This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

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Untersuchungen zum endogenen Stoffwechsel von Mykobakterien

5. Mitt.: Über den Einfluß von Ethambutol auf den endogenen Stoffwechsel von M. smegmatis

The Endogenous Metabolism of Mycobacteria V : The Influence of Ethambutol on the Endogenous Metabolism of M. smegmatis

H . REUTGEN u n d H . IWAINSKY

Forschungsinstitut für Lungenkrankheiten und Tuberkulose, Berlin-Buch Direktor: OMR Prof. Dr. med. habil. P. STEINBRÜCK)

(Z. Naturforsch. 27 b, 1405—1411 [1972] ; eingegangen am 27. Juni 1972)

Mycobacteria, endogenous respiration, phosphate metabolism, ethambutol, mode of action

1. Under conditions of the endogenous respiration the mode of action of ethambutol on myco-bacteria was studied. Oxygen uptake, 32P-incorporation and changes in the phosphate-content were measured as parameters for the behaviour of the metabolism.

2. In order to localize the first step of inhibition the radioactive isotope was applicated in a fixed chronological order and a fractionation in acid-soluble fraction, polyphosphate-, RNA- and DNA-fraction was carried out.

3. Proportional to the incubation periode the 32P was incorporated into the acid-soluble frac-tion, into the polyphosphate- and into the RNA-fraction in about the same proportions. The content in the DNA-fraction is nearly 200-times lower than in the RNA-fraction.

4. The main part of the phosphate is localized in the RNA ( ~ 6 0 % ) . Only in the begin of the incubation periode the part of the acid-soluble fraction is higher than that of the polyphosphate fraction.

5. The main part of the phosphate, transferred from the culture medium into the bacteries, was found in the polyphosphate fraction. During the incubation periode the phosphate-content in the RNA-fraction remains nearly unchanged. After decreasing to the begin the same was found for the acid-soluble fraction.

6. The specific activity of the polyphosphate fraction rises not continuously, according to the changes of the polyphosphate-content. Depending on the incubation periode the occured changes in the relations of the single fractions are similar in both the control- and the Ethambutol-trial.

7. In contrary to the results of other authors these investigations showed the same degree of inhibition of the phosphate metabolism in the acidsoluble fraction, the polyphosphate and the RNA-fraction.

8. Under conditions of the endogenous respiration ethambutol is inhibiting the phosphorylation of specific compounds of the intermediar-metabolism in the acid-soluble fraction or their further reactions. On the other side the changed incorporation of the 32P can be explained with a alterated permeability of the cell wall of the bacteria.

Beim Studium der Wirkungsmodi von Isonikotin-säurehydrazid und Äthioniamid 2 erwies sich der Phosphatstoffwechsel unter bestimmten Bedingungen als frühzeitiger Indikator für Störungen des Gesamt-stoffwechsels. Diese Indikatorrolle erklärt sich aus der engen Verknüpfung des Phosphatstoffwechsels mit den anabolischen und katabolischen Prozessen des Intermediärstoffwechsels. Darüber hinaus sind Mykobakterien gekennzeichnet durch das Vorhan-densein anorganischer Polyphosphate3 -6 . Die Frage nach der Funktion dieser Polyphosphate7-12 ist, nachdem z. B. bei M. phlei eine Polyphosphathexo-kinase gefunden wurde, die ohne Vermittlung des

Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. med. habil. P. STEINBRÜCK, Forschungsinstitut für Lungenkrankheiten und Tuberkulose, X-1115 Berlin-Buch, Karower Str. 11.

Adenylsäuresystems anorganisches Polyphosphat verwertet13-15, gerade im Zusammenhang mit der Wirkungsweise des Ethambutols erneut interessant geworden 1 6 _ 1 8 .

Davon ausgehend sind unter Einsatz von radio-aktivem Phosphat (32P) Studien zum Wirkungs-modus des Ethambutols (EMB) bei M. smegmatis unter endogenen Bedingungen durchgeführt worden, über deren Ergebnisse nachstehend berichtet wird.

