Einfluss phytogener Futterzusätze auf die Darmgesundheit ... · dem QS von Bakterien und besitzen daher das Potenzial die Virulenz von Bakterien zu reduzieren • Die für die QSI

Einfluss phytogener Futterzusätze auf die Darmgesundheit bei

Nutztieren

PD Dr. habil. Andreas Müller, 26. September 2017

Complex challenges from farm to fork …

Pioneer and global market leader in phytogenics

• Founded in 1988

• Dedicated to phytogenicssince the very beginning

• Headquarters in Austria

• 130 employees at locations in 17 countries

• Global distribution in more than 80 countries

• Sustainable annual growth 20 %~

“We are the world’s leading brand” in phytogenic feed additives.”

10% of turnover annually invested in R&D:

• Fundamental research

• Market-oriented research

… resulting inhighly standardized products with measurable effects

Research & Development at Delacon

„Trailblazing findings‘don‘t always come easily.”

Thorough R&D process

“We are taking our role as world leader’in phytogenics seriously.”

Discovery Verification Demonstration

• Screening

• In-vitro testing

• Internal in-vivo testing

… leads to an extensive global trial data base.

• External in-vivo testing (universities, independant research institutes)

• Field trials in collaboration with distributors

• Customer feeding trials

Delacon

and

FH Wels

Connection

FörderprojekteProdukt-entwicklung

Mitarbeiterin im LaborNutzung von Geräten

Beteiligungan derLehre

Wissenstransfer

o Weltweiter Trend

Antibiotika als Leistungsförderer zu verbieten

Verschärfung der Richtlinien zur Verschreibung von Antibiotika

Konsequenzen:

Zunahme von Durchfallerkrankungen bei Nutztieren mit bakteriellen Ursachen

o Die Erderwärmung und der damit verbundene Klimawandel macht Hitzestress bei

landwirtschaftlichen Nutztieren zu einem zunehmendes Problem für die

Tiergesundheit

Konsequenzen:

Schädigung der Darmbarriere, verbunden mit einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber

bakteriellen Infektionen und einer Zunahme der allgemeinen Morbidität und Mortalität

Warum spielt die Darmgesundheit in der modernen Tier-ernährung eine zunehmend wichtige Rolle

Einfluss phytogener Zusatzstoffe auf die Darmgesundheit bei Nutztieren

I. Darmgesundheit:

Antibioticka versus Phytogene Substanzen/Phytogene Futtermittelzusätze

(1) Weltweite Situation des Antibiotikaeinsatzes in der Tierernährung

(2) Wichtige bakterielle Erkrankungen landwirtschaftlicher Nutztiere

(3) Definition Antibakterieller Effekte

(4) Antibakterielle Effekte von Antibiotika und Ätherischen Ölen (Alte Sicht)

(5) Definition von Quorum Sensing (QS) und Quorum Sensing Inhibierung (QSI)

(6) Quorum Sensing Inhibierung durch Pflanzeninhaltsstoffe

II. Darmgesundheit:

Phytogene Substanzen als Induktoren von Reparaturmechnismen der Darmbarriere

im Hitzestress

(1) Hitzestress bei landwirtschaftlichen Nutztieren – ein zunehmendes globales Problem

(2) Schädigung der intestinalen Barriere durch Hitzestress

(3) C. elegans als Screening Modell für die Anti-Hitzestress-Wirkung von phytogenen

Substanzen

(4) CaCo2 Zellen als Screening Tool für die Anti-Hitzestress-Wirkung von phytogenen

Substanzen

(5) In vivo Verifizierung der Anti-Hitzestress Wirkung von phytogenen Substanzen nach

erfolgreicher Testung

III. Kurze Schlussfolgerung

Einfluss phytogener Zusatzstoffe auf die Darmgesundheit bei Nutztieren

Darmgesundheit im Zusammenhang mit dem Fütterungsverbotvon Antibiotika respective der Verschärfung der Verschreibungspflicht von therapeutischen Antibiotika

Derzeitige globale Situation der Verwendung von Antibiotikain der Tierernährung

OECDcountry

Ban on antimicrobial growth promoters

Prescription requirement to use antibiotics in animals

European Union

Yes. All AGP banned in 2006. Yes.

AustraliaNo. But some AGPs are banned(Fluoroquinolones, Avoparcin, Virginiamycin).

Nearly all veterinary antimicrobials can only be sold on a veterinarian prescription.

