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Literatur

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1)ipl.-Chem. Dr. K. Hofmann Bundesanstalt ffir Fleischforschung Inst. ffir Chemic and Physik 1)-8650 Kulmbach, Blaich 4

EinfluB des Gefrierens und Auftauens auf die subcellul/ire Vertei- lung der Aspartat-Aminotransferase in der Skeletmuskulatur ver-

sehiedener Gefliigelarten REINEI¢ HAM~{, DJURDJICA M~SlC a n d LVlSE T~ZLAFF*

Mitteilung aus dem Institut fiir Chemic und Physik der Bundesanstalt fiir Fleisctfforschung, Kulmbach (BRD)

Eingegangen am 17. Mai 1971

Influence of Freezing and Thawing on the Subcellular Dis t r ibut ion of Aspar ta te Aminotransferase in Pou l t ry Muscle

Summary. Freezing (--20 ° C) and thawing of the breast and thigh muscles of poultry (chicken, turkey, goose, duck) did not result in a remarkable change of the total activity of aspartate amino- transferase (glutamate-oxaloacetic transaminase; GOT) in the tissue. ~'reeze-storage for three months (--20 ° C) did not cause changes in the total GOT activity in chicken breast muscle but did lower the GOT activity in the thigh muscle of chicken. For both types of muscle of all species investigated, freezing and thawing of tissue caused an increase in the GOT activity of the muscle press-juice. This increase of GOT activity is due to a partial release of the mitochondrial isozyme GOT~[ into the sarcoplasma. Apparently the membranes of the muscle mitochondria are damaged by the process of freezing. A routine method basing on these results is decsribed which allows a differentiation between nonfrozen poultry and frozen and thawed poultry.

Zusammen/assung. Gefrieren (--20 ° C) nnd Auftauen der Brust- und Schenkelmuskulatur verschiedener Gefliigelarten (Huhn, Pure, Gans, Ente) fiihrte zu keiner nennenswerten Anderung der gesamten Akfivit~,t der Aspartat-Aminotransferase (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase; GOT) im Gewebe...Lgngere Gefrierlagerung (3 Monate) bei - -20 ° C brachte beim Brustmuskel des Huhns keine Anderung, beim Schenkelmuskel jedoch eine Abnahme der gesamten GOT- Aktivit~t mit sich. 1)er MuskelpreBsaft yon gefrorenem und aufgetautem Gewebe enthielt bei beiden Muskeln aller untersuchten Gefliigelarten eine hShere GOT-Aktivit~t als der PreSsaft des frisehen, nicht gefrorenen Gewebes. Diese ErhShung der GOT-Aktivit/it beruht auf einer dtLrch Gefrieren und Auftauen hervorgerufenen partiellen Freisetzung des Mitochondrien-Isozyms GOT~f in das Sarkoplasma. Offensichtlich werden die Membranen der Muskelmitochondrien durch Ge- frieren des Gewebes gesch~digt. Es wird eine auf diesen Resultaten beruhende Routinemethode zur Unterscheidung zwischen Frischgeflfigel and aufgetautem Gefriergefliigel beschrieben.

Ein le i tung

I n einer frfiheren Mit tei lung [1] ha t t en wir festgestellt, dad Aspar ta t -Amino- transferase (Glu tamat -Oxalaee ta t -Transaminase ; GOT; E. C. 2 .6 .1 .1 . ) in der Skelet- musku la tu r verschiedener Geflfigelarten in Fo rm yon zwei I sozymen vorkommt ,

* :Frgulein Herta Sauer danken wir fiir ihre fleiSige und geschickte :~,[itarbeit.

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yon denen das eine (GOT~) in den Mitochondrien, das andere (GOTs) im Sarko- plasma der Muskelzelle lokalisiert ist. Die beiden Isozyme lassen sich durch Elektro- phorese auf Membranfolie trennen und mit Hflfe eines speziilschen Spriihreagenses unter der UV-Lampe sich~bar machen.

Gefrieren and Auftauen des Skcletmuskelgewebes yon Schwein und Rind ver- ursachen durch Schiidigung der Muskelmitochondrien eine Freisetzung des Mito- chondrien-Isozyms in das Sarkoplasma [2]. Auf Grund dieser Beobachtung wurde eine Routinemethode zur Unterscheidung zwischen Frischfleisch und aufgetautem Gefrierfleisch entwickelt [2, 3]. Durch Elektrophorese des MuskelpreBsaftes und Be- sprfihen mit dem GOT-Reagens erscheinen unter der UV-Lampe bei Frischfleisch eine Bande (GOTs), bei aufgetautem Geffierfleisch hingegen zwei Banden (GOTs und GOT~).