Material und Methode

Als Teststamm wird M. smegmatis (Stamm 801 Ber-lin) nach Subkultur auf festem Nährboden (Hohn 4 nach G O T T S A C K E R 19) eingesetzt. Das Abernten der 4 Tage alten Bakterien und die Herstellung der Bak-teriensuspension erfolgt in bereits beschriebener

1 4 0 6 H . R E U T G E N U N D H . I W A I N S K Y

Weise20, wobei die Einsaatdichte einem Bakterien-feuchtgewicht von 8 mg/ml entspricht.

Bei den Untersuchungen unter endogenen Bedin-gungen werden die Keime in 0,1 M Zitratpuffer inku-biert. Die vergleichsweise an proliferierenden Keimen vorgenommenen Untersuchungen erfolgen im Kirchner-Substrat 30 modifiziert nach H E R R M A N N 21 mit Aspara-gin als Stickstoff- und Glycerin als Kohlenstoffquelle.

Die Messung der Sauerstoffaufnahme geschieht in üblicher Weise im Warburg-Apparat. Zur Markierung wird das 32P in Form von H332P04 dem Inkubations-medium bei Versuchsbeginn zugesetzt und zur Aufrecht-erhaltung eines normalen Phosphatstoffwechsels über den gesamten Versuchszeitraum durch Zugabe von sta-bilem K2HP04 für eine bestimmte 32P/31P-Relation ge-sorgt 22' 23. Bei den Untersuchungen, wo die Methode der differenzierenden Markierung 1> 24 angewandt wird,

erfolgt die jeweilige Zugabe des Isotops zu Beginn des zu untersuchenden Zeitbereiches, d. h. nach 0, 2, 4 und 8 Stdn. Grobfraktionierungen der markierten Bakterien werden nach dem in Abb. 1 wiedergegebenen Schema — modifizierter Ogur-Rosen/Schneider-Trennungs-gang 2 5 - 2 7 — vorgenommen.

Die Messung der 32P-Aktivität im Kulturfiltrat sowie in den einzelnen Fraktionen ist bereits beschrieben worden 1. Die Erfassung des Gesamtphosphates erfolgt, nachdem die zu analysierenden Proben mit einem Ge-misch von konz. HN03/HC104 (50 : 1) aufgeschlossen, wurden, nach der Methode von A L L E N 2 8 .

Die als Inhibitor eingesetzte Ethambutol-Reinsub-stanz * (D-2.2'-[Äthylendiimino]-di-l-butanoldihydro-chlorid) des VEB Berlin-Chemie wird jeweils in steriler wäßriger Lösung appliziert.

G r o b f r a k t i o n i e r u n g s - S c h e m a

Markierte Bakterien

Kultur-filtrat

(KF)

säure-lösliche Fraktion

(SF)

Proteine (lösliche)

3 x 45 ml i phys. NaCl

1 x 45 ml ^ Aqua dest.

2 x 4 0 ml A/Ä (1:1) , l h

1 x 4 0 ml j A/Ä (1:1) , 2h

3 x 4 0 ml ] CHC13 , 30'

2 x 40 ml j A/Ä (1:1) , 30'

2 x 20 ml 5-proz. HC104

20' bei 90 °C

t 2 x 8 ml 2-proz. HC104

t 2 ml konz. HC104, lh

2 x 40 ml | 0,6 M HC104 , lh

1 x 40 ml j 0,2 M HC104 , lh

2 x 40 ml j Aqua dest., 10' RNA + DNA

verd. | BaCl2

Polyphosphat-fällung

3 x 10 ml 2M NaCl lh bei 90 °C

gesättigte j BaCl2-Lösunj

Bakterienrest (Phosphoproteine)

Polyphosphate + RNA + DNA

DNA-Fraktion

Polyphosphat-fraktion (PP)

RNA-Fraktion

Abb. 1. Grobfraktionierungs-Schema für Mykobakterien. A/Ä = Äthanol/Diäthyläther-Mischung, | = Suspendieren + Zen trifugieren, <—> = Abdekantieren, * = Ausfällen.