South Korea

Yes. Since 2011 the use of AGPs has been completely discontinued until a veterinary oversight System can be put in place.

Yes. The veterinary oversight system is currently being developed.

United States

Partially. At the end of 2016 antibiotics, with relevance for the treatment of human diseases have been eliminated.

Yes. Under the new FDA guidance for industry, use of medically important antibiotics will be under the oversight of licensed veterinarians.

Zusammenfassung:

• Der Einsatz von Fütterungsantibiotika und therapeutischen Antibiotika wird weltweit

insgesamt immer noch sehr leger gehandhabt

• In vielen Ländern zeichnet sich jedoch ein Trend ab, in Zukunft Gesetze, die den

Einsatz von Fütterungsantibiotika regeln, zu verschärfen

• Gründe für dieses Umdenken sind in erster Linie Verbraucherschutzaspekte und

weltweit zunehmende Probleme mit multiresistenten Bakterien

Derzeitige globale Situation der Verwendung von Antibiotikain der Tierernährung

Tierspezies und Pathogen Assoziierte Erkrankung

Geflügel

Clostridium perfringensNekrotische Enteritis auf der Basis von Eimeria spp.

(Kokzidien) Infektionen

Colibacillosis (APEC 01, 02, 078) Septikämie, Subakute Pericarditis, Luftsackentzündungen,

StaphylococcosisGelenkentzündungen, Herzbeutel- und

Herzmuskelenzündungen

Salmonella (Pullorum, Thyphimurium,

Enteritidis, Kentucky, Heidelberg, Hadar,

Saintpaul)

Wachstumsdepression, Diarrhö, Schwäche, Erhöhte

Mortalität

Schweine

Clostridium perfringens TYPE C Nekrotische Enteritis beim Ferkel

Clostridium perfringens TYPE A Diarrhö

Colidiarrhea Diarrhö

Kälber

E. coli (F5(K99), F4, F17, F41) Diarrhö

Clostridium perfringens Diarrhö

Salmonella Diarrhö

Übersicht über häufig auftretende bakterielle Erkrankungenbei landwirtschaftlichen Nutztieren

Globale Situation wirtschaftlicher Schäden im Zusammen-hang mit bakteriellen Erkrankungen der Nutztiere

Zusammenfassung:

• Jährliche Schäden in Höhe von ~6 Mrd. US$ in der Geflügelindustrie gehen auf das Auftreten der Kokzidiose zurück (Referenzwert im Jahr 2000: 2 Mrd. US$)

• Jährliche Schäden in Höhe von 10 Mrd. US$ gehen auf das Auftreten von E. coli Diarrhö, E. coli Enterotoxikämie und Nekroitsche Enteritis der Ferkel zurück

Diese Zahlen zeigen, dass bakterielle Infektionen bei landwirtschaftlichen Nutztieren, trotz des noch weit verbreiteten Gebrauchs von Antibiotika eine wichtige Rolle spielen

• MIC = “Minimum Inhibitory Concentration”:Ist die niedrigste Konzentration einer antimikrobiell wirkenden Verbindung, die das Wachstum einer definierten mikrobiellen Übernachtkultur sichtbar inhibiert.

• MIC 50 (90):Sind die Konzentrationen einer antimikrobiell wirkenden Verbindung, die das Wachstum einer definierten mikrobiellen Kultur zu 50 %, respektive 90 % inhibiert.

• MBC = “Minimum Bactericidal Concentration”: Ist die niedrigste Konzentration einer antimikrobiell wirkenden Verbindung, welchedie Viabilität einer definierten Bakterienkultur zu mehr als 99.9 % reduziert.

Allgemeine Definitionen zu antibakteriellen Effekten

MIC Werte der ätherischen Öle verschiedenerLabiatae Gewächse gegenüber verschiedenen Bakterien

Ätherisches Öl Bakterien SpeziesMIC (gemessener Bereich)μL/mL ~ mg/mL ~ g/L ~ kg/t

Rosmarin

E. ColiSalmonella typhimurium Bacillus cereusStaphyllococcus aureus

4,5–10>200,200,40–10

Oregano

E. ColiSalmonella typhimuriumStaphyllococcus aureusListeria monocytogenes

0,50–1,21,20,50–1,20,20

Thymian


0,45–1,250,45–20,00,20–2,50,15–0,45

Salbei


3,5–5,010–200,75–100,20

Created from: Burt S. (2004) Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol. 94: 223-253

