Analyse DNAzym-basierter Therapiestrategien bei ... · Analyse DNAzym-basierter Therapiestrategien bei experimenteller Colitis Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Analyse DNAzym-basierter Therapiestrategien

bei experimenteller Colitis

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg zur Erlangung

des Doktorgrades Dr. rer. nat.

Vorgelegt von

Vanessa Popp

2

Als Dissertation genehmigt

von der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 29.04.2019

Vorsitzender des Prüfungsorgans: Prof. Dr. Georg Kreimer

Gutachter: Prof. Dr. Robert Slany

PD Dr. Benno Weigmann

3

1 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................ 7

1.1 Hintergrund und Ziele.......................................................................................... 7

1.2 Methoden .............................................................................................................. 7

1.3 Ergebnisse ............................................................................................................ 8

1.4 Schlussfolgerung ................................................................................................. 9

2 SUMMARY .............................................................................................................. 10

2.1 Background and Aims ....................................................................................... 10

2.2 Methods............................................................................................................... 10

2.3 Results ................................................................................................................ 11

2.4 Conclusion .......................................................................................................... 12

3 EINLEITUNG ........................................................................................................... 13

3.1 Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen ................................................. 13

3.1.1 Colitis ulcerosa ................................................................................................. 13

3.1.2 Morbus Crohn ................................................................................................... 13

3.1.3 Bisherige Therapiestrategien ........................................................................... 13

3.2 Immunregulation im Intestinaltrakt ................................................................. 15

3.3 Die Rolle von T-Helferzellen bei der Entstehung von CED ........................... 17

3.3.1 TH2 Zellen, GATA-3 und Colitis ulcerosa ......................................................... 17

3.3.2 TH1 Zellen, T-bet und Morbus Crohn ............................................................... 20

3.4 DNAzyme als Therapeutika............................................................................... 21

3.4.1 Struktur und Wirkmechanismus von DNAzymen............................................. 21

3.4.2 Mögliche Off-Target Effekte und die Notwendigkeit eines Kontroll-DNAzyms 22

3.4.3 Bisherige Studien über DNAzym-basierte Therapiestrategien ....................... 23

4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ................................................................................ 25

5 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................... 26

4

5.1 Material ................................................................................................................ 26

5.1.1 Fertigkits ........................................................................................................... 26

5.1.2 Primärantikörper ............................................................................................... 26

5.1.3 Sekundärantikörper .......................................................................................... 27

5.1.4 PCR Primer ...................................................................................................... 27

5.1.5 Substanzen ....................................................................................................... 28

5.1.6 Puffer und Lösungen ........................................................................................ 29

5.1.7 Tiere .................................................................................................................. 29

5.1.8 Software ........................................................................................................... 30

5.1.9 Geräte ............................................................................................................... 30

5.2 Methoden ............................................................................................................ 32

5.2.1 RNA-Isolation ................................................................................................... 32

5.2.2 cDNA Synthese ................................................................................................ 32

5.2.3 quantitative Realtime-PCR ............................................................................... 32

5.2.3.1 qRT-PCR mit humaner cDNA ................................................................... 32

5.2.3.2 qRT-PCR mit muriner cDNA ..................................................................... 32

5.2.3.3 Auswertung der qRT-PCRs ...................................................................... 32

5.2.4 Isolation der CD4+ Zellen aus der Milz ............................................................ 33

5.2.5 LPMC-Isolation aus dem Colon ....................................................................... 33

5.2.6 Kultivierung von primären Zellen ..................................................................... 33

5.2.7 FACS-Färbung von Zellen ............................................................................... 33

5.2.8 Hämatoxylin-Eosin (H&E) Färbung .................................................................. 34

5.2.9 Immunfluoreszenzfärbung von Cryoschnitten ................................................. 34

5.2.10 Experimentelle Colitis-Modelle ..................................................................... 35

5.2.10.1 akute Oxazolon-Colitis .............................................................................. 35

5.2.10.2 akute TNBS-Colitis .................................................................................... 36

5.2.10.3 chronische TNBS-Colitis ........................................................................... 37

5.2.11 In vivo Imaging .............................................................................................. 37

5.2.11.1 Mini-Endoskopie und MEICS Scoring ...................................................... 37

5.2.11.2 IVIS-Aufnahmen ........................................................................................ 38

5.2.11.3 Quantum FX CT ........................................................................................ 38

5.2.12 Statistik ......................................................................................................... 39

6 ERGEBNISSE ......................................................................................................... 40

6.1 Untersuchungen zur Wirkweise eines GATA-3 spezifischen DNAzyms im

experimentellen Colitismodell ..................................................................................... 40

5

6.1.1 Analyse der GATA-3 Expression in humanem Darmgewebe ......................... 40

6.1.2 Analyse der Gata-3 Expression im Oxazolon-induzierten Colitismodell ......... 44

6.1.3 Analyse konditionaler GATA-3 KO Mäuse im Oxazolon-Colitismodell ........... 46

6.1.4 Analyse von IFN-γ KO Mäusen im Oxazolon-Colitismodell ............................ 48

6.1.5 In vitro Wirkanalyse des Gata-3 spezifischen DNAzyms hgd40 ..................... 49

6.1.6 Wirkanalyse des Gata-3 spezifischen DNAzyms hgd40 während des

Oxazolon-Colitismodells in C57BL/6 Mäusen ............................................................ 49

