Entwicklung und Testung neuer DNA- und Protein- basierter ...opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1108/pdf/Dissertation_Koehler... · Entwicklung und Testung neuer DNA- und Protein-basierter

Entwicklung und Testung neuer DNA- und Protein-

basierter Multikomponentenvakzinen sowie

regulatorischer Adjuvanzien gegen eine Infektion mit

B. anthracis in Auszucht-Mäusen und Ziegen

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der

Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Fakultät Naturwissenschaften

Universität Hohenheim

Institut für Nutztierwissenschaften (460) /

PD Dr. med. vet. habil. W. Beyer

und

Institut für Zoologie (220) /

Prof. Dr. rer. nat. U. Mackenstedt

vorgelegt von

Susanne Melanie Köhler

aus Eisenach

2015

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Heinz Breer

1. berichtende Person: PD Dr. med. vet. habil. Wolfgang Beyer

2. berichtende Person: Prof. Dr. rer. nat. Ute Mackenstedt

Eingereicht am: 11.03.2015

Mündliche Prüfung am: 10.07.2015

Die vorliegende Arbeit wurde am 12.05.2015 von der Fakultät

Naturwissenschaften der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung

des Doktorgrades der Naturwissenschaften“ angenommen.

Für meine Mutter

Für Daniel

Für mich

„ALL WE HAVE TO DECIDE IS WHAT TO DO WITH THE TIME THAT IS GIVEN TO US.“

John Ronald R. Tolkien

iii

iv

Inhalt

1 EINLEITUNG..........................................................................................................................11.1 ENTDECKUNG DER ÄTIOLOGIE VON MILZBRAND...........................................................................................1

1.2 TAXONOMIE UND MORPHOLOGIE................................................................................................................11.2.1 Aufbau der vegetativen Zelle...................................................................................................2

1.2.1.1 Die Kapsel.........................................................................................................................................................31.2.1.2 Die Toxinkomponenten......................................................................................................................................4

1.2.2 Aufbau der Spore.....................................................................................................................5

1.3 VERBREITUNG UND LEBENSZYKLUS............................................................................................................6

1.4 PATHOGENESE (MENSCH UND TIER)...........................................................................................................8

1.5 IMPFSTOFFE..........................................................................................................................................101.5.1 Historische Entwicklung der Lebendvakzinen gegen B. anthracis........................................101.5.2 Entwicklung der lizenzierten Humanvakzinen.......................................................................111.5.3 Ansätze zur Entwicklung neuer Vakzinen gegen B. anthracis................................................13

1.5.3.1 Toxinkomponenten..........................................................................................................................................141.5.3.2 Antigene der vegetativen Zelle........................................................................................................................161.5.3.3 Antigene der Spore..........................................................................................................................................16

1.5.4 Genetische Immunisierung....................................................................................................171.5.5 Adjuvanzien...........................................................................................................................19

1.6 ZIEL DER ARBEIT..................................................................................................................................22

2 MATERIAL............................................................................................................................232.1 CHEMIKALIEN.......................................................................................................................................23

2.2 PUFFER, LÖSUNGEN UND MEDIEN............................................................................................................25

2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN......................................................................................................................26

2.4 VERSUCHSTIERE....................................................................................................................................26

2.5 GERÄTE...............................................................................................................................................27

2.6 ANTIKÖRPER.........................................................................................................................................27

2.7 UTENSILIEN..........................................................................................................................................28

2.8 ZELLLINIEN..........................................................................................................................................28

2.9 KITS...................................................................................................................................................28

2.10 GENETISCHES MATERIAL......................................................................................................................29

2.11 WIRKSTOFFE.......................................................................................................................................29

2.12 SOFTWARE.........................................................................................................................................29

3 METHODEN..........................................................................................................................303.1 STANDARDMETHODEN.............................................................................................................................30

3.2 HERSTELLUNG UND AUFBEREITUNG VON ANTIGENEN...................................................................................313.2.1 rPA83, rBclA und rLF............................................................................................................31

3.2.1.1 Anzucht von induzierten Bakterienkulturen.....................................................................................................313.2.1.2 Proteinaufreinigung mittels FPLC...................................................................................................................323.2.1.3 Dialyse.............................................................................................................................................................33

3.2.2 Aufreinigung von Kapselmaterial aus einer Bakterienkultur.................................................343.2.3 Färbung mit Stains-All..........................................................................................................343.2.4 Herstellung eines vegetativen Vollantigen von B. anthracis..................................................353.2.5 Herstellung einer Sporensuspension von B. anthracis...........................................................353.2.6 Bestimmung der Sporenkonzentration...................................................................................363.2.7 Herstellung von Formalin inaktivierten Sporen (FIS)...........................................................36

i

3.3 AUF- UND VORBEREITUNG DER VAKZINEN.................................................................................................373.3.1 Endotoxinbestimmung...........................................................................................................373.3.2 Endotoxinaufreinigung..........................................................................................................383.3.3 DNA-Patronen-Herstellung...................................................................................................38

3.3.3.1 Präzipitation von DNA auf Goldstaub.............................................................................................................383.3.3.2 Schlauchpräparation und Beschichtung...........................................................................................................393.3.3.3 Qualitätskontrolle der DNA-Patronen.............................................................................................................40

3.4 VAKZINIERUNG, PROBENNAHME UND INFEKTION..........................................................................................403.4.1 Mausversuche........................................................................................................................42

3.4.1.1 Betäubung und Tötung....................................................................................................................................433.4.1.2 Impfung...........................................................................................................................................................443.4.1.3 Probennahme und Diagnostik..........................................................................................................................443.4.1.4 Infektion..........................................................................................................................................................45

3.4.2 Ziegenversuch (Südafrika).....................................................................................................473.4.2.1 Impfung...........................................................................................................................................................483.4.2.2 Probennahme...................................................................................................................................................493.4.2.3 Infektion..........................................................................................................................................................503.4.2.4 Diagnostik.......................................................................................................................................................51

3.4.3 Wiederholung der Ziegenversuche (Türkei)...........................................................................52

3.5 SEROLOGISCHE ANALYSEVERFAHREN.........................................................................................................543.5.1 Blutaufbereitung....................................................................................................................543.5.2 Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)......................................................................543.5.3 Handhabung der Makrophagenzelllinie J774A.1..................................................................563.5.4 Toxin-Neutralisations-Assay (TNA).......................................................................................56

3.6 STATISTIK.............................................................................................................................................57

4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION.....................................................................................594.1 TESTUNG VON VAKZINEKOMPONENTEN IM NMRI-MAUSMODELL..................................................................59

4.1.1 Einzelbetrachtungen der Impfung von Mäusen mit Vakzinen auf Proteinbasis.....................594.1.1.1 Mausgruppe LN-1000 (Lipopeptid).................................................................................................................604.1.1.2 Mausgruppe NC (Kapselkonjugat)..................................................................................................................604.1.1.3 Mausgruppe NCP (Kapselkonjugat; rPA83)....................................................................................................614.1.1.4 Mausgruppe LN-2000 (Lipopeptid).................................................................................................................624.1.1.5 Mausgruppe LB (Lipopeptid und rBclA).........................................................................................................624.1.1.6 Mausgruppe LP (Lipopeptid und rPA83).........................................................................................................644.1.1.7 Mausgruppe LBP (Lipopeptid, rBclA und rPA83)...........................................................................................654.1.1.8 Mausgruppe LBCP (Lipopeptid, rBclA, Kapselkonjugat und rPA83)..............................................................664.1.1.9 Mausgruppe LBCOP (Lipopeptid, rBclA, Kapselkonjugat, FIS und rPA83)...................................................67

4.1.2 Einzelbetrachtungen der Impfung von Mäusen mit Vakzinen auf DNA-Basis........................684.1.2.1 Mausgruppe TN (CIITA).................................................................................................................................684.1.2.2 Mausgruppe TM (CIITA; BclAD1D3-Uq)......................................................................................................694.1.2.3 Mausgruppe TK (CIITA; TPA-BclAD1D3-LAMP1).......................................................................................704.1.2.4 Mausgruppe TH (CIITA; TPA-rPA83-LAMP1)...............................................................................................714.1.2.5 Mausgruppe TA (CIITA; TPA-LFD1PAD4-LAMP1)......................................................................................724.1.2.6 Mausgruppe NS (TPA-LFD1PAD4-mIPS-1)...................................................................................................734.1.2.7 Mausgruppe TKS (CIITA; TPA-BclAD1D3-LAMP1, TPA-LFD1PAD4-mIPS-1)..........................................74

4.1.3 Überlebensdaten aller Mausversuche im Vergleich...............................................................764.1.4 Interner Vergleich der Titerdaten der Mausversuche............................................................79

4.2 DISKUSSION MAUSVERSUCHE..................................................................................................................834.2.1 Proteinvakzinen.....................................................................................................................83

Der Zusatz des Kapselkonjugats hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf die Schutzwirkung.............................83 BclA und PA wirken einander unterstützend.........................................................................................................85 Zusatz von FIS bietet potentiell höheren Schutz, der nicht zwingend allein auf BclA beruht...............................87

4.2.2 DNA-Vakzinen........................................................................................................................89 Vektoren mit Toxinkomponenten zeigten eine geringere Immunogenität als vergleichbare Proteinvakzinen........89 Die internen Unterschiede der Toxinvektoren sind vermutlich dosisbedingt.........................................................90

ii

DNA-Vektoren mit BclAD1D3 stimulierten eine sterile Immunität bei 50 % Schutzrate......................................91 Die kombinierte DNA-Vakzine TKS vermittelte nahezu vollständigen Schutz gegen eine voll virulente Infektion

mit B. anthracis.......................................................................................................................................92 Zusammenfassung der Mausversuche...................................................................................................................94

4.3 TESTUNG VON VAKZINEKOMPONENTEN IN BURENZIEGEN..............................................................................964.3.1 Gesundheitszustand der Ziegen vor der Infektion..................................................................964.3.2 Überprüfung der Infektiösität der Sporen im BALB/c Mausmodell.......................................984.3.3 Kontrollgruppen....................................................................................................................984.3.4 Ermittlung der MLD..............................................................................................................994.3.5 Einzelbetrachtungen der Immunisierungen von Burenziegen mit der SSLV (Sterne Sporen

Lebendvakzine)...................................................................................................................1004.3.5.1 Ziegengruppe 1 (PBS)...................................................................................................................................1014.3.5.2 Ziegengruppe 2 (SSLV).................................................................................................................................1024.3.5.3 Ziegengruppe 3a/b (SSLV)............................................................................................................................104

Anti-rPA83 IgG-Titer und TNA-Titer..................................................................................................................104 Anti-rBclA und anti-FIS IgG-Titer......................................................................................................................108 Anti-vegetativ IgG-Titer......................................................................................................................................109

4.3.6 Zusammenfassung der SSLV-Gruppen.................................................................................1114.3.7 Einzelbetrachtungen der Immunisierungen von Burenziegen mit NLV................................112

4.3.7.1 Ziegengruppe 4 (rPA83, rBclA und Lipopeptid)............................................................................................1124.3.7.2 Ziegengruppe 5 (DNA-Vakzine)....................................................................................................................1144.3.7.3 Ziegengruppe 6 (rPA83, rBclA, FIS und Lipopeptid)....................................................................................116

4.3.8 Versuchswiederholung der Gruppen 4 und 6 (Türkei).........................................................1184.3.8.1 Negativkontrolle (Wiederholung)..................................................................................................................1194.3.8.2 Ziegengruppe 4 (Wiederholung)....................................................................................................................1204.3.8.3 Ziegengruppe 6 (Wiederholung)....................................................................................................................123

4.3.9 Zusammenfassung der Ergebnisse der NLV.........................................................................1254.3.10 Interner Vergleich der Titerdaten der Ziegenversuche.......................................................1284.3.11 Todesdatenübersicht der Ziegenversuche..........................................................................1294.3.12 Diagnoseprozeduren..........................................................................................................132

4.3.12.1 Temperatur...................................................................................................................................................1324.3.12.2 Zusammenhänge von Fieber, Antikörpertitern und Schutz..........................................................................1374.3.12.3 Verhalten......................................................................................................................................................1404.3.12.4 Detektion von Bakterien im Blut.................................................................................................................141

4.4 DISKUSSION ZIEGENVERSUCHE...............................................................................................................1444.4.1 Versuchsdurchführung und Diagnoseprozeduren................................................................144

Das Auftreten von Fieber steht in Zusammenhang mit den Antikörpertitern gegen rPA83..................................144 Die Höhe der anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion ist in Ziegen und Auszucht-Mäusen prädiktiv für das

Überleben, aber möglicherweise abhängig von der Infektionsdosis......................................................146 Die MLD für das Feldisolat SD20 ist kleiner als 36 Sporen in Ziegen................................................................148 Beim Nachweis von Bakterien im Blut infizierter Ziegen ist mit einem Tod binnen 2 – 5 h zu rechnen.............148 Die hohen unspezifischen Hintergrundtiter bei Ziegenseren im ELISA lassen sich durch den Austausch von FKS

mit Magermilchpulver stark reduzieren.................................................................................................149 Adverse Reaktionen von Ziegen auf die Immunisierung mit der SSLV beruhen möglicherweise auf parallel

vorhandenen Infektionen.......................................................................................................................150 Verbesserung der Diagnoseprozeduren...............................................................................................................151

4.4.2 Impfversuche mit NLV.........................................................................................................153 Die DNA-Vakzine Kombination war in dieser Form weitestgehend wirkungslos...............................................153 FIS als Bestandteil einer Proteinvakzine erhöht die schützende Wirkung von rPA83.........................................154

4.4.3 Impfversuche mit der SSLV..................................................................................................155 Der Erfolg einer Erstimmunisierung mit der SSLV kann stark variieren.............................................................156 Die unspezifische phagozytotische Wirkung von Ziegenseren könnte die Wirkung der Immunisierung mit der

SSLV beeinflussen................................................................................................................................157 Der Höchstpunkt der anti-rPA83 IgG-Titer ist 1 – 2 Wochen nach der Immunisierung zu erwarten...................158 Eine Vakzinierung mit der SSLV von Tieren mit erhöhten Antikörpertitern (gegen PA) ist wirkungslos............158 Eine gedoppelte Erstimmunisierung könnte die sporadischen Immunisierungsausfälle mit der SSLV beheben..159 Die Auffrischungsimpfung sollte 3 – 4 Monate nach der Erstimmunisierung erfolgen.......................................159

iii

Eine jährliche Auffrischung der Impfung mit der SSLV könnte generell obsolet sein oder durch eine Änderung des Impfplans obsolet werden...............................................................................................................160

4.4.4 Generelle Anmerkungen zu den Ergebnissen.......................................................................161 BclA ist in Ziegen nicht bzw. wenig immunogen................................................................................................161 Die immunogene und möglicherweise auch Schutz vermittelnde Wirkung von FIS beruht nicht auf BclA........162 Eine überlebte Infektion erzeugt ein anderes Titerspektrum als eine Impfung mit der SSLV..............................164 BclA könnte im Ziegenmodell die gleiche Funktion für die Spore einnehmen wie die Kapsel für den vegetativen

Zellkörper..............................................................................................................................................165

5 KONKLUSION UND AUSBLICK.....................................................................................166

6 ANHANG...................................................................................................................................I6.1 SEQUENZEN............................................................................................................................................I

6.2 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG.......................................................................................................................II

iv

Verzeichnis der AbbildungenAbbildung 1: Koloniemorphologie................................................................................................2Abbildung 2: Kettenbildung..........................................................................................................2Abbildung 3: Aufbau der vegetativen Zelle...................................................................................3Abbildung 4: Kapselfärbung.........................................................................................................3Abbildung 5: Sporenaufbau...........................................................................................................5Abbildung 6: Zyklus der Anthrax Infektion..................................................................................7Abbildung 7: Genetische Immunisierung....................................................................................18Abbildung 8: synthetisches Lipopeptid (Bsp.)............................................................................20Abbildung 9: Nomenklatur der Mausgruppen.............................................................................42Abbildung 10: Rückstandbild von DNA-Patronen nach Verschuss............................................44Abbildung 11: Burenziegen.........................................................................................................47Abbildung 12: Außengehege für die Infektion............................................................................48Abbildung 13: Blutentnahme für Serologie.................................................................................49Abbildung 14: i. p. Injektion Maus..............................................................................................50Abbildung 15: Färbung von Blutausstrichen mit Azur B............................................................52Abbildung 16: ELISA-Schema....................................................................................................55Abbildung 17: TNA-Belegungschema........................................................................................56Abbildung 18: Mausgruppe NCP................................................................................................61Abbildung 19: Mausgruppe LB...................................................................................................63Abbildung 20: Mausgruppe LP...................................................................................................64Abbildung 21: Mausgruppe LBP.................................................................................................65Abbildung 22: Mausgruppe LBCP..............................................................................................66Abbildung 23: Mausgruppe LBCOP...........................................................................................67Abbildung 24: Mausgruppe TM..................................................................................................69Abbildung 25: Mausgruppe TK...................................................................................................70Abbildung 26: Mausgruppe TH...................................................................................................71Abbildung 27: Mausgruppe TA...................................................................................................73Abbildung 28: Mausgruppe NS...................................................................................................73Abbildung 29: Mausgruppe TKS................................................................................................75Abbildung 30:Überlebensdaten Mausgruppen (Proteinvakzinen, ~1000 Sporen)......................76Abbildung 31: Überlebensdaten Mausgruppen (Proteinvakzinen, ~2000 Sporen).....................77Abbildung 32: Überlebensdaten Mausgruppen (DNA-Vakzinen, ~1000 Sporen)......................78Abbildung 33: Übersicht IgG- und TNA-Titer (Proteinvakzinen, Maus)...................................80Abbildung 34: Übersicht IgG- und TNA-Titer (DNA-Vakzinen, Maus).....................................81Abbildung 35: Ziegengruppe 2 (anti-rPA83 IgG-Titer).............................................................103Abbildung 36: Ziegengruppe 2 (anti-FIS, -Vegetativ, -rBclA und TNA-Titer).........................103Abbildung 37: Ziegengruppe 3a/b und 1 (anti-rPA83 IgG-Titer)..............................................105Abbildung 38: Ziegengruppe 3a/b und 1 (TNA-Titer)..............................................................107Abbildung 39: Ziegengruppe 3a/b und 1 (anti-rBclA und -FIS IgG-Titer)................................109Abbildung 40: Ziegengruppe 3a/b (anti-vegetativ IgG-Titer)....................................................110Abbildung 41: Ziegengruppe 4 (anti-rPA83 und -rBclA IgG-Titer)..........................................113Abbildung 42: Ziegengruppe 5 (anti-rPA83 und -rLF IgG-Titer)..............................................115Abbildung 43: Ziegengruppe 5 (anti-rBclA, -FIS, -vegetativ IgG- und TNA-Titer).................115Abbildung 44: Ziegengruppe 6 (anti-rPA83 IgG-Titer).............................................................117Abbildung 45: Ziegengruppe 6 (ELISA- und TNA-Titer).........................................................117Abbildung 46: Ziegengruppe 4 (W) – anti-rPA83 und TNA-Titer............................................122Abbildung 47: Ziegengruppe 4 (W) – anti-rBclA IgG-Titer......................................................122Abbildung 48: Ziegengruppe 6 (W) – anti-rPA83 IgG- und TNA-Titer....................................124

v

Abbildung 49: Ziegengruppe 6 (W) – anti-rBclA und -FIS IgG-Titer.......................................125Abbildung 50: IgG- und TNA-Titer der NLV (Ziege)...............................................................126Abbildung 51: Gesamtübersicht IgG- und TNA-Titer (Ziege)..................................................128Abbildung 52: Überlebensdaten Ziegengruppen (Vergleich der Wiederholungen)...................130Abbildung 53: Gesamtübersicht der Überlebensdaten der Ziegengruppen...............................131Abbildung 54: Temperaturspektrum Ziegenversuch (Südafrika)..............................................133Abbildung 55: Temperaturspektrum Ziegenversuch (Türkei)...................................................134Abbildung 56: Temperaturverhältnisse......................................................................................136Abbildung 57: BclA-Filament...................................................................................................163Abbildung 58: GeneGun Patronenverschuss................................................................................II

Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1: Chemikalien...............................................................................................................23 Tabelle 2: Puffer, Lösungen und Medien....................................................................................25 Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien................................................................................................26 Tabelle 4: Versuchstiere..............................................................................................................26 Tabelle 5: Geräte.........................................................................................................................27 Tabelle 6: Antikörper..................................................................................................................27 Tabelle 7: Utensilien...................................................................................................................28 Tabelle 8: Zelllinien....................................................................................................................28 Tabelle 9: Kits.............................................................................................................................28 Tabelle 10: Genetisches Material................................................................................................29 Tabelle 11: Wirkstoffe................................................................................................................29 Tabelle 12: Software...................................................................................................................29 Tabelle 13: Übersicht Vakzinekomponenten (Mausversuch).....................................................41 Tabelle 14: Impfgruppen Mausversuch......................................................................................43 Tabelle 15: Impfgruppen Ziegenversuch (Südafrika).................................................................48 Tabelle 16: Wiederholung der Ziegenversuche (Türkei) – Impfgruppen...................................53 Tabelle 17: Schwellenwerte........................................................................................................58 Tabelle 18: Mausgruppe LN-1000..............................................................................................60 Tabelle 19: Mausgruppe NC.......................................................................................................60 Tabelle 20: Mausgruppe NCP.....................................................................................................61 Tabelle 21: Mausgruppe LN-2000..............................................................................................62 Tabelle 22: Mausgruppe LB.......................................................................................................63 Tabelle 23: Mausgruppe LP........................................................................................................64 Tabelle 24: Mausgruppe LBP.....................................................................................................65 Tabelle 25: Mausgruppe LBCP...................................................................................................66 Tabelle 26: Mausgruppe LBCOP................................................................................................67 Tabelle 27: Mausgruppe TN.......................................................................................................68 Tabelle 28: Mausgruppe TM......................................................................................................69 Tabelle 29: Mausgruppe TK.......................................................................................................70 Tabelle 30: Mausgruppe TH.......................................................................................................71 Tabelle 31: Mausgruppe TA.......................................................................................................72 Tabelle 32: Mausgruppe NS.......................................................................................................74 Tabelle 33: Mausgruppe TKS.....................................................................................................75 Tabelle 34: Korrelation der Proteingruppen...............................................................................86 Tabelle 35: Gesundheitszustand nach Transport.........................................................................97 Tabelle 36: Kontrollgruppen (Ziege)..........................................................................................99

vi

Tabelle 37: Bestimmung der MLD.............................................................................................99 Tabelle 38: Ziegengruppe 1......................................................................................................101 Tabelle 39: Ziegengruppe 2......................................................................................................102 Tabelle 40: Ziegengruppe 3a/b (anti-rPA83 IgG-Titer)............................................................105 Tabelle 41: Ziegengruppe 3a/b (TNA-Titer).............................................................................107 Tabelle 42: Ziegengruppe 3a/b (anti-rBclA und -FIS IgG-Titer)..............................................108 Tabelle 43: Ziegengruppe 3a/b (anti-vegetativ IgG-Titer)........................................................110 Tabelle 44: Ziegengruppe 4......................................................................................................113 Tabelle 45: Ziegengruppe 5......................................................................................................114 Tabelle 46: Ziegengruppe 6......................................................................................................116 Tabelle 47: Negativkontrolle (W) – Ziege (Türkei)..................................................................119 Tabelle 48: Ziegengruppe 4 (W) – ELISA- und TNA-Titer.....................................................121 Tabelle 49: Ziegengruppe 6 (W) – ELISA- und TNA-Titer.....................................................123 Tabelle 50: Zusammenhänge von Fieber, Antikörpertitern und Schutz (Ziegen).....................137 Tabelle 51: Zusammenhang zwischen Antikörpertiter und der Entwicklung von Fieber.........139 Tabelle 52: Detektion von Bakterien im Blut...........................................................................142 Tabelle 53: Probennahmepunkte Ziegenversuch (Südafrika).....................................................III Tabelle 54: Probennahmepunkte Ziegenversuch (Türkei - Wiederholungen)............................III Tabelle 55: exemplarische Temperaturerhebung in naiven Ziegen (Südafrika).........................IV Tabelle 56: Ziegenversuche (Südafrika), diagnostische Daten...................................................IV Tabelle 57: Ziegenversuche (Türkei), diagnostische Daten........................................................VI Tabelle 58: Zusammenhänge von Antikörpertitern und Schutz (Mäuse)..................................VII Tabelle 59: Test auf pTBC.......................................................................................................VIII

vii

Verzeichnis der Abkürzungen

viii

°C (Einheit) Grad Celsius

A Österreich

ABTS 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)

APC engl. antigen presenting cells

APS Ammoniumperoxodisulfat

AVA eng. Anthrax vaccine adsorbed

AVP engl. Anthrax vaccine precipitated

B. anthracis Bacillus anthracis

B. cereus Bacillus cereus sensu stricto

BCA engl. bicinchonin acid

BclA

BHI engl. brain heart infusion

bp (Einheit) Basenpaar

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

ca. cirka

Calciumchlorid

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

CBA Columbia-Blutagar

cfu (Einheit) engl. colony forming units

CH Schweiz

CIITA engl. class II major histocompatibility complex transactivator

CLR engl. collagen-like region

Kohlendioxid

CSA Casein-Soya-Agar

D Deutschland

D1 Domäne 1

D2 Domäne 2

D3 Domäne 3

D4 Domäne 4

Dhc Dihydroxypropylcystein

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA engl. desoxyribonucleinacid

DNas engl. Desoxyribonuclease

dpi engl. days post infection

DTT 1,4-Dithiothreitol

DVM eng. doctor of veterinary medicine

E. coli Escherichia coli

EDTA engl. Ethylenediaminetetraacetic acid

Edtx engl. Edema Toxin

EF engl. Edema Factor

EU (Einheit) engl. endotoxin unit

F Frankreich

FIS engl. formalin inacivated spores

FKS fötales Kälberserum

g (Einheit) Gramm

GerD

engl. Bacillus collagen-like protein of anthracis

CaCl2

CO2

engl. B. cereus spore germination protein

ix

h (Einheit) Stunde

HCl engl. hydrogen chloride

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

hpi engl. hours post infection

HRP engl. horseradisch peroxidase

i. c. intra cutan

i. d. intra dermal

i. m. intra muskulär

IPS-1

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

kb (Einheit) Kilo-Basenpaar

KCl Kaliumchlorid

kDa (Einheit) Kilodalton

Kaliumdihydrogenphosphat

KLH engl. keyhole limpet hemocyanin

l (Einheit) Liter

LAL Limulus Amöbuzyten Lysat

LAMP1 engl. lysosomal-associated membrane protein 1

Letx engl. Lethal Toxin

LF engl. Lethal Factor

LPS Lipopolysaccharid

M (Einheit) Molar

MAPKK Mitogen-aktivierten Proteinkinasen Kinasen

mg (Einheit) Milligramm

Magnesiumchlorid

MHC engl. major histocompatibility complex

min (Einheit) Minute

ml (Einheit) Milliliter

MLD Minimum letale Dosis

mm Millimeter

MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromide)

MYA engl. meat yeast agar

Di-Natriumhydrogencarbonat

Dinatriumhydrogenphosphat

NaCl Natriumchlorid

Natriumhydrogencarbonat

Natriumhydrogenphosphat

NaOH Natriumhydroxid

NLV Nicht-Lebendvakzine

nm (Einheit) Nanometer

Nr. Nummer

OBP engl. Onderstepoort Biological Products

OD Optische Dichte

OMPC engl. outer membrane protein complex

PA engl. Protective Antigen

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Pam Palmitinsäure

PBS engl. phosphat buffered saline

PCR engl. polymerase chain reaction

engl. Interferon-ß-Promotor Stimulator 1

KH2PO

4

MgCl2

Na2HCO

3

Na2HPO

4

NaHCO3

NaHPO4

x

PGA

PLAP engl. placental alkaline phosphatase

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PRR engl. pattern recognition receptor

pTBC Pseudotuberkulose

PVP Polyvinylpyrrolidon

RLR engl. RIG-like receptor

RNA engl. Ribonucleinacid

RNase Ribonuklease

Spearman Rangkorrelationskoeffizient

s (Einheit) Sekunde

s. c. sub cutan

SASP engl. small acid-soluble proteins

SDS Natriumdodecylsulfat

SSLV Sterne Sporen Lebendvakzine

STI Sanitary-Technical Institute

TAE TRIS-Acetat-EDTA-Puffer

TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin

TGB Trypton-Glukose-Bouillon

TLR engl. toll-like receptor

TNF engl. tumor necrosis factor

TPA engl. tissue plasminogen activator

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

TSA Trypton-Soja-Agar

üN über Nacht

UpM (Einheit) Umdrehungen pro Minute

Uq Ubiquitin

USA Vereinigte Staaten von Amerika

V (Einheit) Volt

x g (Einheit) Vielfaches der Erdbeschleunigung

z.T. zum Teil

ZA Süd Afrika

ZVH Zentralen Einrichtung für Biologische und Biomedizinische Forschung mit Tierhaltung

µg (Einheit) Mikrogramm

µl (Einheit) Mikroliter

µm (Einheit) Mikrometer

Poly-γ-D-Glutaminsäure

rs

Zusammenfassung

Durch die Entdeckung und subsequenten Verwendung der Sterne Sporen Lebendvakzine

(SSLV) in der Veterinärmedizin konnte die Zahl der globalen Milzbrandausbrüche seit 1930

stark reduziert werden. Dennoch sind auch heute noch Länder im mediterranen Raum, in Süd-

und Zentralamerika, Afrika und Zentralasien, sowie einigen Gebieten der USA und Kanada

endemisch mit Bacillus anthracis belastet. Unter anderem ist dies auf die noch immer

ungeklärten Faktoren im Zyklus der wiederkehrenden Aus- und Verbreitung des Erregers und

dessen Persistenz im Boden zurückzuführen. Zudem ist die Anwendbarkeit der SSLV durch die

Notwendigkeit einer jährlichen Auffrischung, der Restvirulenz des Impfstammes bei einigen

sensitiven Tierarten (Ziegen und Lamas) und der Unvereinbarkeit einer antibiotischen

Behandlung mit einer gleichzeitigen Impfung eingeschränkt, sodass weiterhin nach alternativen

Vakzinierungsmethoden geforscht wird.

In dieser Arbeit wurden unter Verwendung von Vakzinen auf Protein- und DNA-Basis Mög-

lichkeiten zur alternativen Immunisierung mit „nicht lebend Vakzinen“ (NLV) evaluiert. Zu tes-

ten waren in der Proteinstudie rPA83 als Toxinkomponente, Formalin inaktivierte Sporen (FIS)

und rBclA als Sporenantigene, sowie ein Kapsel-Lipopeptid-Konjugat als Bestandteil der vege-

tativen Form von B. anthracis. Zur Unterstützung der Immunogenität wurde ein Lipopeptid-

Adjuvans verwendet. Für die DNA-Vakzine kamen verschiedene Vektorrückgrate zum Einsatz,

welche Signalsequenzen beinhalteten, die das integrierte Antigen (rPA83, PAD4LFD1 und

BclAD1D3) über den MHCI, MHCII oder sekretorischen Weg dirigieren. Als Adjuvanzien wur-

den ein separater Vektor mit einem positiven MHCII-Regulator verwendet (CIITA) oder inte-

griert in den Vektor des Antigens ein Interferon-ß Promotor Stimulator (mIPS1). Die aufgeführ-

ten Vakzinekomponenten wurden im Rahmen dieser Arbeit einzeln und in Kombination im

NMRI-Mausmodell getestet, um eine geeignete Kombination für den Gebrauch in der Ziege

auszuwählen. Die Applikation der Proteinkomponenten (25 µg pro Antigen, 108 FIS und 50 µg

Lipopeptid) erfolgte s. c., die der DNA-Vakzine (3 µg pro Vektor) i. c. mittels GeneGun. Alle

beteiligten Mausgruppen wurden 3 Mal im Abstand von 2 Wochen immunisiert und 3 Wochen

nach der letzten Immunisierung mit ~1000 bzw. ~2000 Sporen eines voll virulenten Stammes

(Ames) infiziert. Mit einigen Ausnahmen konnten für alle Gruppen, entsprechend der eingesetz-

ten Antigene, Antikörpertiter nachgewiesen werden. In Bezug auf rPA83 waren hierbei die

getesteten Proteinvakzinen effektiver als die DNA-Vakzinen, welche weitaus niedrigere Titer

aufwiesen. Für rBclA waren äquivalent hohe Titer bei DNA- und Proteinvakzinen messbar. Den

gemessenen anti-rBclA Titern entsprechende hohe IgG Titer gegen FIS konnten in alle Gruppen

nachgewiesen werden, die sowohl nur rBclA als auch FIS oder beides in Kombination erhalten

hatten. Das Kapselkonjugat war wenig immunogen, was retrospektiv vermutlich auf ein

immunsupprimierendes Epitop zurückzuführen war. Die Überlebensraten der getesteten Grup-

pen bewegten sich zwischen 10 und 100 %, wobei alle Proteinvakzinen, die nur ein Antigen

xi

beinhalteten, mit 10 % Überlebenden nicht signifikant unterschiedlich zur eingesetzten Kon-

trolle waren. Durch Kombination von mindestens 2 verschiedenen Antigenen konnte eine

Schutzrate von mindestens 60 % erreicht werden, wobei nur die Kombination aller Proteinvak-

zinen und FIS mit 100 % komplett schützte. Die DNA-Vakzinen zeigten einzeln Schutzraten

von 30 – 50 %. Hervorstechend hierbei waren die getesteten Konstrukte mit rBclA, die ohne

weitere Antigene mit einer Überlebensrate von 50 % die beste Schutzwirkung zeigten und

zudem eine sterile Immunität aufwiesen. In Kombination mit dem besten Toxin-Vektor konnte

eine Schutzrate von 90 % erreicht werden, womit DNA- und Proteinvakzine ein gleichwertiges

Potential für weitere Versuche aufwiesen.

Entsprechend wurden die erfolgversprechendsten Kombinationsvakzinen im Vergleich zur

SSLV mit Hilfe von Kooperationspartnern in Südafrika und der Türkei in Ziegen getestet. Die

schützende Wirkung der SSLV wurde in 3 Gruppen bestimmt, direkt nach der Erstimmunisie-

rung, nach dem Verlauf von einem Jahr und direkt nach einer Auffrischungsimpfung. Im

Bereich der Protein-basierten Vakzinen wurde auf die weitere Verwendung des Kapselkonjugats

verzichtet, sodass eine Kombination aus Lipopeptid (500 µg), rPA83 und rBclA (je 25 µg bzw.

75 µg in den Wiederholungsversuchen), mit und ohne Zusatz von FIS (108 Sporen) im Ziegen-

modell zum Einsatz kam. Für die DNA-Vakzine wurde eine Kombination aus je 1 mg

NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1, pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1 und pDNA-

Vacc-Ultra5-CIITA s. c. bzw. i. c. injiziert. Die Infektion der Vakzinegruppen wurde mit ~1000

Sporen eines voll virulenten Feldisolats der jeweiligen Region durchgeführt. Neben der Gegen-

überstellung der Immunogenität und Schutzwirkung der Vakzinen im Ziegenmodell waren die

Beobachtungen zum Verlauf der Immunreaktion von SSLV-immunisierten Ziegen im Zeitraum

eines Jahres und die diagnostischen Daten zu Infektion von Ziegen (Verhalten, Temperatur, bak-

terielle Nachweise, Korrelationen und minimale Infektionsdosis) ebenfalls von Interesse.

Im Vergleich zu den NLV erzeugten die SSLV-immunisierten Tiere ähnliche oder höhere

Antikörpertiter gegen die gemessenen Antigene, wobei die höchsten Titer gegen rPA83 und FIS

erreicht wurden. Die Protein-basierenden Vakzinen vermittelten äquivalente Schutzraten zur

SSLV (60 – 100 %), wobei der Zusatz von FIS tendenziell eine höhere Schutzwirkung (80 %)

erzielte als ohne (50 %). Die DNA-immunisierten Tiere wurden aufgrund der geringen Sero-

konversion keiner Belastungsinfektion ausgesetzt. Generell war die Immunreaktion auf das in

Mäusen hoch immunogen BclA in Ziegen sehr niedrig, was in weiterführenden Studien unter-

sucht werden sollte und eine Basis für eine Verbesserung der Vakzinekomposition der NLV und

SSLV bietet. Die Immunisierungen mit der SSLV ergaben eine unterschiedliche Wirksamkeit

der Erstimmunisierung, die sich ebenfalls im Antikörperspektrum deutlich von der Auffri-

schungsimpfung unterschied. Zusammen mit den erhobenen Daten zum Titerverlauf innerhalb

eines Jahres konnte ein Vorschlag zur Optimierung des Impfplans der SSLV, auch in Kombina-

tion mit einer Protein-basierenden NLV erarbeitet werden.

xii

Summary

The discovery of the Sterne spore live vaccine (SSLV) and subsequently its application in a

veterinary context contributed to the global reduction of Anthrax related outbreaks since 1930.

Nonetheless the causative agent Bacillus anthracis is still prevalent in some mediterranean

countries, South and Central America, Africa and Central Asia, as well as the USA and Canada.

Reasons for this are the persistence of the pathogen in the soil, as well as still undefined factors

for an ongoing cycle of outbreak and spread of the disease and the limited applicability of the

SSLV. This includes the necessity to revaccinate annually, the residual virulence in certain

sensitive species (e. g. goats and llamas) and the incompatibility to treat and vaccinate

simultaneously.

To participate in the ongoing search for alternative vaccines this work was dedicated to

evaluate protein- and DNA-based components as potential ingredients for a multi-component

non-living vaccine formulation (NLV). For the protein-based NLV these included rPA83 as part

of the Anthrax toxin, rBclA and Formalin inactivated spores (FIS) as spore specific antigens, a

Capsule-Lipopeptide conjugate as part of the vegetative form of the pathogen and a

Lipopeptide-adjuvant. The DNA-vaccines consisted of vector-backbones comprising signal

sequences able to direct the integrated antigens (rPA83, PAD4LFD1 and BclAD1D3) to the

MHCI, MHCII and the secretory pathway. A sperate vector encoding for a positive MHCII-

regulator (CIITA) and a vector internal sequence for the Interferon-ß promotor stimulator

(mIPS1) served as adjuvants for the DNA-vaccines.

The specified components were tested in NMRI-mice alone and in combination to evaluate

their potential for a vaccine combination to be used in goats. The protein components with

25 µg per antigen (108 spores in case of FIS) and 50 µg of Lipopeptide, were injected s. c.,

while the DNA-vaccines were applied i. c. via GeneGun. All mice were immunized 3 times in

2 week intervals and infected with ~1000 or ~2000 spores of a fully virulent strain (Ames)

3 weeks after the last immunisation. The majority of the groups showed detectable antibody

titres against their respective antigens, with protein vaccines generally eliciting higher titres

against rPA83 than the DNA-vaccines. Regarding rBclA equivalent high titres were measured

for protein- and DNA-vaccines alike, which also corresponded to the anti-FIS titres for groups

immunized with rBclA, FIS or both. The Capsule-Lipopeptide conjugate did not elicit high

titres against the capsule, possibly due to an immune suppressing epitope.

Survival rates ranged between 10 and 100 %, with all protein groups receiving only one

antigen showing survival comparable to the process controls and the paramunized animals

(< 10 %). Combinations of at least two protein components resulted in > 60 % survival, while

full protection was only achieved if FIS was included. All DNA-vectors induced 30 – 50 %

protectiveness when given alone. Notably DNA-vectors including BclAD1D3 elicited 50 %

xiii

survival and sterile immunity. A combination of the most promising vectors encoding for toxin

and spore specific antigens achieved 90 % protectiveness in mice.

According to the results from the mice trials, the auspicious protein- and DNA-vaccine com-

binations were tested in goats in comparison to the SSLV in cooperation with our project part-

ners in South Africa and Turkey. The efficacy of the SSLV was assessed in 3 groups which were

challenged shortly after the first immunisation, one year after the first immunisation or after the

revaccination. The protein combination for the goat trials comprised of the Lipopeptide

(500 µg), rPA83 and rBclA (25 µg respective 75 µg for the repetition) and was administered

with or without the supplementation of FIS (108 spores). Due to the noted lack of immunogeni-

city the Capsule-Lipopeptide conjugate was not included. The vectors used for the DNA-vacci-

ne combination included NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1, pDNAVaccUltra1-TPA-BclA-

D1D3-LAMP1 and pDNAVaccUltra5-CIITA (each 1 mg) which were injected s. c. respectively

i. c. via syringe. The challenge was performed with ~1000 spores of fully virulent field isolates

of the respective regions (Turkey and South Africa). Apart from the comparison of immuno-

genicity and protectiveness between SSLV and NLV in goats, assessment of data concerning the

titre development of SSLV-immunized goats during the course of a year as well as detailed dia-

gnostic data during the infection (behavior, temperature, bacterial loads, correlations and mini-

mal infective dose) were integral part of this study.

Compared to one another the SSLV-immunized animals showed equal or higher antibody

titres against the measured antigens, with FIS and rPA83 being the most immunogen antigens.

Utilizing a higher dose (75 µg) the protein-based NLV protected equivalently to the SSLV

(60 – 100 %) yielding 50 % protectiveness without FIS and 80 % if FIS was included. The

DNA-vaccines showed little to no immunogenicity in goats, thus no challenge was performed

on these animals. The humoral reaction against BclA was generally poor in goats, which has not

been noted before and could be a basis for further improvements concerning the SSLV and NLV

alike. The different immunizations with the SSLV revealed a broad range for the efficacy of the

first vaccination as well as a notable difference in the antibody spectrum between first

vaccination and revaccination. Together with the recorded data of the antibody titre

development throughout a year a more optimal protocol for immunisation with the SSLV,

possibly in combination with an NLV was postulated.

xiv

1. Einleitung

1 Einleitung

1.1 Entdeckung der Ätiologie von Milzbrand

Die heute als Milzbrand, „Anthrax“, „charbon“ oder „woolsorter's disease“ bekannte Krankheit

gehört zu einer der am frühsten dokumentierten Leiden der Menschheitsgeschichte. Beschrei-

bungen von Milzbrand ähnelnden Krankheiten reichen bis weit ins Altertum zurück und finden

sich in klassischen Werken, wie Homers „Ilias“ oder der „Ab Urbe Condita Libri“ von Livius,

wieder [27][323]. Die Ergründung des ursächlichen Agens dieser Krankheit, welche als wieder-

kehrende Pest in Schafen und Rindern Weideland auf Dauer verseuchen konnte, gewann aller-

dings erst im Zuge der fortschreitenden Industrialisierung im 19. Jahrhundert an Brisanz.

Durch den vermehrten Import von Wolle nach England kam es zwischen 1837 und 1880 zu

vermehrten Ausbrüchen von Milzbrand unter Arbeitern der Wollindustrie, daher auch die Be-

zeichnung „woolsorter's disease“ [178]. Die Aufklärung der Ursache dieser grippeähnlichen

Krankheit begann bereits 1823 mit Demonstrationen Éloy Berthelémys zur Infektiösität der

Krankheit [223]. 1850 berichtete Pierre Rayer von fadenförmigen Gebilden im Blut verendeter

Tiere. Auf diesen Beschreibungen aufbauend konnte Casimir Davaine 1863/64 die Übertragung

der Krankheit durch infiziertes Blut nachweisen und Ernst Tiegel und Edwin Klebs (1864) die

Infektiösität durch Filterung des infizierten Blutes negieren [323]. Diese Beobachtungen führ-

ten zu der Annahme, dass die Krankheit durch einen sich im Wirt vermehrenden, lebenden Or-

ganismus verursacht wird, der schlussendlich über eine Septikämie zum Tode führt. Die Bestä-

tigung dieser Annahme, die Zuordnung der Krankheit Milzbrand zu einem spezifischen Bacil-

lus anthracis (B. anthracis) und die Beschreibung des Lebenszyklus von B. anthracis gelang

1876 Robert Koch [171]. Durch R. Kochs Beobachtung der Germination und Sporulation konn-

te zudem erstmals, neben der Infektiösität von kontaminierten Blut, der Bezug der Krankheit zu

kontaminierten Böden und leblosem Material hergestellt werden. Damit war Milzbrand die ers-

te vollständig umschriebene Krankheit, die einem spezifischen Krankheitserreger zuordenbar

war und untermauerte die damals noch umstrittenen Keimtheorie.

1.2 Taxonomie und Morphologie

Die Gattung Bacillus ist eine sehr heterogene Gruppe von Endosporen bildenden Bakterien mit

mehr als 200 Arten, die die Mehrheit der gefundenen Bakterien im Boden stellt [265]. Als pa-

thogene Spezies dieser Gattung sind bisher nur Bacillus cereus sensu stricto (B. cereus), Bacil-

lus thuringiensis, B. anthracis und Bacillus cytotoxicus bekannt [245][121]. Diese bilden zu-

sammen mit den apathogenen Vertretern Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus

medusa und Bacillus weihenstephanensis, die genetisch sehr ähnliche B. cereus sensu lato

1

1. Einleitung

Gruppe [245]. Durch phänotypische Klassifizierung, Nachweis der Virulenz und Genotypisie-

rung lässt sich B. anthracis als eigenständige Spezies dieser Gruppe unterscheiden [136][324],

wenngleich bereits mehrfach verschiedene B. cereus Stämme mit B. anthracis ähnlichen Eigen-

schaften beschrieben sind [140][165].

Für gewöhnlich zeichnet sich B. anthracis durch eine charakteristische Morphologie auf

Blut- und Nähragar aus, auf denen flache, matte, weiße oder gräulich-weiße Kolonien gebildet

werden, die eine klebrige Konsistenz mit meist fransigen Ausläufern aufweisen (Abbildung 1)

[236]. Das Bakterium ist nicht hämolytisch, unbeweglich,

sensitiv gegenüber Penizillin und dem diagnostischen

„Gamma Phagen“ und bildet in Anwesenheit von Bicarbo-

nat/CO2 eine charakteristische Kapsel [236]. Durch die Ab-

klärung dieser Eigenschaften ist eine eindeutige Zuordnung

in den meisten Fällen möglich und kann über eine diagnosti-

sche PCR, mittels Detektion der, die Pathogenitätsfaktoren

kodierenden, Plasmide pX01 und pX02 und spezifischer

chromosomaler DNA-Sequenzen, verifiziert werden [25]

[238][289].

Mit 182 kb ist pX01 das größere der beiden charakteristischen „Milzbrandplasmide“ und ko-

diert für die Toxinkomponenten des Erregers [213]. Die Gene für den Auf- und Abbau der Kap-

sel sind auf einem zweiten, 95 kb großen Plasmid kodiert (pX02) [331][117]. Die Anwesenheit

beider Plasmide sowie die Anzahl der vorhandenen Kopien haben direkten Einfluss auf die Vi-

rulenz von B. anthracis [86][59]. Neben diesen Virulenzfaktoren bestimmt die Fähigkeit des

Bakteriums zur Überdauerung ungünstiger Umweltbedingungen mittels Sporulation die andau-

ernde Verbreitung und Prävalenz des Erregers.

1.2.1 Aufbau der vegetativen Zelle

B. anthracis ist ein grampositives, aerobes oder fakultativ

anaerobes Bakterium, welches unter dem Mikroskop in

vegetativer Form als 3 – 6 µm langes und 1 – 1,5 µm brei-

tes charakteristisch Stäbchen, mitunter in Anordnung von

langen, bambusartigen Ketten zu erkennen ist [86] (Abbil-

dung 2 und 4).

Dem Aufbau der vegetativen Zelle von innen nach au-

ßen folgend (Abbildung 3), grenzt die zytoplasmatische

Membran den Zellinhalt nach außen ab. Sie besteht aus Phospholipiden, Fettsäuren und min-

2

Abbildung 1: Koloniemorphologie

B. anthracis Kolonien auf einer Columbia-Blutagarplatte (CBA) nach über Nacht (üN)Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre

Abbildung 2: Kettenbildung

Vegetative Zellen von B. anthracis im Blut-ausstrich von infizierten Ziegen mittels Azur Bangefärbt.

1. Einleitung

destens 25 verschiedenen Membran- und 13 Lipoproteinen, welche zum Teil für die Faltung,

Translokation und/oder Verankerung von extrazellulären Antigenen verantwortlich sind [342]

[363]. Oberhalb der zytoplasmatischen Membran besitzt B. anthracis als Vertreter der grampo-

sitiven Bakterien eine dicke Zellwand. Sie ist aus Peptidoglycan und assoziierten Polymeren

aufgebaut und dient vornehmlich der Stabilisierung der Zellform, sowie dem Schutz des Zell-

körpers [96].

Außerhalb der Peptidoglycanschicht besitzt

B. anthracis eine zweidimensionale, protein-

haltige, parakristalline Surface Layer (S-

Layer), welche die gesamte Zelle schützend

umschließt [141][267][290][291]. Für B. an-

thracis sind gleich zwei, jeweils 94 kDa große

S-Layer Proteine bekannt [212]: das Surface

array protein (Sap) [87][81] und das Extract-

able Antigen 1 (EA1) [209]. Beide Proteine

sind in geringen Mengen auch in der Human-

vakzine AVP enthalten und fungieren sowohl

dort als auch in der Sterne Sporen Lebendvakzine (SSLV) oder bei natürlichen Infektionen als

immunogene Antigene [9][84]. Eine partielle protektive Wirkung konnte allerdings bisher nur

für EA1 in Mäusen festgestellt werden [332].

1.2.1.1 Die Kapsel

Im Gegensatz zu den meisten bakteriellen

Kapseln ist die von B. anthracis gebildete äu-

ßerste Schicht nicht aus Polysacchariden

[319], sondern aus γ-verketteten Proteinpoly-

meren der D-Glutaminsäure aufgebaut [143]

[340]. Die Gene zur Bildung und Regulation

dieser Poly-γ-D-Glutaminsäure (PGA) sind

auf dem Plasmid pX02 kodiert [117][331], wobei die Kapselproduktion auf transkriptioneller

Ebene von der Anwesenheit von Bicarbonat bzw. Indikatoren der Wirtsumgebung und des

Mediums abhängig ist [288][97]. Entsprechend der Wachstumsbedingungen entsteht Kapselma-

terial unterschiedlicher Länge (20 – 1500 kDa) [128][249], welches als schützende Schicht an

der Zellwand oder der Zellmembran verankert ist [96]. Über Färbung mit Methylenblau [202]

3

Abbildung 3: Aufbau der vegetativen Zelle

Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Teilausschnitts einerbekapselten vegetativen Zelle von B. anthracis; Die markiertenOberflächenmerkmale sind die Kapsel (C – Capsule), die S-Layer(S – Surface-Layer), die Peptidoglycanschicht (P) und diezytoplasmatische Membran (m); Der Maßstab hat eine Länge von250 nm [208]

Abbildung 4: Kapselfärbung

Färbung der Kapsel von B. anthracis indirekt mittels Tusche (links[208]) und direkt mit Azur B (rechts [231])

1. Einleitung

oder Azur B [231] oder indirekt mit Tusche [77] kann die Kapsel in mikroskopischen Aufnah-

men sichtbar gemacht und zur Diagnostik hinzugezogen werden (Abbildung 4).

Durch Degradierung werden Kapselfragmente in großer Zahl freigesetzt. Diese Fragmente

dienen vermutlich als Täuschkörper zum Schutz vor dem Komplementsystem, zur Dämpfung

der Reaktivität von Immunzellen und zur Behinderung der Ausreifung dendritischer Zellen

[203][154]. Die Kapsel selbst wirkt nicht toxisch [292], erhöht aber die Virulenz von B. an-

thracis, da sie die Phagozytose der vegetativen Zelle durch Makrophagen beeinträchtigt [242]

[163][275]. Die Opsonierung des Zellkörpers durch das Komplementsystem und spezifischer

Antikörper wird ebenfalls behindert, da die Kapsel zum einen selbst kaum immunogen ist und

zum anderen immunogene Epitope verdeckt [163][208]. Damit ist die Kapsel wesentlich an der

Etablierung der Infektion beteiligt, da sie den Erreger vor dem Immunsystem abschirmt und

dessen Vervielfältigung, die schlussendlich über Bakteriämie oder/und Toxämie zum Tode führt

ermöglicht [242].

1.2.1.2 Die Toxinkomponenten

Neben der Kapsel stellen die sekretierten Toxinkomponenten von B. anthracis den zweiten Vi-

rulenzfaktor dar, der über pX01 ebenfalls plasmidkodiert ist [213]. Bereits 1954 fanden Harry

Smith und James Keppie [293] eine „toxische, nicht zelluläre Komponente von Milzbrand“, die

trotz Abtötung der Bakterien bei Tieren zum Tode führen konnte. Diese „Komponente“ besteht

aus drei Teilen, die für sich genommen keine toxische Wirkung haben: dem schützenden Anti-

gen (PA – engl. Protective Antigen), dem Letalfaktor (LF – engl. Lethal Factor) und dem

Ödemfaktor (EF – engl. Edema Factor) [295][17]. Sie gehören zur Gruppe der binär oder AB-

Toxine, die sich aus zwei funktionell ergänzenden Untereinheiten aufbauen, von der eine die

enzymatische Aktivität beinhaltet (LF und EF) und die andere die Bindungsfähigkeit vermittelt

(PA) [110]. Durch Kombination von PA mit LF wird das tödlich wirkende Letaltoxin (Letx) ge-

bildet. Analog dazu bilden PA und EF das Ödemtoxin (Edtx), das nur bedingt tödlich ist aber

großflächige Ödeme verursacht [295][17]. Dabei findet zunächst keine Bindung zwischen dem

83 kDa großen PA (PA83) [355] und EF oder LF statt.

Zur Entfaltung der Wirksamkeit der Toxine muss PA83 zunächst proteolytisch in PA63 und

PA20 gespalten werden [168][83]. Das entstandene PA63 heptamerisiert [216] und bildet eine

ringförmige Präpore, die kompetitiv bis zu drei Moleküle LF und/oder EF binden kann [222].

Der entstehende Toxinkomplex gelangt durch rezeptorvermittelte Endozytose [80][37][274]

[115] in die Wirtszelle, wo die sukzessive Freisetzung von EF und LF aus dem Endosom in das

Zytosol [215][60] deren enzymatische Wirkung ermöglicht [370].

4

1. Einleitung

1.2.2 Aufbau der Spore

Bakterielle Sporen sind in nahezu allen Umweltproben vorhan-

den und können potentiell Millionen von Jahren in dieser resis-

tenten Dauerform überleben [47][339]. Sie sind größtenteils me-

tabolisch inaktiv, resistent gegenüber einer Vielzahl an natürli-

chen Stressfaktoren und somit ideal geeignet ungünstiger Bedin-

gungen über längere Zeiträume zu überdauern [5][277][72][226].

Die ausgereifte Spore von B. anthracis ist im Durchschnitt

1,3 µm lang, 0,7 µm breit [51] und aus einer Reihe von Schich-

ten mit spezifischer Funktion aufgebaut, die einem lichtundurch-

lässigen Kern umgeben (Abbildung 5). Der Kern enthält das

dicht gepackte, genetische Material [278] und wird von einer in-

neren und äußere Membran umfasst. Der zwischen den Membra-

nen liegende, lichtdurchlässige Kortex beinhaltet die Peptido-

glykanschicht, die eine Schlüsselrolle in der Erhaltung des Ruhe-

zustands der Spore und der Hitzebeständigkeit einnimmt [224]. Der mehrschichtige Sporen-

mantel grenzt den Kortex nach außen ab, besitzt eine selektive Durchlässigkeit und vermittelt

der Spore durch die Bildung charakteristischer Rillen Flexibilität beim Ein- und Ausstrom von

Wasser [346][5][51][72][74]. Die über 50 bisher für B. anthracis gefundenen, mit dem Mantel

assoziierten Proteine [179][137] sind potentielle Kandidaten für zukünftige Vakzineformulatio-

nen [111].

Die äußerste Struktur der Spore ist ein ca. 10 – 20 nm vom Mantel entferntes, ballonartig

aufgespanntes Exosporium, das aus einer parakristallinen Basalmembran mit aufgelagerten,

haarähnlichen Strukturen aufgebaut ist [108][18][137]. Es ist elastisch, in der Größe variabel

und nicht mit der Spore verbunden [72][137]. Ein Fehlen des Exosporiums wirkt sich nicht si-

gnifikant auf die Virulenz des Erregers aus [33][111], obgleich es für die Adhäsion an Makro-

phagen und anderen Oberflächen von Bedeutung ist [172][35]. Ebenso maskiert es Epitope der

darunter liegenden Schichten, die von Makrophagen über Mustererkennungsrezeptoren erkannt

werden können [16]. Generell sind alle Bestandteile des Exosporiums aufgrund ihrer direkten

Assoziation mit der Umwelt als potentielle Vakzinekomponenten von Interesse.

Besonders herauszustellen ist hierbei das „Bacillus collagen-like protein of anthracis“

(BclA) als primärer Bestandteil der peripheren Schicht aus feinen haarähnlichen Filamenten

(Abbildung 5) [310][296]. Als immunodominantes Oberflächenprotein der Spore war es das

erste identifizierte Protein des Exosporiums [310][296]. Es ist vermutlich bei der Adhäsion an

das Wirtsgewebe involviert [254][34] und hat eventuell auch die Funktion andere immunstimu-

lierende Antigene zu verdecken [279]. Die Virulenz beeinflusst es jedoch nicht direkt [33].

5

Abbildung 5: Sporenaufbau

Elektronenmikroskopie einer Spore;sichtbar sind Kern (Cr – core), Kortex(Cx – cortex), Mantel (Ct – coat),Interner Zwischenraum (IS) und dasExosporium (Exo); Der Maßstab hateine Länge von 700 nm [73]

1. Einleitung

BclA ist aus 382 Aminosäuren [310] aufgebaut und lässt sich in drei Domänen unterteilen, von

denen die mittlere Domäne eine kollagenähnliche Region (CLR) beinhaltet. Diese enthält eine

stammspezifische Anzahl an GRX-Tripletts, die zu einer unterschiedlichen Länge der BclA-

Filamente führen [311]. Als glykosyliertes Trimer ist BclA über dessen aminoterminale Domäne

mittels der Proteine ExsFA und ExsFB an der Basalmembran befestigt [310][309][297][32].

Die nach außen zeigende, immunodominante carboxyterminale Domäne weist eine runde

Struktur mit Ähnlichkeit zum Komplement Faktor C1q auf und vermittelt die Adhäsionseigen-

schaften der Spore [32][254][296]. Weitere wichtige Proteine des Exosporiums umfassen neben

BclB, das viele strukturelle Analogien zu BclA aufweist und eine Funktion in der Stabilisierung

das Exosporiums hat [341][315], BxpA, BxpC, CotB-1, CotB-2, CotY und ExsK [111][251]

[296][310]. Diese sind in ihrer Funktion und Relevanz als potentielle Bestandteile einer zu-

künftigen Vakzine allerdings noch nicht hinreichend charakterisiert.

1.3 Verbreitung und Lebenszyklus

Durch strikte Regelungen im öffentlichen Gesundheitssystem und Routineimpfungen von Per-

sonal und Viehbeständen in Risikogebieten treten Neuerkrankungen in den Industriestaaten nur

noch sehr sporadisch auf und sind meist mit historisch vorbelasteten Arealen, Einschleppung

oder mutwilliger Freisetzung assoziiert [86][155]. In bestimmten Ländern Zentral- und Süd-

amerikas, Zentralasiens und Afrikas, sowie im mediterranen Raum, einigen Gebieten Kanadas,

der USA und Chinas ist der Erreger indes noch prävalent und verursacht regelmäßig große Epi-

demien mit immensen Verlusten an Mensch und Tier [357]. Dabei ist immer noch nicht unein-

geschränkt geklärt, welche Ursachen und Faktoren in welchem Umfang zur Entstehung und

Aufrechterhaltung einer Epidemie beitragen.

Unter natürlichen Umständen befällt Milzbrand hauptsächlich wilde oder domestizierte Her-

bivoren wobei die Ansteckung von Menschen meist über den Umgang mit infizierten Tieren

oder Tierprodukten stattfindet [357]. Durch Grasen auf kontaminierten Böden kommt es via In-

gestion oder Inhalation zur Aufnahme von dormanten Sporen (Abbildung 6) [327]. Im infizier-

ten Wirt entwickeln sich vegetative Zellen (Germination), die über ihre Vermehrung und Bil-

dung der milzbrandspezifischen Toxine letztendlich zum Tod führen können [330]. Unter La-

borbedingungen mittels Germinationsfaktoren [139] ist die Initiation der Germination bereits

nach 2 – 10 min abgeschlossen [92][308] und stellt somit einen sehr schnellen Prozess dar. Der

Germinationsprozess bei einer natürlich akquirierten Infektion, besonders Fragestellungen zum

Ort der Germination und dessen zeitlichem Verlauf, ist noch immer Bestandteil der Forschung.

Besonderer Fokus liegt dabei auf der Beteiligung von Makrophagen und dendritischen Zellen

als Germinationsort und Transportvehikel [120][119][56][94].

6

1. Einleitung

Nach der Öffnung eines an Milzbrand verendeten Kadavers kommt es durch den Austritt der

Bakterien in die Umwelt zu mangelinduziertem Stress, der die Bildung von Sporen (Sporulati-

on) zur Folge hat [190]. Der Umfang und die Rate der Sporulation sind dabei abhängig von

Umweltbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit, pH-Wert, Sonneneinstrahlung und dem

Vorkommen von speziellen Kationen [65][217]. Verendete Tiere können bis zu 108 Bakterien

pro ml Blut aufweisen und so das Erdreich mit hohen Sporenkonzentrationen verseuchen [8].

Die entstandenen Sporen verbleiben im Erdreich oder werden, durch Abschwemmung oder

Vektoren, wie Insekten [321] und Aasfresser [190], weiter verschleppt. Durch orale, aerogene

oder kutane Aufnahme der Sporen sind weitere Infektionen möglich wodurch Sporen das zen-

trale Element des natürlichen Zyklus des Organismus darstellen (Abbildung 6). Unklarheit be-

steht noch immer inwiefern eine Vervielfältigung der Sporen auch außerhalb des Wirts, im Bo-

den [265], oder die Aufkonzentrierung von Sporen durch klimatische und geographische Bedin-

gungen in sogenannten „concentrator areas“ [334] eine signifikante Rolle bei der Bildung von

Infektionsherden und der Persistenz des Erregers spielen [67].

7

Abbildung 6: Zyklus der Anthrax Infektion

Vereinfachte Darstellung des Infektionszyklus mit Sporen als zentralem Element der Übertragung [357]

1. Einleitung

1.4 Pathogenese (Mensch und Tier)

Abhängig vom Eintrittsort der Sporen in den Körper unterscheidet man kutanen, pulmonalen,

oral/gastrointestinalen und neuerdings injektionsbedingten Milzbrand [258][19][86]. Der

Krankheitsverlauf ist dabei in Abhängigkeit von der Spezies, dem Infektionsweg, dem infizie-

renden Stamm, der Dosis und des gesamtheitlichen Gesundheitszustands subakut bis hyperakut

oder chronisch.

Der sogenannte Hautmilzbrand entsteht über Hautläsionen bei Kontakt zu infektiösem Mate-

rial und stellt die häufigste Infektionsart beim Menschen dar [86][126]. Die Infektion bleibt da-

bei lokal, sodass nach 2 bis 7 Tagen an der ursprünglichen Läsion eine kleine Pustel entsteht.

Diese kann sich unbehandelt weiter ausbreiten und bildet später eine Nekrose mit charakteristi-

schem dunklen Schorf [126]. Erhebliche Gefahr geht hierbei von Ödemen aus, die potentiell die

Luftwege abschnüren [86]. Die Sterblichkeitsrate bei unbehandelten Fällen beträgt 20 % [86]

und lässt sich durch Behandlung mit gängigen Antibiotika auf 1 - 5 % reduzieren [104][170]

[116].

Im Gegensatz dazu ist der pulmonal aufgenommene Lungenmilzbrand häufiger tödlich, da

die Symptome bis kurz vor dem Tod einer milden Atemwegsinfektion ähneln und eine richtige

Diagnose ohne Verdachtsmoment kaum möglich ist [86]. Akute Symptome treten plötzlich auf

und umfassen Atemnot, Zyanose, hohe Temperatur und Kreislaufkollaps [126] und führen un-

behandelt in > 80 % oder behandelt in 60 % der Fälle binnen 24 Stunden zum Tode [71][155]

[116]. Es wird vermutet, dass inhalierte Sporen durch alveolare Makrophagen aufgenommen

und in die Lymphknoten transportiert werden, wobei sie innerhalb der Makrophagen germinie-

ren und nach Freisetzung in den Lymphknoten eine systemische Infektion auslösen [261][120].

Generell bedarf es eine um mehrere Größenordnungen höhere Dosis an Sporen als bei anderen

Infektionswegen, um eine Infektion durch Aerosole herbeizuführen [14]. Eine Ansteckung auf

diese Weise unter natürlichen Bedingungen wurde bei Tieren bisher nicht nachgewiesen und

gilt als extrem unwahrscheinlich.

Die Infektion über orale/gastrointestinale Aufnahme von Sporen ist vermutlich die häufigste

natürliche Infektionsart. Im Menschen tritt diese Form nur beim Verzehr von infiziertem Fleisch

auf und stellt daher vor allem in ärmeren Bevölkerungsschichten eine Problematik dar [126].

Ähnlich wie bei kutanem Milzbrand findet der Eintritt der Sporen in den Körper über eine Läsi-

on in den Verdauungsorganen statt und verursacht eine Magen-Darm-Entzündung mit Sympto-

men wie Übelkeit, Erbrechen, Appetitlosigkeit, Fieber und teilweise blutigem Durchfall [116].

Unbehandelt liegt die Sterblichkeit bei 25 - 75 % [116].

Eine weitere sehr seltene Form bzw. symptomatische Ausprägung der genannten Infektions-

wege ist die Milzbrand-Meningitis mit typischen Symptomen wie Leukozytose und hämorrha-

gischer, eitriger Spinalflüssigkeit [126]. Sie kann als Zusatzkomplikation in allen genannten

8

1. Einleitung

Milzbrandformen auftreten. Gerade die favorisierte Behandlungsmethode mit Penizillin schlägt

bei Milzbrand Meningitis nicht an [175]. Weitere Antibiotika wie Erythromyzin, Chloram-

phenicol, Gentamicin, Ciprofloxacin und Tetracyclin können aber ebenfalls zur Behandlung

verwendet werden [187]. Zusätzlich werden anti-Toxin Antikörper ebenfalls angewendet, da

auch das Abtöten der Bakterien durch Antibiotika allein, ab einer gewissen Toxinkonzentration,

ein Fortschreiten der Symptome durch die anhaltende Toxinwirkung nicht unterbindet [10]

[283].

Bei Tieren, insbesondere Herbivoren verläuft die Krankheit häufig perakut oder sogar hyper-

akut, mit zunächst abwesenden oder unspezifischen Symptomen. Einem plötzlich auftretenden

Schlaganfall (Apoplexie), der auf einer Septikämie beruht, folgt kurz nach dem Auftreten erster

Symptome der Tod [126]. Bei einem akuten Krankheitsverlauf sind Krankheitssymptome bis zu

2 Tage vor dem Tod erkennbar und umfassen Herz-Kreislauf-Probleme, Fieber, Depression, hä-

morrhagische Schleimhäute, ödematöse Schwellung der Zunge und des Abdomens, sowie spe-

ziesbedingt Austritt von Blut aus den Körperöffnungen. Ein subakuter teils chronischer Verlauf

ist ebenfalls möglich aber nicht die Regel [126].

Entsprechend der Sensitivität gegenüber Infektionen und der Schwere des Krankheitsver-

laufs lassen sich am Beispiel von Mausinzuchtlinien mindestens zwei Gruppen unterscheiden

[99][221][218][314]: Mauslinien mit Letx-sensitiven Makrophagen, die gegen eine Infektion

resistenter sind als solche mit Letx-resistenten Makrophagen. Die Sensitivität der Makrophagen

beruht dabei auf den entsprechenden Allelen für den Nalp1b Lokus [31], die bei sensitiven Ma-

krophagen durch Letx zu einer Aktivierung des „Kaspase-1-abhängigen Inflammasoms [207]“

führen. Dies resultiert zum einen, über Ausschüttung inflammatorischer Zytokine, in einer po-

tenten Immunreaktion des angeborenen Immunsystems gegen die Infektion [184][134][52] und

zum anderen zum antimikrobiell induziertem Zelltod (Pyroptose) der Makrophagen [371]. Da-

bei besteht die Wirkung des Letx auf Makrophagen und anderen myeloiden Zellen im frühen

Stadium der Infektion in der Behinderung der antibakteriellen Funktion der Phagozyten und so-

mit der Unterstützung der Ausbreitung des Infekts. Die terminale Letalität von Letx und Edtx

beruht allerdings auf deren systemischen Wirkung, die zur Schädigung von Zellen des Herz-

Kreislauf-Systems und der Leber führt [197]. Neben den charakterisierten Inzuchtmodellen für

Ratten und Mauslinien [99][354] sind als besonders sensitive Wildtiere Reh, Büffel, Gnu, Ga-

zellen, Kudu und Rentier, sowie Alpakas, Lamas, Zebras und Ziegen [142][88][48][300][303]

betroffen.

9

1. Einleitung

1.5 Impfstoffe

Durch die Entdeckungen von R. Koch und John Bell waren die Voraussetzungen für eine Ver-

besserung der präventiven Maßnahmen zur Vermeidung von Milzbrandinfektionen [171][21]

[178] gegeben. Sie bildeten die Grundlage der Folgearbeiten von Louis Pasteur und Max Ster-

ne, die zur Entwicklung erster Veterinärimpfstoffe führten [237][300]. Diese und davon abge-

wandelte Impfstoffe sind seit dem Ende des 19. Jahrhunderts bis heute in der Tiermedizin im

Einsatz [322] und ermöglichten eine rapide Verminderung der Milzbrandfälle in Tierbeständen

und beim Menschen. Erst der mögliche Einsatz des Erregers als Biowaffe, der vermutlich erst-

mals im 1. Weltkrieg geplant wurde [356][252], rückte eine Verbesserung der vorhandenen

Impfstoffe, vor allem in Hinblick auf die Anwendung im Menschen, wieder in den Vordergrund

und führte letztendlich zur Entwicklung der heutigen gebräuchlichen humanen Milzbrandvakzi-

nen.

1.5.1 Historische Entwicklung der Lebendvakzinen gegen B. anthracis

Bereits 1880 wurde von William Smith Greenfield und später durch L. Pasteur gezeigt, dass

eine verlängerte Inkubation von B. anthracis bei erhöhten Temperaturen (42 – 43 °C) zur Atte-

nuierung und zum Verlust der Sporulationsfähigkeit führt [317]. Wie sich später herausstellte,

basierte die festgestellte Attenuierung auf einem partiellen Verlust des hitzesensitiven Plasmids

für die Toxinproduktion (pX01) [213]. Prinzipiell erhöhte sich durch die fortdauernde Passage

bei hohen Temperaturen sukzessive der prozentuale Anteil an pX01-defizienten Bakterien, so-

dass die Restvirulenz der resultierenden Mischkultur in Abhängigkeit von der Inkubationszeit

abnahm [213]. L. Pasteur nutzte dies aus und entwarf einen Impfplan, der eine Impfung mit

zwei verschieden Inokula (Typ I und II) von unterschiedlichem Attenuierungsgrad im Abstand

von 12 Tagen erforderte [237]. Die erfolgreiche Testung dieser als Duplex Lebendvakzine be-

kannten Impfstrategie fand 1881 in Pouilly-le-Fort an Schafen statt [237]. Diese erste Lebend-

vakzine wurde bis weit in die 1930er Jahre weltweit als Mittel der Wahl zur veterinären Milz-

brandprophylaxe in Rindern und Schafen eingesetzt [126]. Deren Schutzwirkung beruhte unter

anderem auch auf der minimalen Anwesenheit der Toxine, da Reinkulturen ohne Toxine nicht

schützend sind [144]. Die Anwendbarkeit war aufgrund der umständlichen Präparation, der va-

riablen Wirksamkeit, der Variationen im Attenuierungsgrad und der daraus resultierenden

Krankheitsausbrüche durch die Immunisierung begrenzt [302][304][326]. Ebenso war eine

Vakzinierung anfälliger Spezies aufgrund der Restvirulenz der Präparation nicht möglich [302].

Ein später von M. Sterne isolierter toxinogener Stamm (34F2) mit fehlendem Kapselplasmid

(pX02) [302][300] bildete ab 1937 die Grundlage für eine neue Lebendvakzine (SSLV – Sterne

Sporen Lebendvakzine), die für viele Spezies als unbedenklich galt und weitaus weniger Ne-

10

1. Einleitung

benwirkungen aufwies [301][299][305][126]. Ursprünglich wurde der Stamm auf 50 % Nähr-

agar für 24 Stunden unter 30 % CO2 angezogen und enthielt 105 – 106 Sporen pro ml in 0,5 %

Saponin und 50 % Glyzerin [302][300][304]. Wenngleich die Sporenkonzentration heute etwas

höher ausfällt (~ 107 Sporen pro ml), hat sich an der Zusammensetzung seither nicht viel ver-

ändert, sodass die SSLV als relativ sichere, effektive und kosteneffiziente Vakzine bis heute in

Tieren verwendet wird [126].

Dennoch wird die Forschung nach Alternativen weiter vorangetrieben, da auch dieser Impf-

stoff mit einigen Nachteilen behaftet ist. So ist die Schutzdauer nur begrenzt und muss jährlich

aufgefrischt werden, was vor allem beim Einsatz in Wildbeständen bedrohter Populationen pro-

blematisch ist [326]. Des Weiteren ist auch hier eine Restvirulenz in verschiedenen Spezies vor-

handen [328][353][326], sodass es bei sensiblen Tieren (beispielsweise Ziegen) notwendig ist,

4 Wochen vor der eigentlichen Impfung, die Immunisierung durch eine Prä-Immunisierung mit

einem Viertel der Dosis abzumildern [357]. Als wichtigstes Manko der SSLV gilt die Unverein-

barkeit mit einer antibiotischen Behandlung, da diese die Impfwirkung nahezu komplett aufhebt

[348][298]. Dies ist besonders bei der Prävention einer Ausbreitung der Krankheit in einer

befallenen Herde von Bedeutung. Daher hält die Suche nach alternativen Lebendvakzinen,

Totimpfstoffen und azellulären Mehrkomponenten-Impfstoffen zur Gewährleistung eines

sichereren, länger anhaltenden und universellen Veterinärimpfschutzes bis heute an.

1.5.2 Entwicklung der lizenzierten Humanvakzinen

Aufgrund der möglichen Nebenwirkungen, wie Nekrosen an der Verabreichungsstelle und der

gelegentlich vorkommenden Todesfälle in sensitiven Spezies, wurde von einer Verwendung der

genannten Lebendvakzinen im Menschen abgesehen. Eine Ausnahme bildet die in der früheren

Sowjetunion entwickelte und 1953 im Sanitary-Technical Institute (STI) lizenzierte Lebendvak-

zine für Menschen, die durch Auftragung eines SSLV-ähnlichen Stammes (STI-1) auf die zuvor

aufgeraute Haut oder durch s. c. Applikation angewendet wird [282]. Die Vakzine wurde zwar

umfangreich in Menschen und Tieren ohne Nebenwirkungen getestet, ist aber international

nicht zur Verwendung im Menschen freigegeben, da entsprechende zugängliche, verifizierbare

Veröffentlichungen fehlen [326].

Die Grundsteine zu den heute gängigen Humanvakzinen wurden bereits zu Beginn des

20. Jahrhunderts gelegt. 1904 wurde von Oskar Bail das schützendes Potential zellfreier Flüs-

sigkeit eines Milzbrandödems entdeckt [7]. Diese Arbeiten wurden unter anderem von William

Cromartie und Dennis Watson weitergeführt, welchen es bereits gelang Kaninchen, Meer-

schweinchen, Mäuse, Hamster und Schafe mit ähnlichen Formulationen zu schützen [63][347].

Allerdings war das verwendete, unprozessierte Ödemfluid immer noch toxisch und erzeugte

11

1. Einleitung

Hautläsionen. Dieser toxische Effekt konnte später durch Adsorption mit Calciumphosphat ent-

fernt werden, sodass nur noch das „schützende Antigen“ (Protective Antigen, PA) übrig blieb

[63][316]. Derart filtrierte Kulturüberstände schützten in Abhängigkeit von der Größe des In-

okulums und dem Alter der Kultur Kaninchen, Schafe, Affen und Meerschweinchen, nicht aber

Mäuse [112][22].

Nachfolger waren die „Boor und Tresselt Vakzinen“, die für die Anzucht einen intermediär

virulenten Stamm verwendeten und die zu impfenden Antigene durch Fällung und Trocknung

aufkonzentrierten [29][30][320]. Dieser Ansatz funktionierte ebenfalls gut, war aber wie die

Komposition von W. Cromartie und D. Watson, mit dem Makel behaftet, zu großen Teilen aus

undefinierten Substanzen zu bestehen. In beiden Fällen war Serum essentieller Bestandteil des

Inokulums und die resultierenden Vakzinen per se in ihrer Form als krude Kulturüberstände

nicht vollständig ausdefiniert. Unter diesen Bedingungen war keine normierte Vakzine in großer

Stückzahl und immer gleicher Qualität zu erzeugen.

Dies änderte sich mit der Etablierung und Verfeinerung synthetischer, definierter Medien, die

es erlaubten zwar niedrigere aber konstante Antigenkonzentrationen zu erzeugen [41][366][22].

Das von F. Belton und R. Strange in den 1950er Jahren entwickelte Hydrolysat

Wachstumsmedium ermöglichte unter Zusatz von Aktivkohle, Kulturüberstände mit

vergleichsweise hohem Gehalt an PA [22][326]. Dies bildete die Grundlage für die ab 1965

eingesetzte und 1979 lizenzierte Humanvakzine des Vereinigten Königreichs [326][325]. Diese

ist auch unter dem Namen AVP – Anthrax vaccine precipitated – bekannt, da der gewonnene

Antigenüberstand des verwendeten Kapsel-defizienten SSLV-Stamms (34F2) durch

Präzipitation mit Kaliumaluminiumsulfat (Alaun) abgetrennt und aufkonzentriert wird [326]

[116]. Die Vakzine enthält neben PA auch geringe Mengen an EF und LF, sowie zwei Proteine

der S-Layer (Sap und EA1), wenngleich bisher unklar ist, welche Bedeutung diese Bestandteile

(ausgenommen PA) für die Schutzwirkung haben [9].

Die in den USA in den 1960er Jahren entwickelte Humanvakzine AVA – Anthrax vaccine ad-

sorbed – besteht aus Aluminiumhydroxid adsorbiertem zellfreiem Filtrat einer toxinogenen,

unbekapselten, Protease-defizienten V770-NP1-R Kultur [244]. Im Gegensatz zu AVP enthält

AVA nahezu kein EF und LF, da der verwendete Stamm hauptsächlich PA produziert und die

Kulturbedingungen so ausgelegt sind, den Anteil an EF und LF weiter zu minimieren [244]

[157]. Daher enthält AVA höhere Konzentrationen an PA und gilt gemeinhin als verträglicher

als AVP [328]. Seit 1972 ist auch AVA für den Gebrauch im Menschen lizenziert [326][325].

