / Antwortregulator Systeme konnte bereits beobachtet

werden, dass die Zusammensetzung der Phospholipide einen Einfluss auf die

Aktivierung dieser Systeme hat. Der Cpx-Zweikomponenten-Signaltransduktionsweg

zum Beispiel wurde in E. coli Stämmen aktiviert, die kein PE mehr in der Membran

4. Diskussion

78

aufwiesen (Mileykovskaya & Dowhan, 1997). Im Falle des KdpD / KdpE Systems

konnte mit der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Kinaseaktivität der

Sensorkinase KdpD in seiner natürlichen Membranumgebung durch die Zugabe von

CL in vitro stimuliert wurde, während die gleiche Menge PE / PC zu einer niedrigeren

Aktivität führte. Des Weiteren lassen die Q-RT-PCR-Daten dieser Arbeit darauf

schließen, dass in vivo eher der gesamte Anteil anionischer Phospholipide als die

Höhe des CL-Gehalts einen Einfluss auf die kdpFABC-Expression hat. Der Stamm

WC3899 (∆cls) zum Beispiel hat ein vergleichbares Induktionsverhältnis für die

kdpFABC-Expression wie der Wildtypstamm K12, obwohl sich nur die Zusammen-

setzung der anionischen Phospholipide aufgrund des niedrigeren CL-Gehaltes unter-

scheidet, nicht jedoch die Höhe des anionischen Anteils. Eine Korrelation zwischen

dem Induktionsverhältnis für die kdpFABC-Expression und dem totalen Anteil an

anionischen Phospholipiden (siehe Tabelle 3.7) ist durch die Beobachtung unter-

stützt, dass Stämme mit einem höheren anionischen Phospholipidanteil (18-25 %,

wie in den Stämmen K12, WC3899 und HDL1001 + IPTG) ein höheres Induk-

tionsverhältnis für die kdpFABC-Expression aufweisen, als Stämme mit einem

niedrigeren anionischen Phospholipidanteil (0-4 %, wie in den Stämmen UE54 und

HDL1001 - IPTG). Allerdings ist die Nettoladung der Oberfläche der Membran, wel-

che durch die Phospholipidzusammensetzung beeinflusst wird, nicht ausschließlich

für die kdpFABC-Expression verantwortlich. Dieses ist auf die Beobachtung zurück-

zuführen, dass in dem E. coli Stamm UE54 immer noch kdpFABC exprimiert wird,

obwohl die Membran keine anionischen Phospholipide PG und CL aufweist. Die

restliche Aktivität könnte auf die Akkumulation der Vorstufenmoleküle Phosphatidyl-

säure (PA) und CDP-Diacylglycerol in diesem Stamm zurückzuführen sein, welche

der Membranoberfläche einige negative Ladungen bereitstellen (Tsatskis et al.,

2005). Die Beobachtung, dass die höchste kdpFABC-Expression in dem Stamm, be-

stehend aus einer Membran mit ausschließlich anionischen Phospholipiden (AD93),

gemessen wurde, unterstützt die Theorie, dass anionische Phospholipide einen

stimulierenden Effekt auf die kdpFABC-Expression haben. Auch die Proliferation der

Zytoplasmamembran und der damit verbundene CL-Anstieg scheinen einen Einfluss

auf die Aktivität der Sensorkinase KdpD zu haben. Dies zeigte sich dadurch, dass die

bei der Überproduktion der b-Untereinheit der ATP-Synthase verursachte Ausstül-

pung der Membran ebenfalls in einer Änderung der kdpFABC-Expression resultierte.

Die beschriebene Beobachtung ist vermutlich auf das angestiegene Verhältnis von

4. Diskussion

79

anionischen zu zwitterionischen Phospholipiden zurückzuführen, welche sich mit den

vorherigen Hypothesen deckt.

Auch die ermittelte Kinaseaktivität der Sensorkinase KdpD bei Fusion von Membran-

vesikeln mit synthetisch hergestellten Liposomen zeigte, dass die Autophospho-

rylierungsrate von KdpD nicht nur durch die Anwesenheit von anionischen Phospho-

lipiden, sondern auch durch den prozentualen Anteil von negativ geladenen

Phosphoipiden beeinflusst wird. Da bei dem Versuch die identische Menge von

anionischen oder zwitterionschen Liposomen bzw. Liposomen aus „E. coli total

extract“ zugegeben wurde, kann diese Beobachtung auf den spezifischen Effekt von

negativ geladenen Phospholipiden zurückgeführt werden. Der Einfluss des prozen-

tualen Anteils von negativ geladenen Phospholipiden auf die Kinaseaktivität von

KdpD (siehe 3.7.1) deckt sich mit der kdpFABC-Expression, die in Stämmen mit

einer veränderten nativen Phospholipidzusammensetzung gemessenen wurde. Mit

den beiden Versuchsansätzen konnten folglich die Daten von Stallkamp et al. (1999)

untermauert und detaillierter beschrieben werden, da der Anteil von anionischen

Phospholipiden variiert wurde. Bei den Fusionen der Membranvesikel könnte neben

dem Einfluss der negativen Liposomen auch ein krümmungsbedingter Effekt eine

Rolle spielen. Die Phosphorylierung sowohl von Wildtyp-KdpD als auch vom Derivat

KdpD/E509K nahm ab, je höher der Anteil der zwitterionischen bzw. E. coli Lipo-

somen im Verhältnis zu den Membranvesikeln war. Da die fusionierten Vesikel

anschließend nicht extrudiert wurden, könnte es zu Vesikeln mit unterschiedlichen

Größen gekommen sein. Eine Theorie wäre, dass je höher der Anteil an zuge-

gebenen Liposomen ist, desto größer wird der Durchmesser der fusionierten Vesikel.

Folglich wären die Vesikel im Verhältnis von Membranvesikeln zu Liposomen mit

1 : 0 am kleinsten, gefolgt von denen im Verhältnis von 1 : 1, dann 1 : 2 bzw. 2 : 1

und am größten wären die Vesikel im Fusionsverhältnis von 1 : 3. Das würde

bedeuten, dass die Größe bzw. die Krümmung der Membran der Vesikel einen

Einfluss auf die Autophosphorylierung von KdpD haben könnte. Je kleiner die Vesikel

sind, desto größer ist die Krümmung der Membran. In den kleineren (nativen)

Membranvesikeln, extrudiert auf 400nm Durchmesser, konnte eine höhere Aktivität

gemessen werden, wenn sie nicht mit Liposomen fusioniert wurden. Ramamurthi et

al. (2009) konnten für B. subtilis sogar zeigen, dass die Verteilung von Proteinen in

der Zelle aufgrund der Krümmung der Membran zu erfolgen scheint.

4. Diskussion

80

Die geringere Phosphorylierungsrate von KdpD/E509K bei diesem Versuch ist

vermutlich auf den niedrigeren KdpD-Anteil in den Membranvesikeln zurückzuführen,

da ein anderer Vektor für die Überexpression verwendet wurde. Bei pBD5-9/E509K

handelt es sich um ein Plasmid mit einem Arabinose-induzierbaren Promotor, der

allerdings mit Glucose reprimiert wurde, während es sich bei pKJ2-6His um ein

Plasmid mit einem starken tac-Promotor handelt. Folglich ist das Expressionsniveau

von WT-KdpD deutlich höher als bei dem KdpD-Derivat, was die Ursache für die

unterschiedliche Höhe der Aktivitäten beider Proteine zu sein scheint.

In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass es sich bei den eingesetzten

Membranvesikeln um invertierte Membranvesikel handelt. Das bedeutet, dass die

KdpD-Proteine in umgekehrter Orientierung in den Vesikeln vorlagen, damit die

eigentlich zytoplasmatischen Domänen mit dem konserviertem Histidinrest an den

Außenseite der Proteoliposomen lagen, um für das radioaktiv-markierte ATP

zugänglich zu sein. Folglich handelt es sich bei der Krümmung in allen gemessenen

Proben nicht um den nativen Zustand in der Zelle, sondern um die entgegengesetzte

Richtung. Diese Orientierung spielt auch bei der Rekonstitution von KdpD-6His in

Liposomen eine Rolle, da die unterschiedliche Krümmung in einer schlechteren

Einbaurate resultieren könnte. Möglicherweise konnte das Protein nicht funktionell in

die Liposomen rekonstituiert werden, da das Protein bereits in der Zelle durch die

Überproduktion teilweise an der Zytoplasmamembran aggregiert vorliegen könnte.