Essential oil component Bacteria species MIC (estimated range)μL/mL ~ mg/mL ~ g/L ~ kg/t

Carvacrol (Oregano)

E. ColiSalmonella typhimurium Staphylococcus aureusListeria monocytogenesBacillus cereus

0,25–5,00,22–0,250,17–0,450,37–5,00,18–0,90

Thymol (Thymian)

E. ColiSalmonella typhimurium Staphylococcus aureusListeria monocytogenesBacillus cereus

0,22–0,450,070,15–0,220,450,45

Citral (Citrus)E. ColiSalmonella typhimuriumListeria monocytogenes

0,50,50,5

Created from: Burt S. (2004) Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol. 94: 223-253

MIC Werte der chemischen Leitsubstanzen in den ätherischenÖlen verschiedener Labiatae Gewächse gegenüberverschiedenen Bakterien

Bakterielle Zielstrukturen von Antibiotika

Bakterielle Strukturen in denen sich Resistenzen gegenAntibiotika entwickeln können

Wie / Wo entwickeln sich Antibiotika-Resistenzen?

Das Risiko für Antibiotika-Resistenzen erhöht sich, wenn nicht alle Bakterien abgetötet werden

Zusätzliche Risiken im Hinblick auf die Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Resistenzgene können auch auf andere bakterielle Spezies durch Plasmid- oder Transponson Austausch übertragen werden

Pseudomonas

Enterobacteriaceae

Vibrio cholerae

Campylobacter

Staphylococci

Enterococci

Pneumococci

Streptococci

“Altes Konzept” der antibakteriellen Wirkung ätherischer Öle

• Quorum Sensing (QS) ist ein Populationsdichte-abhängiges System von Stimuli

und Reaktionen auf diese Stimuli und dient:

– Der Koordination der Genexpression

– Der Biofilm-Formation

– Der Ausbildung und Ausprägung der Virulenz

• QS kann innerhalb einer bestimmten bakteriellen Spezies der Kommunikation

dienen, aber auch der Kommunikation zwischen verschiedenen Bakterienarten

Quorum Sensing Inhibierung (QSI), das “Neue Konzept” antibakterieller Effekte phytogener Substanzen

Verschiedene Moleküle können als Kommunikationssignale dienen:

• Unterschiedliche Oligopeptide werden von Gram-positiven Bakterien verwendet

• N-Acyl Homoserine Lactone (AHL) werden von Gram-negativen Bakterien verewendetund aus aktiviertem Methionin synthetisiert

• Bor-haltige Autoinducer-2 Moleküle warden zusätzlich, sowohlin Gram-negative, als auch in Gram-positiven Bakterien verwendet

An AI-2 molecule

Quorum Sensing Inhibierung (QSI), das “Neue Konzept” antibakterieller Effekte phytogener Substanzen

AdhäsionsfaktorenToxine

Violacein(violetter Farbstoff)

AHL-abhängiges Quorum Sensing im Modell OrganismusChromobacterium Violaceum

Bei niedriger Bakteriendichte findet keine Transkriptionsaktivierung

statt

Bei hoher Bakteriendichte findet die Transkriptionsaktivierung von

QS-abhängigen Pathogenitäts- und Virulenzgenen statt

Lux Zielgene Lux Zielgene


a) no-inhibitor

b) 5 µL clove oil

c) 10 µL clove oilMIC

Nicht inhibiert

Sub MIC Bereich= Anti Quorum Sensing


Kurzes Statement bezüglich der QSI von Bakterien durchphytogene Substanzen

• Verschiedene Pflanzeninhaltsstoffe erzielen eine signifikante Wechselwirkung mit

dem QS von Bakterien und besitzen daher das Potenzial die Virulenz von Bakterien

zu reduzieren

• Die für die QSI benötigten Konzentrationen liegen dabei teilweise weit unterhalb der

MIC Werte

• Es existiert eine deutliche Varianz zwischen den Quorum Sensing Systemen individueller

Bakterien

Die Verwendung von Modell Organismen wie Chromobacterium Violaceum

oder Vibrio Fischeri zum Substanzscreening ist daher nur begrenzt möglich

• Die eigentliche Forschung muss daher mit den Zielbakterien (im günstigsten Falle mit

Feldisolaten) durchgeführt werden

• Aus diesem Grund müssen für die Zielbakterien individuelle Readout-Parameter des QS,

wie „Adhäsions Faktoren“, „Toxine“ und „Andere Virulenz Faktoren“ definiert werden

• Das QS erwünschter Bakterien darf nicht in einem zu hohen Maße gestört werden

QSI von Bakterien durch phytogene Verbindungen –Wo sind die Restriktionen ?