Beide Vakzinen können milde Nebenwirkungen am Applikationsort zeigen und beinhalten

einen umfangreichen Impfplan der eine jährliche Auffrischung vorsieht [36][244][116]. Dieser

und die immer wieder auftretenden Lieferengpässe begründen die oft frühzeitig abgebrochenen

oder nicht regelkonformen Impfverläufe [130][325]. Ebenso ist die tatsächliche Effizienz beider

12

1. Einleitung

Vakzinen im Menschen bisher nicht hinreichend bewiesen, da die einzigen belastbaren Daten

zur Schutzwirkung im Menschen mit einem Vorläufer der AVA Vakzine durchgeführt wurden

[36][325]. Hinzu kommt, dass die Standardisierung sehr schwierig ist, die Vakzinen als nicht

vollständig charakterisiert gelten und über die Entwicklung der Impfpläne keine lückenlose Do-

kumentation erhalten ist [325]. Hinweise wonach das Golfkriegssyndrom ebenfalls ursächlich

mit der Impfung gegen Milzbrand verknüpft war [325], wie auch die Tatsache, dass die Human-

vakzinen auf Grundlage von 30 Jahre alten Wissensstandards entwickelt wurden und aufgrund

der Zulassung noch heute so produziert werden, sind der Grund für die andauernde Suche nach

Alternativen. Vergleichende Tests in Tierversuchen zeigen indes deutlich, dass die Schutzwir-

kung der Vakzinen besonders bei Meerschweinchen abhängig vom eingesetzten Infektions-

stamm variiert und bei Hamstern und Mäusen weit hinter den Erwartungen zurückbleibt [328]

[192][146][89][90]. Dies unterstützend belegen zahlreiche Studien, dass rein auf PA bzw. den

Toxinen basierende Impfstoffe nicht ausreichend für einen vollständigen Schutz sind [328]

[329][326]. Überdies ist ein speziesübergreifender, universell verwendbarer Indikator zur Vor-

hersage einer Schutzwirkung nicht vorhanden. Die Bestimmung von Antikörpertitern gegen die

Toxine und deren neutralisierenden Eigenschaften haben sich für einige Tiermodelle als gute

prognostische Mittel erwiesen [147]. Berichte über die Korrelation der gemessenen Titer zum

Überleben sind jedoch in Abhängigkeit vom Versuchsaufbau ambivalent [192][149][329][211],

sodass zur endgültigen Evaluierung einer Vakzine ein direkter Test auf das Überleben einer leta-

len Infektion im avisierten Modellorganismus unabdinglich ist.

1.5.3 Ansätze zur Entwicklung neuer Vakzinen gegen B. anthracis

Aus den vorherigen Kapiteln wird deutlich, dass die gängigen lizenzierten Vakzinen zwar einen

wichtigen Anteil an der Eindämmung der ökologischen und ökonomischen Konsequenzen so-

wie der militärischen Bedrohung hatten und auch immer noch haben, ihre Verbesserung bzw.

Ergänzung durch neue Vakzinen aber wünschenswert ist. Entsprechend der Entwicklung wis-

senschaftlicher Standards haben neue Impfstoffe für eine Zulassung in Mensch und Tier strik-

tere Regularien zu erfüllen, als es noch für die SSLV, AVA und AVP der Fall war [325]. Idealer-

weise sollte ein neuer Impfstoff einfach zu applizieren sein und mit einem möglichst kurzen

und unkomplizierten Impfplan eine langanhaltende Immunität vermitteln [329][326]. Zudem

sollte er kaum Nebenwirkungen verursachen, vollständig avirulent und einfach und billig nach

einem standardisierbaren Verfahren herzustellen sein [329][326][325]. Zur Annäherungen an

diese Idealvorstellungen wird daher unentwegt nach neuen Wegen der Applikation, neuen im-

munogenen Antigenen, effektiveren Adjuvanzien, Methoden zur zielgerichteteren Freisetzung

und der Wirkverbesserung vorhandener Antigene geforscht.

13

1. Einleitung

1.5.3.1 Toxinkomponenten

Die Identifizierung der einzelnen Toxinkomponenten und die damit einhergehende Möglichkeit,

diese aufzureinigen und einzeln zu betrachten, waren grundlegende Voraussetzungen, die eine

Weiterentwicklung von azellulären Milzbrandvakzinen erst ermöglichten [295][294][183][259]

[355][38]. Auf Basis dieser Erkenntnisse konnte bereits in den 70er Jahren gezeigt werden, dass

PA in Abwesenheit von EF und LF eine schützende Wirkung hat, wohingegen für EF und LF al-

lein nur eine marginale schützende Wirkung festgestellt werden konnte [295][294][147]. Daher

gilt PA als essentieller Bestandteil neuer Vakzineentwicklungen [86].

Das monomere Polypeptid PA ist aus 735 Aminosäuren aufgebaut, enthält vier strukturelle

Domänen [239] und fungiert als Bindungskomponente der enzymatisch aktiven Proteine LF

und EF [220]. Wichtige Schlüsselpositionen auf PA zur Verbesserung von Behandlungsmetho-

den und Impfstrategien stellen sowohl die aminoterminale Domäne 1 (D1) als auch die rezep-

torbindende, carboxyterminale Domäne 4 (D4) [287] dar. Wie unter 1.2.1.2 beschrieben wird

PA83 innerhalb D1 proteolytisch in PA63 und PA20 gespalten, wodurch die Oligomerisierung

von PA63 ermöglicht und die Bindungsstellen für EF/LF freigelegt werden. Eine Blockade der

funktionellen Epitope von D1 und D4 kann die Aktivierung von PA83 (D1) bzw. die Bindung

von PA83/PA63 an den Wirtszellrezeptor (D4) gänzlich verhindern und somit die Wirkungskas-

kade der Toxine unterbrechen [193][194]. Antikörpern, die gegen diese Epitope gerichtet sind,

wird eine qualitativ höhere Wirkung zugesprochen, da sie neben der Markierung des Toxins als

Fremdantigen auch neutralisierende Eigenschaften haben. Eine Reduktion der Toxinantigene

auf die für die Blockade wesentlichen Epitope ist daher Inhalt diverser Studien [335][95][193]

[194]. Aufgrund der Möglichkeit Antikörper gegen die Bindungsstellen für EF/LF zu generie-

ren, die ebenfalls zu einer Blockade der Toxinwirkung führen können, ist auch die Verwendung

von PA63 als Alternative zu PA83 in Vakzineformulationen von Interesse, wenngleich PA63

bisher in vergleichenden Studien eine geringere Immunogenität und Schutzwirkung als PA83

aufwies [124][95][1]. Die immunologische Relevanz des Spaltprodukts PA20 ist hierbei noch

unklar. Es gibt Hinweise, wonach dieses Fragment eine apoptotische Wirkung auf Blutleukozy-

ten [127] oder/und eine ablenkende Funktion als bevorzugtes Ziel bei der Bildung von Antikör-

pern gegen PA hat [248][247]. Weitere Strukturen, die für die Wirkverbesserung von PA von

Bedeutung sein könnten, sind funktionale Epitope der Oligomerisation und der Translokation

[227][285][286]. Ebenso bieten LF und EF als Bindungspartner von PA zusätzliche Ansatz-

punkte zur Generierung neutralisierender Antikörper.

LF ist eine hochspezialisierte zinkabhängige Metalloprotease [167], die diverse mitogenakti-

vierte Proteinkinase-Kinasen (MAPKKs) nahe ihrem aminoterminalen Ende spaltet und damit

die Bindung und Phosphorylierung der Substrate der MAPKKs verhindert [54]. Die auf diese

Art unterbrochenen regulative Signalwege in der Phosphorylierungskaskade eukaryotischer Zel-

14

1. Einleitung

len [76][338][337] wirken sich auf die Reaktion gegen eine Reihe von stimulatorischen Signa-

len aus [220]. In Makrophagen, welche zunächst als hauptsächlicher Angriffspunkt der Milz-

brandtoxine ausgemacht wurden [98][129], führt LF zur Unterbrechung der Signalwege der

Antigenrezeptoren [232], sowie Caspase-1 induziert zur Zytokinausschüttung und zum Zelltod

[235][184][134][52]. Darüber hinaus sind Kardiomyozyten und vaskuläre, glatte Muskelzellen

als Zielzellen in der späten Phase der Infektion relevant, wenngleich auch bei anderen myeloi-

den Zellen, Hepatozyten und Endothelzellen eine Letx-Wirkung in vitro nachgewiesen werden

konnte, deren Beeinträchtigung aber vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielt [198]

[221].

Bei einer Größe von 90,2 kDa [38] beinhaltet LF vier unterscheidbare Domänen [233] von

denen D1 und D4 für die Neutralisation relevante Angriffspunkte enthalten, da sie die funktio-

nalen Epitope zur Bindung an PA (D1) beinhalten [6], bzw. die katalytische Aktivität vermitteln

(D4) [193][233]. Zudem erzeugt LF im Menschen teilweise sogar eine stärkere immunogene

Wirkung als PA [11], wobei die Mehrheit der neutralisierenden Antikörper die Epitope betref-

fen, die eine Bindung an PA vermitteln [193]. Eine marginal schützende Wirkung von LF allein

ist ebenfalls bereits in Kaninchen und Mäusen nachgewiesen [243][138]. Zur Kombination der

wirksamsten Eigenschaften von PA und LF wurde bereits eine atoxische Kombinationsvakzine

bestehend aus D1 von LF und D4 von PA erfolgreich im Mausmodell getestet [11].

Von den drei Toxinkomponenten ist EF bisher am wenigsten erforscht. EF ist eine calmodu-

linabhängige Adenylatzyklase, die eine Erhöhung der Produktion des zyklischen Adenosinmo-

nophosphats (cAMP) bewirkt [183][182][281] und damit auch die Konzentration von zellulär

wirksamen ATP vermindert [197]. Die genauen Zusammenhänge der Edtx-induzierten Verände-

rungen im ATP-Haushalt der Zelle, die schlussendlich zur Schädigung von Geweben, Bildung

von Ödemen und dem Zelltod führen können, sind noch nicht vollständig geklärt [93][198].

Eine koordinative Zusammenwirkung mit Letx wird ebenfalls diskutiert, da Edtx die Sensitivi-

tät der Wirtszelle gegenüber den Milzbrandtoxinen erhöht und deren raschen Abbau im Zytosol

verhindert [204][269]. Neben myeloiden Zellen, die als Zielzellen der initialen Infektion rele-

vant sind [219], wirkt die systemische Ausbreitung von Edtx im Verlauf der fortschreitenden

Infektion vor allem schädigend auf Hepatozyten und Epithelzellen [198].

Mit 88,8 kDa besitzt EF eine ähnliche Größe wie LF, bildet aber nur drei Domänen [259].

Dabei hat die aminoterminale Domäne (D1) eine sehr hohe Ähnlichkeit zur aminoterminalen

Domäne von LF und stellt ebenfalls die Bindestelle für PA dar [38]. Die enzymatische Aktivität

ist auf den restlichen Domänen verankert [369][177][176]. Wenngleich auch EF Ansatzpunkte

zur Entwicklung neuer, spezifischer Antigene bietet, wird ihm als Antigen für eine mögliche

Vakzine eher wenig Bedeutung beigemessen, da es alleine nicht schützend ist [295] und bis auf

wenige Ausnahmen nicht tödlich wirkt [93][197].

15

1. Einleitung

1.5.3.2 Antigene der vegetativen Zelle

Prinzipiell sind die Toxinkomponenten ebenfalls als vegetative Antigene anzusehen, da sie nur

von vegetativen Zellen produziert und sezerniert werden. Zur Blockade einer weiteren Vermeh-

rung der Bakterien und Detektion dieser sind aber Reaktionen gegen den Zellkörper selbst er-

forderlich, der durch die wenig immunogene Kapsel (PGA – Poly-γ-D-glumatic acid) nach au-

ßen abgegrenzt [292][86] ist. In ihre Rolle als Schutzhülle erhöht sie die Pathogenität durch

ihre anti-phagozytotischen Eigenschaften [242][50][163][275], durch die Überdeckung immu-

nogener Antigene [208][163], als Wirkungsverstärker in Assoziation mit Letx [85][152] und in

freier Form als Täuschkörper [203][154]. Daher ist die Kapsel und die Erhöhung ihrer Immuno-

genität Bestandteil vieler Studien. Bisher konnte gezeigt werden, dass eine partielle Degradie-

rung der PGA durch enzymatische Spaltung [275] oder eine entsprechende Optimierung der

Länge der PGA [174][158] deren Immunogenität bereits verstärken können. Ebenso kann die

Konjugation von PGA an andere immunogene Substanzen [50][49], wie z. B. PA [273][180]

[105], die Kapsel als T-Zell unabhängiges Antigen zu einem Antigen mit hoher T-Zell-abhängi-

ger Immunogenität konvertieren [345]. Neben der Kapsel rücken verstärkt auch darunter liegen-

de Antigene immer weiter in den Fokus, da auch sie zur Schutzwirkung beitragen können [332].

1.5.3.3 Antigene der Spore

Die Bedeutung von neutralisierenden Antikörpern als bevorzugte Subpopulation ist in der

jüngsten Zeit etwas abgemildert worden. So ist in mehreren Studien belegt, dass Antikörper ge-

gen PA auch Sporen detektieren und opsonieren können [352], was die Germination von Sporen

und die Abtötung der germinierten Zellen durch Makrophagen beeinflusst [351][62][298]. An-

dere vegetative Antigene wie EA1 sind ebenfalls auf der Spore nachweisbar und es scheint

möglich [332], dass die Spore auch weitere vegetative Antigene beherbergen könnte, die ver-

mutlich aus der Mutterzelle bei der Sporulation ihren Weg in bzw. auf die Spore gefunden ha-

ben. Dieser Umstand macht deutlich, dass die Bedeutung der anti-Toxin Antikörper vermutlich

nicht alleinig auf ihrem toxinneutralisierendem Potential beruht, sondern dass sie auch an der

Detektion und Beseitigung von Sporen beteiligt sind.

Die Spore selbst und deren spezifische Antigene sind ebenfalls immunogen [42]. Antikörper,

die direkt gegen die Spore gerichtet sind, beeinflussen ebenfalls deren Germination und Auf-

nahme durch Makrophagen, was die Etablierung einer Infektion verhindern kann und somit zu

einer sterilen Immunität beiträgt [79][39][64]. Beide Arten von sporendetektierenden Antikör-

pern beschleunigen die Aufnahme durch Makrophagen. Ob dies im Einzelfall dem weiteren In-

fektionsverlauf durch den Transport und die Abschirmung der Sporen durch die Makrophagen

zuträglich ist oder zu einer schnelleren Klärung der Infektion führt, muss noch geklärt werden.

16

1. Einleitung

Die betreffenden, sporenspezifischen Antigene können Bestandteile des Exosporiums sein,

welches wie unter 1.2.2 beschrieben die äußerste Schicht der Spore darstellt. Wenngleich einige

der bisher identifizierten und charakterisierten Proteine des Exosporiums ebenfalls eine immu-

nogene Wirkung haben, liegt der Hauptfokus innerhalb der Vakzineforschung bezüglich eines

schützenden Sporenantigens auf BclA. Grund dafür ist die Dominanz der gegen BclA gerichte-

ten Antikörper bei Immunisierungen mit Sporenpräparaten [296][297]. Zudem konnte bereits

gezeigt werden, dass eine zusätzliche Gabe von BclA zu einer PA-Vakzine deren Schutzwir-

kung verbessert [125][39].

Eine weitere Möglichkeit, eine sporenspezifische Immunantwort zu erreichen, ist der Einsatz

von Formalin inaktivierten Sporen (FIS), welche die Schutzwirkung in Kombination mit PA in

bereits getesteten Tierarten erhöhen konnte [42]. Zwar stellen FIS-Präparationen bzw. andere

inaktivierte Sporensuspensionen [79] ein undefiniertes Antigen dar, das zudem nicht synthe-

tisch erzeugt wird und die Handhabung des Erregers erfordert. Bisherige publizierte Versuche

zeigen aber, dass es möglicherweise einen wichtigen Zusatz als Antigen und Adjuvans in einer

Kombinationsvakzine darstellt [106]. Als Bestandteil von intakten Sporen oder FIS-Präparatio-

nen überdeckt BclA andere immunogene Antigene und dämpft deren immunogene Wirkung

[64] [61]. Entsprechende Präparationen ohne BclA wurden in den letzten Jahren auf Immuno-

genität und Schutzwirkung untersucht und zeigten vielversprechende Ergebnisse [336], sodass

gegebenenfalls weitere Antigene des Exosporiums in den Fokus rücken.

1.5.4 Genetische Immunisierung

Eine Alternative zu den Vakzineformulationen, die auf dem Einsatz des kompletten Erregers

oder dessen einzelner Bestandteilen beruhen, stellt die genetische Vakzinierung dar. Im weites-

ten Sinne werden hierbei Gene, die für ein bestimmtes Protein kodieren, in Form von Vektoren

(viral oder mittels Plasmid) injiziert, um eine immunologische Reaktion hervorzurufen. Im Ide-

alfall werden professionelle Antigen präsentierende Zellen (APC) an der Injektionsstelle transfi-

ziert. Dabei wird das eingebrachte Gen in den Zellkern eingeschleust, wie eigene DNA transkri-

biert und translatiert und die resultierenden Proteine über MHCI und auf MHCII [132] T-Zellen

[234] präsentiert (Abbildung 7). Beim Vorhandensein von unmethylierten CpG-Motiven inner-

halb der applizierten DNA kann die DNA selbst zusätzlich als Aktivator der angeborenen

Immunabwehr dienen [173].

Eine funktionierende DNA-Vakzine bietet die Möglichkeit, sowohl zelluläre als auch humorale

Immunantworten gleichermaßen zu aktivieren, hat eine hohe Antigenspezifität und bietet die

Möglichkeit die Art der Immunantwort zu steuern. Darüber hinaus kann sie sehr viel schneller

modifiziert werden und ist weitaus einfacher herzustellen und zu lagern als vergleichbare Prote-

17

1. Einleitung

invakzinen [196][78]. Leider ist es momentan nur möglich, Protein-basierende Antigene auf

genetische Vektoren zu übertragen, wodurch zuckerartige Antigene nicht in Frage kommen.

Zudem kann die Effizienz genetischer Vakzinen geringer als die ihrer Protein-basierenden

Gegenstücke sein, was auf Faktoren wie ineffiziente Zielgenauigkeit beim Einschleusung der

Vektoren in die APCs, unzureichende Genexpression und schwache Antigenpräsentation

zurückzuführen ist [102][262]. Daher werden DNA-Vakzine oft und erfolgreich innerhalb eines

„Prime/Boost Ansatzes“ mit Proteinen oder Ganzzell-Vakzinen verwendet [45]. Damit geneti-

sche Vektoren auch eigenständig als äquivalente Alternative zu Protein-basierenden Vakzinen

eingesetzt werden können, ist die Verbesserung der Applikationsart und die Optimierung der

eingesetzten Vektoren und Antigensequenzen, sowie der Adjuvanzien entscheidend [103].

Da extrazelluläre DNA ineffizient aufgenommen und vornehmlich abgebaut wird, muss sie bes-

tenfalls so appliziert werden, dass sie bereits intrazellulär vorliegt [313][263][57][333]. Durch

Elektroporation kann, nach der Injektion von DNA-Molekülen, eine intrazelluläre Aufnahme

durch elektrische Impulse und die damit einhergehende Permeabilisierung der Membranen for-

ciert werden [200][230][201]. Neben der Elektroporation lassen sich DNA-Moleküle ebenfalls

durch Partikel-Bombardement intrazellulär etablieren. Hierfür wird eine GeneGun verwendet,

welche DNA-beschichtete metallische Mikropartikel (meist Gold) mit Hilfe hoher Beschleuni-

gungen durch Zellmembranen und -wände befördert [101][349]. Die Form der Applikation

beeinflusst hierbei auch die Art der resultierenden Immunantwort und kann unter Umständen

ebenso Adjuvanscharakter haben [349]. So haben Feltquate et al. (1996) und später Weiss et al.

(2002) gezeigt, dass die Injektion von DNA-Vakzinen eher eine TH1-Antwort mit erhöhten

18

Abbildung 7: Genetische Immunisierung

Mechanismus der genetischen Immunisierung: 1) Die Aufnahme von DNA kann frei erfolgen oder durch Integration inVektoren bzw. die Applikationsart unterstützt werden. 2) Betrifft die Aufnahme der DNA eine APC kann das Antigen direktprozessiert und über MHC-Rezeptoren präsentiert werden. 3) Wird die DNA von anderen Zelle aufgenommen kann dasproduzierte Antigen beim Freiwerden durch Lyse oder Sekretion von anderen APC aufgenommen und ebenfalls präsentiertwerden. 4) CpG-reiche Motive bakterieller DNA werden vom TLR9 erkannt und triggern die angeborene Immunität. [333]

1. Einleitung

IgG2a-Titern bewirken kann, wohingegen die Applikation mittels GeneGun eine charakteristi-

sche TH2-Antwort mit IgG1-Gewichtung erzeugt [246][91][349]. Daher ist es sinnvoll, die

Applikationsart der angestrebten Immunantwort anzupassen.

Die erste erfolgreiche Vakzinierung durch ein Plasmid mit einem B. anthracis spezifischen

Antigen wurde 1999 durchgeführt [118]. Hierbei wurde lediglich die Sequenz von PA63 flan-

kiert von einem transkriptionalen Promotor und einem Polyadenylierungssignal i. m. eingesetzt

und induzierte eine humorale und zelluläre Immunantwort, verbunden mit einer Schutzwirkung

in BALB/c Mäusen gegen das Letx. Weitere Versuche mit Domänen von LF [364][243][102]

und verschiedenen Vektoren, die ebenfalls i. m. appliziert wurden, waren gleichermaßen

erfolgreich, wenngleich eine Auffrischungsimpfung mit Proteinkomponenten zur Verstärkung

der Wirkung nötig war. Durch die Verwendung von Signalsequenzen, die das zu exprimierende

Gen flankieren, kann die Effizient der eingesetzten Antigene weiter gesteigert werden, da sie

eine gerichtete Translation des Antigens bewirken. Durch die Signalsequenz des gewebespezifi-

schen Plasminogen Aktivators (TPA – engl. tissue-type plasminogen activator) ist es beispiels-

weise möglich, das integrierte Antigen nach der Translation zu sekretieren [186]. Ebenso sind

Signalsequenzen zur Verankerung an der Zellmembran (PLAP – plazentarische alkaline Phos-

phatase [107], Einschleusung in den MHCII-Präsentationsweg über Verankerung in der endoso-

male Membran (LAMP1 – lysosomal-assoziiertes Membranprotein [368] und zur MHCI-spezi-

fischen Präsentation über die Degradierung im Proteasom (Ubiquitin (Uq) [260]) anwendbar

und bereits erfolgreich eingesetzt worden [124][125][123][211].

1.5.5 Adjuvanzien

Die immunogene Wirkung gereinigter, zellfreier Antigene ist gewöhnlich sehr gering und

bedarf dem Zusatz von Adjuvanzien, die über lokale Gewebereizung oder Bindung der Antige-

ne die Immunantwort gegenüber dem eingesetzten Antigen (meist durch Aktivierung von APC)

unspezifisch steigern [151]. Darüber hinaus können Adjuvanzien und Pufferbedingungen die

Zugänglichkeit gewisser Epitope verändern und steuern somit auch die Effizienz der Vakzine.

Wenngleich auch einige Antigene selbst eine Adjuvanswirkung haben, so sind die wichtigsten

Vertreter meist nicht infektiöse Bestandteile von Bakterien wie Zellwände, Polysaccharide, Hit-

zeschockproteine oder DNA.

Durch Zusatz von unspezifischen, abgetöteten Corynebakterium ovis, Bordetella pertussis

oder Mycobakterium tuberculosis (Freunds Adjuvans) zum Humanimpfstoff oder aufgereinig-

tem PA kann deren Schutzeffekt beispielsweise erheblich erhöht werden [329][330]. Allerdings

verursachen Emulsionen oder Suspensionen aus Ganzzell-Präparationen meist eine sehr starke

Entzündungsreaktion, sind sehr unspezifisch und beinhalten immer das Risiko der Verwendung

19

1. Einleitung

eines vollständig abzutötenden Erregers [100]. Daher sind Bestrebungen zur Suche nach alter-

nativen Adjuvanzien, welche auf die Form der Anwendung, die Art der Antigene und die ange-

strebte Immunantwort zugeschnitten sind, immer essentieller Bestandteil einer Impfstoffent-

wicklung.

Zur Verfeinerung der Adjuvanswirkung gibt es Ansätze, die basierend auf den beschriebenen

Ganzzell-Adjuvanzien nur einzelne bakterielle Bestandteile verwenden. Dazu gehören bei-

spielsweise DeTox, eine Mischung aus detoxifiziertem Endotoxin und dem Zellwandskelett

eines attenuierten Tuberkulosestammes, sowie verschiedene aufgereinigte Faktoren von Myco-

bakterium phlei oder monophosphoryl lipid A aus Salmonella minnesota, ein ebenfalls detoxifi-

ziertes Lipopolysaccharid [3][257][326]. Diese und ähnliche mikrobiell erzeugte Wirkstoffe

sind in Kombination mit PA erfolgreich erprobt [149][145], zeigen aber wie viele andere Ansät-

ze nicht die gleiche Wirksamkeit in verschiedenen Tiermodellen.

Zu den nicht mikrobiologisch hergestellten Adjuvanzien gehören die Aluminimsalze, wie

Aluminiumhydroxid (Alhydrogel), Alaun (Alum) und Aluminiumphosphat, welche bisher als

einzige für eine Anwendung im Menschen zugelassen sind. Das beispielsweise in AVA verwen-

dete Alhydrogel erzeugt in Kombination mit PA eine starke humorale Immunantwort [122][95],

ist aber in der Schutzwirkung stark speziesabhängig [90][149], sodass auch diese Adjuvanzien

nicht universell einsetzbar sind. Weitere Adjuvanzien dieser Art sind verschiedene Lipide [4]

[149], Saponine [162][161][145] oder andere Zellbestandteile, die in Kombination mit Antige-

nen in Form von Emulsionen, Liposomen, Microkapseln oder anderen Trägermaterialien verab-

reicht werden können [149][145].

Ein Beispiel hierfür sind Lipopeptide und Lipopeptid-Konjugate. Bakterielle Lipopeptide als

Bestandteil der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien sind charakteristisch aus der

ungewöhnlichen Aminosäure Dihydroxypropylcystein (Dhc), acetyliert mit 2 – 3 Fettsäuren,

aufgebaut [114][131]. Als Effektoren der angeborenen

Immunität stellen sie hochaktive Immunadjuvanzien

dar, die über Toll-like Rezeptoren (TLR) erkannt wer-

den [133][2]. Die Art und Höhe der Adjuvanswirkung

ist dabei stark von der Struktur des Lipopeptids und

dessen Azetylierungsgrad abhängig [109]. Daher kön-

nen durch gezielte Manipulation und Konjugation von

Antigenen oder Epitopen am aminoterminalen Ende

des Dhc spezifische, auf den jeweiligen Impfstoff zugeschnittene Adjuvanzien erstellt werden

[359][271][358][109]. Im Speziellen sind hier Palmitinsäure (Pam) acetylierte Lipopeptide zu

nennen (Abbildung 8), welche entsprechend des Acetylierungsgrads TLR-2 und TLR-6 (diaze-

tyliert, [229]) bzw. TLR-1 und TLR-2 (triazetyliert, [312]) vernetzen und mit unterschiedlichen

20

Abbildung 8: synthetisches Lipopeptid (Bsp.)

Synthetisches Lipopeptid Pam3Cys-SKKKK; dreifachacetyliert [358]

1. Einleitung

Modifikationen bereits erfolgreich als Adjuvans in antiviralen Vakzinestudien eingesetzt wur-

den [70][270][68][225].

Zur Unterstützung von DNA-Vakzinen können teilweise die bereits beschriebenen Adjuvan-

zien verwendet werden, wohingegen auch gänzlich andere Adjuvanzien möglich sind, welche

sich zum Teil in Wirkung und Funktion vollkommen von den zuvor beschriebenen Adjuvanzien

unterscheiden. Durch die charakteristische Spezifität der DNA-Vakzine selbst ergibt sich für die

Adjuvanzien ein ähnlicher Ansatz, der weg von den unspezifischen Agitatoren der angeborenen

Immunität und hin zu spezifischen, die Stoffwechselwege beeinflussenden Wirkmechanismen

führt. Um die Einschleusung von Antigenen in den MHCI- und MHCII-Präsentationsweg wei-

ter zu verstärken, kann eine künstlich erzeugte Hochregulierung dieser beiden Rezeptoren eine

starke Adjuvanswirkung haben [164]. Der Klasse II Haupthistokompatibilitätskomplex Trans-

aktivator (kurz CIITA) ist ein Hauptfaktor zur Kontrolle der Gene für die MHCII-Präsentation

[318][253]. Er induziert die Expression von MHCI- und MHCII-Rezeptoren auf der Zellober-

fläche [206][12] und resultierte bei Anwendung in Mäusen in verstärkter Antigenpräsentation

auf diesen [164].

Die Sequenz für den Interferon-ß-Promotor Stimulator 1 (IPS-1) kann ebenfalls als Adjuvans

eingesetzt werden [160][276]. Doppelsträngige und einzelsträngige RNAs werden von RIG-1-

like Rezeptoren (RLR) [159], einer Untergruppe von Mustererkennungsrezeptoren (PRR), zu

denen auch die TLR gehören, erkannt [151] und stellen einen TLR-unabhängigen Weg der

Erkennung viraler Infektionen dar [268]. PRR sind Teil der angeborenen Immunität, welche

auch die adaptive Immunität stimulieren können. Detektieren diese RLR Fremd-DNA im

Zytoplasma, interagieren sie mit IPS-1 und setzten so eine Signalkaskade in Gang, die ebenfalls

Überschneidungspunkte mit anderen PRR Signalkaskaden aufweist [160]. Schlussendlich führt

dies zur Sezernierung von TNF-alpha, IL-1, IL-6 und IL-12 durch Makrophagen und Monocy-

ten, die wiederum die Th1-Zellentwicklung beeinflussen und die Aktivierung der adaptiven

Immunität zur Folge haben [303]. Entsprechend führt die Überexpression von IPS-1 zur Ver-

stärkung der nachgeschalteten Signalkaskaden, zur Aktivierung der Typ 1 Interferon Promoto-

ren und Freisetzung inflammatorischer Zytokine [343][160].

Schließlich kann der verwendete DNA-Vektor ebenfalls auf eine Adjuvanswirkung ausgelegt

werden. Eingebaute nicht methylierte CpG-Strukturen werden vom TLR9 als bakterielle DNA

erkannt und wirken so stimulierend [26][135][173][13][169]. Daher kann eine Optimierung der

Sequenzen unter Berücksichtigung von stimulierenden Mustern, sowie eine Vektorarchitektur,

welche die Stabilität der generierten mRNA und des Plasmids selbst verbessert, die Effizienz

der gesamten DNA-Vakzine erheblich steigern [361].

21

1. Einleitung

1.6 Ziel der Arbeit

Dem Aufruf der WHO folgend, Milzbrand als einer globalen „neglected zoonotic disease“ eine

höhere Priorität in der wissenschaftlichen Forschung einzuräumen, sollten in dieser Arbeit neue

Ansätze für einen Veterinärimpfstoff entwickelt und getestet werden. Die momentan verfügbare

Veterinärvakzine ist in nahezu unveränderter Form seit ca. 1940 im Gebrauch und besteht aus

einem attenuierten B. anthracis Stamm (34F2, SSLV, siehe Kapitel 1.5.1 ). Wenngleich der

Lebendimpfstoff in vielen Tierspezies einen sehr guten Impfschutz bietet, so ist er jedoch mit

einigen Nachteilen behaftet, was zum Teil seine Anwendbarkeit einschränkt. Zur Entwicklung

einer alternativen Impfung wurden in dieser Arbeit, gefördert durch die DFG (BE 2157/3-1),

verschiedene Komponenten für eine „nicht lebend Vakzine“ (NLV) getestet. Zielführend war

dabei die Verwendung von Formulationen, deren Wirksamkeit auch bei gleichzeitiger antibioti-

scher Behandlung gewährleistet werden kann und deren Anwendbarkeit in sensiblen Tierarten

unbedenklich ist.

Diese beinhalteten neben neuen Proteinkomponenten sowohl neue Adjuvanzien als auch

neue DNA-Vektoren. Immunogenität, Toxinneutralisationsfähigkeit und Schutzwirkung der

Komponenten wurden einzeln und in Kombination unter Anwesenheit entsprechender Adjuvan-

zien im NMRI-Mausmodell bestimmt. Entsprechend den Ergebnissen der Mausversuche wur-

den geeignete Kombinationen vergleichend zur Veterinärvakzine (SSLV) im Ziegenmodell

getestet und analysiert. Hierbei waren die Titerentwicklung über die Zeit und der Verlauf der

Infektion von Interesse. Alle gesammelten Daten sollten auch im Hinblick auf prädiktive Korre-

lationen zur Schutzrate analysiert werden. Die Tierversuche wurden im Sinne der deutschen

Tierschutzverordnung unter dem Aktenzeichen V 272/10 THy (Regierungspräsidium), der

Abteilung für Tiergesundheit Südafrika unter Protokollnummer V41-10 (Verordnung 34 von

1984) und des ethischen Komitees für Tierversuche der Erciyes Universität Türkei (Protokoll-

nummer 13/01 – 09.01.2013) autorisiert.

22

2. Material

2 Material

2.1 Chemikalien

23

Tabelle 1: Chemikalien

Name Herkunft

1-Butanol (> 99,5 %) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

ABTS (2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)) Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D)

Acrylamid PAGE (40 %) GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Agar-Agar Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Agarose, Biozym LE Biozym Scientific GmbH (Hessisch Oldendorf, D)

APS (Ammoniumperoxodisulfat, >98 %) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Azur B Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

BCA (Bicinchoninsäure) Reagenz A Interchim SA – France (Montlucon, F)

BCA (Bicinchoninsäure) Reagenz B Interchim SA – France (Montlucon, F)

Bestatin Hydrochlorid (> 98 %) Interchim SA – France (Montlucon, F)

BHI (Brain Heart Infusion) Agar Merck KGaA (Darmstadt, D)

BHI (Brain Heart Infusion) Bouillon Merck KGaA (Darmstadt, D)

Bisacrylamid (PlusOne N,N'-Methylene-bisacrylamide, 2 %) GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Bromphenolblau Natriumsalz Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

BSA (Bovines Serumalbumin) Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, D)

Butanol Merck KGaA (Darmstadt, D)

β-Mercaptoethanol Merck KGaA (Darmstadt, D)

Merck KGaA (Darmstadt, D)

Westfalen Austria GmbH (Leobersdorf, A)

Columbia-Agar Merck KGaA (Darmstadt, D)

DMEM (mit L-Glutamin) Lonza Group AG (Basel, CH)

DMSO (Dimethylsulfoxid) Merck KGaA (Darmstadt, D)

DTT (1,4-Dithiothreitol, >99 %) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

E-64 (Proteinase Inhibitor) Interchim SA – France (Montlucon, F)

EDTA (Ethylendinitrilotetraessigsäure) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Essigsäure (100 %) Merck KGaA (Darmstadt, D)

Ethanol (100 %) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Ethanol (99,7 %, vergällt) Alkoholvertrieb Süd GmbH (Horb-Betra, D)

Ethidiumbromid Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

FKS (fötales Kälberserum) Life Technologies GmbH (Darmstadt, D)

Fleischextrakt BD BIOSCIENCES (Heidelberg, D)

Formaldehydlösung (37 %) Merck KGaA (Darmstadt, D)

Formamid Merck KGaA (Darmstadt, D)

Gelatine Merck KGaA (Darmstadt, D)

Fischer Scientific – Germany GmbH (Schwerte, D)

GenLadder 250 bp – 10 kb Genaxxon Bioscience GmbH (Ulm, D)

Glukose Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Glycerin, 86 % Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Goldstaub (1,0 µm) Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

Guanidin-HCl Alfa Aesar GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Harnstoff VWR International GmbH (Darmstadt, D)

HCl (Salzsäure) Merck KGaA (Darmstadt, D)

Hefeextrakt Merck KGaA (Darmstadt, D)

HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, >99,5 %) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Histidin Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Imidazol Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Immersionsöl Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Isopropanol VWR International GmbH (Darmstadt, D)

KCl (Kaliumchlorid) Merck KGaA (Darmstadt, D)


LF (kommerziell) List Biological Laboratories Inc. (Campbell CA, USA)

CaCl2 (Calciumchlorid)

CO2 (Kohlendioxid), gasförmig

GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder

KH2PO

4 (Kaliumdihydrogenphosphat)

2. Material

24

Tabelle 1 Fortführung: Chemikalien

Name Herkunft

Magermilchpuler AppliChem GmbH (Darmstadt, D)

Methanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)


MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromide) Alfa Aesar GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)



NaCl (Natriumchlorid) Merck KGaA (Darmstadt, D)



Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

NaOH (Natriumhydroxid) Merck KGaA (Darmstadt, D)

Nickel(II)-sulfat Hexahydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

PA (kommerziell) List Biological Laboratories Inc. (Campbell CA, USA)

PBS (endotoxinfrei) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Pepstatin A (> 90 %) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Peroxyessigsäure (40 %) Merck KGaA (Darmstadt, D)

PhastGel Blue R (Coomassie) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Phosphoramidon Interchim SA – France (Montlucon, F)

PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Protein-Marker IV (10 – 170 kDa) PEQLAB Biotechnologie GmbH (Erlangen, D)

PVP (Polyvinylpyrrolidon) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Saccharose Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Schafsblut, defibriniert Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

SDS (Natriumdodecylsulfat, >99,5 %) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Spermidin Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Stains-All (~ 95 %) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Standard-Nähragar I Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Standard-Nährmedium I Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Stickstoff, flüssig Westfalen Austria GmbH (Leobersdorf, A)

Stickstoff, gasförmig Westfalen Austria GmbH (Leobersdorf, A)

TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Trichloressigsäure (>99 %) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

TRIS (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

TRIS-HCl Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Trypton (Bacto) BD BIOSCIENCES (Heidelberg, D)

Trypton-Soja-Agar (TSA) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

TWEEN 20 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

VENNO VET 1 super MENNO CHEMIE-VERTRIEB GmbH (Norderstedt, D)

Wofasteril KESLA Hygiene AG (Bitterfeld-Wolfen, D)

Xylol Merck KGaA (Darmstadt, D)

MgCl2 (Magnesiumchlorid)

MnSO4*H

2O (Mangan(II)-sulfat Monohydrat)

Na2HCO

3 (Di-Natriumhydrogencarbonat)

Na2HPO

4 (Dinatriumhydrogenphosphat)

NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat)

NaHPO4 (Natriumhydrogenphosphat)

NaN3 (Natriumazid)

2. Material

2.2 Puffer, Lösungen und Medien

25

Tabelle 2: Puffer, Lösungen und Medien

Bezeichnung Zusammensetzung

ABTS-Puffer 1 ABTS-Tablette in 50 ml sterilem Millipore

Ampicillinlösung (1000fach) 100 mg/ml Ampicillin-Natriumsalz in sterilem Millipore, Lagerung bei -20 °C

Beschichtungspuffer – ELISA (pH 9,5)

Blocklösung – ELISA 10 % FKS (bzw. Magermilchpulver) in PBS

Butanol (wassergesättigt) Butanol und steriles Millipore 1:1 vermengen und vor Gebrauch gut mischen

CBA (Columbia-Blutagar) 5 % Schafsblut (Zugabe nach Sterilisation) in Columbia-Agar mit sterilem Millipore

Chloramphenicollösung (1000fach) 25 mg/ml Chloramphenicol in Ethanol, Lagerung bei -20 °C

Coomassie-Lösung 1 Färbetablette Phast Gel Blue R in 400 ml Entfärber durch Erhitzen auf 60 °C lösen und anschließend filtrieren

CSA-Bicarbonat (Casein Soya Agar mit Bicarbonat)

Dialysepuffer 1 (pH 7,5)



Dialysepuffer 4 / HEPES-Puffer (pH 7,5)

Einfriermedium 20 % DMSO in FKS

Elutionspuffer – FPLC (pH 4,5)

Entfärber – SDS-PAGE 30 % (v/v) Methanol, 8% (v/v) Essigsäure in sterilem Millipore

Ethidiumbromidlösung (20000fach) 10 mg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer

Fixierer – SDS-PAGE 40 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure in sterilem Millipore

Gelpuffer B – SDS-PAGE (pH 8,8) 1,5 mol/l TRIS in sterilem Millipore

Gelpuffer C – SDS-PAGE (pH 6,8) 1,0 mol/l TRIS in sterilem Millipore

Histidin-Lösung (2fach) 40 g/l Histidin in sterilem Millipore

IPTG-Lösung (1000fach) 1 M IPTG in sterilem Millipore, Lagerung bei -20 °C

Kanamycinlösung (1000fach) 50 mg/ml Kanamycinsulfat in sterilem Millipore, Lagerung bei -20 °C

Lysepuffer – FPLC (pH 8,0; 4 °C)

Lysepuffer – TNA 90 % (v/v) Isopropanol; 0,5 % (w/v) SDS; 25 mM HCl

MYA (Meat Yeast Agar, pH 7,0)

NaCl-Gelatine 0,9 % (w/v) NaCl, 0,1 % Gelatine in sterilem Millipore

Nukleasepuffer (10fach)

PBS (Phosphat buffered Saline, pH 7,4)

PBS-Gelatine 0,1 % Gelatine in PBS

Probenpuffer (-DTT) SDS-PAGE (5fach, pH 6,8) 10 % SDS, 25 mg/l Bromphenolblau, 8 % (v/v) Gelpuffer C, 125 g/l Glycerin in sterilem Millipore

Probenpuffer (+DTT) SDS-PAGE (5fach, pH 6,8) 15 g/l DTT, 2 % SDS, 25 mg/l Bromphenolblau, 8 % (v/v) Gelpuffer C, 125 g/l Glycerin in sterilem Millipore

Probenpuffer Agarose-Gelelektrophorese (10fach) 0,25 % Bromphenolblau und 40 % Saccharose in sterilem Millipore

Proteinasecocktail – FPLC

Puffer B – FPLC (pH 8,0)

Puffer C – FPLC (pH 6,3)

PVP-Lösung 0,1 mg/ml PVP in Ethanol (100 %)

Sammelgel SDS-PAGE

SDS-PAGElektrophoresepuffer (10fach, pH 8,9)

Stains-All-Lösung (pH 8,8)

342 g/l TRIS, 57,1 ml/l Essigsäure (100 %), 50 mM EDTA in sterilem Millipore

TGB (Trypton-Glukose-Bouillon, pH 7,2) 2,5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Trypton, 1 g/l Glukose in sterilem Millipore

Trenngel (15 %) SDS-PAGE

Trypsin-Lösung 0,5 g/l Trypsin, 0,2 g/l EDTA in sterilem Millipore

Versuchsmedium – TNA 5 % FKS in DMEM

Wachstumsmedium 1:1 Mischung aus DMEM und RPMI ergänzt mit 10% FKS

Waschpuffer – ELISA 0,05 % TWEEN 20 in PBS

8,4 g/l NaHCO3; 3,56 g/l Na

2CO

3 in sterilem Millipore

0,7% NaHCO3 in CSA

5 mM HEPES, 100 µl CaCl2, 1 M Harnstoff, 10 % Glycerin in sterilem Millipore

5 mM HEPES, 100 µl CaCl2, 0,5 M Harnstoff, 10 % Glycerin in sterilem Millipore

5 mM HEPES, 100 µl CaCl2, 0,1 M Harnstoff, 10 % Glycerin in sterilem Millipore

5 mM HEPES, 100 µl CaCl2 in sterilem Millipore

8 M Harnstoff, 0,1 M NaHPO4, 0,01 M TRIS-HCl (pH 4,5) in sterilem Millipore

6 M Guanidin-HCl, 0,1 M NaHPO4, 0,01 M TRIS-HCl (pH 8,0), 10 mM Imidazol in sterilem Millipore

10 g/l Fleischextrakt, 2 g/l Hefeextrakt, 0,04 g/l MnSO4*H

2O, 15 g/l Agar in sterilem Millipore

0,1 M TRIS (pH 8,0); 10 mM MgCl2; 0,1 M NaCl und 0,02% (w/v) NaN


8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 0,12 g/l KH2PO

4, 0,91 g/l Na

2HPO


0,5 mg/ml Pepstatin A, 0,5 mg/ml Bestatin Hydrochlorid, 0,25 mg/ml E-64, 0,25 mg/ml Phosphoramidon, 1 mM PMSF in DMSO

8 M Harnstoff, 0,1 M NaHPO4, 0,01 M TRIS-HCl (pH 8,0), 10 mM Imidazol in sterilem Millipore

8 M Harnstoff, 0,1 M NaHPO4, 0,01 M TRIS-HCL (pH 6,3), 10 mM Imidazol in sterilem Millipore

900 µl Acrylamid PAGE (40 %), 900µl Bisacrylamid (2 %), 1,25 ml Gelpuffer C, 100 µl SDS (10 %), 75 µl APS (10 %), 7,5 µl TEMED, 6,8 ml steriles Millipore; ausreichend für 2-3 Gele

75 g/l Glycerin in sterilem Millipore; Vor Gebrauch 1:10 verdünnen und mit SDS (Endkonzentration 0,1 %) versetzen

30 mM TRIS, 7,5 % (v/v) Formamid, 25 % (v/v) Isopropanol, 0,025 % (w/v) Stains-All in sterilem Millipore; pH-Wert 8,8 mit HCL einstellen

TAE (TRIS-Acetat-EDTA) Agarose-Gelelektrophorese-Puffer (50fach, pH 8,0)

8,1 ml Acrylamid PAGE (40 %), 6 ml Bisacrylamid (2 %), 2,25 ml Glycerin (86 %), 5,62 ml Gelpuffer B, 225 µl SDS (10 %), 148,5 µl APS (10 %), 14,8 µl TEMED, 90 µl steriles Millipore; ausreichend für 2-3 Gele

2. Material

2.3 Verbrauchsmaterialien

2.4 Versuchstiere

26

Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien

Name Herkunft

Abdeckgläschen VWR International GmbH (Darmstadt, D)

Armstulpen VWR International GmbH (Darmstadt, D)

Atemschutzmaske (P3) Behr Labor-Technik (Düsseldorf, D)

Baretthaube Behr Labor-Technik (Düsseldorf, D)

Dialysemembran (Cellu-Sep T1, 3,5kDa) Membrane Filtration Products Inc. (Sequin, TX, USA)

Dialysemembran (Cellu-Sep T2, 6 - 8kDa) Membrane Filtration Products Inc. (Sequin, TX, USA)

Filterpapier Munktel & Filtrak GmbH (Bärenstein, D)

Flaschenaufsatzfilter (500 ml, steril) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Handschuhe, gepudert / ungepudert (M, L) megro GmbH & Co. KG (Wesel, D)

Impföse (1, 10 µl) VWR International GmbH (Darmstadt, D)

Injektionsnadel (blau, 23G x 1) TERUMO Medical Corporation (Summerset, NJ, USA)

Injektionsnadel (braun, 26G x 1) TERUMO Medical Corporation (Summerset, NJ, USA)

Injektionsnadel (gelb, 20G x 2) TERUMO Medical Corporation (Summerset, NJ, USA)

Insulinspritze mit Nadel (1 ml) TERUMO Medical Corporation (Summerset, NJ, USA)

Kryoröhrchen (2 ml) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Küvette, Plastik (0,5 und 1 ml) ratiolab GmbH (Dreieich, D)

Mikrotiterplatte, 96-Well (endotoxinfrei, steril, mit Deckel, round bottom, einzeln verpackt) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Mikrotiterplatte, 96-Well (Maxisorp, flat bottom) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Mikrotiterplatte, 96-Well (steril, mit Deckel, flat bottom, einzeln verpackt) BD BIOSCIENCES (Heidelberg, D)

Objektträger Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Overall, Einweg ReWa GmbH (Bahlingen, D)

Parafilm Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Petrischale, Plastik (92 x 16 mm, mit Entlüftungsnocken) nerbe plus GmbH (Winsen / Luhe, D)

Pipettenspitzen (20, 200, 300, 1000 µl) Eppendorf AG (Hamburg, D)

Pipettenspitzen, endotoxinfrei (200, 1000) Eppendorf AG (Hamburg, D)

Plastikspatel (steril) VWR International GmbH (Darmstadt, D)

Rasierer, Einweg Wilkinson Sword GmbH (Solingen, D)

Reaktionsgefäß (1,5, 2 ml) Biozym Scientific GmbH (Hessisch Oldendorf, D)

Röhrchen, Plastik (15, 50 ml) Greiner Bio-One International GmbH (Kremsmünster, A)

Schürze ReWa GmbH (Bahlingen, D)

Sepharosesäule (HiTrap Chelating HP, 5 ml) GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Serumröhrchen BD Vacutainer (10 ml) und Zubehör BD BIOSCIENCES (Heidelberg, D)

Spritze (1, 2, 5, 10, 20 ml) TERUMO Medical Corporation (Summerset, NJ, USA)

Spritzenvorsatzfilter (0,2, 0,45 µM) Sartorius AG (Göttingen, D)

Tefzel Schlauch Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

Überschuhe Behr Labor-Technik (Düsseldorf, D)

Zellkulturflaschen (100, 200, 500 ml) BD BIOSCIENCES (Heidelberg, D)

Tabelle 4: Versuchstiere

Spezies Anzahl Zulieferer

BALB/c Maus 6 SAVP (Sandrigham, ZA)

Burenziege 37 diverse lokale Bauern (Pretoria, ZA)

NMRI Maus 145 Charles River Laboratories (Köln, D)

Ziegen (gemischte, türkische Rassen) 25 diverse lokale Bauern (Kars, TR)

2. Material

2.5 Geräte

2.6 Antikörper

27

Tabelle 5: Geräte

Name Herkunft

Agarose-Geldokumentation (Quantum) VILBER LOURMAT Deutschland GmbH (Eberhardzell, D)

Agarose-Gelelektrophoresekammer (Agagel Mini) und Zubehör Biometra GmbH (Göttingen, D)

Autoklav INTEGRA Biosciences GmbH (Fernwald, D)

Bunsenbrenner Bochem Instrumente GmbH (Weilburg, D)

Eppendorf AG (Hamburg, D)

INTEGRA Biosciences GmbH (Fernwald, D)

GeneGun (Helios) und Zubehör Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

Heißluftsterilisator GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Laminar-Flow Sicherheitswerkbank Klasse II BDK-Luft-und Reinraumtechnik GmbH (Sonnenbühl-Genkingen, D)

Magnetrührer und Zubehör IKA-Werke GmbH & Co. KG (Staufen, D)

Zoo-Partner (Lunzenau, D)

Messschreiber (REC-112) und Zubehör GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Mikroskop, Hellfeld (Vilovert) Helmut Hund GmbH (Wetzlar, D)

Mikrowelle Siemens-Electrogeräte GmbH (München, D)

Millipore Milli-Q Biocel Wasser Aufreinigungssystem Merck KGaA (Darmstadt, D)

Netzteil Biometra GmbH (Göttingen, D)

pH-Meter WTW Wissenschaftlich-Technische Werkstätten GmbH (Weilheim, D)

Photometer (Ultrospec 2100 pro) GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Plattenlesegerät (Model 680) Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

Plattenleseinkubator, kinetisch (Endotoxin) Lonza Group AG (Basel, CH)

Plattenwaschgerät (Model 1575) Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

Plattformschüttler, rotierend Heidolph Instruments GmbH & Co. KG (Schwabach, D)

Polyacrylamid-Gelelektrophoresekammer (PAGE) und Zubehör Biometra GmbH (Göttingen, D)

Protein-Aufreinigungssystem (ÄKTAprime plus) und Zubehör GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Schlauchpumpe, peristaltisch (P-1) GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D)

Schlauchrotor (Tubing Prep Station) Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

Schlauchschnittmaschine (Tubing Cutter) Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

Schüttelinkubator Infors AG (Bottmingen, CH)

Stickstoffkontainer (flüssig) Taylor-Wharton International LLC (Theodore, AL, USA)

Thermoblock Biometra GmbH (Göttingen, D)

Thermocycler Biometra GmbH (Göttingen, D)

Tiefkühlschrank (HERAfreeze, -86 °C) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Ultraschall-Homogenisator Hielscher Ultrasonics GmbH (Teltow, D)

Vortexmischer Heidolph Instruments GmbH & Co. KG (Schwabach, D)

Waage, fein Sartorius AG (Göttingen, D)

Waage, grob OHAUS CORPORATION (Parsippany, NJ, USA)

Wasserbad Köttermann GmbH &Co.KG (Uetze/Hänigsen, D)

Wasserbad (Ultraschall) BANDELIN electronics GmbH & Co. KG (Berlin, D)

Zentrifuge (Heraeus Labofuge 400) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Zentrifuge (Heraeus Pico) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Zentrifuge (Heraeus Sepatech Varifuge 3.2S) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Zentrifuge (Heraeus Suprafuge 22) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

Zentrifuge (Spectrafuge Mini) Labnet International Inc (Edison, NJ, USA)

CO2-Inkubator

CO2-Inkubator

Mauskäfig und Zubehör (Makrolon, 820 cm2)

Tabelle 6: Antikörper

Name Hersteller eingesetzte Konzentration

Kaninchen Anti-Ziege IgG HRP Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA) 1:6000

Ziege Anti-Maus IgG HRP Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D) 1:4000

Ziege Anti-Maus IgG1 HRP Acris Antibodies GmbH (Herford, D) 1:16000

Ziege Anti-Maus IgG2a HRP Acris Antibodies GmbH (Herford, D) 1:16000

2. Material

2.7 Utensilien

2.8 Zelllinien

2.9 Kits

28

Tabelle 7: Utensilien

Name Herkunft

Becherglas (250, 500, 1000, 2000 ml) DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Erlenmeyerkolben (100, 250, 500, 1000 ml) DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Erlenmeyerkolben mit Schikanen (500, 1000 ml) DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Gesichtsschutzschirm Behr Labor-Technik (Düsseldorf, D)

Glasflasche (50, 250, 500, 1000 ml) DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Glasperlen (Durchmesser 2 mm) Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

Glaspipette (1, 2, 5, 10, 20, 50 ml) Hilgenberg GmbH (Malsfeld, D)

Impföse (Metall) häberle LABORTECHNIK GmbH & Co. KG (Lonsee-Ettlenschieß, D)

Küvette, Quarz (0,5 und 1 ml) Hellma GmbH & Co. KG (Müllheim, D)

Mehrkanalpipette, automatisiert, 8 Kanäle (15-300 µl) Eppendorf AG (Hamburg, D)

Mehrkanalpipette, mechanisch, 8 Kanäle (20-200 µl) VWR International GmbH (Darmstadt, D)

Messzylinder, glas (50, 100, 250, 500, 1000 ml) DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Neubauer Zählkammer und Zubehör LO – Laboroptik Ltd (Lancing, GB)

Petrischale, Glas (120 x 20 mm) DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Pipette, mechanisch (20, 200, 1000 µl) Gilson Inc. (Middleton WI, USA)

Pipettierhilfe (Easypet) Eppendorf AG (Hamburg, D)

Reagenzglas und Zubehör (9, 16, 21, 32 ml) DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Roux-Flasche Dunn Labortechnick GmbH (Asbach, D)

Saugpumpe DURAN Group GmbH (Wertheim/Main, D)

Tabelle 8: Zelllinien

Bezeichnung Spezies Herkunft

B. anthracis Universität Hohenheim (Stuttgart, D)




Bl21 pRep4 pQE30Lf E.coli Universität Hohenheim (Stuttgart, D)

Bl21 pRep4 pQE30Pa83ec E.coli Universität Hohenheim (Stuttgart, D)

Bl21 pRep4 Ril pQE30BclA1 E.coli Universität Hohenheim (Stuttgart, D)

BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells E.coli Agilent Technologies GmbH & Co.KG (Waldbronn, D)

J774A.1 Maus Monozyten Makrophagen Zelllinie Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

B. anthracis Kafkas Universität (Kars, TR)

B. anthracis Universität Pretoria (Onderstepoort, ZA)

B. anthracis OBP Onderstepoort Biological Products (Onderstepoort, ZA)

A1 (Tox+) (Kap-)

A58 (Tox-) (Kap-)

A73 (Tox-) (Kap+)

Ames (Tox+) (Kap+)

K-136 (Tox+) (Kap+)

SD20 (Tox+) (Kap+)

SSLV 34F2 (Tox+) (Kap-)

Tabelle 9: Kits

Name Herkunft

Endotoxin-Reinigungs-Kit (EndoTrap blue) Hyglos GmbH (Bernried am Starnberger See, D)

Gelextraktions-Kit (DNA) Genaxxon BioScience GmbH (Ulm, D)

LAL (Limulus Amöbozyten Lysat) -Test-Kit, kinetisch, chromogen (Endochrome-K) Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA)

Spritzen-Kit (GeneGun Patronen Präparation) Bio-Rad Laboratories GmbH (München, D)

2. Material

2.10 Genetisches Material

2.11 Wirkstoffe

2.12 Software

29

Tabelle 10: Genetisches Material

Sequenzen von BclAD1D3 und PA83 im Anhang

Name Herkunft

BclaD1D3 Sequenz (Siehe Anhang) Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)

CIITA Sequenz (murin; Mn01492) GeneCopoeia (Rockville, MD, USA)

LFD1PAD4 Sequenz zur Verfügung gestellt von L. Baillie

NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 Nature Technology Corporation (Lincoln, NE, USA)

PA83 Sequenz (Siehe Anhang) zur Verfügung gestellt von W. Beyer

pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1 Nature Technology Corporation (Lincoln, NE, USA)

pDNAVaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-LAMP1 Nature Technology Corporation (Lincoln, NE, USA)

pDNAVaccUltra1-TPA-PA83-LAMP1 Nature Technology Corporation (Lincoln, NE, USA)

pDNAVaccUltra4-BclA-Ubiquitin Nature Technology Corporation (Lincoln, NE, USA)

pDNAVaccUltra5-CIITA Nature Technology Corporation (Lincoln, NE, USA)

pQE-30 QIAGEN GmbH – Germany (Düsseldorf, D)

pREP4 QIAGEN GmbH – Germany (Düsseldorf, D)

Tabelle 11: Wirkstoffe

Name Herkunft

Albendazol Universitätsapotheke Universität Pretoria (Onderstepoort, ZA)

Ampicillin-Natriumsalz Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Chloramphenicol Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Depomin Kafkas Universität (Kars, TR)

Desoxyribonuklease I Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Diazepam-ratiopharm Injektionslösung (10 mg/2 ml) ratiopharm GmbH (Ulm, D)

Isofluran Actavis Deutschland GmbH & Co. KG (München, D)

Ivermectin Universitätsapotheke Universität Pretoria (Onderstepoort, ZA)

Kanamycinsulfat Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, D)

EMC microcollections GmbH (Tübingen, D)

Kapselmaterial eigene Herstellung

Ketamin (100 mg/ml) CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH (Burgdorf, D)

EMC microcollections GmbH (Tübingen, D)

Niclosamid Universitätsapotheke Universität Pretoria (Onderstepoort, ZA)

Penicillin/Streptomycin Kafkas Universität (Kars, TR)

Pentobarbital Universitätsapotheke Universität Pretoria (Onderstepoort, ZA)

rBclA eigene Herstellung

Ribonuklease A Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

rLF eigene Herstellung

rPA83 eigene Herstellung

T61 (5 mg/ml Tetracainhydrochlorid, 50 mg/ml Mebezoniumiodid und 200 mg/ml Embutramid) Intervet Deutschland GmbH (Unterschleißheim, D)

Trypsin Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen bei München, D)

Xylavet (Xylazin, 20 mg/ml) CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH (Burgdorf, D)

Kapsel-Konjugat (Pam3Cys-AQEKEAKSELDYD-(isoE9)-NH2)

Lipopeptid (Mischung aus Pam3Cys-SKKKK und Pam

3Cys-FISEAIIHVLHSRHPG)

Tabelle 12: Software

Name Hersteller

Quantum.CAPT VILBER LOURMAT Deutschland GmbH (Eberhardzell, D)

SigmaPlot Systat Software GmbH (Erkrath, D)

WinKQCL Lonza Group AG (Basel, CH)

3. Methoden

3 Methoden

Alle verwendeten Medien und Nährböden wurden, soweit nicht anders beschrieben, unter steri-

len Bedingungen hergestellt und vor Benutzung für 15 min bei 121 °C autoklaviert oder steril

filtriert. Die Entsorgung von regulärem, infektiösem und nicht infektiösem Material fand eben-

falls für 15 min bei 121 °C in getrennten Autoklaven für die Desinfektion statt. Die Reinigung

von Oberflächen oder nicht autoklavierbaren Materialien erfolgte mit 1 %-iger VENNO VET

Lösung (Einwirkzeit 0,5 – 2 h).

Arbeiten mit voll virulentem B. anthracis wurden unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt,

wobei kontaminierte Oberflächen, Gerätschaften und Einwegartikel mit 1 %-iger frisch ange-

setzter Peroxyessigsäure oder 2,5 % Wofasteril mit einer Mindesteinwirkzeit von 30 min desin-

fiziert werden mussten [28]. Für Arbeiten mit B. anthracis wurden entsprechend Abfallbehälter

vor Beginn der Arbeit frisch mit Desinfektionsmittel bereitgestellt. Im Anschluss wurden auto-

klavierbare Artikel zweifach bei 134 °C für 30 min autoklaviert und entsorgt bzw. für den wei-

teren Gebrauch gereinigt. Zur persönlichen Absicherung, insbesondere bei Gefahr auf Aerosol-

bildung und während der Tierversuche wurde mit P3-Atemschutzmaske, Gesichtsschutzschirm

und Einwegschutzkleidung, bestehend aus doppelter Behandschuhung, Overall, Baretthaube,

Überschuhen, Schürze und Armstulpen gearbeitet.

3.1 Standardmethoden

Sofern nicht anders beschrieben, wurden mikrobiologische und gentechnische Standardmetho-

den entsprechend der publizierten, gängigen Protokolle durchgeführt [15][153]. Diese umfass-

ten:

• Methoden zur Anzucht, Überimpfung und Lagerung von Bakterien- und Zellkulturen

• Absorptionsmessungen zur Bestimmung der Zelldichte oder DNA-Konzentration mit-

tels Photometer

• Messung und Einstellung des pH-Werts

• SDS-PAGE und Agarosegelelektrophorese

• Färbung von Gelen mittels Coomassie-Lösung

• Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA-Methode

30

3. Methoden

3.2 Herstellung und Aufbereitung von Antigenen

3.2.1 rPA83, rBclA und rLF

Zur Herstellung großer Mengen von rPA83, rBclA und rLF für die Diagnostik im ELISA oder

zur Anwendung als Impfstoff wurden bereits vorhandene E. coli Stämme vom Typ BL21-

CodonPlus verwendet. Diese waren zuvor durch Mitarbeiter der Universität Hohenheim mit

entsprechenden Plasmiden zur Synthese der genannten rekombinanten Antigene transformiert

worden. In Kürze zusammengefasst, wobei die einzelnen Arbeitsschritte im Folgenden detail-

liert beschrieben werden, sind entsprechend Bakterienkulturen in großen Volumina angesetzt

und zur Produktion ihrer spezifischen Proteine mit IPTG induziert worden. Nach dem Ernten

der Bakterien kam es zu Lyse und weiteren Aufreinigung der Proteine mittels „fast protein

liquid chromatography“ (FPLC) über das integrierte His-Tag. Zur weiteren Verwendung der

aufgereinigten Proteine fand ein Medienwechsel über Dialyse und eine qualitative Überprüfung

über SDS-PAGE statt. Die Konzentration wurde im Anschluss quantitativ mittels Bicinchonin-

säure (BCA) bestimmt. Kamen die Präparationen zur Verwendung als Impfstoff in Frage,

schlossen sich weitere, reinigende Maßnahmen an (Kapitel 3.3).

3.2.1.1 Anzucht von induzierten Bakterienkulturen

Aus einer Reinkultur wurde mittels Überimpfung einer Einzelkolonie eine 50 ml Vorkultur

(Standard I Medium mit entsprechendem Zusatz von Antibiotika) angelegt. Die Inkubation

erfolgte schüttelnd (120 UpM) üN bei 37 °C. Am Folgetag war eine analog angesetzte Haupt-

kultur (500 ml) durch Zufügen von 5 ml der Vorkultur zu beimpfen. Diese war dann bei 37 °C

unter Schütteln in einem Erlenmeyerkolben mit Schikanen bis zu einer OD600 nm von 0,6 zu

inkubieren. Nach dem Erreichen der gewünschten Zelldichte wurde die Kultur mit IPTG (End-

konzentration 1 mM) induziert und weitere 3 h bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Bei den Bakteri-

enstämmen für rBclA und rLF wurden teilweise bessere Ergebnisse erzielt, wenn das Wachstum

nach der Induktion üN bei 28 °C geschah.

Nach Beendigung der Induktion war die Bakteriensuspension bei 4000 x g für 15 min zu

zentrifugieren. Das resultierende Pellet wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C einge-

froren. Zur Verfolgung der Proteinproduktion wurden vor dem Beginn der Induktion und an

deren Ende je eine 1 ml Probe entnommen.

31

3. Methoden

3.2.1.2 Proteinaufreinigung mittels FPLC

Die über IPTG induzierten Bakterienkulturen produzierten je nach Plasmid rPA83, rBclA und

rLF im Überschuss. Zur Trennung der Proteine von den restlichen Bestandteilen der produzie-

renden Bakterien waren die Proteine mit einem His-Tag versehen. Diese nicht natürlich vor-

kommende Aneinanderreihung von sechs Histidinen besitzt im basischen Bereich eine extrem

negative Ladung und kann daher eine starke Bindung mit Ni2+-Ionen oder anderen stark positi-

ven Ionen eingehen. Durch Auftragung der lysierten Bakterienkultur auf eine Säule mit gebun-

denen Ni2+-Ionen lassen sich die gebildeten Proteine aufreinigen, da andere Bestandteile ohne

das His-Tag nicht anhaften und somit heruntergewaschen werden. Durch anschließendes gradu-

elles Senken des pH-Werts ändert das His-Tag seine Ladung über neutral zu positiv und kann so

inklusive des angehängten Proteins von der Säule in nahezu reiner Form eluiert werden.

Mittels FPLC konnte diese Aufreinigung automatisiert durchgeführt werden. Hierbei wurde

eine zuvor präparierte Säule in einem vorgefertigtem Programm mit der Bakteriensuspension

beladen, durch Puffer gespült und in Fraktionen eluiert. Während des gesamten Prozesses

wurde kontinuierlich die Konzentration der die Säule verlassenden Proteine erfasst, sodass

schlussendlich die Fraktionen mit der höchsten Konzentration weiterverwendet werden

konnten. Da die verwendeten Säulen durch Gaseinschlüsse oder Schmutzpartikel leicht

verstopfen, mussten alle Flüssigkeiten und zuführenden Schläuche gas- und partikelfrei

eingesetzt werden und wurden daher vor Verwendung steril filtriert und entgast. Im Detail war

die Aufreinigung mittels FPLC folgendermaßen durchzuführen:

1. Messung und Einstellung des pH-Werts aller einzusetzenden Puffer (Lysepuffer, Puffer

B, Puffer C, Elutionspuffer), sowie Filtration und Entgasung dieser.

2. Einrichten des FPLC-Geräts:

a) Spülung und Entgasung aller angeschlossenen Schläuche.

b) Einlauf der Puffer in die zugehörigen Schläuche.

c) Beladung der HiTrap Sepharose Säule mit 0,1 M NiSO4 mittels Spritze wie vom

Hersteller angegeben.

d) Säule in das Gerät einsetzen und Dokumentationsschreiber in Betrieb nehmen.

e) Für die fraktionierte Elution 60 1,5 ml Eppendorfgefäße in das Auffangrad einsetzen

und mit je 100 µl TRIS (pH 8,5) zur Neutralisation befüllen.

3. Zugabe von 1 ml Proteinasecocktail zu 100 ml eisgekühltem Lysepuffer und Resuspen-

sion eines induzierten Bakterienpellets mit diesem.

4. Lyse der Bakteriensuspension unter Rühren für 1 h im Eisbad.

5. Zentrifugation des Lysats bei 12000 x g und 4 °C für 20 min.

6. Überstand des Lysats abnehmen und in einen frischen, hohen, gekühlten Zylinder

(100 ml) überführen, Pellet verwerfen.

32

3. Methoden

7. Lysat und Lysepuffer an die vorgesehenen Schläuche anschließen und Programm star-

ten.

8. Programm (soweit nicht anders vermerkt, liefen alle Flüssigkeiten mit 3 ml/min über die

Säule):

a) Einlauf von 50 ml Lysepuffer zur Spülung und Äquilibrierung der Säule.

b) Einlauf des kompletten Lysats (~100 ml) mit 1 – 3 ml/min.

c) Waschgang B mit Einlauf von 50 ml Puffer B

d) Waschgang C mit Einlauf von 50 ml Puffer C

e) Elution in 1 ml Fraktionen durch Einlauf von 50 ml Elutionspuffer mit 1 – 3 ml/min.

f) Spülung des Geräts und der Säule mit 100 ml sterilem Millipore.

9. Markieren, Schließen, Schwenken und Einfrieren von Fraktionen mit adäquaten Prote-

inkonzentrationen.

10. Nachbereitung des Geräts durch Spülen aller Schläuche mit sterilem Millipore.

11. Zur Lagerung der Säule die NiSO4-Ionen, mittels Spülung (Lysepuffer versetzt mit

0,05 M EDTA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers entfernen.

3.2.1.3 Dialyse

Die aus der FPLC resultierenden Fraktionen wurden entsprechend ihrer Konzentration vereinigt

und über Dialyse einem Pufferwechsel mit graduell sinkender Harnstoffkonzentrationen [1 M,

0,5 M, 0,1 M] hin zu einer HEPES-Puffer Formulation ohne Harnstoff (Dialysepuffer 4) unter-

zogen. Dafür wurden Dialyseschläuche mit Porengrößen zwischen 3,5 und 8 kDa verwendet,

welche nach dem Befüllen dicht verschlossen und vollständig bedeckt sukzessive in Dialyse-

puffer 1 bis 4 inkubiert wurden. Alle Dialyseschritte fanden in einem hohen Becherglas (2 l)

gekühlt und unter sachtem Rühren statt. Die Inkubationszeiten betrugen 3 h für Dialysepuffer 1,

1,5 h für Dialysepuffer 2, 1 h für Dialysepuffer 3 und je dreimal 30 min für Dialysepuffer 4. Zur

späteren Analyse und Dokumentation von Verlusten wurden auch hier vor und nach der Dialyse

Proben genommen. Bei einer Verwendung der Proteine für den ELISA waren die Reinigungs-

schritte mit der Dialyse beendet, sodass diese nach Bestimmung der Konzentration und Verifi-

kation der Größe und Reinheit mittels SDS-PAGE eingesetzt werden konnten.

33

3. Methoden

3.2.2 Aufreinigung von Kapselmaterial aus einer Bakterienkultur

Um Kapselmaterial als Antigen für die Verwendung im ELISA herzustellen, wurde der

B. anthracis Stamm A73 verwendet, welcher aufgrund des Fehlens des Plasmids pX01 keine

Toxinkomponenten produzieren kann und damit attenuiert ist. Durch die fehlenden Toxinpro-

duktion ist ebenfalls eine Verunreinigung der Kapselpräparation mit den Toxinen von vornher-

ein ausgeschlossen. Das Protokoll folgte mit kleineren Abwandlungen den von Joyce et al.

(2006) [158] publizierten Aufreinigungsschritten. Pro Präparation war der A73 auf 6 – 10 Plat-

ten CSA-Bicarbonat aus einer frischen Kultur auszuplattieren und bei 37 °C mit 20 % CO2 für

24 h zu bebrüten. Danach waren die Platten unter einer Sterilbank mit möglichst geringem

Volumen an PBS abzuschwemmen. Die vereinigte Bakterienkultur wurde durch autoklavieren

für 30 min bei 121 °C abgetötet und anschließend für 10 min bei 10000 x g abzentrifugiert. Der

resultierende Überstand war abzunehmen, in ein frisches Gefäß zu überführen, auf Sterilität zu

überprüfen und bei 4 °C üN in Nukleasepuffer, versetzt mit 140 U DNase und 10 U RNase zu

inkubieren. Zur Fällung der löslichen Proteine wurde am Folgetag Trichloressigsäure mit einer

Endkonzentration von 5 % zugefügt, auf Eis für 30 min inkubiert und anschließend bei

10000 x g für 30 min zentrifugiert. Zur Neutralisation erfolgte eine Zugabe von NaOH zum

überführten Überstand bis zu einem pH-Wert von 7. Die Quantität und Reinheit der Präparation

wurde durch die Bestimmung der Proteinkonzentration und die Analyse in der SDS-PAGE

bestimmt. Hierbei mussten im Vergleich zwei identisch beladene Gele jeweils mit Coomassie

und Stains-All gefärbt werden, da die Kapsel nur mit Stains-All sichtbar gemacht werden kann

[113]. Die Abwesenheit der entsprechenden Bande für die Kapsel bei der Coomassiefärbung

galt als zusätzlicher, absichernder Nachweis der Identität des Präparats.

3.2.3 Färbung mit Stains-All

Die Färbung von SDS-Gelen mit Stains-All wurde ausschließlich für die Verifikation der Kap-

selpräparation durchgeführt und hielt sich mit kleineren Abweichungen an das von Goldberg et

al. (1997) [113] publizierte Protokoll. Bei Färbungen zur Analyse von Größe und Reinheit an-

derer Präparate wurde standardmäßig Coomassie [153] verwendet. Zur Entfernung von SDS

mussten die Gele einem dreifachen Waschzyklus unterzogen werden, welcher vorsah, die Gele

jeweils dreimal mit einer 25 %igen Isopropanol-Lösung zu spülen und anschließend in selbiger

für 10 min schwenkend zu inkubieren. Die Isopropanol-Lösung wurde anschließend durch die

Stains-All-Lösung ersetzt und schwenkend unter Lichtausschluss für 2 h inkubiert. Die Entfär-

bung erfolgte graduell durch Lichteinfluss, wobei die Färbung der Banden pH-abhängig und die

Kapselpräparation entsprechend als blaue Bande erkennbar war.

34

3. Methoden

3.2.4 Herstellung eines vegetativen Vollantigen von B. anthracis

Zum Nachweis von spezifischen Antikörpern, die gegen den vegetativen Zellkörper und dessen

nicht-toxische Produkte gerichtet sind, wurde ein vegetatives Vollantigen produziert, dessen

Zusammensetzung nicht genau definiert ist. Zur Vermeidung von Verunreinigung mit Kapsel-

oder Toxinantigenen wurde hierfür der toxin- und kapseldefiziente B. anthracis Stamm A58

verwendet.

Zunächst war der A58 in BHI Bouillon versetzt mit 0,7 % Bicarbonat anzuziehen und üN bei

37 °C zu inkubieren. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und bei

4000 x g für 30 min bei 4 °C pelletiert. Das resultierende Pellet musste für eine kombinierte

mechanische und chemische Lyse kurz in flüssigem Stickstoff schockgefroren und direkt im

Anschluss mit 20 ml PBS versetzt mit SDS (Endkonzentration 1 %) resuspendiert werden.

Durch zehnmaliges Beschallen mit Ultraschall für 5 – 10 s wurde die Lyse weiter verstärkt. An-

schließend fand eine weitere Zentrifugation zur Pelletierung der unlöslichen Bestandteile bei

4000 x g für 15 min bei 4 °C statt. Der Überstand wurde mit einem Spritzenfilter steril filtriert

und danach auf Sterilität überprüft. Nach einer Bestimmung der Konzentration mittels BCA

konnte die Präparation im ELISA als vegetatives Antigen verwendet werden.

3.2.5 Herstellung einer Sporensuspension von B. anthracis

Für die Infektion im Tierversuch und die Präparation von FIS war zunächst die Erstellung einer

Sporensuspension nach einem Standardprotokoll (prEN 13697:2000 [357]) mit leichten Ab-

wandlungen nötig. Eine Vorkultur des gewünschten Stammes wurde in TGB mit 106 Sporen

beimpft und bei 30 °C bis zum Eintreten in die exponentielle Wachstumsphase bei einer Kon-

zentration von 107 cfu/ml inkubiert. Zur Inokulation von Roux-Flaschen mit MYA waren je-

weils 2 – 3 ml der Vorkultur überführt und durch Schwenken mit Hilfe von 5 – 10 sterilen Glas-

perlen verteilt worden. Überstehende Flüssigkeit wurde am Ende wieder entfernt. Die Inkubati-

on erfolgte für 14 Tage bei 30 °C, wobei die Sporulation bereits nach 3 Tagen und nochmals

nach dem Ablauf der vollen Inkubationszeit durch Phasenkontrastmikroskopie überprüft wurde.

Die Abschwemmung der Sporen erfolgte mit NaCl-Gelatine ebenfalls über Schwenken mit Hil-

fe steriler Glasperlen. Zur vollständigen Abtötung vorhandener, vegetativer oder nicht vollstän-

dig sporulierter Zellen war die gewonnene Suspension im Wasserbad für 30 min bei 65 °C zu

erhitzen (Hitzeinaktivierung). Im Anschluss wurden die Sporen fünfmal mit NaCl-Gelatine

gewaschen, final in einem gewünschten Volumen NaCl-Gelatine aufgenommen und bis zur Ver-

wendung bei 4 °C gelagert. Zur Feststellung der Konzentration wurde abschließend eine Spo-

renauszählung vorgenommen und gegebenenfalls direkt vor der Verwendung, nebst erneuter

Hitzeinaktivierung wiederholt.

35

3. Methoden

3.2.6 Bestimmung der Sporenkonzentration

Zur Bestimmung der Sporenkonzentration musste die Sporensuspension zunächst gründlich

unter Vermeidung einer Aerosolbildung vermischt werden, wobei dies auch für jede weitere

anzulegende Verdünnung zutraf. Die anschließende Reihenverdünnung wurde in 15 ml Röhr-

chen durchgeführt in die je 9,0 ml NaCl-Gelatine vorgelegt waren. Entsprechend wurden aus

der durchmischten Ausgangslösung mittels 1 ml Glaspipette 1 ml auf die erste Verdünnungsstu-

fe übertragen, mit einer frischen 1 ml Glaspipette durchmischt und 1 ml auf die nächste Stufe

übertragen. Abhängig von der erwarteten Konzentration schlossen sich wiederholend weitere

Verdünnungsschritte an. Bei niedrigen Ausgangsvolumina konnte der erste Verdünnungsschritt

auch durch Übertragung von 0,1 ml Sporensuspension auf 9,9 ml NaCl-Gelatine erfolgen.

Üblicherweise wurden entsprechend der erwartenden Konzentration je 100 µl der Verdün-

nungsstufen zwischen 10-4 und 10-7 im Doppelansatz auf CBA ausplattiert und üN bei 37 °C in-

kubiert. Auszählbare Konzentrationen lagen im Bereich von 10 – 300 cfu pro Platte und erga-

ben entsprechend der Verdünnungsstufen einen Durchschnittswert für die Sporenkonzentration

der Ausgangssuspension.

Für die Infektionsversuche waren zudem zusätzlich abgefüllte Infektionsdosen zur Verifika-

tion der tatsächlich verabreichten Sporenzahl auszuzählen. Hierfür wurden die überzähligen

Dosen in gleicher Art wie die zur Infektion verwendeten Dosen in eine Spritze aufgezogen und

über die Spritze in ein entsprechendes Volumen an NaCl-Gelatine zur Reihenverdünnung gege-

ben oder direkt ausplattiert, wenn die erwartete Sporenzahl ohne weitere Verdünnung auszähl-

bar war. Auf diese Art sollten etwaige Rückstände in der Spritze oder dem Portionierungsgefäß

berücksichtigt werden. Die angegebenen Konzentrationen der Infektionsdosen der Tierversuche

beziehen sich, soweit nicht anders vermerkt, auf diese Auszählung.