Dafür spräche auch die Beobachtung, dass invertierte Membranvesikel nach dem

Extrudieren deutlich niedrigere Phosphorylierungsraten aufwiesen. Das aggregierte

Protein könnte demzufolge bei der Formierung gleich großer Vesikel an dem Poly-

carbonat-Filter unspezifisch binden. Bislang brachten weitere Versuchsansätze,

KdpD-6His funktionell zu rekonstituieren, keine messbare Aktivität des Proteins

(Kipschull, pers. Mitteilung).

Bei der Einlagerung von membranverändernden Substanzen in die Zytoplasma-

membran konnte durch die Zugabe von Procain eine signifikante Änderung der

kdpFABC-Expression, induziert durch WT-KdpD / KdpE, gemessen werden, aller-

dings nur wenn kdpFABC-induzierende Bedingungen vorlagen und die Zytoplasma-

membran ausschließlich aus zwitterionischem PE bestand. Dieses Ergebnis schränkt

die Beobachtung von Jung et al. (2000) ein, die zeigen konnten, dass Procain keinen

Einfluss auf die Phosphorylierung von WT-KdpD in Zellen mit einer nativen Phospho-

4. Diskussion

81

lipidzusammensetzung hat. Demzufolge hat Procain nur eine Auswirkung auf die

Aktivität des Kdp-Systems, wenn anionische Phospholipide in der Zellhülle wie im

Stamm UE54 fehlen. Des Weiteren konnte für Derivate von KdpD mit einem

veränderten Phänotyp hinsichtlich der kdpFABC-Expression durch die Zugabe von

Procain eine Erhöhung der vorhandenen Aktivität ermittelt werden. Dieses deckt sich

mit der Beobachtung von Sugiura et al. (1994), die zeigen konnten, dass semi-

konstitutive Derivate eine erhöhte kdpFABC-Expression bei Zugabe von Procain

aufwiesen. Demzufolge scheinen solche interkalierenden Substanzen die Aktivität

oder den Einbau der Sensorkinase KdpD bzw. des Transportkomplexes KdpFABC in

die Zytoplasmamembran zu beeinflussen. Somit sprechen die mittels Procain

gewonnenen Ergebnisse ebenso wie die Kinaseaktivitäten der fusionierten Vesikel

für die Hypothese, dass KdpD die Änderung der Membranspannung wahrnimmt bzw.

die Aktivität von KdpD durch die Krümmung der Membran beeinflusst wird.

4.2. Modell für den Anstieg von Cardiolipin Der Effekt von zytoplasmatischem K+ auf die Aktivität der CL-Synthase wurde in

früheren Studien analysiert, in denen gezeigt werden konnte, dass K+-Phosphat als

ein Aktivator für die CL-Synthase fungiert (Hiraoka et al., 1991). Außerdem konnte in

der vorliegenden Arbeit experimentell gezeigt werden, dass unter K+-Limitation die

Menge an CL anstieg. Für diese Beobachtung in der exponentiellen Wachstums-

phase gibt es mindestens zwei mögliche Erklärungen: Einerseits könnte eine höhere

Aktivität der CL-Synthase und andererseits eine höhere Expression des cls-Gens

und damit eine größere Menge an CL-Synthase Molekülen die Ursache sein. Die

Ergebnisse des Stammes mit der cls-lacZ transkriptionalen Fusion passen zu der

zweiten Erklärung. Das deutet darauf hin, dass die CL-Synthese auf genetischer

Ebene reguliert wird, wodurch die Ergebnisse von Heber & Tropp (1991) bestätigt

werden. Unter K+-Limitation kommt es vermutlich durch einen bislang unbekannten

Faktor zu einer Erhöhung der cls-Expression. In Bezug auf den CL-Anstieg während

der stationären Wachstumsphase widerspricht die Vermutung der genetischen

Regulation der Beobachtung, dass der CL-Gehalt in dieser Wachstumsphase auf-

grund der höheren Enzymaktivität der CL-Synthase ansteigt (Hiraoka et al., 1993).

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die CL-Synthase durch CL inhibiert

wurde, welches eines der beiden Produkte dieser katalysierten Reaktion ist (Ragolia

& Tropp, 1994). Das verdeutlicht, dass die Synthese von CL auch auf dem

4. Diskussion

82

enzymatischen Niveau reguliert wird und unterstützt das Modell einer Regulierung

auf beiden Ebenen (Abb. 4.1).

Abb. 4.1: Schema einer möglichen Regulation des CL- Niveaus in E. coli. OM: Äußere Membran, CM: Zytoplasmamembran, P: Promotor.

Diese mehrfache Regulierung könnte es der Zelle ermöglichen, ihren CL- und/oder

ihren anionischen Phospholipidgehalt genauer zu steuern und dabei negative

Einflüsse auf essentielle Prozesse und Funktionen in der Zelle zu vermeiden.

Romantsov et al. (2007) vermuten, dass der von Tsatskis et al. (2005) beobachtete

CL-Anstieg auf Kosten von PE unter hohen Osmolalitäten auf den Anstieg der PG-

Synthese und der PG-Konversion zu CL zurückzuführen ist, obwohl das detektierte

Niveau von PG unverändert war. Diese Hypothese könnte ebenfalls den in dieser

Arbeit gezeigten CL-Anstieg unter K+-Limitation erklären. Auch der ermittelte Anstieg

der cls-Expression unter K+-Limitation untermauert diese Hypothese, da folglich mehr

CL-Synthase synthetisiert wird um CL zu bilden und somit für den CL-Anstieg

verantwortlich zu sein scheint. Schließlich gibt es bislang keine experimentellen

Hinweise dafür, dass die CL-Synthase CL auch über einen PG-unabhängigen Weg

synthetisieren kann.

Bezugnehmend auf die cls-Expression ist es erwähnenswert, dass in einem Stamm

mit einer cls-Deletion der restliche Anteil von CL ansteigt, wenn die Zellen die

stationäre Wachstumsphase erreichen (Nishijima et al., 1988). Es wurde von

Nishijima und Mitarbeitern vermutet, dass CL in solchen Stämmen durch einen

alternativen Syntheseweg unter Gebrauch des pssA-Genproduktes hergestellt wird.

4. Diskussion

83

Jedoch waren Zellen mit einer pssA-Deletion in einem Stamm mit einer cls-Deletion

nicht lebensfähig (Nishijima et al., 1988). Bislang konnte kein Enzym identifiziert

werden, welches den restlichen Anteil von CL in einem Stamm mit einer cls-Deletion

synthetisiert. In E. coli gibt es zwei zum cls-Gen homologe Gene ybhO und ymdC,

diese konnten CL in vitro synthetisieren (Guo & Tropp, 2000). Romantsov et al.

(2007) stellten daher die Hypothese auf, dass YbhO für den CL-Anstieg in der

stationären Phase verantwortlich ist. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden

Arbeit kann diese Vermutung jedoch widerlegt werden, da auch in dem ∆cls ∆ybhO

Stamm DG10 der CL-Gehalt in der stationären Wachstumsphase von etwa 0.5 % auf

5 % des totalen Phospholipidgehaltes ansteigt. Folglich ist YbhO nicht bzw. nicht

alleine für den CL-Anstieg in der stationären Phase verantwortlich, da auch in dem

∆ybhO Stamm diese Veränderung in der Kopfgruppenzusammensetzung auftrat. Bei

dem Stamm DG10 fällt allerdings auf, dass in der stationären Phase der CL-Gehalt

nicht durch die sonst übliche PG-, sondern durch eine PE-Abnahme erfolgte. Dieses

liegt vermutlich an der cls-Deletion, da PG nicht mehr wie sonst in CL umgewandelt

werden konnte und somit während des Wachstums akkumulierte. Dieses spricht für

die aufgestellte Theorie, dass es sich bei der CL-Synthese möglicherweise um eine

Nebenreaktion des pssA-Gens handelt, wodurch auch der PE-Abfall bei zunehmen-

dem CL-Anteil zu erklären wäre.