Ffir die Brauchbarkeit des biochemischen Gefriernachweises bei Rind- und Schweinefleisch war es wichtig, dab w~hrend l~ngerer Kfihllagerung (4 ° C) dieser Fleischarten die GOT-Aktivit/it nicht merklich abnahm und dab im Verlaufe der normalen l~leischreffung das Mitochondrien-Isozym nicht aus den Mitochondrien in das Sarkoplasma fibertrat. Die Zuverl~ssigkeit des Gefriernachweises wird somit nicht durch den Reffungszustand, in welchem das Fleisch sich beim Einfrieren be- findet, beeinfluBt. Da nach unseren vorausgegangenen Untersuchungen [l ] auch bei Geflfigelflcisch die Aspartat-Aminotransferase post mortem cine hohe Stabilit/it auf- weist und selbst nach siebentiigiger Kfihllagerung (4 ° C) des Fleisches keine Schi~di- gung der Mitochondrien unter Freisetzung der mitochondrialen GOT eintritt, so sind wichtige Voraussetzungen ffir die Anwendung dieser Methode auf Geflfigel gegeben.

Um nun festzustellen, ob das biochemische Routineverfahren zur Unterscheidung zwischen Frischfleisch und Gefrierfleisch in der Tat auch auf Gefliigelfleisch anwend- bar ist, war es notwendig, den EinfluB des Geffierens und Auftauens der Gefliigel- muskulatur auf die subcellul/~re Verteilung der Aspartat-Aminotransferase zu stu- dieren.

Methodik Untersuchungsmaterial. Untersucht wurde je eine Probe folgender Geflfigelarten: Huhn, Pure,

Gans, Ente und Taube. Brust- und Sehenkelmuskulatur 2--4 Std naeh dem Schlach~en der Tiere entnehmen nnd bei --20°C einfrieren. Nach friiheren Arbeiten besteht eine enge Beziehung zwischen )Suskelfunktion und Transaminaseaktivit~t [1, 4], daher helle und dunkle Muskulatur getrennt untersuchen. Um den Einflu] l~ngerer Gefrierlagerung zu prfifen, Brust- und Schenkel- muskulatur eines Huhns nnmittelbar nach dem Schlachten einfrieren und 3 Monate bei --20 ° C lagern. Sehlie[~lieh wurde die Anwendbarkeit der Methodik zum Naehweis des Gefrierens und Auf- tauens an Gefriergefliigel (Huhn, Gans und Ente), das aus dem Handel gezogen war, gepriift. Auftauen der gefrorenen Proben bei Zimmertemperatur.

Extraktion der gesamten GOT-Aktivitgit aus dem Muskelgewebe; Trennung und Bestimmung der GOT-Isozyme in Muskelextrakt und Muskelpreflsa]t. Extraktion der gesamten GOT-Aktivit~t aus dem Muskelgewebe, Herstellung yon MuskelpreSsaft und Bestimmung der beiden GOT-Iso- zyme vgl. friihere Arbeiten [5--8]. Naeh der elektrophoretisehen Trennung der GOT-Isozyme auf Celluloseacetatmembranen und Bestimmung der GOT-Aktivit~t in den Eluaten der einzelnen Abschnitte der Membranfolie lie] sieh bei den beiden Muskelarten etwa 100% der aufgetragenen GOT-Al:tivi~t wiederfinden. GOT-Aktivit~t: in Biicher-Einheiten pro g Gewebe (BE/g) oder pro ml PreSsaft (BE/ml); spezifische Aktivit~t: GOT-Aktivit~t in Bfieher-Einheiten, bezogen auf 1 mg Protein ;,,relative Aktivit~t" : Aktivit~t der GOT-Isozyme in °/o der gesamten GOT-Aktivit~t.

Ergebnisse und Diskussion

Einflufi des Ge/rierens und Au/tauens au] die gesamte GOT.Aktivit~it in Muslcelextralct und Muslcelpre[3sa/t

1. Muskelextralct. Durch Gefrieren und Auftauen i~ndert sich die gesamte GOT- Aktivit~t in der Brustmuskulatur aller untersuchten Geflfigelarten nur unwesentlich; nur bei der Brustmuskulatur der Ente nahm die gesamte GOT-Aktivitiit durch Gefrieren um 26~o ab (Tab. 1). Bei der Schenkelmuskulatur sind die Schwankungen