3.2.7 Herstellung von Formalin inaktivierten Sporen (FIS)

Die FIS-Präparation wurde entsprechend der von Guidi-Rontani et al. (1999) [120] vorgestell-

ten Methodik mit leichten Abwandlungen durchgeführt. Eine vorher hergestellte, ausgezählte

und gut durchmischte Sporensuspension des kapseldefizienten B. anthracis A1 Stammes

(SSLV) war in möglichst hoher Konzentration zu je 5 ml vorsichtig auf eine Formalinlösung

(Endkonzentration 4 %) aufzuschichten. Die Vermischung erfolgte durch vorsichtiges

Schwenken, um eine Bildung von Lufteinschlüssen zu vermeiden, da diese für gewöhnlich eine

vollständige Inaktivierung verhinderten. Die Inkubation erfolgte üN bei 37 °C. Am Folgetag

wurde die Suspension bei 4000 rpm für 15 min bei RT abzentrifugiert und viermal mit PBS-

Gelatine im Maximalvolumen gewaschen. Nach dem letzten Waschgang war das Pellet im

36

3. Methoden

ursprünglich eingesetzten Volumen der Sporensuspension an NaCl-Gelatine wieder aufzuneh-

men und vorerst bei 4 °C in einem Glasgefäß aufzubewahren.

Zur Kontrolle der Sterilität wurde ein Aliquot von 50 µl abgenommen, mit 50 µl einer Histi-

din-Lösung (Endkonzentration: 20 g/l) versetzt und 30 min bei RT inkubiert, um die Wirkung

von potentiell vorhandenem Formalin zu neutralisieren. Das gesamte Volumen war auf eine

CBA-Platte auszustreichen und üN bei 37 °C zu bebrüten. Die Präparation wurde verworfen,

wenn keine Sterilität vorhanden war. Etwaige Parallelansätze waren bis zu diesem Schritt voll-

kommen getrennt behandelt und betrachtet worden und wurden erst nach Gewährleistung der

Sterilität vereinigt. Zur permanenten Lagerung einer einheitlichen FIS-Präparation musste diese

unter ständigem Rühren in 1,5 ml Eppendorfgefäße aliquotiert und anschließend bei -80 °C

weggefroren werden. Bei der Verwendung im ELISA oder als Antigen innerhalb einer Vakzine

wurden stets Aliquots einer einheitlichen Präparation verwendet, die zudem maximal zweimal

aufgetaut wurden. Die vermerkte Konzentration der FIS-Präparate bezog sich immer auf die

ursprünglich eingesetzte Anzahl an lebensfähigen Sporen.

3.3 Auf- und Vorbereitung der Vakzinen

3.3.1 Endotoxinbestimmung

Zur Verwendung der aufgereinigten Proteine (rBclA und rPA) im Tierversuch musste sicherge-

stellt werden, dass die zu applizierende Dosis insgesamt einen Endotoxingehalt von 5 EU/kg

Körpergewicht mit 10 ng Endotoxin pro EU [205] nicht überschritt. Entsprechend mussten

Antigenpräparationen vor der Verwendung als Vakzine via LAL-Test-Kit auf Endotoxingehalt

getestet und gegebenenfalls weiter gereinigt werden.

Alle Arbeitsschritte waren möglichst in Glaswaren auszuführen, welche zuvor bei 180 °C für

6 h trocken-sterilisiert werden mussten, um Endotoxinfreiheit zu gewährleisten. Verwendete

Plastikgefäße wurden üN in 1 M NaOH inkubiert, gründlich mit Endotoxin-freiem Wasser

gespült, getrocknet und bei 121 °C sterilisiert oder entsprechend endotoxinfrei erstanden.

Zur Evaluierung der Endotoxinkonzentration musste für jeden Test eine Standardreihe mit

einer Endotoxinlösung von bekannter Konzentration erstellt werden. Diese war Bestandteil des

Test-Kits und hatte eine Konzentration von 50 EU/ml. Die daraus zu erstellende Standardreihe

beinhaltete Konzentrationen von 50 bis 0,005 EU/ml, welche in Glasröhrchen mit endotoxin-

freiem Wasser angesetzt wurden. Die zu testenden Proben wurden ebenfalls in verschiedenen

Verdünnungen getestet. Das gesamte Protokoll sah für jeden Mischschritt ein einminütiges Vor-

texen zur vollständigen Durchmischung vor, welches vor der Belegung der verwendeten steri-

len, endotoxinfreien 96-Well-Platte mit den präparierten Proben und der Standardreihe wieder-

holt wurde. Die Blindprobe (endotoxinfreies Wasser) und die Standardreihe waren zu je 100 µl

37

3. Methoden

im Doppelansatz in die Kavitäten der Platte aufzutragen. Eine vierfache Auftragung war für die

Proben nötig, da jeweils zwei Ansätze mit Endotoxin (5 EU/ml) versetzt wurden, um eine hem-

mende oder amplifizierende Wirkung der Bestandteile sichtbar zu machen. Die fertig belegte

Platte, mit einem Deckel abgedeckt, inkubierte im Anschluss für 10 min bei 37 °C. Danach

erfolgte die Zugabe von je 100 µl frisch angesetztem LAL zu jeder Kavität und die kinetische

Messung des Farbumschlags bei OD405 nm und 37 °C. Die Errechnung der Konzentration gesch-

ah über das verwendete Programm (WinKQCL) automatisch.

3.3.2 Endotoxinaufreinigung

Zur weiteren Aufreinigung mittels EndoTrap blue Endotoxin-Reinigungs-Kit wurden nur Prä-

parationen verwendet, die eine hohe Proteinkonzentration in Kombination mit niedrigem Endo-

toxingehalt aufwiesen. Die verwendete Reinigungssäule hatte ein Volumen von 1 ml und wurde

manuell entsprechend der Vorgaben des Herstellers zur Säuberung von maximal 15 ml Protein-

lösung verwendet. Zur Vorbereitung der Säule war diese je zweimal mit 3 ml Regenerationspuf-

fer und 3 ml Equilibrierungspuffer zu spülen. Die Auftragung der Proteinlösung erfolgte suk-

zessive im Anschluss, wobei das Eluat nach dem Ausfluss des Säulenvolumens wieder aufge-

fangen wurde. Durch Nachspülen mit 1 ml Equilibrierungspuffer konnte die aufgetragene Probe

komplett heruntergespült werden. Die Elution wurde in endotoxinfreien Gefäßen aufgefangen,

auf Protein- und Endotoxingehalt geprüft und gegebenenfalls erneut gereinigt. Durch Regenera-

tion der Säule mit zweimal 3 ml Equilibrierungspuffer konnte die Säule bis zu 10 Mal wieder-

verwendet werden. Im Schnitt war eine 10 – 100fache Reduzierung des Endotoxingehalts pro

Aufreinigung erreichbar.

3.3.3 DNA-Patronen-Herstellung

Zur nadelfreien Applikation der DNA-Vakzine via GeneGun waren goldbeschichtete Patronen

herzustellen. Dabei wurde DNA mit dem Ziel, sie intrazellulär einzuschleusen, an Goldpartikel

gebunden und über eine Druckluftpistole in die Haut geschossen.

3.3.3.1 Präzipitation von DNA auf Goldstaub

Hierfür wurden zunächst 30 mg Goldstaub mit 250 µl Spermidin (0,05 M) versetzt und durch

mehrmaliges Vortexen und Beschallen im Ultraschallbad für je 3 – 5 s so vermischt, dass eine

homogene Dispersion frei von Verklumpungen vorlag. Danach erfolgte die Zugabe der DNA-

Vektoren zu je 150 bis 200 µl bei einer Konzentration von 1 µg/µl. Bei der Erstellung von

Mischpatronen, also Patronen mit zwei oder mehr unterschiedlichen Vektoren musste die Ver-

38

3. Methoden

mischung vor der Zugabe erfolgen, um eine gleichförmige Beschichtung zu gewährleisten. An-

schließend wurde die Dispersion kurz gevortext (5 s) und schließlich durch tropfenweise Zuga-

be von 250 µl Calciumchlorid (1 M) und unter sachtem Vortexen gefällt. Zum vollständigem

Setzen der gefällten Goldpartikel wurde die Dispersion 10 min bei RT inkubiert und anschlie-

ßend für 15 – 60 s bei 3000 – 4000 x g abzentrifugiert. Das verbliebene Pellet wurde nach Ab-

gießen des Überstands durch mehrmaliges Anschnipsen resuspendiert und fünfmal mit 1 ml fri-

schen 100 %igem Ethanol gewaschen. Nach Beendigung der Waschschritte war das überstands-

freie Pellet in insgesamt 3 ml PVP-Lösung zu resuspendieren. Diese erfolgte schrittweise mit je

0,5 ml PVP-Lösung, wobei eine leichte Ultraschallbehandlung zur besseren Resuspension ver-

wendet werden konnte. Die so hergestellte Gold-DNA-Dispersion konnte bis zur Verwendung

luftdicht verschlossen bei -20 °C bis zu 2 Monate gelagert werden.

3.3.3.2 Schlauchpräparation und Beschichtung

Zur Beschichtung eines Tefzel Schlauchs mit der präparierten DNA-Dispersion musste dieser

zunächst auf 76 cm zurechtgeschnitten und kurz mit Ethanol (100 %) gespült werden. Die an-

schließende Trocknung fand im Schlauchrotor für mindestens 5 min mittels Stickstoffbegasung

(1 bar) ohne Rotation statt. Nach dem Entfernen des getrockneten Schlauchs aus der Apparatur

wurde die zuvor präparierte Gold-DNA-Dispersion kurz gevortext und beschallt und anschlie-

ßend schnell unter Vermeidung von Luftblasen in den Tefzel Schlauch aufgezogen. Der

Schlauch musste danach vorsichtig in die Apparatur eingespannt und zur gleichmäßigen Ab-

lagerung der Partikel im Inneren des Schlauchs sofort in einem streng einzuhaltenden Rhyth-

mus rotiert werden:

1. Vollständige, ununterbrochene Rotation für 1 min.

2. ¼ Umdrehungen alle 15 s für 2 min.



Nach der letzten Bewegung des Schlauches und der darauf folgenden finalen Ablagerung für

1 min wurde die Flüssigkeit durch den Anschluss einer Schlauchpumpe mit 6 ml/min vollstän-

dig abgezogen. Die Trocknung erfolgte unter Rotation mit 1 bar Stickstoff für mindestens 5 min

bzw. bis der Schlauch vollständig durchgetrocknet war. Die Endtrocknung geschah für

2 – 5 min bei 3 – 4 bar. Der fertige Schlauch wurde durch eine Schlauchschnittmaschine in

gleichförmige Patronen geschnitten, die bis zur Verwendung luftdicht und trocken bei 4 °C bis

zu 8 Monate gelagert werden konnten.

39

3. Methoden

3.3.3.3 Qualitätskontrolle der DNA-Patronen

Zur Kontrolle der präparierten DNA-Patronen wurde das Vorhandensein und die Konzentration

von DNA pro Patrone, sowie der Qualität des Verschusses getestet. Zur Feststellung des Inhalts

der Patronen erfolgte eine Spülung von insgesamt 5 Patronen einer Präparation mit 200 µl Mil-

lipore. Die Beschichtung wurde dabei durch kurzes Vortexen und Beschallen von der Patrone

gelöst.

Je 1, 5 und 10 µl der resultierenden Dispersion 1 : 1 versetzt mit Probenpuffer wurden an-

schließend im Vergleich zum 1 kb DNA-Marker und der ursprünglich eingesetzten DNA-

Lösung in einer Agarosegelelektrophorese in einem 1 %igem Agarosegel auf Anwesenheit der

Plasmide überprüft. Die Auswertung der Geldokumentation erfolgte mit dem Programm Quan-

tum.CAPT. Das Restvolumen der 200 µl Probe wurde kurz anzentrifugiert, um das Absetzen et-

waiger Goldpartikel zu beschleunigen. Danach waren 100 µl abzunehmen, mit Millipore auf

1000 µl aufzufüllen und in einem Photometer zur Bestimmung der DNA-Konzentration zu

messen. Anhand der gemessenen OD konnte über die Formel OD260 nm = 1 ≙ 50 µg/ml, der ein-

gerechneten Verdünnung und verwendeten Anzahl an ausgespülten Patronen auf die durch-

schnittliche Menge an beschichteter DNA pro Patrone geschlossen werden.

Zur finalen Kontrolle der Qualität wurden mindestens 2 Patronen einer Präparation probe-

weise mit einer GeneGun auf Filterpapier verschossen. Dabei waren die Intensität der Färbung

des Einschusses, die Verteilung der Einfärbung und die Rückstände in der Patrone zu bewerten

und galten ggf. als Ausschlusskriterium für eine Verwendung.

3.4 Vakzinierung, Probennahme und Infektion

Die Protein-basierenden Antigene umfassten rPA83, rBclA, ein Kapselkonjugat und FIS, sowie

ein kommerzielles Lipopeptid als Adjuvans. Das in dieser Arbeit verwendete Lipopeptid stellt

eine Mixtur aus Pam3Cys-SKKKK, einem TLR2/1 Aktivator [46] und Pam3Cys-FISEAIIHVL-

HSRHPG einem promiskuitiven T-Helferzellepitop des Pottwal Myoglobins (AA 106-121) dar

[271]. Beim Kapselkonjugat handelt es sich ebenfalls um ein künstliches Konstrukt. Basierend

auf den vielversprechenden Ergebnissen zur Erhöhung der Immunogenität der Kapsel durch

Konjugation (siehe auch Kapitel 1.5.3.2 ) wurde in der Hoffnung Adjuvans und Antigen in einer

Substanz zu vereinen ein Kapsel-Lipopeptid-Konjugat auf Grundlage des Lipohexadekapeptids

des B. cereus Sporen Germinationsprotein (GerD) konstruiert. Das resultierende Nonamer der

PGA Pam3Cys-AQEKEAKSELDYD-(isoE9)-NH2 wie auch das Lipopeptid Adjuvans wurde

extern durch EMC Microcollections hergestellt. Die Produktion und Aufreinigung von rPA83

und rBclA aus Escherichia coli (E. coli) und FIS aus Sporen der SSLV war Bestandteil dieser

Arbeit.

40

3. Methoden

Für die DNA-basierenden Vakzinen wurden bis auf eine Ausnahme Vektorrückgrate der

pDNAVaccUltra Familie verwendet, welche zur Verwendung als Vakzinevektoren optimiert

sind [361][360]. Je nach integriertem Antigen beinhalteten die Vektoren verschiedene flankie-

rende Signalsequenzen zur Sekretion (TPA [372], endosomalen Lokalisation (LAMP1 [53]

[185][362] oder Einschleusung in das Proteasom (Uq [69]). Das pDNAVaccUltra Vektorrück-

grat ohne Signalsequenzen wurde als separater Vektor auch für das Adjuvans CIITA verwendet

und entsprechend in Mischung mit den jeweiligen Vakzinevektoren appliziert. Für mIPS-1, als

weiteres zu testendes Adjuvans, wurde ein anderes Vektorrückgrat verwendet, in das ebenfalls

das zu testende Antigen eingebaut war. Die zu testenden Antigene wurden durch die vertreiben-

de Firma NATX in die entsprechenden Vektoren kloniert und in den benötigten Mengen herge-

stellt. Die Antigene umfassten LFD1PAD4, PA83 und BclAD1D3. Das Fusionsprotein LFD1-

PAD4, bestehend aus der PA-bindenden Domäne von LF und der rezeptorbindenen Domäne

von PA wurde vergleichend zu PA83 getestet. Im Gegensatz zum Proteingegenstück, wurde im

Falle von BclA für die DNA-Versuche eine verkürzte Version von BclA verwendet, um die Effi-

zienz des Konstruktes zu steigern. Die mittlere, kollagenähnliche Domäne von BclA fehlte

daher vollständig, da sie kaum Anteil an den gebildete sporenspezifischen Antikörpern hat

[195]. Die resultierenden Vektoren NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1, pDNAVaccUltra1-

TPA-LFD1PAD4-LAMP1, pDNAVaccUltra1-TPA-PA83-LAMP1, pDNAVaccUltra1-TPA-

BclAD1D3-LAMP1, pDNAVaccUltra4-BclAD1D3-Uq und pDNAVaccUltra5-CIITA wurde

innerhalb der Mausversuche via GeneGun appliziert und entsprechend i. m. im Ziegenversuch.

41

Tabelle 13: Übersicht Vakzinekomponenten (Mausversuch)

Die Abkürzungen beziehen sich auf die Gruppenkürzel für den Mausversuch.

Proteinbasierende Vakzinekomponenten

Bezeichnung Abkürzung Beschreibung

FIS O Formalin inaktivierte Sporen der SSLV

Kapselkonjugat C

Lipopeptid L

rBclA B rekombinantes BclA in voller Länge als Bestandteil des Exosporiums

rPA83 P rekombinantes PA in voller Länge als Bestandteil des Letaltoxins

DNA-basierende Vakzinekomponenten

Bezeichnung Abkürzung Beschreibung

NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 S

pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1 K

pDNAVaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-LAMP1 A

pDNAVaccUltra1-TPA-PA83-LAMP1 H

pDNAVaccUltra4-BclAD1D3-Uq M

pDNAVaccUltra5-CIITA T murines CIITA als vektorexternes Adjuvans

Nonamer der Kapsel konjugiert an ein Lipopeptid: Pam3Cys-AQEKEAKSELDYD-(isoE9)-NH2

als Vakzine mit Adjuvanscharakter

Mixtur aus Pam3Cys-SKKKK und Pam3Cys-SFISEAIIHVLHSRHPG als Adjuvans

Fusionsprotein LFD1PAD4 als Bestandteil des Letaltoxins innerhalb eines sekretierenden Vektors inklusive des vektorinternen Adjuvans mIPS-1

BclA ohne Collagen-ähnliche Domäne als Bestandteil des Exosporiums innerhalb eines sekretierenden und endosomal einschleusenden Vektors

Fusionsprotein LFD1PAD4 als Bestandteil des Letaltoxins innerhalb eines sekretierenden und endosomal einschleusenden Vektors

PA in voller Länge als Bestandteil des Letaltoxins innerhalb eines sekretierenden und endosomal einschleusenden Vektors

BclA ohne Collagen-ähnliche Domäne als Bestandteil des Exosporiums innerhalb eines Proteasom einschleusenden Vektors

3. Methoden

Die beschriebenen Protein- und DNA-Vakzine sollten im Tierversuch auf Immunogenität

und Schutzwirkung getestet werden. Hierfür war zunächst eine Testung aller Komponenten ein-

zeln und in Kombination im NMRI-Mausmodell vorzunehmen, um die erfolgversprechendsten

Kompositionen für die Anwendung im Ziegenmodell zu ermitteln. Protein und DNA Vakzine

wurden hierbei als eigenständige, parallel verlaufende und separate Versuchszweige angesehen,

deren Kombination zunächst nicht vorgesehen war. Eine Übersicht der verwendeten Vakzine-

komponenten ist in Tabelle 13 zu sehen.

3.4.1 Mausversuche

Für die Testung der Vakzinekomponenten im Mausmodell

wurden 8 – 12 Wochen alte, weibliche NMRI-Mäusen in ver-

schiedenen Versuchsgruppengrößen benutzt. Vakzinegruppen

beinhalteten je 10 Tiere, negative Kontrollgruppen nur fünf.

Die Benennung der Gruppen setzte sich aus dem Kürzel für

das Adjuvans als ersten Buchstaben und mindestens einem

weiteren Buchstaben für eine Vakzinekomponente zusammen

(Abbildung 9).

In Tabelle 14 sind alle Impfgruppen der Mausversuche zur

Übersicht aufgeführt. Entsprechend der durchgeführten Ver-

suche waren insgesamt drei Negativkontrollen vorhanden, die

als Vergleichsmaßstab für die ihnen zugeordneten Gruppen

galten. Alle Negativkontrollen wurden analog der Vakzine-

gruppen geimpft, erhielten aber nur das jeweilige gruppen-

spezifische Adjuvans (Lipopeptid oder CIITA). Entsprechend sind jeder Gruppe nach einer Ein-

gewöhnungszeit von 2 Wochen drei Impfungen im Abstand von 2 Wochen verabreicht worden.

In diesem Zeitraum oblag die Pflege den Mitarbeitern der „Zentralen Einrichtung für Biologi-

sche und Biomedizinische Forschung mit Tierhaltung“ (ZVH) der Universität Hohenheim, wel-

che auch die Markierung über Ohrlochung und die Entnahme von Blut zur Analyse durchführ-

ten.

Die Infektion wurde 3 Wochen nach der letzten Impfung im Institut für Umwelt und Tierhy-

giene in einem behördlich zugelassenen Milzbrandlabor durchgeführt. Für den Zeitraum der

Infektion wurde daher die Pflege, Beobachtung und Nachbereitung durch die Verfasserin der

Arbeit und die Mitarbeiter des Instituts gewährleistet. Für den gesamten Versuchszeitraum

waren die Mäuse in Käfigen mit solidem Böden auf Einstreu zu je 5 Tieren pro Käfig, mit ent-

sprechendem Enrichment untergebracht. Nahrung und Wasser standen ad libitum zur Verfü-

42

Abbildung 9: Nomenklatur der Mausgruppen

Benennung der Mausgruppen entsprechendder verabreichten Adjuvanzien (1. Buchstabe;rot) und Vakzinen (2. und folgendeBuchstaben; blau) mit Angabe von mindestensje einem Buchstaben für Adjuvans und Vakzine

3. Methoden

gung. Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit und Hell/Dunkelzyklus (12 h) wurden entspre-

chend den Vorschriften eingerichtet und kontrolliert.

3.4.1.1 Betäubung und Tötung

Zur Vorbereitung der Mäuse für den DNA-Beschuss, Applikation der Impfstoffe und die Infek-

tion war eine kurzzeitige Betäubung der Tiere notwendig. Hierfür ist eine belüftete Box ver-

wendet worden, in der die Tiere einzeln bis zur Bewusstlosigkeit mit Isofluran begast wurden.

Die Gasmenge war so gewählt, dass eine schnelle Wirkung ohne Exitation erzielt werden konn-

te. Bis zur Wiedererlangung des Bewusstseins standen die Versuchstiere unter Beobachtung und

wurden, wenn nötig durch Herzmassage wiederbelebt.

Zur Tötung der überlebenden Versuchstiere nach dem Versuchsende oder zur Euthanasie

moribunder Tiere wurde in gleicher Art CO2 verwendet. Hierbei verblieben die zu tötenden Tie-

re im Begasungsgefäß bis zum Stillstand der Atmung und der Absetzung von Harn. Die Sicher-

stellung des eingetretenen Todes hatte oberste Priorität vor der weiteren Präparation des Leich-

nams.

43

Tabelle 14: Impfgruppen Mausversuch

Die Infektionsdosis bezieht sich auf die Anzahl tatsächlich applizierter Sporen, die über die Auszählung von mindestens zweiüberzähligen Infektionsdosen ermittelt wurde (siehe auch Kapitel 3.2.6)

Gruppe Tierzahl Impfung Infektionsdosis

LN-1000 5 50 µg Lipopeptid (Negativkontrolle der Proteinvakzinen für Infektion mit ~1000 Sporen) 840

LN-2000 5 50 µg Lipopeptid (Negativkontrolle der Proteinvakzinen für Infektion mit ~2000 Sporen) 1990

TN 5 ~3 µg pDNAVaccUltra5-CIITA (Negativkontrolle für DNA-Vakzine) 894

Proteinvakzinen mit ~1000 Sporen infiziert:

NC 10 25 µg Kapselkonjugat 840

NCP 10 je 25 µg Kapselkonjugat und rPA83 901

Proteinvakzinen mit ~2000 Sporen infiziert:

LB 10 50 µg Lipopeptid und 25 µg rBclA 2020

LP 10 50 µg Lipopeptid und 25 µg rPA 2020

LBP 10 50 µg Lipopeptid und je 25 µg rBclA und rPA 2020

LBCP 10 50 µg Lipopeptid und je 25 µg rBclA, rPA und Kapselkonjugat 2020

LBCOP 10 2020

DNA-Vakzinen:

NS 10 ~3 µg NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 894

TA 10 894

TH 10 894

TM 10 901

TK 10 901

TKS 10 864

50 µg Lipopeptid, je 25 µg rBclA, rPA und Kapselkonjugat und 108 FIS

insgesamt ~3 µg DNA zu gleichen Teilen bestehend aus pDNAVaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-LAMP1 und pDNAVaccUltra5-CIITA

insgesamt ~3 µg DNA zu gleichen Teilen bestehend aus pDNAVaccUltra1-TPA-PA83-LAMP1 und pDNAVaccUltra5-CIITA

insgesamt ~3 µg DNA zu gleichen Teilen bestehend aus pDNAVaccUltra4-BclAD1D3-Uq und pDNAVaccUltra5-CIITA

insgesamt ~3 µg DNA zu gleichen Teilen bestehend aus pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1 und pDNAVaccUltra5-CIITA

~3 µg NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 und je ~1,5 µg pDNAVaccUltra5-CIITA und pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1

3. Methoden

3.4.1.2 Impfung

Alle Mausgruppen wurden dreimal im Abstand von 2 Wochen immunisiert. Hierfür waren für

die Proteinvakzinen entsprechend der eingesetzten Antigene je 50 µg Lipopeptid und 108 Spo-

ren FIS, sowie je 25 µg rPA83, rBclA und Kapselkonjugat anzusetzen. Die Impfdosen wurden

für jede Impfung und Gruppe gemeinschaftlich in Mischung angesetzt, um die Gleichförmigkeit

der Impfdosen zu gewährleisten. Das angesetzte Volumen wurde entsprechend so mit sterilem

endotoxinfreiem PBS aufgefüllt, dass sich eine 200 µl Dosis ergab, die s. c. in den Nacken zu

verabreichen war.

Für die Applikation der DNA-Vakzinen war eine Rasur des Abdomens notwendig. Hierfür

wurden alle Versuchstiere initial im entsprechenden Bereich geschoren und rasiert und direkt

vor der Applikation der Dosis nochmals rasiert und mit Ethanol (70 %) desinfiziert. Jedes Ver-

suchstier erhielt zwei DNA-Patronen pro Dosis i. c. appliziert mit 400 bar via GeneGun. Die

Zusammensetzung beider Patronen war gleich und ent-

sprach zusammengenommen einer Mindestmenge von

3 µg. Alle Versuchstiere einer Gruppe erhielten die gleiche

Kombination an DNA-Patronen. Bei Versuchsgruppen mit

10 Tieren war eine Patronenpräparation nicht ausreichend.

Um eine Schwankung der Impfdosis zu vermeiden, be-

standen die Impfungen aus je einer Patrone einer Präpara-

tion, sodass zu jeder Immunisierung mit der gleichen

Menge pro Tier gearbeitet werden konnte. Die Patronen

wurden vor der Benutzung jeweils probeweise auf Filter-

papier verschossen und auf Rückstände begutachtet (siehe

Anhang, Abbildung 58). Wie in Abbildung 10 zu sehen,

konnten die Patronen rückstandslos (1) bis unbenutzt aussehend (5) verschossen werden, wenn-

gleich bei allen Rückstandsbildern eine deutliche Einfärbung des Filterpapiers bei Probeschüs-

sen zu sehen war.

3.4.1.3 Probennahme und Diagnostik

Zur serologischen Analyse wurde vor dem Beginn der Impfung und direkt vor der Infektion

Blut über die Vena facialis oder retrobulbär durch die Mitarbeiter der ZVH entnommen. Außer-

dem erfolgte eine Blutentnahme über Herzpunktion nach der Beendigung des Infektionsver-

suchs. Hierfür wurden überlebende Tiere getötet, identifiziert und anschließend durch Öffnung

des Brustraums und Herzpunktion entblutet.

Verstorbenen und getöteten Tieren waren überdies Milz und Leber für einen Erregernach-

weis zu entnehmen. Die entnommenen Organe wurden gequetscht, auf CBA ausplattiert und üN

44

Abbildung 10: Rückstandbild von DNA-Patronennach Verschuss

Skala von 1 – 5 der verwendeten DNA-Patronennach Verschuss; Einfärbung durch Gold-Rückstände

3. Methoden

bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Detektion des Erregers in Leber und Milz diente der

Verifikation der Todesursache bei den der an der Infektion verstorbenen Tieren. Die entspre-

chende Abwesenheit des Erregers in Überlebenden galt als aussagekräftiger Beweis für die Klä-

rung der Infektion in diesen Tieren.

3.4.1.4 Infektion

Die Infektion erfolgte 3 Wochen nach der letzten Impfung unter Betäubung mit einer s. c. Injek-

tion von ~25LD50 (~1000 Sporen [24]) bzw. ~50LD50 (~2000 Sporen [24]) einer Sporensuspen-

sion eines voll virulenten Ames Stammes in den Nacken. Aufgrund von Kapazitätsbeschrän-

kungen bezüglich der Versuchstierhaltung im BSL-3 wurden die Versuche teilweise gestaffelt

durchgeführt. Die Sporensuspension war dabei für alle Versuche gleich und in entsprechendem

Umfang zuvor angesetzt worden. Vor jedem Infektionszyklus wurde sie erneut hitzebehandelt

(siehe Kapitel 3.2.5) und ausgezählt, wobei sich die Konzentration nur marginal veränderte.

Um die tatsächlich applizierte Dosis abzuschätzen, wurden zusätzlich nach der Infektion über-

zählige Dosen auf CBA ausplattiert und ausgezählt (siehe Kapitel 3.2.6). Die entsprechenden

Mittelwerte dieser Auszählungen sind bei den Gruppen vermerkt und unterlagen leichten

Schwankungen. Angestrebt wurden aber Dosen von ~1000 und ~2000 Sporen in einem Volu-

men von 150 – 200 µl.

Die Infektion der Mausgruppen geschah mehrheitlich mit ~1000 Sporen (~25LD50). Eine er-

höhte Dosis von ~2000 Sporen (~50LD50) wurde nur für die Proteingruppe LN-2000, LP, LBP,

LBCP und LBCOP angewendet. Hintergrund für die unterschiedliche Infektionsdosis einzelner

Gruppen, waren die Ergebnisse hier nicht beschriebener Vorversuche in denen dieselben Grup-

pen mit ~25LD50 infiziert wurden. Eine Unterscheidung der Schutzwirkung war mit dieser Do-

sis für die genannten Gruppen nicht möglich, da alle Vakzinekompositionen 80 – 100 %

Schutzraten erzeugten. Außerdem war bei Gruppe LN-1000 eine verlängerte Überlebenszeit be-

obachtet worden. Diese Restschutzwirkung des Lipopeptids war ebenfalls bereits in anderen

Studien aufgefallen [24]. Für eine erkennbare Unterscheidung der betreffenden Gruppen und

eine stärkere Absetzung von der Negativkontrolle wurde daher eine höhere Infektionsdosis für

diese Proteingruppen angewendet. Eine äquivalente Erhöhung der Infektionsdosis für die DNA-

basierenden Vakzinen schien nicht sinnvoll, da die dort eingesetzten Adjuvanzien keine Rest-

schutzwirkung aufwiesen und eine ausreichende Unterscheidung der Gruppen gegeben war.

Gleiches galt für die Vorversuche der Protein-basierenden Vakzinen mit dem Kapselkonjugat

(Gruppe LN-1000, NC und NCP), deren Wiederholung mit einer höheren Infektionsdosis in

Anbetracht der Ergebnisse überdies nicht sinnvoll schien.

45

3. Methoden

Das Überwachen der Sterberate vollzog sich bis 3 – 4 Wochen nach der Infektion, wobei

todgeweihte Tiere und Tiere, die den Versuchszeitraum überlebten mit CO2, wie unter 3.4.1.1

beschrieben, euthanasiert wurden. Die Beobachtungsintervalle betrugen 3 Stunden, wobei dies

auch nachts und am Wochenende gewährleistet werden musste. Bei Auffälligkeiten wie rauem,

gesträubtem Fell, Zittern, leichter Abgeschlagenheit und hoher Atemfrequenz war die Beobach-

tungsfrequenz auf 1 Stunde zu erhöhen. Waren Versuchstiere bewegungslos, apathisch, lethar-

gisch, krampfend oder moribund, musste eine Euthanasie durchgeführt werden. Da Mäuse oft

symptomlos an einer B. anthracis Infektion versterben, konnte für viele Tiere der genaue Todes-

zeitpunkt nicht ermittelt werden. Die Überlebenszeit umfasste daher den Zeitraum von der

Applikation der Infektion bis zur Feststellung des Todes, respektive der Durchführung der

Euthanasie. Die Identifizierung und eindeutige Zuordnung von Individuen zur Überlebenszeit

erfolgte über Ohrmarkierungen.

46

3. Methoden

3.4.2 Ziegenversuch (Südafrika)

Die Ziegenversuche in Südafrika wurden in Kooperation mit SANParks und der Universität

von Pretoria, Abteilung für veterinäre, tropische Krankheiten, in Zusammenarbeit mit Okechuk-

wu C. Ndumnego, Masterstudent im DFG-Projekt und Tierarzt aus Nigeria, und Dr. Henriette

van Heerden durchgeführt. Dabei oblag Herrn Ndumnego die Vorauswahl, Testung, Impfung

und Blutung der Ziegen, sowie die Vorbereitung der Sporensuspension zur Infektion. Die Appli-

kation und Überwachung der Infektion wurde gemeinschaftlich in Südafrika durchgeführt. Die

serologische Auswertung erfolgt durch die Verfasserin der Arbeit an der Universität Hohen-

heim. Die Herstellung der Antigene zur Vakzinierung und serologischen Analyse vollzog sich

analog zum Mausversuch.

Für den Erwerb der Versuchstiere wurden Burenziegen ohne Krankheits- oder Impfhistorie

bezüglich B. anthracis aus lokalen Beständen auf anti-rPA83 IgG-Titer überprüft und, wenn

keine die Titer niedrig genug oder nicht nachweisbar waren, erstanden. Die Versuchsgruppen

bestanden daher aus einer zufällig ausgesuchten, heterogenen Mischung von 2 – 5 weiblichen

und kastrierten männlicher Burenziegen mit ähnlichem Alter. Für eine eindeutige Identifizie-

rung waren alle Tiere mit Ohrplaketten und entsprechenden Nummern (Nr.) markiert (Abbil-

dung 11). Vor dem Start der Versuchsreihe war der Gesundheitszustand aller Versuchstiere über-

prüft und eine Wurmkur mit Albendazol, Niclosamid und Ivermectin durchgeführt worden.

Die Haltung und Versorgung der Tiere während der Akklimatisierung, Vakzinierung und Blu-

tung oblag den Mitarbeitern der Universität Pretoria. Die Infektion fand in überdachten Außen-

gehegen im Krüger Nationalpark statt (Abbildung 12), da dort aufgrund der Prävalenz von

B. anthracis eine Kontamination durch den Versuch selbst unerheblich war. Der Transport zur

Versuchsanlage fand 5 bis 14 Tage vor der Infektion statt. Die Pflege der Tiere wurde gemein-

47

Abbildung 11: Burenziegen

Burenziegen mit Ohrmarkierungen innerhalb des Versuchsaufbaus

3. Methoden

schaftlich unter Mithilfe der Mitarbeiter des Nationalparks (SANParks) übernommen. Die Ver-

sorgung mit Wasser erfolgte während des gesamten Versuchs ad libitum. Heu und Pellets wur-

den mengenkontrolliert zu geregelten Zeiten verfüttert.

In Tabelle 15 sind alle in Südafrika durchgeführ-

ten Gruppen aufgelistet. Es wurden zwei Protein-

Kombinationen, eine DNA-Kombination, drei Kon-

trollgruppen und drei verschiedene Impfgruppen

mit der kommerziellen SSLV vergleichend in Bu-

renziegen getestet. Ebenfalls Teil des Ziegenver-

suchs waren zwei BALB/c Mausgruppen, bestehend

aus je drei naiven, 8 – 12 Wochen alten, weiblichen

Mäusen, die zur Verifizierung der Infektiösität des

eingesetzten Infektionsstammes verwendet wurden. Eine detaillierte Übersicht zu den Proben-

nahmezeitpunkten, Immunisierungen, Transporten und Infektionen findet sich im Anhang (Ta-

belle 53).

3.4.2.1 Impfung

Die Durchführung der Impfung oblag Herrn DVM Ndumnego. Für die jeweiligen Injektionen

wurde das Tier durch Pflegepersonal liegend am Boden fixiert, sodass der Oberschenkel des

Hinterlaufs frei zugänglich war. Nach der Desinfektion mit Ethanol (70 %) erfolgte die Injekti-

on s. c. in eine Hautfalte im Inguinalbereich. Die Konzentration der zu applizierenden Kompo-

nenten für die Proteinvakzinen betrug entsprechend 500 µg Lipopeptid, je 25 µg rPA83 und

48

Abbildung 12: Außengehege für die Infektion

Infektionsgehege im Krüger Nationalpark

Tabelle 15: Impfgruppen Ziegenversuch (Südafrika)

Die Infektionsdosis bezieht sich auf die Anzahl tatsächlich applizierter Sporen, die über die Auszählung von mindestens zweiüberzähligen Infektionsdosen ermittelt wurde (siehe auch Kapitel 3.2.6)

Gruppe Tierzahl Impfung

1 3 1 ml PBS (1 Mal) 36 62

2 5 SSLV, kommerziell (1 Mal) 850 6

3a 5 SSLV, kommerziell (1 Mal) 850 62

3b 5 SSLV, kommerziell (2 Mal im Abstand von 58 Wochen) 850 4

4 5 844 4

5 5 nicht infiziert -

6 5 844 4

LK 2 500 µg Lipopeptid (1 Mal) 844 11

NK 2 nicht geimpft 172 0

Infektionsdosisa Infektionszeitpunktb

Protein-Kombination mit 500 µg Lipopeptid und je 25 µg rPA83 und rBclA (3 Mal im Abstand von 3 Wochen)

DNA-Kombination mit je 1 mg NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1, pDNAVaccUltra5-CIITA und pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1 (3 Mal im Abstand von 3 Wochen) und 8 Wochen nach der letzten Impfung ein Protein-Boost entsprechend der Dosis von Gruppe 6

Protein-Kombination mit 500 µg Lipopeptid, 108 Sporen FIS und je 25 µg rPA83 und rBclA (3 Mal im Abstand von 3 Wochen)

a Anzahl tatsächlich applizierter Sporen, durch Auszählung der Infektionsdosis ermittelt

b in Wochen nach der letzten Immunisierung

3. Methoden

rBclA, sowie 108 Sporen FIS, wenn diese ein Bestandteil der Vakzine waren. Die Verdünnung

der Vakzinekomponenten erfolgte in sterilem endotoxinfreiem PBS, wobei die Impfdosen einer

Gruppe zusammengefasst angesetzt wurde. Die Planung sah vor, alle Bestandteile der Impfung

zu vermischen und in einem Endvolumen von 1 ml zu applizieren, um eine Zusammenwirkung

aller Bestandteile sicherzustellen. Dies wurde durch die Mitarbeiter vor Ort missverstanden,

sodass alle Vakzinekomponenten der Proteinapplikationen einzeln an die gleiche Stelle, jeweils

in einem Volumen von 1 ml appliziert wurden. Dieser Fehler wurde erst nach Beendigung des

Versuchs und dessen Auswertung realisiert und zog eine Versuchswiederholung (Kapitel 3.4.3)

nach sich.

Die Impfdosen der DNA-Vakzinen umfassten je 1 mg DNA pro Vektor und waren in einer

einzigen 1 ml Dosis i. c. mittels Spritze appliziert worden. Der Protein-Boost, fand analog zu

den Proteinvakzinen statt und war entsprechend ebenfalls suboptimal durchgeführt.

Zur Testung der kapseldefizienten SSLV wurde ein kommerzielles Präparat verwendet, wel-

ches entsprechend der Gebrauchsanweisung des Herstellers zu je 1 ml s. c. injiziert wurde.

Gruppe 1 diente dabei als Vergleichsgruppe, da dieser nur der Verdünnungspuffer (PBS) der

Vakzine injiziert wurde. Einer weiteren Kontrollgruppe waren einmalig 500 µg Lipopeptid ver-

abreicht worden, um adverse Effekte und die unspezifische Schutzwirkung des Adjuvans nach-

zuprüfen.

3.4.2.2 Probennahme

Zur serologischen und diagnostischen Blutabnahme

wurde den Tieren im Versuchszeitraum Blut aus der

Halsvene (Vena jugularis externa) entnommen

(Abbildung 13). Abgesehen von Gruppe 3a/b und 1,

die über den Verlauf von einem Jahr zusätzlich auch

monatlich beprobt wurden, sind alle Ziegen vor dem

Beginn der Immunisierung, vor jeder weiteren

Immunisierung, sowie vor und nach der Infektion

geblutet worden (Details siehe Anhang, Tabelle 53).

Diese Probennahmen umfassten ca. 10 ml Blut, die

mittels Serumröhrchen aufgefangen wurden und der

serologischen Analyse auf Antikörper Titer gegen,

rPA83, rBclA, rLF, FIS und vegetativem Antigen,

sowie TNA dienten. Weitere Blutentnahmen folgten

während der Überwachung der Infektion. Bei Verdachtsmomenten auf eine durchschlagende

49

Abbildung 13: Blutentnahme für Serologie

Blutentnahme vor der Infektion über die Vena jugularisexterna

3. Methoden

Infektion mit B. anthracis waren durch Insulinspritzen zur Diagnostik kleinste Mengen

(~100 µl) an Blut aus der Halsvene zu entnehmen und mittels Blutausstrich (siehe Kapitel

3.4.2.4) auf Bakterien zu überprüfen. Die Verwendung von Insulinspritzen für diese Entnahme

war ohne weiteres möglich und ermöglichte die Durchführung wiederholter Blutentnahmen.

3.4.2.3 Infektion

Die Infektion wurde in zwei Etappen in einer Regi-

on des Krüger Nationalparks durchgeführt, welche

für B. anthracis endemisch ist. Der eingesetzte

Stamm war ein Feldisolat (SD20), welches 2001 aus

dem Ohr eines Schafes isoliert wurde, das im Gebiet

von Standerton, Provinz Mpumalanga, Südafrika an

Milzbrand verendet war. Der Stamm enthielt nach-

weislich die Plasmide pX01 und pX02 und wurde

weiter über mikrobiologische und biochemische

Methoden, sowie Sequenzanalyse charakterisiert

und als B. anthracis verifiziert [181].

Die endgültige Verifikation der Letalität des

Stammes konnte erst im Versuchsgehege des Krüger

Nationalparks durchgeführt werden. Hierfür waren

zwei Gruppen von je drei naiven BALB/c Mäusen

mit 500 (200 µl) und 1000 (400 µl) Sporen, der zur Infektion verwendeten Suspension, i. p.

infiziert worden (Abbildung 14). Die Freigabe der Ziegen zur Infektion geschah erst nach der

einwandfreien Feststellung der Letalität des Stammes. Der Zeitraum zwischen Transport und

Infektion betrug 5 Tage für die Negativkontrolle (NK), 9 Tage für Gruppe 4 und 6 und 14 Tage

für alle anderen Versuchsgruppen (siehe Anhang, Tabelle 53). Die Infektion der Ziegen erfolgte

wie zuvor beschrieben mit verschiedenen Sporenkonzentrationen im Bereich von 36 – 850 Spo-

ren. Analog zum Vorgehen in den Mausversuchen wurden auch hier überzählige Infektionsdo-

sen ausgezählt, um die tatsächliche Menge an applizierten Sporen abschätzen zu können (siehe

Kapitel 3.2.6).

Der Beobachtungszeitraum nach der Infektion umfasste bis zu 14 Tage, wobei todgeweihte

Tiere und Tiere die den Versuchszeitraum überlebten mit Pentobarbital euthanasiert wurden.

Aufgrund der Haltungsbedingungen in einem offenen Gehege konnten die Tiere tagsüber ohne

Unterbrechung überwacht werden. Die Beobachtungsintervalle nachts betrugen 3 Stunden,

wobei kranke und sterbende Tiere gewöhnlich auf sich aufmerksam machten. Daher war für die

50

Abbildung 14: i. p. Injektion Maus

Infektion von BALB/c-Mäusen via i. p. Injektion

3. Methoden

meisten Tiere der Todeszeitpunkt eindeutig feststellbar. Eine Euthanasie war vorzunehmen,

wenn Symptome wie abnormale Atem- und Herzfrequenz, Krampfanfälle, Lethargie, Hämor-

rhagie und Apathie auftraten und ein Nachweis des Erregers im Blut erbracht wurde (siehe

Kapitel 3.4.2.4) bzw. der bevorstehende Tod eindeutig war. Davon ausgeschlossen waren die

Tiere der Kontrollgruppen, da für diese das eindeutige Eintreten des Todes durch den Erreger,

sowie die Feststellung des Todeszeitpunkts durch diesen für die Auswertung essentiell notwen-

dig waren. Die notierte Überlebenszeit umfasste den Zeitraum von der Applikation der Infekti-

on bis zur Feststellung des Todes, respektive der Durchführung der Euthanasie. Verstorbene

Tiere inklusive des sie umgebenden Bodens wurden nach der Identifikation des Tiers und weite-

ren diagnostischen Maßnahmen mit Formalin (10 %) besprüht. Die in Leichensäcke verpackten

Kadaver wurden noch vor Ort kremiert.

3.4.2.4 Diagnostik

Zur Evaluation des Fortschreitens der Infektion wurde das Fress- und Sozialverhalten, die Tem-

peratur und der physiologische Zustand jedes Tieres regelmäßig dokumentiert. Hierfür war täg-

lich morgens bei jedem Tier rektal die Temperatur zu bestimmen. Anschließend und nochmals

nachmittags wurde die Fütterung unter Beobachtung und Dokumentation des Verhaltens vorge-

nommen. Die Beobachtung der Tiere war tagsüber uneingeschränkt möglich und wurde entspre-

chend fortdauernd protokolliert. Bei auffälligen Tieren mit erhöhter Temperatur (> 40 °C) oder

gestörtem Sozial- und Fressverhalten wurde die Frequenz der Temperaturmessung erhöht und

jeweils im Zuge der Messung eine kleine Menge Blut (~100 µl) zur Analyse entnommen.

Ein Tropfen des frischen Blutes wurde auf einen Objektträger aufgetragen und mittels eines

zweiten Objektträgers verschmiert, um einen Blutausstrich anzufertigen (Abbildung 15). Diese

möglichst dünne Blutschicht musste zunächst luftgetrocknet und anschließend in purem Metha-

nol für 1 – 2 min fixiert werden. Danach erfolgte die Inkubation mit Azur B [231] für 1 – 5 min.

Nach dem Abspülen der Färbelösung und Trocknung des Objektträgers konnte dieser unter dem

Mikroskop auf angefärbte, bekapselte Bakterien untersucht werden. Über diese Methode war

eine Detektion von Bakterien im Blut in weniger als einer Stunde möglich, wobei in Einzelfäl-

len zu Verifikation ebenfalls ein Ausstrich auf CBA durchgeführt wurde. Im Falle der einwand-

freien Detektion von Bakterien im Blut war eine Euthanasie des jeweiligen Tieres umgehend

vorzunehmen. Davon ausgeschlossen waren die Kontrollgruppen, da für diese der Todeszeit-

punkt unverfälscht ermittelt werden musste. Zur Verifikation der Todesursache wurde bei ver-

storbenen Tieren über das Anritzen des Ohres ebenfalls ein Blutausstrich angefertigt, um den

Nachweis einer systemischen Infektion mit B. anthracis zu erbringen. Die entsprechende

51

3. Methoden

Abwesenheit des Erregers in Überlebenden galt als aussagekräftiger Beweis für deren Klärung

der Infektion und Klassifizierung als Überlebende.

3.4.3 Wiederholung der Ziegenversuche (Türkei)

Bei der Nachbetrachtung der Ziegenversuche in Südafrika war aufgefallen, dass die Immunisie-

rung der Gruppen 4 und 6 nicht wie geplant durchgeführt worden war, das heißt die Impfkom-

ponenten einzeln und nicht wie erforderlich in Mischung appliziert worden waren. Da sich die

Möglichkeit ergab, in Kooperation mit der Kafkas Universität (Kars, Türkei) unter der Leitung

von Prof. Dr. Mitat Şahin einen weiteren Infektionsversuch vorzunehmen, wurden die Grup-

pen 4 und 6 zu je 10 Tieren zusammen mit einer Negativkontrolle (NK (W)) bestehend aus

5 Tieren in einem verbesserten Ansatz wiederholt (Tabelle 16). Der generelle Versuchsaufbau

im Sinne der Vorbereitung, Durchführung, Probennahme, Diagnostik, Nachbereitung und Aus-

wertung erfolgte analog der zuvor beschriebenen Ziegenversuche mit geringfügigen Optimie-

rungen.

Die Vorauswahl, Testung, Impfung und Blutung der Ziegen, sowie die Vorbereitung der Spo-

rensuspension zur Infektion oblag den Mitarbeitern der Kafkas Universität, angeleitet durch die

Tierärzte Dr. Fatih Büyük und Dr. Özgür Ҫelebi. Die Applikation und Überwachung der Infekti-

on wurde zusammen mit Herrn O.C. Ndumnego in den Versuchsanlagen der Kafkas Universität

durchgeführt. Die Herstellung der Antigene und die serologische Auswertung der Versuche

52

Abbildung 15: Färbung von Blutausstrichen mit Azur B

Abgebildet sind die verschiedenen Schritte einer Färbung mit Azur B, beginnend mit dem Trocknen und Fixieren eines dünnenBlutausstriches (A), der Färbung mit Azur B und anschließender Spülung (B) und abschließend mit der Mikroskopie (C). Entsprechendder Färbeintensität war der Zellkörper und die umgebende Kapsel als ballonartige, rosafarbene Struktur angefärbt.

3. Methoden

erfolgte durch die Verfasserin der Arbeit an der Universität Hohenheim, analog zum Maus- und

Ziegenversuch in Südafrika.

Die zur Immunisierung verwendeten Tiere stellten eine heterogene Gruppe aus männlichen und

weiblichen Ziegen unterschiedlichen Alters (ca. 1 – 3 Jahre) und unterschiedlicher Rassen dar.

Im Gegensatz zu den Bedingungen des Versuchs in Südafrika wurden die Ziegen während der

gesamten Versuchsdurchführung in einer abgeschlossenen Stallanlage gehalten, bei der für den

Zeitraum der Immunisierung ebenfalls ein großzügiges Außengehege frei zugänglich war.

Damit entfiel die Notwendigkeit für einen Transport innerhalb des Versuchs. Die Impfung der

zufällig zusammengestellten Gruppen erfolgte dreimal im Abstand von 3 Wochen nach einer

Eingewöhnungszeit von einem Monat, während der eine Wurmkur mit Ivermectin und Depo-

min vorgenommen wurde. Die Dosis der Antigene rPA83 und rBclA wurde im Vergleich zum

Vorversuch von 25 µg auf 75 µg pro Dosis angehoben, um eine verbesserte Wirksamkeit zu

erreichen. Damit betrug die Konzentration der zu applizierenden Komponenten entsprechend

500 µg Lipopeptid, je 75 µg rPA83 und rBclA für Gruppe 4 (W), sowie zusätzlich 108 FIS für

Gruppe 6 (W). Die NK (W) erhielt keinerlei Immunisierung. Zur Vermeidung erneuter Applika-

tionsfehler wurden die Impfdosen an der Universität Hohenheim angefertigt und die Applikati-

on der ersten Immunisierung durch die Verfasserin der Arbeit angeleitet. Probennahmen zur

Serumanalyse wurden vor jeder Impfung, vor der Infektion und nach dem Überleben der Infek-

tion vorgenommen. Eine detaillierte Übersicht zum Ablauf befindet sich im Anhang (Tabel-

le 54).

Im Zeitraum der Immunisierungen fielen insgesamt 3 Ziegen durch den gewährten Freigang

im Außengehege einheimischen Prädatoren zum Opfer. Zwei Tiere aus Gruppe 4 (W) verstar-

ben im Zeitraum zwischen zweiter und dritter Immunisierung und ein Tier der NK (W) verstarb

zwischen der dritten Immunisierung und der Infektion. Die serologischen Daten dieser Ziegen

wurden bis zu Ihrem Ausscheiden aus dem Versuch in alle Betrachtungen mit einbezogen und

sind entsprechend gekennzeichnet.

53

Tabelle 16: Wiederholung der Ziegenversuche (Türkei) – Impfgruppen

Die Infektionsdosis bezieht sich auf die Anzahl tatsächlich applizierter Sporen, welche über die Auszählung von mindestenszwei überzähligen Infektionsdosen ermittelt wurde (siehe auch Kapitel 3.2.6); (W) – dient zur Unterscheidung derwiederholten Gruppen

Gruppe Impfung

4 (W) 10 (8) 918 5

6 (W) 10 (10) 918 5

NK (W) 5 (4) nicht geimpft 0

Tierzahla Infektionsdosisb Infektionszeitpunktd

Protein-Kombination mit 500 µg Lipopeptid und je 75 µg rPA83 und rBclA (3 Mal im Abstand von 3 Wochen)

Protein-Kombination mit 500 µg Lipopeptid, 108 Sporen FIS und je 75 µg rPA83 und rBclA (3 Mal im Abstand von 3 Wochen)

1027 (918)c

a initial immunisierte Tierzahl (infizierte Tierzahl)

b Anzahl tatsächlich applizierter Sporen, durch Auszählung der Infektionsdosis ermittelt

c wurde in 2 Etappen zu je 2 Tieren infiziert

d in Wochen nach der letzten Immunisierung

3. Methoden

Zur Infektion standen daher nur 8 Tiere für Gruppe 4 (W), 10 Tiere für Gruppe 6 (W) und

4 Tiere für die NK (W) zur Verfügung. Die Infektion erfolgte mit Stamm K-136, einem Feldiso-

lat der Region. Dieses war durch die Mitarbeiter der Kafkas Universität aus der Milz eines an

Milzbrand verstorbenen Rinds isoliert und mittels Nachweis der virulenzvermittelnden Plasmi-

de pX01 und pX02 identifiziert worden. Der Nachweis der Virulenz erfolgte in Mäusen durch

Prof. Dr. Mehmet Doğanay an der Erciyes Universität (Kayseri, Türkei). In Anlehnung an die

verwendete Infektionsdosis der Ziegenversuche in Südafrika wurde auch hier eine Dosis von

~1000 Sporen angestrebt. Die Infektion aller Tiere wurde mittels einer Sporensuspension

durchgeführt, die eine Konzentration von 1255 Sporen/ml aufwies. Entsprechend der vorherge-

henden Versuche waren auch hier überzählige Infektionsdosen bei jeder Infektion ausgezählt

worden, wodurch sich die in Tabelle 16 angegebenen leicht veränderten Konzentrationen erga-

ben. Da der Infektionsstamm K-136 bisher nur in Mäusen erprobt worden war, wurde die Infek-

tion zunächst exemplarisch an zwei zufällig ausgewählten Ziegen der NK (W) erprobt. Hierfür

wurden die Ziegen von der Herde abgetrennt und in einem abgeschlossenen Bereich der Stal-

lungen gehalten. Nach der Verifikation der Virulenz waren die verbleibenden Ziegen der

NK (W) sowie die Ziegen der Gruppe 4 (W) und 6 (W) in gleicher Art infiziert worden. Auf-

grund dieser Staffelung ergaben sich für die Angaben zu diesem Probenzeitpunkt und die Kon-

zentration der ausgezählten Infektionsdosen Schwankungen.

3.5 Serologische Analyseverfahren

3.5.1 Blutaufbereitung

Blutentnahmen für die Serologie wurden entweder bereits mit Serumröhrchen durchgeführt

oder nach der Entnahme zur Gerinnung und Absetzung für 1 – 2 h bei 4 °C inkubiert. Die

anschließende Zentrifugation bei 2000 x g und 4 °C für 10 min diente zur Sedimentation des

Blutkuchens, wonach das aufliegende Serum in ein frisches Gefäß überführt wurde. Die Lage-

rung der gewonnenen Seren erfolgte bis zur Verwendung bei -80 °C, wobei größere Mengen

zuvor gemischt und aliquotiert wurden.

3.5.2 Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)

Zur Evaluation der Wirksamkeit der eingesetzten Impfstoffe wurden Seren der immunisierten

Tiere auf detektierbare Antikörper gegen verschiedene Antigene im ELISA überprüft. Zunächst

mussten hierfür 96-Well-Platten mit 0,5 µg Antigen in 100 µl Beschichtungspuffer pro Kavität

befüllt und üN abgedeckt bei 4 °C inkubiert werden. Beschichtungen mit FIS wurden mit 108

Zellen pro Kavität bei 37 °C durchgeführt. Am Folgetag wurden die Platten zweimal mit

54

3. Methoden

Waschpuffer durch ein Plattenwaschgerät gewaschen und danach mit 100 µl Blocklösung pro

Kavität für 1 h bei RT inkubiert. Nach zwei weiteren Waschzyklen konnten die Platten mit den

vorbereiteten Seren und Kontrollen belegt werden. Die Seren wurden auf den Platten, gewöhn-

lich beginnend mit einer Konzentration von 1 : 100, im Doppelansatz über 8 bzw. 12 log2 Stu-

fen in Blocklösung reihenverdünnt (siehe Abbildung 16). Abweichungen von der Startkonzen-

tration waren durch das Volumen des vorhandenen Serums oder den zu erwartenden Titerwerten

bedingt. Ein Positivserum mit bekanntem Titer war zu Vergleichszwecken im Einfachansatz

austitriert auf jeder Platte mitzuführen, ebenfalls ein entsprechendes Negativserum als Einzel-

punktmessung im Doppelansatz. Jede Platte enthielt zudem mindestens sechs Parallelansätze

für Blindproben, denen anstatt einer Serumprobe nur die Blocklösung zugefügt wurde. Die

Belegung der Platten erfolgte so, dass das Endvolumen in allen Kavitäten 100 µl betrug. Nach

einer Inkubation von 2 h bei RT wurden die Platten fünfmal gewaschen. Im nächsten Schritt

war der sekundäre Antikörper in Blocklösung zu je 100 µl pro Kavität aufzutragen, welcher

entsprechend der zu testenden Tierart und nachzuweisenden Antikörperklasse variabel war

(Details siehe Material, S. 27).

Alle sekundären Antikörper waren

HRP konjugiert und wurden in unter-

schiedlichen Konzentrationen ent-

sprechend der individuellen Wirk-

samkeit eingesetzt. Diese war zuvor

durch einen Schachbretttest für jeden

sekundären Antikörper ermittelt wor-

den. Hierbei wurde ein bekanntes po-

sitives Serum in 10 Parallelansätzen (entsprechend Abbildung 16, links) austitriert und der zu

testende sekundäre Antikörper um 90° versetzt ebenso (ähnlich Abbildung 16, rechts). Die Kon-

zentration des sekundären Antikörpers, die den Titer des Vergleichsserums korrekt wiedergab,

bzw. am effektivsten funktionierte, ergab die einzusetzende Konzentration, wenn diese auch bei

einem Negativserum unreaktiv blieb.

Nach einer weiteren Inkubation für 1 h bei RT wurden die Platten sechsmal gewaschen.

Anschließend erfolgte die Zugabe von je 100 µl ABTS-Lösung zu jeder Kavität, welche durch

die Anwesenheit des sekundären Antikörpers einen Farbumschlag zu dunkelgrün zeigt. Da die-

se Reaktion ebenfalls durch Licht katalysiert werden kann, fand die Inkubation für 30 min im

Dunkeln statt. Abschließend wurde die OD bei 414 nm in einem Plattenlesegerät gemessen.

Für die Auswertung war der Mittelwert der Blindproben von allen Werten abzuziehen. Die

so normierten OD-Werte der Seren wurden gemittelt und anschließend in SigmaPlot gegen die

Verdünnungsstufen aufgetragen. Der ELISA-Titer war als reziproker Wert der Verdünnung

55

Abbildung 16: ELISA-Schema

Titration über 8 (links) und 12 (rechts) Stufen; orange/gelb – Reihenverdünnungder Testseren; rot/rosa – positives Kontrollserum; grün – Negativkontrolle;grau – Blindprobe

3. Methoden

deklariert, welcher eine OD414 nm von 0,1 zeigte, da dies der maschinelle Schwellenwert für die

Nachweisgrenze ist. Das eingesetzte positive Kontrollserum musste auf jeder Platte den korrek-

ten Titerwert mit einem Spielraum von einer Titerstufe anzeigen, damit die Ergebnisse der Plat-

te gewertet wurden. Entsprechend musste das Negativserum unter der Nachweisgrenze bleiben

bzw. dem etabliertem unspezifischen Hintergrundwert entsprechen.

3.5.3 Handhabung der Makrophagenzelllinie J774A.1

Alle Arbeiten mit der murinen Makrophagenzelllinie J774A.1 wurden unter einer Sterilbank

durchgeführt. Die Zellkultur betreffende Gerätschaften, sowie die Arbeitsfläche und Handschu-

he sind vor Gebrauch mit Ethanol (70 %) desinfiziert worden. Vor der Verwendung in der Zell-

kultur waren die einzusetzenden Medien im Wasserbad auf ca. 37 °C zu erhitzen. Die Anzucht,

Erhaltung und Vermehrung der Zelllinie erfolgte entsprechend des Bedarfs nach standardisier-

ten Methoden [15] in Zellkulturflaschen mit 100, 200 und 500 ml Volumen bei 37 % und 5 %

CO2.

3.5.4 Toxin-Neutralisations-Assay (TNA)

Der hier beschriebene Test richtet sich nach den publizierten Angaben des USAMRIID mit ent-

sprechenden Labor-bedingten Anpassungen. Während im ELISA die anti-Toxin Antikörper

quantitativ bestimmt werden können, wird im TNA eine Aussage über deren Qualität möglich.

Behindern gebildete Antikörper, neben ihrer Eigenschaft die Antigene zu markieren, die Funkti-

on der Milzbrandtoxine, spricht man von neutralisierenden Antikörpern. Im TNA kann daher

die Fähigkeit von Seren oder spezifischen Antikörpern ermittelt werden, Makrophagen konzen-

trationsabhängig vor der Giftwirkung des Letaltoxins zu schützen.

Zunächst wurde eine Konzentration von 5 * 105 Zellen/ml

in Wachstumsmedium hergestellt und zu 200 µl pro Kavität in

einer sterilen 96-Well-Platte ausgesät, die danach üN inkubier-

te. Dabei waren auf jeder Platte drei Kavitäten für die Blind-

proben zellfrei zu belassen (Abbildung 17). Zur Vorbereitung

der zu testenden Seren waren diese vor der Verwendung im

TNA im Heizblock für 30 min bei 56 °C zu inaktivieren. Am

Folgetag wurde auf einer separaten, sterilen 96-Well-Platte eine

Reihenverdünnung über 8 log2 Stufen der zu testenden Seren

im Versuchsmedium, versetzt mit 500 ng/ml PA und 100 ng/ml LF, angefertigt (Startkonzentra-

tion 1 : 50 bzw. 1 : 100). Abweichungen von der Startkonzentration waren durch das Volumen

56

Abbildung 17: TNA-Belegungschema

orange/gelb – Reihenverdünnung derTestseren; rot/rosa – positivesKontrollserum; grün – Mediumkontrolle;blau – Toxinkontrolle; grau – Blindprobe

3. Methoden

des vorhandenen Serums oder den zu erwartenden Titerwerten bedingt. Zusätzlich zu den zu

testenden Seren im Doppelansatz enthielt jede Platte (Abbildung 17) ein positives Kontrollse-

rum im Einfachansatz, sowie nicht titrierte Einzelmessungen für die Toxinkontrolle (Versuchs-

medium mit PA und LF, Zellen, kein Serum), die Mediumkontrolle (Versuchsmedium ohne PA

und LF, Zellen, kein Serum) und die Blindproben zum Abgleich des unspezifischen Hinter-

grunds (Versuchsmedium ohne PA und LF, keine Zellen, kein Serum). Die so vorgelegte Platte

wurde für eine Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um die Antikörper-Toxin-Wirkung vor

dem Kontakt mit den Makrophagen zu gewährleisten. Im Anschluss wurden beginnend mit der

niedrigsten Serumkonzentration je 100 µl dieser vor-inkubierten Toxinplatte 1 : 1 auf die Platte

mit den angewachsenen Makrophagen übertragen, nachdem das Wachstumsmedium dort voll-

ständig von den Zellen abgenommen war. Nach einer weiteren Inkubation für 3 h bei 37 °C und

5 % CO2, erfolgte die Zugabe von 25 µl MTT (5 mg/ml in PBS) zu jeder Kavität. Dieser Farb-

stoff wird von lebenden Zellen in dunkelviolette Farbkristalle umgewandelt und ermöglicht so

den Nachweis der schützenden Wirkung der Antikörper, so sie vorhanden sind. Für die Umset-

zung des Farbstoffs wurden die Zellen weitere 2 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Vor der

photometrischen Messung des Farbumschlags (gelb/braun) erfolgte eine Lyse der Zellen durch

Zugabe von 100 µl Lysepuffer zu jeder Kavität. Nach Bereinigung der durch die Mischung ent-

standenen Bläschen wurde die OD über ein Plattenlesegerät bei 540 nm gemessen.

Zur Ermittlung des Neutralisationstiters aus den gemessenen Werten war der Durchschnitts-

wert der Blindproben von allen Werten abzuziehen. Die gemittelte Mediumkontrolle stellte den

100 %-Wert für das Überleben dar, analog die Toxinkontrolle den 0 %-Wert. Alle gemessenen

Werte der Reihenverdünnung für die unbekannten Seren und die Positivkontrolle wurden mit

der Formel: (ODProbe - ODToxinkontrolle) / (ODMediumkontrolle - ODToxinkontrolle) * 100 normalisiert wodurch

sich für jede eingesetzte Konzentration ein prozentualer Wert für das Überleben der Zellen

ergab. Dabei wird der Neutralisationstiter als reziproker Wert der Serumverdünnung mit 50 %

Schutzwirkung definiert. Diese Verdünnungsstufe wurde mit Hilfe des SigmaPlot Regression

Wizard über eine sigmoide Regressionskurve (mit 4 Parametern) bestimmt.

3.6 Statistik

Für die Betrachtung des Ausgangs der Infektion wurden die Sterbedaten zwischen verschiede-

nen Gruppen im Log-rank-Test miteinander verglichen. Als ausschlaggebende Zeitintervalle

galten volle überlebte Tage. Die Überlebenszeit ergab sich aus dem Zeitintervall vom Beginn

der Infektion bis zu dem Zeitpunkt an dem das Tier tot aufgefunden bzw. euthanasiert oder

behandelt wurde.

Zum Vergleich der serologischen Daten der Gruppen untereinander wurden im Falle der Zie-

genversuche die zu verschiedenen Zeitpunkten gemessenen Titer zunächst gegen die eigenen

57

3. Methoden

unspezifischen Hintergrundtiter der Woche 0 normalisiert und im ungepaarten, zweiseitigen

t-Test auf signifikante Unterschiede geprüft. Bei den Mausversuchen wurde auf eine Normali-

sierung verzichtet, da nahezu keine unspezifischen Hintergrundtiter detektierbar waren. Bei

gruppeninternen Vergleichen wurden die in den Tabellen ange-

gebenen, nicht normalisierten Werte verwendet, damit ein statis-

tische Abgleich zu den unspezifischen Hintergrundtitern erfol-

gen konnte. Hierfür war ein gepaarter, zweiseitige t-Test bzw.

der Spearman Rangkorrelationskoeffizient (rs) zu verwenden.

Der rs diente zur Abschätzung von Korrelationen zwischen

gemessenen Titern untereinander, sowie der Überlebenszeit.

Dabei wird jedem gemessenen Wert einer Datenreihe entspre-

chend der Höhe ein Rang zugewiesen und paarweise mit anderen, gleichgroßen Datenreihen

verglichen. Eine Korrelation ist um so stärker, je näher der rs-Wert an ±1 liegt. Die Signifikanz

dieser Korrelation ist schwellenabhängig bezüglich der Anzahl der Werte der Datenreihe, im

vorliegenden Fall also der Individuenzahl.

Allen statistischen Berechnungen wurde eine Signifikanzschwelle von p ≤ 0,05 zugrunde

gelegt. Die entsprechenden rs-Werte sind Tabelle 17 zu entnehmen. Die Berechnungen erfolgten

mittels SigmaPlot. Angegebenen Mittelwerte sind arithmetische Mittel, welche wenn nötig in

den Abbildungen durch einen positiv gerichtete Standardabweichung ergänzt sind.

58

Tabelle 17: Schwellenwerte

rs-Schwellen für p ≤ 0,05 ; rs-Werteunterhalb der angegebenen Werte für dieentsprechende Tierzahl sind nichtsignifikant

Anzahl der Individuen

4 1,000

5 0,900

6 0,829

7 0,714

8 0,643

9 0,600

10 0,564

rs - Schwelle

4. Ergebnisse und Diskussion

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Testung von Vakzinekomponenten im NMRI-Mausmodell

Zur serologischen Evaluation der Vakzine wurden Antikörpertiter gegen rPA83, rBclA, rLF, die

Kapsel und FIS mit den Subklassen IgG, IgG1 und IgG2a entsprechend der eingesetzten Vakzi-

nekomponenten im Serum jeder Maus mittels ELISA gemessen. Zur qualitativen Bewertung der

Toxin-Antikörpertiter ist außerdem der Neutralisationstiter über einen TNA bestimmt worden.

Die Messungen wurden, soweit nicht anders beschrieben, für die Seren vor der Impfung (Nega-

tivseren) und direkt vor der Infektion durchgeführt. Detaillierte Titer-Werte der Negativseren

sind allerdings nur in Einzelfällen angegeben. Soweit nicht anders vermerkt, konnten keine

unspezifischen Hintergrundtiter für die Negativseren nachgewiesen werden.

Generell wurden für jedes Tier Einzelwerte gegen diejenigen Antigene bestimmt, mit denen

die jeweilige Gruppe immunisiert wurde. Eine Mischprobe der vereinigten Seren einer Gruppe

kam zum Einsatz als Abgleich zum Negativserum oder zusätzlicher Antigene, die nicht Be-

standteil der jeweiligen Vakzinekomposition waren. Diese sind zusammen mit den Einzelmes-

sungen als Gruppengesamttiter in den Wertetabellen der jeweiligen Gruppe vermerkt. Die Dar-

stellung der Messwerte innerhalb der Gruppenbeschreibung erfolgte nur für die entsprechend

der jeweiligen Immunisierung relevanten Titer jeder Gruppe. Zunächst sind die serologischen

Ergebnisse aller Mausgruppen (unterteilt in Protein- und DNA-Vakzinen) einzeln aufgeführt

und werden in den nachfolgenden Kapiteln gemäß der Schutzraten und Immunogenität unter-

einander verglichen.

4.1.1 Einzelbetrachtungen der Impfung von Mäusen mit Vakzinen auf Proteinbasis

Für diesen Teil der Studie wurden Protein-basierende Vakzine zunächst einzeln und später in

Kombination im NMRI-Mausmodell geprüft. Die eingesetzten Adjuvanzien umfassten das

Lipopeptid und, als Kombination von Vakzine und Adjuvans, das Kapselkonjugat.

Das Lipopeptid wurde mit 50 µg und FIS mit 108 Sporen pro Dosis eingesetzt, so sie

Bestandteil der Impfung waren. Alle weiteren Komponenten waren in einer Menge von 25 µg

pro Dosis beigefügt. Die Applikation der Dosen mit einem Gesamtvolumen von 200 µl erfolgte

unter Betäubung s. c. in den Nacken. Die Infektion fand analog mit ~1000 bzw. ~2000 Sporen

eines voll virulenten Stammes (Ames) statt. Für Vergleichszwecke wurden zwei Kontrollgrup-

pen mit entsprechend unterschiedlichen Infektionsdosen mitgeführt.

59


4.1.1.1 Mausgruppe LN-1000 (Lipopeptid)

Eine Gruppe von 5 Mäusen wurde wie zuvor beschrie-

ben dreimal mit dem Lipopeptid paramunisiert und mit

840 Sporen (~25LD50) eines voll virulenten Ames Stam-

mes infiziert. Diese Gruppe diente als negative Ver-

gleichsgruppe für alle Proteingruppen, die ebenfalls mit

~1000 Sporen infiziert wurden. Für diese Gruppe wurde

nur einmal direkt vor der Infektion Blut abgenommen

und in einer Mischprobe der Gruppe analysiert.

Wie in Tabelle 18 ersichtlich, waren die gemessenen

Titer mit < 100/200 bis auf den anti-Kapsel IgG-Titer,

der mit 360 ebenfalls nur gering ausfiel, unter der Nach-

weisgrenze der jeweiligen Tests. Da bereits beim Test

auf IgG keine bzw. nur geringe Titer gemessen wurden, ist von einem Test auf IgG1- oder

IgG2a-Antikörper abgesehen worden. Alle eingesetzten Mäuse dieser Gruppe verstarben

3 – 5 Tage nach der Infektion (dpi). Da nur mit dem Adjuvans paramunisiert wurde, waren kei-

nerlei Titer oder Überlebende zu erwarten.

4.1.1.2 Mausgruppe NC (Kapselkonjugat)

Eine Gruppe von 10 Mäusen wurde wie zuvor

beschrieben dreimal mit einem Kapselkonju-

gat geimpft und mit 840 Sporen (~25LD50) ei-

nes voll virulenten Stammes (Ames) infiziert.

Die gemessenen Titer vor der Infektion sind in

Tabelle 19 einzusehen. Durch die Immunisie-

rung konnten die anti-Kapsel IgG-Titer in eini-

gen Individuen bestenfalls leicht erhöht wer-

den, wenngleich sie nur in einem Bereich

knapp oberhalb der Nachweisgrenze lagen.

Bei allen anderen getesteten Antigenen ergab

sich durch die Immunisierung keine Verände-

rung. Ebenso gab es keine nachweisbaren Sub-

klassentiter gegen die Kapsel.

Einige Seren konnten aufgrund ihres geringen Volumens nicht mit optimalen Ausgangskon-

zentrationen getestet werden. Von neun infizierten Mäusen verstarben acht nach 2 – 4 dpi. Maus

Nr. 502 überlebte die Infektion komplett. Auf eine grafische Darstellung der Werte wurde auf-

60

Tabelle 19: Mausgruppe NC

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe NC vor der Infektion, sowieEintritt des Todes in dpi. Titer-Werte ergeben sich als reziprokerWert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. DieÜberwachung des Überlebens erfolgte bis 21 dpi. Überlebende sindentsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange;M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung

rBclA rPA83 TNA Kapsel FIS Tod in

IgG IgG IgG IgG1 IgG2a IgG dpi

<400 <100 <100

<200 <200 <200

<100

-

482 <400 <400 <400 4

483 <100 <100 <100 3

484 100 <100 <100 2

485 <100 <100 <100 3

486 552 <100 <100 3

487 <100 <100 <100 3

488 100 <200 <200 3

499 257 <100 <100 4

502 142 <100 <100 -

M - - - 115 - - - 3,1

S - - - 56 - - - 0,6

Maus Nr.

481a

a erhielt zur 2. Impfung versehentlich 2 Dosen und starb bei der Applikation der Infektion am Narkotikum; serologische Daten dieser Maus flossen in die Betrachtungen mit ein, Daten zum Überleben entsprechend nicht

Tabelle 18: Mausgruppe LN-1000

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe LN-1000 vorder Infektion als vereinigte Mischprobe der Gruppegemessen, sowie Eintritt des Todes in Tagen nach derInfektion (dpi); Titer-Werte ergeben sich alsreziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe miteiner OD404nm ≥ 0,1; Verstorbene sind entsprechendorange hinterlegt; M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung

TNA

501

<200 <100 <100 360 <100

4

3

4

489 3

490 5

M - - - - - 3,8

S - - - - - 1,0

Maus Nr.

rBclA IgG

rPA83 IgG

Kapsel IgG

FIS IgG

Tod in dpi

493a

494b

a verlor zwischen 2. und 3. Impfung ein Auge

b erlitt bei der Infektion einen Herzstillstand und konnte wiederbelebt werden


grund der niedrigen Titer verzichtet. Serologisch waren keine Unterschiede zwischen überle-

benden und verstorbenen Tieren zu erkennen.

4.1.1.3 Mausgruppe NCP (Kapselkonjugat; rPA83)


beschrieben drei Mal mit einer Mischung aus

dem Kapselkonjugat und rPA83 geimpft und

mit 901 Sporen (~25LD50) eines voll virulen-

ten Stammes (Ames) infiziert. Durch die

Immunisierung konnten bei allen Mäusen im

Vergleich zum Negativserum signifikant höhe-

re und relativ homogene anti-rPA83 IgG-,

IgG1-Titer, sowie Neutralisationstiter erzeugt

werden (Tabelle 20; Abbildung 18). Die IgG-

Titer gegen rPA83 waren dabei auch signifi-

kant höher als die IgG1- und IgG2a-Titer, wel-

che sich untereinander ebenfalls signifikant unterschieden (p ≤ 0,004). Hierbei schien der Anteil

der IgG1- bzw. IgG2a-Titer nur einen kleinen Teil der Gesamt-IgG auszumachen. Bezüglich

rPA83 und in Tendenz auch für das Kapselkonjugat war allerdings eine deutliche Gewichtung

zur IgG1 Subklasse sichtbar. Eine Korrelation zwischen TNA-Titern und anti-rPA83 IgG- und

IgG1-Titern gab es nicht (rs ≤ +0,361).

61

Abbildung 18: Mausgruppe NCP

Halblogarithmische Auftragung der Antikörpertiter; Titerwertenunterhalb der Nachweisgrenze wurde ein Betrag von 1 zugewiesen;* markiert signifikant erhöhte Titer im Vergleich zum Negativserum

Tabelle 20: Mausgruppe NCP

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe NCP vor der Infektion, sowie Eintritt des Todes in dpi.Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1.Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis 21 dpi. Überlebende sind entsprechend grünhinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung


IgG IgG IgG1 IgG2a IgG IgG1 IgG2a IgG dpi

57

347

350000 165161 1858 16119 648 3200 <400

<200

-

58 256000 57806 400 19353 <400 1973 <400 -

59 122181 71019 <400 2281 <400 <200 <400 -

60 197818 38812 <400 3909 1241 6400 <400 13

61 453818 51200 658 5046 <400 <200 <400 -

256000 112309 903 4218 <400 200 <400 -

63 512000 62761 <400 3909 <400 <200 <400 6

64 350000 87535 <400 7628 <400 200 <400 -

65 256000 14864 <400 4189 <400 <200 <400 2

66 512000 67716 <400 5507 <400 <200 <400 -

M - 326582 72918 382 7216 189 1197 - - 7

S - 133063 41689 615 5761 422 2130 - - 6

Maus Nr.

62a

a Negativserum wies anti-rPA83 IgG-Titer von 217 auf


In Abbildung 18 sind die für diese Gruppe wichtigen Titer noch einmal graphisch dargestellt.