Abb. 4.2: Alternative Wege für die CL-Synthese von E. coli. Dabei ist der vom Gen-produkt des pssA-Gens abhängige Weg für die CL-Synthese grün und der vom Genprodukt des pgsA-Gens abhängige Weg rot eingezeichnet.

Eine andere Theorie ist, dass die CL-Synthese durch YbhO ebenfalls wie die durch

die CL-Synthase von der Anwesenheit des Produktes des pgsA-Gens abhängig sein

könnte (Abb. 4.2). Das erklärt sich daraus, dass der Stamm UE54, der keine

4. Diskussion

84

anionischen Lipide aufgrund seiner pgsA-Deletion besitzt, auch in der stationären

Wachstumsphase keinen CL-Anstieg unter K+-Limitation aufwies (Daten nicht

gezeigt), obwohl er keine ybhO-Deletion besitzt. Folglich scheinen verschiedene

Mechanismen zu existieren, welche die Transkription des cls-Gens und folglich die

CL-Synthese in der exponentiellen und in der stationären Wachstumsphase auf

genetischer Ebene regulieren.

Auch die beiden Reize von KdpD, K+-Limitation und hohe Osmolalität, scheinen den

CL-Gehalt unterschiedlich zu beeinflussen. Der Vergleich des CL-Gehalts unter K+-

Limitation und hoher Osmolalität zeigt, dass es unter beiden kdpFABC-induzierenden

Bedingungen während der exponentiellen Wachstumsphase zu einem Anstieg des

anionischen Phospholipids kommt. Die Höhe des CL-Anstiegs ist allerdings unter-

schiedlich, denn während es unter hohen Osmolalitäten zu einem 2-3 fachen Anstieg

kommt (Tsatskis et al., 2005), konnte unter K+-Limitation nur eine 1.44-fache

Erhöhung gemessen werden (siehe 3.1.1). Ein weiterer Unterschied der beiden

Wachstumsbedingungen ist die Höhe des Induktionsverhältnisses der kdpFABC-

Expression, denn während bei hoher Osmolalität kdpFABC nur transient und auf

einem niedrigeren Niveau exprimiert wird, kommt es unter K+-Limitation zu einer

kontinuierlichen und wesentlich höheren Induktion des Systems (Hamann et al.,

2008). Anhand dieser beiden Stresssituationen für die Zelle kann folglich kein

gemeinsames Regulationsmodell für den CL-Anstieg in der exponentiellen Wachs-

tumsphase postuliert werden.

Des Weiteren fiel bei den Induktionsverhältnissen für die kdpFABC-Expression auf,

dass der Stamm K12 in dem GM56-Medium ein vermindertes Induktionsverhältnis für

die kdpFABC-Expression im Gegensatz zum Induktionsverhältnis in Minimalmedium

nach Epstein und Kim aufwies. Die stärkere Induktion der kdpFABC-Expression in

K12 könnte möglicherweise auf die unterschiedliche Natrium-Konzentration in den

phosphat-gepufferten Medien K0.1 und K115 zurückzuführen sein. Da aber in GM56

mit 0.1 mM K+ bzw. 115 mM K+ die Na+-Konzentration mit 78 mM konstant ist, zeigt

sich, dass diese Induktion definitiv nur auf die K+-Limitation zurückzuführen ist. Das

würde bedeuten, dass bei einer höheren Na+-Konzentration (wie z.B. in GM56-

Medium im Vergleich zu dem Minimalmedium nach Epstein und Kim) die Synthese

des KdpFABC-Komplexes stärker induziert wird, weil durch die Na+-Ionen eine

4. Diskussion

85

geringere K+-Verfügbarkeit suggeriert wird (Hamann et al., 2008). Aufgrund der

höheren kdpFABC-Expression in GM56 mit 115 mM K+ verringert sich folglich das

Induktionsverhältnis. Ebenfalls könnte auch die unterschiedliche Höhe der Ionen-

stärke dabei eine Rolle spielen. Während das phosphat-gepufferte Minimalmedium

sowohl mit 0.1 mM K+ als auch mit 115 mM K+ eine Gesamtionenstärke von 115 mM

aufweist, ist die Ionenstärke in GM56-K0.1 und GM56-K115 mit 78.1 mM bzw.

183 mM unterschiedlich. Ähnliche Daten für unterschiedliche Expressionen unter

verschiedenen Osmolalitäten konnten für Salmonella enterica beobachtet werden

(Balaji et al., 2005).

Im Hinblick auf die Induktion der Expression unter K+-Limitation werden die

Promotoren des cls-Gens und des kdpFABC-Operons von E. coli hochreguliert bzw.

aktiviert. Deshalb wurde ein Alignment der Sequenzen beider Promotoren durch-

geführt (Daten nicht gezeigt). Es wurde untersucht, ob sich ähnliche Sequenzen vor

dem jeweiligen Transkriptionsstart befinden, die evtl. auf eine ähnliche Regulation

(z.B. Aktivierung) hinweisen. Vor dem Transkriptionsstart (+1) des kdpFABC-Operons

konnte eine 23 bp lange Bindestelle (-72 bis -50) für dimerisiertes KdpE~P identi-

fiziert werden (Nakashima et al., 1993). Der 11 bp große Abstand zur -35 Region ist

typisch für Aktivatoren wie KdpE, welche bei einer größeren Entfernung der Binde-

stelle zur -35 Region nicht mehr mit der RNA-Polymerase interagieren und bei einem

kleineren Abstand zur -35 Region diese blockieren können. Die KdpE-Bindesequenz

war allerdings nicht vor dem Transkriptionsstart von cls zu finden. Auch bei Berück-

sichtigung der DNA-Windung, bei der nur ein Teil der Basen mit den entsprechenden

Abständen identisch sein muss, konnte keine passende Sequenz identifiziert werden.

Dieses deutet auf keine ähnliche Regulation der Expression von cls und kdpFABC

unter K+-Limitation hin. Auch sonst konnten keine Homologien der Sequenzen der

beiden Promotoren beobachtet werden. Außerdem zeigten beide Gene bzw.

Operons deutliche Unterschiede in der Höhe ihres Induktionsverhältnisses bezüglich

niedriger und hoher K+-Konzentrationen im Medium. Während es für die cls-Ex-

pression zu einem mit 2 - 3 kleinen Induktionsverhältnis kommt, wird das kdpFABC-

Expression ~6000-fach induziert. Dieses lässt vermuten, dass verschiedene Mecha-

nismen für die Regulation der cls- und kdpFABC-Expression unter K+-Limitation

existieren.

4. Diskussion

86

Zusammenfassend ist noch offen, warum die Zelle in der exponentiellen Wachstums-

phase unter K+-Limitation eine Änderung der Zusammensetzung der Kopfgruppen

der Phospholipide vornimmt. Vermutlich ist der CL-Anstieg ebenso wie unter hoher

Osmolalität oder in der stationären Wachstumsphase ein Schutzmechanismus auf

solch einen Stress, um die Phospholipide gegen den Abbau zu schützen, da CL

stabiler als PG ist. Ebenfalls wird in Stresssituationen die Zusammensetzung der

Fettsäuren variiert, indem der Anteil an 17:0 cyclo 9-10 auf Kosten von 16:1 cis 9

erhöht wird (Cronan, 1968). Dabei wird die Doppelbindung am 9. C-Atom von 16:1

cis 9 zu einer zyklischen Verbindung zwischen dem 9. und 10. C-Atom in 17:0 cyclo

9-10 umgewandelt. Diese Verschiebung bei der Zusammensetzung der Fettsäuren

konnte in der vorliegenden Arbeit auch erstmalig unter K+-Limitation beobachtet

werden. Die kleinen Schwankungen des prozentualen Anteils von 16:1 cis 9 und 17:0

cyclo 9-10 zwischen K0.1 und K115 sind damit zu erklären, dass die Zellen unter K+-

Limitation aufgrund des Kaliummangels schneller die stationäre Wachstumsphase

erreichen. Diese Änderung der Fettsäurezusammensetzung hat keinen Einfluss auf

die Beschaffenheit der Lipiddoppelschicht der Zytoplasmamembran, da beide Fett-

säuren die gleichen chemischen Eigenschaften aufweisen. Somit konnte gezeigt

werden, dass sich unter K+-Limitation nur die Zusammensetzung der Kopfgruppen

und nicht die der Fettsäureketten der Phospholipide ändert. Folglich wird nur die

Oberfläche der Lipiddoppelschicht unter K+-Limitation verändert, indem der Anteil an

negativen Ladungen (CL-Anstieg durch PE-Abnahme) erhöht wird.