6.1.7 Wirkanalyse von hgd40 während des chronischen TNBS-induzierten

Colitismodells in BALB/c Mäusen ............................................................................... 54

6.1.8 Wirkanalyse von hgd40 während des Oxazolon-Colitismodells in TNFR1/R2

KO Mäusen .................................................................................................................. 58

6.2 Untersuchungen zur Wirkweise eines T-bet spezifischen DNAzyms im

experimentellen Colitismodell ..................................................................................... 62

6.2.1 Analyse der T-bet Expression in humanem Gewebe von CED Patienten ...... 62

6.2.2 Untersuchung konditionaler T-bet KO Mäuse im experimentellen TNBS-Colitis

Modell 64

6.2.3 In vitro Analyse des T-bet spezifischen DNAzyms td32 .................................. 67

6.2.4 Untersuchung des T-bet spezifischen DNAzyms td32 im TNBS-Colitismodell

……………………………………………………………………………………….69

6.2.5 TNFΔARE Ileitis Modell ....................................................................................... 72

6.2.6 Messung der Transitzeit einer Kupferkapsel durch den GIT mittels Quantum

FX CT ……………………………………………………………………………………….77

7 DISKUSSION .......................................................................................................... 80

7.1 Vor- und Nachteile einer Antisense-Oligonukleotid-vermittelten

Therapiestrategie .......................................................................................................... 80

7.2 GATA-3 und T-bet als aussichtsreiche Kandidaten einer DNAzym-basierten

Colitistherapie ............................................................................................................... 84

7.3 Ausblick auf präklinische und klinische Studien mit hgd40 und td32 ........ 87

8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................ 89

9 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................... 91

6

10 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ........................................................................... 99

11 VERZEICHNIS DER VERÖFFENTLICHUNGEN ............................................. 101

12 DANKSAGUNG ................................................................................................. 102

13 ERKLÄRUNG .................................................................................................... 103

14 LEBENSLAUF ................................................................................................... 104

Zusammenfassung

7

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Für Patienten, die an chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) leiden, gibt es

zwar bereits ein Spektrum an Behandlungsmöglichkeiten. Allerdings ist es unabdingbar

spezifischere, schneller wirksamere und verträglichere Medikationen zu finden. Morbus

Crohn und Colitis ulcerosa Patienten, bei denen bisher keine Therapie zur

Remissionserhaltung geführt hat, bekommen somit eine Chance, eine spezifischere

Behandlung zu erhalten, die den gewünschten Erfolg erzielen könnte. Die anfänglichen

Therapieformen, vor allem die Behandlung mit small molecule drugs wie 5-ASAs,

weichen nun immer mehr der Behandlung mit sogenannten Biologika wie Antikörpern

oder Antisense-Oligonukleotiden, da solche spezifischer und schneller wirken.

Da Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Patienten ein stark erhöhtes RNA- und Protein-

Level der T-Helferzell-Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA-3 aufweisen, sind diese

Faktoren potentielle Ziele einer Biologika-vermittelten Therapie. Deshalb soll die

Funktion von GATA-3 und T-bet bei der Initiierung und Aufrechterhaltung

experimenteller Colitis untersucht werden, um anschließend DNAzym-basierte

Therapien, die gegen diese Faktoren gerichtet sind, in diesen Modellen zu analysieren.

Diese Analyse soll die Anwendung GATA-3 und T-bet spezifischer Medikamente für

die Klinik ermöglichen und verbessern.

1.2 Methoden

In experimentellen Colitis Modellen wie Oxazolon und TNBS Colitis wurde das

immunologische Netzwerk der Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-bet untersucht.

Hierfür wurde zum einen die Colitis Entstehung in konditionalen GATA-3 oder T-bet

CD4 Knockout (KO) Mäusen im Vergleich mit Wildtyp (WT) Wurfgeschwistern in diesen

Modellen untersucht. Zum anderen kamen als Wirkstoffe sogenannte DNAzyme zum

Einsatz. Diese katalytisch aktiven DNA-Moleküle binden ein spezifisches Target-RNA-

Molekül (in diesem Fall die mRNA von GATA-3 und T-bet) und verhindern durch

Degradation der mRNA die Proteinsynthese. WT Mäuse wurden während der Colitis

Versuche mit dem Gata-3 spezifischen DNAzym hgd40 oder dem Tbx21 spezifischem

DNAzym td32 behandelt. Verschiedene Kontrollgruppen (u.a. eine Placebo-behandelte

Gruppe) ergänzen die Auswertung der Wirksamkeit der DNAzym-Behandlung.