* Für die Überlassung der Substanz sei auch an dieser Stelle dem VEB Berlin-Chemie nochmals herzlich gedankt.

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Ergebnisse

Der Einfluß von Ethambutol auf die Sauerstoff-aufnahme der Keime von M. smegmatis wird unter endogenen Bedingungen und vergleichsweise auch unter Bedingungen einer Vermehrungs-Atmung ge-testet. Dabei zeigen proliferierende Keime das be-kannte Verhalten 29> 30, d. h. nach 3-stdg. Inkuba-tionszeit wird die Wirkung des Mittels bei einer Konzentration von 1 /^g/ml erkennbar. Höhere Kon-zentrationen (250 jug/ml) bewirken keinen früheren Hemmeffekt, sondern vergrößern diesen nur gering-fügig. Demgegenüber sind unter Bedingungen der endogenen Atmung bei den eingesetzten Konzentra-tionen (0,1 - 2 5 0 , 0 yug EMB/ml) und einer Inku-bationszeit bis 12 Stdn. keine Störungen in der Sauerstoffaufnahme festzustellen.

Wird der Einfluß des Ethambutols auf den Phos-phatstoffwechsel der Keime mit Hilfe von 32P als Indikator unter endogenen Bedingungen getestet, so läßt sich, wie Tab. I zu entnehmen ist, eine Inhibi-tion desselben auch bei pH 7 — bei pH 5 und 6 zeigt das Mittel keinen Hemmeffekt — erst durch den Einsatz relativ hoher Konzentrationen ( 1 0 - 2 M ) nachweisen.

Tab. I. Einfluß der Ethambutol-Konzentration auf den 32P-Einbau der Keime. Inkubationszeit: 12 Stdn. bei pH 7 ; Bak-

terieneinsaat : 8 mg Feuchtgewicht/ml.

Kontrolle EMB-Konzentration (Mol/l) IO-6 IO-5 IO"4 IO"3 10-2

25 100* 25 360 25 280 24 300 24 150 17 020 100** 101 101 97 96 68

Zahlenangaben: * eingebaute Radioaktivität in cpm/ml; ** eingebaute Radioaktivität in % zur Kontrolle.

16 24 32 Stdn.

Abb. 2. Inhibition des 32P-Einbaues durch Ethambutol in Ab-hängigkeit von der Inkubationszeit. EMB-Konz.: 10~ 2 M,

Bakterieneinsaat: 8 mg Feuchtgewicht/ml.

Bei Einsatz dieser Inhibitor-Konzentration wer-den in Abhängigkeit von der Inkubationszeit die in Abb. 2 angeführten 32P-Einbauraten erhalten. Dem-nach ist die Inhibition nach 8-stdg. Bebrütung am stärksten, wird danach wieder geringer und ist auch nach 32 Stdn. noch nicht völlig aufgehoben.

Wird der 32P-Gesamteinbau nach 12-stdg. Inkuba-tionszeit durch anschließende Grobfraktionierung der Kontroll- wie auch Ethambutol-Ansätze in säure-lösliche Fraktion (SF), Polyphosphatfraktion (PP), Ribonukleinsäure- (RNA) und Desoxyribonuklein-säure-Fraktion (DNA) aufgeschlüsselt, dann ergeben sich die in Abbn. 3 und 4 dargestellten Ergebnisse.

[Stdn]

Abb. 3. Einfluß des Ethambutols auf die 32P-Aufnahme der säurelöslichen Fraktion und der Polyphosphat-Fraktion. Kon-troll-Ansatz , Ansatz mit 10~ 3 M , Ansatz mit 1 0 - 2 M EMB , Inkubationszeit 12 Stdn. Bakterien-

einsaat : 8 mg Feuchtgewicht/ml.