4.3. Hypothesen zur Interaktion von KdpD Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Korrelation zwischen dem

Gehalt an anionischen Phospholipiden und dem Signalstatus der membran-

gebundenen Sensorkinase KdpD sowohl in vitro als auch in vivo besteht. Für den K+-

Kanal KcsA aus Streptomyces lividans konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit

von anionischen Phospholipiden für die Aktivierung bzw. Öffnung des Kanals jedoch

nicht für die Tetramerisierung von KcsA essentiell ist (Alvis et al., 2003). Ähnlich

wäre für KdpD in E. coli vorstellbar, dass die Bildung eines Homodimers auch ohne

die Anwesenheit von negativ geladenen Phospholipiden stattfindet. Folglich würde es

erst zu einer Aktivierung der Sensorkinase durch eine Wechselwirkung mit den

anionischen Phospholipiden kommen, wenn diese unter kdpFABC-induzierenden Be-

dingungen vermehrt in die Membranumgebung der Sensorkinase gelangen. Für die

4. Diskussion

87

chemische Wechselwirkung der nicht-integralen Membranbereiche von KdpD mit den

Phospholipiden der Zytoplasmamembran sind verschiedene Möglichkeiten denkbar.

Zum Einen ist vorstellbar, dass die N-terminale Domäne von KdpD aufgrund der

hydrophoben Aminosäuresequenz an der Position 27-43 mit der Membran

interagiert. Heermann et al. (2003) konnten zeigen, dass ein KdpD-Derivat ohne

Transmembrandomänen und C-terminale Domäne an die Zytoplasmamembran

assoziiert vorliegt. Maier et al. (2008) beobachteten sogar, dass die amphiphile

Region der N-terminalen Domäne von KdpD (AS 22-48) für die Insertion in die

Membran notwendig zu sein scheint, da diese Aminosäuresequenz von Signal-

erkennungspartikeln erkannt wurde, welche für den Transport zur Membran ver-

antwortlich sind (Maier et al., 2008). Zum Anderen wäre es denkbar, dass das positiv

geladene Arginincluster hinter der vierten Transmembrandomäne mit den Kopf-

gruppen der negativ geladenen Phospholipide an der Oberfläche der Zytoplasma-

membran wechselwirkt (Abb. 4.3). Dafür spräche auch die helikale Anordnung der

Aminosäurereste in dem Arginincluster, da mit einem Computerprogramm sechs der

acht positiven Reste auf einer Seite der Helix lokalisiert wurden (Andreeßen, 2007).

Solche Interaktionen der nicht-integralen Membranbereiche von KdpD könnten

widerum zu einer Aktivierung der Signalkaskade von KdpD / KdpE bzw. zu einem

Wechsel zwischen Kinase- und Phosphataseaktivität von KdpD führen.

Abb. 4.3: Topologie-Modell der Sensorkinase KdpD (v erändert nach Zimmann et al., 1995). Dargestellt sind mögliche Protein-Lipid-Interaktionen. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz. Das positiv geladene Arginincluster ist mit „++++“ gekennzeichnet.

Eine Interaktion des Argininclusters mit den anionischen Phospholipiden wird auch

für die RCK-Domäne des K+ Kanals MjK2 von Methanococcus jannaschii vermutet

(Ptak et al., 2005). Des Weiteren konnten Schmidt et al. (2006) zeigen, dass die

Funktion eines spannungsabhängigen K+ Kanals von negativ geladenen Phospho-

lipiden abhängig ist, da diese eine stabilisierende Interaktion mit den positiv gela-

denen Argininresten des Spannungssensors bilden. Die Position der α-Helix nach

401 498

475 466

446444

428

423

27 43

P

H673 N 1

C 894

Periplasma

Zytoplasmamembran

Zytoplasma

? ?

4. Diskussion

88

den Transmembrandomänen von OpuA aus Lactococcus lactis wird sowohl von dem

PG-Gehalt der Membran als auch von der Ionenstärke reguliert (Biemans-Oldehinkel

et al., 2006), da beobachtet wurde, dass bei einem höheren PG-Gehalt die Aktivität

des Proteins ansteigt. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe konnten auch die

Bedeutung des Argininclusters für die Aktivität der Sensorkinase KdpD zeigen.

Derivate von KdpD, denen die vier Transmembrandomänen und das dahinter liegen-

de Arginincluster fehlen, zeigten keine Aktivität unter allen getesteten Bedingungen

(Puppe et al., 1996). Im Gegensatz dazu konnte bei Derivaten, denen nur die vier

Transmembrandomänen fehlten, das Arginincluster jedoch vorhanden war, ein semi-

konstitutiver Phänotyp in Bezug auf die kdpFABC-Expression unter K+-Limitation

beobachtet werden (Heermann et al., 2003a). Derivate von KdpD mit einer Deletion

des Argininclusters (Aminosäure 498 - 530 bzw. 499 - 513) konnten jedoch weder

phosphoryliert werden, noch waren diese in der Lage das Kdp-System zu

komplementieren (Eisenbarth, 2006; Andreeßen, 2007). Des Weiteren wurden durch

ungerichtete Mutagenese ausschließlich Derivate von KdpD mit einem einzelnen

Aminosäureaustausch und einem semi-konstitutiven Phänotyp in der α-Helix loka-

lisiert, die den vierten Transmembrandurchgang und das dahinter liegende Arginin-

cluster bildet (Sugiura et al., 1994; Brandon et al., 2000; Zimmann et al., 2007).

Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese, dass solche Derivate von KdpD

wahrscheinlich durch Änderung der Ladungen in diesem Bereich eine „locked-on“

Konformation annehmen (Zimmann et al., 2007). Eine vom Wildtyp abweichende

Aktivität der Sensorkinase durch einen derartigen starren Zustand könnte möglicher-

weise durch eine veränderte Protein-Lipid-Interaktion bewirkt werden. Ein solcher

Effekt wurde bereits für den Antennenkomplex II in dem Purpurbakterium

Rhodobacter sphaeroides beobachtet, bei dem ein einzelner Aminosäureaustausch

die Protein-Lipid-Interaktion verändert (Kwa et al., 2008). Außerdem kann durch

einen einzelnen Aminosäureaustausch die Orientierung der α-Helices zueinander

verändert werden, wie für ProP in E. coli gezeigt wurde (Tsatskis et al., 2008).

Anstelle einer direkten Interaktion mit Phospholipiden wäre es auch möglich, dass

KdpD einen bislang unbekannten Interaktionspartner hat, wie für KdpD aus of

Mycobacterium tuberculosis gezeigt wurde (Steyn et al., 2003). Die Lipoproteine

LprF und LprJ aus M. tuberculosis wechselwirken mit dem N-terminalen zytoplasma-

tischen Teil der Sensorkinase KdpD und können so die kdpFABC-Expression modu-

lieren (Steyn et al., 2003). Bei einem Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen

4. Diskussion

89

A) B)

dem gesamten E. coli Chromosom und den Lipoproteinen LprF und LprJ aus M.

tuberculosis konnten keine Proteine in E. coli identifiziert werden, die homolog zu

den Lipoproteinen LprF und LprJ sind (Hamann et al., 2008). Somit konnte anhand

der Interaktionspartner von KdpD in M. tuberculosis keine Schlussfolgerung für eine

Wechselwirkung anderer Proteine mit KdpD in E. coli gezogen werden. Hamann et

al. (2008) vermuten, dass die membrangebundenen Enzyme, welche die Phospho-

lipide bzw. deren Fettsäuren in die Zytoplasmamembran einbauen, mögliche Interak-

tionspartner von KdpD in E. coli durch direkte Protein-Protein-Interaktion (Abb. 4.4 B)

oder durch ein Vermittlerprotein wie die Lipoproteine in M. tuberculosis sein könnten.