Zusammenfassung

8

Um den Verlauf der experimentellen Colitis zu untersuchen, wurde die mini-

endoskopische in vivo Bildgebung, das murine endoscopic index of colitis severity

(MEICS) Scoring und die in vivo IVIS Bildgebung genutzt. Anschließend wurde das

Colon für mRNA-Gewinnung, Cryoschnitte und Zellisolation entnommen. Mit Hilfe von

qRT-PCRs, histologischen und Immunfluoreszenzfärbungen der Cryoschnitte,

durchflusszytometrischer Analyse der isolierten Zellen und Zytokinsekretionsassay

(ELISA) der Zellüberstände wurde der Effekt des konditionalen KO der

Transkriptionsfaktoren und der DNAzym Behandlung näher charakterisiert.

Weiterhin wurden Proben von CED Patienten und gesunden Kontrollen mit Hilfe von

qRT-PCR und Durchflusszytometrie im Hinblick auf die Expression der

Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-bet untersucht, um die Relevanz für eine

klinische Therapie darzustellen.

1.3 Ergebnisse

Die Analyse der Proben von CED Patienten und gesunden Kontrollen hat gezeigt, dass

der Transkriptionsfaktor GATA-3 bei Colitis ulcerosa und der Faktor T-bet bei Morbus

Crohn eine wichtige Rolle spielt. Beide Proteine sind in den entsprechenden

Erkrankungen stark erhöht, was darauf schließen lässt, dass sie bei der Entstehung

oder Aufrechterhaltung der chronischen Entzündung im Darm eine große Rolle spielen.

Konditionale KO Mäuse, bei denen die Gata-3 oder Tbx21 Expression spezifisch in

CD4+ T-Zellen fehlt, zeigen signifikant weniger Entzündungszeichen in experimentellen

Colitis Modellen als WT Wurfgeschwister. ELISA Analysen mit LPMC Überständen

haben gezeigt, dass die konditionalen KO Tiere signifikant niedrigere Level von pro-

inflammatorischen Zytokinen aufweisen. Auch durch Immunfluoreszenzfärbungen der

Colon Cryoschnitte zeigte sich, dass Entzündungsmarker wie MPO signifikant weniger

im Gewebe der konditionalen KO Tiere zu finden sind als im Gewebe der Kontrolltiere.

Die Gabe des Gata-3 DNAzyms hgd40 im Oxazolon-induzierten Colitis Modell bewirkte

eine Abschwächung des Entzündungsverlaufs und eine signifikante Reduktion der

Aktivität des GATA-3 getriggerten Immun-Netzwerkes. Dabei spielte es keine Rolle, ob

das DNAzym als Präventivtherapeutikum verabreicht wurde oder nach der

Entzündungsinduktion als akute Medikation. Beide Behandlungsformen zeigten eine

ähnliche Effektivität was sich durch die Mini-Endoskopie und das MEICS Scoring

belegen ließ. Nach Etablierung und Anwendung des chronischen TNBS-induzierten

Colitis Modells mit BALB/c Tieren hat sich gezeigt, dass die Gabe des DNAzyms eine

Zusammenfassung

9

TH2-GATA-3-vermittelte Immunreaktion erfolgreich reduzieren konnte und die Wahl des

Modells oder des Maushintergrunds keinen Einfluss auf die Wirksamkeit der Therapie

hat.

Die Gabe des Tbx21 DNAzyms td32 im TNBS Colitis Modell zeigte ebenfalls eine

Reduktion der Entzündungszeichen im Colon verglichen mit den Versuchstieren, die

ein Kontroll-DNAzym bekamen. Dies ließ sich ebenfalls mittels ELISA Analyse mit der

Reduktion wichtiger pro-inflammatorischer Zytokine wie GM-CSF und IL-6 und dem

Anstieg des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 erklären und bestätigen. Um auch

dieses DNAzym in einem weiteren Entzündungsmodell für Morbus Crohn testen zu

können, wurde außerdem das TNFΔARE Ileitis Modell etabliert. Diese Tiere entwickeln

aufgrund eines deregulierenden Defekts eine spontane Entzündung des Ileums. Die

erfolgreiche Etablierung des Versuchstyps wurde über Gewichtsdokumentation, Mini-

Endoskopie des Ileums, histologischer Färbung und durchflusszytometrische Analyse

isolierter Zellen bestätigt. Um td32 in diesem Modell testen zu können, musste im

Vorfeld eine neue Applikationsform gefunden werden, da eine rektale Gabe des

DNAzyms das entzündete Ileum nicht mit einschließen würde. Hierfür soll eine orale

Applikation von td32 (über Kapsel oder Cellets) ausgetestet werden. Diese Versuche

stehen zum jetzigen Zeitpunkt noch aus.

1.4 Schlussfolgerung

Die Tests der DNAzyme hgd40 und td32 in verschiedenen experimentellen CED

Modellen und die erfolgreiche Analyse dieser Wirkstoffe haben gezeigt, dass

DNAzyme eine innovative Behandlungsmöglichkeit für CED Patienten sein können.

Durch die Inhibierung der Schlüssel-Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-bet, die für

die Aufrechterhaltung der Darm-Entzündung essentiell sind, könnte eine Remission,

also eine Phase ohne akute Entzündungsschübe, erzielt werden. Gerade für Patienten,

bei denen bisher keine gängige Therapie diesen Erfolg erreichen konnte, ist diese

neue Behandlungsmöglichkeit eine große Chance.