5000

2 4000 -Sc

I 3000 o o

^2000

1000

12 [Stdn]

Abb. 4. Einfluß des Ethambutols auf die 32P-Aufnahme der RNA- und DNA-Fraktion. Kontroll-Ansatz -———, Ansatz mit 10 3 M EMB , Ansatz mit 10~ 2 M EMB , Inkubationszeit 12 Stdn. Bakterieneinsaat: 8 mg Feuchtge-

wicht/ml.

Bei 1 0 - 3 M Ethambutol-Zusatz ist demnach nur eine sehr geringfügige Beeinflussung des Einbaues in die säurelösliche Fraktion und in die Polyphos-

1 4 0 8 H . R E U T G E N U N D H. I W A I N S K Y

phat-Fraktion nachzuweisen. Die Einbaurate sinkt dabei auf maximal 94% gegenüber der jeweiligen Kontrolle ab. Bei 1 0 - 2 M Zusatz ist die Hemmwir-kung bei 4 Stdn. bereits deutlich zu erkennen, ver-stärkt sich kontinuierlich und erreicht nach 12 Stdn. Werte von 71% bei der säurelöslichen Fraktion bzw. 56% bei der Polyphosphat-Fraktion.

Ähnlich verhält sich bereits unter Einfluß von 1 0 - 3 M Ethambutol, wie auf Abb. 4 hervorgeht, der Einbau bei der RNA. Hier sinkt die Einbaurate auf 81% ab. Bei dieser Inhibitor-Konzentration zeigt die DNA erst nach 8-stdg. Inkubation eine ge-ringe Beeinflussung der Einbaurate, die nach 12 Stdn. schließlich 84% beträgt. Eine Erhöhung der Inhibitor-Konzentration auf 1 0 - 2 M bedingt ledig-lich eine verstärkte Inhibition des Einbaues bei der RNA-Fraktion (12-Stdn.-Wert: 57%) und DNA-Fraktion (12-Stdn.-Wert: 69%).

Bei Anwendung der Methode der differenzieren-den Markierung 1 ' 24 und ebenfalls anschließender Grobfraktionierung der markierten Keime ist eine bessere zeitliche Lokalisierung der Ethambutol-Stö-rung möglich, die letztlich auch unter dem Aspekt des Wirkungsmechanismus des Mittels von Bedeu-dung ist (vgl. Tab. II). Danach sind bei 10~3M Zu-satz von Ethambutol die Einbauraten bei der säure-

Tab. II. Einfluß der Ethambutol-Konzentration auf den 32P-Einbau bei der säurelöslichen Fraktion, Polyphosphat-, RNA-und DNA-Fraktion in den einzelnen Markierungsbereichen. Bakterieneinsaat: 8 mg Feuchtgewi cht/ml; Zahlenangaben: * eingebaute Radioaktivität in 103 cpm/Fraktion; ** einge-

baute Radioaktivität in % zur jeweiligen Kontrolle.

EMB- Frak- Markierungsbereiche in Stdn. Konz. tion 0 - 2 2 - 4 4 - 8 8 - 1 2

IO-3 M SF 1082 101 923 93 1685 90 1710 94 PP 292 98 717 96 1838 94 1909 94 R N A 49 89 400 53 1870 80 1830 93 DNA 3,0120 2,5 92 6,0 71 4,0 62

IO-2 M SF 1092 102 669 67 1261 67 1103 61 PP 293 98 451 61 1087 56 1003 49 R N A 95 173 550 73 1250 53 1050 53 DNA 3,5 140 3.0 86 3,5 54 3,0 46

löslichen Fraktion und der Polyphosphatfraktion ab 2. Markierungsbereich geringfügig erniedrigt. Das auffallendste Ergebnis ist die Störung in der RNA-Fraktion, die nach maximaler Hemmung des Ein-baues im 2. Markierungsbereich (53% zur Kon-trolle) geringer wird und im Bereich von 8 — 12 Stdn. bereits wieder zu Einbauraten von 93% führt. Dieser Befund zeigt, daß die durch 10~3 M Etham-

butol-Zusatz bedingte Störung in der RNA-Fraktion scheinbar auch ohne Zugabe irgendwelcher Substrate zumindest für die angeführten Zeitbereiche rever-sibel ist. Demgegenüber ist bei der DNA-Fraktion — nach anfänglicher Stimulierung wird der 32P-Einbau in den nachfolgenden Markierungsbereichen inhibiert — im untersuchten Zeitbereich eine Rever-sion der Stoffwechselstörung nicht festzustellen.