Die gemessenen anti-Kapsel Titer, wie auch die anti-rPA83 IgG2a-Titer waren zwar erhöht,

allerdings nicht bei allen Individuen und auch in keinem Fall signifikant (p ≥ 0,098). Die Infek-

tion überlebten 7 von 10 Mäusen, wobei ebenfalls die Anzahl der überlebten Tage für die ver-

storbenen Tiere durch die Impfung teilweise erhöht werden konnte. Eine signifikante Korrelati-

on zwischen der Überlebenszeit und den gemessenen Titern bestand nur für die anti-rPA83

IgG1-Titer, welche schwach korrelierten (rs = +0,697).

4.1.1.4 Mausgruppe LN-2000 (Lipopeptid)

Eine Gruppe von 5 Mäusen wurde wie zuvor beschrieben dreimal mit dem Lipopeptid paramu-

nisert und mit 1990 Sporen (~50LD50) eines voll virulenten Stammes (Ames) infiziert. Diese

Gruppe diente zum Negativabgleich aller Proteingruppen bei denen ebenfalls eine Infektion mit

~2000 Sporen erfolgte.

Wie in Tabelle 21 ersichtlich, waren die gesamtheitlich als vereinigte Mischprobe der Grup-

pe gemessenen Titer mit < 100/200 bis auf den anti-Kapsel IgG-Titer unter der Nachweisgrenze

der jeweiligen Tests. Da bereits beim Test auf IgG keine bzw. nur geringe Titer gemessen wur-

den, ist von einem Test auf IgG1- oder IgG2a-Antikörper abgesehen worden. Im Gegensatz zur

Gruppe LN-1000 wurde hier ebenso das Serum vor der

Paramunisierung als vereinigte Mischprobe der Gruppe

untersucht und ergab keine relevanten IgG-Titer gegen

die jeweiligen Antigene. Hierbei ist hervorzuheben, dass

dies auch für den anti-Kapsel IgG-Titer (< 100) galt, der

nach der Paramunisierung immerhin oberhalb der Nach-

weisgrenze messbar war. Von den eingesetzten Mäusen

sind vier bis zum 3. Tag nach der Infektion verstorben,

Maus Nr. 5 zeigte zwar ab dem 3. Tag großflächige Öde-

me und andere leichte Krankheitssymptome, verstarb

aber erst am Tag 10.

4.1.1.5 Mausgruppe LB (Lipopeptid und rBclA)

Eine Gruppe von 10 Mäusen wurde wie zuvor beschrieben dreimal mit einer Mischung aus dem

Lipopeptid und rBclA geimpft und mit 2020 Sporen (~50LD50) eines voll virulenten Stammes

(Ames) infiziert. Durch die Immunisierung mit rBclA konnte in allen Individuen ein signifikant

(p ≤ 0,001) erhöhter IgG- bzw. IgG1-Titer gegen rBclA erzeugt werden (siehe Tabelle 22). Die

entsprechenden IgG2a-Titer waren ebenfalls erhöht, aber stark gestreut und nicht signifikant

62

Tabelle 21: Mausgruppe LN-2000

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe LN-2000 vorder Infektion als vereinigte Mischprobe der Gruppegemessen, sowie Eintritt des Todes in dpi; Titer-Werteergeben sich als reziproker Wert der letztenVerdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1;Verstorbene sind entsprechend orange hinterlegt;M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung

TNA

1

<200 <100 <100 340 <200

3

2 3

3 3

4 2

5 10

M - - - - - 4,2

S - - - - - 3,3

Maus Nr.

rBclA IgG

rPA83 IgG

Kapsel IgG

FIS IgG

Tod in dpi


(p = 0,08). Interessanterweise konnte ebenso ein hoher anti-FIS IgG-Titer über die Detektion

von BclA-Filamenten im FIS erzeugt werden. Wie auch schon in anderen Gruppen beschrieben,

war zudem ein leichter Titer gegen die Kapsel messbar, der bereits vor der Immunisierung im

Negativserum als unspezifischer Hintergrundtiter nachweisbar war.

Obwohl diese Versuchsgruppe keine Toxinkomponenten erhalten hatte, wurde ein TNA mit

allen Einzelseren durchgeführt, da der TNA für das vereinigte Serum der Gruppe einen leichten

Anstieg bei der Startverdünnung von 1 : 100 zeigte. Nach einem exemplarischen Test mit allen

Seren bei einer Startkonzentration von 1 : 500 war nur das Serum von Maus Nr. 10 auffällig

und wurde in höherer Konzentration nochmal getestet, woraus sich dann der in Tabelle 22 auf-

geführte Titer ergab. Zum Abgleich wurde das Negativserum von vor der Immunisierung eben-

falls als Mischprobe der Gruppe getestet und zeigte bei einer Startkonzentration von 1 : 100

einen ähnlichen Anstieg wie das Serum vor der Infektion. Demnach wies Maus Nr. 10 mögli-

cherweise bereits vor der Immunisierung einen niedrigen unspezifischen TNA-Titer auf, der

den Ausgang der Infektion beeinflusst haben

könnte.

In Abbildung 19 sind alle relevanten Titer

noch einmal grafisch dargestellt, von 10 Ver-

suchstieren waren neun innerhalb von 5 dpi

verstorben. Die überlebende Maus Nr. 10 hatte

die niedrigsten IgG und IgG1 Titer dieser Ver-

suchsgruppe. Entsprechend gab es keine signi-

fikante Korrelation zwischen den anti-rBclA

Titern und der Überlebenszeit, wobei die er-

rechnete Tendenz sogar eher antagonistischer

63

Tabelle 22: Mausgruppe LB

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe LB vor der Infektion, sowie Eintritt des Todesin dpi. Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe miteiner OD404nm ≥ 0,1; Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis 25 dpi; Überlebendesind entsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung

rBclA rLF rPA83 TNA Kapsel FIS Tod in

IgG IgG1 IgG2a IgG IgG IgG IgG dpi

6 341333 483555 21000

<500 <1600

<500

390 84676

3

7 192000 341333 3500 <500 3

8 366933 568888 <250 <500 3

9 192000 265481 1111 <500 4

10 61866 68740 2777 324 -

11 247466 251259 833 <500 3

12 512000 777481 375 <500 3

13 93866 106666 1777 <500 5

14 426666 426666 4500 <500 3

15 136533 184888 2875 <500 3

M 257066 347496 3875 - - - - - 3,4

S 149351 220316 6187 - - - - - 0,7

Maus Nr.

Abbildung 19: Mausgruppe LB



Natur war (rs ≤ -0,43). Die Titer für anti-rBclA IgG und IgG1 hatten eine ähnliche Höhe und

Verteilung und zeigten eine hohe Korrelation rs = +0,924), womit eine entsprechend starke

IgG1-Gewichtung vorlag.

4.1.1.6 Mausgruppe LP (Lipopeptid und rPA83)

Eine Gruppe von 10 Mäusen wurde wie

zuvor beschrieben dreimal mit einer

Mischung aus dem Lipopeptid und

rPA83 geimpft und mit 2020 Sporen

(~50LD50) eines voll virulenten Stam-

mes (Ames) infiziert. Durch die Immu-

nisierung konnte in allen Individuen ein

signifikant erhöhter (p ≤ 0,02) IgG-,

IgG1- bzw. IgG2a-Titer gegen rPA83,

sowie TNA-Titer erzeugt werden (Ta-

belle 23). Wie auch schon in anderen

Gruppen beschrieben, war zudem ein

unspezifischer Hintergrundtiter gegen die Kapsel messbar, der auch bereits vor der Immunisie-

rung nachweisbar war.

Die anti-rPA83 IgG-, IgG1- und IgG2a-Titer unterschieden sich untereinander signifikant,

obwohl IgG und IgG1 (Abbildung 20) ähnlich hoch und homogen verteilt waren (p ≤ 0,001).

Die anti-rPA83 IgG2a-Titer streuten sehr stark, sodass einige Individuen einen fast nicht nach-

zuweisenden Titer zeigten, während andere

nahezu äquivalente IgG1 und IgG2a-Titer auf-

wiesen. Daher war die Tendenz zu einer IgG1

gerichteten Immunantwort noch immer vor-

handen, wobei IgG1 und IgG2a nur einen Teil

der gemessenen IgG auszumachen schienen.

In dieser Versuchsgruppe verstarben 9 von 10

Versuchstieren bis zum 7. Tag nach der Infek-

tion. Keine der gemessenen Werte korrelierten

untereinander oder zur überlebten Zeit in

Stunden (rs ≤ ±0,62).

64

Tabelle 23: Mausgruppe LP

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe LP vor der Infektion, sowie Eintrittdes Todes in dpi. Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letztenVerdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung des Überlebenserfolgte bis 25 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt,Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung


IgG IgG IgG1 IgG2a IgG IgG dpi

36

<200

660945 448000 22303 13398

400 <100

7

37 442181 304000 37818 24064 4

38 432872 368000 5575 10421 -

39 660945 240000 147393 20095 4

40 623709 448000 44606 16871 3

41 414254 304000 1909 13150 3

42 623709 304000 23757 10669 3

43 512000 256000 67878 12406 3

44 512000 256000 30545 14390 3

45 735418 448000 2181 10173 2

M - 561803 337600 38397 14564 - - 3,7

S - 113102 84142 43517 4544 - - 1,4

Maus Nr.

Abbildung 20: Mausgruppe LP



4.1.1.7 Mausgruppe LBP (Lipopeptid, rBclA und rPA83)


Lipopeptid, rBclA und rPA83 geimpft und mit 2020 Sporen (~50LD50) eines voll virulenten

Stammes (Ames) infiziert. Wie in Tabelle 24 zu sehen, konnten durch die Impfung in allen Indi-

viduen erhöhte anti-rBclA, -rPA83 und TNA-Titer erzeugt werden (p ≤ 0,048). Die TNA-Titer

korrelierten signifikant mit den IgG-Titern gegen rPA83 (rs = +0,85). Außerdem waren IgG-

Titer gegen FIS und unspezifische Hintergrundtiter gegen die Kapsel nachweisbar, wobei letzte-

re bereits vor der Immunisierung nachweisbar waren.

In Abbildung 21 sind alle wichtigen Einzelmessungen dieser Gruppe noch einmal grafisch dar-

gestellt. Es ist zu erkennen, dass alle IgG-, IgG1- und TNA-Titer homogen verteilt sind, wäh-

rend die IgG2a-Titer stark verstreut liegen und

nicht für alle Individuen messbar waren.

Daher ergab sich eine starke IgG1-Gewich-

tung, sowohl für rPA83 als auch für rBclA, die

beide eine starke Korrelation zwischen IgG

und IgG1 Titern aufwiesen (rs ≥ +0,81).

In dieser Versuchsgruppe verstarben 3 von

10 Versuchstieren, wobei bei einem Individu-

um eine verlängerte Überlebenszeit von

9 Tagen zu beobachten war. Keiner der gemes-

senen Titer war ausschlaggebend für eine ver-

längerte Überlebenszeit (rs ≤ ±0,53).

65

Tabelle 24: Mausgruppe LBP

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe LBP vor der Infektion, sowie Eintritt des Todes in dpi.Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1.Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis 25 dpi. Überlebende sind entsprechend grünhinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung


IgG IgG1 IgG2a IgG IgG1 IgG2a IgG IgG dpi

16 102787 160000 <250 496484 436148 <250 12406

580 46276

3

17 114424 160000 6666 589575 398222 85333 13398 9

18 128000 201142 <250 310303 175407 397 10669 -

19 186181 320000 <250 364606 256000 1000 9181 -

20 77575 91428 1500 473212 251259 136533 27041 3

21 151272 246857 <250 837818 625777 3647 35722 -

22 135757 160000 1444 310303 265481 16000 12158 -

23 61090 70857 <250 143515 184888 1833 7693 -

24 91151 114285 1611 213333 208592 6133 5212 -

25 186181 246857 3333 411151 237037 76800 22328 -

M 123442 177143 1455 415030 303881 32768 15581 - - 5,2

S 42637 77589 2142 199480 141720 48757 9186 - - 3,2

Maus Nr.

Abbildung 21: Mausgruppe LBP



4.1.1.8 Mausgruppe LBCP (Lipopeptid, rBclA, Kapselkonjugat und rPA83)


Lipopeptid, rBclA, dem Kapselkonjugat und rPA83 geimpft und mit 2020 Sporen (~50LD50) ei-

nes voll virulenten Stammes (Ames) infiziert. Als Auffälligkeit bei dieser Gruppe ist zu ver-

merken, dass nach den Impfungen bei einem Teil der Versuchstiere kleine Verkapselungen im

Injektionsbereich zu spüren waren, welche bei den anderen Versuchsgruppen, mit Ausnahme

von LBCOP nicht aufgetreten sind.

Das Negativserum dieser Gruppe wurde als Mischprobe der Gruppe auf IgG-Titer gegen rPA83,

rBclA, FIS und die Kapsel getestet und zeigte nur bei der Kapsel einen unspezifischen Hinter-

grundtiter. Ein TNA-Titer war ebenfalls nicht nachweisbar. Durch die Immunisierung konnten

signifikante IgG-, IgG1- bzw. IgG2a-Titer gegen rPA83 und rBclA, sowie signifikante anti-Kap-

sel IgG- und TNA-Titer erzeugt werden (p ≤ 0,016, Tabelle 25). Ein erhöhter anti-FIS IgG-Titer

war ebenfalls messbar.

Wie in Abbildung 22 zu sehen, waren die

gemessenen Titer bezüglich rBclA und die

anti-rPA83 IgG2a-Titer stark gestreut. Für bei-

de Antigene ergab sich eine ähnlich hohe

IgG1-Gewichtung, wobei sich für rBclA eine

signifikante starke (rs = +0,85) und für rPA83

eine schwache (rs = +0,65) Korrelation zwi-

schen IgG- und IgG1-Titern ergab. TNA- und

rPA83-Titer korrelierten nicht signifikant mit-

einander (rs ≤ +0,59), ließen aber eine Tendenz

erkennen.

66

Tabelle 25: Mausgruppe LBCP

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe LBCP vor der Infektion, sowie Eintritt des Todes in dpi.Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD 404nm ≥ 0,1.Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis 25 dpi. Überlebende sind entsprechend grünhinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung



26 143360 197818 1382 407272 337454 1230 11914 1344

18707

-

27 40320 55272 1000 180363 113454 9692 11914 <400 -

28 110080 232727 4680 471272 241454 5538 10425 4561 -

29 48640 145454 24170 180363 74181 11692 4472 2859 -

30 143360 197818 20765 226909 64000 14615 8937 1225 -

31 110080 113454 11063 349090 241454 3692 10425 6808 7

32 194560 232727 6382 308363 162909 30153 5960 3131 -

33 99840 113454 2595 442181 215282 31384 23324 987 4

34 48640 113454 <1000 663272 241454 5076 11417 1106 3

35 12960 29818 1000 768000 215272 43692 39199 2655 24

M 95184 143200 7304 399709 190691 15676 13799 2468 - 9,6

S 56849 70901 8677 196943 86179 14382 10239 2022 - 9,8

Maus Nr.

Abbildung 22: Mausgruppe LBCP



Die Infektion überlebten 6 von 10 Versuchstieren, wobei ein Tier erst kurz vor Beendigung

des Versuchs am 24. Tag nach der Infektion verstarb. Da auch hier der Erreger aus der Milz die-

ses Tieres nachgewiesen werden konnte, ist als Todesursache die Infektion mit dem Erreger

anzusehen. Keiner der gemessenen Titer korrelierte signifikant zum Überleben (rs ≤ ±0,61).

4.1.1.9 Mausgruppe LBCOP (Lipopeptid, rBclA, Kapselkonjugat, FIS und rPA83)


beschrieben dreimal mit einer Mischung aus

dem Lipopeptid, rBclA, dem Kapselkonjugat,

rPA83 und FIS geimpft und mit 2020 Sporen

(~50LD50) eines voll virulenten Stammes

(Ames) infiziert. Diese Gruppe stellte die

Kombination aller vorhandenen Impfkompo-

nenten auf Proteinbasis dar. Die schon

beschriebenen Verkapselungen durch die

Immunisierungen waren hier ebenfalls

bemerkbar.

Wie in Tabelle 26 aufgeführt, konnten

durch die Immunisierung gegen jedes eingesetzte Antigen signifikante Antikörpertiter für alle

gemessenen Subklassen, sowie TNA-Titer erzeugt werden (p ≤ 0,044), obgleich die Titer für ei-

nige Messreihen stark streuten (Abbildung 23). Die Gewichtung der Subklassen für rPA83 und

rBclA lag hierbei auf IgG1, welcher zudem stark mit den jeweiligen gesamt IgG korrelierte

(rs ≥ +0,82).

67

Tabelle 26: Mausgruppe LBCOP

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe LBCOP vor der Infektion, sowie Eintritt des Todes in dpi. Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD 404nm ≥ 0,1. DieÜberwachung des Überlebens erfolgte bis 25 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt,Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung



46 170666 256000 24000 1191183 988279 41531 28781 2991 51200 -

47 19333 52837 2000 454530 470325 15489 17867 660 8000 -

48 35333 61023 5000 256000 229209 13106 14890 973 24400 -

49 272000 363162 69818 381387 163720 110297 33742 5147 92800 -

50 62666 61023 11272 433632 351255 61957 16378 1356 43200 -

51 186666 175627 7636 381387 273860 18042 12906 3756 40800 -

52 68000 145860 <1000 512000 988279 1489 23820 3200 25600 -

53 42000 61023 2363 412734 470325 73531 70453 895 5688 -

54 124000 363162 7636 172408 273860 3617 8441 852 65422 -

56 58000 175627 14545 214204 247069 32000 5960 400 16711 -

M 103866 171534 14427 440947 445618 37106 23324 2023 37382 -

S 82158 121105 20707 285533 302547 35188 18680 1625 27277 -

Maus Nr.

Abbildung 23: Mausgruppe LBCOP



Die TNA-Titer korrelierten in dieser Gruppe schwach mit den anti-rPA83 IgG-Titern

(rs = +0,65). Eine starke Korrelation konnte für die Titer gegen FIS und rBclA gezeigt werden

und betraf alle Subklassen (rs ≥ +0,65). In dieser Versuchsgruppe konnten alle 10 Versuchstiere

gegen eine Infektion mit B. anthracis geschützt werden.

4.1.2 Einzelbetrachtungen der Impfung von Mäusen mit Vakzinen auf DNA-Basis

Für diesen Teil der Studie wurden die zur Impfung eingesetzten Vektoren vorerst einzeln und

(resultierend aus den Ergebnissen der Einzelapplikationen) in Kombination getestet. Als Adju-

vans, sofern es nicht integraler Bestandteil der Vakzinevektoren selbst war, wurde neben den

antigenkodierenden Vektoren ein zusätzlicher, für CIITA-kodierender Vektor mit Adjuvanswir-

kung verabreicht.

War mehr als ein Vektor Bestandteil der Impfung, sind Mischpatronen erstellt worden, um

eine simultane Wirkung zu gewährleisten. Pro Dosis wurden mindestens 3 µg DNA mittels 2

Patronen appliziert. Schwankungen ergaben sich durch die unterschiedlichen Präparationen,

wobei innerhalb der Gruppen stets die gleiche Kombination an Patronen pro Individuum ver-

wendet wurde. Die Infektion erfolgte mit ~1000 Sporen unter Betäubung s. c. in den Nacken.

4.1.2.1 Mausgruppe TN (CIITA)

Eine Gruppe von 5 Mäusen wurde wie zuvor beschrieben

dreimal mit je zwei DNA-Patronen paramunisiert, welche

mit dem Adjuvans-Vektor pDNAVaccUltra5-CIITA

beschichtet waren und 3 Wochen nach der letzten Paramu-

nisierung mit 894 Sporen (~25LD50) eines voll virulenten

Stammes (Ames) infiziert. Diese Gruppe diente als nega-

tive Vergleichsgruppe für alle DNA-Gruppen. Für die

Paramunisierung wurden nur Patronen einer Präparation

benutzt, deren DNA-Menge 2,4 µg pro Patrone betrug. Die

verwendeten Patronen verschossen sich bei Probeschüssen

auf Filterpapier gleichmäßig mit intensiver Färbung und

nahezu ohne Rückstände (Rückstandbild 2 – 3, siehe Abbildung 10 und 58).

Das Blut vor Beginn der Paramunisierung und vor der Infektion (aufgeführt in Tabelle 27)

wurde als vereinigte Mischprobe der Gruppe auf Antikörper gegen rBclA, rPA83 und rLF,

sowie TNA-Titer untersucht. Es konnten zu beiden Zeitpunkten keine relevanten Titer gegen

die getesteten Antigene gefunden werden. Einzig für rBclA waren nach der Paramunisierung

68

Tabelle 27: Mausgruppe TN

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe TN vorder Infektion, sowie Eintritt des Todes in dpi;Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert derletzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1;Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis25 dpi; Überlebende sind entsprechend grünhinterlegt, Verstorbene orange; M -arithmetischerMittelwert; S – Standardabweichung

rBclA rLF rPA83 TNA Tod in

IgG IgG IgG dpi

31

174 <200 <200 <100

2

32 3

33 4

35 3

36 3

M - - - - 3,0

S - - - - 0,7

Maus Nr.


unspezifische Hintergrundtiter messbar. Erwartungsgemäß verstarben alle Individuen dieser

Gruppe bis zum 4. Tag nach der Infektion.

4.1.2.2 Mausgruppe TM (CIITA; BclAD1D3-Uq)


zuvor beschrieben dreimal mit je zwei

DNA-Patronen, welche mit den Vektoren

pDNAVaccUltra5-CIITA und pDNAVacc-

Ultra4-BclAD1D3-Uq beschichtet waren,

geimpft und 3 Wochen nach der letzten

Immunisierung mit 901 Sporen (~25LD50)

eines voll virulenten Stammes (Ames)

infiziert. Eine Impfdosis bestand aus je

einer Patrone mit 1,51 und 1,99 µg DNA.

Die Patronen konnten bei allen Impfun-

gen nahezu rückstandsfrei mit intensiver

Färbung verschossen werden (Rückstandbild 1 – 2, siehe Abbildung 10 und 58).

Wie in Tabelle 28 aufgeführt, konnten durch die Impfungen signifikante IgG-, IgG1- und

IgG2a-Antikörpertiter gegen rBclA erzeugt werden (p ≤ 0,017). Hervorzuheben ist, dass eben-

falls ein sehr hoher, den anti-rBclA IgG-Titern entsprechender IgG-Titer gegen FIS vorhanden

war. Damit konnte gezeigt werden, dass die spezifisch gegen BclAD1D3 gebildeten Antikörper

auch natürliches BclA auf Sporen detektieren können.

Wie in Abbildung 24 zu sehen, schwankten

die erzeugten Titer zwischen den Individuen

stark. Allerdings ähnelte sich die Verteilung

der IgG- und IgG1-Titer gegen rBclA sehr.

Entsprechend stark war die Korrelation beider

Werte (rs = +0,98). IgG2a-Titer gegen rBclA

waren im Vergleich sehr viel niedriger und für

die Hälfte der getesteten Seren nicht nachweis-

bar. Daraus ergab sich für die gesamte Gruppe

eine deutliche Gewichtung zur IgG1-Subklas-

se. Belegbare Korrelationen zwischen der

Überlebenszeit und den gemessenen anti-

rBclA Titern gab es nicht (rs ≤ ±0,07).

69

Tabelle 28: Mausgruppe TM

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe TM vor der Infektion, sowieEintritt des Todes in dpi. Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert derletzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung desÜberlebens erfolgte bis 21 dpi. Überlebende sind entsprechend grünhinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung

rBclA rLF rPA83 TNA FIS Tod in

IgG IgG1 IgG2a IgG IgG IgG dpi

47 75636 143238 <250

<500 <100 <100 204800

6

48 279272 512000 3380 -

49 96000 195047 <250 -

50 384000 768000 1861 3

51 67716 28160 <250 4

52 331636 707047 <250 -

53 279272 633904 5714 -

54 477090 902095 6095 3

55 46545 85333 <250 6

56 174545 274285 3619 -

M 221171 424911 2067 - - - - 4,5

S 150564 316907 2473 - - - - 1,7

Maus Nr.

Abbildung 24: Mausgruppe TM



In dieser Gruppe überlebten 5 der 10 Tiere, wobei zwei verstorbene Tiere eine verlängerte

Überlebenszeit von 6 Tagen aufwiesen. Daher wurde in dieser Gruppe auch das Serum der

überlebenden Mäuse nach der Infektion untersucht. Von Interesse war hierbei, die Entwicklung

von anti-rPA83 Titern durch die Infektion. Diese würden eine vollständig verlaufene Infektion

mit Anwesenheit von vegetativen Zellen und Ausschüttung der Milzbrandtoxine belegen, gegen

die über eine reine BclA Immunisierung keine Schutzwirkung bestehen sollte. Für alle Indivi-

duen konnte nach der überlebten Infektion kein IgG-Titer gegen rPA83 gemessen werden

(< 100/200).

4.1.2.3 Mausgruppe TK (CIITA; TPA-BclAD1D3-LAMP1)


zuvor beschrieben dreimal mit je zwei

DNA-Patronen, welche mit den Vekto-

ren pDNAVaccUltra5-CIITA und

pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-

LAMP1 beschichtet waren, geimpft und

3 Wochen nach der letzten Immunisie-

rung mit 901 Sporen (~25LD50) eines

voll virulenten Stammes (Ames) infi-

ziert. Jede Dosis umfasste je eine Patro-

ne mit 1,51 und 1,3 µg DNA. Die

Patronen konnten bei allen Impfungen

nahezu rückstandsfrei mit intensiver Färbung verschossen werden (Rückstandbild 1 – 2, siehe

Abbildung 10 und 58). Es konnten durch die

Impfungen signifikante IgG-, IgG1- und

IgG2a-Antikörpertiter gegen rBclA erzeugt

werden (p ≤ 0,04; Tabelle 29). Ebenso waren

hohen IgG-Titer gegen FIS gemessen worden,

während IgG-Titer gegen rPA83 und rLF,

sowie TNA-Titer nicht nachweisbar waren.

Wie zuvor bei Gruppe TM bemerkt, belegten

die gemessenen Antikörpertiter gegen FIS die

Funktionalität der gebildeten Antikörper gegen

BclAD1D3 auch bei natürlichem BclA. Wie in

Abbildung 25 zu sehen, ist die Verteilung der

70

Tabelle 29: Mausgruppe TK

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe TK vor der Infektion, sowie Eintrittdes Todes in dpi. Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letztenVerdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung des Überlebenserfolgte bis 21 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt,Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung

rBclA rLF rPA83 TNA FIS Tod in

IgG IgG1 IgG2a IgG IgG IgG dpi

37 200727 363162 35200

<500 <100 <100 68923

4

38 91454 160744 500 3

39 218181 303627 301 -

40 418909 446511 39200 -

41 168727 238139 60800 4

42 45090 49860 1046 -

43 142545 226232 5176 7

44 66909 110139 1441 -

45 119272 208372 1735 -

46 192000 267906 6235 3

M 166381 237469 15163 - - - - 4,2

S 106094 116938 21718 - - - - 1,6

Maus Nr.

Abbildung 25: Mausgruppe TK



IgG- und IgG1-Titer gegen rBclA nahezu identisch und korrelierte entsprechend stark

(rs = +0,99). Die IgG2a-Titer gegen rBclA waren im Vergleich zu den IgG1-Titern sehr viel

niedriger, aber im Gegensatz zur Gruppe TM für alle Individuen nachweisbar. In dieser Gruppe

überlebten ebenfalls 5 von 10 Mäusen, wobei eine Korrelation der gemessenen Titer zur über-

lebten Zeit in Stunden nicht gegeben war (rs ≤ ±0,16). Analog zur Mausgruppe TM wurde auch

hier das Blutserum der Überlebenden nach der Infektion auf rPA83-Antikörper getestet und

zeigten keinerlei nachweisbare Titer (< 100).

4.1.2.4 Mausgruppe TH (CIITA; TPA-rPA83-LAMP1)


beschrieben dreimal mit je zwei DNA-Patronen,

die mit den Vektoren pDNAVaccUltra5-CIITA

und pDNAVaccUltra1-TPA-rPA83-LAMP1

beschichtet waren, geimpft und 3 Wochen nach

der letzten Immunisierung mit 894 Sporen

(~25LD50) eines voll virulenten Ames Stammes

infiziert. Jede Dosis enthielt je eine Patrone mit

2,4 und 1,5 µg DNA. Die Patronen mit 2,4 µg

DNA verschossen sich sehr gleichmäßig mit

einer intensiven Färbung, wiesen aber bei allen

Patronen Rückstände auf (Rückstandbild 3, sie-

he Abbildung 10 und 58). Die andere Präparati-

on hatte weniger Rückstände (1 – 2), aber eine weniger intensive, diffuse Färbung. Beim Test

der Negativseren war nur ein Serum auffällig

(Maus Nr. 27). Es zeigte einen unspezifischen

Hintergrundtiter von 546 gegen rPA83. In

Tabelle 30 sind alle gemessenen Titer vor der

Infektion für diese Gruppe aufgeführt. Für

rBclA war nach der Immunisierung ein detek-

t ierbarer, unspezifischer Hintergrundtiter

messbar, der vor der Immunisierung nicht vor-

handen war. Die IgG- und IgG1-Titer gegen

rPA83 waren nach der Immunisierung signifi-

kant erhöht (p ≤ 0,001), wobei die IgG1-Titer

zwar niedriger als die IgG-Titer waren, aber

71

Tabelle 30: Mausgruppe TH

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe TH vor der Infektion,sowie Eintritt des Todes in dpi. Titer-Werte ergeben sich alsreziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einerOD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis28 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt,Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung


IgG IgG IgG IgG1 IgG2a dpi

21

131 <100

51200 18773 <800 652 5

22 37485 12800 <800 <250 4

23 12800 5120 <800 <250 -

24 19657 10453 <800 <250 3

25 21028 4693 <800 <250 5

26 56685 15360 <800 <250 -

800 <800 <800 <250 4

28 28342 8320 <800 125 3

29 84114 25600 1300 1614 -

30 4342 1440 <800 <250 3

M - - 31645 10256 - 239 4,0

S - - 26068 8059 - 524 1,0

Maus Nr.

27a

a Negativserum zeigte anti-rPA83 IgG-Titer von 564

Abbildung 26: Mausgruppe TH



beide stark miteinander korrelierten (rs = +0,927). Dies und die starke Streuung aller Titerwerte

ist in der grafischen Darstellung der Werte in Abbildung 26 ebenfalls deutlich erkennbar. Der

niedrige Anteil der IgG1-Antikörper an den gesamt IgG-Antikörpern lässt aber Raum für Spe-

kulationen zu anderen involvierten Subklassen.

Nachweisbare IgG2a-Titer konnten in nur einem Individuum erzeugt werden und auch dort

nur marginal. Entsprechend lies sich die Gewichtung nicht beziffern, lag aber eindeutig auf ei-

ner IgG1-Antwort. Des Weiteren wiesen die Seren dieser Gruppe nur geringe oder nicht detek-

tierbare TNA-Titer auf. Trotzdem war eine schwache Korrelation der TNA-Titer mit den anti-

rPA83 Titern vorhanden (rs ≥ +0,67). Es überlebten 3 von 10 Versuchstieren, wobei keine ver-

längerte Überlebenszeit ersichtlich war. Signifikante Korrelationen zwischen der überlebten

Zeit und den gemessenen Titern waren nicht vorhanden (rs ≤ +0,61).

4.1.2.5 Mausgruppe TA (CIITA; TPA-LFD1PAD4-LAMP1)

Eine Gruppe von 10 Mäusen wurde wie zuvor beschrieben dreimal mit je zwei DNA-Patronen,

welche mit den Vektoren pDNAVaccUltra5-CIITA und pDNAVaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-

LAMP1 beschichtet waren, geimpft und 3 Wochen nach der letzten Impfung mit 894 Sporen

(~25LD50) eines voll virulenten Stammes (Ames) infiziert. Jede Dosis enthielt je eine Patrone

mit 2,1 und 1,8 µg DNA. Beide Präparationen ließen sich sehr gut verschießen und hatten kaum

Rückstände (Rückstandbild 2 – 3, siehe Abbildung 10 und 58), wobei die höher konzentrierte

Patrone intensivere Verfärbungen erzeugte. Die Analyse der Negativseren offenbarte nur für ein

Serum (Maus Nr. 19) einen unspezifischen Hintergrundtiter gegen rPA83 von 400. In Tabelle 31

sind die gemessenen Titer für die Seren vor der Infektion zu sehen.

72

Tabelle 31: Mausgruppe TA

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe TA vor der Infektion, sowie Eintritt desTodes in dpi. Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letztenVerdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung des Überlebenserfolgte bis 28 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt, Verstorbeneorange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung


IgG IgG IgG1 IgG2a IgG IgG1 IgG2a dpi

11

<200

4303 4266 <800 <800 <800 <800 <250 5

12 11696 9813 <800 <800 <800 <800 <250 3

13 12137 32426 <800 <800 <800 <800 <250 4

14 6289 6400 <800 <800 <800 <800 <250 4

15 4303 5760 <800 <800 <800 <800 <250 4

16 22058 25600 <800 1600 <800 <800 <250 -

17 32662 32426 1306 12800 3200 <800 <250 -

18 18096 17920 1013 2096 <800 <800 <250 -

25158 25600 <800 4855 800 <800 <250 -

20 7724 11520 <800 <800 <800 <800 <250 4

M - 14443 17173 232 2135 400 - - 4,2

S - 9708 11090 494 4066 1015 - - 0,7

Maus Nr.

19a

a hatte bereits vor der Immunisierung einen anti-rPA83 IgG-Titer von 400


Die erzeugten Antikörpertiter gegen rPA83 waren im Gruppenmittel nicht signifikant erhöht

(p ≥ 0,11). Einzig die Überlebenden hatten einen sehr niedrigen, nachweisbaren IgG-Titer, der

entsprechend stark mit dem Überleben korrelierte (rs = +0,88). Gegen rLF konnten dagegen in

allen Individuen signifikante IgG- und IgG1-Titer erzeugt werden (p ≤ 0,001). Die IgG2a-Titer

waren für beide Antigene in den meisten Tieren nicht nachweisbar. Die Gewichtung der IgG

Antwort bezüglich LF lag bei IgG1. Dies spiegelte sich auch in einer starken Korrelation

(rs = +0,89) und der nahezu identischen Verteilung der Titerwerte (Abbildung 27) wieder. Beim

Vergleich der IgG-Titer gegen rPA83 und rLF ergab sich, trotz der teilweise nicht nachweisba-

ren Titer gegen rPA83, ebenfalls eine starke

Korrelation (rs = +0,88). Das heißt, Tiere mit

einem detektierbaren anti-rPA83 IgG-Titer

wiesen auch die höchsten anti-rLF IgG-Titer

auf. Ein detektierbarer TNA-Titer war für kei-

nes der getesteten Seren vorhanden. In dieser

Gruppe verstarben 6 von 10 Individuen inner-

halb der ersten 5 Tage nach der Infektion. Eine

Korrelation zur überlebten Zeit in Stunden er-

gab sich neben den anti-rPA83 IgG-Titern

auch etwas schwächer zu den anti-rLF IgG-

Titern (rs = +0,685).

4.1.2.6 Mausgruppe NS (TPA-LFD1PAD4-mIPS-1)


beschrieben dreimal mit je zwei DNA-Patro-

nen, die mit dem Vektor NTC7382-TPA-

LFD1PAD4-mIPS-1 beschichtet waren,

geimpft und 3 Wochen nach der letzten Immu-

nisierung mit 894 Sporen (~25LD50) eines voll

virulenten Stammes (Ames) infiziert. In dieser

Gruppe war kein zusätzlicher Vektor als Adju-

vans beigefügt, da der Vakzinevektor selbst

regulatorische Sequenzen mit Adjuvanscha-

rakter (mIPS-1) aufwies. Jede Dosis setzte

sich aus je einer Patrone mit 2,1 und 1,3 µg

DNA zusammen. Damit war die Konzentration des antigentragenden Vektors doppelt so hoch

73

Abbildung 27: Mausgruppe TA


Abbildung 28: Mausgruppe NS



wie in den anderen Versuchsgruppen, die zusätzlich den CIITA-Vektor enthielten. Die serologi-

sche Untersuchung der Seren vor der Infektion ergab die in Tabelle 32 aufgelisteten Titer, die

teilweise in Abbildung 28 dargestellt sind.

Für rLF und rPA83 waren signifikante aber generell stark gestreute IgG- und IgG1-, sowie

TNA-Titer messbar (p ≤ 0,023), wohingegen die jeweiligen IgG2a-Titer nur in einem Individu-

um nachweisbar waren. Dabei korrelierten die IgG1-Titer gegen rPA83 nicht mit den entspre-

chenden IgG-Titern (rs = +0,19), für rLF indes stark (rs = +0,94). Ebenfalls ergab sich eine

signifikante Korrelation der TNA-Titer zu den anti-rPA83 und anti-rLF IgG-Titern (rs ≥ +0,66).

Da keine aussagekräftigen IgG2a-Titer messbar waren, ist eine IgG1-Gewichtung sowohl für

rLF, als auch für rPA83 anzunehmen (Abbildung 28). Eine signifikante Korrelation der rPA83

und rLF Titer untereinander war nicht vorhanden (rs = +0,55). In dieser Gruppe überlebten 3

von 10 Tieren die Infektion, wobei zwischen den gemessenen Titern und der überlebten Zeit in

Stunden ebenfalls keine erkennbare Korrelation bestand (rs ≤ ±0,30).

4.1.2.7 Mausgruppe TKS (CIITA; TPA-BclAD1D3-LAMP1, TPA-LFD1PAD4-mIPS-1)

Eine Gruppe von 10 Mäusen wurde wie zuvor beschrieben dreimal mit je zwei DNA-Patronen,

die mit den Vektoren pDNAVaccUltra5-CIITA, pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1 und

NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 beschichtet waren, geimpft. Jede Dosis setzte sich aus je

einer Patrone mit 3,65 und 3,51 µg DNA zusammen. Das Mischverhältnis der Vektoren ent-

sprach einer 1 : 1 : 2 Mischung, sodass die applizierte Menge jedes Vektors der Menge in den

Einzelapplikationen entsprach. Daher betrug die Gesamtmenge an DNA pro Dosis mindestens

6 µg für diese Gruppe. Die Auswahl der Vektoren stützte sich auf die gewonnenen Daten der

Vorversuche und ist unter 4.1.4 erläutert. Die Infektion fand 3 Wochen nach der letzten Immu-

74

Tabelle 32: Mausgruppe NS

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe NS vor der Infektion, sowie Eintritt des Todes indpi. Titer-Werte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einerOD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis 28 dpi. Überlebende sindentsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung


IgG IgG IgG1 IgG2a IgG IgG1 IgG2a dpi

1

200

66560 88746 <800 21557 25600 <800 1296 6

2 36693 40106 <800 6400 3986 <800 397 5

3 293546 266240 4114 94315 5440 4457 2630 -

4 204800 119466 <800 16168 22186 <800 844 3

5 41813 24320 <800 2610 9386 <800 498 4

6 41813 37546 <800 45810 102400 <800 447 -

7 21333 12373 <800 21557 22186 <800 400 3

8 21333 8106 <800 800 14080 <800 149 4

9 8960 8106 <800 4884 63146 <800 50 -

10 69973 42666 <800 10778 39253 <800 199 3

M - 80682 64768 - 22488 30766 - 691 4,1

S - 93200 79441 - 28511 30768 - 772 1,2

Maus Nr.


nisierung mit 864 Sporen (~25LD50) eines voll

virulenten Stammes (Ames) statt.

Durch die Immunisierung konnten signifi-

kante IgG- und IgG1-Titer gegen rBclA, rLF

und rPA83 erzeugt werden (p ≤ 0,004; Tabel-

le 33), wobei die IgG2a-Titer nicht für alle

Individuen messbar waren. Ein TNA-Titer war

für nahezu alle Individuen nachweisbar, ist

aber aufgrund der hohen Standardabweichung

und der generell sehr niedrigen Titer nicht

signifikant erhöht (p = 0,06). Ein leicht erhöh-

ter Titer gegen FIS, sowie ein unspezifischer

Hintergrundtiter gegen die Kapsel wurde ebenfalls gemessen, beide waren im Negativserum

nicht nachweisbar. Eine signifikante Korrelation der TNA-Titer ergab sich für anti-rLF IgG und

IgG1 (rs ≥ +0,85), sowie anti-rPA83 IgG1 (rs = +0,66).

Wie in Abbildung 29 ersichtlich, ähneln sich die Titerspektren für IgG und IgG1 bei allen

Antigenen, was sich für rPA83 und rLF auch in entsprechenden, signifikanten Korrelationen

widerspiegelt (rs ≥ +0,77). IgG2a-Titer gegen die verschiedenen Antigene waren nicht in allen

Tieren nachweisbar und deutlich niedriger als die IgG- und IgG1-Titer. Daher ist von einer star-

ken IgG1-Gewichtung aller relevanten Antigene auszugehen. Eine Korrelation der Antigene

untereinander war nicht gegeben (rs ≤ +0,56).

75

Tabelle 33: Mausgruppe TKS

ELISA- und TNA-Titer der Mausgruppe TKS vor der Infektion, sowie Eintritt des Todes in dpi. Titer-Werteergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung desÜberlebens erfolgte bis 18 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange;M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung

rBclA rLF rPA83 TNA Kapsel FIS Tod in

IgG IgG1 IgG2a IgG IgG1 IgG2a IgG IgG1 IgG2a IgG IgG dpi

274 15680 22531 653 31360 55040 <400 15872 19918 <400 <100

229 2204

-

275 31680 31346 1224 44800 87040 <400 81920 82286 4114 150 -

276 41600 27755 7706 24320 42880 400 29696 34612 5812 <100 -

277 37760 31346 514 26240 55040 1000 27136 32000 <400 150 -

281 60160 35918 <400 55040 92160 491 82286 73143 3004 199 9

286 31040 42449 <400 128000 363520 <400 76800 77061 400 646 -

287 13440 21551 <400 48000 92160 582 32768 23837 759 348 -

288 25920 30041 400 46080 104960 <400 81920 55510 498 199 -

289 31680 35918 <400 50560 138240 <400 113633 159347 <400 2291 -

292 56320 58122 612 122880 281600 873 58122 88816 <400 646 -

M 34528 33698 1111 57728 131264 335 60015 64653 1459 463 - - -

S 15256 10620 2351 37181 106317 392 32158 41909 2093 682 - - -

Maus Nr.

Abbildung 29: Mausgruppe TKS



4.1.3 Überlebensdaten aller Mausversuche im Vergleich

Aufgrund der unterschiedlichen Infektionsdosis und der Unterscheidung zwischen Protein- und

DNA-Vakzinen wurden die Überlebensdaten in drei Gruppen zusammengefasst und analysiert.

Auffällige Vergleiche zwischen diesen Gruppen werden aber ebenfalls beschrieben. Bei keinem

Individuum, das die Infektion überlebte und am Ende euthanasiert wurde, konnte der Erreger in

Leber oder/und Milz nachgewiesen werden. Alle in diesem Zeitraum selbstständig verstorbenen

Tiere wiesen B. anthracis in Leber oder/und Milz auf. Folglich ist davon auszugehen, dass

durch die Immunisierung eine komplette Klärung der Infektion bei allen Überlebenden stattge-

funden hat und entsprechend die Todesursache bei allen verstorbenen Tieren eine fortschreiten-

de Infektion mit B. anthracis war.

In Abbildung 30 sind die Überlebenskurven für die Proteingruppen aufgeführt, die mit

~25LD50 eines voll virulenten Stamm (Ames) infiziert wurden. NC unterschied sich nicht signi-

fikant von der Kontrollgruppe und LN-1000, während die Versuchstiere der Gruppe NCP mit

70 % Überlebenden signifikant besser geschützt waren als beide anderen Gruppen.

76

Abbildung 30:Überlebensdaten Mausgruppen (Proteinvakzinen, ~1000 Sporen)

Prozentuale Auftragung der Überlebenden über die Zeit in dpi; Angegebene p-Werte über den jeweiligen Kurven beziehensich auf den Vergleich mit der Kontrollgruppe (LN-1000); Kap – Kapselkonjugat


In Abbildung 31 sind die restlichen Versuchsgruppen, welche mit Protein-Komponenten immu-

nisiert wurden, aufgeführt. Diese waren mit ~50LD50 eines voll virulenten Stamm (Ames) infi-

ziert worden. Die Gruppen LB und LP mit je 10 % Überlebenden unterschieden sich nicht

signifikant von der negativen Vergleichsgruppe LN-2000 und voneinander. Da für LN-2000

eine leicht verlängerte Überlebenszeit aufgetreten ist, muss angemerkt werden, dass es für LB

und LP ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zu den anderen Kontrollgruppen (LN-1000

und TN) gab. Mit 70 % und 60 % Überlebenden unterschieden sich LBP und LBCP nicht signi-

fikant voneinander (p = 0,696). Bei einer Überlebensrate von 100 % unterschied sich LBCOP

mit Ausnahme von LBCP (und NCP) von allen anderen Proteingruppen signifikant (p ≤ 0,029)

und stellte somit die beste Proteinkombination dar.

In Abbildung 32 sind die Überlebenskurven nach einer Infektion mit ~25LD50 eines voll viru-

lenten Stammes (Ames) der Gruppen zur Testung der DNA-Vakzine aufgeführt. Alle DNA-

Gruppen hatten eine signifikant höhere Überlebensrate als die Kontrollgruppe, die nur den

Adjuvansvektor CIITA erhalten hatte (TN). Innerhalb der DNA-Gruppen, die nur mit Toxin-

komponenten immunisiert wurden, gab es mit 30 – 40 % ähnliche Überlebensraten (p ≥ 0,573).

Analog verhielt es sich für die Gruppen TK und TM, welche jeweils mit einem Vektor immuni-

siert wurden, der BclAD1D3 als Antigensequenz enthielt (p = 0,983) und 50 % Schutzwirkung

77

Abbildung 31: Überlebensdaten Mausgruppen (Proteinvakzinen, ~2000 Sporen)

Prozentuale Auftragung der Überlebenden über die Zeit in dpi; Angegebene p-Werte über den jeweiligen Kurven beziehensich auf den Vergleich mit der Kontrollgruppe (LN-2000); Kap – Kapselkonjugat


erzielte. Die Kombination der erfolgversprechendsten Toxin- und Sporenvektoren resultierte in

einer im Vergleich zu allen anderen DNA-Vakzinen signifikant besseren Überlebensrate von

90 % und verlängerten Überlebenszeit für das verstorbene Tier.

Gesamtheitlich betrachtet, waren die Kontrollgruppen LN-1000, LN-2000 und TN trotz

unterschiedlicher Infektionsdosis nicht voneinander zu unterscheiden (p ≥ 0,137). Innerhalb der

Proteinvakzinen konnte keines der getesteten Antigene alleine eine Schutzwirkung erzielen, die

sich von den Kontrollgruppen unterschied. Erst eine Kombination von rPA83 mit mindestens

einem weiteren Antigen, erzeugte einen partiellen Schutz, der nur bei zusätzlicher Anwesenheit

von FIS komplettiert wurde.

Der potentielle Beitrag des Kapselkonjugats zur Schutzwirkung ist indes fraglich. Im Gegensatz

dazu konnten die DNA-Vektoren mit BclA (TM und TK) ohne zusätzliche Antigene eine signi-

fikant höhere Überlebensrate erzeugen (p ≤ 0,023) als die Kontrollgruppe und die vergleichbare

Proteinvakzine (LB) und erreichten äquivalente Ergebnisse wie die Kombinationsvakzinen LBP

und LBCP (p ≥ 0,375). Die Mehrheit der Toxinvektoren erzeugten ohne weitere Antigene ähnli-

che Überlebensraten wie die Proteingruppen LP, NCP, LBP und LBCP. Es gilt allerdings zu

beachten, dass eine geringere Infektionsdosis bei den DNA-Vakzinen verwendet wurde und die

Vergleiche zwischen Gruppen mit unterschiedlicher Infektionsdosis kritisch zu betrachten sind.

Dennoch konnten auf beiden Versuchszweigen Kombinationsvakzinen erstellt werden, deren

Schutzwirkung nahezu komplett war und sich nicht voneinander unterschied (p = 0,317).

78

Abbildung 32: Überlebensdaten Mausgruppen (DNA-Vakzinen, ~1000 Sporen)

Prozentuale Auftragung der Überlebenden über die Zeit in dpi; Angegebene p-Werte über den jeweiligen Kurven beziehensich auf den Vergleich mit der Kontrollgruppe (TN); LFD1PAD4, PA83 und BclAD1D3 ohne weitere Anhänge beziehen sichauch die Vektorrückgrate mit TPA und LAMP1


4.1.4 Interner Vergleich der Titerdaten der Mausversuche

Zum Vergleich der gemessenen Titerdaten der Mausversuche untereinander wurden die gemit-

telten IgG Antikörpertiter in Reihenfolge der Komplexität der eingesetzten Impfkomponenten,

unterteilt in Protein- und DNA-Vakzinen, einander gegenübergestellt. Insgesamt waren bei eini-

gen Individuen oder Messpunkten sporadisch niedrige unspezifische Hintergrundtiter für einige

Antigene messbar, obwohl die Messmethoden so eingestellt waren, dass entsprechend naive Se-

ren keinen Titer ergaben. Dies betraf vornehmlich das Kapselpräparat, aber auch rPA83 und rB-

clA. Die rPA83-assoziierten unspezifischen Hintergrundtiter traten ausnahmslos vor der Immu-

nisierung auf und betrafen nur vereinzelte Individuen. Im Falle von rBclA verhielt es sich ent-

gegengesetzt, da erst nach einer Vakzinierung ohne BclA oder FIS ein unspezifischer Hinter-

grundtiter messbar war. Eine Verunreinigung ist ausgeschlossen. In beiden Fällen waren die

Messwerte unerheblich (<600) und haben in Anbetracht der Höhe der durch die Vakzinierung

generierten Antikörpertiter gegen rPA83 und rBclA keine statistische Relevanz. Die gemesse-

nen unspezifischen Hintergrundtiter gegen die Kapsel waren indes sowohl vor der Immunisie-

rung, als auch nach der Immunisierung bei den Gruppen erhöht, die nicht mit dem Kapselkon-

jugat immunisiert wurden. Wie in Abbildung 33 ersichtlich, waren unspezifische Titer gegen

die Kapsel in ähnlicher Höhe in allen Gruppen, die mit dem Lipopeptid immunisiert wurden,

detektierbar.

Da dies entsprechend auch die Kontrollgruppen betraf, ist davon auszugehen, dass es sich

bei den gemessenen Titern nicht um spezifische gegen die Kapsel gerichtete Antikörpertiter

handelt. Davon ausgenommen sind nur die Gruppen LBCP und LBCOP, welche identische und

weitaus höhere Titer gegen die Kapsel aufwiesen (p = 0,594).

Die anti-rPA83 IgG-Titer aller Protein-Gruppen, die entsprechend mit rPA83 immunisiert

wurden, waren signifikant erhöht und lagen alle in einem ähnlich hohen Bereich (~ 5 * 105).

Damit waren sie bis auf Gruppe LP, die einen noch höheren Titer aufwies, nicht signifikant un-

terschiedlich (p ≥ 0,259). Ein ähnliches Verhältnis ergab sich auch im Bezug auf IgG1, wobei

diese in Abhängigkeit von der applizierten Vakzinekomposition nur einen Teil der gesamt IgG

ausmachten und entsprechend auch Unterschiede in der Korrelation zeigten. Etwaige Effekte

durch zusätzliche Vakzinekomponenten oder Adjuvanzien könnten demnach nicht in der Höhe

der IgG, sondern über Veränderungen der Subklassengewichtung detektierbar sein.

Zur Abschätzung der Qualität der anti-rPA83 Antikörper wurden die Seren auf ihre neutrali-

sierende Wirkung im TNA getestet. Für die Proteingruppen, denen unter anderem rPA83 verab-

reicht wurde, ergaben sich mit Ausnahme von Gruppe NCP, welche niedrigere Titer aufwies,

einheitlich hohe, signifikante TNA-Titer (p ≥ 0,167). Korrelationen zu den anti-rPA83 Titern

waren uneinheitlich und nur für LBP und LBCOP signifikant, die beide auch die höchsten

TNA-Titer zeigten.

79


Ähnlich den gemessenen IgG-Titern gegen rPA83 verhielten sich die anti-rBclA IgG-Titer, die

für alle entsprechend immunisierten Proteingruppen äquivalente Werte zeigten (~105;

p ≥ 0,225). Ausgenommen hierbei war Gruppe LB, die weitaus höhere Titer als die restlichen

Gruppen aufwies (p ≤ 0,014). Die generell starke IgG1 Gewichtung war bei den anti-rBclA

Titern noch deutlicher sichtbar und wurde in einer entsprechend starken Korrelation der IgG-

und IgG1-Titer reflektiert. Dies war mit Ausnahme der Gruppe TKS für alle getesteten Grup-

pen, inklusive der DNA-Vakzinen signifikant.

Die DNA-Vakzinegruppen TK und TM waren über die gemessenen rBclA-Titer nicht zu

unterscheiden (p ≥ 0,074, Abbildung 34), wenngleich TM einen messbaren IgG2a-Titer für alle

Individuen aufwies und TK nicht. Für eine DNA-Vakzine erstaunlich, hatten TM und TK äqui-

valente oder sogar höhere Titer als die vergleichbare Proteinvakzinen. Da auch die Überlebens-

raten beider Gruppen gleich waren, musste die Auswahl einer der Vektoren für eine Kombinati-

onsvakzine auf anderer Grundlage erfolgen. Schlussendlich wurde der Vektor pDNAVacc-

Ultra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1, aufgrund der möglichen antagonistischen Wirkung des Ubi-

quitins in Kombination mit anderen DNA-Vektoren [211] ausgewählt. Trotzdem erzeugte die

80

Abbildung 33: Übersicht IgG- und TNA-Titer (Proteinvakzinen, Maus)

Logarithmische Auftragung der ELISA-Titer (IgG) und TNA-Titer der Seren aller Proteingruppen vor der Infektion; DieStandardabweichung ist über den Balken als positiver Wert angegeben (bei Messwerten aus vereinigten Mischprobenentsprechend nicht); Werten unterhalb der Nachweisgrenze wurde für eine bessere Darstellung ein Wert von 100zugewiesen; Kap – Kapselkonjugat


Kombinationsvakzine TKS niedrigere anti-rBclA IgG- und IgG1-Titer als die Gruppen TK und

TM, sowie alle Proteinvakzinen mit rBclA als Bestandteil (p ≤ 0,017) und zeigte somit schlech-

tere Immunogenität als die korrespondierende Einzelapplikation des BclA-Vektors (TK). Aller-

dings waren die IgG Titer dieser Gruppe bezogen auf alle eingesetzten Antigene uniformer als

in den Einzelapplikationen.

Alle Gruppen, die mit rBclA immunisiert wurden, wiesen neben dem anti-rBclA Titer auch

einen anti-FIS IgG-Titer auf. Dieser war in teilweise ähnlicher Höhe wie der anti-rBclA IgG-

Titer vorhanden und somit nicht allein der Gruppe vorbehalten, die zusätzlich auch FIS erhielt.

Da der anti-FIS Titer für alle Gruppen außer LBCOP nur als Mischprobe der jeweiligen Gruppe

exemplarisch gemessen wurde, können nur Tendenzen angegeben und analysiert werden.

Augenscheinlich erhöht die gleichzeitige Gabe von FIS und rBclA den anti-FIS Titer aber nicht

weiter, da kein merklicher Unterschied zwischen den Gruppen LBP, LBCP und LBCOP vor-

liegt. Die Kombination der Toxin- und Sporenvektoren in der Gruppe TKS schien außerdem

einen negativen Einfluss auf die anti-FIS Titer gehabt zu haben.

81

Abbildung 34: Übersicht IgG- und TNA-Titer (DNA-Vakzinen, Maus)

Logarithmische Auftragung der ELISA-Titer (IgG) und TNA-Titer der Seren aller DNA-Gruppen vor der Infektion; DieStandardabweichung ist über den Balken als positiver Wert angegeben (bei Messwerten aus vereinigten Mischprobenentsprechend nicht); Werten unterhalb der Nachweisgrenze wurde für eine bessere Darstellung ein Wert von 100zugewiesen; LFD1PAD4, PA83 und BclAD1D3 ohne weitere Anhänge beziehen sich auch die Vektorrückgrate mit TPA undLAMP1; n.v. – nicht vorhanden (Wert wurde nicht gemessen)


Die IgG-Antikörpertiter gegen rPA83 der DNA-Vakzinen mit Toxinkomponenten hatten im

Vergleich zu den analogen Proteingruppen einen ca. zehnfach niedrigeren Wert (p ≤ 0,001). Für

IgG1 und IgG2a waren bis auf wenige Ausnahmen ebenfalls signifikant höhere Titer bei den

Proteingruppen vorhanden. Innerhalb der DNA-Gruppen waren die IgG- und IgG1-Titer gegen

rPA83 für NS und TH gleich (p ≥ 0,056), wobei beide signifikant höhere Titer als TA zeigten

(p ≤ 0,038), da in dieser Gruppe nur sehr niedrige, nicht bei allen Individuen nachweisbare Titer

gegen rPA83 erzeugt werden konnten. Für eine Kombinationsvakzine wurde daher dieser

Toxinvektor nicht in Erwägung gezogen. Da beide verbliebenen Vektoren ähnlich gute anti-

rPA83 Titer erzeugten und der Vektor NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 der Gruppe NS

neben PA auch eine LF-Komponente besaß, lag die Entscheidung für dessen Einsatz in der

Kombinationsvakzine nahe. Entsprechend konnte die Kombinationsvakzine TKS sogar signifi-

kant höhere anti-rPA83 IgG-Titer als alle Einzelapplikationen der DNA-Vakzine (p ≤ 0,038)

erzeugen.

Antikörpertiter gegen rLF, das ebenfalls zu den Toxinkomponenten zählt, wurden nur bei

den DNA-Vakzinen gemessen. Die IgG-Titer von Gruppe NS waren dabei signifikant höher als

die von Gruppe TA (p = 0,038), wobei in beiden Fällen die IgG-Titer gegen rLF signifikant

höher waren als die Titer gegen rPA83 (p ≤ 0,035). Dies war für die Kombination TKS nicht der

Fall (p = 0,861). Der anti-LF IgG-Titer von Gruppe TKS hatte zudem die gleiche Höhe, wie die

Einzelapplikation desselben Vektors in Gruppe NS (p = 0,479). Generell lag für die anti-rLF

Titer eine starke Gewichtung zu IgG1 vor. Bezüglich der Neutralisierungsfähigkeit der Toxin-

Antikörper waren in den DNA-Gruppen nur sehr niedrige TNA-Titer detektierbar. Einzig die

Gruppen NS und TKS hatten signifikant erhöhte Titer, die signifikant niedriger als die der Pro-

teingruppen waren (p ≤ 0,001).

82


4.2 Diskussion Mausversuche

Mit der Zielführung für DNA- und Proteinvakzinen geeignete Kombinationen zu finden, die

eine Erprobung im Ziegenmodell rechtfertigen, sollen im Folgenden die Ergebnisse der Maus-

versuche anhand der Fachliteratur diskutiert werden.

4.2.1 Proteinvakzinen

Wie unter 4.1.4 bereits angerissen, konnte keines der erprobten Antigene für sich genommen

eine signifikante Schutzwirkung erzielen, gleichwohl, mit Ausnahme der Kapsel, hohe Antikör-

pertiter gegen die eingesetzten Antigene erzeugt wurden. Erst eine Kombination von rPA83 mit

mindestens einem weiteren Antigen erzeugte einen partiellen Schutz, der nur bei zusätzlicher

Anwesenheit von FIS komplettiert wurde. Während Einzelimmunisierungen mit PA umfang-

reich erprobt sind und in Abhängigkeit vom eingesetzten Adjuvans, dem Tiermodel, dem Infek-

tionsstamm und dessen eingesetzter Dosis stark variieren [149][145], sind Studien zur Schutz-

wirkung von BclA, FIS und der Kapsel oder deren Kombination sehr begrenzt. Entsprechend

lassen sich Mausinzuchtlinien mit PA alleine vor einer Infektion mit der kapseldefizienten

SSLV zu 100 % schützen [95], aber nicht gegen eine Infektion mit einem voll virulentem

Stamm von B. anthracis. Die hier durchgeführte Einzelvakzinierung mit rPA83 diente als Ver-

gleichsgruppe für die Kombinationen. Um deren Schutzwirkung entsprechend abzugrenzen,

war der Versuchsaufbau und die Infektionsdosis entsprechend so gewählt, dass Unterscheidun-

gen zwischen den einzelnen Gruppen möglich waren. Das verwendet Lipopeptid als Adjuvans

[23] war ebenso bereits in einer vorhergehenden Studie im Vergleich zu RIBI und Alhydrogel

im NMRI-Mausmodell erprobt und in vielen Belangen als Zusatz für rPA83 für gleichwertig

bzw. besser befunden worden [24]. Die Neuerungen der Protein-basierenden Vakzinierungsver-

suche umfassten die Erprobung eines Kapselkonjugats und rBclA einzeln, sowie Kombinations-

versuche mit rPA83, rBclA, FIS und dem Kapselkonjugat.

Der Zusatz des Kapselkonjugats hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf die SchutzwirkungDer Zusatz des Kapselkonjugats hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf die Schutzwirkung

Bisherige Versuche mit allein auf PA basierenden Vakzineformulationen zeigten in Mausin-

zuchtlinien vorwiegend eine hohe Schutzwirkung bei der Verwendung kapseldefizienter Infek-

tionsstämme, wie der SSLV und dem STI-1. Ohne die Anwesenheit der Kapsel sind die germi-

nierten, vegetativen Bakterienkörper durch das Wirts-Immunsystem leichter zu detektieren und

zu beseitigen [275], sodass ein nur auf einer Antitoxinwirkung beruhender Schutz bereits aus-

reichend sein kann. Da dies unter natürlichen Bedingungen nicht vorkommt und außerhalb des

Inzuchtmodells keine Gültigkeit besitzt, ist eine zusätzliche Wirkung gegen die Kapsel wün-

83


schenswert. In ihrer Eigenschaft als äußerste Schicht der vegetativen Zelle verdeckt die wenig

immunogene Kapsel andere immunogene Antigene und vermindert die Detektion und Phagozy-

tose des Erregers durch das Immunsystem des Wirts [242][163][208]. Die Immunogenität der

Kapsel kann durch eine Konjugation an andere immunogene Proteine verändert werden. Immu-

nisierungsversuche mit natürlichen oder künstlichen Kapselpräparaten konjugiert an BSA [50]

[273], PA [256][105], OMPC (Outer Membran Protein Complex von Neisseria meningitidis

serotyp B) [158][49] oder KLH (keyhole limpet hemocyanin) [344] resultierten teilweise in

Abhängigkeit von der Länge der PGA und der Konjugationsart [273][174] in stark erhöhten

(>104) kapselspezifischen Antikörpertitern. Diese waren im Falle eines Kapselkonjugats mit

OMPC im BALB/c Mausmodell bei einer s. c. Infektion mit 20000 Sporen eines Ames Stam-

mes auch ohne Zugabe weiterer Antigene zu 100 % protektiv, während die unkonjugierte Kap-

sel nur 30 % Schutzwirkung zeigte [158]. Der verbesserte immunogene Effekt trat entsprechend

nicht auf, wenn die Konjugationspartner nur in Mischung verabreicht wurden. Tendenziell

waren Kapselmultimere mit mindestens vier Glutaminsäureresten nötig, um ein funktionelles

Konjugat zu erstellen [344], wobei Dekamere Optimallänge zu haben schienen [273].

In Anlehnung an diese erfolgversprechenden Experimente und zur Minimierung der

Bestandteile einer zukünftigen NLV sollte ein Kapselkonjugat erstellt werden, das mit einem

Lipopeptid als Adjuvans verknüpft ist. Das resultierende Kapsel-Nonamer Pam3Cys-

AQEKEAKSELDYD-(isoE9)-NH2 beinhaltete Bestandteile des B. cereus spore germination

protein (GerD) und wurde von EMC-Microcollections (Herrn Dr. Wiesmüller) zur Verfügung

gestellt. Die Testung erfolgte einzeln (NC), in Kombination mit rPA83 (NCP) oder Lipopeptid,

rBclA, rPA83 (LBCP), sowie Lipopeptid, rBclA, rPA83 und FIS (LBCOP). Entgegen den

Erwartungen konnte das Kapselkonjugat ohne das zusätzliche Lipopeptid keine signifikanten

Titer erzeugen und induzierte auch bei Zusatz des Lipopeptids nur sehr niedrige Antikörpertiter.

Zudem ist davon auszugehen, dass das Konjugat keinerlei Einfluss auf die Schutzwirkung hatte.

Zwar konnte in der Gruppe NCP mit 70 % Überleben eine weitaus höhere Schutzrate erzeugt

werden als mit PA allein (LP – 10 %), was auf den ersten Blick für eine Wirksamkeit des Kon-

jugats spricht. Allerdings gilt es hier zu beachten, dass Gruppe LP mit ~50LD50 und NCP mit

~25LD50 infiziert wurden. Da frühere Versuche dieser Arbeitsgruppe bei einer Infektion mit

~21LD50 für eine mit Lipopeptid und rPA83 immunisierte Gruppe 80 % Überleben ergaben

[24], kann davon ausgegangen werden, dass die Schutzwirkung in NCP einer rPA83-Immuni-

sierung ohne Lipopeptid entspricht. Dies wird auch durch die Titerwerte von Gruppe NCP

unterstützt, die für rPA83 unter denen von Gruppe LP bleiben. Des Weiteren zeigte das Kapsel-

konjugat allein keinerlei Wirkung (NC) und trug auch als Bestandteil der Kombinationsvakzine

nichts bei, da die Gruppen LBP und LBCP, die sich nur im Zusatz des Konjugats unterschieden,

in allen Belangen gleiche Werte aufwiesen. Die Erhöhung der anti-Kapsel IgG-Titer für die

84


Gruppen LBCP und LBCOP auf ~2000 könnte dem zusätzlich verabreichten Lipopeptid zuzu-

schreiben sein, ist aber für die Erwartungen, die sich aus den Vorarbeiten an das Kapselkonjugat

ergeben haben, viel zu niedrig.

Einen Erklärungsversuch für den Fehlschlag dieses Ansatzes bietet ein 2013 veröffentlichtes

Manuskript, welches Arbeiten zum gleichen Rumpfgerüst des hier verwendeten Kapselkonju-

gats beschreibt [306]. Darin wird die Wirksamkeit von Pam3Cys-AQEKEAKSELDYD, dem

hier innerhalb des Kapselkonjugats verwendeten Epitops, als LPS-Toleranz (Lipopolysaccharid)

erzeugendes Antiallergikum erörtert. Der beschriebene immunsupprimierende Effekt dieses

Epitops war zuvor nicht bekannt und könnte die Unwirksamkeit des hier verwendeten Kapsel-

konjugats erklären. Damit wäre zudem das Prinzip der Erhöhung der Immunogenität des Kap-

selkonstrukts durch Konjugation an ein immunogenes Peptid unterwandert und dessen Unwirk-

samkeit begründet. Das bedeutet allerdings keinesfalls eine generelle Untauglichkeit von Lipo-

peptiden für ein Kapselkonjugat. Ebenfalls sollte angemerkt werden, dass das als generelles

Adjuvans verwendete Lipopeptid in diesen Versuchen eine Mischung aus einem TLR2/1 Akti-

vator und einem promiskuitiven TH2-Epitop darstellte und nicht von den Ergebnissen des Kap-

selkonjugats betroffen ist.

Auf Grundlage dieser Ergebnisse und der Annahme, dass ebenso die bei Gruppe LBCP und

LBCOP bemerkten Verkapselungen nach der Vakzinierung auf das Kapselkonjugat zurückzu-

führen sind, wurde von einer Verwendung in weiteren Versuchen abgesehen.

BclA und PA wirken einander unterstützend BclA und PA wirken einander unterstützend

Sowohl rBclA als auch rPA83 erzeugten ohne den Zusatz weiterer Antigene signifikant hohe

Antikörpertiter mit starker IgG1-Gewichtung. Dabei waren beide ähnlich immunogen mit

Titerwerten, welche die der Kombinationsvakzinen übertrafen. Die Immunogenität beider Anti-

gene ist hinlänglich bekannt, wobei BclA als immunodominantes Oberflächenprotein der Spore

in Anwendung als Vakzine [310][296] im Vergleich zu PA und dessen geschichtlicher Relevanz

für die Vakzineentwicklung [347] noch relativ unerforscht ist. In den wenigen Vergleichsstudien

zur Immunisierung mit BclA als rekombinantes Protein oder DNA-Vakzine [125] konnten in

Kaninchen, Meerschweinchen und verschiedenen Mauslinien [39][195][61] ebenfalls hohe

Antikörpertiter gegen BclA erzeugt werden, die allerdings ebenfalls nur einen Schutz von

< 20 % vermittelten.

Versuche zur Kombination von BclA und PA wurden vor allem in Hinblick auf die Verbesse-

rung der Schutzwirkung von suboptimalen Konzentrationen von PA durchgeführt und vermit-

telten den Eindruck eines antagonistischen Effekts von BclA auf die anti-PA Titer [39]. Eine

Trennung der Antigene in einem Prime/Boost Ansatz nivellierte den Effekt und resultierte in

85


kompletten Schutzraten bei einer Infektion von A/J-Mäusen mit Sporen der SSLV [39]. Spätere

Versuche zeigten allerdings, dass der störende Effekt von BclA nur bei suboptimalen Konzen-

trationen von PA und während der frühen Impfphase auftritt, sodass eine Kombination beider

Antigene ohne nachteilige Reaktionen problemlos möglich ist [125][61]. Dies konnte in den

hier durchgeführten Versuchen bestätigt werden, wobei eine Schutzrate von bis zu 70 % nach

einer Infektion mit voll virulentem B. anthracis für die Kombination beider Antigene erreicht

wurde.

Der offensichtlich synergetische Effekt beider Antigene in Kombination, wurde allerdings

nicht in den gemessenen Antikörper- oder TNA-Titern reflektiert, die in der Kombination sogar

eher niedriger ausfielen. Mit einem ähnlichen Ergebnis konfrontiert, folgerten Brahmbhat et al.

(2007) [39] aufgrund weiterführender Experimente, dass der Zusatz von BclA zu einer PA-

basierenden Vakzine die Schutzrate über die Erzeugung sporenopsonierender und germinations-

hemmender Antikörper erhöht. Überdies belegten weitere Studien die Fähigkeit von anti-PA

Antikörpern zu Detektion von Sporen [352][62]. Dies beruht vermutlich auf einer Einlagerung

von vegetativen Bestandteilen in den Sporenmantel bei der Sporulation und betrifft nicht nur

PA [352][332]. Durch die Opsonierung der Sporen mittels anti-PA Antikörpern kann es zu einer

Hemmung der Germination und einer Erhöhung der Phagozytose dieser durch Makrophagen

kommen [352][62]. Schlussfolgernd könnte also die partielle Schutzrate von rPA83 und rBclA

in Kombination sowohl ein Produkt des erzeugten anti-Sporeneffekts, als auch der und der

Antitoxineigenschaften der Antikörper sein.

Ein detaillierterer Blick auf die gemessenen Titer beider

Antigene in allen relevanten Protein-basierenden Gruppen

und deren Korrelationen, lässt weitaus mehr Schlüsse zur

Synergie zu als die unprozessierten Rohdaten erahnen las-

sen. So scheint rBclA die Gewichtung der Antikörpertiter

gegen rPA83 in Richtung IgG1 zu verschieben und hat

eventuell auch Einfluss auf deren Korrelation zur Toxinneu-

tralisationsfähigkeit.

In Tabelle 34 sind zur Erläuterung noch einmal alle betreffenden Gruppen nebst ihrer rs-

Werte aufgeführt. Betrachtet man hierbei Gruppe NCP, in Anbetracht der bereits erläuterten

Wirkungslosigkeit des Kapselkonjugats ebenfalls als reine rPA83 vakzinierte Gruppe, wird der

Unterschied zwischen den Einzelvakzinierungen mit rPA83 und den Kombinationsvakzinen mit

rBclA deutlich. Während rBclA allein und in Kombination eine nahezu gleiche und starke

IgG:IgG1-Korrelation aufweist, wird diese für rPA83 erst in Kombination mit rBclA erzeugt.

Im Weiteren schlägt sich dies auch in der Korrelation der anti-rPA83 IgG-Titer mit den TNA-

Titern nieder.

86

Tabelle 34: Korrelation der Proteingruppen

Angegeben sind die rs-Werte der Protein-basierenden Mausgruppen; Korrelationen sindum so stärker je näher der rs-Wert an ±1gelangt; signifikante Werte sind fett gedruckt

GrupperPA83 rBclA rPA83

IgG vs IgG1 IgG vs IgG1 IgG vs TNA

NCP +0,14 - +0,36

LP +0,28 - -0,05

LB - +0,92 -

LBP +0,81 +0,95 +0,85

LBCP +0,65 +0,85 +0,59

LBCOP +0,82 +0,85 +0,65


Die Anwesenheit von BclA in einer Kombinationsvakzine könnte also einen nivellierenden

Einfluss auf die Richtung der Antikörpersubklassenentwicklung von PA und deren toxinneutra-

lisierende Eigenschaften haben ohne dabei die Titerhöhe zu beeinflussen. Eine Wirkung dieser

Art ist bisher nirgends dokumentiert. Umgekehrt scheint rPA83 keinen Einfluss auf rBclA zu

haben.

Zusatz von FIS bietet potentiell höheren Schutz, der nicht zwingend allein auf BclA beruhtZusatz von FIS bietet potentiell höheren Schutz, der nicht zwingend allein auf BclA beruht

Anschließend an die vorhergehenden Betrachtungen zur Wirksamkeit von BclA schien ein

Zusatz von FIS zu rPA83 und rBclA innerhalb der serologischen Parameter keinen weiteren

Einfluss zu haben. Nahezu alle gemessenen Antikörpertiter der Gruppen LBP, LBCP und

LBCOP waren identisch, was bei der Gegenüberstellung der IgG Titer aller Proteingruppen in

Kapitel 4.1.4 , Abbildung 33 gut zu sehen ist. Ein ähnlich detaillierterer Blick auf die Subklas-

sen wie bei BclA ist für FIS nicht möglich, da für FIS nur Messungen auf IgG-Titer durchge-

führt und abgesehen von Gruppe LBCOP nur die vereinigten Mischseren der Gruppen getestet

wurden. Eine nachweisbare starke Korrelation zwischen anti-FIS und anti-rBclA IgG-Titern

ergab sich daher nur für Gruppe LBCOP. Da die Antikörpertiter gegen FIS und rBclA auch in

den anderen Gruppen, die keine FIS erhalten hatten eine ähnliche Höhe aufwiesen, ist davon

auszugehen, dass die über FIS generierten Antikörper mehrheitlich gegen BclA gerichtet waren.

Die Möglichkeit anti-rBclA Antikörper mit FIS als Antigenkomponente zu detektieren

spricht auch für die Funktionalität der Epitope des rekombinant in E. coli gebildeten BclA und

auch für die Funktionalität der intrazellulär exprimierten BclAD1D3 DNA-Konstrukte. Im

Umkehrschluss verdeutlicht dies, dass die FIS-Präparation intakte BclA-Filamente enthielt. Die

fehlende Glykosylierung des rekombinant hergestellten BclA schien überdies keinen merkli-

chen Einfluss zu haben, obwohl für den in die Glykosilierung involvierten Zucker bereits eine

immunogene Wirkung beschrieben ist [214].

Mittels der vorhandenen, serologischen Werte ließ sich allerdings keine Aussage über den

Beitrag von FIS zur Vakzineformulation treffen. Einzig der vollständige Schutz gegen eine

Infektion mit ~50LD50 Sporen eines voll virulentem Stammes (Ames), der nur über den Zusatz

von FIS erreicht wurde, spricht für deren zusätzlichen positiven Einfluss. Damit entsprechen

die erzielten Ergebnisse den Vorarbeiten von Brossier et al. (2002) [42] und Gauthier et al.

(2009) [106], denen es gelungen war, Mäuse und Meerschweinchen mit einer Vakzinekomposi-

tion aus PA und FIS gegen eine Infektion mit einem voll virulenten Stamm zu schützen (bis

30LD50). Beide erreichten 100 % Schutzraten, wobei PA und FIS allein unter gleichen Bedin-

gungen keinen bis geringen (< 25 %) Schutz boten.

87


In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage nach dem Wert von BclA, da der Zusatz von

FIS für einen Schutz ausreichend erscheint und über FIS generierte Antikörper auch gegen BclA

gerichtet sind. Entsprechend könnten diese Antikörper die gleiche nivellierende Funktion wie

reines BclA übernehmen. Hintergrund für den Einsatz von rBclA zusätzlich zu FIS war die

Befürchtung, dass funktionale BclA-Epitope größtenteils durch die FIS-Präparation verloren

gegangen sein könnten und FIS als undefinierte Mischung bestenfalls nur Adjuvanscharakter

haben könnte. Neuere Erkenntnisse zeigen noch einen weiteren Grund für die Beibehaltung bei-

der Antigene in einer Kombinationsvakzine und erklären die mögliche Zusatzwirkung von FIS.

Nachdem Cybulsky et al. (2008) [64] 10 weitere immunogene, sporenspezifische Antigene

fanden, verdichteten sich die Belege, wonach BclA die Erkennung anderer Antigene auf der

Spore behindert. Untermauert wurde dies durch die Arbeiten von Côte et al. (2012) [61], die

Kombinationen von suboptimalen Mengen von PA mit BclA und anderen Sporenantigenen tes-

teten. Während der alleinige Zusatz von BclA und anderer Sporenantigene zu PA nur maximal

40 % der Tiere schützte, konnte eine Kombination aus PA, BclA und der Sporenantigen ExsFA

und p5303 einen kompletten Schutz vermitteln. Die Detektion von Antikörpern gegen ExsFA

und p5303 war hierbei mit BclA-defizienten Sporen wesentlich besser möglich, wodurch die

überdeckenden Eigenschaften von BclA nochmals herausgestellt wurden. Schlussendlich zeig-

ten die Ergebnisse von Vergis et al. (2013) [336] mit FIS eines B. cereus eine bessere Schutz-

wirkung von BclA-defizientem FIS im Vergleich zu BclA-tragenden Sporen und bestätigte das

Vorhandensein von mindestens 11 weiteren immunogenen, sporenspezifischen Antigenen.

Damit kann davon ausgegangen werden, dass die immunogene Wirkung von FIS nicht allein

und potentiell nicht einmal hauptsächlich auf BclA beruht. Darüber hinaus scheint BclA weitere

sporenspezifische Antigene zu überdecken und könnte als Bestandteil von Sporen einen negati-

ven Einfluss auf der Immunogenität und Schutzwirkung haben. Die beobachtete zusätzliche

Schutzwirkung von FIS in den hier gezeigten Versuchen könnte daher auf weiteren sporenspezi-

fischen Antigenen beruhen. Da rBclA erheblich zur Schutzwirkung von rPA83 beitrug, sollte es

aber weiterhin Bestandteil zukünftiger Versuche bleiben. Um beiden Erkenntnissen gerecht zu

werden, wäre eine Vakzine bestehend aus BclA-defizienten FIS, rPA83 und rBclA ein sinnvol-

ler Kompromiss, der sowohl BclA als auch die Gesamtheit an immunogenen Sporenantigenen

berücksichtigt. Die Veröffentlichungen und die damit einhergehenden Erkenntnisse sind erst

während oder nach den hier ebenfalls durchgeführten Ziegenversuchen erschienen, daher wur-

den auch für diese BclA-tragende FIS verwendet.