Summary

10

2 Summary

2.1 Background and Aims

There is already a range of treatment options available for patients with chronic

inflammatory bowel disease (IBD). However, it is essential to find more specific, faster

effective and tolerable medications. For Crohn's Disease (CD) and Ulcerative Colitis

(UC) Patients, who have not received a therapy, that maintains remission, would this

be a chance to receive an innovative treatment that could achieve the desired

outcome. The initial forms of therapy, especially the treatment with small molecule

drugs such as 5-ASAs, are more and more replaced by so-called biologicals such as

antibodies or antisense oligonucleotides, as these operate more specific and faster.

Because Crohn's Disease and Ulcerative Colitis patients have greatly increased RNA

and protein levels of the T helper cell transcription factors T-bet and GATA-3, these

factors are potential targets of a biological-mediated therapy. Therefore, the role of

GATA-3 and T-bet in the initiation and maintenance of experimental colitis will be

investigated in order to subsequent analysis of DNAzyme-based therapies directed

against these factors in the colitis models. The purpose of this analysis is to enable and

enhance the use of GATA-3 and T-bet specific drugs for the clinic.

2.2 Methods

In experimental colitis models such as oxazolone and TNBS colitis, the immunological

network of the transcription factors GATA-3 and T-bet was investigated. The colitis

formation in conditional GATA-3 or T-bet CD4 knockout (KO) mice was investigated in

comparison to wildtype (WT) littermates in these models. On the other hand, so-called

DNAzymes were used as therapeutic agents. These catalytically active DNA molecules

bind a specific target RNA molecule (in this case the mRNA of GATA-3 and T-bet) and

inhibit protein synthesis by degradation of mRNA. WT mice were treated during the

colitis experiments with the Gata-3 specific DNAzyme hgd40 or the Tbx21 specific

DNAzyme td32. Various control groups (including a placebo-treated group) will

supplement the evaluation of the efficacy of the DNAzyme treatment.

To investigate the process of experimental colitis, mini-endoscopic in vivo imaging,

murine endoscopic index of colitis severity (MEICS) scoring, and in vivo IVIS imaging

were used. Subsequently, the colon was removed for mRNA extraction, cryosections

and cell isolation. Via qRT-PCRs, histological and immunofluorescent stainings of the

Summary

11

cryosections, flow cytometric analysis of the isolated cells and cytokine secretion assay

(ELISA) of cell supernatants, the effect of the conditional KO of the transcription factors

and the DNAzyme treatment was further characterized.

In addition, samples from CED patients and healthy controls were analyzed for the

expression of the transcription factors GATA-3 and T-bet using qRT-PCR and flow

cytometry to demonstrate their relevance to clinical therapy.

2.3 Results

Analysis of samples from CED patients and healthy controls has shown that the

transcription factors GATA-3 and T-bet play important roles in ulcerative colitis and

Crohn's disease. Both factors are highly elevated in the corresponding diseases,

suggesting that they play a major role in the development and/or maintenance of

chronic inflammation in the gut.

Conditional KO mice lacking Gata-3 or Tbx21 expression specifically in CD4+ T cells

show significantly fewer signs of inflammation in experimental colitis models than WT

littermates. ELISA analyzes of LPMC supernatants have shown that the conditional KO

animals have significantly lower levels of pro-inflammatory cytokines.

Immunofluorescence stainings of colon cryosections also showed that inflammatory

markers such as MPO are significantly reduces in the tissue of conditional KO animals.

The administration of the Gata-3 DNAzyme hgd40 in the oxazolone-induced colitis

model caused a weakening of the inflammatory process and a significant reduction in

the activity of the GATA-3 triggered immune network. It did not matter if the DNAzyme

was given as a preventive therapy or after the induction of inflammation as an acute

medication. Both treatment options showed similar efficacy as demonstrated by mini-

endoscopy and MEICS scoring. Even after establishment and performance of the

chronic TNBS-induced colitis with BALB/c mice, the administration of the DNAzyme

could successfully reduce a TH2-GATA-3-mediated immune response and the choice of

the model or the mice background does not affect the effectiveness of the therapy.

The administration of the Tbx21 DNAzyme td32 in the TNBS colitis model also showed

a reduction of inflammatory signs in the colon compared to the animals that received a

control DNAzyme. This could also be confirmed by ELISA analysis by reduction of

important pro-inflammatory cytokines such as GM-CSF and IL-6 and the increase of

the anti-inflammatory cytokine IL-10. In order to test this DNAzyme in another model of

CD-like inflammation, the TNFΔARE ileitis model was established. These animals

Summary

12

develop spontaneous inflammation of the ileum due to a deregulating defect. The

successful establishment of the experimental type was confirmed by weight

documentation, mini-endoscopy of the ileum, histological stainings and flow cytometric

analysis of isolated cells. To test td32 in this model, a new application form had to be

found in advance, as a rectal administration of the DNAzyme would not include the

inflamed ileum. For this an oral application of td32 (via capsule or cellets) will be

tested. These analyses are still pending at this time.