Eine Erhöhung der Ethambutol-Konzentration auf M hat zur Folge, daß der 32P-Einbau in die

säurelösliche Fraktion und vor allem in die Poly-phosphat-Fraktion in erheblichem Maße inhibiert wird. Bei der RNA- und DNA^Fraktion bewirkt diese Erhöhung im Bereich von 0 — 2 Stdn. eine starke Stimulierung des 32P-Einbaues. Bei beiden Fraktio-nen schlägt der stimulierende Effekt des Ethambutols bereits im 2. Markierungsbereich in eine Hemmung um. Während diese bei der RNA-Fraktion ab einer Inkubationszeit von 4 Stdn. mit 53% gleichbleibt, nimmt sie bei der DNA-Fraktion weiterhin zu. Die höhere Inhibitor-Konzentration führt aber dazu, daß im Untersuchungszeitraum die Störung des RNA-Stoffwechsels nicht mehr reversibel gestaltet werden kann.

Bemerkenswert sind noch die gegenüber den ande-ren isolierten Stoffwechselfraktionen sehr niedrigen Einbauraten bei der DNA-Fraktion, die damit stoff-wechselchemisch kaum in Erscheinung tritt und des-halb bei der weiteren Betrachtung unberücksichtigt bleibt.

Obwohl die mit dem 32P-Isotop als Indikator er-haltenen Ergebnisse hinsichtlich der Dynamik der Ethambutol-Störung aufschlußreich sind, muß doch in Betracht gezogen werden, daß nicht in jedem Falle der Einbau des Isotops ein Spiegelbild des Ge-samtgeschehens ist. Das trifft dann zu, wenn bei die-sen relativ kurzen Markierungszeiten in die Stoff-umsetzungen körpereigene Reservestoffe, z. B. nicht oder nur gering markierte Polyphosphate bzw. anderweitige Phosphatreserven einbezogen werden.

Hier ist die Bestimmung der spezifischen Aktivi-

tät der Stoffwechselfraktionen die Methode der Wahl. Die dabei erhaltenen Werte zeigen, daß die säurelösliche Fraktion, die Polyphosphat- und RNA-Fraktion durch 10~2M Ethambutol in nahezu glei-cher Weise beeinträchtigt werden. Für die angeführ-ten 3 Fraktionen liegt das Mittel der spezifischen Aktivität im Markierungsbereich von 2 — 4 Stdn. bei 73%, von 4 - 8 Stdn. bei 82% und von 8 - 1 2 Stdn.

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bei 60%. Die größte gemessene Abweichung beträgt 3%.

Einen absoluten Vergleich der in den Kontroll-ansätzen für die einzelnen Markierungsbereiche und Stoffwechselfraktionen gemessenen spezifischen Akti-vitäten ermöglicht Abb. 5.

100 (100)

3000

• 2000

1000

700 (100)

(60)

0-2 2-4 Markierungsbereiche •

19 (17)

-12 Stdn.

Abb. 5. Verlauf der spezifischen Aktivität in der säurelös-lichen Fraktion, Polyphosphat- und RNA-Fraktion der Kon-trollansätze für die einzelnen Markierungsbereiche. • säure-lösliche Fraktion, • Polyphosphat-Fraktion, |//////| RNA-Fraktion. Bakterieneinsaat: 8 m g Feuchtgewicht/ml, EMB-Konz. 10~ 2 M. Zahlenangaben = % zur spezifischen Aktivität der säurelöslichen Fraktion der Kontrollansätze. Zahlenanga-ben in Klammern = entsprechende Werte der Ethambutol-

ansätze.