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etwas gr6Ber, aber aueh hier konnte keine st/~rkere Abnahme der gesamten GOT- Aktivit/it durch Gefrieren und Auftauen festgestellt werden (Tab. 1). Die Xnderungen der spezifischen GOT-Aktivit/~t naeh dem Gefrieren entspreehen in etwa denen der gesamten GOT-Aktivit/it. Bei der Brustmuskulatur des Huhns nahm die gesamte GOT-Aktivit/it aueh naeh I/~ngerer Gefrierlagerung (3 Monate bei - 20 ° C) nieht ab (Tab. 2). Diese Ergebnisse stimmen mit den bei der Skeletmuskulatur yon Sehwein und Rind erhaltenen Befunden gut iiberein [2]. Bei der Sehenkelmuskulatur des Huhnes hatte die GOT-Aktivit/it nach dreimonatiger Gefrierlagerung um etwa 50% abgenommen (Tab. 2). Die spezifische GOT-Aktivit/~t hat sieh dabei nieht wesentlieh ver/indert, da sich auch der Gehalt an extrahierbarem Protein dureh die lange Ge- frierlagerung vermindert habte.

2. Muskelpre[3sa]t. Die GOT-Aktivit/~t im MuskelpreBsaft wurde dutch Gefrieren und Auftauen yon Brust- und Sehenkelmuskeln aller untersuehten Gefltigelarten erh6ht (Tab. 1). Eine ErhShung der gesamten GOT-Aktivit/it im MuskelpreBsaft konnte aueh naeh Ianger Gefrierlagerung (3 Monate bei - 20 ° C) bei beiden Nuskeln des Huhnes festgestellt werden (Tab. 2). Auch bei der Muskulatur yon Schwein und Rind war im Muskelpregsaft naeh dem Gefrieren, unabh/ingig v o n d e r Dauer der Gefrierlager~ng (bis zu 6 Monate), stets eine h6here GOT-Aktivitiit festzustellen Ms im Pregsaft des nichtgefrorenen Gewebes [2]. Die Ursache fiir die erh6hte GOT- Aktivit/it im Muskelprel~saft des aufgetauten Geflfigelfleisehes ist, wie im n/~ehsten Absehnit$ gezeigt werden soll, eine durela Gefrieren hervorgerufene Freisetzung des Mitochondrienisozymes in das Sarkoplasma.

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Abb. 2. Trennung der GOT-Isozyme dutch Elektrophorese des NfuskelpreBsaftes aus frischem (o-- -o) und gefrorenem und aufgetautem ( • - - • ) Schenkelmuskel des Hulmes

Einflu fl des Ge/rierens und A u/tauens au] die subcelluldre Verteilung der GOT-Isozyme in der Muskulatur verschiedener Gefli~gelarten

Nach der Elektrophorese des Nuskelpregsaftes yon frischera, unzerkleinertem Geflfigelfleiseh und Besprfihen der Membranen mit dem GOT-spezifischen Reagens ist auf dem Elektropherogramm unter der UV-Lampe nut eine schnell zur Anode wandernde Bande, n/imlich das Sarkoplasma-Isozym (GOTs), feststellbar. Im Elektro- pherogramm des MuskelpreBsaftes yon aufgetautem Gefrierfleiseh erscheint noch eine zus~tzliche, langsam zur Anode wandernde Bande, bei der es sieh nach unseren friiheren Untersuehungen [1] um das Mitoehondrien-Isozym (GOTM) handelt. Die Verteilung der GOT-Aktiviti~t auf dem Elektrophoresestreffen ist in Abb. 1 ffir den

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MuskelpreBsaft der Brustmuskulatur, in Abb. 2 fitr den MuskelpreBsaft der Schenkel- muskulatur des Huh]as wiedergegeben. Wie man sieht, t r i t t naeh Gefrieren und Auf- tauen eine starke GOT~-Aktivitiit im PreBsaft auf. Die niedrige Aktiviti~t des Mito- chondrien-Isozyms GOT~ im MuskelpreBsaft von frisehem Fleiseh ist dutch die un- vermeidliehe Seh£digung der Muskelmitochondrien an den Ansehnittstellen der Gewebeproben, aus welchen der MuskelpreBsaft hergestellt wurde, bedingt. Durch Gefrieren und Auftauen werden die Mitoehondrienmembranen offenbar so geschgdigt, dab es zu einer erhebliehen Freisetzung des zuniiehst ziemlieh lest an die Mitoehon- drienmembranen gebundenen Isozyms kommt. Eine eingehende Begrfindung ffir diese Vorstellung wurde bereits frtiher gegeben [2]. Eine starke ErhShung der rela- riven GOT~-Aktivi tat im MuskelpreBsaft nach Gefrieren und Auftauen des Gewebes war beim Brustmuskel (Abb. 3) nnd Sehenkelmuskel (Abb. 4) aller nntersuehten Gefltigelarten festzus~bellen. Bei Gefl/igel, das im gefrorenen Zustand aus dem Handel bezogen worden war, lag die im MuskelpreBsaft gemessene relative GOTM-Aktivit/it in etwa der gleichen I t6he wie bei Geflfigel, das 2 - 4 Std post mortem bei - 2 0 ° C gefforen und 2 Tage gefriergelagert worden war (Abb. 5).