2.4 Conclusion

The hgd40 and td32 assays in various experimental IBD-like colitis models and the

successful analysis of these agents have shown that DNAzymes can be an innovative

treatment option for IBD patients. By inhibiting the key transcription factors GATA-3

and T-bet, which are essential for the maintenance of intestinal inflammation, a

remission, so a phase without acute inflammatory episodes, could be achieved. This

new treatment option is a great opportunity, especially for those patients, which have

no efficient therapy at the moment.

Einleitung

13

3 Einleitung

3.1 Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen

Die 2 Hauptverlaufsformen der chronisch-entzündlichen Darmerkrankung oder kurz

CED sind die sogenannte Colitis ulcerosa und die Morbus Crohn. Bei beiden Typen der

Erkrankung sind wiederkehrende Entzündungen in verschiedenen Bereichen des

Gastrointestinaltrakts für schwere Symptome wie frequentierte blutige Diarrhöe und

Abdominalschmerzen verantwortlich [1]. Im Folgenden soll näher auf beide Formen der

CED eingegangen werden.

3.1.1 Colitis ulcerosa

Colitis ulcerosa (CU) zeichnet sich durch wiederkehrende, nicht-transmurale

Entzündungen aus, die fast ausschließlich im Colon und Rektum lokalisiert sind.

Patienten, die an CU erkrankt sind, leiden unter schweren Symptomen wie blutige

Diarrhöe, Abdominalschmerzen und Anämie. Oft treten während des

Krankheitsverlaufs auch entzündliche extraintestinale Beschwerden auf, die

beispielsweise die Gelenke oder die Haut betreffen können [1].

3.1.2 Morbus Crohn

Anders als bei Colitis ulcerosa kann bei Morbus Crohn (MC) der gesamte

Gastrointestinaltrakt von transmuralen Entzündungsherden befallen sein, wobei die

Hauptlokalisation der Krankheit am häufigsten im terminalen Ileum diagnostiziert wird

[2]. Neben den allgemeinen Symptomen wie Diarrhöe und Abdominalschmerzen, die

auch bei CU auftreten, kommt es bei MC häufig zur Bildung von intestinalen

Abszessen, Fisteln und Strikturen. Auch bei MC können extraintestinale Symptome

das Leben der Patienten zusätzlich beeinträchtigen [1].

3.1.3 Bisherige Therapiestrategien

Um chronische Entzündungsschübe weitestgehend zu verhindern und die Patienten in

Remission, also in einer Phase, die keine intestinale Entzündung aufweist, zu halten,

werden aktuell einige Therapiestrategien angewendet, die nun kurz zusammengefasst

werden sollen.

Als eine wichtige Behandlungsstrategie gegen CED werden sogenannte anti-

inflammatorische Medikamente, wie zum Beispiel 5-Aminosalicylsäuren (5-ASAs) oder

Corticosteroide eingesetzt. 5-ASAs werden bei der Behandlung von CU eingesetzt [3],

zeigen jedoch bei MC Patienten kaum Wirkung [4]. Corticosteroide hingegen werden

Einleitung

14

sowohl bei MC als auch bei CU Patienten angewandt, um diese in Remission zu führen

(Abbildung 1). Aufgrund der zahlreichen Nebenwirkungen ist diese Strategie allerdings

nicht für eine Langzeittherapie geeignet [1, 5].

Weitere häufig angewendete Medikamente wie Azathioprin, Methotextrat und

Cyclosporin-A wirken immunsupprimierend und werden bei beiden Subgruppen der

CED verwendet, um eine Remission herbeizuführen [6] (Abbildung 1).

Wenn keine der oben aufgeführten Behandlungen zu einer Verbesserung des

Zustands der Patienten führt oder diese nach einiger Zeit nicht mehr auf die Therapie

ansprechen, werden meist Biologika wie anti-Tumornekrosefaktor (TNF) Antikörper

eingesetzt (Abbildung 1). TNF-α ist ein Zytokin, das maßgeblich an Infektions- und

Entzündungsprozessen beteiligt ist. Es wird hauptsächlich von stimulierten Monozyten

und Makrophagen produziert, kann aber auch von T-und B-Zellen sezerniert werden

[7]. anti-TNF-α Antikörper wie Infliximab (Remicade®) oder Adalimumab (Humira®)

werden bei der Behandlung von MC und CU eingesetzt [8]. Allerdings sprechen

anfangs nur ca. 60% der Patienten auf die Therapie an, von denen nach einem Jahr

nur noch 30% in Remission sind [9]. Die neueste Entwicklung im Bereich der anti-TNF-

α Antikörper Therapien ist Certolizumab (Cimzia®). Es wurde 2018 von der FDA für die

Behandlung von Morbus Crohn zugelassen. Es ist bisher der einzige Fab-Fragment

TNF-α Inhibitor [10]. Durch das Fehlen der Fc-Einheiten, kann keine zytotoxische

Reaktion durch Komplementsystem-Aktivierung stattfinden. Dies ist eine häufige

unerwünschte Nebenwirkung von Fc-Antikörper-vermittelten Therapien [11]. Fab-

Fragment Antikörper haben eigentlich eine sehr kurze Plasmahalbwertszeit, weshalb

sie zu Therapiezwecken nicht nutzen würden. Durch Modifikationen wie PEGylierung

(Konjugat mit Polyethylenglycol) sind diese Inhibitoren aufgrund von verbesserter

Stabilität und Plasmahalbwertszeit sehr gut für eine Medikation geeignet [11].