Es überwiegt, wie zu erwarten, die säurelösliche Fraktion bereits vom ersten Markierungsbereich an. Sie liegt 10-fach höher gegenüber der RNA- und ca. 3-fach höher gegenüber der Polyphosphat-Fraktion. Diese Relationen verringern sich mit zunehmender Inkubationszeit. Im Bereich von 8 —12 Stdn. wird nur noch die 5-fache spezifische Aktivität gegenüber der RNA- bzw. die ca. 1,5-fache gegenüber der Polyphosphat-Fraktion gefunden. Dabei ist die größte Veränderung im Markierungsbereich von 4 — 8 Stdn. zu verzeichnen.

Bezieht man die entsprechenden, unter Einfluß von 1 0 - 2 M Ethambutol erhaltenen Werte (sie sind vergleichsweise in Klammern mitangeführt) in diese Betrachtungen ein, so werden wider Erwarten die gleichen Relationen zwischen den einzelnen Stoff-

wechselfraktionen wie bei den Kontrollansätzen er-halten.

Die Veränderungen in der spezifischen Aktivität werden, wie aus der Bestimmung des Gesamtphos-phates - vgl. Tab. III - hervorgeht, bei der RNA-Fraktion weitgehend durch die 32P-Einbaurate be-einflußt. Im Inkubationszeitraum von 12 Stdn. bleibt

Tab. III. Veränderungen des Gesamtphosphatgehaltes der säurelöslichen Fraktion, Polyphosphat- und RNA-Fraktion in den einzelnen Markierungsbereichen unter Einfluß von Ethambutal. Bakterieneinsaat: 8 mg Feuchtgewicht/ml, EMB-Konz. I O " 2 M; * Gesamtphosphatgehalt in % zur jewei-

ligen Kontrolle.

Stoffwechsel-fraktion

Gesamtphosphatgehalt [mg] Markierungsbereiche in Stdn. 0 - 2 2 - 4 4 - 8 8 - 1 2

SF Kontr . 1,64 1,37 1,42 1,32 IO"2 M E M B 1.62 1,43 1,38 1,29 * 99 104 97 98

P P Kontr . 1,24 1,86 2,12 2,36 IO"2 M E M B 1,42 1,76 1,96 2,18 * 115 95 93 92

R N A Kontr. 5,00 5,0<) 4,80 4,80 i o - 2 M E M B 5,00 4,84 4,88 4,84 * 100 97 102 101

der Gesamtphosphatgehalt bei dieser Fraktion gleich bzw. sinkt nur geringfügig ab. Während bei der säurelöslichen Fraktion nach anfänglichem Abfall der Phosphatgehalt gleichbleibt, verdoppelt sich die-ser Wert nahezu bei der Polyphosphat-Fraktion.

Die unter Einfluß von 1 0 - 2 M Ethambutol erhal-tenen Veränderungen der Gesamtphosphatkonzentra-tion betreffen vor allem die Polyphosphat-Fraktion. Sie zeigen sich in einer Erhöhung gegenüber der Kontrolle im 1. Markierungsbereich und nachfolgen-dem Absinken auf 92% nach 12 Stdn. Alle anderen festgestellten Abweichungen vom Kontrollansatz sind ^ 4% und liegen damit im Bereich der Fehlerbreite der Methode.

Auswertung der Ergebnisse

Bekanntlich reagieren Mykobakterien unter Be-dingungen der endogenen Atmung gegenüber En-zyminhibitoren oder Antituberkulotika unempfind-licher als proliferierende Keime 31, 32. Die Stoffwech-selvorgänge verlaufen aber übersichtlicher als unter Vermehrungsbedingungen, wo eine Auswertung von Inkorporationsversuchen durch die gleichzeitig er-folgende Proliferation außerordentlich schwierig ist33. Die Empfindlichkeit des gewählten Parameters ist für die Aussagen nicht ohne Bedeutung. So spre-

1 4 1 0 E N D O G E N E R S T O F F W E C H S E L V O N M Y K O B A K T E R I E N 1410

chen FORBES und Mitarb. 34 auf Grund der Messung der Sauerstoffaufnahme dem Ethambutol eine Wir-kung auf nichtproliferierende Mykobakterien ab. Auch im vorliegenden Fall wird die Sauerstoffauf-nahme durch Ethambutol im untersuchten Zeitraum nicht verändert, während der wesentlich empfind-licher reagierende Phosphatstoffwechsel bereits eine deutliche Hemmung des 32P-Einbaues anzeigt.