Beispiel für die QSI in pathogenen E. coli Bakterien



Ein Beispiel aus der aktuellen Forschung von Delacon zumAspekt der QSI in pathogenen Bakterien

Delacon hat mittlerweile die MIC Testung und Quorum Sensing Inhibition für eine Reihe von pathogenen Bakterien bei Nutztieren untersucht:

o E. coli, inklusive aktueller Feldisolateo C. perfringens, inklusive aktueller Feldisolateo S. Suis

o S. agalactiaeo Streptococcus iniaeo Francisella sp.o Vibrio parahemolyticuso Vibrio harveyi

Ein Beispiel aus der aktuellen Forschung von Delacon zumAspekt der QSI in pathogenen Bakterienµg/mL

%

Ein Beispiel aus der Forschung von Delacon zu anti-inflammatorischen Eigenschaften phytogener Substanzen

Curcuma: C→5µM→10µM→25µM:

• Erhöht den antioxidativen Zellschutz• Reduziert oxidativen Stress• Wirkt anti-inflammatorisch

Ergebnisse mit nicht gechallengten CaCo2-Zellen


Garlic: C→10µM→50µM

• Erhöht den antioxidativen Zellschutz• Reduziert oxidativen Stress• Wirkt anti-inflammatorisch

Ergebnisse mit nicht gechallengten CaCo2-Zellen


Intr

ace

llula

rre

act

ive

oxy

ge

nsp

eci

es


Intr

ace

llula

r re

act

ive

oxy

ge

n s

pe

cie

s

Phytogene Substanzen in der Prävention Hitzestress-

induzierter Schäden der intestinalen Barriere

Derzeitige Situation

• Die Geflügel- und Schweineproduktion nimmt in Schwellenländern in heißen Klimaten

überproportional zu

(Latin America, South/East Asia and Africa [FAO, 2006])

• Die Erderwärmung und der Klimawandel führen zu zunehmenden Hitzestress

(Climate Assessment Dataset, 2011)

• Hitzestress bei Nutztieren erreicht eine sehr starke Ausprägung insbesondere imZusammenspiel mit einer hohen Luftfeuchtigkeit

Room

Temp. 40% 45% 50% 55% 60% 65% 70% 75% 80% 85% 90% 95% 100%

35°C

34°C

33°C

32°C

31°C

30°C

29°C

28°C

27°C

26°C

25°C

24°C

23°C

21°C

Relative Humidity

Heat stress emergency

Heat stress danger

Heat stress alert

No heat stress

Derzeitige Situation

Reduzierung von Hitzestress – Generelle Strategien

Generelle Fütterungsstrategien bei Hitzestress

1. Erhöhung des Fettgehalts der Diät

2. Reduzierung des Proteingehalts der Diät und Supplementation von

essentiellen Aminosäuren zur Steigerung der Proteinqualität

3. Supplementierung von Elektrolyten und Puffernden Substanzen zur

Kompensation von Verlusten und zur Reduktion der respiratorischen Alkalose

4. Supplementierung von Antioxidanzien zur Reduktion von oxidativem Stress

Hitzestress und Schädigung der intestinalen Barriere


--++


+

+

+


Generelle Funktionenvon HitzestressProteinen imOrganismus

Stimulus for increased geneexpression of degradedproteins


Verbesserung des Hitzestresses durch phytogene Zusätze:Ziele der Produktentwicklung

• Verbesserung der reduzierten Leistung im Hitzestress

• Erhaltung der Nährstoffverdaulichkeit und-absorption durch Erhaltung der intestinalen Barriere

• Reduzierung der Exposition des Organismus gegenüber Toxinen und

bakteriellen Toxinen durch Erhaltung der intestinalen Barriere

C. Elegans - als Screening Modell für Forschung zum Hitzestress

• Eistadium (1 Tag)

• 4 Larvenstadien mit Häutung nach jedem Stadium (3 Tage)

• Erwachsenenstadium (7-10 days)