Aufgrund des anfänglichen Erfolgs der anti-TNF-α Antikörper Therapie, wurden im

Weiteren Medikamente getestet, die in Signalkaskaden anderer pro-inflammatorischer

Zytokine durch dessen Inhibierung eingreifen. Eine Interferon-γ Antikörper Therapie

(Fontolizumab) und eine anti-IL-17A Therapie (Secukinumab, Cosentyx®) zeigten

allerdings keine protektiven Effekte bei der Behandlung von CED Patienten [12, 13].

Anti-IL-12/23 Antikörper wie Ustekinumab (Stelara®), die gegen die p40 Untereinheit

gerichtet ist, zeigten bisher in klinischen Studien mit Morbus Crohn Patienten, die nicht

auf eine anti-TNF-α Antikörper Medikation ansprechen, gute Erfolge [10, 14]. Ein

vielversprechender Kandidat für eine neue Behandlungsstrategie ist das pro-

inflammatorische Zytokin IL-6. Es wurde ein stark erhöhtes Level des Zytokins und des

Einleitung

15

löslichen IL-6 Rezeptors (sIL-6R) im Blutserum und Darmgewebe von MC Patienten

gefunden [15]. In einer Studie führte eine Blockierung des sIL-6R (durch Tocilizumab)

zu einer Reduktion der intestinalen Entzündung bei MC Patienten [16].

Wenn keine der erwähnten Behandlungsstragien zu einer dauerhaften Remission führt,

bleibt meist nur die Möglichkeit, den entzündeten Darm Abschnitt operativ zu entfernen

(Resektion) (Abbildung 1).

Abbildung 1 Therapiestrategien bei Chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED)

Dargestellt ist die in der Regel zum Einsatz kommende Therapiestrategie bei CED. Nach einer

anfänglichen 5-ASA/Corticosteroid Therapie, kommen im nächsten Schritt oder auch begleitend

Immunsuppressiva und Biologika zum Einsatz. Als letzte Möglichkeit steht eine Darmresektion zur

Verfügung, wobei neue Therapieansätze unbedingt notwendig sind, um diesen Schritt

weitestgehend zu vermeiden.

Obwohl es bereits ein Spektrum an Therapieformen gibt, die sowohl bei MC als auch

CU eingesetzt werden, ist es unabdingbar neue Biomarker zu finden und andere

Behandlungsstrategien zu entwickeln. Patienten, die bisher auf keine zugelassene

Therapieform ansprechen oder deren Medikament keine dauerhafte Remission erzielt,

kann so eine Möglichkeit eröffnet werden, ohne schwere Symptomatik und

Beeinträchtigungen mit CED zu leben (Abbildung 1).

3.2 Immunregulation im Intestinaltrakt

Der gastrointestinale (GI) Trakt stellt einen der größten und wichtigsten Bereiche des

menschlichen Immunsystems dar. Die Zusammensetzung der Darmflora, die über 400

Bakterienspezies enthalten kann, ist dabei absolut essentiell für die Funktionserfüllung,

Einleitung

16

da diese als Kommensale in Symbiose (z.B. die Gattung Bacteroides) und nicht als

Parasiten mit dem menschlichen Wirt leben und die Waage zu schädlichen Bakterien

halten [17]. Der GI Trakt (GIT) übernimmt 2 Hauptaufgaben: Zum einen nimmt er

Nährstoffe aus der Nahrung auf, damit diese im Körper weiter verarbeitet werden

können. Zum anderen muss er aber eine nahezu undurchlässige Barriere gegen

potenziell pathogene Organismen stellen [17, 18]. Trotzdem können Bakterien durch

die epitheliale Barriere in die Mukosa gelangen und eine Immunreaktion auslösen.

Bakterielle Produkte können dort von Dendritischen Zellen aufgenommen werden.

Diese reifen daraufhin zu Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) heran, deren

Aufgabe es ist, die bakteriellen Peptide und Bestandteile an deren Zelloberfläche

anderen Immunzellen wie zum Beispiel T-Helferzellen zu präsentieren [18]. CD4+ T-

Helferzellen (TH-Zellen) spielen eine maßgebliche Rolle in der protektiven Funktion des

Immunsystems. Durch ihren Einfluss auf eine Vielzahl von Zellen wie B-Zellen,

Makrophagen, Neutrophile oder Eosinophile stellen sie ein essentielle Modulation in

der Immunantwort dar [19]. Ziel der entzündlichen Immunreaktion, die durch diese

Effektor T-Zellen ausgelöst wird, ist es, die eingedrungenen Bakterien und Pathogene

zu neutralisieren und den Gesundheitszustand des Körpers wiederherzustellen. Um

dem entzündungsfördernden Zell- und Zytokinmilieu die Waage zu halten und die

intestinale Homöostase wieder herzustellen, sezernieren regulatorische T-Zellen

Zytokine, die der Entzündung entgegen wirken [20, 21] (Abbildung 2).