Eine erste Lokalisierung des Angriffspunktes des Ethambutols ist durch eine Grobfraktionierung bei gleichzeitiger Erfassung der 32P- und der Gesamt-phosphatkonzentration möglich. Das eingebaute mar-kierte Phosphat verteilt sich im Kontrollansatz nach 12-stdg. Inkubation etwa zu gleichen Anteilen auf die säurelösliche Fraktion, Polyphosphat- und RNA-Fraktion. Der 32P-Einbau und die Phosphatkonzen-tration der DNA sind so gering, daß eventuelle Ver-änderungen nicht exakt erkannt werden können. Die durch Ethambutol bedingte Hemmung ist bereits im Bereich von 2 — 4 Stdn. erkennbar. Der 32P-Einbau wird bei 10 _ 3 M Zusatz nur in der RNA-Fraktion deutlich inhibiert. Bei 1 0 _ 2 M Zusatz sind Polyphos-phat- und RNA-Fraktion stärker betroffen als die säurelösliche Fraktion. In der RNA-Fraktion ist ver-mutlich als Folge von Kompensationsmöglichkeiten bereits nach 4 — 8 Stdn. eine Angleichung des 32P-Einbaues an den des Kontrollansatzes festzustellen.

Für die unter Ethambutol-Einfluß gefundenen Veränderungen in der spezifischen Aktivität sind für die säurelösliche Fraktion und RNA-Fraktion vor allem veränderte 32P-Einbauraten, für die Polyphos-phat-Fraktion dagegen zusätzlich Veränderungen der Gesamtphosphatkonzentration verantwortlich.

Bei bestimmten Ethambutol-Konzentrationen und Stoffwechselfraktionen ist vor der zu erwartenden Inhibition bereits ein gegenüber dem Kontrollansatz stimulierter Einbau von 32P festzustellen. Dieses bei einer Reihe von Versuchen mit Enzyminhibitoren beobachtete Phänomen 81' 32' 35 bedarf noch eingehen-der Klärung. Es ist offenbar das erste Anzeichen gestörter Regulationsmechanismen.

Wenn die Stoffwechselintensität der einzelnen Fraktionen an Hand der spezifischen Aktivität beur-teilt wird, ist im Kontrollansatz ein Anstieg der An-teile der Polyphosphat- und der RNA-Fraktion auf Kosten der säurelöslichen Fraktion festzustellen. Die

gleichen Relationen ergeben sich aber auch in Gegen-wart von Ethambutol.

Aus diesen Befunden ergeben sich für die Wir-kungsweise des Ethambutols folgende Möglichkei-ten: 1. Die Phosphorylierung oder der weitere Um-satz von Verbindungen des Intermediärstoffwechsels, die für die säurelösliche Fraktion, für die Polyphos-phat" und für die RNA-Fraktion gleichermaßen von Bedeutung sind, wird inhibiert. Die Folgen dieser Störung treten daher in den genannten Fraktionen in gleichem Ausmaß in Erscheinung. 2. Die Auf-nahme des Phosphates durch die Zellmembran wird durch das Antituberkulotikum vermindert. Gegen diese Möglichkeit sprechen aber der stimulierte Ein-bau in einzelne Fraktionen bei Inkubationsbeginn und die nicht beeinträchtigte Sauerstoffaufnahme, da der zuerst diskutierte Stoffwechselblock sich nicht in ganzem Ausmaß unmittelbar auf diese Größe aus-wirkt.