88


4.2.2 DNA-Vakzinen

Wie unter 4.1.4 zusammengefasst, erzeugten die DNA-Vektoren generell signifikant niedrigere

Titer gegen rPA83, aber äquivalent hohe anti-rBclA Titer wie die Proteinvakzinen. Bei ver-

gleichsweise verminderter Infektionsdosis waren alle antigentragenden Vektoren partiell pro-

tektiv, konnten aber, analog zu den Proteinvakzinen in Kombination einen nahezu vollständigen

Schutz vermitteln. Die eingesetzten Konstrukte umfassten die antigenkodierenden Vektoren

pDNAVaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-LAMP1, pDNAVaccUltra1-TPA-PA83-LAMP1, NTC-

7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1, pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1, pDNAVacc-

Ultra4-BclA-Ubiquitin und den Adjuvansvektor pDNAVaccUltra5-CIITA. In dieser Kompositi-

on waren alle Vektoren bisher unerprobt.

Vektoren mit Toxinkomponenten zeigten eine geringere Immunogenität als vergleichbare Vektoren mit Toxinkomponenten zeigten eine geringere Immunogenität als vergleichbare ProteinvakzinenProteinvakzinen

Die Grundlage für die Erstellung und Tests der Vektoren mit Toxinkomponenten bestand in

einer früheren Studie, deren Zielsetzung es war, ein atoxisches Fusionsprotein des Letaltoxins

zu erstellen, das vornehmlich neutralisierende Titer erzeugt [11]. Resultat war das in dieser Stu-

die ebenfalls verwendete LFD1PAD4, welches die PA-Bindestelle von LF [6] und die Rezeptor-

bindestelle von PA miteinander [287] vereint. Eingesetzt als Protein war es damit möglich, A/J-

Mäuse gegen eine i. p. Infektion mit ~105 Sporen der SSLV zu schützen [11]. Zuvor war dies

ebenfalls für die Einzelkomponenten PAD4 und LFD1 im BALB/c bzw. A/J Mausmodell eta-

bliert worden [243][95][307], wobei für beide Antigene eine starke IgG1-Gewichtung ungeach-

tet der Darreichungsform aufgefallen war.

Um die Wirksamkeit von LFD1PAD4 innerhalb einer DNA-Vakzine in einem Versuchsauf-

bau mit einem voll virulenten Infektionsmodell zu testen, wurde es in zwei verschiedenen Vek-

toren im Vergleich zu einen Vektor mit PA in voller Länge getestet. Diese umfassten zum einen

den von Dr. L. Baillie zur Verfügung gestellten Vektor NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 und

zum anderen, in Anlehnung an die Arbeiten von Midha et al. (2009) [211], pDNAVaccUltra1-

TPA-LFD1PAD4-LAMP1 und respektive pDNAVaccUltra1-TPA-PA83-LAMP1. Die integrier-

ten Signalsequenzen TPA, LAMP1 und das für die BclA-Vektoren zum Einsatz gekommene

Ubiquitin dienten zur gerichteten Expression der eingefassten Proteinsequenzen. Die Funktio-

nalität solcher Sequenzen war bereits in anderen Arbeiten erprobt worden [211][124][210].

Alle drei getesteten Vektoren zeigten eine signifikante Schutzrate (30 – 40 %) gegenüber ei-

ner Infektion mit Ames-Sporen (~25LD50), wobei die gemessenen anti-rPA83 und TNA-Titer

einen mindestens zehnfach niedrigeren Wert als die analogen Proteingruppen aufwiesen. Dies

war auch schon in vorhergehenden Versuchen mit PA83 in einem sekretierenden und endoso-

mal verankernden Vektor aufgefallen [125], der bei gleicher Infektionsdosis im gleichen Tier-

89


modell ebenfalls eine ähnliche Schutzrate (30 %) zeigte. Da dies für Vektoren mit LFD1PAD4,

PA83 (diese Arbeit [125]) und PAD4 [24] gleichermaßen zutraf, ist davon auszugehen, dass die

serologischen Unterschiede zwischen der Protein- und DNA-Vakzine nicht auf die Verkürzung

des Fusionsproteins auf einzelne Domänen zurückzuführen sind. Die generelle Funktion der

Vektoren oder die Form der DNA-Vakzinierung als Ursache für die Diskrepanz anzunehmen,

scheint aber ebenfalls unplausibel, da die gleichen Vektoren mit integrierter Sequenz von BclA-

D1D3 äquivalente Titer gegenüber der Proteinapplikation erzeugen konnten. Zudem erreichten

die von Midha et al. (2009) [211] getesteten gleichartigen Vektoren mit PA63 äquivalente Titer

im Vergleich zu PA63 und PA83 als Protein. Unterscheidungsmerkmal war hier allerdings die

Form der Applikation als i. m. Injektion, sowie die applizierte Menge von 100 µg pro Dosis.

Ebenso könnte das verwendete Tiermodell einen Einfluss haben, da Tests mit PA und dessen

Domänen in verschiedenen Mausmodellen unterschiedliche Immunogenität aufwiesen [1]. Eine

generelle Erhöhung der DNA-Menge für die applizierten Toxin-Vektoren wäre also möglicher-

weise zuträglich für eine verbesserte Titerentwicklung gewesen, was aber nicht zwingend

gleichbedeutend mit einer besseren Schutzwirkung sein muss.

Die internen Unterschiede der Toxinvektoren sind vermutlich dosisbedingtDie internen Unterschiede der Toxinvektoren sind vermutlich dosisbedingt

Unterschiede zwischen den getesteten DNA-Vektoren betrafen die Antikörpertiter gegen rPA83,

welche für Gruppe TA (pDNAVaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-LAMP1) im Gegensatz zu Grup-

pe NS (NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1) und TH (pDNAVaccUltra1-TPA-PA83-LAMP1)

nur geringfügig erhöht waren. Gegen rLF waren vergleichsweise niedrigere Titer in Gruppe TA

als für Gruppe NS gemessen worden. Abgesehen von der Höhe der gemessenen Titer, war das

Antikörperspektrum von TA und NS gleich, wobei die gebildeten anti-rLF IgG-Titer signifikant

höher als die anti-rPA83 IgG-Titer waren (p ≤ 0,035). Damit scheint die verminderte Immuno-

genität von pDNAVaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-LAMP1 den Vektor, bzw. die Vakzinekomposi-

tion insgesamt zu betreffen. Abgesehen vom schlichten Unterschied der Menge an applizierter

antigenkodierender DNA der Gruppen NS und TA, die für Gruppe NS aufgrund der Abwesen-

heit eines weiteren Vektors doppelt so hoch war wie für Gruppe TA sind auch funktionelle

Unterschiede denkbar. Hierbei könnte eine Zurückhaltung des Fusionsproteins im Lysosom

durch LAMP1 nachteilig sein, da für eine umfangreiche immunogene Wirkung von PA dessen

Sekretion und Rezeptorbindung [75][43] essentiell wichtig sind. Eine Verminderung dieses Pro-

zesses durch lysosomal gerichtete Expression könnte somit negative Auswirkung auf die Immu-

nogenität des Vektors gehabt haben. Da PA83 und BclAD1D3 im gleichen Vektor funktional

waren und ähnliche Studien mit Kombinationen aus sekretierenden und intrazellulär einschleu-

senden Vektoren [211][125] keine nachteiligen Wirkungen aufzeigten, ist der Konzentrations-

90


unterschied zwischen Gruppe NS und TA als wahrscheinliche Ursache für die dokumentierten

Unterschiede anzunehmen. Da diese Konzentrationsunterschiede auch Gruppe TH betraf und

diese äquivalente anti-rPA83 Titer wie Gruppe NS vorwies, ist davon auszugehen, dass das Vor-

handensein von PA in voller Länge bei dieser Gruppe die Konzentrationsunterschiede ausgegli-

chen haben könnte.

Trotz der geringen immunogenen Wirkung des Vektors überlebten in Gruppe TA 40 % der

Tiere, wobei nur die Überlebenden einen anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion zeigten. Daher

war für diese Gruppe eine signifikante Korrelation der anti-rPA83 und anti-rLF IgG-Titer zum

Überleben vorhanden. Die Arbeiten von Brossier et al. (2000) [43] deuteten diesbezüglich an,

dass innerhalb einer Lebendvakzine marginale anti-PA Titer die Schutzwirkung von LF erhöhen

können, wohingegen bei gänzlicher Abwesenheit von PA kein Schutz durch LF erzielt wurde.

Eine ähnliche Beziehung könnte für das Fusionsprotein in beiden Vektoren ebenfalls zutreffen,

wenngleich entsprechende Korrelationen aufgrund der klaren serologischen Unterscheidbarkeit

zwischen Lebenden und Verstorbenen im Bezug auf die Antikörpertiter vor der Infektion nur für

Gruppe TA zu sehen sind. Diese Unterschiede könnten allerdings ebenfalls bei NTC7382-TPA-

LFD1PAD4-mIPS-1 vorhanden, aber durch quantitativ dominantere, für den Schutz aber uner-

hebliche Antikörperfraktionen überdeckt worden sein.

DNA-Vektoren mit BclAD1D3 stimulierten eine sterile Immunität bei 50DNA-Vektoren mit BclAD1D3 stimulierten eine sterile Immunität bei 50 % Schutzrate% Schutzrate

Die verkürzte Sequenz von BclAD1D3 wurde in zwei verschiedenen Vakzinevektoren ange-

wendet. Zum einen flankiert von TPA und LAMP1 (Gruppe TK) und zum anderen mit Ubiqui-

tin (Gruppe TM) als Signalsequenz. Beide Konstrukte erzeugten hohe Antikörpertiter gegen

rBclA, welche denen vergleichbarer Proteinanwendungen entsprachen. Einen signifikanten

Unterschied zwischen den Konstrukten gab es nicht. Beide zeigten, wie auch die Toxinvekto-

ren, eine hohen IgG1-Dominanz, sodass vektorspezifische Unterschiede bzw. Veränderungen in

der Subklassengewichtung durch unterschiedliche Signalsequenzen nicht erkennbar waren.

Dies kann auf die Art der Applikation mittels GeneGun zurückzuführen sein, die als Anwen-

dung selbst die Subklassengewichtung stark in Richtung TH2 (IgG1) beeinflusst [91][350].

Damit traf die durch Midha et al. (2009) [211] beschriebene unterschiedliche Immunogenität

der beiden Vektoren nicht auf die hier verwendeten Konstrukte zu. Dort zeigte der Vektor

pPA63-Ubiquitin im Vergleich zu pTPA-PA63-Lamp1 deutlich niedrigere Titer mit einer stärke-

ren IgG2a-Gewichtung. Allerdings waren diese Ergebnisse wahrscheinlich nicht durch die Art

der Applikation beeinflusst, da dort eine i. m. Injektion vorgenommen wurde.

Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse für BclAD1D3 entsprachen bezüglich der

erreichten Antikörpertiter und deren Gewichtung einer früheren Studie mit ähnlichem

91


Versuchsaufbau, bei dem die gesamte Sequenz von BclA in einem sekretierenden Vektor

erprobt wurde [125]. Die Menge an antigenkodierender DNA war doppelt so hoch wie in den in

dieser Arbeit präsentierten Gruppen, erzielte aber keine höheren Titer und erzeugte nur Schutz-

raten von 20 % bei einer äquivalenten Infektion. Damit übertrafen beide hier getesteten Vekto-

ren mit 50 % Überlebenden die bisher getesteten rein auf BclA basierenden DNA- und Protein-

vakzine [39][61], was darauf hindeutet, dass die Deletion der CLR, wie von Liu et al. (2007)

[195] beabsichtigt, einen signifikanten Effekt auf die Immunogenität von BclA hatte. Dieser

Effekt könnte auch darauf zurückzuführen sein, dass BclAD1D3 durch das Fehlen der CLR

nicht trimerisiert [254][32] und so eventuell weitere Epitope zugänglich sind. Ebenso ist davon

auszugehen, dass die hier applizierte Menge an antigentragender DNA für eine maximale

immunogene Wirkung von BclA ausreichend ist, da auch in anderen Studien mit höheren

Konzentrationen keine höheren Titer erzeugt wurden [125].

Von besonderer Bedeutung ist, dass messbare anti-rPA83 IgG-Titer in den Seren aller überle-

benden Tiere nach der Infektion abwesend waren. Dies deutet darauf hin, dass die durch die

Impfung erzeugte Immunität zur Erkennung und Beseitigung der initialen Sporenlast der Infek-

tion ausreichte, ohne eine wesentliche Etablierung der Infektion und damit einhergehender Ger-

mination und Ausschüttung von Toxinen zuzulassen.

Die kombinierte DNA-Vakzine TKS vermittelte nahezu vollständigen Schutz gegen eine voll Die kombinierte DNA-Vakzine TKS vermittelte nahezu vollständigen Schutz gegen eine voll virulente Infektion mit virulente Infektion mit B.B. anthracisanthracis

Um herauszufinden, ob eine Kombination aus Toxin- und Sporenantigenen auf Ebene der

DNA-Vakzine einen ähnlichen additiven Effekt wie bei den Proteinvakzinen aufweist, sollten

die erfolgversprechendsten Vektoren gemeinsam appliziert werden. Als Toxinvektor wurde

NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 der Gruppe NS ausgesucht. Die Verwendung von pDNA-

VaccUltra1-TPA-LFD1PAD4-LAMP1 (Gruppe TA) wurde nicht in Erwägung gezogen, da ein

rein sekretierender Vektor in Kombination mit einem zusätzlichen, vektorinternen Adjuvans

entsprechend der zuvor erörterten Punkte vorteilhafter schien.

Beide Vektoren für BclAD1D3 waren gleichermaßen geeignet. Da eine eventuelle negative

Wirkung von Ubiquitin [211] auf den Toxinvektor vermieden werden sollte, bekam das Vektor-

konstrukt VaccUltra1-TPA-BclAD1D3-LAMP1 (Gruppe TK) den Vorzug. Unter Zusatz des

CIITA-kodierenden Vektors als Adjuvans stellte diese Kombinationsgruppe (TKS) nicht nur

eine Vakzinekombination, bestehend aus den Antigenen BclA, LF und PA dar, sondern beinhal-

tete ebenso zwei funktionale Adjuvanzien. Zum besseren Vergleich der Vakzinekombination

waren die Konzentrationen der einzelnen Vektoren so gewählt, dass sie denen der Einzelappli-

kationen entsprachen.

92


Die entsprechend vakzinierte Gruppe TKS zeigte eine Schutzrate von 90 %, wobei das einzi-

ge verstorbene Tiere eine verlängerte Überlebenszeit aufwies. Dieser Anstieg der Schutzrate im

Vergleich zu den Einzelapplikationen spiegelte sich auch in einer Erhöhung der anti-PA83 IgG-

Titer wider, obgleich diese weiterhin nicht das Maß der Proteinvakzinen erreichten. Interessan-

terweise ging diese Erhöhung nicht mit gesteigerten TNA-Titern einher, welche tendenziell

sogar niedriger waren. Daher ist davon auszugehen, dass die zusätzlich gebildeten anti-rPA83

Antikörper eher markierende oder germinationshemmende Eigenschaften aufwiesen. Die Erhö-

hung der Immunogenität gegen PA könnte mit der Anwesenheit sowohl von CIITA als auch von

BclAD1D3 in Zusammenhang stehen. Ein entsprechender positiver Einfluss von BclA auf anti-

rPA83 Titer wurde bereits in einer anderen Proteinstudie bemerkt [61].

Bei genauerem Blick auf die Subklassenkorrelationen der Antikörper fällt auf, dass bezüg-

lich der anti-rPA83 Titer nur Gruppe NS mit rs = +0,19 eine ebenso niedrige Korrelation der

IgG- und IgG1-Titer zeigte wie die Proteinvakzinen ohne BclA. Dies war allerdings bei den

anderen Toxinvektoren aus Gruppe TA und TH mit rs ≥ +0,85 und der Kombinationsgruppe

TKS mit rs = +0,77 nicht der Fall. Die entsprechende Verschiebung muss also eher auf die

Anwesenheit des zusätzlichen Adjuvans CIITA zurückzuführen sein, statt wie bei den Proteinen

auf BclA, und könnte ebenfalls ein Grund für das veränderte Verhältnis von TNA zu anti-rPA83

IgG-Titern in der Kombination sein. Die initial niedrige Korrelation der IgG-/IgG1-Titer der NS

Gruppe wiederum könnte mit dem Vektor zusammenhängen. Dieser ist im Gegensatz zu den

anderen eingesetzten Vektoren CpG optimiert und sollte somit neben einer verbesserten Anti-

genpräsentation und der Auslösung der Produktion von Zytokinen und Chemokinen vornehm-

lich TH1-Zellen aktivieren [173][13][169]. Allerdings sind kaum IgG2a-Titer für Gruppe NS

gemessen worden, welche für eine TH1-Antwort sprächen.

Sowohl für BclA als auch für LF waren bei allen Einzelanwendungen der Vektoren starke

Korrelationen zwischen IgG und IgG1 vorhanden (rs ≥ +0,91). Die Kombinationsgruppe TKS

zeigte für BclA eine drastisch verringerte Korrelation zwischen IgG und IgG1 (rs = +0,61) und

wies generell deutlich verringerte anti-rBclA Titer auf, die in der Höhe den Antikörpertitern

gegen die Toxine entsprachen. Da diesbezüglich in der Kombination nur der Vektor NTC7382-

TPA-LFD1PAD4-mIPS-1 eine Neuerung darstellt, könnte der beschriebene Effekt der CpG-

Motive auch hierbei eine Rolle spielen.

Eine weitere Begründung für die signifikant niedrigeren Titer gegen rBclA der Gruppe TKS

könnte in der Anwendung von Mischpatronen bei der Applikation gelegen haben. Zur Ermögli-

chung eines vollständigen Zusammenwirkens aller Vektoren sollte die Mischung der Vektoren

sicherstellen, dass über den GenGun-Beschuss applizierte Goldpartikel möglichst Kopien aller

Vektoren enthalten. Damit sollte gewährleistet werden, dass möglichst alle Vektoren gleichzei-

tig in einer Zelle vorhanden sind. Bei einer Verteilung der Vektoren auf verschiedene Patronen

93


wäre dies eher unwahrscheinlich gewesen. Das Zusammenwirken mehrerer antigentragender

Vektoren in einer Zelle könnte aber auch nachteilig sein, da sie, wie schon im Bezug auf Grup-

pe NS angedeutet, gegenläufige stimulatorische Signale auslösen könnten. Außerdem wäre,

bedingt durch die Kapazität einer Zelle zur Antigenpräsentation, eine Konkurrenz der Antigene

möglich. Im Falle einer kapazitätsbedingten Konkurrenz müssten beide Antigene eine gleich-

starke Reaktion hervorrufen, wenn keines der Antigene bevorzugt präsentiert wird und eine

Absättigung der Antigenpräsentation erreicht ist. Die Ergebnisse von Gruppe TKS sprächen für

ein solches Szenario, da die Antikörpertiter gegen rPA83, rLF und rBclA, im Gegensatz zu den

Einzelapplikationen der Vektoren, eine ähnliche Höhe haben. Diese These unterstützend zeigten

die Versuche von Hahn et al. (2006) [125][24], dass bei einer separaten Applikation der Vekto-

ren für BclA und PA Antikörpertiter erzeugt werden konnten, die denen der Einzelapplikationen

derselben Vektoren glichen.

Die anti-rLF IgG-Titer der Kombinationsvakzine waren indes unverändert im Vergleich zur

Einzelapplikation. Die einzige feststellbare Veränderung war ein Anstieg der Korrelation zwi-

schen TNA-Titern und IgG- bzw. IgG1-Titern (rs ≥ +0,85). Denkbar wäre also, dass die neutrali-

sierenden Eigenschaften der gebildeten Antikörper der Kombinationsvakzine aufgrund der

erläuterten Verschiebungen eher auf LF, denn PA zurückzuführen sind, zumal die steigenden

anti-rPA83 Titer die TNA-Titer nicht weiter erhöht haben.

Generell waren die individuellen Titer in der Gruppe TKS weitaus weniger gestreut, was

vermutlich auf die erhöhte Gesamtmenge an applizierter DNA zurückzuführen ist. Ähnliche

Ergebnisse erzielten Hahn et al. (2004) [124], wo eine starke Streuung bei niedrigen DNA-

Mengen (~1 µg) durch Applikation von ~5 µg DNA vermindert werden konnte. Die Vereinheit-

lichung der Titerwerte könnten aber auch auf die Zusammenwirkung der Vektoren und/oder

Antigene zurückzuführen sein.

Zusammenfassung der MausversucheZusammenfassung der Mausversuche

Die Erprobung von Vakzinekomponenten im NMRI-Mausmodell für eine NLV ergab sowohl

für die DNA- als auch die Proteinvakzinen Kompositionen, deren Immunogenität und Schutz-

wirkung eine Erprobung im Ziegenmodell rechtfertigten. Dabei wurde nachgewiesen, dass das

Kapselkonjugat nichts zur Schutzwirkung beitrug, was vermutlich auf ein immunsuppressives

Epitop im Lipopeptid zurückzuführen war. Daher wurde ein potentieller Einsatz innerhalb der

Kombinationsvakzine mit diesem Konstrukt nicht weiter verfolgt. Ein äquivalenter Ansatz mit

einem anderen integrierten Epitop im Lipopeptid, im Speziellen sogar das in dieser Studie als

eigenständiges Adjuvans verwendete Lipopeptid, wären aber für zukünftige Studien denkbar.

94


PA und BclA wirkten einander unterstützend und erzeugten in Kombination eine Schutz-

wirkung, die höher als die der Einzelanwendung beider Antigene zusammengenommen war.

Dieser Schutz wurde durch den Zusatz von FIS komplettiert, wobei das in den FIS vorhandene

BclA wahrscheinlich mögliche weitere immunogene Antigene verdeckte. Daher wäre eine FIS

Präparation mit einem BclA-defizienten Stamm unter separater Zugabe von rBclA bzw. rBclA-

D1D3 und rPA83 bzw. einem Kapselkonjugat mit PA eine erfolgversprechende Kombinations-

vakzine für zukünftige Anwendungen. Für die nachfolgenden Ziegenversuche konnten diese

Erkenntnisse noch nicht umgesetzt werden, sodass je eine Kombination aus rPA83, rBclA und

Lipopeptid sowohl mit als auch ohne Zusatz von FIS im Vergleich zur SSLV getestet wurde.

Im Vergleich zu den Proteinvakzinen und den auf BclA basierenden Vektoren zeigten die

Toxinvektoren generell ca. zehnfach niedrigere Antikörpertiter. Trotzdem konnten durch den

Einsatz des Fusionsproteins im Verhältnis zu den anti-Toxin Antikörpertitern ähnliche TNA-

Titer wie in den Proteinvakzinen erzeugt werden.

Die Verwendung von BclAD1D3 stimulierte eine sterile Immunität bei 50 % Schutzrate, was

alle bisherigen Anwendungen dieser Art übertraf. Durch Kombination der Toxin- und BclA

Vektoren konnte auch hier ein nahezu vollständiger Schutz erzeugt werden, wenngleich die

Infektionsdosis im Vergleich zur Proteinstudie halbiert war. Auf Grundlage der hier erzielten

Ergebnisse wären potentiell alle getesteten Vektoren für einen Einsatz in einer Kombinations-

vakzine denkbar, wobei für einen auf PA basierenden Vektor generell ein rein sekretorisches

Signal vermutlich vorteilhafter gewesen wäre. Ebenso könnte eine getrennte, aber gleichzeitige

Applikation der antigentragenden Vektoren, verteilt auf verschiedene Patronen, sowie eine

Erhöhung der Konzentration zur zukünftigen Verbesserung der Wirkung in Erwägung gezogen

werden. Für die weiterführenden Tests im Ziegenmodell wurde eine Vektorkombination analog

zur Mausgruppe TKS i. m. in weitaus höheren Konzentrationen angewendet.

95


4.3 Testung von Vakzinekomponenten in Burenziegen

Die Vakzinierungs- und Infektionsversuche in Burenziegen fanden in Südafrika unter Koopera-

tion mit der Universität Pretoria und SANParks statt. Entsprechend der Vorversuche im NMRI-

Mausmodell wurden die in Tabelle 15 aufgeführten Gruppen immunisiert. Der Versuchsaufbau

umfasste drei Vergleichsgruppen, die mit der SSLV immunisiert wurden (Gruppe 2 und 3 a/b),

drei naive Kontrollgruppen (Gruppe 1, NK und LK), zwei Protein-basierende Vakzinegruppen

(Gruppe 4 und 6) und eine DNA-basierende Vakzinegruppe (Gruppe 5). Ein separater Wieder-

holungsversuch der Gruppe 4 und 6, inklusive einer weiteren naiven Kontrollgruppe schloss

sich in Zusammenarbeit mit der Kafkas Universität (Türkei) an. Da die Details zur Versuchs-

durchführung leicht von den in Südafrika durchgeführten Versuchen abweichen, werden die

Wiederholungsversuche im Anschluss gesondert behandelt (siehe Kapitel 4.3.8).

Zur serologischen Evaluation der Vakzinen wurden Antikörpertiter gegen rPA83, rBclA, rLF,

FIS und eine vegetative Antigenpräparation mittels ELISA bestimmt. Soweit nicht anders ver-

merkt, wurden nur Titerbestimmungen zur IgG Subklasse vorgenommen. Zur qualitativen

Bewertung der Toxin-Antikörpertiter ist außerdem der Neutralisationstiter mittels TNA

bestimmt worden. Im Kontrast zu den Mausversuchen wurde auch die Titerentwicklung über

die Zeit berücksichtigt. Details zu den entsprechenden Probenahmen finden sich in Tabelle 53

und 54 im Anhang und entsprechend bei den Beschreibungen der Gruppen. Generell wurden

alle Individuen mindestens vor dem Beginn der Immunisierung, vor jeder weiteren Immunisie-

rung sowie vor und nach der Infektion für die Untersuchung der Serokonversion geblutet.

Neben der Testung der Vakzinekomponenten war der Versuchsaufbau in Südafrika zudem

darauf ausgelegt, die Pathogenität des zur Infektion verwendeten Feldisolats SD20 [181] zu

verifizieren, sowie dessen minimale letale Dosis (MLD) in Burenziegen einzugrenzen. Zudem

war eine detaillierte Betrachtung der Titerentwicklung der SSLV-immunisierten Tiere im Ver-

lauf eines Jahres nebst Revakzinierung von Interesse, da Daten dieser Art für Großtiere und

Feldversuche nur bedingt vorhanden oder veraltet sind. Diesbezüglich war auch die Durchfüh-

rung der Infektion außerhalb der Rahmenbedingungen eines Labors und die Diagnostik auf

Grundlage der Interpretation von Verhalten, Temperatur und systemischer Bakterienlast bisher

unerprobt und barg für zukünftige Versuche entsprechend verwertbare Ergebnisse. Alle folgen-

den Daten und Angaben beziehen sich zunächst nur auf die Versuche in Südafrika.

4.3.1 Gesundheitszustand der Ziegen vor der Infektion

Nach dem Transport der Ziegen zum Infektionsort, wurde ihr Zustand genau untersucht. Wie in

Tabelle 35 ersichtlich wiesen einige Tiere teils durch den Transport (Husten und Schnupfen),

teils durch die vorhergehende Haltung (kleinere bilaterale Abszesse) bedingte Krankheitssym-

96


ptome auf. Einige der Symptome blieben auch nach der Akklimatisierung und während des

gesamten Versuchs erhalten und könnten das Ergebnis beeinflusst haben. Die bemerkten

Abszesse bei einigen Ziegen waren bereits zu Beginn der Haltung immer wieder aufgetreten

und erfahrungsbedingt mit einer persistierende Infektion von Corynebacterium pseudotubercu-

losis in Verbindung gebracht worden. Ein nachträglicher Test exemplarischer Seren auf Pseudo-

tuberkulose (pTBC) Antikörper (siehe Anhang Tabelle 59) durch Dr. Sting (CVUA Fellbach)

bestätigte diese Vermutung insofern, als ein Großteil der Tiere positive Testergebnisse zeigte.

Die Beeinträchtigung der Ziegen durch die genannten Krankheitssymptome schien jedoch

gering. Auffällig war ebenfalls die gemessene Temperatur der Ziegen, die individuell stark

schwankte und bereits vor der Infektion Werte von 37,6 – 40,2 °C annehmen konnte.

Aufgrund des begrenzten Platzangebots an der Ver-

suchsanlage wurde die Infektion in zwei Etappen

durchgeführt. Für die erste Etappe wurden Gruppe 4

und 6 sowie Gruppe NK und LK direkt von Pretoria

zur Versuchsanlage im Krüger Nationalpark

(~600 km) verbracht und für 5 – 14 Tage akklimati-

siert (Details siehe Tabelle 53 Anhang). Zwecks einer

erhofften Verbesserung des Gesundheitszustands nach

dem Transport wurden die Versuchstiere der zweiten

Etappe (Gruppen 1 – 3) einige Wochen früher in den

Nationalpark transportiert und in der Nähe der Ver-

suchsanlage versorgt. Die endgültige Überführung zur

Versuchsanlage geschah 14 Tage vor der Infektion.

Trotz der umfangreich gestatteten Akklimatisierung

an das Gebiet das Krüger Nationalparks zeigten auch

diese Tiere die beschriebenen Symptome und Tempe-

raturschwankungen. Zudem ergab sich durch die ver-

längerte Haltung in diesem Gebiet ein erhöhtes Risiko

für eine Herzwassererkrankung, welche in der zweiten

Etappe zum Verlust von drei Versuchstieren führte.

Die Infektionsgefahr für die Herzwasserkrankheit

bestand dabei nur für die Zwischenhaltung im Natio-

nalpark für den Zeitraum zwischen Transport und

Infektion, da dort Zugang zu natürlichem Bewuchs

vorhanden war. Die Stallungen für Immunisierung

97

Tabelle 35: Gesundheitszustand nach Transport

Gesundheitszustand und rektale Temperatur (°C) derVersuchstiere einen Tag nach dem Transport zurVersuchsanlage; An der Herzwasserkrankheit erkrankteTiere (in grau) verstarben oder wurden behandelt undvom Infektionsversuch ausgeschlossen; Gruppe 5 istnicht aufgeführt, da diese nicht infiziert wurde; n.v. -nicht vorhanden

Gruppe

II NK 37,6 gesund

VI NK 39,0 gesund

8202 LK 39,0 leichter Husten

8203 LK 38,6 leichter Husten

8185 1 38,9 gesund

1 n.v.

8187 1 39,9 leichter Husten

8210 2 38,8 gesund

8211 2 39,0 gesund


8213 2 39,0 gesund


8172 3a 37,7 gesund

8173 3a 40,2 leichter Husten

3b n.v.

8175 3b 37,9 gesund

8176 3a 38,3 leichter Husten

8178 3a 38,2 gesund

3b 38,8

8180 3a n.v. gesund

8181 3b 39,0 gesund

8182 3b 38,6 gesund und läufig


8190 4 39,4 tränende Augen

8192 4 39,3 gesund

8198 4 38,9 gesund

8199 4 39,8

8191 6 39,7 tränende Augen

8194 6 39,0 gesund

8195 6 39,4 gesund

8200 6 38,7 gesund

8201 6 39,3 gesund

Ziegen Nr.

Temperatura Zustand nach Transport

8186b verstarb an der Herzwasserkrankheit

8174b verstarb an der Herzwasserkrankheit

8179b infiziert mit der Herzwasserkrankheit

bilaterale Abszesse (Wange)

a rektal gemessen am Tag nach dem Transportb wurde nicht infiziert


und Infektion waren betoniert und entsprechend so eingezäunt, dass ein Kontakt zur Bepflan-

zung nicht möglich war.

4.3.2 Überprüfung der Infektiösität der Sporen im BALB/c Mausmodell

Vor dem Beginn der Infektionsversuche an Ziegen mit dem vorbereiteten Feldisolat SD20

musste dessen Virulenz zweifelsfrei festgestellt werden. Dieser war zuvor bereits durch

E. Lekota [181] mikrobiologisch und genetisch verifiziert und als voll virulent klassifiziert wor-

den. Zur Bestätigung der Virulenz wurden 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse in zwei

Gruppen zu je 3 Tieren mit 500 und 1000 Sporen i. p. mit dem Feldisolat infiziert. Entspre-

chend der eingesetzten Konzentration sind die Mausgruppen mit M500 und M1000 bezeichnet

worden.

Einen Tag nach der Infektion waren in Gruppe M500 1 Tier und in M1000 2 Tiere verstor-

ben. Alle übrigen Tiere verstarben bis zum 2. Tag nach der Infektion. Zur Verifizierung der

Todesursache wurde allen Tieren durch Herzpunktion Blut entnommen und die Anwesenheit

des Erregers mikroskopisch bzw. mittels Ausstrich auf Blutplatten nachgewiesen.

4.3.3 Kontrollgruppen

Für den gesamten Versuchsaufbau wurden drei verschiedene Kontrollgruppen mitgeführt. Diese

umfassten Gruppe 1 mit 3 Tieren, sowie LK und NK mit je 2 Tieren. Gruppe 1 erhielt einmalig

eine Injektion mit 1 ml PBS, dem Verdünnungsmedium der SSLV und wurde während der kom-

pletten Versuchsdauer zusammen mit den SSLV immunisierten Ziegen der Gruppe 3 gehalten

und in gleichem Maße beprobt und analysiert, um einen permanenten serologischen Vergleich

zu erhalten. Auf Gruppe 1 wird bis auf die für die Infektion relevanten Daten entsprechend in

Kapitel 4.3.5.1 ausführlich im Vergleich mit den SSLV immunisierten Gruppen 2 und 3 a/b ein-

gegangen.

Die Ziegen der Gruppe LK wurden je einmal s. c. mit je 500 µg Lipopeptid paramunisiert,

um etwaige negative Effekte des Adjuvans in Ziegen abzuklären und eine eventuell auftretende

Schutzwirkung des Lipopeptids abschätzen zu können. Nebenwirkungen aufgrund der Applika-

tion des Lipopeptids sind weder bei dieser Gruppe noch bei allen weiteren Gruppen, die damit

immunisiert wurden, aufgetreten. Bei der Gruppe NK handelte es sich um komplett ungeimpfte

Tiere, die zur Verifikation der Virulenz des eingesetzten Feldisolats SD20 in Ziegen und der

Abschätzung der zu verwendenden Infektionsdosis dienten.

Zum Abgleich zu den eigentlichen Testgruppen wurden alle genannten Kontrollgruppen auf

IgG-Antikörper gegen rBclA, rPA83, FIS und vegetatives Antigen sowie TNA-Titer getestet.

98


Die in Tabelle 36 dargestellten Titer-Werte stammen von vereinigten Blutseren der jeweiligen

Gruppen, welche direkt vor der Infektion entnommen wurde.

Für alle gemessenen Antigene wurden in

allen Kontrollgruppen niedrige unspezifi-

sche IgG-Titer detektiert. Diese waren in

schwankender Höhe bereits vor dem Beginn

der Immunisierung und für den gesamten

Versuchszeitraum für diese Gruppen und die

Negativseren der Impfgruppen messbar. Dies betraf auch die nur für die DNA-Vakzinen ermit-

telten anti-rLF IgG-Titer. Unter Einbeziehung aller gemessenen naiven Seren ergaben sich

Schwankungsbreiten von <100 – 2539 für anti-rPA83 IgG, 400 – 1056 für anti-rLF IgG,

162 – 2122 für anti-rBclA IgG, 575 – 1856 für anti-FIS IgG und 158 – 300 für anti-vegetativ

IgG. Die gemessenen unspezifischen Hintergrundtiter bei nicht immunisierten Tieren schwank-

ten individuell stark und waren auch im zeitlichen Verlauf nicht einheitlich (siehe hierzu beson-

ders Gruppe 1, Kapitel 4.3.5.1). Daher wurde bei den Einzeldarstellungen jeder Gruppe von

einer Normalisierung gegen die gemessenen Werte vor der Immunisierung abgesehen, um die

Schwankungen in die gruppeninterne Statistik mit einzubeziehen. Beim Vergleich der Gruppen

untereinander wurden die individuellen Titerdaten gegen ihren jeweiligen Titerwert in Woche 0

normalisiert, um eine bessere Vergleichbarkeit zu gewährleisten.

4.3.4 Ermittlung der MLD

Zur Eingrenzung der MLD des Feldisolats SD20 und

der endgültigen Feststellung der Virulenz des Stammes

im Ziegenmodell wurde eine Infektion der Kontroll-

gruppen mit unterschiedlichen Sporenkonzentrationen

durchgeführt. Das Infektionsvolumen betrug hierbei

1 ml mit avisierten Dosen von 50, 200 und 1000 Spo-

ren, welche s. c. in den Hinterlauf unter Fixierung der

Tiere appliziert wurden. Entsprechend der Vorgehens-

weise innerhalb der Mausversuche waren auch hier

überzählig abgefüllte Infektionsdosen zur Bestimmung

der tatsächlich applizierten Menge an Sporen auszuzählen (Kapitel 3.2.6) und ergaben durch-

schnittlich 36, 172 und 844 Sporen pro Dosis.

Die Ergebnisse der Infektion sind in Tabelle 37 dargestellt. Durch die haltungsbedingte

Exponiertheit der Versuchstiere war es möglich, den Zeitpunkt des Todes in den meisten Fällen

99

Tabelle 36: Kontrollgruppen (Ziege)

ELISA IgG- und TNA-Titer der Kontrollgruppen der Ziegenversuchevor der Infektion als vereinigte Seren gemessen oder als gemittelterWert der Individualmessungen; Titer-Werte ergeben sich als reziprokerWert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1.

Gruppe rBclA rPA83 TNA FIS Vegetativ

1 162 800 <50 1550 231

NK 247 271 <50 600 141

LK 247 235 <50 537 141

Tabelle 37: Bestimmung der MLD

Überlebenszeit der Kontrollgruppen derZiegenversuche nach Infektion mit 36, 172 undrespektive 844 Sporen des voll virulenten FeldisolatsSD20; Der Todeszeitpunkt der NK konnte nicht genaubestimmt werden und ist entsprechend als Zeitfensterangegeben; M – Mittelwert

Gruppe Ziegen Infektionsdosis Überlebenszeit

Nr. (Sporen) (in h)

1 818536

57,3

8187 83,3

M 70,3

NK II172

66,3 – 67,5

VI 57,5 – 63,5

M 61,9 – 65,5

LK 8202844

37,8

8203 63,5

M 50,7


genau zu bestimmen. Für die Gruppe NK war dies nicht der Fall, sodass entsprechend ein Zeit-

fenster angegeben wurde. Wenngleich anhand der überlebten Stunden eine Tendenz zu einer

verkürzten Überlebenszeit bei steigender Sporenkonzentration erkennbar ist, so unterschieden

sich die Überlebensdaten der Kontrollgruppen vermutlich aufgrund der kleinen Gruppengröße

nicht signifikant voneinander (siehe Kapitel 4.3.11). Da auch eine Dosis von 36 Sporen spätes-

tens 4 Tage nach der Infektion zum Tode führte, ist davon auszugehen, dass die MLD für diesen

Stamm in diesem Tiermodel unter 36 Sporen liegt.

Für alle weiteren Versuche durfte die Höhe der Infektionsdosis nicht zu niedrig angesetzt

werden, um eine aussagekräftige Diskriminierung zwischen Impf- und Kontrollgruppen und

einen schnellen Krankheitsfortschritt (< 3 Tage) in nicht geschützten Tieren zu bewirken. Eine

zu stark erhöhte Dosis könnte ebenfalls negative Auswirkungen haben, da die Unterscheidbar-

keit der Wirksamkeit verschiedener Impfgruppen beeinträchtigt sein könnte. Daher wurde für

alle weiteren Gruppen eine Infektionsdosis von ~850 Sporen ausgewählt.

4.3.5 Einzelbetrachtungen der Immunisierungen von Burenziegen mit der SSLV (Sterne Sporen Lebendvakzine)

Die Zielsetzung der Studie war es, alternative Impfkomponenten zur veterinärmedizinisch ein-

gesetzten SSLV zu testen. Daher wurden mehrere Ziegengruppen mit der SSLV immunisiert,

um sowohl vergleichende serologische Daten zu erheben als auch einen direkten Vergleich in

Bezug auf die Schutzwirkung gegenüber einer tödlichen Infektion zu haben. Hierfür wurden

drei Gruppen (Gruppe 2, 3a und 3b) verwendet.

Für einen fortdauernden Impfschutz muss die Immunisierung mit der SSLV jährlich aufge-

frischt werden, wobei ein Impfschutz bereits 2 – 4 Wochen nach der initialen Immunisierung

bestehen soll (Angaben des Herstellers OBP). Aus diesem Grund war die schützende Wirkung

der SSLV direkt nach der Vakzinierung, nach dem Verlauf von einem Jahr und direkt nach einer

Auffrischungsimpfung von Interesse. Dementsprechend wurden 10 naive Tiere mit der SSLV

immunisiert und im Verlauf eines Jahres monatlich geblutet (Gruppe 3). 58 Wochen nach der

Erstimmunisierung wurden fünf dieser Tiere zufällig ausgewählt und erneut mit der SSLV

immunisiert, sodass sich eine Teilung von Gruppe 3 in 3a (ohne Auffrischungsimpfung) und 3b

(mit Auffrischungsimpfung) ergab. Zeitgleich mit der Auffrischungsimpfung wurde eine weite-

re naive Gruppe von 5 Ziegen ebenfalls mit der SSLV geimpft (Gruppe 2). Zum Zeitpunkt der

Infektion waren drei verschieden SSLV-Gruppen vorhanden, welche einmal 62 Wochen zuvor

(Gruppe 3a), zweimal 62 Wochen und 4 Wochen zuvor (Gruppe 3b) und einmal 6 Wochen

zuvor (Gruppe 2) geimpft worden waren. Bei allen serologischen Betrachtungen wurden die

100


Gruppen 3a und b bis zur 57. Woche nach der ersten Impfung gemeinschaftlich als Gruppe 3

ausgewertet.

4.3.5.1 Ziegengruppe 1 (PBS)

Wie zuvor erwähnt (Kapitel 4.3.3), wurden die Ziegen dieser Gruppe zum andauernden serolo-

gischen Vergleich zusammen mit Gruppe 3 über den Verlauf von einem Jahr gehalten und

jeweils im gleichen Maße beprobt und behandelt. Zum Zeitpunkt der ersten Impfung von Grup-

pe 3 erhielt Gruppe 1 einmalig eine Injektion s. c. mit PBS. Serologisch dient diese Gruppe

dem Negativabgleich zum Rest der Impfgruppen. Da die Messzeitpunkte eng mit den Daten

von Gruppe 3 verknüpft sind, werden die Titerdaten (Tabelle 38) hierzu vergleichend in den

Abbildungen zu Gruppe 3 dargestellt. Von den 3 Ziegen der Gruppe 1 verstarb Ziege Nr. 8186

zwischen Woche 57 und 62 an der Herzwasserkrankheit und fehlte daher im Infektionsversuch.

Die serologischen Daten dieser Ziege wurden bis einschließlich Woche 57 in alle Betrachtun-

gen mit einbezogen.

Die übrigen 2 Tiere wurden 62 Wochen nach Beginn des Versuchs mit 36 Sporen des voll

virulenten Feldisolats SD20 infiziert. Beide Tiere verstarben innerhalb von 4 Tagen, wobei nur

eine der Ziegen vor dem Tod (9 h) eine erhöhte Temperatur zeigte, welche bis zum Tod erhalten

blieb und die andere ohne Symptome verstarb.

101

Tabelle 38: Ziegengruppe 1

ELISA IgG- und TNA-Titer der Ziegengruppe 1 im Verlauf von 64 Wochen gemessen. Titerwerte ergeben sich alsreziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Ausgegraut dargestellt sind alle Tiere die nichtinfiziert werden konnten. An der Infektion Verstorbene sind entsprechend orange unterlegt; Detaillierte Todesdaten inhpi sind Tabelle 37 zu entnehmen; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung

W ochen nach 1. Immunisierung

0 4 8 12 16 20 24 28 32 37 48 53 57

rPA83

8185 758 1058 688 736 353 318 194 223 464 336 360 624 <100 659 -

593 683 752 656 471 318 265 282 360 296 672 896 188 - -

8187 703 2529 736 560 353 259 212 205 360 376 360 368 156 941 -

M 685 1423 725 651 392 298 224 237 395 336 464 629 115 800 -

S 84 976 33 88 68 34 37 40 60 40 180 264 101 199 -

TNA

8185

<50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 -

8187

rBclA

8185

236 189 298 298 267 307 280 342 334 246 196 185 165 162 -

8187

FIS

8185

1225 1525 1450 1400 1150 1050 1300 1175 1100 1300 1350 1856 1425 1550 -

8187

Veg.

8185

262 188 188 158 158 158 184 175 156 150 162 285 215 231 -

8187

Antigen / Titer

Ziegen Nr. 62b 64c

8186a

8186a

8186a

8186a

8186a

a starb zwischen Woche 57 und 62 an der Herzwasserkrankheit und wurde entsprechend nicht infiziertb Probenzeitpunkt direkt vor der Infektionc Probenzeitpunkt nach Beendigung der Infektion


Wie in Tabelle 38 aufgeführt, konnten selbst bei nicht immunisierten Tieren über die Dauer von

einem Jahr unspezifische IgG-Titer gegen rPA83, rBclA, FIS und vegetatives Vollantigen nach-

gewiesen werden. Dabei waren die gemessenen Titer, außer für rPA83, bei allen Tests als verei-

nigte Mischprobe der Gruppe gemessen worden. Für den TNA waren keine Titer oberhalb der

Nachweisgrenze messbar. Signifikanzbetrachtungen der gruppeninternen Schwankungen für die

anti-rPA83 IgG-Titer zeigten für Woche 4 bis 16, 58, 53 und 62 keine signifikanten Unterschie-

de zu Woche 0 (p ≥ 0,078), weshalb alle diese Titer als unspezifisch betrachtet wurden. Für alle

weiteren Messzeitpunkte, waren die unspezifischen anti-rPA83 IgG-Titer niedriger als die in

Woche 0 gemessenen (p ≤ 0,031).

4.3.5.2 Ziegengruppe 2 (SSLV)

Eine Gruppe von 5 Ziegen wurde einmal mit der SSLV

immunisiert und 6 Wochen später mit 850 Sporen des

voll virulenten Feldisolats SD20 infiziert. Es überleb-

ten 3 von 5 Tieren, wobei die Beobachtungszeit nach

der Infektion 2 Wochen betrug. Die Probennahmen zur

serologischen Auswertung umfassten das Negativse-

rum, entnommen vor der Immunisierung (Woche 0),

sowie Serum vor (Woche 6) und nach der Infektion

(Woche 8). Alle gemessenen Titer sind in Tabelle 39

aufgeführt. Die Negativseren zeigten für alle betrachte-

ten Antigene unspezifische Hintergrundtiter entspre-

chend der beschriebenen Kontrollgruppen. Durch die

Immunisierung mit der SSLV konnten die anti-rPA83

IgG-Titer tendenziell leicht erhöht werden, wobei der

Anstieg nicht signifikant (p = 0,110) und auch nicht für

alle Tiere sichtbar war. So zeigten die Ziegen Nr. 8211,

8212 und 8213 6 Wochen nach der Immunisierung

Titerwerte (Abbildung 35), die im Bereich der Schwan-

kungsbreite der naiven Seren lagen. Bei der nachfol-

genden Infektion verstarben die 2 Tiere mit den nied-

rigsten anti-rPA83 IgG-Titern, entsprechend war eine

Korrelation der Titer mit der Überlebenszeit vorhanden (rs = +0,9). Alle weiteren gemessenen

Titer vor der Infektion, davon rBclA und FIS als vereinigte Mischprobe der Gruppe gemessen,

102


ELISA IgG- und TNA-Titer der Ziegengruppe 2 imVerlauf von 8 Wochen gemessen, sowie Eintritt desTodes in dpi. Titerwerte ergeben sich als reziprokerWert der letzten Verdünnungsstufe mit einerOD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung des Überlebenserfolgte bis 14 dpi. Überlebende sind entsprechendgrün hinterlegt, Verstorbene orange;M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung

W ochen nach 1. Immunisierung Tod in

0 dpi

rPA83

8210 471 9035 90353 -

8211 541 1600 - 7,6

8212 800 2653 256000 -

8213 612 776 - 3,0

8214 1634 5271 49694 -

M 812 3867 132016 5,3

S 476 3348 109281 3,3

TNA

8210

<50

112 1643 -

8211 <50 - 7,6

8212 <50 6873 -

8213 <50 - 3,0

8214 <50 4848 -

M - - 4455 5,3

S - - 2637 3,3

Veg.

8210

300

258 1050 -

8211 235 - 7,6

8212 258 10541 -

8213 305 - 3,0

8214 800 894 -

M - 371 4162 5,3

S - 241 5525 3,3

rBclA Pool 173 173 196 -

FIS Pool 400 2600 5000 -

Antigen / Titer

Ziegen Nr. 6a 8b

a Probenzeitpunkt direkt vor der Infektionb Probenzeitpunkt nach Beendigung der Infektion


zeigten keine bzw. nur leichte Veränderungen

im Vergleich zu vor der Immunisierung

(p ≥ 0,374, Abbildung 36).

Eine sichtbare weitere Erhöhung der ge-

messenen Titer, exklusive der anti-rBclA IgG

Titer war erst nach dem Überleben der Infekti-

on zu sehen. Aufgrund der geringen Gruppen-

größe waren diese zwar nicht signifikant

(p ≥ 0,1), aber deutlich verschieden zu den zu-

vor gemessenen Werten. Dies war besonders

für die anti-rPA83 IgG- und TNA-Titer auf-

fällig, die 10 – 100fach höhere Werte als vor

der Infektion aufwiesen. Die IgG-Titer gegen

das vegetative Antigen waren durch die Imp-

fung unverändert, zeigten aber abhängig vom Individuum deutliche Erhöhungen durch die In-

fektion. Die gemessenen anti-FIS IgG-Titer waren sowohl durch die Immunisierung als auch

durch die Infektion leicht erhöht, wobei die

Messung einer vereinigten Mischprobe der

Gruppenseren diesbezüglich fehleranfällig ist,

da eine Mittlung aus zunächst fünf und nach

der Infektion drei Individuen vorliegt. Daher

könnte es sein, dass die sichtbare Erhöhung

der Titer nach der Infektion nur durch den

Wegfall der möglicherweise niedrigeren Titer

der Verstorbenen zustande kommt. Eine merk-

liche Reaktion gegen rBclA konnte weder

durch die Immunisierung, noch durch die In-

fektion hervorgerufen werden, was aufgrund

der zumindest leicht erhöhten anti-FIS IgG-

Titer bemerkenswert ist.

103

Abbildung 35: Ziegengruppe 2 (anti-rPA83 IgG-Titer)

Halblogarithmische Auftragung der anti-rPA83 IgG-Titer;Mittelwerte sind durch gepunktete Linien miteinander verknüpft;Grüne Pfeile deuten den Zeitpunkte der Immunisierung, schwarzePfeile geben den Zeitpunkt der Infektion an. Die y-Achse istlogarithmisch dargestellt.

Abbildung 36: Ziegengruppe 2 (anti-FIS, -Vegetativ, -rBclA undTNA-Titer)

Lineare Darstellung der Antikörpertiter; Mittelwerte sind durchgepunktete Linien miteinander verknüpft; Grüne Pfeile deuten denZeitpunkte der Immunisierung, schwarze Pfeile geben den Zeitpunktder Infektion an.


4.3.5.3 Ziegengruppe 3a/b (SSLV)

Eine Gruppe von 10 Ziegen wurde mit der SSLV immunisiert, im Verlauf von einem Jahr ca.

alle 4 Wochen geblutet und das so gewonnene Serum auf Antikörper- und TNA-Titer unter-

sucht. In der 58. Woche nach der ersten Impfung wurden 5 der 10 Tiere zufällig ausgewählt und

erneut mit der SSLV immunisiert (3b). Die restlichen 5 Tiere blieben ohne Revakzinierung (3a).

Für die grafische Darstellung und die gemittelten Werte wurden daher Gruppe 3a und b bis zur

Trennung durch die Revakzinierung von 3b gesamtheitlich als Gruppe 3 betrachtet. Zur besse-

ren Übersicht wird Gruppe 3a in den Abbildungen farblich wie zuvor die Gesamtgruppe 3 in

Blautönen fortgeführt und 3b nach der Trennung in Rottönen. Bis zur Trennung waren die Mit-

glieder von Gruppe 3a und b für alle individuell gemessenen Antikörpertiter serologisch nicht

voneinander zu unterscheiden (p ≥ 0,283). Zusätzlich zu Gruppe 3 sind in den Abbildungen

auch die Daten von Gruppe 1 (PBS) für Vergleichszwecke abgebildet.

Während der Akklimatisierungsphase im Krügerpark infizierten sich 2 Ziegen der Gruppe 3b

(Nr. 8174 und 8179) mit der Herzwasserkrankheit, woran Nr. 8174 verstarb und Nr. 8179

erfolgreich behandelt werden konnte. Beide schieden zur Verwendung bei der Infektion aus,

wurden aber serologisch in die Betrachtungen integriert. Die Infektion der restlichen 8 Tiere

erfolgte in Woche 62 mit 850 Sporen des voll virulenten Feldisolats SD20, wobei die Tiere für

weitere 2 Wochen auf den Ausgang der Infektion überprüft wurden. Die Infektion überlebten 4

von 5 Tieren der Gruppe 3a, wobei das verstorbene Tier eine verlängerte Überlebenszeit von

10 Tagen aufwies. Aus der revakzinierten Gruppe 3b überlebten drei von drei der infizierten

Ziegen.

Anti-rPA83 IgG-Titer und TNA-TiterAnti-rPA83 IgG-Titer und TNA-Titer

In Tabelle 40 sind die gemessenen anti-rPA83 IgG-Titer von Gruppe 3 im Verlauf eines Jahres

aufgeführt. Durch die erste Impfung konnte nach 4 Wochen bei allen Individuen ein deutlicher,

signifikanter Anstieg (p ≤ 0,002) der anti-rPA83 IgG-Titer im Vergleich zu den Seren vor der

Immunisierung gemessen werden. In Abbildung 37 ist gut zu sehen, dass zu diesem Zeitpunkt

(Woche 4) die Einzelwerte sehr stark voneinander abwichen und somit kein einheitlicher IgG-

Titer gegen rPA83 vorhanden war. Da für den Zeitraum zwischen Impfung und Woche 4 keine

weitere Probennahme erfolgte, ist zudem unklar, ob der sichtbare Höhepunkt in Woche 4 tat-

sächlich den Spitzentiter angibt oder bereits abfallende Titerwerte beinhaltet. Zumindest fügt

sich ein weiter sinkender Trend für die anti-rPA83 IgG-Titer der Wochen 8, 12 und 16 an, die

sich jeweils signifikant vom vorhergehenden Messzeitpunkt unterscheiden (p ≤ 0,04). Diese

verbleiben ab Woche 16 auf einem relativ konstanten, im Vergleich zu Gruppe 1 leicht erhöh-

tem Niveau und verändern sich erst mit der nächsten Immunisierung bzw. der Infektion.

104


105

Tabelle 40: Ziegengruppe 3a/b (anti-rPA83 IgG-Titer)

ELISA IgG-Titer der Ziegengruppe 3a/b im Verlauf von 64 Wochen gemessen; Titerwerte ergeben sich als reziproker Wert derletzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Ausgegraut dargestellt sind alle Tiere, die nicht infiziert werden konnten; DieÜberwachung des Überlebens erfolgte bis 14 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange;M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung


0 4 8 12 16 20 24 28 32 37 48 53

3a

8172 1379 24361 8704 5632 2918 2729 1882 2259 3200 3200 3200 4992 3712 5271 7529

8173 551 82580 14848 6400 6965 7529 2776 3765 3800 3200 3200 4992 1536 5271 87341

8176 965 44593 15872 5632 5271 5835 2071 4141 6400 6144 10338 4224 7138 15812 24847

8178 620 44593 7680 3200 2541 1741 671 1035 992 928 800 1056 800 1412 96376

8180 510 15277 4864 3200 1788 1600 1247 1882 1600 1856 1984 1856 1984 2653 -

3b

303 51200 8704 5632 4518 4800 2588 3059 4736 7168 9088 6154 5046 - -

8175 1158 51200 11264 4480 3765 2729 2682 1412 1536 1856 2880 3008 2880 39153 24847

882 21058 6400 5632 4518 2729 2588 1318 2176 3200 2880 4224 3968 20329 -

8181 482 35509 7680 5120 2918 2729 2447 5365 2176 2436 2880 3200 800 39153 24847

8182 303 135432 23040 12288 4518 4800 3953 2635 4992 5632 5292 2560 800 31624 12800

M 715 50580 10906 5722 3972 3722 2291 2687 3161 3562 4254 3627 28666084 (3a) 54023 (3a)

32565 (3b) 20831 (3b)

S 365 35479 5527 2544 1514 1934 899 1400 1778 2065 3099 1573 21165691 (3a) 44410 (3a)

8896 (3b) 6955 (3b)

Ziegen Nr. 57c 62d 64e

8174a

8179b

a starb zwischen Woche 57 und 62 an der Herzwasserkrankheit und wurde entsprechend nicht infiziertb erkrankte zwischen Woche 62 und 64 an der Herzwasserkrankheit und wurde entsprechend nicht infiziertc Probenzeitpunkt vor der 2. Immunisierung von 3b in Woche 58d Probenzeitpunkt vor der Infektione Probenzeitpunkt nach Beendigung der Infektion

Abbildung 37: Ziegengruppe 3a/b und 1 (anti-rPA83 IgG-Titer)

Halblogarithmische Darstellung der anti-rPA83 IgG-Titer (Tabelle 40) von Gruppe 3 a/b und 1 im Verlauf eines Jahres; Biszur revakzinierung von Gruppe 3b wurde Gruppe 3a/b gesamtheitlich betrachtet (Gruppe 3, Blautöne); Nach der Splittungin Woche 57 wird Gruppe 3a in Blautönen weitergeführt und ab diesem Zeitpunkt entsprechend in Rottönen die revakzinierteGruppe 3b. Die Rohdaten für Gruppe 1 (grau) sind Tabelle 38 zu entnehmen; Für jeden Messzeitpunkt sind die Einzelwertealler Individuen angegeben, sowie durch einen horizontalen Strich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linienmiteinander verknüpft sind; Grüne Pfeile deuten den Zeitpunkte der Immunisierung, schwarze Pfeile geben den Zeitpunktder Infektion an. Die y-Achse ist logarithmisch aufgeteilt. Werten unterhalb der Nachweisgrenze wurde ein Wert von 100, füreine bessere Darstellung zugewiesen.


Die zweite Immunisierung von Gruppe 3b (rot), 58 Wochen nach der ersten Immunisierung,

erzeugte in allen Tieren eine signifikante Erhöhung (p = 0,006) der anti-rPA83 IgG-Titer. Diese

entsprachen der Höhe nach dem Titer nach der ersten Impfung in Woche 4 (p = 0,347) und stie-

gen durch die nachfolgende Infektion nicht weiter an, sondern fielen signifikant ab (p = 0,009).

Für die nicht revakzinierte Gruppe 3a (blau) blieben die Titer-Werte bis Woche 62 konstant und

wurden erst durch die überlebte Infektion auf ein ähnliches Niveau wie das von Gruppe 3b vor

der Infektion bzw. das in Woche 4 erreichte Niveau angehoben (p ≥ 0,272). Da Ziege Nr. 8172

von Gruppe 3a durch die überlebte Infektion kaum erhöhte Titer im Vergleich zum vorherge-

henden Zeitpunk aufwies, waren die Titer von Gruppe 3a in Woche 64 nicht signifikant gegen-

über Woche 0 (p = 0,098) erhöht.

Vergleicht man die individuellen Titer nach der ersten und zweiten Impfung fällt auf, dass

die beobachtete starke Streuung der erzeugten Titer nach der zweiten Immunisierung (Grup-

pe 3b, rot) geringer ausfällt. Im Gegensatz dazu sind die Titer von Gruppe 3a (blau) nach einer

überlebten Infektion wieder stark gestreut. Ebenfalls ungewöhnlich sind die Titer-Werte der

Ziegen Nr. 8172 und 8173 62 und 64 Wochen nach der Immunisierung. Obwohl beide vor der

Infektion den gleichen Ausgangstiter aufwiesen und diese auch überlebten, kam es bei Nr. 8173

zu einem erheblichen Anstieg der anti-rPA83 IgG-Titer durch die Infektion und bei Nr. 8172

nicht.

In Tabelle 41 sind die gemessenen TNA-Titer aufgeführt. Aufgrund der niedrigen anti-rPA83

IgG-Titer wurden alle TNA-Titer der Wochen 0 bis 57 als vereinigte Mischprobe der Gruppe

bestimmt, da Titer über der Nachweisgrenze nicht zu erwarten waren. In Abbildung 38 sind die

aufgeführten Titer noch einmal grafisch gegen die gemessenen Titer von Gruppe 1 dargestellt.

In Woche 4 nach der ersten Impfung konnte nur ein leicht erhöhter TNA-Titer gemessen wer-

den, dieser war in Anbetracht der Höhe der generierten anti-rPA83 IgG-Titer (~50000) ver-

gleichsweise gering. Im nachfolgenden Zeitraum bis einschließlich zur 32. Woche waren keine

TNA-Titer messbar (<50). Erstaunlicherweise konnten ab Woche 37 bis zur Revakzinierung

bzw. Infektion wieder fortdauernd leicht erhöhte TNA-Titer (>100) gemessen werden, obwohl

die anti-rPA83 IgG-Titer für diesen Zeitraum konstant und niedrig waren (~3500). Durch die

zweite Immunisierung in Woche 58 konnten bei Gruppe 3b (Abbildung 38, rot) signifikant er-

höhte TNA-Titer erzeugt werden (p = 0,002), welche tendenziell höher als die TNA-Titer der

ersten Immunisierung waren. In einem ähnlichen Maße waren die TNA-Titer von Gruppe 3a

(blau) nach der Infektion erhöht. Somit wurden sowohl bei der zweiten Immunisierung von

Gruppe 3b, als auch der Infektion von Gruppe 3a ähnliche anti-rPA83 IgG-Titer wie bei der ers-

ten Immunisierung erzeugt (~30000 – 50000), der TNA-Titer war aber im Vergleich um ein

~Zehnfaches erhöht.

106


107

Tabelle 41: Ziegengruppe 3a/b (TNA-Titer)

TNA-Titer der Ziegengruppe 3a/b im Verlauf von 64 Wochen gemessen; TNA-Titerwerte ergeben sich als reziprokerWert der Verdünnungsstufe bei der 50 % Neutralisation gemessen wurden. Ausgegraut dargestellt sind alle Tiere, dienicht infiziert werden konnten; Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis 14 dpi. Überlebende sindentsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung


0 4 8 12 16 20 24 28 32 37 48 53

3a

8172

<50 248 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 100 149 100 100

149 149

8173 74 2042

8176 285,5 348

8178 <50 2839

8180 86,5 -

3b

- -

8175 1488 597

546 -

8181 1860 896

8182 1265 398

M - - - - - - - - - - - - -119 (3a) 1345 (3a)

1290 (3b) 630 (3b)

S - - - - - - - - - - - - -107 (3a) 1309 (3a)

553 (3b) 251 (3b)


8174a

8179b


Abbildung 38: Ziegengruppe 3a/b und 1 (TNA-Titer)

Lineare Darstellung der TNA-Titer (Tabelle 41) von Gruppe 3a/b und 1 im Verlauf eines Jahres; Bis zur revakzinierung vonGruppe 3b wurde Gruppe 3a/b gesamtheitlich betrachtet (Gruppe 3, Blautöne); Nach der Splittung in Woche 57 wirdGruppe 3a in Blautönen weitergeführt und ab diesem Zeitpunkt entsprechend in Rottönen die revakzinierte Gruppe 3b. DieRohdaten für Gruppe 1 (grau) sind Tabelle 38 zu entnehmen; Für einige Messzeitpunkte sind die Einzelwerte allerIndividuen angegeben, sowie durch einen horizontalen Strich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linien miteinanderverknüpft sind; Grüne Pfeile deuten den Zeitpunkte der Immunisierung, schwarze Pfeile geben den Zeitpunkt der Infektionan. Zur besseren Darstellung wurde die y-Achse mit einer Unterbrechung im Bereich 2100 – 2800 versehen.


Analog zu den anti-rPA83 IgG-Titern konnten durch die Infektion die TNA-Titer von Grup-

pe 3b nicht weiter erhöht werden. Eine signifikante Korrelation der anti-rPA83 IgG-Titer zu den

TNA-Titern war nicht vorhanden, da die Signifikanzschwelle aufgrund der Gruppengröße sehr

hoch war. Dennoch war eine Korrelation in Tendenz für beide Gruppen vor der Infektion

erkennbar (rs ≥ +0,825).

Anti-rBclA und anti-FIS IgG-TiterAnti-rBclA und anti-FIS IgG-Titer

In Tabelle 42 sind die gemessenen anti-rBclA und anti-FIS IgG-Titer aufgeführt, deren grafische

Darstellung sich in Abbildung 39 im Vergleich zu Gruppe 1 befindet. Alle Titer wurden als ver-

einigte Mischprobe der Gruppe gemessen. Sowohl FIS als auch rBclA sind Sporenantigene,

wobei im vorliegenden Fall BclA auch Bestandteil der FIS-Präparation war, da die dazu ver-

wendeten Sporen BclA exprimierten. Da auch die Immunisierung mit der SSLV auf Sporen

basiert, war daher eine immunogene Reaktion auf beide Antigene zu erwarten.

Wie zu erkennen ist, konnten weder durch die Impfungen, noch die Infektion, die ebenfalls mit

Sporen stattgefunden hat, erhöhte Titer gegen rBclA erzeugt werden. Somit blieben die IgG-

Titer gegen rBclA für den gesamten Versuchszeitraum konstant auf dem Niveau von Gruppe 1

(Abbildung 39, links) und den Werten, die vor der Immunisierung gemessen wurden.

Im Vergleich dazu konnten durch die erste Immunisierung hohe anti-FIS IgG Titer erzeugt

werden. Diese verhielten sich im weiteren Verlauf ähnlich den gemessenen Titern gegen rPA83

und fielen schrittweise nach 8, 12 und 16 Wochen auf einen niedrigen Wert. Ab Woche 16 ver-

blieben die Werte auf einem konstanten Niveau, das höher lag als die Werte von vor der Immu-

nisierung und der Kontrollgruppe im gesamten Jahresverlauf (Gruppe 1, grau). Wie in Abbil-

dung 39 (rechts, rot) gut zu sehen ist, konnte die zweite Immunisierung von Gruppe 3b in Wo-

che 58 den IgG-Titer gegen FIS noch weiter erhöhen, womit er ca. dreimal höher lag als der Ti-

ter nach der ersten Immunisierung.

Wie auch schon für die anti-rPA83 IgG-Titer bemerkt, wurden die anti-FIS IgG-Titer bei

Gruppe 3b durch die Infektion nicht weiter erhöht, sondern fielen in Woche 64 auf ein Niveau

108

Tabelle 42: Ziegengruppe 3a/b (anti-rBclA und -FIS IgG-Titer)

ELISA IgG-Titer der Ziegengruppe 3a/b im Verlauf von 64 Wochen gemessen; Titerwerte ergeben sich alsreziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Die Überwachung des Überlebens erfolgtebis 14 dpi. Angegeben sind Werte von vereinigten Mischproben der Gruppe.

AntigenW ochen nach 1. Immunisierung

0 4 8 12 16 20 24 28 32 37 48 53

rBclA3a

298 307 347 400 667 702 471 533 533 277 331 154647 752 188

3b 200 223 200

FIS3a

1400 13600 9813 5801 4906 5409 5180 3200 2742 2971 5638 32002628 2742 4400

3b 3961 32426 20000

57a 62b 64c

a Probenzeitpunkt vor der 2. Immunisierung von 3b in Woche 58b Probenzeitpunkt vor der Infektionc Probenzeitpunkt nach Beendigung der Infektion


ab, das dem der ersten Immunisierung entsprach. Auffallend ist hierbei, dass in Gruppe 3a nach

dem Überleben der Infektion kein bzw. nur ein marginal erhöhter anti-FIS IgG-Titer messbar

war. Da im Gegensatz zu rBclA eine Veränderung der anti-FIS IgG-Titer durch die Immunisie-

rungen detektierbar war, muss die Immunreaktion gegen FIS auf anderen Antigenen als BclA

beruhen.

Anti-vegetativ IgG-TiterAnti-vegetativ IgG-Titer

Das vegetative Antigen stellt ein undefiniertes Zelllysat eines unbekapselten, toxindefizienten

Stammes von B. anthracis dar. Entsprechend kann damit eine Immunantwort gegen die vegeta-

tive Form des Bakteriums unabhängig von den Toxinen und der Kapsel detektiert werden. In

Tabelle 43 und Abbildung 40 sind die gemessenen IgG-Titer von Gruppe 3a/b gegen das vege-

tatives Antigen aufgeführt.

Durch die erste Immunisierung mit der SSLV konnten die IgG-Titer im Vergleich zur Nega-

tivkontrolle nur leicht erhöht werden, wobei das so entstandene Niveau bis zur nächsten Imp-

fung erhalten blieb. Durch eine weitere Immunisierung mit der SSLV in Woche 58 (Gruppe 3b)

konnten ca. zehnfach höhere IgG-Titer gegen vegetatives Antigen erzeugt werden. Diese wur-

den durch die nachfolgende Infektion in Woche 62 nicht weiter erhöht (Gruppe 3b). Erstaunli-

cherweise zeigte Gruppe 3a ebenso wie für die anti-FIS IgG-Titer durch die überlebte Infektion

keine bzw. nur marginal erhöhte Titer gegen das vegetatives Antigen.

109

Abbildung 39: Ziegengruppe 3a/b und 1 (anti-rBclA und -FIS IgG-Titer)

Lineare Darstellung der anti-rBclA (A) und -FIS IgG-Titer (B) (Tabelle 42) von Gruppe 3a/b und 1 im Verlauf eines Jahres;Bis zur revakzinierung von Gruppe 3b wurde Gruppe 3a/b gesamtheitlich betrachtet (Gruppe 3, Blautöne); Nach derSplittung in Woche 57 wird Gruppe 3a in Blautönen weitergeführt und ab diesem Zeitpunkt entsprechend in Rottönen dierevakzinierte Gruppe 3b. Die Rohdaten für Gruppe 1 (grau) sind Tabelle 38 zu entnehmen; Für jeden Messzeitpunkt sindMesswerte aus vereinigten Mischproben der Gruppe als horizontaler Striche angegeben und durch gepunktete Linienmiteinander verknüpft; Grüne Pfeile deuten den Zeitpunkte der Immunisierung, schwarze Pfeile geben den Zeitpunkt derInfektion an.


110

Tabelle 43: Ziegengruppe 3a/b (anti-vegetativ IgG-Titer)

Anti-vegetativ IgG-Titer der Ziegengruppe 3a/b im Verlauf von 64 Wochen gemessen; Titerwerte ergeben sich alsreziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Ausgegraut dargestellt sind alle Tiere, die nichtinfiziert werden konnten; Die Überwachung des Überlebens erfolgte bis 14 dpi. Überlebende sind entsprechend grünhinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung


0 4 8 12 16 20 24 28 32 37 48 53

3a

8172

215 1323 1046 1046 1046 1600 1600 1600 1600 1600 1969 1785 1508

1500 941

8173 682 1411

8176 1317 941

8178 564 5082

8180 447 -

3b

- -

8175 7529 5553

8282 -

8181 10917 8658

8182 21083 10164

M - - - - - - - - - - - - -902 (3a) 2094 (3a)

11953 (3b) 8125 (3b)

S - - - - - - - - - - - - -474 (3a) 2004 (3a)

6258 (3b) 2351 (3b)


8174a

8179b


Abbildung 40: Ziegengruppe 3a/b (anti-vegetativ IgG-Titer)

Lineare Darstellung der anti-vegetativ IgG-Titer (Tabelle 43) von Gruppe 3a/b und 1 im Verlauf eines Jahres; Bis zurrevakzinierung von Gruppe 3b wurde Gruppe 3a/b gesamtheitlich betrachtet (Gruppe 3, Blautöne); Nach der Splittung inWoche 57 wird Gruppe 3a in Blautönen weitergeführt und ab diesem Zeitpunkt entsprechend in Rottönen die revakzinierteGruppe 3b. Die Rohdaten für Gruppe 1 (grau) sind Tabelle 38 zu entnehmen; Für einige Messzeitpunkte sind die Einzelwertealler Individuen angegeben, sowie durch einen horizontalen Strich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linienmiteinander verknüpft sind; Grüne Pfeile deuten den Zeitpunkte der Immunisierung, schwarze Pfeile geben den Zeitpunktder Infektion an. Zur besseren Darstellung wurde die y-Achse mit einer Unterbrechung im Bereich 12500 – 19500 versehen.


4.3.6 Zusammenfassung der SSLV-Gruppen

Für Gruppe 3a/b erzeugte die erste Impfung nach 4 Wochen äquivalent hohe anti-rPA83 IgG-

Titer (p = 0,501) wie die zweite Impfung (Gruppe 3b, Woche 62). Die Antikörpertiter gegen FIS

und das vegetative Antigen sowie die TNA-Titer waren nach der zweiten Immunisierung aber

tendenziell höher als nach der ersten, sodass die Auffrischungsimpfung nach einem Jahr eine

bessere immunogene Wirkung erzielte.

Die Reaktion auf die Infektion war in Gruppe 3a und 3b ebenfalls unterschiedlich. Während

sämtliche Titerwerte der frisch revakzinierten Gruppe 3b nach der Infektion (Woche 64) kon-

stant blieben oder abfielen, waren für die Mehrheit der Überlebenden von Gruppe 3a im Ver-

gleich zu den vor der Infektion gemessenen Werten die anti-rPA83 IgG- und TNA-Titer tenden-

ziell erhöht. Alle weiteren Titer verblieben auf dem Niveau von vor der Infektion.

Betrachtet man im Fall von Gruppe 3a die überlebte Infektion als zweite Immunisierung mit

einer Lebendvakzine und vergleicht die immunologische Reaktion darauf mit einer zweiten

SSLV Immunisierung (Gruppe 3b), ergeben sich ebenfalls Unterschiede. Die anti-rPA83 IgG-

und TNA-Titer bei Gruppe 3b nach der Revakzinierung (Woche 62) und Gruppe 3a nach der In-

fektion (Woche 64) stiegen für beide Gruppen in gleicher Weise an (p ≥ 0,380), wohingegen

eine Erhöhung der anti-FIS und anti-vegetativ IgG Titer nur bei der Revakzinierung mit der

SSLV (Gruppe 3b, Woche 62) zu sehen ist. Damit unterscheiden sich in ihrer Immunogenität

sowohl die Erst- und Zweitimmunisierung mit der SSLV, als auch die Infektion mit einem voll

virulentem Stamm voneinander.

Gruppe 2 erhielt die gleiche Impfung wie Gruppe 3 und sollte sich daher von Woche 0 bis 6

serologisch analog zu dieser verhalten. Tatsächlich lagen die gemessenen Antikörpertiter für

Gruppe 2 weit unter denen von Gruppe 3, wobei einzelne Tiere von Gruppe 2 Antikörpertiter

aufwiesen, die denen der Kontrollgruppen glichen. Leider war es nicht möglich, Gruppe 2 ana-

log zu Gruppe 3 in Woche 4 zu beproben, um die Seren für diesen Zeitpunkt direkt zu verglei-

chen. Da der Titerverlauf von Gruppe 3 eine rapide Abnahme der Antikörpertiter ab Woche 4

angibt, könnte der um 2 Wochen verspätete Probenzeitpunkt von Gruppe 2 als Begründung für

die niedrigeren Titer angesehen werden. Ein Vergleich der anti-rPA83 IgG-Titer von Gruppe 2

(Woche 6) mit den in Woche 4 und 8 gemessenen Titern der Gruppe 3 ergibt allerdings für bei-

de Zeitpunkte signifikant niedrigere Titer (p ≤ 0,022) für Gruppe 2. Eine ähnliche Tendenz war

auch für alle weiteren Antikörpertiter dieser Gruppen zu diesen Zeitpunkten sichtbar. Damit

sind die generell niedrigeren Titer von Gruppe 2 nicht auf den späteren Probenzeitpunkt

zurückzuführen, wonach die Unterschiede zwischen Gruppe 2 und 3 nach der ersten Immuni-

sierung andere Ursachen haben müssen.

111


4.3.7 Einzelbetrachtungen der Immunisierungen von Burenziegen mit NLV

Der SSLV standen die Gruppen zur Testung der NLV gegenüber, die sich aus den Ergebnissen

der Mausversuche ergaben. Die Ziegengruppen 4 und 6 wurden entsprechend dreimal im

Abstand von 3 Wochen mit rPA83, rBclA und Lipopeptid bzw. rPA83, rBclA, FIS und Lipopep-

tid immunisiert und 4 Wochen nach der letzten Immunisierung s. c. mit 844 Sporen des voll

virulenten Feldisolats SD20 infiziert. Ebenso wurde an Ziegengruppe 5 die analoge Kombinati-

on aus DNA-Vektoren der Mausgruppe TKS getestet, die ebenfalls dreimal im Abstand von

3 Wochen appliziert wurde. Da für diese Gruppe schon im Verlauf der Immunisierung kaum

erhöhte Titer festgestellt werden konnten, wurde 9 Wochen nach der letzten Impfung eine Auf-

frischungsimpfung in Form des eingesetzten Proteingemischs von Gruppe 6 appliziert. Da auch

diese keine zufriedenstellenden Titer erzeugte, wurde von einer Infektion von Gruppe 5 zum

Schutz der Tiere gänzlich abgesehen.

4.3.7.1 Ziegengruppe 4 (rPA83, rBclA und Lipopeptid)

Eine Gruppe von 5 Ziegen wurde dreimal im Abstand von 3 Wochen mit rPA83 (25 µg), rBclA

(25 µg) und Lipopeptid (500 µg) s. c. immunisiert und 4 Wochen nach der letzten Immunisie-

rung s. c. mit 844 Sporen des voll virulenten Feldisolats SD20 infiziert. Die Applikation der

einzelnen Impfkomponenten erfolgte nicht wie geplant in Mischung, sondern jeweils einzeln in

einem Volumen von 1 ml in das gleiche Areal. Serumentnahmen fanden vor dem Beginn der

Immunisierung (Woche 0), nach jeder Immunisierung (Woche 3, 5 und 8) und direkt vor der In-

fektion (Woche 10) statt. Die serologische Auswertung umfasste die Ermittlung von Antikör-

pertitern gegen rPA83, rBclA, FIS und vegetativem Antigen, sowie TNA-Titern (Tabelle 44).

Wie schon zuvor beobachtet, waren auch bei diesen Individuen bereits vor dem Start der

Immunisierungen niedrige unspezifische Titer gegen die jeweiligen Antigene messbar. Beson-

ders auffällig war hierbei Ziege Nr. 8188, die mit Abstand den höchsten gemessenen, unspezifi-

schen Hintergrundtiter gegen rBclA aufwies und auch im weiteren Verlauf der Immunisierung

beibehielt. Für alle anderen Mitglieder dieser Gruppe änderten sich die anti-rBclA IgG-Titer

durch die Immunisierung ebenfalls kaum merklich (Abbildung 41, rechts), sodass ein signifi-

kanter Anstieg der anti-rBclA IgG-Titer nicht ersichtlich war (p ≥ 0,104). Korrelierend zu die-

sen Ergebnissen konnten auch mit FIS nur marginal erhöhte anti-rBclA Titer detektiert werden,

die sich weitestgehend im Rahmen der zuvor gemessenen unspezifischen Hintergrundtiter

bewegten.