Dies könnte die Hypothese aufwerfen, dass bei der Aktivierung der KdpD / KdpE –

Signalkaskade Protein-Protein-Interaktionen mit Protein-Lipid-Interaktionen gekop-

pelt wären, woraus ein neuer Mechanismus der Reizwahrnehmung resultieren

würde.

Abb. 4.4: Schema der möglichen Protein-Protein-Inte raktionen der Sensorkinase KdpD mit einem anderen Protein. CM: Zytoplasmamembran, a: Außen bzw. Periplasma, i: Innen bzw. Zytoplasma. In A ist KdpD als Monomer ohne Wechselwirkung und in B ist KdpD in Wechselwirkung mit einem anderen (unbekannten) Protein dargestellt, die möglicherweise zu einer Aktivierung der Signalkaskade von KdpD / KdpE bzw. zu einem Wechsel zwischen Kinase- und Phosphataseaktivität von KdpD führt. Bei der Interaktion mit einem anderen Protein könnte es sich dabei möglicherweise um ein zytoplasmatisches (rot) oder um ein membrangebundenes Protein (grün) handeln.

Eine andere, umgekehrte Verknüpfung von Zweikomponentensystemen mit En-

zymen, welche die Lipide in Glycerin und Fettsäuren spalten, konnte für das Sensor-

kinase / Antwortregulator System LipQ / LipR in Pseudomonas alcaligenes gezeigt

werden, welches die Synthese der Lipasen reguliert (Krzeslak et al., 2008). Ebenfalls

wäre es denkbar, dass KdpD (oder der KdpFABC-Komplex) mit dem „multi-drug“

Effluxsystem AcrAB interagiert, da in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte,

4. Diskussion

90

dass ein intaktes KdpFABCDE-System für das Wachstum auf Agarplatten mit

höheren Konzentrationen des Antibiotikums Novobiocin, welches durch AcrAB aus

der Zelle geschleust wird (Ma et al., 1995), notwenig zu sein scheint (siehe 3.10).

Auch Lebendzellzahlen von mehr als 100 % bei niedrigeren Novobiocin-Konzen-

trationen im Vergleich zu Agarplatten ohne Antibiotikum sprechen für eine Abhängig-

keit von KdpD, da dieser Effekt nur bei einem funktionsfähigen Kdp-System bzw. bei

Überproduktion der Sensorkinase KdpD unter kdpFABC-induzierenden Bedingungen

(0.1 mM K+) beobachtet werden konnte. Es wäre möglich, dass durch die größere

Menge von KdpD in der Zytoplasmamembran eine Interaktion mit AcrAB beeinflusst

wird bzw. vermehrt auftritt und daraus womöglich eine höhere Resistenz gegenüber

Novobiocin resultiert.

Für eine Interaktion des KdpFABC-Komplexes mit AcrAB sprächen hingegen die

Daten unter nicht-kdpFABC-induzierende Bedingungen (Daten nicht gezeigt). Im

Vollmedium KML herrschen aufgrund der Kaliumkonzentration von ~144 mM K+

ebenso wie im Minimalmedium K115 mit 115 mM K+ nicht-kdpFABC-induzierende

Bedingungen und folglich wird kein KdpFABC-Komplex synthetisiert. Unter diesen

Wachstumsbedingungen liegen die regulatorischen Proteine KdpD / KdpE jedoch nur

in einem kdp+ Stamm in einer geringen Menge vor. Da allerdings unter nicht-

kdpFABC-induzierende Bedingungen in der vorliegenden Arbeit kein signifikanter

Unterschied zwischen einem kdp+ und kdp- Stamm für die Resistenz gegenüber

Novobiocin beobachtet werden konnte, scheint die Höhe der Novobiocin-Resistenz

von dem Vorhandensein des KdpFABC-Komplexes beeinflusst zu werden. Dieses

Ergebnis widerspricht den Beobachtungen von Zhou et al. (2003), die einen Unter-

schied in dem Resistenzverhalten zwischen einem kdp+ und kdp- Stamm im

Vollmedium ermittelten. Des Weiteren klassifizierten Zhou et al. (2003) einen kdp-

Stamm im Gegensatz zu einem kdp+ Stamm als resistenter gegenüber Novobiocin.

Die vorliegene Arbeit zeigt jedoch, dass genau der umgekehrte Fall eintritt und ein

intaktes KdpFABCDE-System für das Wachstum auf höheren Novobiocin-Konzen-

trationen notwenig zu sein scheint. Die widersprüchlichen Ergebnisse von Zhou et al.

(2003) sind möglicherweise damit zu erklären, dass sie in ihrer Veröffentlichung nicht

genauer auf ihren Versuchsansatz eingegangen sind und sich auch nur am Rande

mit dem Kdp-System beschäftigt haben, da sie alle Sensorkinase / Antwortregulator

Systeme von E. coli untersuchten.

4. Diskussion

91

Damit der Stamm TKV2208 (kdpD- trk-) überhaupt auf Agarplatten mit 0.1 mM K+

wachsen kann, muss der Stamm den KdpFABC-Komplex synthetisieren, um K+-

Ionen in die Zelle transportieren zu können. Mittels Q-RT-PCR konnte in diesem

Stamm die kdpFABC-Expression nachgewiesen werden, obwohl das für die Sensor-

kinase kodierende kdpD-Gen deletiert war (Zimmann, pers. Mitteilung). Somit könnte

die kdpFABC-Expression durch eine KdpD-unabhängige Phosphorylierung des

Antwortregulators KdpE induziert werden. Dabei könnte KdpE durch nieder-

molekularen Phosphodonoren oder durch eine andere Sensorkinase („cross-talk“)

phosphoryliert werden. Ein solcher Mechanismus wurde oft in Organismen beob-

achtet, die aufgrund einer Mutation nicht mehr in der Lage waren, die normale

Signalkaskade zur Aktivierung einer spezifischen Antwort zu benutzen (Laub &

Goulian, 2007). In E. coli wurden alle Zweikomponentensysteme bezüglich ihrer

funktionellen Eigenschaften (Autophosphorylierung und Phosphotransfer) und

möglicher „cross-talk“ Reaktionen in vitro untersucht (Yamamoto et al., 2005). Dabei

konnte in vitro gezeigt werden, dass einige Sensorkinasen die Antwortregulatoren

anderer Systeme phosphorylieren, wobei die Sensorkinase KdpD nur in der Lage ist

den eigenen Antwortregulator KdpE zu phosphorylieren. Jedoch konnten Yamamoto

et al. (2005) zeigen, dass UhpB neben KdpD die einzige Sensorkinase von E. coli ist,

die KdpE in vitro phosphorylieren kann. Die aus drei Komponenten bestehende

UhpABC Signalkaskade reguliert die Aufnahme von Glucose-6-Phosphat über den

Transporter UhpT (Verhamme et al., 2001). Folglich wurde für die Aufklärung der

Reizweiterleitung von KdpD auf KdpE je ein Alignment der Aminosäuresequenz der

Sensorkinasen UhpB und KdpD bzw. der Antwortregulatoren UhpA und KdpE durch-

geführt. Jedoch zeigten beide Alignments keine signifikanten Homologiebereiche, die

einen Aufschluss über die strukturelle Wechselwirkung von KdpD (bzw. UhpB) mit

KdpE bringen könnten (Daten nicht gezeigt).