• Gesamte Lebensspanne: ca. 2 Wochen

• Länge: 1 mm, Diameter: 65 µm

• Mund und Verdauungssystem

• Reproduktionssystem

• Nervensystem (aber kein Gehirn)

• Muskuläres System

• Haut

• Geruchs- und Geschmacksinn

• Tastsinn

• Wärme- und Kälteempfinden

• Keine Wahrnehmung für Töne oder Licht


• Eine definierte Anzahl an Nematoden wird Kulturschalen mit Nährmedium eingesetzt

• Die Würmer werden für 24 h mit den im Medium gelösten Testsubstanzen bei

Normaltemperatur (25°C) vorinkubiert

• Danach wird die Temperatur auf Hitzestressniveau (37°C) angehoben

• Die Überlebenskurven werden durch Messung der SYTOX Green Fluorescense

gemessen



Versuchdesign

• 8 Gruppen mit je 60 Broileren

– 1. Negativ Kontrolle

– 2. Positiv Kontrolle

– 3. + 4. Substanz 1 in 2 Konzentrationen



• 42-tägiger Fütterungsversuch mit 2 Phasen Fütterung

• 21 Tage ohne Hitzestress

• Ab Tag 21: Exposition der Broiler mit zyklischem Hitzestress:

– 12 h Hitzestress-Periode mit 35°C, 12 h Nachtperiode mit 27°C

Transfer der in vitro Daten auf in vivo Bedingungen - Versuchemit Broilern

Tested Substance NEG CON POS CON Substance 1 Substance 1 Substance 2 Substance 2

Conc. (g/t) Conc. 1 Conc. 2 Conc. 1 Conc. 2

Body weight

0 43,3 43,3 43,3 43,3 43,3 43,3± Control 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Body weight

21 685,5 690,3 713,5 745,1 743,6 745,7± Control 0,70 4,08 8,69 8,48 8,78

Body weight

42 1965,9 2034,1 2064,6 2138,8 2119 2116,6± Control 3,47 5,02 8,79 7,79 7,67

Body weight

gain 1-21 642,2 647 670,2 701,8 700,3 702,4± Control 0,75 4,36 9,28 9,05 9,37

Body weight

gain 22-42 1280,4 1343,8 1351,1 1393,7 1375,4 1370,9± Control 4,95 5,52 8,85 7,42 7,07

Body weight

gain 1-42 1922,6 1990,8 2021,3 2095,5 2075,7 2073,3± Control 3,55 5,13 8,99 7,96 7,84

FCR

1-21 1,350 1,307 1,353 1,295 1,286 1,266± Control -3,19 0,22 -4,07 -4,74 -6,22

FCR

22-42 1,470 1,421 1,411 1,378 1,392 1,386± Control -3,33 -4,01 -6,26 -5,31 -5,71

FCR

1-42 1,429 1,387 1,392 1,35 1,355 1,345± Control -2,94 -2,59 -5,53 -5,18 -5,88




Hitzestress- Eine kurze Schlussfolgerung

Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen:

C. elegans ist ein geeigneter Modellorganismus zum Screenen des

Schutzpotenzials phytogener Substanzen gegen Hitzestress

Die Ergebnisse aus den Nematodenversuchen sind sehr gut auf die in vivo

Situation bei Hitze-gestressten Broilern zu übertragen

Die ausgewählten Substanzen konnten neben einer Steigerung der Leistung

ebenso die Funktion der intestinalen Barriere im Hitzestress schützen

Schlussfolgerungen

• Vor dem Hintergrund

einer weltweit steigenden Nachfrage nach tierischen Lebensmitteln

einer weltweit zunehmenden Restriktion von Antibiotika als Leistungsförderer in der

Tierernährung

der globalen Erwärmung

• spielt die Allgemeingesundheit und vor Allem die Darmgesundheit der landwirtschaftlichen

Nutztiere eine wichtige Rolle, um eine nachhaltige und Verbraucherschutz-orientierte

Tierproduktion sicherzustellen.

Phytogene Futterzusätze, in Verbindung mit der Applikation der neuesten

Forschungsansätze können einen wertvollen Beitrag dazu leisten die Nutz-

tiergesundheit und die Darmgesundheit von Nutztieren unter verschiedenen

herausfordernden Szenarios sicherzustellen.

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Einfluss phytogener Futterzusätze auf die Darmgesundheit ... · dem QS von Bakterien und besitzen daher das Potenzial die Virulenz von Bakterien zu reduzieren • Die für die QSI