Die Messung der anti-vegetativen Antikörper ergab ebenfalls keine Veränderung, was zu

erwarten war, da die Impfung keine Antigene gegen den vegetativen Zellkörper enthielt. Einzig

der anti-rPA83 IgG-Titer war bei einigen Tieren nach der ersten Immunisierung (Woche 3) ten-

112


denziell und nach der zweiten Immunisierung

(Woche 5) signifikant (p = 0,017) erhöht (Abbil-

dung 41, links). Die dritte Immunisierung (Woche 8)

schien die Titer gegen rPA83 insgesamt nicht weiter

zu erhöhen, sondern nivellierte lediglich die Titer

zuvor wenig reaktiver Tiere auf ein einheitlicheres

Niveau. Bis zur Infektion in Woche 10 blieben die

anti-rPA83 IgG-Titer signifikant erhöht (p ≤ 0,042),

obgleich sie im Vergleich zu Woche 5 und 8 signifi-

kant abgefallen waren (p ≤ 0,034) und in der Höhe

den gemessenen Werten von Woche 3 entsprachen

(p = 0,704). Aufgrund der niedrigen anti-rPA83 IgG-

Titer war ein TNA-Titer über der Nachweisgrenze

(<50) nicht zu erwarten und konnte entsprechend mit

einer Ausnahme auch nicht detektiert werden. Daher

wurde von einer graphischen Darstellung dieser Titer

und der ebenfalls kaum veränderlichen Titer gegen

FIS und das vegetative Antigen abgesehen. Durch die

Infektion verstarben alle Tiere in einem relativ ähnlichem Zeitrahmen bis zum 3. Tag, wobei

alle Tiere vor ihrem Tod eine erhöhte Temperatur aufwiesen. Korrelationen zwischen den

gemessenen Titern und der überlebten Zeit waren nicht vorhanden (rs ≤ +0,5).

113


ELISA IgG und TNA-Titer der Ziegengruppe 4 im Verlaufvon 10 Wochen gemessen, sowie überlebte Zeit in dpi;Titerwerte ergeben sich als reziproker Wert der letztenVerdünnungsstufe mit einer OD404nm ≥ 0,1. Verstorbenesind orange hinterlegt; M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung


0 3 5 8 dpi

rPA83

8188 557 800 2571 2571 1371 3,2

8190 371 4457 5600 5028 2914 3,5

8192 400 1114 2857 1828 942 2,2

8198 285 700 1600 4800 1600 3,2

8199 700 3314 5828 6857 4571 3,2

M 463 2077 3691 4217 2280 3,0

S 165 1707 1906 2024 1477 0,5

TNA

8188 <50 <50 <50 <50 <50 3,2

8190 <50 <50 50 <50 <50 3,5

8192 <50 <50 <50 <50 <50 2,2

8198 <50 <50 <50 <50 <50 3,2

8199 <50 <50 <50 <50 <50 3,2

M - - - - - 3,0

S - - - - - 0,5

rBclA

8188 2122 1795 3200 2448 1387 3,2

8190 318 612 1387 865 481 3,5

8192 465 726 465 726 661 2,2

8198 346 587 400 726 677 3,2

8199 628 800 800 930 563 3,2

M 776 904 1250 1139 754 3,0

S 762 506 1158 737 363 0,5

veg Pool 123 100 150 135 150 -

FIS Pool 575 713 675 1150 1150 -

Antigen / Titer

Ziegen Nr. 10a

a Probenzeitpunkt vor der Infektion

Abbildung 41: Ziegengruppe 4 (anti-rPA83 und -rBclA IgG-Titer)

Lineare Darstellung der anti-rPA83 IgG-Titer (A) und anti-rBclA IgG-Titer (B) von Gruppe 4 (Tabelle 44) imVersuchsverlauf; Für jeden Messzeitpunkt sind die Einzelwerte aller Individuen angegeben, sowie durch einen horizontalenStrich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linien miteinander verknüpft sind; Blaue Pfeile deuten den Zeitpunkte derImmunisierung mit der Proteinkombination an, schwarze entsprechend den der Infektion.


4.3.7.2 Ziegengruppe 5 (DNA-Vakzine)

Eine Gruppe von 5 Ziegen wurde dreimal im Abstand

von 3 Wochen mit einer Mischung aus je 1 mg NTC-

7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1, pDNAVaccUltra1-

TPA-BclAD1D3-LAMP1 und pDNAVaccUltra5-CIITA

in einem Endvolumen von 1 ml s. c. (erste Immunisie-

rung) bzw. i. c. (zweite und dritte Immunisierung)

geimpft. Zur Erhöhung der Immunreaktion wurde

9 Wochen nach der letzten Immunisierung mit der

DNA-Mischung eine weitere Immunisierung mit Prote-

inkomponenten vorgenommen. Diese beinhaltete

rPA83 (25 µg), rBclA (25 µg), FIS (108 Sporen) und

Lipopeptid (500 µg) und wurde analog zu den Protein-

gruppen 4 und 6 s. c. appliziert. Die serologische Aus-

wertung umfasste die Detektion von IgG Antikörper

gegen rPA83, rBclA, FIS, rLF und vegetatives Antigen,

sowie TNA-Titer. Die Probennahmen erfolgten vor

dem Beginn der Immunisierung (Woche 0) und nach

jeder DNA-Vakzinierung (Woche 3, 6 und 9) sowie vor

(Woche 15) und 2 Wochen nach (Woche 17) dem Pro-

teinboost (Tabelle 45). Wie schon für die anderen Zie-

gengruppen bemerkt, waren für alle Negativseren

(Woche 0) unspezifische Hintergrundtiter detektierbar.

Durch die 3fach-Immunisierung mit der DNA-Vakzine konnten die anti-rPA83 IgG-Titer

nicht signifikant erhöht werden (p ≥ 0,107). Der Proteinboost in Woche 15 erzeugte zwar eine

leichte Erhöhung der Antikörpertiter gegen rPA83, aber auch diese Erhöhung war nicht signifi-

kant (Abbildung 42; p = 0,099). Die Titerentwicklung gegen rLF verlief ähnlich, wobei durch

die niedrigeren unspezifischen Hintergrundtiter und die teilweise geringere Streuung der Mess-

werte die Titer ab Woche 3 signifikant erhöht waren (Abbildung 42; p ≤ 0,047). Der Protein-

boost erzeugte hier ebenfalls, deutlich höher als bei rPA83, einen Titeranstieg, der mit

p = 0,0498 sogar signifikant war. Die Erhöhung des anti-rLF IgG-Titers durch den Proteinboost

war unerwartet, da nur rPA83, rBclA und FIS verabreicht wurden. Möglicher Hintergrund könn-

te eine Kreuzreaktion mit rPA83 sein, die bereits in anderen Studien bemerkt wurde [11][193],

womit die sichtbaren Titer keine „echten“ Titer gegen rLF darstellen würden. Eine entsprechen-

de Korrelation der anti-rPA83 und -rLF IgG-Titer für Woche 17 bestand jedoch nicht (rs = -

0,175). Entsprechend der niedrigen Antitoxin-Titer waren zu keinem Zeitpunkt TNA-Titer über

114


ELISA IgG und TNA-Titer der Ziegengruppe 5 imVerlauf von 17 Wochen gemessen; Titerwerte ergebensich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufemit einer OD404nm ≥ 0,1; Verstorbene orange;M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung


0 3 6

rPA83

8205 1262 1732 1356 1354 1323 1969

8206 985 1323 769 923 769 1415

8207 1908 1732 1415 1785 892 1846

8208 1169 892 831 1354 1323 2831

8209 723 662 631 769 677 1077

M 1209 1268 1000 1237 997 1828

S 441 485 360 402 307 663

rBclA

8205 246 446 831 923 677 1538

8206 315 600 477 708 400 1385

8207 446 1015 677 692 354 1569

8208 754 754 738 862 400 4062

8209 492 1077 708 646 331 1723

M 451 778 686 766 432 2055

S 196 268 130 119 140 1128

rLF

8205 1056 1280 1152 1536 800 1664

8206 592 800 720 1280 768 1664

8207 864 1792 1216 1376 960 1920

8208 528 688 800 1440 1184 3456

8209 400 1120 768 1088 640 4864

M 688 1136 931 1344 870 2714

S 267 437 234 171 209 1415

TNA Pool <50 <50 <50 <50 <50 <50

FIS Pool 1050 1050 1200 950 800 1900

veg Pool 182 182 170 152 282 282

Antigen / Titer

Ziegen Nr. 9a 15b 17c

a 3 Wochen nach letzter DNA Impfung

b 9 Wochen nach letzter DNA Impfung und direkt vor dem Proteinboost

c 2 Wochen nach dem Proteinboost


der Nachweisgrenze (<50) messbar (Abbildung 43, rechts). Titer gegen das vegetative Antigen

waren erwartungsgemäß ebenfalls, abgesehen von den unspezifischen Hintergrundtitern, nicht

messbar.

Auch die Antikörpertiter gegen rBclA und FIS (Abbildung 43) zeigten einen ähnlichen Verlauf

wie für rPA83 und rLF. Wie bei rLF waren auch bei den anti-rBclA IgG-Titern die Werte zu

einigen Zeitpunkten signifikant erhöht (Woche 3 und 9; p ≤ 0,043). Der Proteinboost bewirkte

jedoch eine deutlichere Erhöhung der Antikörpertiter gegen die Spore als die DNA-Vakzinie-

rungen, sodass die anti-rBclA IgG-Titer in Woche 17 signifikant erhöht waren (p = 0,02).

115

Abbildung 42: Ziegengruppe 5 (anti-rPA83 und -rLF IgG-Titer)

Lineare Darstellung der anti-rPA83 IgG-Titer (A) und anti-rLF IgG-Titer (B) von Gruppe 5 (Tabelle 45) im Versuchsverlauf;Für jeden Messzeitpunkt sind die Einzelwerte aller Individuen angegeben, sowie durch einen horizontalen Strich, derenMittelwerte, die durch gepunktete Linien miteinander verknüpft sind; Rote Pfeile deuten den Zeitpunkte der Immunisierungmit der DNA-Vakzine an und blau entsprechend den der Immunisierung mit der Proteinkombination

Abbildung 43: Ziegengruppe 5 (anti-rBclA, -FIS, -vegetativ IgG- und TNA-Titer)

Lineare Darstellung der anti-rBclA IgG-Titer (A) und anti-FIS, -vegetativ IgG- und TNA- Titer (B) von Gruppe 5 (Tabelle 45)im Versuchsverlauf; Für jeden Messzeitpunkt sind individuelle Einzelwerte oder Mittelwerte angegeben; Mittelwerte sinddurch gepunktete Linien miteinander verknüpft; Rote Pfeile deuten den Zeitpunkte der Immunisierung mit der DNA-Vakzinean und blaue entsprechend den der Immunisierung mit der Proteinkombination


Generell sind die durch die DNA-Vakzinierung erzeugten Titerveränderungen marginal und

bewegen sich in einem Bereich, der auch bei unspezifischen Hintergrundtitern der Seren von

nicht immunisierten Tieren (siehe Kapitel 4.3.3) gefunden wurde. Es kann davon ausgegangen

werden, dass die DNA-Vakzinierung generell keine Titererhöhung erzeugte, die von den berich-

teten Schwankungen innerhalb naiver Tiere zu unterscheiden gewesen wären. Der nachträgliche

Proteinboost erhöhte die Antikörpertiter nur in dem Umfang, wie es der Erstimmunisierung der

Gruppe 6 entsprach (p ≥ 0,254), die die gleiche Vakzineformulation erhalten hatte. Daher ist ein

humorales Priming durch die vorherige Gabe der DNA-Vakzine, das sich in Memoryreaktion

gegen die Proteinantigene hätte äußern können, unwahrscheinlich. Aufgrund der geringen

Immunogenität der DNA-Vakzine wurde, zur Vermeidung von unnötigem Leid, von einer

Infektion abgesehen.

4.3.7.3 Ziegengruppe 6 (rPA83, rBclA, FIS und Lipopeptid)

Eine Gruppe von 5 Ziegen wurde dreimal im

Abstand von 3 Wochen mit rPA83 (25 µg),

rBclA (25 µg), FIS (108 Sporen) und Lipopep-

tid (500 µg) s. c. immunisiert und 4 Wochen

nach der letzten Immunisierung mit 844 Spo-

ren des voll virulentem Feldisolats SD20 infi-

ziert. Die Applikation der einzelnen Impfkom-

ponenten erfolgte nicht wie geplant in

Mischung, sondern jeweils einzeln in einem

Volumen von 1 ml in das gleiche Areal. Die

Serumentnahme fand vor dem Beginn der

Immunisierung (Woche 0) und nach jeder

Immunisierung (Woche 3, 5 und 8), sowie vor

(Woche 10) und 2 Wochen nach der Infektion

(Woche 12) statt. Die serologischen Tests

umfassten die Detektion von IgG Antikörpern

gegen rPA83, rBclA, FIS und vegetatives

Antigen, sowie TNA-Titer (Tabelle 46).

Wie schon zuvor beobachtet, waren auch

bei dieser Gruppe bereits vor dem Start der Immunisierung niedrige unspezifische Titer gegen

die jeweiligen Antigene messbar. Durch die Immunisierung konnten die anti-rPA83 IgG-Titer

bereits ab der zweiten Immunisierung tendenziell erhöht werden (Abbildung 44). Dieser

116


ELISA IgG und TNA-Titer der Ziegengruppe 6 im Verlauf von12 Wochen gemessen, sowie überlebte Zeit in dpi; Beobachtungenzum Überleben wurden bis 8 dpi durchgeführt; Titerwerte ergebensich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einerOD404nm ≥ 0,1. Verstorbene sind orange hinterlegt, Überlebendeentsprechend grün; M – arithmetischer Mittelwert;S – Standardabweichung


0 3 5 8 dpi

rPA83

8191 514 657 10285 6171 3200 - 4,1

8194 385 600 4000 2857 1485 - 2,6

8195 214 2285 17371 12342 5600 - 4,6

8200 685 771 3200 4228 1600 1314 -

8201 685 2171 1942 5028 285 - 3,8

M 497 1297 7360 6125 2434 - 3,8

S 202 853 6456 3679 2051 - 0,8

TNA

8191 <50 <50 99 <50 <50 - 4,1

8194 <50 <50 50 <50 <50 - 2,6

8195 <50 50 149 74 74 - 4,6

8200 <50 <50 <50 <50 <50 <50 -

8201 <50 <50 <50 <50 <50 - 3,8

M - - 60 - - - 3,8

S - - 65 - - - 0,8

rBclA

8191 281 759 3853 3853 1551 - 4,1

8194 387 1355 1795 1453 742 - 2,6

8195 185 2644 2906 1795 1077 - 4,6

8200 342 783 1600 1093 604 522 -

8201 661 628 383 1730 144 - 3,8

M 371 1234 2107 1985 824 - 3,8

SE 179 837 1324 1080 527 - 0,8

FIS Pool 625 6800 14400 20000 16800 12400 -

veg Pool 170 200 200 282 247 1694 -

Antigen / Titer

Ziegen Nr. 10a 12b

a Probenzeitpunkt vor der Infektionb Probezeitpunkt nach Beendigung der Infektion


Anstieg war aber durch die starken Unter-

schiede zwischen den einzelnen Tieren nicht

signifikant (p = 0,081). Obwohl die Titer

gegen rPA83 nach der dritten Immunisierung

(Woche 8) auf dem Niveau von Woche 5 ver-

blieben (p = 0,464), waren sie im Vergleich zu

Woche 0 signifikant erhöht (p = 0,03), da die

individuellen Werte weniger streuten. Entspre-

chend der niedrigen anti-rPA83 IgG-Titer

waren TNA-Titer nur marginal (<150) und

nicht für alle Tiere messbar.

Auch die anti-rBclA IgG-Titer in Woche 8

zeigten eine signifikante Erhöhung gegenüber

den Werten von Woche 0 (p = 0,034). Den-

noch lagen die individuellen Werte für rBclA

mehrheitlich in einem Bereich, der den unspezifisch gemessenen Hintergrundtitern entsprach

(Abbildung 45). Daher ist davon auszugehen, dass auch in dieser Gruppe rBclA nur marginal

immunogen war. Sowohl für rBclA, als auch für rPA83 fielen die Antikörpertiter in Woche 10,

wie auch bei Gruppe 4, im Vergleich zu Woche 8 rapide ab (p ≤ 0,027).

Durch die Immunisierung mit FIS konnte ein sehr hoher Titer anti-FIS Titer erzeugt werden.

Dieser stieg, im Gegensatz zu den anderen gemessenen Antikörpertitern kontinuierlich mit

jeder Immunisierung weiter an und fiel nach der Beendigung des Impfplans nur langsam wieder

117

Abbildung 44: Ziegengruppe 6 (anti-rPA83 IgG-Titer)

Lineare Darstellung der anti-rPA83 IgG-Titer von Gruppe 6(Tabelle 46) im Versuchsverlauf; Für jeden Messzeitpunkt sind dieEinzelwerte aller Individuen angegeben, sowie durch einenhorizontalen Strich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linienmiteinander verknüpft sind; Blaue Pfeile deuten den Zeitpunkte derImmunisierung an und schwarz entsprechend den Zeitpunkt derInfektion. Zur besseren Darstellung wurde die y-Achse mit einerUnterbrechung im Bereich 13000 – 17000 versehen.

Abbildung 45: Ziegengruppe 6 (ELISA- und TNA-Titer)

Lineare Darstellung der anti-rBclA IgG-Titer (A) und anti-FIS, -vegetativ und TNA-Titer (B)von Gruppe 6 (Tabelle 46). imVersuchsverlauf; Für jeden Messzeitpunkt sind durch einen horizontalen Strich Mittelwerte angegeben und durch gepunkteteLinien miteinander verknüpft; Für Woche 12 sind die Einzeltiter der Überlebenden verzeichnet; Blaue Pfeile deuten denZeitpunkte der Immunisierung an und schwarz entsprechend den Zeitpunkt der Infektion


ab (Abbildung 45). Ein erhöhter Titer gegen das vegetative Antigen konnte auch bei dieser

Gruppe durch die Immunisierung erwartungsgemäß nicht nachgewiesen werden.

Die Infektion überlebte nur 1 von 5 Tieren, wobei eine leicht erhöhte Überlebenszeit der ver-

storbenen Tiere erkennbar war. Die überlebende Ziege zeigte nach der Infektion für alle gemes-

senen Antigene, exklusive des vegetativen Antigens, nahezu unveränderte Antikörpertiter. Der

Titer gegen das vegetative Antigen schien marginal erhöht. Korrelationen der gemessenen Titer

mit dem Überleben waren nicht vorhanden. Alle verstorbenen Ziegen hatten vor dem Tod eine

erhöhte Temperatur, die Überlebende zu keinem Zeitpunkt.

4.3.8 Versuchswiederholung der Gruppen 4 und 6 (Türkei)

Aufgrund des beschriebenen Fehlers bei der Immunisierung der Gruppen 4 und 6 und der dort

beobachteten niedrigen Schutzraten, wurde eine Wiederholung dieser Gruppen angestrebt. Die

generelle Durchführung der Wiederholung geschah analog zu den bereits beschriebenen

Arbeitsschritten mit leichten, erfahrungsbedingten Änderungen (siehe hierzu auch 3.4.3). Diese

betrafen die Messung der Temperatur, welche zweimal täglich regulär durchgeführt wurde

(zuvor ein Mal) und die Erhöhung der Fütterungsintervalle (dreimal täglich, statt zuvor

zweimal). Zudem waren die Tiere während der Infektion, durch die ausschließliche Haltung

innerhalb eines Gebäudes, weniger stark äußeren Temperaturschwankungen ausgesetzt und

auch nachts in Intervallen von 3 – 6 h gut beobachtbar. Ein Transport zwischen Immunisierung

und Infektion entfiel. Ausschlaggebend für eine frequentere Kontrolle des Zustands der Tiere

sowie eine Blutabnahme zur Abklärung von Bakterien im Blut war wie zuvor eine Temperatur

von 40 °C und höher. Eine weitere Veränderung betraf die serologische Auswertung. Zur Ver-

minderung der unspezifischen Hintergrundtiter wurde die Blocklösung im ELISA mit 10 %

Milchpulver statt 10 % FKS verwendet. Wie in Tabelle 47 aufgeführt, konnten durch die Ver-

wendung von Milchpulver die unspezifischen Hintergrundtiter gegen alle Antigene deutlich

vermindert werden, sodass sich eine niedrigere Schwankungsbreite bis zu Titerwerten von ca.

200 ergab. In Einzelfällen, bei den Negativseren der Gruppen 4 (W) und 6 (W), waren aber

auch höhere unspezifische Hintergrundtiter möglich. Daher ist für die Einzelbetrachtungen die-

ser Gruppen ebenfalls keine Normalisierung angewendet worden. Beim Vergleich der Gruppen

untereinander wurde mit normalisierten Werten gearbeitet.

Zur Verbesserung der Wirksamkeit wurde, neben der korrekten Applikation als Mischung,

die Konzentration der Antigene rPA83 und rBclA von 25 µg auf 75 µg pro Dosis erhöht. Dar-

über hinaus beinhalteten die vakzinierten Gruppen 4 (W) und 6 (W) 10 statt 5 Tiere, um poten-

tielle Verluste durch Umwelteinflüsse ausgleichen zu können und bessere Vergleichswerte zu

erhalten. Da in der Versuchswiederholung ein anderer Infektionsstamm verwendet wurde, war

118


zudem eine weitere unvakzinierte Kontrollgruppe (NK (W)) bestehend aus 5 Tieren Bestandteil

des Wiederholungsversuchs. Die Impfung der Tiere erfolge dreimal im Abstand von 3 Wochen.

Blutentnahmen wurden vor dem Beginn der Vakzinierung vorgenommen (Woche 0), vor jeder

weiteren Vakzinierung (Woche 3 und 6), direkt vor der Infektion (Woche 10 bzw. 11) und nach

der Beendigung des Infektionsversuchs (Woche 13).

4.3.8.1 Negativkontrolle (Wiederholung)

Eine Gruppe von 5 Ziegen wurde nicht vakziniert und während des gesamten Versuchsverlaufs

mit den Ziegen von Gruppe 4 (W) und 6 (W) gehalten und beprobt. Da für die Versuchswieder-

holungen ein anderer Infektionsstamm verwendet wurde, stellt diese Gruppe die negativen Ver-

gleichswerte für die Serologie und Schutzraten der Wiederholungen dar. Von den fünf ursprüng-

lich eingesetzten Ziegen dieser Gruppe verstarb Ziege Nr. 96132 zwischen Woche 6 und 9 an

einer Infektion. Die serologischen Daten dieser Ziege wurden bis einschließlich Woche 6 in alle

Betrachtungen mit einbezogen.

Zur Verifizierung der Pathogenität des verwendeten Feldisolats K-136 in Ziegen wurden vor der

Durchführung des Infektionsversuchs 2 der verbliebenen 4 Tiere dieser Gruppe zufällig ausge-

wählt (96163 und kesik kulak), abgetrennt und bereits in Woche 10 mit einer Dosis von

1027 Sporen infiziert (Tabelle 16). Die Infektion der restlichen 2 Tiere dieser Gruppe erfolgte in

119

Tabelle 47: Negativkontrolle (W) – Ziege (Türkei)

ELISA IgG- und TNA-Titer der Gruppe NK (W) im Verlauf von 13 Wochen gemessen, sowie Eintritt des Todes in dpi.Titerwerte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD 404nm ≥ 0,1. Die Überwachung desÜberlebens erfolgte bis 14 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange; Ausgegrautdargestellt (Hintergrund weiß) sind Tiere die vorzeitig aus dem Versuch ausgeschieden sind; M – arithmetischerMittelwert; S – Standardabweichung

Tod in Tod in

0 3 6 dpi 0 3 6 dpi

rPA83

97014 <100 <100 <100 <100 2,5

rBclA

97014 <100 <100 <100 118 2,5

97015 <100 <100 <100 <100 4,7 97015 102 104 142 136 4,7

<100 <100 <100 - - 179 289 477 - -

<100 <100 <100 <100 2,3 120 <100 101 155 2,3

<100 <100 <100 <100 2,9 116 <100 <100 115 2,9

M - - - - 3 M 103 79 144 131 3

S - - - - 1 S 65 126 196 18 1

TNA

97014 <50 <50 <50 <50 2,5

FIS

97014 160 143 138 171 2,5

97015 <50 <50 <50 <50 4,7 97015 182 188 326 338 4,7

<50 <50 <50 - - 132 137 161 - -

<50 <50 <50 <50 2,3 131 151 139 <100 2,3

<50 <50 <50 <50 2,9 155 114 209 239 2,9

M - - - - 3 M 152 147 195 187 3

S - - - - 1 S 21 27 79 142 1

Veg

97014 <100 <100 <100 <100 2,5

97015 <100 <100 <100 <100 4,7

<100 <100 <100 - -

<100 <100 <100 <100 2,3

<100 <100 <100 <100 2,9

M - - - - 3

S - - - - 1

Antigen / Titer

Ziegen Nr.

W ochen nach 1. ImmunisierungcAntigen / Titer

Ziegen Nr.

W ochen nach 1. Immunisierungc

11d 11d

96132a 96132a

96163b 96163b

kkb kkb

96132a 96132a

96163b 96163b

kkb kkb

a starb zwischen Woche 6 und 9 durch eine Infektionb Infektion bereits in Woche 10

96132a c bezogen auf Gruppe 4(W) und 6(W)

96163b d Probenzeitpunkt vor der Infektion

kkb


Woche 11 mit derselben Sporensuspension, zusammen mit allen Tieren von Gruppe 4 (W) und

6 (W), mit 918 Sporen. Die Schwankung der Infektionsdosis ergab sich aus den unterschiedli-

chen Auszählungen der jeweiligen überzähligen Infektionsdosen, wobei beide Infektionen mit

der gleichen Sporensuspension durchgeführt wurden. Alle Tiere verstarben innerhalb von

5 Tagen, wobei nur zwei der Tiere vor dem Tod eine kurzzeitige Erhöhung der Temperatur

(<10h vor dem Tod) zeigten, die bis zum Tod erhalten blieb. Keiner der gemessenen Titer

(Tabelle 47) zeigte eine signifikante Veränderung während des Versuchszeitraums (p ≥ 0,098),

daher wurde davon abgesehen die Werte grafisch darzustellen.

4.3.8.2 Ziegengruppe 4 (Wiederholung)

Eine Gruppe von 10 Ziegen wurde dreimal im Abstand von 3 Wochen mit einer Mischung aus

rPA83 (75 µg), rBclA (75 µg) und Lipopeptid (500 µg) s. c. immunisiert. Während der Immuni-

sierungsphase fielen 2 Tiere (Nr. 97011 und Eks) zwischen Woche 3 und 6, bedingt durch den

gewährten Freigang im Außengehege, wildernden Straßenhunden zum Opfer. Die serologischen

Daten dieser Tiere wurden bis zu deren Ausscheiden aus dem Versuch in alle Betrachtungen

einbezogen. Die Infektion der verbliebenen 8 Tiere erfolgte s. c. 5 Wochen nach der letzten

Immunisierung in Woche 11 mit einer Dosis von 918 Sporen des voll virulenten Feldisolats K-

136. Die Infektion überlebten 4 von 8 Tieren, wobei bei den verstorbenen eine verlängerte

Überlebenszeit von durchschnittlich 5 Tagen gemessen wurde. Bei zwei der als „verstorben“

gewerteten Tiere wurden frühzeitig Bakterien im Blut nachgewiesen und aufgrund des guten

Gesundheitszustands der Tiere eine Behandlung mit Penicillin/Streptomycin begonnen. Der

„Todeszeitpunkt“ dieser Tiere wurde daher artifiziell festgelegt und stellt den Zeitpunkt des

positiven Befunds dar. Beide Tiere (Nr. 99834 und 627398) blieben am Leben und konnten

ebenfalls nach der Beendigung des Versuchs beprobt werden. Die Daten für diesen Zeitpunkt

sind zwar in den Tabellen und Darstellungen angegeben, flossen aber nicht in die Berechnungen

und statistischen Kalkulationen für Woche 13 mit ein. Alle verstorbenen Tiere zeigten an min-

destens einem Probenzeitpunkt vor dem Tod eine erhöhte Temperatur von >40 °C, bei zwei von

vier Überlebenden war dies ebenfalls der Fall. In Tabelle 48 sind die serologischen Daten der

Gruppe aufgelistet. Auch in dieser Gruppen waren für den Zeitpunkt vor dem Beginn der

Immunisierung (Woche 0) teilweise unspezifische Hintergrundtiter für die einzelnen Antigene

messbar.

120


Durch die Immunisierung konnten die Antikörpertiter gegen rPA83 bereits nach der ersten

Immunisierung (Woche 3) signifikant erhöht werden (p = 0,001). Diese stiegen durch die zwei-

te Immunisierung weiter an (p = 0,007), sodass für den Probenzeitpunkt in Woche 6 ebenfalls

signifikant erhöhte und stark mit den anti-rPA83 IgG-Titern korrelierende TNA-Titer messbar

waren (p = 0,02; rs = +0,927; Abbildung 46). Für den Messzeitpunkt nach der dritten Immuni-

sierung in Woche 11 waren die Titer gegen rPA83 zwar weiterhin signifikant erhöht (p = 0,046),

jedoch nicht unterschiedlich zu den in Woche 6 gemessenen Titern (p = 0,064). Für die Mehr-

heit der Tiere waren keine nachweisbaren TNA-Titer für Woche 3 und 11 messbar. Das heißt

die nach der zweiten Immunisierung messbaren TNA-Titer fielen nach der dritten Immunisie-

rung wieder unter den Wert von 1 : 50 (Abbildung 46B). Durch die überlebte Infektion kam es

für einige Tiere, insbesondere den behandelten Tieren, die nachweislich Bakterien im Blut auf-

gewiesen hatten, zu einem extremen Anstieg der anti-rPA83 IgG-Titer und damit korrelierend

121

Tabelle 48: Ziegengruppe 4 (W) – ELISA- und TNA-Titer

ELISA IgG- und TNA-Titer der Ziegengruppe 4 (W) im Verlauf von 13 Wochen gemessen, sowie Eintritt des Todes in dpi.Titerwerte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD 404nm ≥ 0,1. Die Überwachung desÜberlebens erfolgte bis 14 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange; Ausgegraut dargestelltsind Tiere die vorzeitig aus dem Versuch ausgeschieden sind; M – arithmetischer Mittelwert; S – Standardabweichung

W ochen nach 1. Immunisierung Tod in W ochen nach 1. Immunisierung Tod in

0 3 6 dpi 0 3 6 dpi

rPA83

105 642 - - - -

rBclA

<100 250 - - - -

97013 <100 528 2836 2628 - 5,8 97013 <100 197 267 111 5,8

134 427 5415 2921 1244641 8,7 101 105 157 175 192 8,7

580315 213 391 15903 23386 282292 - 580315 164 200 297 126 120 -

580319 105 368 2872 2415 - 2,7 580319 <100 128 179 171 - 2,7

<100 773 4704 3006 800475 2,8 103 <100 225 124 228 2,8

627399 <100 157 2371 972 762 - 627399 369 624 701 382 366 -

728761 <100 597 6600 11190 658286 - 728761 <100 <100 159 <100 <100 -

119 813 - - - - <100 179 - - - -

Gk <100 1354 12719 5022 1404 - Gk <100 110 186 <100 <100 -

M 68 605 6678 6443 235686 5,0 M 74 179 271 136 121 5,0

S 77 329 4998 7527 311363 2,9 S 120 177 181 120 173 2,9

TNA

<50 <50 - - - -

FIS

144 206 - - - -

97013 <50 <50 <50 <50 - 5,8 97013 164 177 316 191 - 5,8

<50 <50 74,8 <50 10461 8,7 115 <100 170 262 190 8,7

580315 <50 <50 223,6 50 1315 - 580315 305 237 536 730 430 -

580319 <50 <50 74,8 <50 - 2,7 580319 180 172 265 319 - 2,7

<50 <50 50 <50 9465 2,8 103 123 269 267 189 2,8

627399 <50 <50 <50 <50 <50 - 627399 198 194 326 267 197 -

728761 <50 <50 198,8 50 3225 - 728761 <100 <100 171 158 129 -

<50 <50 - - - - 150 129 - - - -

Gk <50 74,8 273,24 <50 <50 - Gk 258 350 568 391 286 -

M - - 112 13 1135 5,0 M 162 159 328 323 261 5,0

S - - 105 23 1525 2,9 S 84 105 150 179 130 2,9

Veg

<100 <100 - - - -

97013 <100 <100 <100 <100 - 5,8

<100 <100 <100 <100 110 8,7

580315 <100 <100 <100 <100 <100 -

580319 <100 <100 <100 <100 - 2,7

<100 <100 <100 <100 <100 2,8

627399 <100 <100 <100 101 <100 -

728761 <100 <100 <100 <100 <100 -

<100 <100 - - - -

Gk <100 <100 <100 <100 <100 -

M - - - - - 5,0

S - - - - - 2,9

Antigen / Titer

Ziegen Nr.

Antigen / Titer

Ziegen Nr.11c 13d 11c 13d

97011a 97011a

99348b 99348b

627398b 627398b

Eksa Eksa

97011a 97011a

99348b 99348b

627398b 627398b

Eksa Eksa

97011a a starb zwischen Woche 3 und 6 durch Wildhunde

b wurde nach der Detektion von Bakterien im Blut mit Antibiotika behandelt und überlebte; zählt zu Verstorbenen; Zeitpunkt des Todes ist Zeitpunkt der Antibiotikagabe

99348b

c Probenzeitpunkt vor der Infektion

627398b d Probenzeitpunkt nach Beendigung der Infektion

Eksa


den TNA-Titern (rs = +0,95). Für zwei der überlebenden Tiere war keine Titererhöhung für

rPA83 feststellbar, weshalb die gemessenen Werte für TNA und rPA83 in Woche 13 insgesamt

aufgrund der hohen Streuung keine Signifikanz aufwiesen. Alle Tiere die eine Temperatur von

>40 °C und höher aufwiesen, zeigten auch eine deutliche Titererhöhung gegen rPA83 von

Woche 11 auf Woche 13.

Wie in Tabelle 48 aufgeführt, konnten gegen

das vegetative Antigen im Verlauf der Immu-

nisierung erwartungsgemäß keine signifikan-

ten Titer gemessen werden. Dies änderte sich

auch nach der überlebten Infektion nicht. Die

Titer gegen rBclA nach der ersten und zweiten

und für FIS nach der zweiten und dritten Im-

munisierung waren signifikant erhöht

(p ≤ 0,02; Abbildung 47). Allerdings bewegten

sich die Titer für beide Antigene in einem Be-

reich knapp oberhalb der unspezifischen Hin-

tergrundtiter, weswegen diese Titererhöhung

wenig aussagekräftig ist. Eine Korrelation der

rBclA und FIS-Titer bestand nur für Woche 3

und 6 (rs ≥ +0,685). Nach der Infektion konnte

auch für die anti-rBclA und -FIS IgG-Titer kei-

ne Veränderung festgestellt werden. Keiner der gemessenen signifikant erhöhten Titer (rPA83

122

Abbildung 46: Ziegengruppe 4 (W) – anti-rPA83 und TNA-Titer

Halblogarithmische Darstellung der anti-rPA83 IgG-Titer (A, links) und TNA-Titer (B, rechts) von Gruppe 4 (W) (Tabelle 48)im Versuchsverlauf; Für jeden Messzeitpunkt sind die Einzelwerte aller Individuen angegeben, sowie durch einenhorizontalen Strich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linien miteinander verknüpft sind; Blaue Pfeile deuten denZeitpunkte der Immunisierung mit der Proteinkombination an, schwarze entsprechend den der Infektion; Mit *gekennzeichnete Zeitpunkte zeigen signifikant erhöhte Titer (p ≤ 0,05) im Vergleich zu Woche 0;

Abbildung 47: Ziegengruppe 4 (W) – anti-rBclA IgG-Titer

Halblogarithmische Darstellung der anti-rBclA IgG-Titer vonGruppe 4 (W) (Tabelle 48) im Versuchsverlauf; Für jedenMesszeitpunkt sind die Einzelwerte aller Individuen angegeben,sowie durch einen horizontalen Strich, deren Mittelwerte, die durchgepunktete Linien miteinander verknüpft sind; Blaue Pfeile deutenden Zeitpunkte der Immunisierung mit der Proteinkombination an,schwarze entsprechend den der Infektion; Mit * gekennzeichneteZeitpunkte zeigen signifikant erhöhte Titer (p ≤ 0,05) im Vergleichzu Woche 0;


und TNA eingeschlossen) korrelierte mit der überlebten Zeit (rs ≤ +0,49). Dies galt für alle

Messzeitpunkte.

4.3.8.3 Ziegengruppe 6 (Wiederholung)

Eine Gruppe von 10 Ziegen wurde dreimal im Abstand von 3 Wochen mit einer Mischung aus

rPA83 (75 µg), rBclA (75 µg), FIS (108 Sporen) und Lipopeptid (500 µg) s. c. immunisiert und

5 Wochen nach der letzten Immunisierung (Woche 11) mit einer Dosis von 918 Sporen des voll

virulenten Feldisolats K-136 infiziert. Die Infektion überlebten 8 von 10 Tieren, wobei eines

der verstorbenen Tiere eine verlängerte Überlebenszeit von 5 Tagen aufwies. Die serologischen

Tests umfassten die Detektion von IgG Antikörper gegen rPA83, rBclA, FIS und vegetatives

Antigen, sowie TNA-Titer (Tabelle 49).

123

Tabelle 49: Ziegengruppe 6 (W) – ELISA- und TNA-Titer

ELISA IgG- und TNA-Titer der Ziegengruppe 6 (W) im Verlauf von 13 Wochen gemessen, sowie Eintritt des Todes in dpi.Titerwerte ergeben sich als reziproker Wert der letzten Verdünnungsstufe mit einer OD 404nm ≥ 0,1. Die Überwachung desÜberlebens erfolgte bis 14 dpi. Überlebende sind entsprechend grün hinterlegt, Verstorbene orange; M – arithmetischerMittelwert; S – Standardabweichung

W ochen nach 1. Immunisierung Tod in W ochen nach 1. Immunisierung Tod in

0 3 6 dpi 0 3 6 dpi

rPA83

96139 122 188 3017 903 94279 -

rBclA

96139 120 147 1093 380 517 -

96157 104 1422 6471 2721 1194 - 96157 <100 191 779 398 182 -

97162 110 1681 13044 3591 283759 - 97162 <100 148 805 252 164 -

580316 561 22434 25111 20003 32358 - 580316 132 329 768 668 259 -

627395 754 2335 50260 18230 - 5,1 627395 <100 166 1226 478 - 5,1

627396 <100 143 2886 1494 - 2,5 627396 <100 159 649 286 - 2,5

728758 198 740 8533 5194 2816 - 728758 <100 270 567 217 175 -

729277 140 345 17898 4413 134279 - 729277 <100 187 1248 456 216 -

729278 167 3541 1575 5566 34909 - 729278 100 151 177 256 137 -

729284 163 768 11387 6083 1479612 - 729284 <100 <100 305 159 <100 -

M 232 3360 14018 6820 257901 3,8 M 35 175 762 355 206 3,8

S 235 6787 14706 6709 502403 1,8 S 57 86 360 152 146 1,8

TNA

96139 <50 <50 <50 <50 670 -

FIS

96139 172 1386 5221 4596 5030 -

96157 <50 <50 124 <50 <50 - 96157 121 1708 10150 5295 3612 -

97162 <50 75 199 <50 3473 - 97162 153 4595 6074 5230 5911 -

580316 <50 323 596 248 99 - 580316 184 4250 16053 11707 6378 -

627395 <50 50 373 50 - 5,1 627395 <100 10818 24160 12676 - 5,1

627396 <50 <50 50 <50 - 2,5 627396 <100 1492 3135 869 - 2,5

728758 <50 <50 50 <50 <50 - 728758 159 737 7428 4802 3071 -

729277 <50 <50 100 <50 3299 - 729277 <100 2253 2428 1834 3045 -

729278 <50 149 <50 75 322 - 729278 175 2319 2123 3681 1728 -

729284 <50 <50 50 75 4168 - 729284 <100 2627 3924 3869 1979 -

M - 60 154 45 1504 3,8 M 96 3218 8070 5456 3844 3,8

S - 105 191 78 1804 1,8 S 85 2936 7057 3834 1746 1,8

Veg

96139 <100 <100 <100 <100 163 -

96157 <100 <100 <100 <100 <100 -

97162 <100 <100 <100 <100 186 -

580316 <100 <100 <100 <100 <100 -

627395 <100 <100 <100 <100 - 5,1

627396 <100 <100 <100 <100 - 2,5

728758 <100 <100 <100 <100 <100 -

729277 <100 <100 <100 <100 <100 -

729278 <100 <100 <100 <100 <100 -

729284 <100 <100 <100 <100 176 -

M - - - - 66 3,8

S - - - - 91 1,8

Antigen / Titer

Ziegen Nr.

Antigen / Titer

Ziegen Nr.11a 13b 11a 13b

a Probenzeitpunkt vor der Infektionb Probenzeitpunkt nach Beendigung der Infektion


Wie schon zuvor beobachtet, waren auch bei dieser Gruppe bereits vor dem Start der Immuni-

sierung niedrige unspezifische Hintergrundtiter gegen die jeweiligen Antigene messbar. Die

anti-rPA83 IgG-Titer konnten bereits durch die erste Immunisierung bei einigen Tieren erhöht

werden. Da dies nicht auf alle Tiere zutraf und die Werte für diesen Zeitpunkt (Woche 3) ent-

sprechend stark streuten, war diese Erhöhung nicht signifikant. Dies änderte sich erst mit der

zweiten Immunisierung, die eine signifikante Titererhöhung bei allen Tieren bewirkte

(p = 0,015; Abbildung 48). Die TNA-Titer waren ebenfalls nach der zweiten Immunisierung

(Woche 6) signifikant erhöht (p = 0,031) und korrelierten für alle Messzeitpunkte nach der ers-

ten Immunisierung stark mit den anti-rPA83 IgG-Titern (rs ≥ +0,833). Die Titerwerte für rPA83

IgG und TNA in Woche 11, nach der dritten Immunisierung fielen im Vergleich zu Woche 6

signifikant ab (p ≤ 0,047). Allerdings lagen die Werte für rPA83 noch immer in einem Bereich,

der signifikant höher lag, als die gemessenen Titer vor der Immunisierung (p = 0,011). Durch

die überlebte Infektion kam es, wie auch schon in Gruppe 4 (W) beobachtet, zu einem extremen

Anstieg der anti-rPA83 IgG- und TNA-Titer in ca. der Hälfte der Tiere. Die restlichen Tiere

zeigten nur leicht ansteigende, stagnierende oder sogar fallende Titer. Daher besteht für diesen

Messzeitpunkt keine Signifikanz. Auch bei dieser Gruppe ging eine deutliche Erhöhung der

anti-rPA83 IgG-Titer nach der Infektion tendenziell mit dem Auftreten von Fieber einher. Ähn-

lich wie bei Gruppe 4 (W) waren auch hier für den gesamten Messzeitraum keine signifikanten

anti-vegetativ IgG-Titer feststellbar.

Die in Abbildung 49 dargestellten anti-FIS und -rBclA IgG-Titer waren bereits nach der ersten

Immunisierung signifikant erhöht (p ≤ 0,008), wobei die gemessen Titer gegen rBclA (< 1300)

verglichen mit den anti-FIS IgG-Titern (< 25000) sehr gering waren. Eine weitere Erhöhung der

124

Abbildung 48: Ziegengruppe 6 (W) – anti-rPA83 IgG- und TNA-Titer

Halblogarithmische Darstellung der anti-rPA83 IgG- (A) und TNA-Titer (B) von Gruppe 6 (W) (Tabelle 49) imVersuchsverlauf; Für jeden Messzeitpunkt sind die Einzelwerte aller Individuen angegeben, sowie durch einen horizontalenStrich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linien miteinander verknüpft sind; Blaue Pfeile deuten den Zeitpunkte derImmunisierung mit der Proteinkombination an, schwarze entsprechend den der Infektion; Mit * gekennzeichnete Zeitpunktezeigen signifikant erhöhte Titer (p ≤ 0,05) im Vergleich zu Woche 0;


Antikörpertiter nach der zweiten Immunisierung war für beide Antigene nachweisbar

(p ≤ 0,012), nach der dritten Immunisierung jedoch nicht. Generell sanken die Titerwerte ab

Woche 6 kontinuierlich ab und wurden auch durch die überlebte Infektion nicht weiter erhöht.

Eine signifikante Korrelation der anti-rBclA und -FIS IgG Titer bestand für den Zeitraum der

Immunisierung (rs ≤ +0,41) und nach der Infektion (rs = +0,619) nicht.

Erstaunlicherweise war auch eine teils starke Korrelation der anti-FIS IgG-Titer sowohl mit

den anti-rPA83 IgG-Titern, als auch den TNA-Titern für Woche 3 und 6 vorhanden

(+0,600 ≤ rs ≥ +0,724). Weitere Korrelationen, die Überlebenszeit eingeschlossen, konnten

nicht festgestellt werden.

4.3.9 Zusammenfassung der Ergebnisse der NLV

Die Antikörpertiter der Ziegenversuche mit NLV in Südafrika (Gruppe 4 – 6) waren generell

sehr niedrig und durch die individuell stark schwankenden, unspezifischen Hintergrundtiter

schwer interpretierbar. Die Schwankungsbreite der Titer lag je nach Antigen bei <100 – 2600.

Durch den Austausch von FKS mit Milchpulver in der Blocklösung des ELISA konnte die

unspezifischen Hintergrundtiter in den Wiederholungsversuchen verringert werden

(<100 – 800). Für eine bessere Vergleichbarkeit der Gruppen untereinander wurden daher die

individuellen Titerwerte durch Abzug der gemessenen Titer aus Woche 0 normalisiert. Die ent-

sprechenden Gegenüberstellungen und Signifikanzberechnungen beziehen sich daher auf nor-

malisierte Werte. Da die Probennahmezeitpunkte der verschiedenen Gruppen unterschiedlich

waren, wurden für die vergleichende Darstellung in Abbildung 50 die Probenzeitpunkte aus-

125

Abbildung 49: Ziegengruppe 6 (W) – anti-rBclA und -FIS IgG-Titer

Halblogarithmische Darstellung der anti-FIS (A) und -rBclA IgG-Titer (B) von Gruppe 6 (W) (Tabelle 49) imVersuchsverlauf; Für jeden Messzeitpunkt sind die Einzelwerte aller Individuen angegeben, sowie durch einen horizontalenStrich, deren Mittelwerte, die durch gepunktete Linien miteinander verknüpft sind; Blaue Pfeile deuten den Zeitpunkte derImmunisierung mit der Proteinkombination an, schwarze entsprechend den der Infektion; Mit * gekennzeichnete Zeitpunktezeigen signifikant erhöhte Titer (p ≤ 0,05) im Vergleich zu Woche 0;


gewählt, die einander am besten entsprachen. So ist anzumerken, dass für Gruppe 4 und 6 in

Woche 8, 2 Wochen nach der letzten Immunisierung, zwar die höchsten Titerwerte gemessen

wurden, aber der sinnvollere Vergleich zu den Wiederholungsgruppen bei den Werten aus

Woche 10 besteht. Entsprechend beinhaltet Abbildung 50 die normalisierten Werte des Mess-

punkts vor der Infektion von Woche 62 für Gruppe 1, Woche 10 für Gruppe 4 und 6, Woche 17

für Gruppe 5 und Woche 11 für Gruppe 4 (W), 6 (W) und NK (W).

Die DNA-Vakzinierung von Ziegen mit der erfolgversprechenden Kombination an Vektoren

schien nur eine schwache Immunität zu erzeugen. So waren zwar teils leicht erhöhte Titer

(≤ 1000, nach Normalisierung) gegen die eingesetzten Antigene vorhanden, diese waren aber

nicht signifikant höher als die Titer der Kontrollgruppen (p ≥ 0,057). Der nachträglich verab-

reichte Proteinboost mit rPA83 (25 µg), rBclA (25 µg), FIS (108 Sporen) und Lipopeptid

erzeugte zwar eine deutliche Erhöhung der Antikörpertiter gegen rLF, rPA83 und rBclA, dieser

Anstieg entsprach aber für rPA83 und rBclA der gemessenen Titererhöhung von Gruppe 6 und,

rBclA ausgenommen, von Gruppe 6 (W) nach der ersten Immunisierung (p ≥ 0,071). Da im

126

Abbildung 50: IgG- und TNA-Titer der NLV (Ziege)

Logarithmische Darstellung der ELISA-Titer (IgG) und TNA-Titer der Seren aller Ziegengruppen direkt vor der Infektion;Die Standardabweichung ist über den Balken als positiver Wert angegeben (bei Messwerten aus vereinigten Mischprobender Gruppe entsprechend nicht); Werten unterhalb der Nachweisgrenze wurde für eine bessere Darstellung ein Wert von 10zugewiesen; BclAD1D3 bezieht sich auf den Vektor mit flankierenden Signalsequenzen von TPA und LAMP1; Die graueTrennlinie auf Höhe von 100 soll zur ungefähren Abschätzung des möglichen unspezifischen Hintergrunds der ELISA-Titerdienen


Wiederholungsversuch generell niedrigere anti-rBclA IgG-Titer gemessen wurden, erzeugte der

Proteinboost in Gruppe 5 signifikant höhere Titer gegen rBclA als in Gruppe 6 (W) (p ≤ 0,021).

Damit schien die DNA-Vakzinierung selbst keinen nachweisbaren Effekt zu haben und war

auch in Kombination mit einem Proteinboost nicht besser als die analoge Proteinapplikation

allein.

Beim Vergleich der Gruppen 4 und 6 waren über den gesamten Immunisierungsverlauf keine

Unterschiede für die anti-rPA83, -rBclA IgG- und TNA-Titer erkennbar (p ≥ 0,084). Einzige

Ausnahme bildeten die anti-rBclA IgG-Titer in Woche 8, die für Gruppe 6 signifikant höher

lagen (p = 0,04). In den abgebildeten Werten ist dieser Unterschied tendenziell noch sichtbar,

war aber für Woche 11 nicht mehr signifikant. Da für diese Gruppen die anti-FIS IgG-Titer nur

für eine vereinigte Mischprobe der Gruppe erhoben wurden, ließ sich keine Aussage über die

statistische Signifikanz der Unterschiede tätigen. Allerdings lagen die Werte für Gruppe 6 weit

über denen von Gruppe 4, sodass diese das einzige nachweisbare Unterscheidungsmerkmal der

beiden Gruppen darstellten.

Dies wurde auch in den Wiederholungsversuchen untermauert und statistisch belegt. Wäh-

rend für die anti-rPA83 IgG- und TNA-Titer ebenfalls keine Unterschiede zwischen Grup-

pe 4 (W) und 6 (W) festgestellt werden konnten (p ≥ 0,142), waren die Antikörpertiter für

rBclA und FIS in Gruppe 6 (W) für nahezu alle Probenpunkte signifikant höher als für Grup-

pe 4 (W) (p ≤ 0,007). Ebenso waren für Gruppe 6 (W) vermehrt TNA-Titer messbar, welche

neben den anti-rPA83 IgG-Titern auch mit den anti-FIS IgG-Titern korrelierten (rs ≥ +0,6).

Der Vergleich der Gruppen 4 und 6 mit den Wiederholungsversuchen zum Zeitpunkt vor der

Infektion (Woche 10 bzw. 11; Abbildung 50) zeigte für keines der Antigene signifikante Unter-

schiede in der Titerhöhe (p ≥ 0,142). Bei dreifach erhöhter Dosis und Applikation der Vakzine-

komponenten in Mischung bei Gruppe 4 (W) und 6 (W) war das unerwartet, könnten aber auch

auf die starke Streuung der individuellen Titer zurückzuführen sein. Dies trifft besonders auf

die Antikörpertiter gegen rPA83 zu, da diese in den Wiederholungen tendenziell erhöht waren

und somit von der Konzentrationserhöhung und/oder Applikation als Mischung profitiert haben

könnten. Die anti-FIS IgG-Titer schienen sich in beiden Versuchsdurchführungen ähnlich zu

verhalten. Da die Konzentration von FIS in beiden Ansätzen mit 108 Sporen unverändert blieb,

ist davon auszugehen, dass eine kombinierte Applikation keinen Einfluss auf die immunogene

Wirkung hatte. Einzig die anti-rBclA IgG-Titer schienen in der Wiederholung vermindert zu

sein, bewegten sich aber generell bei allen Gruppen in einem niedrigen Bereich.

Obwohl es keinen signifikanten Unterschied der Antikörpertiter zwischen den Gruppen 4

und 6 und deren Wiederholungen gab, zeigten die Wiederholungen tendenziell bessere Antikör-

pertiter und höhere Schutzraten. Daher werden im Weiteren nur Gruppe 4 (W) und 6 (W) in der

serologischen Gegenüberstellung mit den Lebendvakzine berücksichtigt.

127


4.3.10 Interner Vergleich der Titerdaten der Ziegenversuche

In den vorhergehenden Unterkapiteln wurden bereits die mit der SSLV immunisierten Gruppen

und die NLV-Gruppen untereinander kurz zusammengefasst dargestellt und verglichen.

Abschließend sollen die serologischen Daten beider Versuchszweige miteinander verglichen

werden. Da sich die Gruppen untereinander stark in der Anzahl der Impfungen, Probennahmen

und dem Zeitpunkt der Infektion unterscheiden (siehe Tabelle 53 und 54 Anhang), ist ein direk-

ter Vergleich schwierig. Serologisch gesehen, wurden die Gruppen teils gewollt, teils bedingt

durch den Versuchsaufbau nicht im selben Zeitrahmen infiziert. Daher wurden für die verein-

fachte Darstellung (Abbildung 51) die normalisierten Titerwerte der Zeitpunkte direkt nach dem

Abschluss des jeweiligen Impfplans ausgewählt. Dies entspricht den Messwerten von Woche 62

für Gruppe 1 und Woche 4 für 3a, Woche 6 für Gruppe 2, Woche 11 für Gruppe 4 (W) und

6 (W), Woche 17 (nach dem Proteinboost) für Gruppe 5, sowie Woche 62 für Gruppe 3 b.

In der Abbildung wird zunächst nochmal der Unterschied zwischen Gruppe 2 und 3a nach der

Immunisierung mit der SSLV deutlich. Für den betrachteten Zeitpunkt sollten beide Gruppen

128

Abbildung 51: Gesamtübersicht IgG- und TNA-Titer (Ziege)

Logarithmische Darstellung der IgG-Titer und TNA-Titer der Seren aller Ziegengruppen direkt nach der Beendigung desjeweiligen Impfplans; Die Standardabweichung ist über den Balken als positiver Wert angegeben (bei Messwerten ausvereinigten Mischproben entsprechend nicht); Werten unterhalb der Nachweisgrenze wurde für eine bessere Darstellung einWert von 10 zugewiesen; BclAD1D3 bezieht sich auf den Vektor mit flankierenden Signalsequenzen von TPA und LAMP1;Die graue Trennlinie auf Höhe von 100 soll zur ungefähren Abschätzung des möglichen unspezifischen Hintergrunds derELISA-Titer dienen


äquivalente Titer zeigen, da sie beide 4 bzw. 6 Wochen zuvor einmalig mit der SSLV immuni-

siert wurden. Der Zeitunterschied der Messungen in Form von 2 Wochen spielte dabei keine

Rolle, da auch die Werte von Gruppe 3a nach 8 Wochen deutlich über denen von Gruppe 2

lagen (p ≤ 0,022). Als funktionell schlechteste der SSLV-immunisierten Gruppen war Gruppe 2

damit serologisch nicht von Gruppe 4 (W) und 6 (W) zu unterscheiden (p ≥ 0,16) für rPA83,

TNA und vegetatives Antigen). Das galt ebenso in Tendenz für die anti-FIS IgG-Titer im Bezug

zu Gruppe 6 (W), die generell eine sehr hohe Ähnlichkeit im Titerspektrum mit Gruppe 2 auf-

wies.

Diese Ähnlichkeit war auch mit Gruppe 3a und 3b vorhanden, allerdings zeigten beide signi-

fikant höhere (p ≤ 0,001) anti-rPA83, TNA- und anti-vegetative IgG-Titer als Gruppe 6 (W).

Die deutlichsten Unterschiede bestanden dabei für die TNA-Titer und anti-vegetativen IgG-

Titer, die bei den NLV nur knapp oberhalb der Nachweisgrenze messbar waren. Die Antikörper-

spektren für FIS und rPA83 waren jedoch sehr ähnlich zwischen den SSLV und Gruppe 6 (W).

Beim direkten Vergleich der ersten und zweiten SSLV Immunisierung von Gruppe 3 wird

deutlich, dass die anti-rPA83 IgG-Titer in beiden Gruppen relativ gleich ausfallen, während die

TNA-Titer und die Titer gegen das vegetative Antigen und FIS durch die zweite Immunisierung

merklich gestiegen sind. Interessant ist diesbezüglich auch, dass das in Gruppe 6 (W) zugesetz-

te FIS offenbar ähnlich hohe Titer erzeugen kann wie die lebensfähigen Sporen der SSLV. Zu-

dem scheint die Wirkungen der FIS mehrheitlich nicht auf den Anteil an BclA zurückzuführen

zu sein, da eine äquivalente Reaktion gegen BclA ausblieb. Dies ist besonders bei den Grup-

pen 4, 4 (W) und 5 erkennbar, denen nur BclA verabreicht wurde und deren anti-FIS und -rBclA

IgG-Titer eine ähnliche Höhe haben. Im Bezug auf BclA gab es auch einen merklichen Unter-

schied zwischen den SSLV- und NLV-immunisierten Gruppen.

4.3.11 Todesdatenübersicht der Ziegenversuche

Alle Versuchstiere wurden nach dem Tod bzw. der Euthanasie via Blutausstrich auf die Anwe-

senheit von B. anthracis überprüft. Für keines der überlebenden Tiere waren Erreger im Blut

nachweisbar, sodass davon ausgegangen werden kann, dass diese Tiere die Infektion klären

konnten. Bei allen verstorbenen Tieren war der Erreger nachweisbar. Für die Betrachtung des

Ausgangs der Infektion wurden die Sterbedaten im log-rank-Test miteinander verglichen, wobei

als ausschlaggebende Intervalle volle überlebte Tage galten. Die Überlebenszeit ergab sich aus

dem Zeitintervall vom Beginn der Infektion bis zu dem Zeitpunkt an dem der Tod des Tieres

festgestellt wurde bzw. es euthanasiert oder behandelt wurde. Da in den Versuchswiederholun-

gen der Gruppen 4 (W) und 6 (W) ein anderer Infektionsstamm als für die restlichen Gruppen

angewendet wurde, beziehen sich die angegebenen Vergleiche zur Negativkontrolle auf die

129


Gruppe NK (W). Alle anderen Gruppen wurden gegen die Negativgruppen LK, NK und 1 auf

Signifikanz geprüft, welche als Kontrollgruppen für die Versuche in Südafrika mitgeführt wur-

den.

In Abbildung 52 sind zunächst Gruppe 4 und 6 gegen die Wiederholungsversuche, inklusive

sämtlicher Kontrollgruppen aufgetragen. Visuell und auch statistisch belegt waren alle vier

Kontrollgruppen (Gruppe 1, NK, LK und NK (W)) nicht voneinander verschieden (p ≥ 0,317),

obgleich sie jeweils mit einer unterschiedlichen Dosis (36, 172 und 844 Sporen) oder einem an-

deren Isolat infiziert worden waren. Da in Gruppe 4 keines der 5 Tiere überlebte, lag hier die-

selbe Schutzrate vor, wie in den Kontrollgruppen. Ähnlich verhielt es sich für Gruppe 6 bei der

1 von 5 Tieren die Infektion überlebte, allerdings war die Schutzrate aufgrund der teilweise ver-

längerten Überlebenszeit nur im Vergleich zu Gruppe NK nicht signifikant verschieden.Vergli-

chen zur Gruppe 1 und LK war für Gruppe 6 die Schutzwirkung signifikant (p ≤ 0,039). In den

Wiederholungsversuchen mit dreifach höherer Dosis von rPA83 und rBclA und einer verbesser-

ten Applikation, waren die Schutzraten von Gruppe 4 (W) (50 %) und von Gruppe 6 (W)

(80 %) signifikant. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war aber aufgrund der verlänger-

ten Überlebenszeit einiger Tiere aus Gruppe 4 (W) nicht signifikant. Der direkte Vergleich bei-

130

Abbildung 52: Überlebensdaten Ziegengruppen (Vergleich der Wiederholungen)

Prozentuale Auftragung der Überlebenden über die Zeit in dpi bei einer Infektionsdosis von 36 Sporen für Gruppe 1; 172Sporen für Gruppe NK, 844 für Gruppe LK, Gruppe 4 und 6 und 918 bzw. 1027 Sporen für die Wiederholungsversuche;Angegebene farblich angepasste p-Werte beziehen sich auf die jeweilige farblich passende Gruppe im Vergleich zu denjeweiligen Kontrollgruppen; p-Werte in schwarz sind Vergleich zwischen den entsprechend gekennzeichneten Gruppen


der Vakzinegruppen mit ihren Wiederholungsversuchen ergab eine deutliche signifikante Erhö-

hung der Schutzraten (p ≤ 0,023). Es ist davon auszugehen, dass die Erhöhung der Dosis

oder/und die verbesserte Applikation für die deutlich höheren Schutzraten verantwortlich ist. In

den nachfolgenden Vergleichen zu den SSLV-immunisierten Gruppen wurden nur die Wieder-

holungsversuche betrachtet.

In Abbildung 53 sind die Sterbedaten der NLV gegen die SSLV-immunisierten Ziegengruppen

aufgetragen. Innerhalb der mit der SSLV immunisierten Gruppen 2, 3a und 3b gab es keinen

signifikanten Unterschied im Überleben (p ≥ 0,246), was auch an der verringerten Tierzahl auf-

grund der Infektionen mit Ehrlichia ruminantium (Herzwasserkrankheit) für Gruppe 3 a und b

gelegen haben könnte. Es überlebten 3 von 5 Tieren in Gruppe 2, vier von fünf in Gruppe 3a

und drei von drei in Gruppe 3b. Die Vakzinegruppen 4 (W) und 6 (W) waren im Vergleich zu

allen SSLV-immunisierten Gruppen äquivalent geschützt (p ≥ 0,165).

131

Abbildung 53: Gesamtübersicht der Überlebensdaten der Ziegengruppen

Prozentuale Auftragung der Überlebenden über die Zeit in dpi bei einer Infektionsdosis von 36 Sporen für Gruppe 1; 172Sporen für Gruppe NK, 844 für Gruppe LK, 850 Sporen für die SSLV-immunisierten Gruppen (2 und 3a/b) und 918 bzw.1027 Sporen für die Wiederholungsversuche; Angegebene farblich angepasste p-Werte beziehen sich auf die jeweiligefarblich passende Gruppe im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollgruppen;


4.3.12 Diagnoseprozeduren

Feldversuche dieser Art in Großtieren, außerhalb einer umfassend kontrollierbaren Umwelt,

sind selten bzw. in neueren Studien kaum vorhanden. Daher sind die diagnostisch erhobenen

Daten bezüglich der Temperatur, dem Verhalten und der detektierbaren Bakterienlast aller

untersuchten Gruppen sowie deren Implikationen für zukünftige Versuche im Folgenden darge-

legt. Eine entsprechende Übersicht der Rohdaten findet sich im Anhang (Tabellen 56 und 57).

Bereits während der Versuchsdurchführung in Südafrika wurden initial festgelegte Handlungs-

kaskaden anhand der gemachten Erfahrungen minimal abgeändert, um eine bessere Praktikabi-

lität und Prognose vor Ort zu gewährleisten. Bei der Wiederholung der NLV mit Proteinkompo-

nenten kamen diese Verbesserungen ebenfalls zum Einsatz. Dazu zählte die Erhöhung der Fre-

quenz der Beobachtungsintervalle, der Fütterungen und der Temperaturmessung sowie die bes-

sere Durchführbarkeit der Blutentnahme zu diagnostischen Zwecken mittels Insulinspritzen.

Zur Beurteilung des Verlaufes der Infektion und zur Prävention von unnötigem Leid wurden

die Tiere regelmäßig auf abnormale Temperatur und auffälliges Verhalten überprüft. Die Tem-

peratur wurde rektal gemessen, wobei die Normalwerte zwischen 38,5 °C und 40,5 °C ange-

nommen wurden. Bei auffälligem Verhalten und ab einer Temperatur von 40,0 °C musste, wenn

möglich, eine Blutentnahme zum Bakteriennachweis über einen Blutausstrich erfolgen. Bei

einem positiven Befund war das entsprechende Tier mit Penicillin/Streptomycin zu behandeln

oder entsprechend des Gesundheitszustands mit Pentobarbital zu euthanasieren. Bei einem

negativen Befund war das Tier genauer zu beobachten und in regelmäßigen Abständen erneut

Temperatur und Blut zu überprüfen. Für die Beurteilung des Verhaltens galt lebhaftes, aufmerk-

sames und neugieriges Verhalten als normal. Die Fressgewohnheiten und Interaktionen mit den

Pflegern und Artgenossen sowie die Körperhaltung und der Zustand des Fells waren weitere

Kriterien.

4.3.12.1 Temperatur

Bereits zu Beginn des Infektionsversuchs in Südafrika, im Zuge der Eingangsuntersuchung im

Anschluss an den Transport, war die enorme Schwankungsbreite der individuellen Temperatu-

ren mit 37,6 – 40,2 °C (Kapitel 4.3.1) auffällig. Dies trat auch direkt vor und während der

Infektion auf und war vermutlich auch auf den mit dem Transport und der Infektion verbunde-

nen Stress zurückzuführen, zumal sich die Temperaturen am Folgetag der Infektion mit

36,5 – 39,3 °C bei deutlich niedrigeren Temperaturen einpegelten. Außerdem waren die Tiere

durch die Haltung in einem Außengehege mit Überdachung den Temperaturschwankungen

(15 – 35 °C) der Umgebung permanent ausgesetzt. Wichtig hierbei ist, dass die Temperatur nie

bei allen Tieren gleich stark schwankte, sodass theoretisch auch individuelle Faktoren wie Alter,

132


Gewicht, Geschlecht, Brunst, persistierende Infektionen oder die Stellung in der Gruppe eine

Rolle spielen könnten. Die Versuchswiederholungen in der Türkei beinhalteten keinen Trans-

port zwischen Immunisierung und Infektion und fanden im Zeitraum der Infektion ausschließ-

lich innerhalb eines abgeschlossenen Gebäudes mit konstanter Außentemperatur (20 – 22 °C)

statt. Daher waren die individuellen Temperaturschwankungen vor (38,1 – 40,1 °C) und inner-

halb der Infektionszeit geringer, sodass eine bessere Einschätzung des Gesundheitszustands

über die Temperatur möglich war. Trotzdem waren auch hier bereits vor der Infektion, wie auch

bei den Versuchen in Südafrika, 2 Tiere mit Temperaturen über 40 °C vorhanden. Da diese

Temperaturerhöhung nicht auf die Infektion zurückzuführen sein konnten und diese sich in den

meisten Fällen nach der Infektion wieder verringerten, wurden erhöhte Temperaturen bis 3 hpi

nicht in den Betrachtungen berücksichtigt.

Die Festlegung der Temperaturschwelle von 40,0 °C als Indikator für weitere diagnostische

Maßnahmen stellt eine artifizielle Grenze dar, deren Sinnhaftigkeit im Zuge der erzielten

Ergebnisse erörtert werden sollte. Aufgrund der Gruppenstärke und den äußeren Gegebenheiten

in Südafrika wurde die Temperatur der Ziegen nur einmal täglich morgens nach der Reinigung

des Geheges und vor der Fütterung durchgeführt. Weitere Messungen wurden individuell ent-

sprechend des Zustandes der Tiere durchgeführt. Daher sind die Zusammenhänge zwischen

erhöhter Temperatur (>40,0 °C) und dem Infektionsstatus der Tiere mit einer Ungenauigkeit

(ca. 24 h) behaftet. Die Wiederholungsversuche in der Türkei erlaubten eine reguläre Messung

der Temperatur aller Tiere zweimal täglich, sodass die Veränderungen der Temperatur über die

Zeit dort besser dokumentiert sind. Die Ergebnisse der Versuche in Südafrika und der Türkei

werden daher zunächst getrennt

analysiert.

Von den in Südafrika insgesamt

29 infizierten Tieren überlebten 11

den Versuch. In Abbildung 54 sind

die Temperaturspektren jedes Tiers

für den Infektionszeitraum, mit

maximal und minimal gemessener

sowie durchschnittlicher Tempe-

ratur, aufgeführt. Es ist zu sehen,

dass drei der 11 überlebenden Tie-

re dabei zu mindestens einem

Messzeitpunkt eine erhöhte Tem-

peratur aufwiesen. Von den 18 ver-

storbenen Tieren zeigten 13 eine

133

Abbildung 54: Temperaturspektrum Ziegenversuch (Südafrika)

Gemessene Temperaturen der einzelnen Versuchstiere für den Zeitraum von 3 hpi biszum Tod bzw. Ende des Versuchs; Angegeben sind jeweils dieDurchschnittstemperatur (Symbol) und die maximal bzw. minimal gemesseneTemperatur jedes infizierten Versuchstiers; Die Gruppenzugehörigkeit ist durchentsprechende Kürzel gekennzeichnet (L – Lipopeptidkontrolle;N – Negativkontrolle). Die Gruppen sind in Überlebende und Verstorbene unterteiltund anhand aufsteigender Maximaltemperatur sortiert.


erhöhte Temperatur, welche teilweise auch bis zum Tod erhalten blieb. Die niedrigsten gemes-

senen Temperaturen bei überlebenden und verstorbenen Ziegen unterschieden sich mit 36,2 °C

und 36,3 °C kaum. Die höchste gemessene Temperatur bei den überlebenden Ziegen betrug

40,5 °C, während bei den Verstorbenen Temperaturen bis 41,6 °C messbar waren. Somit

verstarben alle Tiere, die eine Temperatur von mindestens 40,6 °C aufwiesen im weiteren Ver-

lauf an der Infektion.

Von den in der Türkei infizierten 22 Tieren überlebten 12 den Versuch. Die gemessenen

Temperaturen dieser Tiere sind analog zu den Versuchen in Südafrika in Abbildung 55 darge-

stellt. Die Hälfte der Überlebenden und acht der 10 verstorbenen Tiere hatte dabei zu mindes-

tens einem Zeitpunkt vor dem Tod

eine erhöhte Temperatur. Die nied-

rigsten gemessenen Temperaturen

waren mit 37,6 °C bei den Überle-

benden und 38,0 °C bei den Ver-

storbenen kaum unterschiedlich,

lagen aber bedeutend höher als die

Messungen in Südafrika. Auch die

maximal gemessene Höchsttempe-

raturen war mit 41,6 °C bei Ver-

storbenen und Überlebenden

gleich, wohingegen es bei den Ver-

suchen in Südafrika einen Unter-

schied gegeben hatte. Da bei den

Versuchen in Südafrika aber nur

drei überlebende Tiere überhaupt

eine Temperaturerhöhung zeigten, ist davon auszugehen, dass der dort notierte Unterschied zu-

fällig war und die umfangreicheren Daten der Nachfolgeversuche ein realistischeres Bild erge-

ben. Die deutlich höher ausfallenden Minimaltemperaturen der Versuchstiere in der Türkei sind

vermutlich ein weiterer Indikator für die geringeren Schwankungsbreiten der Temperatur der

einzelnen Tiere durch die haltungsbedingten, konstanteren Umgebungstemperaturen.

Betrachtet man die Versuche in Südafrika und der Türkei zusammengenommen, fällt auf,

dass vor allem naive Tiere, die paramunisiert wurden oder keine Impfung erhalten hatten, mehr-

heitlich ohne messbares Fieber verstarben. Dies betraf insgesamt sechs der 10 naiven Tiere. Die

restlichen 4 Tiere wiesen zumindest kurzzeitig (1 – 7 h) Temperaturen von 40 °C und höher auf.

Da die regulären Temperaturmessintervalle 12 – 24 h betrugen, könnte es möglich sein, dass

auch die unauffälligen Tiere kurzzeitig Fieber aufwiesen, dies aber nicht detektiert wurde.

134

Abbildung 55: Temperaturspektrum Ziegenversuch (Türkei)

Gemessene Temperaturen der einzelnen Versuchstiere für den Zeitraum von 3 hpi biszum Tod bzw. Ende des Versuchs; Angegeben sind jeweils dieDurchschnittstemperatur (Symbol) und die maximal bzw. minimal gemesseneTemperatur jedes infizierten Versuchstiers; Die Gruppenzugehörigkeit ist durchentsprechende Kürzel gekennzeichnet (N – Negativkontrolle (W); 4 – Gruppe 4 (W);6 – Gruppe 6 (W)). Rot markiert sind die Tiere, die nach dem Nachweis von Bakterienim Blut behandelt wurden. Die nach der Behandlung gemessenen Temperaturenwurden nicht berücksichtigt. Die Gruppen sind in Überlebende und Verstorbeneunterteilt und anhand aufsteigender Maximaltemperatur sortiert.


Darüber hinaus schienen nicht nur versterbende Tiere zeitweilig ein Fieber aufzuweisen, da

auch neun der überlebenden Tiere eine erhöhte Temperatur aufwiesen, die nicht von der der

später versterbenden zu unterscheiden waren. Damit gab es keine eindeutige Temperaturschwel-

le. Betrachtet man allerdings die Veränderung des Anteils an versterbenden Tieren mit Erhö-

hung der maximal gemessenen Temperatur (Abbildung 56), lässt sich ein optimaler Schwellen-

wert besser abschätzen.

Insgesamt beinhalteten die Versuche 51 Tiere, von denen 28 durch die Infektion verstarben,

was einen Anteil von 55 % ausmacht. Mit steigender maximal gemessener Temperatur erhöht

sich der Anteil versterbender Tiere an der Gesamtzahl an Tieren die ebenfalls mindestens eine

solche Temperatur aufwiesen. Die entsprechende Kurve (Abbildung 56, dunkelblaue Kurve)

stellt somit den prozentualen Anteil richtiger Vorhersagen für den Tod eines Tieres auf Grund-

lage einer bestimmten Temperaturschwelle dar. Die niedrigste gemessenen Höchsttemperatur

aller involvierten Tiere betrug 38,7 °C. Würde man diese Temperatur als Schwellenwert ver-

wenden, wären 100 % der später versterbenden Tiere erfasst (Abbildung 56, blaue Kurve), der

Anteil an richtig diagnostizierten Tieren läge aber nur bei 55 % und würde alle 51 Tiere mit ein-

beziehen. Damit hätte ein Schwellenwert bei dieser Temperatur keine Funktionalität als prakti-

kable Diagnosehilfe. Eine Verbesserung ergibt sich, wenn der Schwellenwert so gewählt wird,

dass möglichst viele richtige Vorhersagen getroffen werden, bei möglichst geringer Zahl an

falsch Negativen.

Wie in Abbildung 56 zu sehen ist, sinkt der Anteil versterbender Tiere an deren Gesamtzahl

bereits zwischen 38,9 und 39,8 °C auf 75 % ab. Für einen diagnostischen Schwellenwert sind

die Temperaturen zwischen 37,4 – 39,6 °C aber ungeeignet, weil sie der natürlichen Schwan-

kungsbreite nicht infizierter Tiere entsprechen (Tabelle 55, Anhang). Daher kommt erst ein

Schwellenwert ab 39,6 °C in Frage. Für die Höchsttemperaturen zwischen 39,8 und 40,4 °C

bleibt der Anteil verstorbener Tiere an deren Gesamtzahl konstant (hellblaue Kurve), während

der Anteil richtiger Vorhersagen weiter zunimmt (dunkelblaue Kurve). Das bedeutet, dass in

diesem Bereich nur falsch positive Tiere aus dem Anteil ausgeschlossen werden und somit die

Temperatur von 40,4 °C einen optimalen Schwellenwert darstellt, der eine korrekte Vorhersage

für 75 % der verstorbenen Tiere ermöglicht. Dies unterstützend zeigt der weitere Verlauf der

Kurven, dass die Anzahl Verstorbener an der Gesamtzahl Verstorbener, die diese Temperatur

mindestens aufwiesen, ab 40,4 °C rapide abnimmt und gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit für

eine richtige Aussage nur langsam weiter ansteigt (dunkelblau). Die Fieberdauer im Tempera-

turbereich zwischen 40,0 und 40,8 °C ist zudem mit <7 h sehr kurz (Abbildung 56, Balken),

was die Detektionsfähigkeit einschränkt. Ebenso ist das Auftreten eines kurzen Fiebers bei

einem später versterbenden Tier erstmals bei 40,4 °C vermerkt, während bei niedrigeren Maxi-

135


maltemperaturen nur falsch positive Tiere Fieber zeigten. Länger andauerndes Fieber über teils

mehrere Tage ist sowohl bei Überlebenden, als auch bei Verstorbenen erst ab einem Tempera-

turbereich von 40,8 – 41,6 °C aufgetreten. Für eine Verwendung der Temperatur als diagnosti-

sches Mittel sollte daher weiterhin eine Temperatur von 40,0 °C und höher als Indikator für Fie-

ber angenommen werden. Weiterführende diagnostische Mittel, wie eine Blutentnahme zur

Detektion von Bakterien, sollten aber erst ab einer Temperatur von 40,4 °C vorgenommen wer-

den. Frequentere Kontrollen auf Temperatur und Verhalten wären aber weiterhin ab 40,0 °C

angeraten.

Da 90 % der Tiere (32,1 % der Gesamtzahl Verstorbener) mit einer Höchsttemperatur von

≥ 41,4 °C im weiteren Verlauf verstarben, könnte diese Temperatur als zusätzlicher Schwellen-

wert dienen. Zur Vermeidung von Leid könnten Tiere mit dieser Temperatur auch ohne den

Nachweis von Bakterien im Blut als verstorben gewertet und entsprechend frühzeitig behandelt

oder euthanasiert werden. Außerhalb eines Infektionsversuchs wäre eine Behandlung von Ver-

dachtsfällen auf Grundlage der rektal gemessenen Temperatur ab 40,4 °C angeraten. Allerdings

ist zu beachten, dass naive Tiere tendenziell ohne detektierbares Fieber verstarben bzw. nur

kurz vor dem Tod ein Fieber zeigten und die hier betrachteten Tiere zum Teil eine partielle

Immunität aufwiesen.

136

Abbildung 56: Temperaturverhältnisse

Die Kurvenverläufe (y-Achse links) geben den prozentualen Anteil verstorbener Ziegen an der Gesamtzahl an Ziegen(schwarz) bzw. der Gesamtzahl an verstorbenen Ziegen (blau) an, die eine Höchsttemperatur von mindestens der an der x-Achse angegebenen Temperatur entsprach. Es wurden alle 51 Tiere der Infektionsversuche in Südafrika und der Türkeiberücksichtigt. Das integrierte Balkendiagramm (y-Achse rechts) stellt die Dauer des Fiebers (≥ 40,0 °C) von Tieren mit derangegeben Höchsttemperatur dar (Anzahl der Tiere farblich gekennzeichnet über den entsprechenden Balken), unterteilt inÜberlebende (grün) und Verstorbene (rot). Für eine verbesserte Darstellung wurde eine Maximaldauer von 48 h alsObergrenze festgesetzt, sodass alle Balken auf dieser Höhe einer Fieberdauer von ≥ 48 h entsprechen.