Die hypothetische Wechselwirkung mit AcrAB könnte auch eine für das Kdp-System

regulierende Funktion haben. Eine Regulation der Resistenzen gegenüber

verschiedenen Antibiotika durch solche Sensorkinase / Antwortregulator Systeme ist

bereits für verschiedene Bakterien bekannt (Matsushita & Janda, 2002). In E. coli

konnte beobachtet werden, dass das Zweikomponentensystem VanS / VanR die

Resistenz gegenüber Vancomycin reguliert (Silva et al., 1998). Hirakawa et al.

(2003a) untersuchten alle 32 Antwortregulatoren von E. coli, wobei sie für KdpE

4. Diskussion

92

keinen Einfluss auf die Resistenz gegenüber den getesteten β-Lactam-Antibiotika

feststellen. Bereits zuvor hatte diese Arbeitsgruppe veröffentlicht, dass die Über-

produktion einiger Antwortregulatoren, darunter auch KdpE, oft nur die Resistenz

gegenüber bestimmten Antibiotika, welche über den „multi-drug“ Effluxsystem AcrAB

ausgeschleust werden, beeinflusst (Hirakawa et al., 2003b). Es konnte für über-

produziertes KdpE eine 4-fach höhere Resistenz gegenüber Kanamycin, jedoch

keine Änderung gegenüber Novobiocin bestimmt werden (Hirakawa et al., 2003b).

Ein weiterer Hinweis auf eine globalere Regulierung durch die Sensorkinase KdpD

könnte sein, dass das Kdp-System nicht nur in E. coli, sondern auch in vielen

anderen Mikroorganismen existiert. Folglich hätte die konstitutiv synthetisierte Sen-

sorkinase KdpD zwei grundverschiedene Funktionen. Eine Funktion ist die Regula-

tion des KdpFABC-Systems, um die K+-Homeostase bei extremen Bedingungen

durch die Aufnahme von K+ über den KdpFABC-Komplex in der Umgebung aufrecht

zu erhalten. Die andere Funktion könnte sein, weitere Prozesse durch die Interaktion

mit einem anderen Protein unter nicht-kdpFABC-induzierenden Bedingungen zu

regulieren. Diese Theorie ist denkbar, da die Anordnung der Gene kdpA, kdpB und

kdpC relativ konserviert ist, während die regulatorischen Gene kdpD / kdpE in den

verschiedenen Organismen unterschiedlich angeordnet sind oder nur teilweise

vorhanden sind (Ballal et al., 2007). In dem Archaeon Halobacterium salinarium wird

ein KdpFABC-Transporter unter K+-Limitation gebildet, der K+-Ionen in die Zelle

transportiert und so ein Wachstum unter extremen Bedingungen in Abhängigkeit von

der Anwesenheit der Produkte des kdpFABCcat3-Operons ermöglicht (Strahl &

Greie, 2008). Allerdings fehlen in diesem halophilen Organismus die zu kdpD und

kdpE homologen regulatorischen Gene. Jedoch könnte das zusätzlich chromosomal-

kodierte cat3-Gen ebenfalls eine Rolle bei der Transkription spielen. In dem

thermoacidophilen Bakterium Alicyclobacillus acidocaldarius hingegen wurde in zwei

Regionen eine zu KdpD homologe Sensorkinase lokalisiert. Die eine Region befand

sich im Operon kdpZFABCN, wobei kdpN für einen Homodimer der N-terminalen

Domäne von KdpD kodiert und die andere in dem kdpHE-Operon, wobei kdpH die

Transmembrandomänen und die C-terminale Domäne von KdpD kodiert

(Schleußinger et al., 2006). In dem Stickstoff-fixierenden Cyanobakterium Anabena

sp. L-31 konnten zwei Kopien der Gene kdpAGBC im Genom lokalisiert werden,

wobei nur in einem der beiden Operone (kdp1) eine verkürzte Form der N-terminalen

4. Diskussion

93

Domäne von KdpD vorhanden war und ein kdpE homologes Gen weder in dem

einen noch in dem anderen Operon vorhanden war (Ballal & Apte, 2005). Allerdings

scheint die Expression von nur einem der beiden Operone (kdp2) unter K+-Limitation

induziert zu werden. In Sinorhizobium meliloti konnte neben den zu E. coli

homologen niedrig affinen K+-Aufnahmesystemen ebenfalls ein Kdp-System anhand

von Sequenzhomologien ermittelt werden, dass ebenfalls nur unter K+-Limitation und

hoher Osmolalität K+ in die Zelle transportiert (Domingeuz-Ferreras et al., 2009).

Es ist wichtig zu erwähnen, dass die bakterielle Membran eine heterogene Verteilung

der Lipide besitzt (zum Überblick siehe Matsumoto et al., 2006). In E. coli ist das

anionische Phospholipid CL am Septum und an den Zellpolen angereichert, wodurch

CL-reiche Domänen vorliegen (Mileykovskaya & Dowhan, 2000). Huang et al. (2006)

vermuten, dass diese Clusterung ein krümmungsbedingtes Phänomen ist. Bezug-

nehmend auf die heterogene Verteilung der Lipide konnten mehrere Membran-

proteine am Septum und/oder an den Polen der Bakterienzelle lokalisiert werden (Lai

et al., 2004). Diese Lokalisation deutet an, dass diese Membranproteine die Nähe

anionischer Phospholipide bevorzugen. Des Weiteren wurde vermutet, dass Mem-

branproteine mit einer hohen Affinität für CL die Domänen aus CL stabilisieren (zum

Überblick siehe Matsumoto et al., 2006) oder dass CL die polare Lokalisation dieser

Proteine fördert, wie für den Osmosensor ProP in E. coli vorgeschlagen wurde

(Romantsov et al., 2007). Es ist auch für KdpD vorstellbar, dass dieses Protein in

diesen CL-reichen Domänen geclustert vorkommt oder sogar mit CL interagiert.

Mikrodomänen, die CL und KdpD enthalten, könnten somit erklären, warum ein

Anstieg von CL unter K+-Limitation nicht unbedingt essentiell ist, wie in einigen

Stämmen beobachtet wurde. Bisherige Daten mit KdpD-GFP lassen jedoch keine

Clusterung von KdpD vermuten (Feuerbaum, 2008). In dem Stamm UE54, der kein

PG und CL aufweist, konnte Phosphatidylsäure und ein neu identifiziertes an-

ionisches Lipid, N-acyl PE, ebenfalls an den Polen der Zelle angereichert, gefunden

werden (Mileykovskaya et al., 2009). Eine erhöhte Bindeaffinität zu CL konnte für die

Glycosyltransferase MurG mittels einer Co-Reinigung gezeigt werden (Van den

Brink-Van der Laan et al., 2003). Mit diesem Ansatz konnten für KdpD jedoch keine

Rückschlüsse auf eine spezifische Interaktion von Phospholipiden mit KdpD

herausgefunden werden (siehe 3.9). Dieses liegt vermutlich daran, dass es sich im

Gegensatz zu der mit vier Transmembrandomänen in der Zytoplasmamembran

4. Diskussion

94

verankerten Sensorkinase KdpD bei MurG nur um ein an die Membran assoziiertes

Protein handelt. Demzufolge ist die Zugabe eines Detergenz, welches für die

Stabilität von Membranproteinen in Lösung notwendig ist, bei der Co-Reinigung von

MurG nicht essentiell. Bei der Solubilisierung von KdpD hingegen könnte das Deter-

genz mit einer höheren Affinität die verschieden Phospholipidtypen unterschiedlich

stark vom Protein verdrängen. Dadurch würde sich auch die Frage stellen, ob die

Quantifizierung der Phospholipide vom gewählten Detergenz abhängig ist und wie es

sich bei anderen Membranproteinen verhält, um von einer wirklich spezifischen

Wechselwirkung sprechen zu können.