Einleitung

17

Abbildung 2 Mukosales Gleichgewicht im Darm

Um die mukosale Homöostase im Intestinaltrakt aufrecht zu erhalten, halten sich Effektor T-Zellen

und Regulatorische T-Zellen die Waage (modifiziert nach Bouma und Strober, Nature Reviews

Immunology 2003)

Kommt es allerdings zu einem Ungleichgewicht zwischen Effektor T-Zellen und

regulatorischen T-Zellen, weil entweder eine Überproduktion von Effektor T-Zellen

vorliegt oder regulatorische T-Zellen nicht mehr nachgebildet werden können,

begünstigt dies die Entstehung und Aufrechterhaltung eines chronischen

Entzündungsprozesses [21, 22] (Abbildung 2).

3.3 Die Rolle von T-Helferzellen bei der Entstehung von CED

3.3.1 TH2 Zellen, GATA-3 und Colitis ulcerosa

Colitis ulcerosa ist eine Typ 2 Immunantwort gesteuerte entzündliche Erkrankung des

Dickdarms [23]. An dieser sind neben TH2 Zellen auch TH9 Zellen, Mast Zellen,

Eosinophile, Basophile und ILCs (innate lymphoid cells) beteiligt (Abbildung 3).

Einleitung

18

Abbildung 3 Typ 2 Immunantwort-assoziierte Zelltypen (modifiziert nach Oliphant et al.,

Immunology 2011)

Abgebildet sind verschiedene Immunzelltypen, die an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer

Typ 2 Immunantwort beteiligt sind wie Eosinophile, TH2 Zellen und ILCs

Naϊve CD4+ T-Zellen entwickeln sich nach Aktivierung durch IL-4 über den IL-4R-

pSTAT6-GATA-3 Signalweg zu TH2 Zellen. Ausdifferenzierte TH2 Zellen produzieren

vor allem IL-5 und IL-13 [24] (Abbildung 4). IL-5 wird zum einen benötigt um B-Zellen in

Antikörper-produzierende Plasmazellen zu konvertieren [25, 26]. Es wurde aber auch

als einer der Hauptfaktoren für die Differenzierung von Eosinophilen identifiziert [27].

IL-13 reguliert das Wachstum und inhibiert den Zelltod von B-Zellen. Außerdem wirkt

es wie IL-5 positiv auf die Immunglobulin Produktion der B-Zellen [28]. Neben B-Zellen

beeinflusst IL-13 auch Monozyten und Makrophagen, indem es verschiedene

Adhäsionsmoleküle hochreguliert [28].

Einleitung

19

Abbildung 4 Entwicklung der TH2 Zelle

Entwicklung der TH2 Zelle aus einer naiven CD4+ Zelle unter Einfluss von IL-4. Ausdifferenzierte

TH2 Zellen exprimieren die Transkriptionsfaktoren (TF) STAT6, IRF4 und GATA-3 und sezernieren

die Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13. Sie sind wichtig für die Abwehr von extrazellulären Parasiten.

Einer der wichtigsten Transkriptionsfaktoren der TH2 Zellen ist GATA-3 (GATA binding

protein 3). Er reguliert die IL-5 und IL-13 Produktion in TH2 Zellen, indem er direkt an

den Promoter der entsprechenden Gene bindet und als Transkriptionsaktivator fungiert

[29, 30]. Dazu wird GATA-3 von der Kinase p38 phosphoryliert, um einen Transfer in

den Nukleus zu gewährleisten [31]. GATA-3 fungiert nicht nur als

Transkriptionsaktivator, sondern beeinflusst die Transkription bestimmter Gene auch

negativ. So blockiert der Transkriptionsfaktor die Expression von STAT4 und T-bet

[32], was eine verringerte TH1 Zellentwicklung zur Folge hat. Die Funktionen von

GATA-3 beschränken sich allerdings nicht nur auf die T-Zellentwicklung. Ein

vollständiger Knockout des Gens führt im frühen Embryonalstadium zur Letalität.

Dieser Effekt ist auf eine neuroendokrine Fehlentwicklung zurückzuführen [33], was

zeigt, dass GATA-3 auch außerhalb der lymphoiden Zellentwicklung eine maßgebliche

Rolle spielt.

TH2 Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Colitis ulcerosa, da die

mukosale Expression des TH2 Transkriptionsfaktors GATA-3 bei CU Patienten

signifikant erhöht ist [34] und das Homing/Einwandern von IL-5 und IL-13

produzierende Zellen in die Mukosa von CU Patienten stark erhöht ist [35, 36]. Deshalb

stellt der Transkriptionsfaktor GATA-3 einen völlig neuen Aspekt der CU-Therapie dar,

gerade für Patienten, die ein stark erhöhtes mukosales GATA-3 Level aufweisen und

auf gängige Behandlungen mit Corticosteroide oder anti-TNF basierten Therapien nicht

ansprechen.