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A: Proben yon Gefltigel, das innerhalb von 2--4 Std post mortem bei --20 ° C eingefroren und 2 Tage gefroren gelagert worden war. ]3: Proben yon Geflfige], das in gefrorenem Zustand aus dem Handel

gezogen worden war. Die Zeit der Gefrierlagertmg ist unbekannt

Routine-Methode zur Unterscheidung zwischen /rischem und au/getautem Ge]riergefli~gel

Aus den vorliegenden Resultaten geht hervor, dab sich die biochemische Me~hode zur Unterscheidung zwischen frischem und gefrorenem, aufgetautem Rind- und Sehweinefleisch [3] auch auf Gefliigelfleisch anwenden l~Bt. Wenn auch Geflfigelfleisch

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in wesentlich geringerer Menge konsumiert wird Ms Rind- und Schweinefleiseh, so ist doch die MSgliehkeit einer Anwendung dieser Methodik auf diese Fleischar~ yon be- sonderem Interesse, da heute Geflfigel meist in gefrorenem Zus~and in den Handel kommt und aufgetautes Gefriergeflfigel schon wiederholt als frisehe Ware angebo~en wurde. Die HShe der GOT-Aktivit~t in der hellen und dunklen Muskulatur des t tuh- nes entsprieht etwa derjenigen in der Skeletmuskulatur yon Schwein und Rind [1, 6]. Man kann daher methodisch in gleieher Weise verfahren.

Muskelprel3saft mit der gleichen Menge Phosphatpuffer (0,1 mol; pH 7,6) verdiinnen; 5 ~I dieser Fliissigkeit mit einer Blutpipette au~ eine mit dem Phosphatpuffer befeuchtete Cellulose- acetat-Membranfolie auftragen. Bei einer Spannung yon 100--150 V (gemessen an den Enden des Streifens) Elektrophorese etwa 12 Std laufen lassen; bei Hochspannungselektrophorese (z. B. 1000 V; 20--30 mA) Trennung bereits nach 60--90 rain beendet. Den noch feuchten Streifen mit einem Reagens rein bespriihen, durch AuflSsen des Inhaltes yon einem Fl~sehchen ,,GOT- Monotest" (Fa. C.F. Boehringer u. SShne, GmbH, Mannheim) in Phosphatpuffer unter Zusatz yon etwa 3 mg NADH (Na-Salz) zu erhalten. Falls efforderlich, Bespriihen ein- bis zweimal wieder- holen. Beim Betrachten des Streifens unter der UV-Lampe (gefiltertes UV-Licht, 365 nm) er- scheint bei frischem Gefltigel eine einzige dunkle Bande auf hell-fluorescierendem Hintergrund; bei aufgetautem Gefriergefliigel hingegen treten zwei deutliche dunkle Banden auf.

Dal~ der Prel3saft des frisehen, nieht gefrorenen Fleisches neben der starken GOTs-Bande bisweflen eine ganz sehwaehe GOTM-Bande aufweisen kann, war bereits bei Schweinefleisch beobaehtet worden [2, 3]. Diese schwaehe, dureh Gewebeseh~di- gung an den Ansehnittfl/~chen bedingte Bande stSrt jedoch den Gefriernachweis nicht. Wie wir im Falle der Schenkelmuskulatur des Huhns feststellen konnten, l~Bt sieh die schwache GOT~-Bande im Elektropherogramm des Prel]saftes aus frisehem, nieht gefrorenem Geflfigelfleiseh dutch etwas st~rkere Verdiinnung mit Phosphat- puffer (z. B. 1 : 5) vSllig zum Verschwinden bringen, ohne dal~ die Zuverl~ssigkeit des Gefriernachweises hierdurch beeintr~chtigt wird.

Die bier beschriebene, mit einfachen Mi~teln durehzuffihrende bioehemische l~outinemethode ist unseres Eraehtens gut daffir geeignet, im Rahmen der Lebens- mitteliiberwachung aufgetautes Gefriergeflfigel sicher yon Frischgeflfigel zu unter- scheiden.

Literatur

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