Eine andere Begründung für die verschiedenen Aktivitäten von KdpD in den „Lipid-

Stämmen“ und folglich eine veränderte native Lipidzusammensetzung haben, könnte

sein, dass jeder Typ der Phospholipide zu einem anderen lateralen Packungsdruck

führt. De Kruijff (1997) vermutet, dass nicht-bilayer-bevorzugende Lipide wie PE

einen höheren lateralen Packungsdruck auf Membranproteine ausüben, um diese in

eine für sie bessere Konformation zu bringen, als es bilayer-bevorzugende Lipide wie

CL und PG tun. Wikström et al. (2009) stellen die Hypothese auf, dass der laterale

Packungsdruck auf die Größe der Kopfgruppen der Phospholipide zurückzuführen

ist, wobei kleinere Kopfgruppen eine höhere Krümmung der Membran verursachen

und mehr Vorteile für viele Membranproteine als größere Kopfgruppen (niedrigere

Krümmung) darstellen.

4.4. Ausblick

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Anteil von anionischen Phospho-

lipiden in der Zellhülle von E. coli die kdpFABC-Expression beeinflusst. Des Weiteren

könnte die heterogene Verteilung der Lipide ein Parameter sein, der für den Signal-

status von KdpD von Bedeutung ist. Daher wird zurzeit die Lokalisation von KdpD in

der Zytoplasmamembran mit KdpD-GFP Fusionen untersucht (Zimmann, pers.

Mitteilung), die möglicherweise mit der Clusterung von CL übereinstimmt und auf

eine Interaktion mit dem Phospholipid hindeuten könnte.

Zur Untersuchung der Wechselwirkungen der nicht-integralen Membranbereiche von

KdpD mit den Phospholipiden der Zytoplasmamembran (siehe Abb. 4.3) bietet sich

folgende experimentelle Vorgehensweise an: Zunächst muss KdpD in Liposomen

rekonstituiert werden, in denen eine Fettsäure einen TID-Rest (Diazirin) trägt. Dieser

4. Diskussion

95

geht bei Bestrahlung mit UV-Licht kovalente Bindungen mit Proteinen in der nahen

Umgebung ein. Um die Kontaktstellen zwischen dem Protein und der Membran zu

lokalisieren, kann die Position dieser Markierung mit Hilfe der MALDI-Analyse und

des Edman-Abbaus bestimmt werden. Solch ein Ansatz wurde bereits für die Identi-

fizierung von Kontaktstellen anderer Proteine erfolgreich angewandt (Von Ballmoos

et al., 2002).

Alternativ könnte auch die BIAcore Technik („biomolecular interaction analysis“) mit

KdpD Peptiden angewandt werden. Dafür müssten Liposomen bestehend aus einem

Typ Phospholipid (also nur PE, PG oder CL) auf spezielle Chips gezogen werden.

Die Messung der Peptidbindung würde mittels SPR („surface plasmon resonance“)

erfolgen, wobei KdpD-Peptide in verschiedenen Puffern über die Chips fließen

würden, um verschiedene Bedingungen wie kdpFABC-induzierend und nicht-

kdpFABC-induzierend zu untersuchen. Mit dieser Methode können Informationen

über die Kinetik und die Affinität der Bindung von Phospholipiden an KdpD ge-

wonnen werden.

Außerdem wäre es interessant zu überprüfen, ob anionische Phospholipide einen

Einfluss auf die Topologie von KdpD haben und womöglich dadurch die Aktivität der

Sensorkinase beeinflussen, wie für die Lactose Permease LacY von E. coli

beobachtet werden konnte (Dowhan et al., 2004). Dazu müssten zunächst die „Lipid-

Stämme“ mit einer veränderten nativen Phospholipidzusammensetzung mittels P1-

Transduktion so verändert werden, dass sie ∆lacZ oder ∆phoA sind, um an-

schließend mit Plasmiden, die eine kdpD-lacZ oder ein kdpD-phoA Fusion kodieren,

transformiert werden zu können. Dabei wäre es sinnvoll Positionen von KdpD zu

untersuchen, die beim Wildtyp in der Nähe der Zytoplasmamembran lokalisiert sind.

Somit sollten die Fusionen an Aminosäuren in den periplasmatischen Loops

zwischen den Transmembrandomänen 1 - 2 bzw. 3 - 4 liegen. Des Weiteren sollten

Positionen für die Fusion kurz vor der ersten und hinter der vierten Trans-

membrandomäne bzw. im Loop zwischen den Transmembrandomänen 2 - 3 sowie in

dem N- und C-terminalen zytoplasmatischen Bereich gewählt werden. Mit dem

jeweiligen Enzymaktivitätstest könnten dann die verschiedenen Konstrukte auf ihre

Zugänglichkeit untersucht werden. Anhand der unterschiedlichen Enzymaktivitäten

kann die getestete Position der Fusion lokalisiert werden, da die alkalische Phos-

phatase im Zytoplasma und die β-Galaktosidase im Periplasma inaktiv ist. Die

4. Diskussion

96

Topologie von KdpD in einem Stamm mit einer nativen Phospholipidzusammen-

setzung wurde unter anderem mit dieser Methode analysiert (Zimmann et al., 1995).

Dabei fiel jedoch auf, dass die synthetisierten Mengen der verschiedenen Fusions-

proteine unterschiedlich und zudem auch noch instabil waren (Zimmann et al., 1995).

Solch eine Topologiestudie könnte unter Berücksichtigung dieser Problematik die

Funktionalität von KdpD in den „Lipid-Stämmen“, wie in der vorliegenden Arbeit

gezeigt, ergänzen.

Es wäre ebenfalls denkbar, dass KdpD mit anderen Proteinen wechselwirkt. Dieses

könnte anhand des „Bacterial two-hybrid systems“ für potentielle Kandidaten

überprüft werden (Karimova et al., 1998). Es wurde von Hamann et al. (2008) die

Hypothese vorgeschlagen, dass KdpD mit den membrangebundenen Phospholipid-

synthasen PlsB und PssA interagieren könnte, da diese in einem Komplex an den

Septen lokalisiert sind (Gully & Bouveret, 2006). Ebenfalls könnte mit dieser Methode

eine potentielle Wechselwirkung mit dem „multi-drug“ Effluxsystem AcrAB anhand

der gezeigten Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit untersucht werden. Für die

globalere Suche nach Interaktionspartnern von KdpD können in vivo Crosslinks

mittels HPINE („His-Protein-Interaction-Experiment“) nach Herzberg et al. (2007)

durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird das Zielprotein mit einen His-Tag

versehen. Zu der Bakterienkultur wird Formaldehyd gegeben, wodurch die momen-

tanen Protein-Protein-Interaktionen fixiert werden. Nach einer kurzen Inkubationszeit

werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen. Das Protein kann dann zusammen

mit seinen potentiellen Partnern über seinen His-Tag mittels Ni2+-NTA-Affinitäts-

chromatographie aufgereinigt werden. Nach der Auflösung der Crosslinks können die

Interaktionspartner durch Massenspektrometrie identifiziert werden. Erste Versuche

waren bislang jedoch noch nicht erfolgreich (Zimmann, pers. Mitteilung).

Aufgrund der Beobachtung von Hirakawa et al. (2003b), dass überproduziertes KdpE

in Zellen zu einer erhöhten Resistenz gegenüber Kanamycin führt, könnten weitere

Versuche unter diesem Aspekt durchgeführt werden. Möglicherweise könnten

entsprechende Plattentests ein Zusammenhang zwischen dem Kdp-System und dem

Effluxsystem AcrAB genauer verifizieren. Es könnten an die vorliegende Arbeit

angelehnte Versuche durchgeführt werden.

4. Diskussion

97

Die oben beschriebenen möglichen Interaktionsstudien von KdpD mit den Phospho-

lipiden der Zytoplasmamembran, intra- oder intermolekular mit sich selbst oder mit

anderen Proteinen sowie die Studie möglicher Konformationsänderungen sind für die

Erforschung des genaueren Mechanismus der Reizwahrnehmung durch das

KdpD / KdpE - System bzw. der Signalweiterleitung innerhalb dieses Systems von

großer Bedeutung.