4.3.12.2 Zusammenhänge von Fieber, Antikörpertitern und Schutz

Die Entwicklung einer Vorhersage der Schutzrate auf Grundlage

der immunologischen Daten ohne die Notwendigkeit eines Infekti-

onsversuchs ist häufiger Bestandteil der Vakzineentwicklung.

Daher werden im Folgenden die Zusammenhänge zwischen der

beobachteten Schutzrate, den gemessenen anti-rPA83 IgG-Titern

und der Entwicklung von Fieber nach der Infektion näher betrach-

tet. In Tabelle 50 sind alle 51 Tiere der Ziegenversuche aus Süd-

afrika und der Türkei in aufsteigender Reihenfolge ihrer normali-

sierten anti-rPA83 IgG-Titer aufgeführt. Überlebende sind dabei

grün hinterlegt und Verstorbene orange. Die Fieberdauer ist eben-

falls vermerkt. Dabei war der zeitliche Abstand zwischen dem ers-

ten und letzten Auftreten einer kontinuierlich erhöhten Temperatur

ausschlaggebend. Daher stellt der angegebene Zeitraum eine Mini-

malangabe dar, wobei nochmals anzumerken ist, dass die reguläre

Frequenz der Temperaturmessung unauffälliger Tiere bei 12 – 24 h

lag, sodass die tatsächliche Fieberdauer entsprechend länger sein

konnte. Für einige Tiere war eine erhöhte Temperatur an nur

einem Messzeitpunkt feststellbar, diese sind in der Tabelle mit

einer artifiziellen Fieberdauer von 1 h angegeben. Aufgrund der

beschriebenen Ungenauigkeit der Temperaturerfassung, bedingt

durch die Messintervalle, besteht daher generell die Möglichkeit,

dass auch Tiere ohne ein detektierbares Fieber ebenfalls eine kurz-

zeitige Temperaturerhöhung aufwiesen.

Anhand der sortierten Daten in Tabelle 50 ist ersichtlich, dass

alle Tiere bis zu einem anti-rPA83 IgG-Titer von 542 vor der

Infektion mit teils nur kurzzeitig gemessenem Fieber (< 10 h) aus-

nahmslos verstorben sind. Dies betraf insgesamt 46,5 % aller ver-

storbenen Tiere. Ab dem genannten Antikörpertiter zeigten zudem

alle später verstorbenen Tiere an mindestens einem Messzeitpunkt

ein detektierbares Fieber. Generell wiesen Tiere mit anti-rPA83

IgG-Titern unter 972 oder 2617, wenn nur die Überlebenden

betrachtet werden, kein oder nur kurzzeitig ein Fieber (< 10 h)

auf. Bei Titerwerten zwischen 781 und 3006 war keine eindeutige

Tendenz zu erkennen, da sowohl 26 % der Überlebenden als auch

43 % der Verstorbenen Antikörpertiter in dieser Höhe aufwiesen.

137

Tabelle 50: Zusammenhänge vonFieber, Antikörpertitern und Schutz(Ziegen)

Auftragung aller 51 infizierten Tiere inaufsteigender Reihenfolge ihrer anti-rPA83 IgG-Titer; Tieren bei denen nureine einzige Messung eine Temperaturvon ≥ 40,0 °C ergab wurde eineFieberdauer von (1) h zugeschrieben;

Gruppe Ziegen anti-rPA83 Fieber

Nr. [h]

G1 8185 <100 7

G6 8201 <100 9

LK 8202 <100

LK 8203 <100 3

NK II <100

NK VI <100

NK (W) 96163 <100 6

NK (W) 97014 <100

NK (W) 97015 <100

NK (W) kk <100 7

G2 8213 164

G1 8187 238

G4 8192 542 (1)

G6 (W) 96139 781 9

G3a 8178 792 (1)

G4 8188 814 (1)

G6 8200 915

G4 (W) 627399 972

G2 8211 1059 72

G6 8194 1100 (1)

G4 8198 1315 (1)

G6 (W) 627396 1494 32

G2 8212 1853 (1)

G3a 8180 2143 95

G4 (W) 580319 2310 8

G4 8190 2543 9

G6 (W) 96157 2617

G4 (W) 97013 2628 39

G6 8191 2686 26

G4 (W) 2787 48

G4 (W) 3006 15

G6 (W) 97162 3481 41

G2 8214 3637

G4 8199 3871 (1)

G3a 8172 3892

G6 (W) 729277 4273 120

G3a 8173 4720 (1)

G6 (W) 728758 4996

G4 (W) Gk 5022

G6 8195 5386 35

G6 (W) 729278 5399

G6 (W) 729284 5920 48

G2 8210 8564

G4 (W) 728761 11190 24

G3a 8176 14847

G6 (W) 627395 17476 71

G6 (W) 580316 19442

G4 (W) 580315 23173 (1)

G3b 8182 31321

G3b 8175 37995

G3b 8181 38671

IgG-Titerb

99348a

627398a

a wurde behandelt und überlebteb direkt vor der Infektion


Ab einem Antikörpertiter von 3481 überlebte die Mehrheit (85 %) der Tiere die Infektion,

wobei 74 % aller Überlebenden und 11 % der Verstorbenen mindestens diesen Titer aufwiesen.

Auffällig ist hierbei, dass die beiden antibiotisch behandelten Tiere bezüglich ihrer Antikörper-

titer direkt an diesem Schwellenwert angrenzen, was eventuell den Erfolg der Behandlung

bedingt hat. Einen merklichen Unterschied zwischen Verstorbenen und Überlebenden bezüglich

der Fieberdauer gab es nicht, da unabhängig vom Ausgang der Infektion kurzzeitiges Fieber bis

teils tagelang anhaltende Fieberperioden möglich waren.

Ähnliche Zusammenhänge zwischen den gemessenen anti-rPA83 IgG-Titern und dem beob-

achteten Schutz ergaben sich für die analoge Gegenüberstellung aller Einzeltiter der Mausgrup-

pen (siehe Anhang, Tabelle 58), die mit ~1000 Sporen infiziert wurden. Alle Tiere mit einem

Antikörpertiter von ~800 und niedriger verstarben ausnahmslos, was insgesamt 33 % der Ver-

storbenen Tiere betraf. Ab einem Antikörpertiter von ~30000 überlebten 75 % aller Tiere, wobei

69 % aller Überlebenden und 25 % aller Verstorbenen mindestens diesen Titer aufwiesen. Der

dazwischenliegende Wertebereich beinhaltete (nahezu identisch zu den Ergebnissen aus den

Ziegenversuchen) 42 % der Verstorbenen und 26 % der Überlebenden. Die Gegenüberstellung

der Mausgruppen, deren Infektionsdosis ~2000 Sporen betrug, zeigte keine entsprechenden

Schwellenwerte.

In den Korrelationsberechnungen innerhalb der einzelnen Gruppen waren, bis auf zwei

Ausnahmen, keine signifikanten Korrelationen zwischen Antikörpertitern und der überlebten

Zeit nachweisbar. Aufgrund der sichtbaren Schwellenwerte unter Berücksichtigung aller Indivi-

duen wurden gruppenübergreifende Korrelationsberechnungen durchgeführt. Einbezogen wur-

den alle Messwerte, für die Einzelmessungen gegen das jeweilige Antigen vorhanden waren,

unterteilt in Ziegen- und Mausversuche, sowie im Falle der Mausversuche nach unterschiedli-

chen Infektionsdosen (~1000 und ~2000 Sporen).

Korrespondierend zu den zuvor beschriebenen Schwellenwerten in Ziegen ergab sich eine

signifikante Korrelation der anti-rPA83 IgG-Titer zur überlebten Zeit (rs = +0,606). Ähnlich

verhielt es sich für FIS (rs = +0,562) und das vegetative Antigen (rs = +0,528). Für die TNA-

und anti-rBclA IgG-Titer waren keine signifikanten Korrelationen messbar (rs ≤ +0,192). Damit

schienen in Ziegen bei einer Infektionsdosis von ~1000 Sporen vor allem die Antikörpertiter

gegen die Spore (exklusive BclA), den vegetativen Zellkörper und PA für das Überleben von

Bedeutung zu sein, wobei nur für rPA83 eindeutige Schwellenwerte sichtbar waren.

Die Vergleiche der Mausversuche beschränkten sich, aufgrund der vorhandenen Daten, auf

rLF, rBclA, rPA83, TNA und die Kapsel. Bei einer Infektionsdosis von ~1000 Sporen korrelier-

ten die anti rPA83 IgG-Titer ebenfalls signifikant mit der überlebten Zeit (rs = +0,507). Eine

weitaus schwächere signifikante Korrelation ergab sich für die anti-rLF IgG- und TNA-Titer

(rs ≤ +0,334). Für rBclA und die Kapsel waren keine signifikanten Korrelationen sichtbar

138


(rs ≤ ±0,188). Die Vergleiche innerhalb der Mausgruppen die mit ~2000 Sporen infiziert wur-

den, ergaben für die anti-rBclA IgG- und anti-Kapsel IgG-Titer (rs ≤ ±0,213), sowie TNA-Titer

(rs = +0,313) ähnliche Werte, wohingegen die anti-rPA83 IgG-Titer mit rs = -0,406 zwar signi-

fikant, aber entgegengesetzt zur überlebten Zeit korrelierten. Daher scheint auch in Auszucht-

Mäusen ein Überleben mit den anti-rPA83 IgG-Titern in Zusammenhang zu stehen, wobei

deren Relevanz für das Überleben abhängig von der Infektionsdosis variiert.

In Tabelle 51 sind die Titerdaten für rPA83 von

vor und nach der Infektion für alle Überlebenden,

inklusive der behandelten Ziegen dargestellt. Bei

der Betrachtung der Daten war aufgefallen, dass

größtenteils nur diejenigen Tiere die ein nachweis-

bares Fieber hatten, eine deutliche Erhöhung der

anti-rPA83 IgG-Titer nach der Infektion aufwiesen.

Diese Tiere sind entsprechend gelb hinterlegt. Tie-

re, deren anti-rPA83 IgG-Titer nach der Infektion

den Titern vor der Infektion entsprachen oder sogar

sanken, hatten hingegen kein nachweisbares Fieber

(blau). Dies galt ohne Ausnahme. Die Sortierung

der Daten in aufsteigender Höhe der anti-rPA83

IgG-Titer nach der Infektion (Tabelle 51) zeigt

deutlich die Abhängigkeit der Titer nach der Infek-

tion zu einer Entwicklung von Fieber. Dabei sind

die vermeintlichen 3 Ausnahmen (weiß) im Über-

gangsbereich angesiedelt, sodass bei diesen entwe-

der eine Titererhöhung ohne Fieber stattgefunden

haben muss oder die Detektion des Fiebers bei die-

sen Tieren durch die geringe Dauer des Fiebers

nicht funktioniert hat. Dafür spricht auch, mit Aus-

nahme von Ziege Nr. 729277, die eine Fieberdauer

von 120 h aufwies, die geringe Fieberdauer im Titerbereich nach der Infektion von

~34000 – ~280000. Eine Abhängigkeit der Fieberentwicklung bzw. Titererhöhung nach der

Infektion zu den Titern vor der Infektion scheint dabei nicht zu existieren, da Tiere mit ähnli-

chen Titern vor der Infektion in beiden Kategorien zu finden sind. Auch ein Zusammenhang zur

Stärke der Titererhöhung ist nicht ersichtlich.

139

Tabelle 51: Zusammenhang zwischen Antikörpertiter undder Entwicklung von Fieber

Aufgelistet sind alle 23 Überlebenden der Ziegenversucheinklusive der zwei Individuen die durch eine Behandlunggerettet werden konnten. Die Reihenfolge ergibt sich aus denaufsteigend sortierten anti-rPA83 IgG-Titern nach derInfektion; Blau hinterlegt sind alle Tiere bei denen die Titernach der Infektion ähnlich hoch wie vor der Infektion lagenoder absanken und bei denen kein Fieber gemessen werdenkonnte; Gelb hinterlegt sind alle Tiere deren Titer nach derInfektion deutlich anstieg und die ein Fieber aufwiesen;Weiß hinterlegt sind alle Tiere die ebenfalls einenTiteranstieg zeigten, aber kein Fieber aufwiesen.

Gruppe Ziegen anti-rPA83 IgG-Titer Fieberdauer

Nr. vor Infektion nach Infektion [h]

G6 8200 915 629 0

4 (W) 627399 972 762 0

6 (W) 96157 2617 1090 0

4 (W) Gk 5022 1404 0

6 (W) 728758 4996 2618 0

G3a 8172 3892 6150 0

G3b 8182 31321 12497 0

G3b 8175 37995 23689 0

G3a 8176 14847 23882 0

G3b 8181 38671 24365 0

6 (W) 580316 19442 31797 0

6 (W) 729278 5399 34742 0

G2 8214 3637 48060 0

G3a 8173 4720 86790 (1)

G2 8210 8564 89882 0

6 (W) 96139 781 94157 9

G3a 8178 792 95756 (1)

6 (W) 729277 4273 134139 120

G2 8212 1853 255200 (1)

4 (W) 580315 23173 282079 (1)

6 (W) 97162 3481 283649 41

4 (W) 728761 11190 658286 24

4 (W) 3006 800475 15

4 (W) 2787 1244507 48

6 (W) 729284 5920 1479449 48

627398a

99348a

a zählte zu den Verstorbenen, wurde aber behandelt und überlebte


4.3.12.3 Verhalten

Die Beurteilung des Verhaltens und des Zustandes der Tiere war subjektiv und damit ungenau,

da Stress und Wetterverhältnisse sowie die Variation in den Möglichkeiten zur Beobachtung die

Ergebnisse beeinflussten. Hierbei gilt es vor allem zu beachten, dass zwischen

19:00 – 06:00 Uhr unter den Bedingungen der Versuchsanlage im Krüger Nationalpark keine

ununterbrochene Beobachtung möglich war. Tiere, die in diesem Zeitraum starke Symptome

entwickelten, machten aber für gewöhnlich auf sich aufmerksam und wurden entsprechend ver-

sorgt und beobachtet. Der Versuchsaufbau in der Türkei erlaubte auch Beobachtungen zwischen

19:00 – 06:00, was bei auffälligen Tieren in Intervallen von 3 Stunden wahrgenommen wurde.

Allerdings konnten außerhalb dieser Intervalle, aufgrund der Entfernung zu den Schlafplätzen

der Helfer, kranke Tier nicht auf sich aufmerksam machen.

Tagsüber wurden die Tiere im Zuge der regelmäßigen Temperaturmessung genau überprüft

und im Tagesverlauf ununterbrochen beobachtet. Bei den Fütterungen konnten Agilität, Appetit

und Durchsetzungsvermögen beim Ringen um Futterplätze eingeschätzt werden, welche im

Gesamtbild den stärksten, früh sichtbaren Indikator für eine Veränderung des Verhaltens erga-

ben. In einigen Fällen war auch auffällig, dass die Tiere zwar Appetit hatten, jedoch das Fassen

und Kauen der Nahrung schwerzufallen schien. Deutlicher auffallende Verhaltensweisen waren

erst später erkennbar und beinhalteten das stoische Herumstehen mit gekreuzten Beinen und

gesenktem Kopf und die Abtrennung von der Gruppe. Selbst wenn es zuvor keine Anzeichen

einer Infektion gab, waren ab ca. eine Stunde vor dem Tod die Symptome und Verhaltensauf-

fälligkeiten, wie lautes Stöhnen, Gleichgewichtsstörungen, Orientierungslosigkeit und Krämp-

fe, unmissverständlich.

Aufgrund der unterschiedlichen Versuchsbedingungen werden die Versuche in Südafrika und

der Türkei zunächst getrennt beschrieben. Unter Ausschluss der Symptome, die erst kurz vor

dem Tod (<1 h) erkennbar waren, zeigten in Südafrika sieben der überlebenden 11 und 11 der

18 verstorbenen Tiere auffälliges Verhalten. In der ursprünglichen Versuchsplanung sollten

Temperatur und Verhalten Aufschluss über den Gesundheitszustand bezüglich der Infektion

geben. Es wurde davon ausgegangen, dass nicht erkrankte Tiere weder auffälliges Verhalten

noch eine erhöhte Temperatur haben. In der praktischen Durchführung zeigte sich aber, dass nur

drei der 11 überlebenden Tiere dieser Annahme entsprachen. Die restlichen überlebenden Tiere

zeigten vordergründig auffälliges Verhalten, was im Falle des zusätzlichen Auftretens von hoher

Temperatur gleichzeitig oder zuerst bemerkbar war. Für die Beurteilung kam erschwerend hin-

zu, dass auch fünf der 18 verstorbenen Tiere im Bezug auf Temperatur und Verhalten vollkom-

men unauffällig waren. Die restlichen Tiere, die der Infektion erlagen, waren mehrheitlich

sowohl verhaltensauffällig als auch fiebrig, wobei die erhöhte Temperatur erstes und/oder

hauptsächliches Merkmal war.

140


Bei der Versuchsdurchführung in der Türkei zeigten sieben der 10 verstorbenen Tiere auffäl-

liges Verhalten, was sich mehrheitlich in Appetitlosigkeit äußerte. Mit einer Ausnahme traten

Verhaltensauffälligkeiten erst nach der Detektion einer erhöhten Temperatur auf, wobei bei sie-

ben der verstorbenen Tiere beides vorhanden war. Zwei Tiere verstarben ohne jegliche frühzei-

tig (<1 h vor dem Tod) erkennbare Symptomatik. Von den überlebenden Tieren zeigte kein Tier

auffälliges Verhalten und 6 der 12 Tiere hatten eine erhöhte Temperatur.

Damit war die Beurteilung von Temperatur und Verhalten in den Wiederholungsversuchen

eindeutiger, was zum einen an der frequenteren Fütterung und Temperaturmessung gelegen

haben könnte aber auch an der Haltung der Tiere in einem abgeschlossenen Gebäude. Unabhän-

gig von der stark schwankenden Außentemperatur war innerhalb des Gebäudes eine konstante

Temperatur von 20 – 22 °C gegeben. Bei den Versuchen in Südafrika war nur ein Außengehege

mit Überdachung vorhanden, das zwar Schutz vor Regen und direkter Sonneneinstrahlung bot,

aber die Tiere den Temperaturschwankungen der Umwelt aussetzte. Dies hatte möglicherweise

zu erhöhtem Stress geführt, der sich in teils unspezifischem, auffälligem Verhalten äußerte und

die Aussagekraft von Verhaltensauffälligkeiten als diagnostisches Mittel beeinträchtigt haben

könnte. Da generell eine Temperaturerhöhung mehrheitlich das eindeutigere und im Ver-

suchsaufbau in der Türkei auch das erste detektierbare Symptom darstellte, sollte die Priorität

bei der Diagnostik auf der Temperaturmessung liegen und die Veränderung des Verhaltens nur

unterstützende Funktion haben. Die Relevanz der Verhaltensbeobachtungen ist dabei aber umso

höher, je reduzierter die regelmäßigen Temperaturerhebungen ausfallen.

4.3.12.4 Detektion von Bakterien im Blut

Auffälligkeiten bei Temperatur und Verhalten galten als Indikatoren für ein Fortschreiten der

Infektion, deren Bestätigung über einen Blutausstrich und visuellen Nachweis von B. anthracis

nötig war. Ein entsprechend positiver Befund hierbei galt als ausreichendes Anzeichen für einen

im weiteren zum Tode führenden Krankheitsverlauf und hatte die Euthanasie des betreffenden

Tieres zur Vermeidung von Leid zur Folge.

Zu Beginn der Versuche war die Möglichkeit der Blutentnahme durch die Verwendung von

entsprechenden für Ziegen vorgesehenen Kanülen limitiert, da es nicht praktikabel war mit

diesen, mehrmals täglich an ähnlichen Stellen Blut abzunehmen. Zusätzlich erschwert wurde

die Diagnose durch die nicht vorhandenen Daten zum Zeitpunkt des Auftretens von B. anthra-

cis im Blutkreislauf bei Ziegen. Somit war die Detektionsrate von Bakterien im Blut vor dem

Tod der Tiere begrenzt und größtenteils aufgrund der geringen Frequenz der Probennahme dem

Zufall überlassen. Anlässlich der Unzulänglichkeit dieser Methode wurde gegen Ende der Ver-

suchsdurchführung in Südafrika eine Blutentnahme an der Halsvene mittels Insulinspritzen

141


erprobt. Mit diesen war es möglich minimal invasiv mehrmals täglich sehr kleine Mengen

(<100 µl) Blut zu entnehmen. Zur Gewinnung besserer Daten bezüglich des Auftretens von

Bakterien im Blut von Ziegen wurden die Ziegen der Gruppe LK nach der Infektion im Abstand

von 3 – 6 h auf die beschriebene Art geblutet und auf Bakterien untersucht. Ebenso fand diese

verbesserte Blutentnahme zur Detektion von Bakterien im Blut in der Gesamtheit der Ziegen-

versuche in der Türkei Anwendung. Zusammengenommen ergaben die gesammelten Daten bei-

der Versuche (Tabelle 52) ein deutlicheres Bild.

Der frühest mögliche Zeitpunkt ab dem Bakterien

im Blut nachgewiesen wurden, lag bei 25,5 h vor dem

Tod. Allerdings war dies verglichen mit den restlichen

Ergebnissen, die zudem mehrheitlich von naiven Tie-

ren stammten, vermutlich eine Ausnahme. Außerdem

beinhaltete der Blutausstrich dieser Ziege nur zwei

vereinzelte Bakterien, sodass ein eindeutig positiver

Befund erst später durch Kultivierung des Bluts auf

CBA erbracht wurde. Daher ist davon auszugehen,

dass bei der hier verwendeten Art der Detektion mit-

tels mikroskopischer Beurteilung eines Blutausstrichs

ein positiver Befund regulär erst bei weiterem Fort-

schreiten des Krankheitsverlaufs möglich ist.

Unter Ausschluss dieses Einzelfalls lag die frühste

Detektion von Bakterien im Blut bei 2,8 bis 5,25 h,

wobei beide Daten durch den nicht eindeutig festge-

stellten Todeszeitpunkt ungenau waren. Allerdings

werden diese Werte durch weitere Ergebnisse gestützt,

bei denen in anderen Tieren frühstens 2,3 h bzw.

1,83 h vor dem Tod Bakterien nachgewiesen werden

konnten. Ebenso lagen die Zeitpunkte für einen nega-

tiven Abstrich bei frühstens 4,83, 5,5, 5,75 oder 6,0 h

oder vor dem Tod. Dabei war die Anzahl der gefunde-

nen Bakterien 1 – 3 h vor dem Tod zunächst gering (< 10) und bestand mehrheitlich aus Einzel-

zellen oder kurzen Ketten. Probennahmen zum Zeitpunkt des Todes enthielten hohe Konzen-

trationen, bestehend aus zum Teil langen Bakterienketten mit bis zu 40 Bakterien.

Auf Grundlage dieser Ergebnisse kann vorläufig postuliert werden, dass wenigstens 2 – 5

Stunden vor dem Tod einer Ziege Bakterien im Blut nachweisbar waren, während 4 – 6 Stunden

vor dem Tod die Diagnose noch negativ ausfallen konnte. Dies bedeutet, dass bei einer Detekti-

142

Tabelle 52: Detektion von Bakterien im Blut

Ergebnisse der Blutausstriche aller an B. anthracisverstorbenen Ziegen aus den Versuchen in Südafrika undder Türkei. Zeitangaben beziehen sich auf Stunden vordem Todeszeitpunkt und sind als Zeitintervallangegeben, wenn der Zeitpunkt nicht eindeutig bestimmtwerden konnte; Die aussagekräftigsten Ergebnisse sindfett hervorgehoben; n.v. - nicht vorhanden; 0 – positiverBlutausstrich zum Zeitpunkt des Todes

Ziegen Gruppe letzter negativer erster positiver

Nr. Blutabstrich Blutabstrich

[h vor Tod] [h vor Tod]

II NK 8,2 – 10 2,8 – 4

VI NK 6 n.v. *

97014 NK (W) n.v. n.v. *

97015 NK (W) n.v. n.v. *

96163 NK (W) 5,75 1

kk NK (W) 9,25 – 10,25 5,25 – 6,25

8202 LK 4,83 1,83

8203 LK 5,5 0

8185 1 9,3 2,3

8187 1 35,3 0

8211 2 14,67 0

8213 2 n.v. 0

8180 3a 25,2 1,2

8188 4 n.v. 0,58

8190 4 n.v. 0

8192 4 n.v. 0,33

8198 4 n.v. 0

8199 4 n.v. 0,25

627398 4 (W) wurde behandelt und überlebte

580319 4 (W) 9,25 – 13,25 n.v. *

97013 4 (W) 52 25,5

99348 4 (W) wurde behandelt und überlebte

8191 6 n.v. 0

8194 6 n.v. n.v. *

8195 6 12,75 0

8201 6 n.v. 0

627396 6 (W) 4 – 8,75 n.v. *

627395 6 (W) 7,5 n.v. *

* Verifikation von Bakterien im Blut erst nach dem Tod


on von Bakterien im Blut einer infizierten Ziege in einem Zeitraum von 2 – 5 h mit deren Tod

zu rechnen ist, wohingegen ein negatives Resultat nur Prognosen für die nächsten 4 – 6 Stunden

zulässt. Daraus ergeben sich Beobachtungs- und Kontrollintervalle mit denkbaren initialen Zeit-

fenstern von maximal 6 h bzw. 3 h bei auffälligen Tieren.

143


4.4 Diskussion Ziegenversuche

4.4.1 Versuchsdurchführung und Diagnoseprozeduren

Ein nicht zu vernachlässigender Faktor bei Versuchen dieser Art in Großtieren außerhalb einer

Laborumgebung ist der Mangel an verifizierbaren Daten zu den Rahmenbedingungen der Ver-

suchsdurchführung. Vor allem neuere Daten zu Infektionsversuchen in Tiermodellen wie Ziege,

Schaf und Rind sind, durch den damit verknüpften hohen Aufwand und die einzuhaltenden

Sicherheitsrichtlinien, rar. Die Möglichkeit, solche Versuche unter Feldbedingungen in Ende-

miegebieten durchzuführen, war daher sowohl einzigartig, als auch im Bezug auf die sonst

gesetzten Maßstäbe und Vereinheitlichungen eines Laborumfelds schwierig. Daher sollen

zunächst die gewonnenen Daten zur Durchführung und Diagnose anhand der vorhandenen Lite-

ratur ausgewertet werden, um zukünftigen Vorhaben dieser Art eine bessere Ausgangslage zu

ermöglichen.

Das Auftreten von Fieber steht in Zusammenhang mit den Antikörpertitern gegen rPA83Das Auftreten von Fieber steht in Zusammenhang mit den Antikörpertitern gegen rPA83

Die Ermittlung der rektalen Temperatur war im Zuge des Infektionsversuchs eines der wichtigs-

ten Mittel zur Früherkennung einer voranschreitenden Infektion und ausschlaggebend für weite-

re diagnostische Maßnahmen. Daher war eine Abgrenzung zwischen normalen Körpertempera-

turen und erhöhten Temperaturen notwendig. Im Zuge der Vorbereitung der Versuche in Süd-

afrika wurde daher die Temperatur der Ziegen aus Gruppe 1 bei den monatlichen Probenentnah-

men bestimmt. Entsprechend der Messungen schwankten die Normaltemperaturen sehr stark

und erreichten Werte von 37,4 – 39,6 °C (Tabelle 55, Anhang), was auch während der Infektion

auffällig war.

Zur Unterscheidung eines Fiebers war in früheren Studien von Schlingman et al. (1956) und

Jackson et al. (1957) [272][150] mit Großtieren wie Rind und Schaf eine Temperatur von

39,4 °C und höher angenommen worden, welche entsprechend der gemessenen Normalwerte

für diesen Versuch auf 40,0 °C angehoben wurden. In den Experimenten von Schlingman und

Jackson nahm die Schutzwirkung der applizierten Vakzinen mit fortschreitender Entfernung

vom Zeitpunkt der Vakzinierung ab und damit einhergehend die Inzidenz von Fieber sowohl in

Überlebenden wie Verstorbenen mit verlängerter Überlebenszeit zu. Diese erhöhten Temperatu-

ren konnten bei Rindern und Schafen generell im Zeitraum von 1 – 9 Tagen nach der Infektion

auftreten und hielten bei Schafen 1 – 3 Tage an [272][150]. Die höchste Inzidenz an Fieber trat

am 3. Tag nach der Infektion auf [150]. Ein ähnlicher Verlauf wurde auch für Schweine be-

schrieben [250].

Diese Beobachtungen konnten auch in den hier beschriebenen Versuchen an Ziegen bestätigt

werden. Der Zeitraum des Auftretens erhöhter Temperaturen lag bei 2 – 10 Tagen nach der

144


Infektion, wobei die Mehrheit der Tiere mit erhöhter Temperatur von Tag 2 – 4 auftraten und

Tag 3 mit Abstand die höchste Rate an auffälligen Temperatur aufwies. Die Fieberdauer betrug

1 – 5 Tage.

Ausgehend von den gemessenen serologischen Werten vor und nach der Infektion lassen

sich in Bezug auf die gemessenen Temperaturen zudem einige Tendenzen feststellen. So

verstarben in den vorliegenden Versuchen, wie in Abbildung 54 und 55 zu sehen ist, insgesamt

7 Versuchstiere ohne ein detektierbares Fieber (≥ 40,0 °C). Sechs dieser Tiere stammten aus den

Kontrollgruppen, die keine funktionelle Vakzinierung erhalten hatten und alle 7 Tiere zeigten

vor der Infektion einen unspezifischen anti-rPA83 IgG-Titer von ≤ 238. Ähnliche Versuche in

Stieren zeigten ebenfalls, dass ein Großteil der Tiere, die ohne ein messbares Fieber verstarben,

zur Gruppe der unvakzinierten naiven Tiere gehörten [150]. Da auch sechs weitere verstorbene

Tiere mit einem ähnlichen anti-rPA83 IgG-Titer (< ~550) nur kurzzeitig auftretendes Fieber

(< 10) aufwiesen, ist bei den praktizierten Messintervallen nicht auszuschließen, dass auch

unauffällige Tiere eine transiente Temperaturerhöhung aufwiesen, die nicht detektiert wurde.

Kein Tier mit einem anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion von 550 und niedriger überlebte

und keines dieser Tiere zeigte eine Temperaturerhöhung, die länger als 10 h detektierbar war.

Ebenfalls keine Temperaturerhöhung zeigten Überlebende mit anti-rPA83 IgG-Titern vor der

Infektion von > ~30000, was ausschließlich auf die frisch revakzinierten Tiere der SSLV-immu-

nisierten Gruppe 3b zutraf. Auch bei den Versuchen von Schlingman et al. (1956) und Jackson

et al. (1957) [272][150] mit AVP und Lebendvakzinen war auffällig, dass Tiere mit einem fri-

schen Impfschutz durch eine Infektion keinerlei Temperaturerhöhung erfuhren. Diese abwesen-

de Temperaturerhöhung ging zudem in der hier beschriebenen Versuchsgruppe 3b auch mit

einer Verminderung der anti-rPA83 IgG-Titer nach der Infektion einher. Es ist daher denkbar,

dass eine ausreichende Höhe an anti-rPA83 IgG-Titern im Falle einer Infektion den Progress der

Infektion und damit einhergehend die Entwicklung von Fieber unterbindet und somit zu einer

„sterilen Immunität“ [49] führt. Dies würde über die schnelle Klärung der Antigene durch die

vorhandenen Antikörper eine weitere spezifische Immunreaktion auf diese verhindern und so

konstante oder sinkenden Antikörpertiter nach der Infektion zur Folge haben.

Entsprechend müsste bei Überlebenden ein konstanter Antikörpertiter vor und nach der

Infektion mit der Abwesenheit von Fieber einhergehen. Dies konnte in dieser Arbeit bestätigt

werden, da alle 11 Tiere mit konstanten oder fallenden Antikörpertitern gegen rPA83 auch kein

detektierbares Fieber aufwiesen. Umgekehrt wiesen auch 11 der 14 überlebenden Tiere mit

einer starken Erhöhung der Antikörpertiter gegen rPA83 nach der Infektion ein detektierbares

Fieber auf. Dabei war ab einer Titerhöhe von ~90000 nach der Infektion in allen Fällen Fieber

nachweisbar, während dies bei Titerhöhen bis ~32000 nie der Fall war.

145


Die Titerhöhe vor der Infektion schien für eine Vorhersage der Entwicklung von Fieber nicht

aussagekräftig zu sein. Dies bestätigt die zuvor festgestellte Tendenz, wonach sowohl Tiere mit

besonders niedrigen (≤ 238), also auch besonders hohen (> ~30000) anti-rPA83 IgG-Titern vor

der Infektion kein oder nur kurzzeitiges Fieber entwickelten. In beiden Fällen ist es vermutlich

nicht zu einer systemischen Reaktion auf die Infektion gekommen, wobei die Ursache dafür

jeweils eine andere war. Tiere mit besonders niedrigen Titern starben an der Infektion bevor

sich ein Fieber entwickeln konnte, während Tiere mit besonders hohen Titern vermutlich erst

gar keine systemische Infektion entwickelten. Titerwerte zwischen diesen Extremen bieten mit-

unter nur einen partiellen Schutz, wodurch ein ambivalentes Krankheitsbild entsteht. Damit

scheint der anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion keinen linearen Bezug zur Entwicklung von

Fieber zu haben, wohl aber zum Verlauf der Infektion.

Der Unterschied zwischen den anti-rPA83 IgG-Titern vor und nach der Infektion könnte zu

einer quantifizierbaren Auswertung der Schutzrate hinzugezogen werden, da dieser in Zusam-

menhang mit einer Fieberentwicklung und damit dem Fortschreiten der Infektion steht. Somit

wäre eine Unterscheidung bei Überlebenden zu einer sterilen Immunität ohne eine Temperatur-

und Titerentwicklung durch die Infektion für eine generell bessere Beurteilung von Vakzinen

sinnvoll. Daher sollte in Vakzinestudien bei Überlebenden generell auch das Blut nach der

Infektion auf Titerveränderungen untersucht werden. Entsprechend konstante oder abfallende

Titer im Vergleich zu vor der Infektion würden demnach auf eine sterile Infektion hindeuten,

qualitative Unterscheidungen bei den Überlebenden ermöglichen und so potentiell eine tiefere

Diskriminierung zwischen ähnlich schützenden Ansätzen erlauben.

Die Höhe der anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion ist in Ziegen und Auszucht-Mäusen Die Höhe der anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion ist in Ziegen und Auszucht-Mäusen prädiktiv für das Überleben, aber möglicherweise abhängig von der Infektionsdosisprädiktiv für das Überleben, aber möglicherweise abhängig von der Infektionsdosis

Bei der Beurteilung neuer Vakzinekomponenten gilt letztendlich die Schutzwirkung vor einem

letalen Infekt mit einem voll virulentem Stamm als ausschlaggebendes Kriterium. Besonders im

Bezug auf Humanvakzinen und der Vermeidung von Tierversuchen im Sinne des Tierschutzes

ist dies aber nicht immer möglich oder praktikabel. Daher wird seitdem es möglich ist die Sero-

konversion durch verschiedene Antigene mittels ELISA und TNA zu messen, versucht, diese

mit eine Prognose zur Überlebenswahrscheinlichkeit zu verknüpfen. Korrelationen der gemes-

senen Antikörpertiter zum Überleben geben aber bisher kein schlüssiges Bild, sodass es beson-

ders auch im Hinblick auf die Antitoxin-Titer namhafte Verfechter für deren Korrelation zum

Überleben (auszugsweise: [211][102][307][20][240]) und auch dagegen (auszugsweise: [124]

[95][148][326][61]) gibt. Hauptgründe für die widersprüchlichen Berichte sind die fehlenden

Richtlinien zum Zeitpunkt der Probennahme und die Variationen in den Beurteilungsmaßstä-

ben. Wie besonders bei der Titerentwicklung der SSLV über ein Jahr ersichtlich ist, können

146


Korrelationsversuche zu verschiedenen Probenzeitpunkten gänzlich andere Ergebnisse liefern.

Überdies beeinflussen auch Faktoren wie die Infektionsdosis, Infektionsart oder der eingesetzte

Stamm sowie das Tiermodell die Ergebnisse [192][89][1], sodass die Vergleichbarkeit zwischen

den Arbeiten kaum gegeben ist.

Im Zuge der hier vorliegenden Arbeit wurde dennoch nach Korrelationen zwischen den

Titern vor der Infektion und der überlebten Zeit in Stunden mittels des Spearman Rangkorrela-

tionskoeffizienten gesucht. Entsprechende Vergleiche innerhalb einzelner Gruppen waren auf-

grund der teilweise geringen Gruppengröße nicht für alle Gruppen möglich bzw. resultierten in

sehr hohen Signifikanzschwellen. Die Mausversuche mit einbegriffen, ergaben sich nur signifi-

kante Korrelationen für die zwei Gruppen, deren Immunogenität weniger gut anmutete, was

natürlich auch dadurch bedingt ist, dass Korrelationsberechnungen bei vollständiger Schutzwir-

kung nicht möglich sind. Dies betraf Gruppe 2 der Ziegenversuche und Gruppe TA der Maus-

versuche, bei denen die anti-rPA83 IgG-Titer (und für TA auch die anti-rLF IgG-Titer) mit der

überlebten Zeit korrelierten (rs = +0,9). Beide Gruppen zeigten durch die jeweilige Immunisie-

rung nur sehr niedrige Antikörpertiter und in beiden Gruppen verstarben die Tiere mit den nied-

rigsten bzw. nicht nachweisbaren anti-rPA83 IgG-Titern. Möglicherweise sind daher die für den

Schutz relevanten Antikörperfraktionen nicht zwingend gegen die immunogensten Epitope

gerichtet.

Für einen weiteren Versuch, Zusammenhänge zwischen den anti-rPA83 IgG-Titern und dem

Überleben aufzudecken, wurden alle Versuchstiere der Ziegenversuche anhand ihrer anti-rPA83

IgG-Titer direkt vor der Infektion sortiert. Dabei ergab sich, dass Tiere mit einem anti-rPA83

IgG-Titern von ~550 und weniger nicht mehr ausreichend geschützt waren und ausnahmslos

verstarben. Dies betraf 46,5 % aller verstorbenen Tiere (25 % aller Tiere insgesamt) und diese

blieben tendenziell symptomlos mit einem möglicherweise äußerst kleinem Zeitfenster (< 10 h)

in dem eine erhöhte Temperatur messbar gewesen wären. Alle verstorbenen Ziegen mit einem

Ausgangstiter von ~550 und höher wiesen eine detektierbare Temperaturerhöhung auf. In einem

Bereich zwischen ~550 bis ~3400 war keine eindeutige Tendenz zu erkennen, da sowohl 26 %

der Überlebenden als auch 43 % der Verstorbenen Antikörpertiter in dieser Höhe aufwiesen. Ab

einem Titerwert von 3400 überlebten 85 % aller Tiere, wobei eine eindeutige Prognose für

einen vollständigen Schutz erst ab einem Titer von 20000 möglich war. Die gleiche Analyse

von Mausgruppen mit einer Infektionsdosis von ~1000 Sporen ergab eine Überlebensrate von

75% ab einem Schwellenwert von 30000, wobei eine vergleichbare Tendenz bei einer Infekti-

onsdosis von ~2000 Sporen nicht vorhanden war. Analoge Beobachtungen gaben Minimaltiter

gegen rPA83 von 1132 für eine Schutzrate von 90 % in Kaninchen [102] und 2500 – 4200 für

100 % Schutzraten in Meerschweinchen an [255]. Der postulierte Schwellenwert von 3400 für

147


Ziegen bei einer Schutzrate von 85 % läge damit in einem ähnlichen Bereich, wäre aber nicht

absolut. Für alle weiteren Antigene waren keine Schwellenwerte erkennbar.

Um die Zusammenhänge zwischen den gemessenen Antikörpertitern und der überlebten Zeit

statistisch zu belegen, wurden gruppenübergreifende Korrelationsberechnungen durchgeführt.

Es ergaben sich korrespondierend zu den beschriebenen Schwellenwerten für die Ziegen- und

Mausgruppen, die eine Infektionsdosis von ~1000 Sporen erhielten, signifikante Korrelationen

der anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion zur überlebten Zeit (rs ≥ +0,507), wohingegen die

Mausgruppen, die eine Infektionsdosis von ~2000 Sporen erhielten eine gegenläufige Korrela-

tion aufwiesen (rs = -0,406). Daher scheint in Ziegen und Auszucht-Mäusen ein Überleben mit

den anti-rPA83 IgG-Titern in Zusammenhang zu stehen, wobei deren Relevanz für das Überle-

ben in Auszucht-Mäusen abhängig von der Infektionsdosis sein kann.

Die MLD für das Feldisolat SD20 ist kleiner als 36 Sporen in ZiegenDie MLD für das Feldisolat SD20 ist kleiner als 36 Sporen in Ziegen

Für die Infektion der Ziegen in Südafrika wurden Sporen des bis dato unerprobten Feldisolats

SD20 verwendet. Dieser war 2001 aus dem Ohr eines an Milzbrand verendetem Schafes im

Gebiet von Standerton, Provinz Mpumalanga, Südafrika isoliert und als voll virulent typisiert

[181] worden. Die Testung des Stammes vor Ort mit 500 und 1000 Sporen in BALB/c-Mäusen

bestätigte dessen Virulenz. Für den Einsatz in der Ziege fehlten direkte Vergleichsangaben zur

einzusetzenden Dosis, sodass vor der eigentlichen Infektion verschiedene Konzentrationen

getestet wurden. Andere Infektionsversuche in sensiblen Tierarten stellten hierbei eine Orientie-

rungshilfe. So gaben Schlingman et al. (1956) [272] eine LD50 (s. c.) von 100 Sporen für den

Stamm V770-2-P in Schafen und de Vos et al. (1996) [66] eine MLD von < 100 für den Stamm

17JB in Impalas an. In Anlehnung an diese Ergebnisse sollten 1000, 200 und 50 Sporen des

SD20 Stammes s. c. in naiven Ziegen erprobt werde. Die Auszählung der Infektionsdosen ergab

eine tatsächlich applizierte Dosis von 844, 172 und 36, wobei alle Dosen mit korrelierender

Überlebenszeit tödlich wirkten. Da selbst die geringste Dosis einen Tod innerhalb von 4 Tagen

zur Folge hatte, ist davon auszugehen, dass die MLD dieses Stammes in der Ziege < 36 Sporen

für eine s. c. Applikation beträgt.

Beim Nachweis von Bakterien im Blut infizierter Ziegen ist mit einem Tod binnen 2Beim Nachweis von Bakterien im Blut infizierter Ziegen ist mit einem Tod binnen 2 –– 55 h zu h zu rechnenrechnen

Die Einwanderung von B. anthracis in den Blutkreislauf und die dortige Replikation wird als

finales Stadium der Infektion angesehen, weswegen ein Nachweis von Bakterien im Blut ein

sicheres Zeichen für eine letale Infektion darstellt. Abhängig von der Spezies, dem eingesetzten

Stamm, dessen Dosis und der Infektionsroute [189][44][89][357] kann der Zeitpunkt des Auf-

148


tretens von Bakterien und deren Verdopplungszeit variieren. Dabei ist der Nachweis von Bakte-

rien nicht generell prädiktiv für einen tödlichen Verlauf, da auch Einzelfälle bekannt sind, bei

denen sich Infizierte sogar ohne Behandlung voll erholten [89][264][156][272]. Ausschlagge-

bend für eine Remission ist aber die Konzentration der vorhandenen Bakterien [293]. Dennoch

wurde aus technischen und ethischen Gründen in dieser Studie die Detektion von Bakterien im

Blut als Kriterium für eine therapeutische Intervention angenommen.

Ähnliche Studien dieser Art ergaben eine frühest mögliche Detektion von 5 – 24 Stunden vor

dem Tod für Kaninchen und Meerschweinchen [174], bei einem Detektionslimit von

100 cfu/ml, sowie 24 – 46 Stunden für Rinder [272][150], 12 – 16 Stunden für Schafe [272]

und 11,5 – 12 Stunden für Rhesusaffen [166][188]. Beim Vergleich dieser Daten ist zu beach-

ten, dass das Detektionslimit bedingt durch die Art der Blutabnahme beeinflusst werden kann.

Überdies kann auch ein etwaiger bestehender Impfschutz das Ergebnis beeinflusst haben.

Für die aus dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse kann das Detektionslimit nur mit einem

Schätzwert von 100 cfu/ml angegeben werden, da bei jeder Probennahme nur jeweils 1 – 2

Objektträger mit je einem Tropfen Blut (~10 µl) komplett begutachtet wurden. Die unter diesen

Voraussetzungen frühste Entdeckung von Bakterien im Blut lag bei 2 – 5 Stunden vor dem Tod,

wobei bei einzelnen Tieren 4 – 6 Stunden vor dem Tod noch keine Bakterien nachweisbar

waren. Damit war mit dem Tod von unbehandelten Ziegen nach Detektion von Bakterien im

Blut innerhalb der nächsten 2 – 5 Stunden zu rechnen. Die Mehrheit der gesammelten Messda-

ten zu diesem Thema wurde in den Kontrollgruppen erhoben, wodurch etwaige Verfälschungen

durch einen bestehenden Impfschutz weniger ins Gewicht fallen. Im Vergleich liegt die Detekti-

onsfähigkeit von Bakterien im Blut infizierter Ziegen weit unter der anderer Großtiere, wobei

die größte Ähnlichkeit mit Schafen [272] und möglicherweise mit Schweinen besteht, da letzte-

re terminal sehr niedrige Bakterienkonzentrationen aufzuweisen scheinen [250]. Alle genannten

Ergebnisse könnten zusätzlich auch durch die Art der Blutentnahme über große Blutgefäße

beeinflusst worden sein, wobei gerade bei den zitierten Großtierversuchen diesbezüglich keine

Angaben gemacht wurden. Daher ist davon auszugehen, dass die Beprobung dort auf ähnlich

Weise stattgefunden hat. Unter der Voraussetzung der Praktikabilität könnte eine Blutentnahme

aus kleinvolumigeren Gefäßen eine bessere Detektion ermöglichen, da dort Bakterien in größe-

ren Konzentrationen vorhanden sein könnten.

Die hohen unspezifischen Hintergrundtiter bei Ziegenseren im ELISA lassen sich durch den Die hohen unspezifischen Hintergrundtiter bei Ziegenseren im ELISA lassen sich durch den Austausch von FKS mit Magermilchpulver stark reduzierenAustausch von FKS mit Magermilchpulver stark reduzieren

Im Vergleich zu den Mausversuchen zeichneten sich die serologischen Analysen der Ziegense-

ren mittels ELISA durch starke unspezifische Hintergrundtiter (< ~2500) gegen verschiedene

Antigene, insbesondere rPA83, rBclA und FIS aus. Diese schienen individuell unterschiedlich

149


auszufallen, sowohl in den Kontrollgruppen, als auch in den Seren der Vakzinegruppen vor der

Immunisierung und waren auch über die Zeit (Gruppe 1) Schwankungen unterlegen. Ähnlich

hohe Titer bei naiven Tieren waren auch in den Arbeiten von Hahn et al. (2006) [123] in Scha-

fen bezüglich rPA83 festgestellt worden, die dort in einer Serumverdünnung von im Durch-

schnitt bis zu ~1:2000 nachweisbar waren [123]. Auch für Seren humanen Ursprungs, von Rhe-

susaffen und sogar diversen Mausmodellen ist dieses Phänomen bekannt und betrifft neben PA

auch LF und EF [40][49][75]. Damit ist davon auszugehen, dass es sich um ein generelles Phä-

nomen handelt, das vermutlich auch mehr oder weniger stark von der individuellen Zusammen-

setzung der Seren abhängt. Der Austausch von FKS gegen Magermilchpulver als Bestandteil

des Blockpuffers im ELISA bewirkte eine deutliche Verminderung der unspezifischen Hinter-

grundtiter auf < ~200. Dies wurde ausschließlich bei den Seren der Wiederholungsversuche

(Türkei) angewendet, weswegen die Vergleiche der Ziegengruppen untereinander mit normali-

sierten Titerwerten durchgeführt wurden.

Die Höhe der unspezifischen Hintergrundtiter war nur im Bezug auf die anti-rBclA Titer

problematisch, da die eventuell sichtbaren Titererhöhungen in einem Bereich lagen, der den

unspezifischen Titern entsprach. Für FIS, rPA83 und das vegetative Antigen waren spezifische

Titererhöhungen aufgrund der Titerhöhe deutlicher unterscheidbar. Allerdings waren auch bei

diesen Antigenen aufgrund der unspezifischen Hintergrundtiter marginale Titerveränderungen

im Verlauf der Immunisierung weniger aussagekräftig.

Adverse Reaktionen von Ziegen auf die Immunisierung mit der SSLV beruhen Adverse Reaktionen von Ziegen auf die Immunisierung mit der SSLV beruhen möglicherweise auf parallel vorhandenen Infektionenmöglicherweise auf parallel vorhandenen Infektionen

Während bereits M. Sterne selbst Zweifel an der Sicherheit seiner Vakzine in Ziegen äußerte

[300] und die generelle Empfehlung zur Anwendung der SSLV in diesen Tieren eine Prä-

Inokulation, vorzugsweise in der Schwanzregion mit einem Viertel der eigentlichen Dosis, vor-

sieht [357], sind publizierte Fallbeschreibungen zu dieser Thematik kaum vorhanden. Zwar

wird in vielen Publikationen die Sensitivität von Ziegen und Lamas aufgegriffen und deren Nei-

gung zu negativen Reaktionen auf die Vakzine postuliert [326], dennoch beruhen die meisten

auf einer einzigen echten Referenz. Dieser von Cartwright et al. (1987) [48] berichtete Fall be-

traf drei 3 Monate alte Lama-Kälber, die durch die Immunisierung mit der SSLV erkrankten

und von denen zwei im weiteren Verlauf verstarben. Dabei zeigte keines der älteren Tiere eine

ähnliche Reaktion. Weitere Berichte dieser Art auch in anderen Tiermodellen wie Ziegen sind

nur mündlich überliefert oder beruhen auf Erfahrungswerten. Hinlänglich nachgewiesen und

publiziert, ist die Restvirulenz der SSLV indes nur in verschiedenen sensitiven Mausinzuchtmo-

dellen und Meerschweinchen [354][353][192][148].

150


Ebenso gibt der Hersteller (OBP – Onderstepoort Biological Products) der hier verwendeten

Vakzine (SSLV, Stamm 34F2) bezüglich einer Verwendung in Ziegen an, dass es regional zu

Schockreaktionen aufgrund der Immunisierung kommen kann. Zudem sollte von einer Applika-

tion wie üblich in der Halsreaktion aufgrund von möglichen Schwellungen abgesehen werden,

sodass eine Sicherheit der Vakzine nicht in allen Tieren gewährleistet werden kann. Die Grund-

lage dieser Empfehlung wird allerdings nicht erläutert.

Entgegen der generellen Einschätzung und den vom Hersteller geäußerten Bedenken verlief

die Immunisierung von Gruppe 2 und 3 a/b mit der SSLV vollkommen nebenwirkungsfrei,

wobei zudem auf eine Prä-Inokulation verzichtet und entsprechend sofort eine reguläre Dosis

verabreicht wurde. Todesfälle aufgrund der Immunisierung traten ebenfalls nicht auf. Damit

schließen sich die Ergebnisse diesbezüglich an die von Shakya et al. (2007) [280] gemachten

Erfahrungen an, die ebenfalls keinerlei adversen Reaktionen der SSLV in Ziegen feststellen

konnten. Einzig die aufgetretenen generellen gesundheitlichen Probleme sowie die Verluste

durch parallel auftretende Infektionen könnten einen Anhaltspunkt bieten. Ähnliche Vakzinie-

rungsversuche in Ziegen, anderen Großtieren und Wildtieren waren vermutlich eher, wie die in

dieser Arbeit beschriebenen Versuche, als Feldversuche ausgelegt und auch eine reguläre Imp-

fung findet zumeist in Tieren statt, deren Gesundheitszustand nicht genau erfasst ist. Daher

scheint es möglich, dass adverse Effekte oder gar Verluste von Tieren durch die Immunisierung,

gerade auch bei jungen Tieren, auf mögliche Zusatzbelastungen durch Nebeninfektionen oder

einen generell schlechten Zustand zurückzuführen sind.

Die hier verwendeten Ziegen zeigten mehrheitlich positive Reaktionen im Test auf Pseudo-

tuberkulose, welche oft vor allem junge Tiere befällt, latent verläuft und erst bei älteren Tieren

durch Stress z. B. beim Transport oder einer Impfung zum Ausbruch kommt [55]. Ebenso

erkrankten und verstarben mehrere Tiere vor der Infektion durch Freilandhaltung an der Herz-

wasserkrankheit. Wäre die Ausprägung besonders der Herzwasserkrankheit direkt nach der

Immunisierung oder Infektion aufgetreten, hätte man die Todesursache ausschließlich auf

B. anthracis zurückgeführt und nicht auf eine Zusammenwirkung mit einem relevanten Paralle-

linfekt. Die beobachteten Krankheitsfälle waren in dieser Arbeit eindeutig auf die kurzzeitige

Haltung in einem Freilandgehege zurückzuführen. Während der Haltung in betonierten Ställen

traten keine Fälle auf.

Verbesserung der DiagnoseprozedurenVerbesserung der Diagnoseprozeduren

Zusammenfassend war die Beobachtung von Verhalten und Temperatur abhängig vom Ver-

suchsaufbau kein vollends verlässlicher Indikator zur Beurteilung des Infektionsverlaufs. Dies

war auch darauf zurückzuführen, dass die Temperatur nur punktuell gemessen werden konnte

151


und Verhaltensauffälligkeiten vornehmlich nachts nicht oder schwer bemerkbar waren und

zudem durch äußere Faktoren beeinflusst werden konnten. Generell ist daher eine kontinuierli-

che Messung der Temperatur über einen Chip bei dieser Art von Experiment anzuraten, da so

eventuelle kurze durch Stress oder andere Einflüsse induzierte Temperaturerhöhungen besser

als solche erkannt werden können und sich so ein schlüssigeres Beurteilungskonzept erstellen

lässt. Muss die Temperatur manuell erhoben werden, so sollte dies mehrmals täglich entspre-

chend der Praktikabilität in Abständen von 6 – 12 h (optimal 8 h) geschehen. Hierbei gewinnt

die zusätzliche Beurteilung des Verhaltens um so mehr an Bedeutung je weniger frequent eine

reguläre Temperaturmessung möglich ist. Zur Verbesserung der Aussagekraft von auffälligem

Verhalten ist die Haltung innerhalb eines abgeschlossenen Gebäudes anzuraten, um Stress

durch Umwelteinflüsse zu minimieren. Generell sollte darauf geachtet werden, die Betreuung

und Untersuchung der Tiere mit möglichst großer Routine durchzuführen, um Stress zu vermin-

dern. Zudem sind regelmäßige Fütterungen, mehrmals täglich mit Heu oder Laub zur Einschät-

zung des Appetits, des Durchsetzungsvermögens und der Stellung in der Gruppe hilfreich. Bei-

des wird von Ziegen gerne angenommen und deckt besser als pelletiertes Futter Probleme beim

Zerkauen der Nahrung auf. Beim Auftreten von Verhaltensauffälligkeiten sollte die Temperatur

der jeweiligen Tiere auch außerhalb der normalen Messintervalle ermittelt werden.

Der Schwellenwert für die Indikation von Fieber liegt bei 40,0 °C. Dabei sollte bei ausrei-

chender Versuchsgruppengröße in Erwägung gezogen werden, Tiere nicht zu infizieren, die vor

der Applikation der Infektionsdosis eine Temperatur von 40,0 °C und höher aufweisen. Mit

einer infektionsbedingten Erhöhung der Temperatur ist zwischen 2 und 10 Tagen nach der

Infektion zu rechnen, wobei zwischen Tag 2 und 5 die Inzidenz am höchsten ist. Tiere mit einer

Temperatur von < 40,0 °C oder/und auffälligem Verhalten nach der Infektion sollten bei jeder

regulären Überprüfung genau auf eine Veränderung ihres Zustands überprüft werden. Weiter-

führende diagnostische Maßnahmen (Blutausstrich) und eine häufigere Überprüfung der ent-

sprechenden Tiere (alle 2 – 5 h) sind erst ab einer Temperatur von 40,4 °C sinnvoll und sollten

so lange in dieser Frequenz weitergeführt werden, bis sich der Zustand verbessert (< 40,0 °C)

oder Bakterien im Blut nachweisbar sind. Entsprechend der Anzahl an gefundenen Bakterien

und des Gesamtzustands des Tiers kann bei einer Detektion von Bakterien im Blut statt einer

Euthanasie ebenfalls eine antibiotische Behandlung in Erwägung gezogen werden. Als weiteres

frühzeitiges Abbruchkriterium könnte eine Temperaturerhöhung auf 41,4 °C verwendet werden,

da die Ergebnisse dieser Arbeit ergaben, dass 90 % der Tiere mit einer Höchsttemperatur von

≥ 41,4 °C im weiteren Verlauf verstarben. Tiere mit einer solchen Temperatur könnten auch

ohne den Nachweis von Bakterien im Blut behandelt oder euthanasiert werden, wenn es die

Zielsetzung des Versuchs erlaubt.

152


Als weiteres diagnostisches Mittel könnten, sofern es durchführbar ist, die anti-rPA83 IgG-

Titer der Seren direkt vor der Infektion ermittelt werden. In den Versuchen dieser Arbeit wiesen

46,5 % der verstorbenen Tiere einen anti-rPA83 IgG-Titer von < ~550 auf und verstarben sym-

ptomlos oder mit kurz andauerndem Fieber (< 10 h). Daher waren diese Tiere anhand der Beob-

achtung von Temperatur und Verhalten nur schwer korrekt zu diagnostizieren. Mit entsprechen-

der Kenntnis der anti-rPA83 IgG-Titerwerte von vor der Infektion könnten Tiere dieser Katego-

rie verstärkt beobachtet werden oder von der Infektion ausgeschlossen werden, wenn es der

Versuchsaufbau zulässt.

Ein zusätzliches Hilfsmittel vor allem zur Unterscheidung von infektionsbedingt auffälligem

Verhalten wäre die Inklusion von 1 – 2 nicht infizierten Tieren in die Kohorte, anhand derer

sich ein normales Verhalten abschätzen lässt. Dies ist besonders von Vorteil, wenn äußere

Stressfaktoren nicht vermieden werden können.

Die Anwendung der genannten Erkenntnisse aus dieser Studie können dazu beitragen, inner-

halb ähnlicher Versuche einen irreversiblen Krankheitsverlauf frühzeitig zu erkennen und durch

Behandlung oder Euthanasie das Leid der Tiere und das Kontaminationsrisiko zu vermindern.

4.4.2 Impfversuche mit NLV

Während die Ergebnisse zum diagnostischen Prozedere nur Beiwerk der eigentlichen Versuche

waren, lag das Hauptaugenmerk auf der Testung von NLV im Vergleich zur gängigen SSLV.

Geeignete Kandidaten und deren Kombinationen waren zuvor im NMRI-Mausmodell etabliert

worden. Während die DNA-basierenden Vakzinen in Ziegen eine geringere Wirksamkeit auf-

wiesen, konnten die Protein-basierenden Vakzinen im Vergleich zur Immunisierung mit der

SSLV einen äquivalenten Schutz erzeugen, waren aber weniger immunogen. Daher sollen im

Folgenden die Ergebnisse anhand der vorhandenen Literatur verglichen und Gründe für die

unterschiedliche Wirksamkeit, sowie Verbesserungsmöglichkeiten erörtert werden.

Die DNA-Vakzine Kombination war in dieser Form weitestgehend wirkungslosDie DNA-Vakzine Kombination war in dieser Form weitestgehend wirkungslos

Die Ergebnisse der DNA-Vakzinierung der Ziegen belegten, dass keine der drei Impfungen eine

merkliche Titererhöhung bewirkte. Ebenso schien auch kein Potential als vorbereitende Vakzi-

nierung für einen Proteinboost vorhanden zu sein, da auch eine entsprechende Boosterdosis kei-

ne besseren Ergebnisse brachte als die vergleichbare Proteinimmunisierung alleine. Die fehlen-

de Wirkung der DNA-Vakzinierung war vor allem im Bezug auf die gute, teils zu den Proteinen

äquivalente Wirkung der Vektoren im NMRI-Mausmodell erstaunlich. Zu beachten ist hierbei

allerdings die unterschiedliche Applikation der Vakzine in den Maus- und Ziegenversuchen,

wenngleich bereits in Schafen gezeigt wurde, dass generell eine i. m. Applikation von DNA-

153


Vakzinen wirkungsvoll sein kann. So konnten Hahn et al. (2006) [123] erfolgreich mit einer

ähnlichen DNA-Vakzine anti-rPA83 IgG-Titer (~104) in Merino-Schafen erzeugen. Abgesehen

von der Verwendung einer anderen Wirtsspezies und anderer Vektoren lag ein großer Unter-

schied in der Verwendung eines anderen Adjuvans (Vaxfektin), das gerade bei i. m. Immunisie-

rungen mit DNA eine Rolle spielen kann. Die verstärkende Wirkung von Vaxfektin war auch

innerhalb der Versuche von Hahn et al. (2006) [123] nachgewiesen, da eine Immunisierung

ohne das Adjuvans im Vergleich ebenfalls kaum eine Wirkung der Vektoren zur Folge hatte.

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Adjuvanzien mIPS-1 und CIITA sind zudem

stark auf eine intrazelluläre Wirkung angewiesen, welche durch eine Injektion nur über aktive

Aufnahme der betreffenden Zellen gewährleistet werden kann. Dabei ist die generelle Aufnah-

me von extrazellulärer DNA durch APCs ohnehin sehr ineffektiv [262]. Darüber hinaus ist be-

sonders CIITA auf eine gemeinsame Wirkung mit den applizierten Antigenvektoren angewie-

sen, was ebenfalls außerhalb einer GeneGun-Anwendung weitestgehend dem Zufall überlassen

ist.

Ein weiterer Faktor könnte die Herkunft der genannten Sequenzen selbst sein. Sowohl

mIPS-1 als auch CIITA waren murinen Ursprungs und könnten in anderen Tiermodellen eine

andere Wirkung haben.

Aus den Versuchen von Hahn et al. (2006) [123] schließend, könnte eine erneute Anwen-

dung der Vektoren NTC7382-TPA-LFD1PAD4-mIPS-1, pDNAVaccUltra1-TPA-BclAD1D3-

LAMP1 und pDNAVaccUltra5-CIITA mit anderen Adjuvanzien, beispielsweise Vaxfektin gänz-

lich andere Ergebnisse erzielen. Ebenso wären alternative Applikationsarten, die ein intrazellu-

läres Eintreffen der Vektoren sicherstellen, wie z. B. Elektroporation, Tätowierung oder Mikro-

partikelbeschuss [262] für das zwingende Zusammenwirken mehrere Vektoren vorteilhafter.

FIS als Bestandteil einer Proteinvakzine erhöht die schützende Wirkung von rPA83FIS als Bestandteil einer Proteinvakzine erhöht die schützende Wirkung von rPA83

Trotz der veränderten Dosis und Applikation unterschieden sich die Wiederholungsversuche

von den Vorversuchen in der Höhe der gebildeten Antikörpertiter nicht signifikant, was wahr-

scheinlich auf die in beiden Versuchsdurchgängen beobachtete starke Streuung der Titerwerte

innerhalb der Gruppen zurückzuführen ist. Die anti-rPA83 IgG-Titer in den Wiederholungsver-

suchen lagen tendenziell höher und es wurde eine signifikant bessere Schutzwirkung erzielt.

Inwiefern neben der Erhöhung der Dosis auch die gemeinsame Applikation der Antigene als

Mischung einen Einfluss hatte, ist dabei nicht abzusehen, da die Titerentwicklung in beiden

Szenarien ähnlich verlief. So scheint bei allen getesteten Gruppen eine dritte Immunisierung die

erzeugten Antikörpertiter nicht weiter zu erhöhen. Die unerwartet niedrige Immunogenität von

rBclA in Ziegen betraf alle Gruppen gleichermaßen und wird in späteren Abschnitten diskutiert.

154


Eine Veränderung der anti-rPA83 IgG-Titer durch den Zusatz von FIS war weder bei den

Vorversuchen, noch bei den Wiederholungsversuchen vorhanden. Einzig die TNA-Titer schie-

nen durch die Kombination mit FIS tendenziell erhöht und wiesen im Falle von Gruppe 6 (W)

eine Korrelation mit den anti-FIS IgG-Titern auf. Ebenso lagen die Schutzraten bei Zusatz von

FIS mit 20 % bei Gruppe 6 und 80 % bei Gruppe 6 (W) höher als ohne FIS (respektive 0 % und

50 %). Die verbesserte Wirkung der Kombinationsvakzine beruhte also entweder auf der Erhö-

hung der gebildeten neutralisierenden Antikörper gegen rPA83, bedingt durch die Zugabe von

FIS oder/und auf den durch Fis generierten anti-Spore Antikörpern. Damit konnte die zuvor in

Mäusen nachgewiesene, verbesserte Schutzwirkung von Vakzinekombinationen mit FIS und PA

[42][106], die ebenfalls bereits in den hier beschriebenen Vorversuchen in Mäusen gezeigt wur-

de auch in Ziegen nachgewiesen werden.

Im Vergleich zur Vakzinierung mit der SSLV (diese Studie) und der von Hahn et al. (2006)

getesteten Kombination aus rPA83 und Alhydrogel in Schafen [123] waren die anti-rPA83 IgG-

Titer der NLV insgesamt weitaus niedriger. Nur vereinzelte Tiere wiesen Titerwerte (> 104) auf,

die mit den genannten Versuchen vergleichbar wären. Allerdings war die erzielte Schutzrate von

80 %, mit einer Kombination von rPA83, rBclA, Lipopeptid und FIS vergleichbar mit den von

Jackson et al. (1957) und Schlingman et al. (1956) erreichten Schutzraten von 100 % durch

AVP in Stieren und Schafen [150][272] und den in dieser Studie durchgeführten Versuchen mit

der SSLV.

Tendenziell scheint die Wirksamkeit der Kombination von rPA83, (rBclA), Lipopeptid und

FIS allerdings nicht vollständig ausgeschöpft worden zu sein, da die Titer innerhalb der Gruppe

unabhängig von der Applikationsart stark schwankten. Eine weitere Erhöhung der Antigendo-

sis, FIS eingeschlossen, oder/und die Verwendung eines anderen Adjuvans [123] könnte die

Schwankungen reduzieren und für ein höheres, einheitlicheres Titerbild sorgen, was sich ent-

sprechend auch positiv auf die Schutzrate auswirken könnte.

4.4.3 Impfversuche mit der SSLV

Während eine oder mehrere verstärkende Folgeimmunisierungen zur Gewährleistung eines

vollständigen Schutzes Bestandteil der meisten Impfpläne sind, wird für die SSLV ein Impf-

schutz ab der ersten Immunisierung angenommen. Die maximale Schutzdauer wird für jede

Immunisierung mit einem Jahr angegeben, sodass Auffrischungen jährlich notwendig sind.

Inwiefern die Aufrechterhaltung dieses Impfplans nach der ersten Auffrischungsimpfung not-

wendig ist oder ein den Schutz beeinflussender Unterschied zwischen der ersten und allen wei-

teren Impfung besteht, ist jedoch nicht schlüssig geklärt. Initiale Arbeiten zu diesem Thema zur

Zeit der Testung und Einführung der Vakzine befassten sich bei der Einschätzung der Wirksam-

155


keit hauptsächlich mit der klinischen Reaktion der Tiere und der praktischen Schutzwirkung.

Inzwischen sind detailliertere Untersuchung zur Grundlage einer Schutzwirkung möglich.

Daher waren die Daten zur Titerentwicklung der SSLV, neben der Funktion als Referenz, insbe-

sondere mit Abdeckung der hier getesteten Antigene von generellem Interesse.

Der Erfolg einer Erstimmunisierung mit der SSLV kann stark variierenDer Erfolg einer Erstimmunisierung mit der SSLV kann stark variieren

Während neuere Studien zur Wirksamkeit der SSLV in Großtieren kaum vorhanden sind, finden

sich zahlreiche Studien in Mäusen, Kaninchen und Meerschweinchen, in denen die Vakzinie-

rung mit der SSLV vergleichend zu anderen Ansätzen erprobt wird. Leider beschränkt sich der

serologischen Anteil dieser Studien oft auf die Antikörpertiter gegen die Toxine, insbesondere

PA, und erstreckt sich zudem meist nicht über längere Zeiträume. Wurde eine Immunisierung

mit der SSLV in diesen Studien mehrfach vorgenommen, so geschah dies in Angleichung an die

Impfpläne der zu vergleichenden Ansätze im Abstand von 2 – 4 Wochen, was nicht der Anwen-

dungsrealität der SSLV entspricht. Daher sind reale Vergleichsstudien, wie die in dieser Arbeit

präsentierte, mit einem über PA hinausgehenden Titerspektrum nahezu nicht vorhanden. Einzig

die Arbeiten von Shakya et al. (2007) [280] bieten eine direkte Vergleichsmöglichkeit zu den

Versuchen dieser Arbeit. Dort sollte die Möglichkeit einer oralen Immunisierung mit der SSLV

im Vergleich zur regulären Impfung mit der SSLV in Ziegen getestet werden. Analog zu Grup-

pe 3 wurden durch die initiale Impfung in Woche 3 hohe, aber auch stark streuende anti-rPA83

Titer (~13000) gemessen. Diese sanken vergleichsweise schnell in Woche 6 auf ein stabiles,

niedriges Niveau (~1500), welches sich bis Woche 9 nicht weiter änderte. Vergleichend dazu

war die Immunisierung von Gruppe 3 langlebiger und auch der Initialtiter in Woche 4 (~50000)

sehr viel höher. Zwar fielen auch hier die Titer danach rapide ab, pegelten sich aber erst ab

Woche 12 – 16 auf ein unveränderliches Niveau (~3000) ein. Vergleicht man die Daten von

Shakya et al. (2007) [280] mit der weniger gut verlaufenen Immunisierung von Gruppe 2 ergibt

sich eine größere Überschneidung, da diese 6 Wochen nach der Immunisierung ebenfalls bereits

sehr niedrige Titer aufwies (~3000). Aufgrund der fehlenden Messung für Woche 3 kann aller-

dings nicht gesagt werden, ob diese zu einem früheren Zeitpunkt ebenfalls entsprechend höhere

Titer gehabt hätte. Dennoch zeigt dies, sowie der Bericht von Salmon et al. (1992) [266] deut-

lich, dass eine solche Variation in der Immunreaktion auf einen initiale Immunisierung mit der

SSLV kein Einzelfall sein muss. Auch bei der Anwendung in Pferden ist bekannt, dass sich die

erzeugte Immunität bei einer initialen Immunisierung mit der SSLV nur sehr langsam entwi-

ckelt [228]. Darüber hinaus ist auch eine unterschiedliche Wirksamkeit der Vakzinierung durch

Chargenunterschiede denkbar. Damit ist fraglich ob eine Schutzwirkung der SSLV ab der ersten

Immunisierung umfassend für alle Tiere gegeben ist, zumal sogar ein vollständiges Ausbleiben

156


einer detektierbaren Reaktion, einhergehend mit dem Verlust der Schutzwirkung, wie in 2 Tie-

ren von Gruppe 2 beobachtet wurde, möglich ist.

Die Versuche von Shakya et al. (2007) [280] sahen weiterhin eine Reimmunisierung mit der

SSLV in Woche 9 vor, die eine Erhöhung der Titer gegen PA bereits nach einer Woche auf ein

weitaus höheres Niveau (~40000) als das der initialen Impfung bewirkte. Dieses Niveau blieb

noch mindestens drei weitere Wochen erhalten und entsprach von der Höhe eher den in unseren

Versuchen gemessenen Titern für Gruppe 3, sowohl nach der ersten Immunisierung, als auch

nach der Revakzinierung von Gruppe 3b. Damit scheint der grobe Verlauf der Immunisierungen

sehr ähnlich zu sein, in den Details sind aber durchaus Unterschiede erkennbar, wie sie auch

analog zu den Ergebnissen von Gruppe 3 und 2 vorlagen.

Die unspezifische phagozytotische Wirkung von Ziegenseren könnte die Wirkung der Die unspezifische phagozytotische Wirkung von Ziegenseren könnte die Wirkung der Immunisierung mit der SSLV beeinflussenImmunisierung mit der SSLV beeinflussen

Neben der Bedeutung für die Schutzwirkung einer Erstimmunisierung mit der SSLV werfen die

Ergebnisse auch die Frage nach der Ursache der ausbleibenden Wirkung der SSLV in einzelnen

Tieren auf. Wie zuvor erwähnt, scheint die zwischen Gruppe 3a und 2 bezüglich der Erstimmu-

nisierung notierte Diskrepanz keine Ausnahme zu sein, da auch Beispiele in anderen Arbeiten

zu finden sind, bei denen die erste Immunisierung mit der SSLV kaum erhöhte anti-rPA83 Titer

erzeugte [280][192][144][84]. Erstaunlicherweise waren die Unterschiede in den Überlebensra-

ten zu Gruppen, die mit hohen anti-rPA83 Titern reagierten nur gering und auch in den hier

beschriebenen Versuchen überlebten noch 60 % (Gruppe 2) trotz kaum erhöhter Titer. Dies ist

ein deutlicher Hinweis darauf, dass die Schutzwirkung durch die SSLV vermutlich durch

zusätzliche Faktoren, als nur die anti-rPA83 IgG-Titer klassifiziert werden sollte. Allerdings

geben diesbezüglich für Gruppe 2 die gemessenen Titer für FIS, TNA, BclA und das vegetative

Antigen nach der Immunisierung keine weiteren Hinweise, da keiner der Titer eine Veränderung

aufwies. Einzig die gemessenen anti-FIS IgG-Titer waren leicht erhöht, lagen aber ebenfalls

weit unter den Werten von Gruppe 3 für Woche 4 und 8.

Neben potentiellen Unterschieden in der Wirksamkeit verschiedener Vakzinechargen könnte

die von Welkos et al. (2001) [352] beschriebe Wirkung von naiven Tierseren auf Sporen einen

Hinweis auf die Ursache für die unterschiedlichen Reaktionen auf die Vakzinierung bieten.

Demnach scheinen besonders bei Ziegenseren eine hohe unspezifische phagozytosefördernde

Wirkung zu haben, die zu einer vermehrten Aufnahme der Sporen durch murine Makrophagen

führt. Diese Eigenschaft, sofern sie auch auf andere Makrophagen zutrifft, könnte einen Ein-

fluss auf die individuelle Wirksamkeit der SSLV haben.

157


Der Höchstpunkt der anti-rPA83 IgG-Titer ist 1Der Höchstpunkt der anti-rPA83 IgG-Titer ist 1 –– 22 Wochen nach der Immunisierung zu Wochen nach der Immunisierung zu erwartenerwarten

Im Hinblick auf die erst spät erfolgte Beprobung von Gruppe 2 in Woche 6 stellt sich die Frage,

ob die gemessenen Titer für Gruppe 3 in Woche 4 noch dem Höhepunkt entsprachen oder diese

dort schon im Absinken begriffen waren. Die bereits eine Woche nach der Revakzinierung deut-

lich erhöhten Titer bei Shakya et al. (2007) [280] würden für Letzteres sprechen, wenn auch

klar ist, dass eine Auffrischungsimpfung anders verläuft als eine Erstimmunisierung. Andere

Studien mit der SSLV, vornehmlich in Meerschweinchen, machen teils nur sehr ungenaue

Angaben bezüglich des Zeitpunkts der Blutentnahme, wobei dieser oft mit „nach der Immuni-

sierung“ angegeben wird und daher davon auszugehen ist, dass die Probennahme entsprechend

zeitnah nach der Immunisierung erfolgte. Die angegebenen Titer gegen PA umfassten dabei,

auch in Abhängigkeit der applizierten Sporenzahl bei einer einmaligen Immunisierung,

200 – 6000 [192][148][144][329], was eher den von Shakya et al. (2007) [280] angegebenen

Werten bzw. Gruppe 2 entspricht. Ein von Cohen et al. (2000) [58] durchgeführter Versuch mit

einem SSLV-ähnlichen EF- und LF-defizientem Stamm ergab einen Höchsttiter gegen PA erst

8 Wochen nach der Immunisierung, wohingegen Versuche mit azellulärem PA bereits nach

2 Wochen Höchstwerte erreichten [365] [191]. Damit bleibt der genaue Zeitpunkt der höchsten

Immunreaktion weiterhin ungenau, wobei dieser, aufgrund den Ergebnissen von Shakya und der

rasanten Titerentwicklung 2 Wochen nach der Infektion für Gruppe 2 und 3 a, vermutlich eher

innerhalb der ersten 2 Wochen nach der Immunisierung zu erwarten ist.

Eine Vakzinierung mit der SSLV von Tieren mit erhöhten Antikörpertitern (gegen PA) ist Eine Vakzinierung mit der SSLV von Tieren mit erhöhten Antikörpertitern (gegen PA) ist wirkungsloswirkungslos

Der danach folgende rasante Abfall der Titer scheint ebenfalls bereits in anderen Applikationen

beobachtet worden zu sein [280][365][191] und kann eventuell in Abhängigkeit der initial

erzeugten Titer wie in unserem Fall bis zu 16 Wochen nach der Immunisierung andauern, bevor

ein unveränderliches Niveau erreicht ist. Dies kann insbesondere im Zuge einer rasch folgenden

Revakzinierung besonders ins Gewicht fallen. Betrachtet man die überlebte Infektion mit dem

voll virulenten Stamm SD20 als weitere Immunisierung mit einer Lebendvakzine, so konnte

durch diese in der frisch revakzinierten Gruppe 3b keiner der gemessenen Titer weiter erhöht

werden. Ähnlich verhielt es sich auch für ein Individuum von Gruppe 3a (8176), welches vor

der Infektion noch leicht erhöhte anti-rPA83 IgG-Titer aufwies. In beiden Fällen könnten die

erhöhten Antikörpertiter die Infektion vollständig abgefangen haben, sodass diese keine weitere

Immunreaktion auslösen konnte [82][284]. Setzt man also eine gute Wirksamkeit der Erstim-

munisierung voraus, könnte eine zu dicht darauf folgende zweite Immunisierung wirkungslos

verpuffen. Teilergebnisse von Ivins et al. (1990) [148] unterstützen diese Annahme, wonach

158


einmalige Immunisierungen mit der SSLV in Meerschweinchen äquivalent hohe anti-rPA83

Titer erzeugte wie zwei Immunisierungen im Abstand von 4 Wochen. Überdies ergaben die

zusammengefassten Ergebnisse anderer Studien kaum Unterschiede in der Titerhöhe bei ein

und mehrfach in rascher Folge immunisierten Meerschweinchen, wenn die Erstimmunisierung

Wirkung zeigte [192][144][84].