Zusammenfassung

Die Wirkungsweise von Ethambutol auf Mykobakte-rien (M. smegmatis) wird unter Bedingungen der endogenen Atmung untersucht. Als Parameter für den Ablauf der Stoffwechselvorgänge werden Sauerstoff-aufnahme, 32P-Einbau und Gesamtphosphatgehalt ge-wählt.

Zur Lokalisierung der Stoffwechselhemmung wird eine Grobfraktionierung in säurelösliche Fraktion, Poly-phosphat-, RNA- und DNA-Fraktion vorgenommen und dabei das radioaktive Isotop zeitlich differenziert zuge-geben.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen anderer Autoren wirkt Ethambutol auch unter Bedingungen der endo-genen Atmung. So läßt sich u. a. eine gleichstarke Inhi-bition des Phosphatumsatzes der säurelöslichen Frak-tion, der Polyphosphat- und der RNA-Fraktion nach-weisen.

Die Wirkung des Ethambutols wird in einer Störung der Phosphorylierung spezifischer Verbindungen des Intermediärstoffwechsels in der säurelöslichen Fraktion oder ihres weiteren Umsatzes gesehen, wenn nicht eine durch Ethambutol veränderte Aufnahme des 32P durch die Zellwand als Ursache angenommen wird.

Dem Strahlenmeßingenieur Herrn C. B E R N H A R D T sowie den chem. techn. Ass. C. KEMSIES und G. H O I N K I S sei auch an dieser Stelle für die fleißige und gewissen-hafte Mitarbeit herzlich gedankt.

1 H . REUTGEN U. H . IWAINSKY, Z . N a t u r f o r s c h . 2 3 b , 9 7 6 [ 1 9 6 8 ] .

2 H . IWAINSKY u . H . REUTGEN, Z . N a t u r f o r s c h . 2 3 b , 9 8 2 [ 1 9 6 8 ] .

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[1966].

Isoelectric Behaviour of Different Rabbit Interferons Induced by Newcastle Disease Virus *

WOLFGANG HELLMANN and HEINZ KOHLHAGE

Institute of Hygiene, University of Marburg, Pilgrimstein 2, 355 Marburg,Lahn, German Federal Republik

(Z. Naturforsch. 27 b, 1411—1414 [1972] ; received July 17/July 29, 1972)

Isoelectric, focusing, rabbit, interferons

The isoelectric behaviour of the NDV-induced rabbit serum interferon was compared with dif-ferent NDV-induced interferons from rabbit cells. The activity of serum interferon was found in a pH range from 4.6 — 6.2. In contrast, the isoelectric positions of cell interferons could be demon-strated in a more acid pH range between pH 3.7 and 5.0.

Physicochemioal investigations of the last years have shown that the interferons represent a very heterogenous class of molecules. Differences are not only related to the molecular weights but also to the isoelectric behaviour. Electrofocusing demonstrated that depending on the cellular origin even inter-feron of one species as chick interferon 1 , interferons of mouse2, rabb i t 2 - 4 and human cells2 '5 show remarkable heterogeneity of electric charge.

In 1969 4 we reported that the NDV induced rabbit serum interferon is not homogenous in charge. The purpose of the present paper was to

Requests for reprints should be sent to Dr. W. HELLMANN, Hygiene Institut und Medizinal-Untersuchungsamt d. Uni-versität D-3550 Marburg, Pilgrimstein 2.

* Supported by Deutsche Forschungsgemeinschaft.

obtain more information about localisation and number of isoelectric positions of rabbit serum interferon. In addition we wanted to examine poten-tial differences between NDV induced interferons of spleen cells, blood lymphocytes and blood granu-locytes.

Materials and Methods

Rabbits: Animals of different sex of the same breeding (crossing: Widder x Deutscher Riese) weighing about 3.0 — 3.5 kg.

Virus: Newcastle disease virus (NDV), strain "Italy". Multiplication, purification and concentration of the virus was described previously 6.

Induction and isolation of serum interferon: Inter-feron was induced by i.v. injection of 4000 HU NDV/