5. Zusammenfassung

98

5. Zusammenfassung In dieser Arbeit wurde untersucht, ob K+-Limitation die Zusammensetzung der Phos-

pholipide der Membran in Escherichia coli beeinflusst. Es konnte gezeigt werden,

dass es unter K+-limitierenden Bedingungen im Medium zu einem Anstieg des

Cardiolipin (CL) Gehaltes auf Kosten des zwitterionischen Phospholipids Phos-

phatidylethanolamin (PE) während der exponentiellen Wachstumsphase kommt.

Durch den CL-Anstieg auf Kosten von PE steigt ebenfalls der Anteil an anionischen

Phospholipiden (PG und CL) an. Der Anstieg von CL konnte auf die Erhöhung der

transkriptionalen Aktivität des cls-Gens zurückgeführt werden, welches für die CL-

Synthase kodiert. Im Gegensatz zu den Kopfgruppen änderte sich die Fettsäure-

zusammensetzung der Phospholipide nicht signifikant unter K+-Limitation. Dieses

Phänomen tritt vermutlich auf, um die Lipide gegen den Abbau zu schützen.

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Kinaseaktivität von KdpD in seiner

nativen Membranumgebung durch Fusion mit Liposomen aus anionischen Phospho-

lipiden stimuliert wird, während diese durch Fusion mit Liposomen aus zwitter-

ionischen Phospholipiden reduziert wird. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass

die Höhe des gesamten Anteils anionischer Phospholipide neben der Kinaseaktivität

von KdpD auch die kdpFABC-Expression beeinflusst.

Die in die Zytoplasmamembran interkalierende Substanz Procain zeigte einen

signifikanten Einfluss auf die kdpFABC-Expression in Abhängigkeit von der Phospho-

lipidzusammensetzung der Membran. Für Derivate von KdpD konnte eine Erhöhung

der bereits vorhandenen Aktivität, aber kein neuer Phänotyp der Sensorkinase

ermittelt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse ist es vorstellbar, dass die Sensor-

kinase KdpD Änderungen der Membranspannung wahrnimmt. Des Weiteren

sprechen die Kinaseaktivitäten der fusionierten Membranvesikel für die Hypothese,

dass die Aktivität von KdpD durch die Krümmung der Membran beeinflusst wird.

Aufgrund der Beobachtung, dass die Resistenz gegenüber hohen Novobiocin-

Konzentrationen von dem Vorhandensein eines intakten KdpFABCDE-Systems

abhängig zu sein scheint, könnte auch eine Interaktion mit dem „multi-drug“ Efflux-

system AcrAB möglich sein.

6. Summary

99

6. Summary In this study it was investigated whether K+ limitation affects membrane phospholipid

composition in Escherichia coli. Our measurements revealed that there is an

increase in the cardiolipin (CL) content during the exponential growth phase at the

expense of the zwitterionic phospholipid phosphatidylethanolamine (PE) under K+

limitation. In addition, the CL increase at the expense of PE results in a higher

anionic phospholipid content (PG and CL). It could be shown, that the increase of CL

is the result of the increased transcriptional activity of the cls gene coding for the CL

synthase. In contrast to the head groups there was no significant change in the fatty

acid composition of the phospholipids under K+ limitation. Probably, this phenomenon

occurs to protect the lipids against degradation.

Furthermore, the kinase activity of KdpD is stimulated in its native membrane

environment by fusion with liposomes containing anionic CL while the addition of the

same amount of zwitterionic PE/PC liposomes results in a reduced kinase activity. In

addition, it could be observed, that the content of anionic phospholipids affects

beside the kinase activity of KdpD also the kdpFABC expression.

In addition, the cytoplasmic membrane intercalating reagent procaine had a

significant influence on kdpFABC expression depending on the phospholipid

composition of the membrane. For derivatives of KdpD an increase of already

existing activity, but no new phenotype for the sensor kinase could be observed.

Regarding these results, it is possible that the sensor kinase KdpD senses changes

of the membrane strain. Furthermore, the kinase activities of the fused vesicles lead

to the assumption that the activity of KdpD is influenced by the curvature of the

membrane.

Due to the fact that the resistance against high novobiocin concentrations seems to

depend on the presence of an intact KdpFABCDE system, an interaction with the

multi-drug efflux system AcrAB could be envisaged.

7. Literaturverzeichnis

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7. Literaturverzeichnis Ahnert, F., R. Schmid, K. Altendorf, and J. C. Grei e. 2006. ATP binding properties of the soluble part of the KdpC subunit from the Escherichia coli K(+)-transporting KdpFABC P-type ATPase. Biochem. 45: 11038-11046. Altendorf, K., and W. Epstein. 1996. The Kdp-ATPase of Escherichia coli, pp 403-420. In A.G. Lee (ed.), Biomembranes, Vol 5 (ATPases), London, JAI Press. Altendorf, K., M. Gaßel, W. Puppe, T. Möllenkamp, A . Zeeck, C. Boddien, K. Fendler, E. Bamberg, and S. Drosse. 1998. Structure and function of the Kdp-ATPase of Escherichia coli. Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 137-146. Alvis, S. J., I. M. Williamson, J. M. East, and A. G. Lee. 2003. Interactions of anionic phospholipids and phosphatidylethanolamine with the potassium channel KcsA. Biophys. J. 85: 3828-3838. Andreeßen, B. 2007. Einfluss des C-terminalen Bereichs der Sensordomäne auf die Reizperzeption der Histidinkinase KdpD von Escherichia coli. Masterarbeit. Universität Osnabrück. Aravind, L., and C. P. Ponting. 1997. The GAF domain: an evolutionary link between diverse phototransducing proteins. Trends Biochem Sci 22: 458-459. Arber, W. 1960. Transduction of chromosomal genes and episomes in Escherichia coli. Virology 11: 273-288. Arechaga, I., B. Miroux, S. Karrasch, R. Huijbregts , B. de Kruijff, M. J. Runswick, and J. E. Walker. 2000. Characterisation of new intracellular membranes in Escherichia coli accompanying large scale over-production of the b subunit of F1F0 ATP synthase. FEBS Letters 482: 215-219. Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moo re, J. G. Seidman, J. A. Smith, and K. Struhl. 1987. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. John Wiley and Sons. New York. Bakker, E. P. 1993. Cell K+ & K+-transport systems in prokaryotes, Alkali cation transport systems in prokaryotes (Bakker, E. P. ed.), CRC Press, 205-224, Boca Raton, Florida. Bakker, E. P., A. Borchard, M. Michels, K. Altendor f, and A. Siebers. 1987. High affinity potassium uptake system in Bacillus acidocaldarius showing immunological cross-reactivity with the Kdp system from Escherichia coli. J. Bacteriol. 147: 820-826. Balaji, B., K. O´Connor, J. R. Lucas, J. M. Anderso n, and L. N. Csonka. 2005. Timing of induction of osmotically controlled genes in Salmonella enterica serovar typhimurium determined with quantitative real-time reverse transcription-PCR. Appl. Environ. Microbiol. 71: 8273-8283. Ballal, A., and S. K. Apte. 2005. Differential expression of the two kdp operons in the nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena sp. Strain L-31. Appl. Environ. Microbiol. 71: 5297-5303. Ballal, B., B. Basu, and S. K. Apte. 2007. The Kdp-ATPase system and its regulation. J. Biosci. 32: 559-568. Becker, D., K. Fendler, K. Altendorf, and J.-C. Gre ie. 2007. The conserved dipole in transmembrane helix 5 of KdpB in the Escherichia coli KdpFABC P-type ATPase is crucial for coupling and the electrogenic K+-translocation step. Biochemistry 46: 13920-13928. Bogdanov M., J. Sun, H. R. Kaback, and W. Dowhan. 1996. A phospholipid acts as a chaperone in assembly of a membrane transport protein. J. Biol. Chem. 271: 11615–11618.


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Eidesstattliche Erklärung

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Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und

ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus

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Angabe der Quelle gekennzeichnet. Bei der Auswahl und Auswertung folgenden

Materials haben mir die nachstehend aufgeführten Personen in der jeweils beschrie-

benen Weise entgeltlich / unentgeltlich geholfen. Weitere Personen waren an der

inhaltlichen materiellen Erstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.

Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw.

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stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder

ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

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