Eine gedoppelte Erstimmunisierung könnte die sporadischen Immunisierungsausfälle mit der Eine gedoppelte Erstimmunisierung könnte die sporadischen Immunisierungsausfälle mit der SSLV behebenSSLV beheben

Zusammengenommen haben die beschriebenen Ergebnisse der Versuche mit der SSLV Implika-

tionen für die Praxis. So muss davon ausgegangen werden, dass eine Erstimmunisierung, even-

tuell auch chargenabhängig, mit der SSLV nicht allen Tieren einen Schutz vermittelt und eine

umfassende Schutzwirkung für alle immunisierten Tiere erst frühestens ab der zweiten Immuni-

sierung gegeben ist. Daher scheint es unplausibel eine zweite Immunisierung erst nach

9 – 12 Monaten durchzuführen. In Anbetracht des zuvor beschriebenen Zeitfensters

12 – 16 Wochen in dem nicht nur die anti-rPA83 IgG-Titer, sondern auch die anti-FIS IgG-Titer

zwar fallend, aber immer noch leicht erhöht sind, würde sich eine zweite Impfung nach

16 Wochen anbieten. Dadurch wäre eine erneute immunogene Reaktion ohne Verluste durch

bestehende Antikörpertiter wahrscheinlich. Für einen ungewissen Impfschutz ist allerdings auch

eine Wartezeit von 4 Monaten recht lang. Daher wäre auch eine doppelte initiale Impfung im

Abstand von 1 bis 2 Wochen möglich. Davon könnten Tiere profitieren bei denen die Erstim-

munisierung nicht angegangen ist. Dieser Ansatz wird auch indirekt durch die zuvor genannten

Arbeiten unterstützt. Diese führten Fallbeispiele mit sehr niedrigen Titerentwicklungen bei ein-

mal immunisierten Tieren auf, aber niemals für schnell aufeinander folgende, mehrfach Immu-

nisierte und dies galt auch für Tests mit niedrigeren Sporenkonzentrationen. Eine mindestens

doppelte, rasch aufeinander folgende Immunisierung scheint das sporadische Fehlschlagen der

Erstimmunisierung zu beheben. Eine entsprechende Empfehlung dieser Art der Erstimmunisie-

rung ist für Pferde bereits vorhanden [228]. Überdies würde es, abgesehen von der verminder-

ten Konzentration der Prä-Inokulation, exakt den Vorgaben der WHO zur Immunisierung von

Ziegen entsprechen [357], die aber nicht aufgrund der verbesserten Wirksamkeit, sondern zur

Verminderung von adversen Reaktionen auf die Vakzine postuliert wurde.

Die Auffrischungsimpfung sollte 3Die Auffrischungsimpfung sollte 3 –– 4 Monate nach der Erstimmunisierung erfolgen4 Monate nach der Erstimmunisierung erfolgen

Unabhängig davon, ob in einem veränderten Impfplan mit initial zwei dicht aufeinanderfolgen-

den Impfungen oder nur einer Erstimmunisierung operiert wird, wäre aber dennoch die Appli-

kation der ersten Folgeimpfung 3 – 4 Monate nach der letzten Impfung sinnvoll, da diese fakti-

159


sche Auffrischungsimpfung einen zusätzlichen Effekt zu haben scheint. Vergleicht man die

Titerwerte der ersten und zweiten Immunisierung von Gruppe 3b, scheinen die anti-rPA83 IgG-

Titer ähnlich und für die zweite Immunisierung sogar leicht niedriger zu sein. Dies könnte aber

auch darauf zurückzuführen sein, dass sie, wie bei Shakya et al. (2007) [280] dargestellt, früher

ihren Höhepunkt erreicht haben und in Woche 4 nach der Impfung bereits wieder abfallen.

Davon abgesehen sind die anti-FIS und anti-vegetativ IgG-Titer für die erste Immunisierung

deutlich geringer ausgefallen als für die zweite, sodass diese drei- bzw. zehnfach höhere Werte

zeigte. Zudem scheint auch der Anteil an neutralisierenden Antikörpern im Vergleich zur

Erstimmunisierung, trotz ähnlich hoher anti-rPA83 Titer, zugenommen zu haben. Prozentual

machten die TNA-Titer nach der ersten Immunisierung nur 0,5 % der anti-rPA83 IgG-Titer aus,

nach der 2. Immunisierung bzw. überlebten Infektion betrugen diese 2 – 4 %. Hierbei ist es

allerdings anzumerken, dass bereits ab Woche 37 und für alle folgenden Zeitpunkte TNA-Titer

knapp oberhalb der Nachweisgrenze messbar waren, obwohl die anti-rPA83 IgG-Titer unverän-

dert blieben. Da diese Erhöhung nicht mit den Titern gegen rPA83 einherging, wäre auch eine

Beteiligung der hier nicht gemessenen anti-LF Antikörpertiter möglich, die nachweislich eben-

falls den TNA beeinflussen können [199][43] und im Zuge einer Immunisierung mit der SSLV

ebenfalls produziert werden [192]. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit

dafür, dass eine zweite Immunisierung nach einem Jahr ein deutlich anderes Titerspektrum

erzeugt als die Erstimmunisierung. So werden neben einer Auffrischung der Immunreaktion

gegen rPA83 durch die zweite Immunisierung auch verstärkt Antikörper gegen die Spore und

den vegetativen Zellkörper gebildet.

Eine jährliche Auffrischung der Impfung mit der SSLV könnte generell obsolet sein oder durchEine jährliche Auffrischung der Impfung mit der SSLV könnte generell obsolet sein oder durcheine Änderung des Impfplans obsolet werdeneine Änderung des Impfplans obsolet werden

Abschließend ist auch die Dauer des Impfschutzes durch die Vakzinierung mit der SSLV und

die damit einhergehende Notwendigkeit jährlicher Auffrischungen zu erörtern. Langzeitstudien

vor allem mit den Humanvakzinen AVA und AVP zeigen deutlich, dass zumindest deren auf PA

basierende immunogene Wirkung bis zu 2 Jahre anhält [241][367], während für die SSLV und

SSLV-ähnliche Lebendvakzinen eine Mindestwirkzeit von nur 9 – 12 Monaten angegeben wird

[357][228][58]. Ausgehend von den hier erläuterten Ergebnissen wäre eine solche Begrenzung

der Wirkdauer für die SSLV nicht anzunehmen.

Zunächst scheinen die nach Woche 16 stabil, leicht erhöhten Titer gegen rPA83 und FIS bis

zur Revakzinierung oder respektive Infektion auf einem einheitlichen Niveau zu verbleiben

(p ≥ 0,114). Daher gibt es keinen Grund anzunehmen, dass sich dies nach einem Jahr ändert,

zumal die Titer im Bezug auf PA auch in Woche 62 immer noch signifikant höher waren als die

vor dem Beginn der Immunisierung gemessenen (p = 0,006). Zudem waren vier von fünf der

160


nicht revakzinierten Tiere (Gruppe 3a) auch 62 Wochen nach der Erstimmunisierung geschützt,

was zudem sogar eine marginal bessere Schutzrate erzeugte als die frisch immunisierte Grup-

pe 2 mit drei von fünf Überlebenden. Hinzu kommt, dass die einzige verstorbene Ziege aus

Gruppe 3a nicht nur eine verlängerte Überlebenszeit zeigte, sondern nach der ersten Immunisie-

rung (Woche 4) mit Abstand die niedrigsten anti-rPA83 IgG-Titer der Gruppe 3 aufwies und

somit womöglich eher Ähnlichkeit mit den Tieren und der beschriebenen Problematik von

Gruppe 2 hatte. Legt man die zuvor erörterten Theorien zugrunde, hätte gerade diese von einer

„doppelten“ Erstimmunisierung profitiert und wäre vermutlich wie alle anderen auch nach

einem Jahr nicht verstorben. Auf Grundlage dieser Ergebnisse ist daher nicht davon auszuge-

hen, dass der Impfschutz auf ein Jahr begrenzt ist und noch weniger, wenn der Erfolg einer

Erstimmunisierung gewährleistet und durch eine zweite Impfung 3 – 4 Monate später aufge-

frischt ist. Um dies zu untermauern, müssten langandauernde Impfstudien über mehrere Jahre

durchgeführt werden. Eine Begrenzung des Impfplans auf maximal 2 – 3 Immunisierungen

innerhalb von einem halben Jahr ohne weitere Auffrischungen wäre aber eine deutliche Verbes-

serung zum jetzigen Szenario.

4.4.4 Generelle Anmerkungen zu den Ergebnissen

Neben den diagnostischen Ergebnissen und den Vergleichen der Versuche untereinander und zur

vorhandenen Literatur warfen die Versuche generelle Fragen auf bzw. gaben weitere Denkan-

stöße zu bereits bestehenden Fragestellungen. Diese sollen im Folgenden beleuchtet werden.

BclA ist in Ziegen nicht bzw. wenig immunogenBclA ist in Ziegen nicht bzw. wenig immunogen

Zur Unterstützung und Verbesserung der Wirksamkeit von rPA83 wurde bei den Maus- und

Ziegenversuchen das Sporenantigen rBclA eingesetzt in der Hoffnung, den Vakzinen neben

einer Antitoxinwirkung auch eine Antisporenwirkung hinzuzufügen. Die Eignung von rBclA für

diese Aufgabe schien dabei klar, da es als äußerster Bestandteil der Spore zu deren immuno-

gensten Antigenen gehört [310][296] und bereits in anderen Versuchen die Schutzwirkung von

PA verbessern konnte [39][125]. Diese Eigenschaft wurde auch in den Mausversuchen dieser

Arbeit bestätigt, wobei rBclA nicht nur äquivalent hohe Antikörpertiter wie rPA83 erzeugte,

sondern innerhalb einer DNA-Vakzine auch eine eigenständige Schutzwirkung zu haben schien.

Auch in anderen Tierarten wie Kaninchen, Rind, Schaf und Rhesusaffe [195][64][264] war die

Immunogenität von BclA bereits erwiesen, sodass es keinen Anlass gab, an der analogen Wir-

kung in Ziegen zu zweifeln. Daher war die Abwesenheit einer deutlichen Titerentwicklung

gegen rBclA in den getesteten Ziegen höchst erstaunlich. Durch die SSLV konnten keine signi-

fikanten Titer gegen rBclA erzeugt werden und auch die NLV mit rBclA und FIS erzeugten teil-

161


weise zwar signifikante, aber nur marginal erhöhte Antikörpertiter. Dabei schienen die Gruppen

mit FIS und BclAD1D3 als DNA-Vektor im Vergleich etwas besser zu funktionieren als rBclA.

Als mögliche Ursache im Bezug auf FIS könnte hier die fehlende Glykosylierung von rBclA

[296] in Betracht gezogen und damit einhergehend die verringerte Stabilität des Trimers [254]

herausgestellt werden, wobei mögliche Folgen unklar sind. Des Weiteren sind fehlerhafte Mes-

sungen diesbezüglich auszuschließen, da die gleichen Präparationen im Mausmodell und im

ELISA funktional waren und auch über den ELISA mit FIS, welches nachweislich ebenfalls

BclA enthielt (siehe Kapitel 4.1.1.5, 4.1.2.2 und 4.1.2.3), keine erhöhten Titer in Gruppe 4 und

4 (W) (erhielt rBclA aber keine FIS) detektiert werden konnten.

Die immunogene und möglicherweise auch Schutz vermittelnde Wirkung von FIS beruht Die immunogene und möglicherweise auch Schutz vermittelnde Wirkung von FIS beruht nicht auf BclAnicht auf BclA

Überraschend in diesem Zusammenhang war die hohe Immunogenität von FIS bzw. der leben-

den Sporen der SSLV, war man doch davon ausgegangen, dass ein Großteil von deren Immuno-

genität auf BclA zurückzuführen sei. So zeigten die mit der SSLV immunisierten Gruppen und

die zusätzlich mit FIS immunisierte Gruppe 6 Antikörpertiter gegen FIS, die denen gegen

rPA83 entsprachen. Ein ähnliches Bild hatte sich bereits für die Mausversuche abgezeichnet,

war aber hauptsächlich dem vorhanden BclA auf der FIS Präparation zugeschrieben worden.

Zur Aufklärung dieses Missverhältnisses gereichen neuere Studien, welche die Funktion von

BclA in einem etwas anderen Licht als bisher darstellen. So revidieren die Arbeiten von

Cybulsky et al. (2008) [64], Côte et al. (2012) [61] und Vergis et al. (2013) [336] nicht nur das

Alleinstellungsmerkmal von BclA als einzigem relevanten Immunogen der Spore, sondern defi-

nieren dessen Rolle sogar eher als maskierenden Täuschkörper mit der Funktion der Überde-

ckung anderer möglicherweise viel relevanterer Antigene der Spore.

Unter diesem Gesichtspunkt scheint die geringe immunogene Reaktion von Ziegen auf BclA

in Kombination mit einer hohen Immunogenität von FIS bzw. der lebenden Sporen der SSLV

merkwürdig. Wie exemplarisch innerhalb der Mausversuche (siehe Kapitel 4.1.1.5, 4.1.2.2 und

4.1.2.3) gezeigt wurde, war die Detektion von Antikörpern gegen rBclA und BclAD1D3 mittels

FIS möglich. Daher ist davon auszugehen, dass die BclA-Filamente sowohl auf FIS, als auch

auf den Sporen der SSLV noch weitestgehend intakt sind. Trotzdem erzeugten FIS und die

SSLV in Ziegen hohe Titer gegen FIS, die nicht auf eine immunogene Wirkung von BclA

zurückzuführen waren und trotz der Anwesenheit von BclA auf den Sporen gebildet wurden.

Auf Grundlage der Beobachtung der überdeckenden Eigenschaften von BclA auf andere Spo-

renantigen in vorhergehenden Studien [64][61][336] sind mehrere Erklärungen denkbar, die die

hier präsentierten Ergebnisse mit einbeziehen.

162


Zunächst könnte das Potential BclAs zur Überdeckung anderer Antigene ein Faktor der

Immunogenität selbst sein, sodass eine verstärkte Immunreaktion auf BclA eine vergleichbare

Reaktion auf konkurrierende Antigene vermindert. Ist die Immunogenität von BclA herabge-

setzt, wie es bei Ziegen zu sein scheint, bestünde dieser Effekt nicht und eine Reaktion auf wei-

tere Sporenantigene auch bei Anwesenheit von BclA wäre ungehindert möglich. Unter diesen

Umständen hätte eine Sporenpräparation ohne BclA eine ähnliche immunogene Wirkung wie

mit BclA.

Eine weitere mögliche Erklärung, die für die tatsächliche mechanische Überdeckung anderer

Antigene durch BclA sprechen würde, ist die Beschädigung des Exosporiums oder der BclA-

Filamente. Sowohl FIS, als auch die SSLV sind Produkte eines präparativen Protokolls mit

mehreren Reinigungsschritten. Dabei könnte das Exosporium und dessen BclA-Filamente teil-

weise beschädigt worden sein, womit der Zugang zu weiteren Sporenantigenen, trotz Anwesen-

heit von BclA ermöglicht wäre. Die in Ziegen gemessenen anti-FIS IgG-Titer müssten demnach

durch die komplette Entfernung des BclAs von der Sporenoberfläche weiter erhöhbar sein. Eine

Bestätigung dieses Szenario hätte allerdings weitreichende Implikationen für die Vakzinepro-

duktion und die Vergleichbarkeit verschiedener Arbeiten mit Lebendvakzinen, FIS und sogar

Infektionsstämmen. Sogar die in den vorherigen Kapiteln bemerkte unterschiedliche Wirksam-

keit der SSLV könnte durchaus auf entsprechende Schwankungen im Präparationsprotokoll

zurückzuführen sein.

Ein weiterer Erklärungsversuch bezieht die Länge der

BclA-Filamente mit ein. Bedingt durch die variable Länge der

CLR variiert auch die Länge der BclA-Filamente stammspezi-

fisch [296][310][254]. Bisher hat man diesem Umstand wenig

Bedeutung beigemessen, da die gänzliche Abwesenheit von

BclA keinen nachweislichen Einfluss auf die Resistenz und

Virulenz von B anthracis Sporen zu haben schien [296][310]

[33]. Trotzdem könnte durch die Länge der Filamente, die

Zugänglichkeit weiterer Antigene unterschiedlich stark beein-

trächtigt sein. Auch die Struktur der BclA-Filamente, mit

einem haarähnlichem Mittelteil und bulbärem Ende (Abbil-

dung 57, [310]), könnte dabei von Bedeutung sein und zur

Abschirmung der Sporenoberfläche beitragen. In diesem

Zusammenhang zeichnet sich gerade der für die SSLV ver-

wendete und innerhalb dieser Arbeit auch zur Erstellung von

FIS benutzte Stamm 34F2 durch die längsten bislang getesteten BclA-Filamente aus [311].

Inwiefern diese Eigenschaft die besondere Eignung als Vakzinestamm beeinflusst haben könn-

163

Elektronenmikroskopische Aufnahme einesBclA Filaments nach Färbung undImmunogold Markierung aus [310]; derMaßstab entspricht 100 nm

Abbildung 57: BclA-Filament


te, ist allerdings unklar. Ebenso geben die vorangegangenen Arbeiten über die Wirkung von

BclA als Täuschkörper wenig Aufschluss über den potentiellen Anteil der Länge der BclA-Fila-

mente an der immunogenen Wirkung der SSLV-Sporen, da diese mit Sporen von B. anthracis

Ames [61] oder B. cereus [336] durchgeführt wurden.

Wie auch immer die tatsächlichen Begebenheiten sein mögen, die Grundlage der Immunoge-

nität von FIS in Ziegen scheint nicht auf BclA zu beruhen, wobei die fehlende Immunogenität

von BclA in diesem Tiermodell für sich genommen Grundlage neuer Experimente sein sollte.

Möglicherweise ist auch die beschriebene Sensitivität dieser und anderer sensibler Spezies auf

diesem Merkmal begründet. Trotzdem sollte die Relevanz von BclA als Antigen innerhalb einer

universell einsetzbaren NLV erhalten bleiben. Die Versuche in NMRI-Mäusen haben deutlich

gezeigt, dass eine additive Schutzwirkung durch den Zusatz von BclA ausgehen kann und dass

diese durch FIS noch verstärkt wird. Allerdings sollte in Anbetracht der überdeckenden Eigen-

schaften von BclA bei einen Zusatz von lebenden oder inaktivierten Sporen die Verwendung

BclA-defizienter Stämme in Erwägung gezogen werden. Davon abgesehen, sollten die Auswir-

kungen unterschiedlicher Präparationsprotokolle für lebende und inaktivierte Sporen sowie die

Verwendung unterschiedlicher Stämme eingehend untersucht werden. Nicht nur die unter-

schiedliche Länge von BclA oder dessen Konzentration auf der Oberfläche könnten eine größe-

re Relevanz haben als bisher angenommen, sondern auch die von Welkos et al. (2001) [352]

beschriebene, möglicherweise auch präparationsbedingte Einlagerung von vegetativen Bestand-

teilen in die Sporenoberfläche.

Eine überlebte Infektion erzeugt ein anderes Titerspektrum als eine Impfung mit der SSLVEine überlebte Infektion erzeugt ein anderes Titerspektrum als eine Impfung mit der SSLV

Neben den bereits beschriebenen Unterschieden für die erste und zweite Immunisierung mit der

SSLV waren auch serologische Unterschiede zur überlebten Infektion mit dem voll virulenten

Stamm SD20 vorhanden. Während die Auffrischungsimpfung mit der SSLV (Gruppe 3b) bei

gleichen anti-rPA83 IgG-Titern in höheren TNA, anti-FIS und anti-vegetativ IgG-Titern resul-

tierte, erzeugte die überlebte Infektion bei Gruppe 3a nur äquivalent hohe anti-rPA83 IgG-Titer

und erhöhte TNA-Titer. Verstärkte Reaktionen gegen FIS und das vegetative Antigen blieben

aus. Die Reaktionen auf das Toxin schien äquivalent zu einer zweiten Immunisierung mit der

SSLV zu sein. Da eine Reaktion auf das Toxin erfolgte, ist davon auszugehen, dass eine Germi-

nation nebst Ausschüttung von Toxinen in den meisten infizierten Tieren, abgesehen von der

frisch revakzinierten Gruppe 3b, stattgefunden haben muss. Um so verwunderlicher ist die

schwache oder gänzlich fehlende Reaktion gegen die Spore und den vegetativen Zellkörper. Die

einfachste generelle Erklärung zu diesem Unterschied wäre schlicht die unterschiedliche Kon-

zentration der Sporen. Während sowohl die SSLV als auch FIS mit einer Dosis von >107 Sporen

164


appliziert wurde, betrug die Infektionsdosis nur ~900 Sporen. Daher wäre es möglich, dass die

immunogene Reaktion auf die zellulären Komponenten, besonders die der Sporenantigene kon-

zentrationsbedingt weitaus geringer ausgefallen ist, sodass sie weniger deutlich sichtbar ist.

Davon abgesehen, scheint als Begründung für die mangelnde Reaktion auf den vegetativen

Zellkörper die Bildung einer Kapsel durch den Infektionsstamm naheliegend. Diese ist nur

wenig immunogen, inhibiert die Phagozytose der vegetativen Zelle und verhindert die Erken-

nung darunter liegender Antigene, sowie die Opsonierung durch das Komplementsystem und

Antikörper [163]. Da der zur Immunisierung verwendete SSLV-Stamm aufgrund des Verlusts

des entsprechenden Plasmids keine Kapsel ausbildet, war im Gegensatz zu Infektion eine Reak-

tion auf den vegetativen Zellkörper bei der Immunisierung uneingeschränkt möglich.

BclA könnte im Ziegenmodell die gleiche Funktion für die Spore einnehmen wie die Kapsel BclA könnte im Ziegenmodell die gleiche Funktion für die Spore einnehmen wie die Kapsel für den vegetativen Zellkörperfür den vegetativen Zellkörper

Lässt man die konzentrationsbedingte Begründung für die Unterschiede außer acht, war die

mangelnde Reaktion auf die Spore zwar unerwartet, aber im Zuge der zuvor erläuterten eventu-

ellen Unterschiede verschiedener Stämme oder/und Präparationen bezüglich der BclA-Filamen-

te plausibel. Sollten strukturelle Unterschiede die Detektionsfähigkeit anderer sporenspezifi-

scher Antigene als BclA bedingen und im schlechtesten Falle gänzlich verhindern, so könnte

die Immunogenität der Spore gänzlich von einer Reaktion auf BclA abhängig sein. Da im vor-

liegendem Fall BclA kaum eine immunogene Wirkung erzeugte, ist die Spore, wie auch der

durch die Kapsel geschützte vegetative Zellkörper, immunologisch inert, wodurch einzig die

Antitoxinwirkung für einen Schutz verbleibt. Sollte dies wirklich innerhalb des Ziegenmodells

Bestand haben, erklärt dies eventuell deren Sensitivität gegenüber dem Erreger, da innerhalb

einer natürlichen Infektion weder die Spore, noch die vegetative Zelle spezifisch erkennbar

wären und deren Beseitigung hauptsächlich auf unspezifischer Phagozytose und der Antitoxin-

wirkung beruhen würde. Diesen Gedanken weiterführend, stellt sich die Frage, inwiefern die

Einbeziehung immunogener Antigene gegen die Spore und das vegetative Antigen sinnvoll ist,

wenn diese nicht zur Beseitigung einer virulenten Infektion beitragen. Sinnvoller erscheint die

Erhöhung der Immunogenität der Kapsel und BclA, um eine bessere Detektion der des Bakteri-

enkörpers zu ermöglichen, was beispielsweise mittels Konjugation dieser an PA erreicht werden

könnte.

165

5. Konklusion und Ausblick

5 Konklusion und Ausblick

Die Ergebnisse dieser Arbeit führten neben der Evaluation neuer Ansätze für eine NLV und

deren Abgleich mit der Sterne Sporen Lebendvakzine (SSLV) zu neuen Erkenntnissen für die

Diagnostik und die Auswertung ähnlicher Versuche. Besonders zukünftige Versuche in Ziegen

und anderen Großtieren könnten durch die beschriebenen Verbesserungsvorschläge reibungslo-

ser ablaufen und eine frühzeitigere Diagnose ermöglichen. So konnte das Auftreten von Bakte-

rien im Blut bei Ziegen in einem Zeitraum von 2 – 5 h vor dem Tod nachgewiesen und, durch

eine praktikablere Blutentnahme mittels Insulinspritze, als geeignetes Diagnosemittel zum

Nachweis einer terminalen Infektion etabliert werden. In Kombination mit der ermittelten Tem-

peraturschwelle von 40,4 °C und optimalen Beobachtungsintervallen sollte eine frühzeitige

Diagnose, nebst aussichtsreicher Behandlung, von 75 % der später versterbenden Tiere möglich

sein.

Überdies konnte ein Zusammenhang zwischen der Entwicklung von Fieber (≥ 40,0 °C) und

den nach der Infektion gemessenen anti-rPA83 IgG-Titern nachgewiesen werden. Demnach

ging eine deutliche Erhöhung der anti-rPA83 IgG-Titer nach der Infektion mehrheitlich mit dem

Auftreten von Fieber einher. Tiere bei denen kein Fieber detektierbar war, zeigten ausnahmslos

keine Titererhöhung gegen rPA83. Unter der Annahme, dass bei einer Infektion ohne Titer- und

Temperaturerhöhung diese schon frühzeitig geklärt werden konnte, lassen sich anhand der Ver-

änderungen der Messwerte Aussagen über die Qualität einer Schutzwirkung treffen. Eine detail-

lierte serologische Analyse der Seren nach der Infektion wird bisher nicht regulär durchgeführt

bzw. ist selten Bestandteil von Publikationen, würde aber eine tiefere Diskriminierung der

Ergebnisse eines Infektionsversuchs erlauben, die bisher nur das Überleben und die überlebte

Zeit bei Verstorbenen in die Auswertung mit einbezieht. Ob dieser Zusammenhang zwischen

erhöhter Temperatur, Titerentwicklung und Verlauf der Infektion auch in anderen Spezies als

der Ziege Gültigkeit hat, muss aber noch gezeigt werden. Beim Nachweis eines generell gülti-

gen Zusammenhangs könnte die Titerveränderung durch die Infektion auch Rückschlüsse auf

die Entwicklung von Fieber erlauben, wenn es spezies- oder situationsbedingt nicht gemessen

werden kann.

Für die Antikörpertiter gegen rPA83 vor der Infektion waren Schwellenwerte erkennbar, die

bei Ziegen und Auszucht-Mäusen mit einer Infektionsdosis von ~1000 Sporen eine Aussage

zum Ausgang der Infektion erlaubten. Nahezu 50 % aller später verstorbenen Ziegen wiesen

einen anti-rPA83 IgG-Titer von < ~550 auf und zeigten maximal eine kurzzeitige Erhöhung der

Temperatur (< 10 h). Alle Ziegen mit höheren Antikörpertitern als 550, die im weiteren Verlauf

starben, wiesen eine unterschiedlich lang anhaltende, erhöhte Temperatur auf. Erst ab einem

anti-rPA83 IgG-Titer von ~3400 überlebten 85 % der infizierten Ziegen, wobei eine eindeutige

166


Zuordnung zu den Überlebenden erst auf Tiere mit einem Titer von mindesten ~20000 zutraf.

Im Mausmodell war ein Schwellenwert von ~30000 prädiktiv für 75 % der Überlebenden,

wobei Tiere mit Titerwerten unterhalb von 800 ausnahmslos verstarben. Damit könnten die

anti-rPA83 IgG-Titer vor der Infektion als prädiktive Diagnosehilfe bei der Infektion verwendet

werden und im Falle der Ziegen zusammen mit der erörterten Temperaturschwelle eine nahezu

vollständige Erfassung aller gefährdeten Tiere ermöglichen.

Eine statistisch belegbare Korrelation der Antikörpertiter innerhalb der einzelnen Gruppen

ergab sich aber nur bei Maus- und Ziegengruppen, die insgesamt sehr niedrige Antikörpertiter

aufwiesen. Erst bei einer gruppenübergreifenden Betrachtung der Titerwerte, unterteilt nach

Spezies und Infektionsdosis ergaben sich aussagekräftige Korrelationen. Damit scheinen für

Ziegen die Antikörpertiter gegen die Spore (exklusive BclA), den vegetativen Zellkörper und

PA für das Überleben von Bedeutung zu sein. In Auszucht-Mäusen war eine Korrelation, in

Abhängigkeit von der Infektionsdosis nur für die anti-rPA83 IgG-Titer vorhanden, wobei

Berechnungen für FIS und das vegetative Antigen aufgrund fehlender Daten nicht durchführbar

waren.

Neben der Analyse der Seren nach der Infektion und dem Hinzuziehen der Titerdaten vor der

Infektion für eine bessere Diagnose, sind weitere Tests zur Verbesserung der Auswertung denk-

bar. Während die Immunreaktion auf die Toxinkomponenten mittels ELISA und TNA quantita-

tiv und qualitativ bestimmt wurde, war für die anti-Sporen Antikörper keine qualitative Ein-

schätzung möglich. Dies könnte durch Messungen der Fähigkeit der anti-Sporen Antikörper zur

Opsonierung von Sporen und deren Einfluss auf die Phagozytoserate von Sporen durch Makro-

phagen erweitert werden [352][351][79][64]. Zudem wäre eine Erfassung der gebildeten

Gedächtniszellen für die Einschätzung der Dauer der Immunität und der entsprechenden Pro-

gnosen zur Schützbarkeit sinnvoll.

Zur Erprobung neuer Ansätze für eine NLV wurden in Mäusen und Ziegen antigenkodierenden

DNA-Vektoren angewendet. Dabei bot die Kombination der erfolgversprechendsten DNA-

Vektoren in Mäusen mit 90 % Überlebenden einen äquivalenten Schutz wie eine analoge Prote-

inkombination und erzeugte bessere Resultate als ähnliche Ansätze mit anderen Vektorkon-

strukten. Trotzdem lagen die gegen die Toxine gebildeten Antikörpertiter der DNA-Vakzinen in

Mäusen weit unter den für die Proteingruppen gemessenen. Für eine weitere Erhöhung der

Immunogenität und Schutzwirkung könnte daher eine separate Applikation der antigentragen-

den Vektoren und eine rein sekretorische Expression der Toxine förderlich sein.

Die Immunogenität von BclA ohne die CLR innerhalb eines DNA-Vektors war von rekombi-

nantem BclA nicht zu unterscheiden. Sowohl innerhalb der DNA-Vektoren als auch in Protein-

form konnten hohe Antikörpertiter gegen BclA in Mäusen erzeugt werden, die innerhalb der

167


DNA-Vektoren bei niedrigerer Infektionsdosis ohne weitere Antigene sogar partiell protektiv

waren (50 %). Da die Überlebenden dieser Gruppen nach der Infektion keinen erhöhten anti-

rPA83 IgG-Titer aufwiesen, ist zudem davon auszugehen, dass die durch BclA vermittelte

Schutzwirkung auf einer sterilen Immunität beruhte.

Die Übertragung der erfolgversprechenden Ergebnisse der Mausversuche mit DNA-Vakzi-

nen auf Ziegen war nicht möglich. Dieselbe Vektorkombination, die in den Mausversuchen eine

Schutzrate von 90 % erzielte, hatte eine kaum nachweisbare immunogene Wirkung in Ziegen.

Auch eine zusätzliche Immunisierung mit den entsprechenden Proteingegenstücken ergab keine

Ergebnisse, die auf eine Zusatzwirkung der DNA-Vakzinen schließen ließen. Daher wurde von

eine Infektion gänzlich abgesehen. Da die Immunisierung der Ziegen i. m. erfolgte und nicht

mittels GeneGun, wie in den Mausversuchen, kann der verminderte Effekt durch die Applikati-

onsart zustande gekommen sein. Zwar wurde innerhalb der Ziegen mit einer höheren Dosis

gearbeitet, diese schien aber den verminderten Effekt durch die veränderte Applikationsart nicht

aufzuwiegen. Neben einer weiteren Erhöhung der Dosis für eine bessere Wirksamkeit und der

Applikation der Vektoren durch GeneGun oder Elektroporation ist auch der Einsatz weiterer

Adjuvanzien denkbar, die die Wirksamkeit von DNA-Vakzinen bei Injektionen unterstützen.

Ausgehend von den Ergebnissen der Mausversuche und ähnlichen Studien in Großtieren [123]

war die niedrige Wirksamkeit der DNA-Vektoren im Ziegenmodell vermutlich nicht auf eine

mangelnde Funktionalität der Vektoren zurückzuführen, sondern auf die Art und Form der

Applikation. Zur vollständigen Klärung der Anwendbarkeit der DNA-Vektoren in Ziegen wären

daher weiterführende Versuche mit entsprechenden Verbesserungen in der Vakzinekomposition

und Applikation notwendig.

Die Erprobung neuer Vakzinekompositionen auf Proteinbasis ergab in Mäusen eine synergeti-

sche Wirkung von rBclA und rPA83 mit einer Schutzrate von 70 %, die durch den Zusatz von

FIS zu einem vollständigen Schutz komplettiert werden konnte. Mit 80 % Überlebenden konnte

die gleiche Komposition, bestehend aus Lipopeptid, rPA83, rBclA und FIS auch in Ziegen eine

ähnliche Schutzrate erzeugen. Damit war die zuvor in mehreren Studien beschriebene Wirk-

samkeit einer Kombination von PA mit Sporenantigenen auch im NMRI-Mausmodell und Zie-

gen bestätigt. Allerdings scheint die immunogene Wirkung von FIS nicht wie bisher ange-

nommen, ausschließlich auf BclA zurückzuführen zu sein und ist mitunter sogar negativ durch

BclA beeinflusst oder zumindest gänzlich unabhängig davon. Hintergrund für diese Annahme

war die unerwartet geringe bis nicht vorhandene Immunogenität von BclA im Ziegenmodell in

Kombination mit einer hohen Immunogenität von FIS.

Das im Mausversuch innerhalb der DNA-Vakzine und als Protein applizierte hoch immuno-

gene BclA erzeugte in Ziegen kaum Antikörpertiter. Durch verschiedene Teilergebnisse war die

168


Anwesenheit von BclA auf FIS und dessen Detektionsfähigkeit durch anti-rBclA Antikörper

bereits nachgewiesen. Da auch eine Kombination von rPA83, rBclA und FIS kaum Antikörper-

titer gegen rBclA erzeugte, war auch für natürliches, auf den FIS befindliches BclA keine nach-

weisliche Wirkung in Ziegen zu finden. In bisherigen Studien mit verschiedenen Mausinzucht-

linien, Kaninchen und Rhesusaffen war die Immunogenität von BclA unstrittig [310][296][39]

[125][195][64][264], sodass die beobachtete Wirkung in Ziegen diese Spezies herausstellt und

womöglich eine Grundlage für neue Erkenntnisse zu deren Sensibilität bietet.

Im Licht dieser Erkenntnis war die hohe immunogene Wirkung von FIS in Ziegen umso

erstaunlicher. Neuere Studien hatten BclA-Filamenten auf Sporen überdeckende Eigenschaften

zugeschrieben, die die Immunogenität anderer, darunter befindlicher Antigene einschränkt [64]

[61][336]. Daher war bei einer abwesenden Reaktion auf BclA nicht mit einer starken immuno-

genen Wirkung durch FIS zu rechnen. Eine Erklärung, die beiden Erkenntnissen gerecht wird,

wäre eine präparationsbedingte Beschädigung der BclA-Filamente oder des Exosporiums in

FIS-Präparaten, die zur Freilegung sonst verdeckter Antigene führt. Dies hätte entsprechende

Konsequenzen für alle Präparationsprotokolle mit Sporen, da kleine unprotokollierte Eigen-

schaften, wie das Alter der Kultur, die Anzahl der Waschschritte, die Lagerung und Handha-

bung einen verstärkten Einfluss auf die Wirksamkeit des Präparats haben könnten. Dies beträfe

neben FIS Präparationen auch Sporensuspensionen zur Infektion und Immunisierung und könn-

te mitunter auftretende Fluktuationen der Schutzrate, Infektiösität oder Wirkung erklären.

Alternativ wäre auch eine Überdeckung der BclA-Filamente denkbar, die möglicherweise

abhängig von der Länge und Dichte der Filamente einen flexiblen Zugang zu den darunter lie-

genden Antigenen erlaubt. Da die Länge der BclA-Filamente stammspezifisch variiert, ergäben

sich entsprechende graduelle Unterschiede, die eventuell besonderen Einfluss auf Spezies

haben könnten, die nicht auf BclA reagieren. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass

sich gerade die SSLV, die auch zur Produktion von FIS in dieser Arbeit verwendet wurde, durch

die längsten bisher vermessenen BclA-Filamente auszeichnet [311], was dessen besondere Eig-

nung als Lebendvakzine beeinflusst haben könnte. Eine genaue Aufklärung dieser Mechanis-

men und deren Implikationen für die Vergleichbarkeit von Studien mit verschiedenen Sporen-

präparaten sollte Bestandteil zukünftiger Studien sein.

Ungeachtet der Hintergründe der Reaktion von Ziegen auf BclA und FIS konnte sowohl in

Ziegen als auch in Mäusen gezeigt werden, dass die zusätzliche Schutzwirkung von FIS nicht

allein und nicht hauptsächlich auf BclA beruht. In Kombination mit den überdeckenden Eigen-

schaften BclAs und der vorhandenen Immunogenität anderer sporenspezifischer Antigene

scheint daher die Verwendung von FIS ohne BclA für weitere Vakzinekompositionen sinnvoller.

Zur Erhöhung der Immunogenität von BclA in Ziegen und eventuell ähnlich reagierenden Tie-

ren wären zudem Konjugationsversuche in Anlehnung an die Konjugationsversuche der Kapsel

169


denkbar. Ein genereller Zusatz von rekombinantem BclA zu einer universell einsetzbaren Vak-

zineformulation hätte aber auch ohne dessen Verbesserung weiterhin Bestand, da es in diversen

Spezies hoch immunogen ist und in diesen zur Schutzwirkung beitragen kann.

Ebenso sollten weiterhin Untersuchungen zur Konjugation der Kapsel und der Integration

dieses Antigens in eine NLV unternommen werden. Die Dysfunktionalität des hier getesteten

Kapselkonjugats war vermutlich einem Epitop des konjugierten Lipopeptids geschuldet. In

Anlehnung an andere Studien [256][273][50] wäre daher eine Konjugation der Kapsel, und

weiterführend auch BclA, an PA eine sinnvolle Alternative.

Im Zusammenhang mit der beobachteten, extrem unterschiedlichen Wirkung von BclA in

NMRI-Mäusen und Ziegen sollte die Wahl des Tiermodells zur Testung von Vakzinekomponen-

ten kritisch betrachtet werden. Die Verwendung von Mausinzuchtlinien zur Testung einer brei-

ten Auswahl an potentiellen Vakzinekomponenten hat neben den praktischen Gründen auch den

Vorteil, diese, aufgrund der genetischen Ähnlichkeit, in einer Gruppe möglichst gleichförmig

reagierender Individuen zu erproben. Dennoch ist hinlänglich bekannt, dass die Sensitivität

gegenüber einer Infektion mit B. anthracis und entsprechend die Schützbarkeit speziesbedingt

stark variiert [354][353]. Zudem konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch in der Reak-

tion auf ein Antigen starke Unterschiede auftreten können. Entsprechend sind eindeutige

Schlussfolgerungen aus Vorversuchen mit anderen Spezies als der Zielspezies bedenklich. Die

Entscheidung über den Ein- oder Ausschluss eines Antigens als potentielle Komponente einer

Vakzineformulation sollte daher nicht auf Grundlage von Vorversuchen in Spezies getroffen

werden, die aufgrund der Durchführbarkeit der Versuche ausgewählt wurden. Eine solche Aus-

wahl könnte zur Exklusion für die Zielspezies wichtiger Antigene führen, weil diese in den Vor-

versuchen mit anderen Spezies unreaktiv waren und vice versa. Entsprechend sollten vorberei-

tende Versuche in anderen Spezies nur verwendet werden, um graduelle Unterschiede ähnlicher

Formulationen oder Kombinationen von Komponenten, deren Wirksamkeit in der Zielspezies

belegt ist, zu evaluieren.

Zusammenfassend war die Testung der NLV, bestehend aus rPA83, rBclA, FIS und Lipopep-

tid mit einer Schutzrate von 80 % sehr erfolgversprechend, kann aber noch weiter verbessert

werden.

Hintergrund für Testung neuer NLV waren die bekannten Defizite der SSLV als favorisierte

Veterinärvakzine gegen B. anthracis. Neben der Unvereinbarkeit einer antibiotischen Behand-

lung mit der Applikation einer wirksamen Lebendvakzine stand vor allem die beschriebene

Restvirulenz in sensiblen Tierarten wie Ziegen und Lamas im Fokus. Dabei beruhen die meis-

ten Beschreibungen zur Restvirulenz der SSLV auf Erfahrungswerten und sind, mit wenigen

Ausnahmen, nicht publiziert. In den hier durchgeführten Versuchsgruppen mit der SSLV traten

170


keine adversen Effekte auf. Allerdings kam es durch verschiedene Nebeninfektionen zu Tier-

verlusten, was unter Umständen auch der Immunisierung mit der SSLV hätte zugeschrieben

werden können. Daher wäre es prinzipiell möglich, dass die beschriebene Restvirulenz der

SSLV eher durch latente Nebeninfektionen oder einen generell schlechten Gesundheitszustand

der Tiere bedingt wird, als durch die Immunisierung selbst.

Generell blieb bei allen Immunisierungen mit der SSLV und auch bei den Tieren, die eine

Infektion mit voll virulenten Sporen überlebten, analog zu den NLV, eine Reaktion gegen rBclA

aus. Damit konnten neben inaktivierten Sporen und rekombinantem BclA auch mittels intakter

Sporen keine nennenswerten anti-rBclA Antikörpertiter erzeugt werden. Analog zu den Erfah-

rungen mit FIS konnte auch die SSLV deutliche Antikörpertiter gegen FIS erzeugen, wobei dies

nach einer zweiten Immunisierung noch gesteigert wurde. Erstaunlicherweise hatte die Infekti-

on mit einem voll virulenten Stamm keinen Effekt auf die anti-FIS Antikörpertiter. Dies könnte

auf die in der Infektion verwendete, verhältnismäßig geringe Sporenzahl (~103) im Vergleich

zur SSLV (107) zurückzuführen sein oder mit den zuvor beschriebenen Ursachen durch die

Anwesenheit von BclA begründet werden.

Für einen Teil der insgesamt 15 Tiere, die mit der SSLV immunisiert wurden, zeigte die

Erstimmunisierung nur einen geringen bzw. keinen nachweisbaren Effekt, was sich teilweise

auch in einer verminderten Schutzrate widerspiegelte. Auch innerhalb anderer Studien und bei

der Immunisierung von anderen Spezies wurde eine individuell verminderte Wirksamkeit der

SSLV ohne Angabe von Gründen bereits beschrieben [266][280][228]. Daher scheint zumindest

für die betreffenden Spezies eine Veränderung des Impfplans, der erst nach einem Jahr eine

weitere Immunisierung vorsieht, sinnvoll. Demnach sollte eine gedoppelte Erstimmunisierung

gefährdeter Tiere in einem Abstand von 1 – 2 Wochen vorgenommen werden, um langsam rea-

gierenden oder unreaktiven Tieren bis zur Revakzinierung ebenfalls einen Schutz zu vermitteln.

Entsprechend der vorhandenen Richtlinien [357] könnte die erste der beiden Immunisierungen

auch nur mit einer verminderten Dosis vorgenommen werden, um adversen Reaktionen in sen-

sitiven Tierarten vorzubeugen.

Auch die potentielle Schutzdauer der SSLV von 9 – 12 Monaten und die damit verbundene

Notwendigkeit von jährlichen Auffrischungen wurde in dieser Studie näher betrachtet. Durch

eine funktionierende Erstimmunisierung konnte in den meisten Tieren ein hoher anti-rPA83

IgG-Titer und TNA-Titer erzeugt werden, der sich im Verlauf der folgenden 3 – 4 Monate auf

ein Niveau absenkte, das signifikant höher als das naiver Tiere lag. Dieses Niveau blieb auch

bis zur Revakzinierung bzw. Infektion nach einem Jahr erhalten. Darüber hinaus waren Tiere

ohne Revakzinierung auch nach einem Jahr noch signifikant geschützt. Die Annahme, dass die

Schutzdauer nach dem Ablauf eines Jahres rapide abnimmt, konnte jedoch nicht gestützt wer-

den. Die beobachteten Einzelfälle, bei denen ein Schutz nach einem Jahr nicht mehr gegeben

171


war, könnten zudem gerade diejenigen Tiere betreffen, die wenig oder gar nicht auf die Erstim-

munisierung reagiert haben. Damit wäre deren Schützbarkeit, wie in Gruppe 2 deutlich gezeigt

wurde, bereits direkt nach der ersten Immunisierung fraglich und hätte nichts mit der Schutz-

dauer einer sonst immunogene Impfung mit der SSLV zu tun. Wie lange daher die Schutzwir-

kung der Erstimmunisierung anhält, wenn diese immunogen war, und inwiefern die Schutzdau-

er bei einer Revakzinierung denselben Verlauf zeigt, bleibt offen.

Nachweislich hatten die nach einem Jahr revakzinierten Tiere ein anderes Antikörpertiter-

spektrum als nach der Erstimmunisierung. So waren zwar die anti-rPA83 IgG-Titer im gleichen

Maße erhöht wie bei der Erstimmunisierung, zeigten aber deutlich höhere neutralisierende

Eigenschaften. Zudem waren nach der Revakzinierung weitaus höhere anti-FIS und -vegetativ

IgG-Titer messbar, die nach der Erstimmunisierung nicht oder kaum vorhanden waren. Auf-

grund des deutlichen Unterschieds beider Vakzinierungen könnte potentiell eine stärkere

oder/und länger andauernde Schutzwirkung nach der Revakzinierung vorliegen. Sollte dies in

weiteren Studien bestätigt werden, wäre an dieser Stelle ebenfalls über eine Veränderung des

bisherigen Impfplans nachzudenken, da die zusätzliche Wirkung der Revakzinierung in gefähr-

deten Tieren möglichst früh anzustreben wäre. Entsprechend der hier gezeigten Wirkungslosig-

keit einer Impfung mit lebenden Sporen bei noch erhöhten Antikörpertitern, wie bei der Infekti-

on der frisch revakzinierten Gruppe 3b gesehen, sollte eine Revakzinierung frühstens 3 – 4

Monate nach der Erstimmunisierung erfolgen. Ab diesem Zeitpunkt waren die Antikörpertiter

der immunisierten Tiere auf einem leicht erhöhten, unveränderlichem Niveau.

Auf Grundlage der aufgeführten Ergebnisse wäre zusammenfassend in weiterführenden Ver-

suchen ein verkürzter Impfplan für die SSLV mit einer gedoppelten Erstimmunisierung und

einer Revakzinierung nach 3 – 4Monaten in Ziegen oder andern sensitiven Spezies auszutesten.

Zudem sollte hierbei auch die absolute bzw. maximale Dauer der Schutzwirkung nach der

Revakzinierung festgestellt werden, da Grund zur Annahme besteht, dass weitere Immunisie-

rungen obsolet sein könnten wenn Erstimmunisierung und Revakzinierung funktional waren.

Bei einer Bestätigung dieser Annahme würde eine entsprechende Anpassung des Impfplans die

Handhabung und Anwendbarkeit der SSLV verbessern und potentielle Verluste durch nachlas-

sende oder unvollständige Immunität von Einzeltieren vermindern. Zudem sollte auch im Hin-

blick auf die beschriebene Unwirksamkeit von BclA die Anwendung einer BclA-defizienten

SSLV erprobt werden, da die beschriebenen Vakzinierungsausfälle oder/und die Restvirulenz

potentiell auch auf die Anwesenheit von BclA auf Sporen zurückzuführen sein könnten.

Abschließend könnte die in dieser Arbeit erfolgreich erprobte Protein-basierende NLV oder dar-

auf aufbauende Nachfolger als alternative Immunisierungen innerhalb des Impfplans der SSLV

erprobt werden. Unter Bedingungen, die den Einsatz der SSLV nicht zulassen, beispielsweise

bei einer bestehenden antibiotischen Behandlung oder bei Bedenken zum Einsatz der SSLV in

172


sensitiven Tierarten, könnte die Erstimmunisierung mit der Protein-basierenden NLV vorge-

nommen werden. Bei der Anwendung einer gedoppelten Erstimmunisierung wäre sogar gene-

rell in sensitiven Tierarten oder Tieren mit ungewissem Gesundheitszustand eine vorbereitende

Impfung mit der Protein-basierenden NLV denkbar, die dann nach 1 – 2 Wochen mit der Injek-

tion der SSLV komplettiert wird. Weiterführende Revakzinierungen könnten je nach Bedarf mit

einer der beiden Vakzinen fortgeführt werden. Bei einem entsprechenden Nachweis der Funk-

tionalität einer solchen kooperativen Anwendung könnten die positiven Aspekte beider Immu-

nisierungen genutzt werden, ohne in Konkurrenz zueinander zu stehen.

173

6 Anhang

6.1 Sequenzen

BclAD1D3

gcatttgaccctaatcttgtaggacctacattaccaccgataccaccatttacccttcctaccggaccatccggactaggacttccagcagg

actatatgcatttaactccggtgggatttctttagatttaggaattaatgatccagtaccatttaatactgttggatctcagtttggtacagcaattt

ctcaattagatgctgatactttcgtaattagtgaaactggattctataaaattactgttatcgctaatactgcaacagcaagtgtattaggaggtc

ttacaatccaagtgaatggagtacctgtaccaggtactggatcaagtttgatttcactcggagcacctatcgttattcaagcaattacgcaaat

tacgacaactccatcattagttgaagtaattgttacagggcttggactatcactagctcttggcacgagtgcatccattattattgaaaaagttg

cttaa

PA83

gaagtaaagcaagagaaccgtctgctgaacgaatctgaatccagctctcagggcctgcttggttactatttctctgacctgaacttccaagca

ccgatggttgtaaccagctctaccactggcgatctgtccatcccgtctagtgaacttgagaacattccaagcgagaaccagtatttccagtct

gcaatctggtccggttttatcaaagtcaagaaatctgatgaatacacgtttgccacctctgctgataaccacgtaaccatgtgggttgacgatc

aggaagtgatcaacaaagcatccaactccaacaaaattcgtctggaaaaaggccgtctgtatcagatcaagattcagtaccaacgcgagaa

cccgactgaaaaaggcctggactttaaactgtattggactgattctcagaacaagaaagaagtgatcagctctgacaatctgcaactgccgg

aattgaaacagaaaagctccaactctcgtaagaaacgttccaccagcgctggcccgaccgtaccagatcgcgacaacgatggtattccgg

actctctggaagttgaaggctacacggttgatgtaaagaacaaacgtaccttccttagtccgtggatctccaatattcacgagaagaaaggtc

tgaccaaatacaaatccagtccggaaaaatggtccactgcatctgatccgtactctgactttgagaaagtgaccggtcgtatcgacaagaac

gtctctccggaagcacgccatccactggttgctgcgtatccgatcgtacatgttgacatggaaaacatcattttgtccaagaacgaagacca

gtccactcagaacactgactctgaaactcgtaccatctccaagaacacctccacgtctcgtactcacaccagtgaagtacatggtaacgctg

aagtacacgcctctttctttgacatcggcggctctgttagcgctggcttctccaactctaattcttctactgttgccattgatcactctctgagtct

ggctggcgaacgtacctgggcagagaccatgggtcttaacactgctgataccgcgcgtctgaatgctaacattcgctacgtcaacactggt

acggcaccgatctacaacgtactgccaaccaccagcctggttctgggtaagaaccagactcttgcgaccatcaaagccaaagagaacca

actgtctcagattctggcaccgaataactactatccttccaagaacctggctccgatcgcactgaacgcacaggatgacttctcttccactcc

gatcaccatgaactacaaccagttcctggaacttgagaagaccaaacagctgcgtcttgacactgaccaagtgtacggtaacatcgcgacc

tacaactttgagaacggtcgcgtccgcgttgacacaggctctaattggtctgaagtactgcctcagattcaggaaaccaccgctcgtatcatc

ttcaacggtaaagacctgaacctggttgaacgtcgtattgctgctgtgaacccgtctgatccattagagaccaccaaaccggatatgactctg

aaagaagccctgaagatcgcctttggcttcaacgagccgaacggtaatcttcagtaccaaggtaaagacatcactgaatttgacttcaacttt

gatcagcagacctctcagaatatcaagaaccaactggctgagctgaacgcgaccaatatctatacggtactcgacaagatcaaactgaacg

cgaaaatgaacattctgattcgcgacaaacgtttccactacgatcgtaataacatcgctgttggcgctgatcaatctgttgtgaaagaagcgc

atcgcgaagtcatcaactccagcaccgaaggcctgcttctgaacatcgacaaagacattcgtaagatcctgtctggttacattgttgagatcg

aagacaccgaaggcctgaaagaagtgatcaatgatcgttacgacatgctgaacatcagctctctgcgtcaagatggtaagacgttcattga

cttcaagaaatacaacgacaaacttccgctgtatatctctaatccgaactacaaagtgaacgtttacgctgttaccaaagagaacaccatcat

caatccatctgagaacggcgatacctctaccaacggtatcaagaagattctgatcttctccaagaaaggttacgagatcggttaa

I

6.2 Versuchsdurchführung

II

Abbildung 58: GeneGun Patronenverschuss

Probeverschuss der für die GeneGun Immunisierung verwendeten Patronen derMausgruppen auf Filterpapier

Tabelle 53: Probennahmepunkte Ziegenversuch (Südafrika)

Immunisierungszeitpunkte, Blutungen, Transport zum Infektionsort und Infektionszeitpunkt aller Ziegengruppen (Südafrika); Probennahme 10 war geplant konnte aber nicht durchgeführtwerden

Gruppe1 2 3 4 naive 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15

1 0,0 - - - 2,0 0,0 3,6 7,6 11,6 15,6 19,6 23,6 27,6 31,6 36,7 47,6 52,6 56,9 61,6 - 61,7

2 0,0 - - - 2,0 0,0 6,0 - - - - - - - - - - - - 6,1

3a 0,0 - - - 2,0 0,0 3,6 7,6 11,6 15,6 19,6 23,6 27,6 31,6 36,7 47,6 52,6 56,9 61,6 61,7

3b 0,0 58,4 - - 2,0 0,0 3,6 7,6 11,6 15,6 19,6 23,6 27,6 31,6 36,7 47,6 52,6 56,9 61,6 61,7

4 0,0 3,0 6,0 - 1,3 0,0 2,9 4,9 8,1 10,3 - - - - - - - - - - 10,4

5 0,0 3,0 6,0 14,7 - 0,0 3,0 6,0 9,0 14,7 16,7 - - - - - - - - - -

6 0,0 3,0 6,0 - 1,3 0,0 2,9 4,9 8,1 10,3 - - - - - - - - - 10,4

LK 0,0 - - - 2,0 11,3 - - - - - - - - - - - - - - 11,3

NK - - - - 0,7 9,9 - - - - - - - - - - - - - - 9,9

Immunisierunga

TransportbProbennahmen (Blut)a

Infektiona

8,0c

63,6c

63,6c

11,6c

a in Wochen nach erster Immunisierung (für die Negativgruppe gilt die Immunisierung von Gruppe 3a/b)

b in Wochen vor Infektion

c Blutprobennahme nach Überleben der Infektion

Tabelle 54: Probennahmepunkte Ziegenversuch (Türkei - Wiederholungen)

Immunisierungszeitpunkte, Blutungen und Infektionszeitpunkt aller Ziegengruppen (Türkei)

Gruppe1 2 3 naive 1 2 3

4 (W) 0,0 3,3 6,0 0,0 3,3 6,0 11,0 13,1 11,0

6 (W) 0,0 3,3 6,0 0,0 3,3 6,0 11,0 13,1 11,0

NK (W) - - - 0,0 3,3 6,0 -

Immunisierunga Probennahmen (Blut)a

Infektiona

4c

10,4 (11,0)b 10,4 (11,0)b

a in Wochen nach erster Immunisierung (für die Negativgruppe gilt die Erstimmunisierung von Gruppe 4 und 6)

b Zeitpunkt leicht unterschiedlich, da in 2 Etappen infiziert wurde

c Blutprobennahme nach Überleben der Infektion

Tabelle 56: Ziegenversuche (Südafrika), diagnostische Daten

Temperatur- und Verhaltensdaten aller Versuchstiere während der Infektion; Angegebene Zeitintervalle der Messpunkte sind in Stunden nach Infektion (hpi) aufgeführt; Verstorbene Individuen sind mit orange unterlegt,Überlebende entsprechend mit grün; Gelb unterlegt sind Zeitpunkte für positive Blutausstriche vor dem Eintreten des Todes (grau hinterlegt); Rot und dick hervorgehoben sind Zeitpunkte an denen erstmals eineVeränderung des Verhaltens (gewöhnlich Verlust des Appetits) festgestellt wurden; NK – Negativkontrolle; LK – Lipopeptidkontrolle; G – Gruppe; T – teilnahmslos; A – Appetitverlust

hpi 0 3 7 9 17 19 21 24 30 33 34 36 38 40 42 43 45 46 48 50 51 52 53 54 55 57 58 63 64 65 66 67 68 69 71 72

NKII 38,6 38,9 38,5 38,0 38,7 37,7 37,8 37,7 38,6 38,6 37,2 36,3 T 37,3

VI 38,0 38,8 37,5 37,6 38,4 38,1 37,7 39,1 38,6 38,4

LK8202 37,7 38,0 39,3 39,5 39,4

8203 37,5 36,5 38,2 38,7 38,2 38,0 37,2 37,2 37,3 39,2 40,5 40,0

G18185 39,0 40,1 40,6

8187 38,9 38,8 38,8

G2

8210 38,5 38,0 38,3

8211 38,7 38,2 38,4

8212 38,8 40,4 37,9

8213 39,0 37,6

8214 39,3 39,4 38,2

G3a

8172 38,7 38,4 38,5

8173 38,5 40,1 39,8

8176 38,6 37,8 38,2

8178 38,8 38,0 40,5

8180 38,5 38,7 38,6

G3b

8175 38,5 38,0 38,1

8181 39,0 38,1 38,1

8182 39,0 38,1 38,6

G4

8188 39,2 38,0 41,6 39,4

8190 39,5 38,1 41,6 41,4

8192 39,0 38,1 40,4

8198 39,4 38,1 A 40,4 39,7

8199 40,8 37,6 A 40,6 37,7

G6

8191 38,8 38,1 40,1

8194 39,4 38,0 A 41,5

8195 39,3 37,6 41,5 40,8

8200 39,3 37,2 39,3 37,6 37,7

8201 40,4 37,8 A 41,1 40,1

Tabelle 55: exemplarische Temperaturerhebung in naiven Ziegen (Südafrika)

rektale Temperaturen der Gruppe 1, in Wochen nach der Erstimmunisierung mit PBS

Ziegen W ochen nach Erstimmunisierung

Nr. 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

8185 39,1 39,5 39,2 39,2 39,5 39,6 39,5 39,5 39,2 39,2 38,4 39,1 39,3 38,8

8186 39,5 39,5 39,3 39,4 39,4 39,5 39,3 38,7 38,7 38,7 38,1 38,5 39,3 38,7

8187 39,3 38,8 38,9 39,2 39,2 39,3 39,1 39,2 39,1 39,1 37,4 38,3 39,4 38,6

Tabelle 56: Ziegenversuche (Südafrika), diagnostische Daten Part 2 (76 – 336 hpi)

Temperatur- und Verhaltensdaten aller Versuchstiere während der Infektion; Angegebene Zeitintervalle der Messpunkte sind in Stunden nach Infektion(hpi) aufgeführt; Verstorbene Individuen sind mit orange unterlegt, Überlebende entsprechend mit grün; Gelb unterlegt sind Zeitpunkte für positiveBlutausstriche vor dem Eintreten des Todes (grau hinterlegt); Rot und dick hervorgehoben sind Zeitpunkte an denen erstmals eine Veränderung desVerhaltens (gewöhnlich Verlust des Appetits) festgestellt wurden; NK – Negativkontrolle; LK – Lipopeptidkontrolle; G – Gruppe; T – teilnahmslos;A – Appetitverlust

hpi 76 77 83 84 93 96 98 103 111 120 129 132 144 150 153 168 183 192 216 240 241 264 288 312 336

NKII

VI

LK8202

8203

G18185

8187

G2

8210 38,7 38,0 38,6 38,3 37,6 37,9 38,4 38,4 38,6 38,4 38,7

8211 41,2 39,6 41,4 41,4

8212 38,6 38,3 38,8 38,6 37,7 37,4 38,0 38,8 38,8 38,0 38,0

8213

8214 38,6 38,0 38,5 38,5 37,4 37,4 38,6 38,2 38,3 38,0 38,0

G3a

8172 38,4 38,0 38,5 38,4 38,2 37,7 38,3 37,7 38,9 38,2 37,2

8173 38,6 37,8 40,0 38,4 37,5 37,3 37,7 37,7 37,8 36,2 36,9

8176 38,1 38,8 38,5 38,2 37,8 38,2 37,9 38,5 37,6 37,5 37,4

8178 39,2 37,7 38,1 38,4 38,0 37,8 37,5 38,5 38,6 38,0 38,0

8180 39,0 39,3 40,6 41,5 40,4 40,2 40,4

G3b

8175 38,4 37,9 39,0 38,1 37,3 37,3 37,9 38,0 38,6 37,4 37,5

8181 38,3 38,7 38,2 38,2 38,5 37,2 38,0 39,1 38,4 38,4 37,2

8182 38,0 38,3 38,2 38,3 37,5 37,7 37,8 38,5 37,9 37,3 38,0

G4

8188

8190

8192

8198

8199

G6

8191 40,8

8194

8195 40,4

8200 38,2 36,6 39,0 38,2 38,7 38,0

8201

Tabelle 57: Ziegenversuche (Türkei), diagnostische Daten

Temperatur- und Verhaltensdaten aller Versuchstiere während der Infektion; Angegebene Zeitintervalle der Messpunkte sind in Stunden nach Infektion (hpi) aufgeführt; Verstorbene Individuen sind mit orange unterlegt oder rot, wenn diese behandelt wurden und überlebten, Überlebende entsprechend mit grün; Gelb unterlegt sind Zeitpunkte für positive Blutausstriche vor dem Eintreten des Todes (grau hinterlegt); Rot und dick hervorgehoben sind Zeitpunkte an denen erstmals eine Veränderung des Verhaltens (gewöhnlich Verlust des Appetits) festgestellt wurden; N – Negativkontrolle; G – Gruppe; A – Appetitverlust; B (blau) – Behandlung

hpi 0 16 19 25 40 43 49 51 54 55 60 64 66 67 69 70 75 88 114 122 138 140 162 170 186 189 194 210 218 234 258 282 306 330 354 359

NK (W)

96163 39,5 39,6 39,5 39,1 40,5 39,7 40,5

97014 38,8 38,9 38,9 39,3

97015 39,5 39,5 39,4 39,4 38,9 38,9 38,9

kk 40,0 39,1 38,0 39,0 39,1 39,7 39,8 40,2 40,7 41,1

G4 (W)

97013 38,9 38,7 39,2 39,1 38,9 41,2 41,1 41,4 A 39,7

99348 38,9 38,4 39,5 39,5 39,5 39,0 38,2 39,0 41,2 41,5 A 41,3 B 41,5 41,3 39,9 39,5 38,6 38,5 38,9 38,6 38,2

580315 38,7 38,1 38,8 39,0 38,6 39,2 38,9 38,1 38,7 38,3 38,5 39,0 40,0 38,3 38,6 38,5 38,3 38,3 B

580319 39,1 38,6 41,3 40,9 A

627398 38,9 38,1 39,2 41,2 A 41,0 B 38,2 40,2 36,1 38,3 38,9 38,6 38,5 38,5 38,7 38,4 38,5 39,5 39,0

627399 39,6 39,4 39,3 39,1 38,8 39,3 39,0 38,7 38,9 38,8 38,4 39,0 38,4 39,1 39,3 39,0 39,8 39,3 B

728761 38,1 38,0 38,3 38,9 38,2 38,6 37,9 38,4 41,0 41,0 39,8 38,4 38,3 38,3 38,4 37,9 38,4 38,0 B

Gk 39,0 38,1 38,0 38,8 38,2 38,7 38,5 38,2 37,9 37,8 37,8 38,2 38,3 38,4 37,9 38,2 38,4 38,5 B

G6 (W)

96139 39,4 38,4 39,0 38,8 41,3 40,5 39,9 38,7 39,4 38,4 38,0 38,4 38,6 38,6 37,6 38,1 38,7 38,2 B

96157 39,1 39,1 39,3 39,0 39,1 39,0 38,4 38,7 38,7 38,7 38,4 38,6 38,3 39,1 38,7 38,3 38,8 38,6 B

97162 39,7 39,3 41,1 41,5 41,6 41,2 40,7 39,4 39,4 39,2 39,2 39,2 39,0 39,3 39,0 38,9 39,0 38,8 B

580316 39,1 38,9 38,7 38,8 37,9 38,7 38,0 38,0 38,0 38,3 38,2 38,9 38,8 38,9 39,1 38,4 38,7 38,7 B

627395 38,6 39,0 40,9 41,5 41,6 41,5 41,3 41,5

627396 40,1 40,1 41,1 41,0

728758 38,9 39,1 39,5 39,3 38,7 38,9 38,6 38,7 38,6 38,6 38,4 39,0 39,0 38,8 38,8 38,7 38,5 39,1 B

729278 38,6 38,7 39,1 39,0 38,3 39,1 39,0 39,0 38,3 38,4 38,4 38,7 38,5 38,9 38,6 38,6 38,8 39,1 B

729277 39,0 38,4 39,1 39,3 38,5 39,1 39,1 38,9 38,6 38,3 39,2 40,4 40,8 40,0 40,0 40,6 40,3 39,8 B

729284 39,7 39,2 39,1 39,5 39,0 39,1 39,4 38,7 41,1 40,8 40,1 39,8 39,1 38,7 38,2 38,4 38,5 38,3 B

VII

Tabelle 58: Zusammenhänge von Antikörpertitern undSchutz (Mäuse)

Auftragung aller 90 infizierten Tiere mit Einzelmessungen fürdie anti-rPA83 IgG Titer, unterteilt nach Infektionsdosis inaufsteigender Reihenfolge ihrer anti-rPA83 IgG-Titer

Infektionsdosis: ~1000 Sporen Infektionsdosis: ~2000 Sporen

Gruppe Maus anti-rPA83 Gruppe Maus anti-rPA83

Nr. Nr.

TA 12 0 LBP 23 143515

TA 13 0 LBCOP 54 172408

TA 14 0 LBCP 27 180363

TA 15 0 LBCP 29 180363

TA 20 0 LBP 24 213333

TA 11 0 LBCOP 56 214204

NS 8 800 LBCP 30 226909

TH 27 800 LBCOP 48 256000

TA 16 1600 LBCP 32 308363

TA 18 2096 LBP 18 310303

NS 5 2610 LBP 22 310303

TH 30 4342 LBCP 31 349090

TA 19 4855 LBP 19 364606

NS 9 4884 LBCOP 49 381387

NS 2 6400 LBCOP 51 381387

NS 10 10778 LBCP 26 407272

TA 17 12800 LBP 25 411151

TH 23 12800 LBCOP 53 412734

TKS 274 15872 LP 41 414254

NS 4 16168 LP 38 432872

TH 24 19657 LBCOP 50 433632

TH 25 21028 LBCP 33 442181

NS 7 21557 LP 37 442181

NS 1 21557 LBCOP 47 454530

TKS 277 27136 LBCP 28 471272

TH 28 28342 LBP 20 473212

TKS 276 29696 LBP 16 496484

TKS 287 32768 LP 43 512000

TH 22 37485 LP 44 512000

NS 6 45810 LBCOP 52 512000

TH 21 51200 LBP 17 589575

TH 26 56685 LP 40 623709

TKS 292 58122 LP 42 623709

TKS 286 76800 LP 39 660945

TKS 275 81920 LP 36 660945

TKS 288 81920 LBCP 34 663272

TKS 281 82286 LP 45 735418

TH 29 84114 LBCP 35 768000

NS 3 94315 LBP 21 837818

TKS 289 113633 LBCOP 46 1191183

NCP 59 122181

NCP 60 197818

NCP 65 256000

NCP 58 256000

NCP 62 256000

NCP 57 350000

NCP 64 350000

NCP 61 453818

NCP 63 512000

NCP 66 512000

IgG-Titera IgG-Titera

a direkt vor der Infektion

VIII

Tabelle 59: Test auf pTBC

exemplarischer Test der Seren Vor der Impfungund/oder vor der Infektion auf pTBC; +/- gebenan ob der Test positiv ausgefallen ist, bei ? warder Test inkonklusiv; alle nicht aufgeführten Serenwurden nicht getestet

Gruppe Probenzeitpunkt pTBC-Test

II NK vor Infektion +

VI NK vor Infektion +

8202 LK vor Infektion +

8203 LK vor Infektion -

8185 1 Negativserum -

1 Negativserum +

8187 1 Negativserum +

8172 3a Negativserum +


3b Negativserum +

8175 3b Negativserum +


8178 3a Negativserum ?

3b Negativserum ?




8188 4Negativserum +

vor Infektion +

8190 4Negativserum -

vor Infektion -


vor Infektion -


vor Infektion -


vor Infektion +


vor Infektion -

8194 6Negativserum ?

vor Infektion +

8195 6Negativserum +

vor Infektion +


vor Infektion ?


vor Infektion -

Ziegen Nr.

8186a

8174a

8179a

a waren mit der Herzwasserkrankheit infiziert

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IX

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XXVII

Eidesstattliche Versicherung gemäß § 7 Absatz 7 der Promo-tionsordnung der Universität Hohenheim zum Dr. rer. nat.

1. Bei der eingereichten Dissertation zum Thema „ Entwicklung und Testung neuer DNA-

und Protein-basierter Multikomponentenvakzinen, sowie regulatorischer Adjuvanzien gegen

eine Infektion mit B. anthracis in Auszucht-Mäusen und Ziegen“ handelt es sich um eine eigen-

ständig erbrachte Leistung.

2. Ich habe nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und mich keiner unzuläs-

sigen Hilfe Dritter bedient. Insbesondere habe ich wörtlich oder sinngemäß aus anderen Werken

übernommene Inhalte als solche kenntlich gemacht.

3. Ich habe nicht die Hilfe einer kommerziellen Promotionsvermittlung oder -beratung in

Anspruch genommen.

4. Die Bedeutung der eidesstattlichen Versicherung und der strafrechtlichen Folgen einer

unrichtigen oder unvollständigen eidesstattlichen Versicherung sind mir bekannt.

Die Richtigkeit der vorstehenden Erklärung bestätige ich: Ich versichere an Eides statt, dass ich

nach bestem Wissen die reine Wahrheit erklärt und nichts verschwiegen habe.

------------------------------- -----------------------------------

Ort und Datum Unterschrift

XXVIII

Lebenslauf

Name: Susanne Melanie Köhler

Geboren: 18.04.1981 in Eisenach

Eltern: Barbara und Andreas Köhler

SCHULAUSBILDUNG

Realschulabschluss: 1987 – 1997

Schule: Wartburgschule (Eisenach)

Note: 1,1

Auslandsaufenthalt (USA): 1998 – 1999

Schule: Shell-Rock High School (Waverly, Iowa)

Abitur: 1998 – 2001

Schule: Ernst-Abbe-Gymnasium (Eisenach)

Note: 1,3

STUDIUM

Georg-August-Universität Göttingen von 2001 bis 2007

Hauptfach: Mikrobiologie; Nebenfächer: Immunologie und Biochemie

Abschluss als Diplom-Biologin mit einer Arbeit zum Thema:

„Quantitative Bestimmung von Enten Hepatitis B Virus Ausbreitung und Titer im Verlauf

von in vitro Infektionen“

Abschlussnote: „Gut“ (1,5)

Universität Hohenheim von 2009 bis 2014

Projektarbeit und Dissertation zum Thema:

„Entwicklung und Testung neuer DNA- und Protein-basierter Multikomponentenvakzi-

nen, sowie regulatorischer Adjuvanzien gegen eine Infektion mit B. anthracis in Aus-

zucht-Mäusen und Ziegen“

WEITERBILDUNG

GV-SOLAS zertifizierter Kurs zur Versuchstierkunde (B)

XXIX

PUBLIKATIONEN

„Synthesis and immunochemical evaluation of a nonmethylated disaccharide analogue of

the anthrax tetrasaccharide“ [Milhomme et al. 2012]

„BclA and toxin antigens augment each other to protect NMRI mice from lethal Bacillus

anthracis challenge“ [Koehler et al. 2015 – eingereicht]

„Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity“ [Hardes et al. 2015 - einge-

reicht]

VORTRÄGE UND POSTERPRÄSENTATIONEN

„Vaccination of NMRI mice against Bacillus anthracis using DNA-vectors and novel ad-

juvants as an approach to a new acellular vaccine-combination.“ BACT conference 2013

und Nationales Symposium für Zoonoseforschung Berlin 2013 [Koehler et al. 2013]

„Recombinant acellular vaccines tested in goats for immunogenicity and protectivity.“

BACT conference 2013 und DFG [Koehler et al. 2013]

„Vaccination of NMRI mice against Bacillus anthracis using DNA and protein based acel-

lular vaccine candidates and novel adjuvants.“ BACT conference 2011 [Koehler et al.

2011]

„Highly potent inhibitors of the proprotein convertase furin as potential drugs for the

treatment of viral and bacterial infectious diseases.“ DPHG Annual Meeting 2013 [Stein-

metzer et al. 2013]

„Immunogenicity and protective efficacy of the Sterne 34F2 live spore anthrax vaccine in

goats.“ BACT conference 2013 [Ndumnego et al. 2013]

„Quantitative anti-anthrax IgG ELISA correlates with the anthrax toxin neutralization

assay in goats.“ BACT conference 2013 [Ndumnego et al. 2013]

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Ort und Datum Unterschrift

XXX

Danksagung

Eine Arbeit wie diese ist ein langwieriger Prozess, dessen Realisierung neben der eigenen Kraft,

Initiative und Ausdauer vor allem von den Menschen im persönlichen und beruflichen Umfeld

abhängt. Dabei ist nicht von Bedeutung welcher Beitrag, wann geleistet wurde, wie einschnei-

dend dieser war oder gar ob der entscheidende Einfluss direkt mit dieser Arbeit verknüpft ist.

Die Tatsache dass ich jetzt, hier an diesem Punkt in meinem Leben das Privileg habe die Dok-

torwürde zu erreichen, ist allen Menschen geschuldet die mich seit meiner Geburt unterstützt,

begleitet, gefördert und beflügelt haben. Und so gilt mein Dank zuoberst und zuallererst meiner

Mutter, Barbara Köhler, die immer an mich geglaubt und nie etwas unversucht gelassen hat, mir

dabei zu helfen meine Träume zu verwirklichen, selbst dann wenn diese schwer nachvollzieh-

bar, utopisch oder schmerzhaft für sie waren. Ich danke dir dafür von Herzen und mit Stolz.

In meiner Kindheit und Jugend haben mir die wenigsten Leute Wertschätzung entgegen ge-

bracht sodass ich oft als beliebtes Negativbeispiel - „Werde bloß nie wie Susanne!“ - bei der Er-

ziehung gleichaltriger herhalten musste. Glücklicherweise konnte ich in dieser Zeit auf Gabi

und Jürgen Meißner zählen, die mich bedingungslos und vorurteilsfrei an ihrem Familienleben

teilhaben ließen und mir wie einer eigenen Tochter Geborgenheit und Unterstützung gewährten.

Im Bezug auf meine akademische Laufbahn möchte ich mich besonders bei Jürgen bedanken.

Ich war damals nur eine mittelmäßige Schülerin. Erst durch deine Hilfe, mir mittels Übung die

Angst vor den topografischen Tests in den Geografiestunden zu nehmen, habe ich überhaupt be-

griffen was es bedeutet zu lernen und erst danach avancierte ich zu einer Musterschülerin. Ich

bin mir daher sicher, dass Du, Deine Frau und auch eure Kinder einen entscheidenden Einfluss

auf meinen Werdegang hatten und dafür bin ich sehr dankbar.

Aus dieser für mich sehr schwierigen Zeit und darüber hinaus möchte ich mich auch bei meiner

Freundin Franziska Groß bedanken, die mit Freude meine Fantasien, Spinnereien und Ideen

teilte und damals schon meine Andersartigkeit zu schätzen wusste. Nach ihr kamen noch viele

weitere Weggefährten die mich durch ihren Einfluss und ihre Freundschaft auch über diese Ar-

beit hinaus geprägt haben, ihnen möchte ich an dieser Stelle ebenfalls danken: Martin Baum-

gartl, Annika Benner, Elisabeth Blaschke, Rene Eling, Holger Engelhardt, Dora Finkeisen, Da-

niel Graeber, Dieter Graeber, Irina Graeber, Hannlore Goerz, Matthias Goerz, Ayesha Hassim,

Nicole Hesse, Jan Hönneman, Philipp Klemm, Jörg Lüdke, Dirk Mathes, Marion Mikoteit, Eric

Morfa-Morales, Kathy Olson, Lynn Olson, Fabian Patzke, Tobias Peter, Sandra Seelke, Britta

von Terzi und Arne Walter

XXXI

Für die Ermöglichung dieser Arbeit und der damit verbundenen Abenteuer, Eindrücke und Er-

fahrungen möchte ich mich vor allem bei Herrn PD Dr. med. vet. habil. Wolfgang Beyer bedan-

ken. Sie waren mir in den 6 Jahren unserer Zusammenarbeit eine große Stütze, bereichernder

Lehrer und beflügelnder Diskussionspartner. Überdies erlaubte mir die Arbeit in ihrer Arbeits-

gruppe, unterstützt durch Elisabeth Blaschke, Karen Hills und Sabine Hoche, eine freie Entfal-

tung in einem familiären Umfeld, dass sich auch auf unsere Projektpartner in der Türkei und

Südafrika erstreckte. Besonders möchte ich hierbei Dr. Fatih Büyük, Dr. Özgür Ҫelebi, At De-

cker, Schalk van Dyk, Dr. Henriette van Heerden, Okechukwu Ndumnego, Prof. Dr. Mitat Şa-

hin, Dr. Louis van Schalkwyk, Dr. Peter Turnbull und deren Mitarbeiter herausstellen, deren

Hilfe und Ratschläge oft über das Notwendige und Machbare hinausgehend, bei der Realisation

der Versuche in Südafrika und der Türkei essentiell waren. Zudem danke ich Frau Prof. Dr. rer.

nat. Ute Mackenstedt für die Übernahme der Betreuung meiner Dissertation. Allen weiteren

Mitarbeitern des ehemaligen Instituts für Umwelt und Tierhygiene möchte ich ebenfalls für ihre

Hilfe und Unterstützung bei dieser Arbeit, aber auch für ihre Freundschaft und Anteilnahme

meinen Dank aussprechen und dazu anhalten weiterhin mit Güte und Hilfsbereitschaft jungen

Wissenschaftlern zur Seite zu stehen.

Abschließend ein großes DANKE auch Daniel Goerz, für deinen Beistand, deine Bienchen, dei-

nen Humor, deine Freundschaft und deine Liebe.

XXXII

Documents

Entwicklung und Testung neuer DNA- und Protein- basierter ...opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1108/pdf/Dissertation_Koehler... · Entwicklung und Testung neuer DNA- und Protein-basierter