Einleitung

20

3.3.2 TH1 Zellen, T-bet und Morbus Crohn

Morbus Crohn wird als Typ 1 Immunantwort-vermittelte Entzündung des

Gastrointestinaltrakts beschrieben. An dieser Immunantwort sind neben anderen Zellen

vor allem TH1 beteiligt [37]. TH1 Zellen entstehen aus naiven CD4+ T-Zellen, nachdem

diese durch Dendritische Zellen und Einwirkung der Zytokine IL-12 und IFN-γ aktiviert

werden [38]. TH1 Zellen exprimieren den Transkriptionsfaktor T-bet (ein T-Box

Transkriptionsfaktor, Gen Name: Tbx21) und sezernieren die pro-inflammatorischen

Zytokine Interferon-γ (IFN-γ) und TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) (Abbildung 5).

Abbildung 5 Entwicklung der TH1 Zelle

Entwicklung der TH1 Zelle aus einer naiven CD4+ Zelle unter Einfluss von IL-12. Ausdifferenzierte

TH1 Zellen exprimieren die Transkriptionsfaktoren (TF) STAT4 und T-bet und sezernieren die

Zytokine TNF-α und IFN-γ. Sie sind Hauptbestandteil der Abwehr von intrazellulären Parasiten.

TNF-α spielt in vielen Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arthritis und Morbus

Crohn eine Hauptrolle, weshalb hier anti-TNF-α Antikörper basierte Therapien

angewendet werden [39, 40]. Er gilt als einer der Hauptmediatoren von

Entzündungsprozessen, indem er auf eine Vielzahl von Zielzellen wie Fibroblasten

proliferationsfördernd und auf pro-inflammatorische Zytokine wie IL-6 und GM-CSF als

parakriner Induktor wirkt [41, 42].

Analysen humaner Proben ergab eine stark erhöhte Produktion von IFN-γ und ein

signifikant erhöhtes T-bet Level in der entzündeten Mukosa von MC Patienten [43-45].

IFN-γ wirkt durch seinen Einfluss auf B-Zellen (Reifung und Immunglobulin-Produktion)

und Makrophagen (Aktivierung) entzündungsfördernd. Durch die fördernde Wirkung

auf regulatorische T Zellen und die Inhibierung der Hämatopoiese kann IFN-γ einer

Entzündung aber auch entgegen wirken [46]. Die dominierende Wirkweise des

Zytokins hängt stark von äußeren Einflüssen und dem Zusammenspiel mit anderen

Zellen ab.

Einleitung

21

Der Transkriptionsfaktor T-bet wird vorrangig mit TH1 Zellen assoziiert. Durch T-

Zellrezeptor und IFN-γ Stimulation kommt es zu einem ersten Maximum an Tbx21-

Expression, welches zu einer positiven Regulation des IL-12 Rezeptor auf TH1 Zellen

führt. Eine zweite IL-12 abhängige Tbx21-Expressionswelle führt zur vollständigen

Differenzierung von TH1 Zellen [47-50].

Neueste Studien zeigen, dass T-bet nicht ausschließlich als Transkriptionsfaktor in TH1

Zellen zu finden ist, sondern auch in einer intermediären Form von TH17 Zellen

exprimiert werden kann. Im Allgemeinen wird mit der T-Zellsubpopulation der TH17

Zellen der Transkriptionsfaktor RORγT (RAR-related orphan receptor γ) assoziiert [51,

52]. Dieser wird benötigt, um die TH17 Zelldifferenzierung zu gewährleisten und

assoziierte Zytokine wie IL-17 zu exprimieren [52]. Unter Einfluss des Zytokins IL-23

verlieren TH17 Zellen ihre Stabilität, exprimieren sowohl RORγT als auch T-bet und

beginnen neben TH17-Zytokinen wie IL-17 auch TH1 Zytokine wie IFN-γ zu produzieren

[53, 54]. Im weiteren Verlauf können diese Zellen unter IL-12 Einfluss weiter zu

sogenannten „Ex-TH17“ TH1 Zellen differenzieren, die dann IFN-γ produzieren [53].

Diese intermediäre TH1-TH17 Zellpopulation ist aufgrund der Produktion der pro-

inflammatorischen Zytokine IL-17 und IFN-γ maßgeblich an der Induktion

experimenteller Colitis beteiligt [55, 56].

Aufgrund des erhöhten T-bet Expressionslevels während der MC Entstehung, könnte

hier ein neuer Therapieansatzpunkt liegen, um Morbus Crohn Patienten, die bisher auf

keine herkömmliche Behandlungsmethode ansprechen, in dauerhafte Remission zu

führen.

3.4 DNAzyme als Therapeutika

3.4.1 Struktur und Wirkmechanismus von DNAzymen

DNAzyme sind einzelsträngige DNA Moleküle, die aus einem katalytischen Kern und 2

flankierenden Bindungsarmen bestehen [57] (Abbildung 6). Zuerst wurden sie 1994

von Ronald Breaker und Gerald Joyce beschrieben [58]. DNAzyme ermöglichen den

sequenzspezifischen Abbau einer Target RNA, indem die Bindearme des Moleküls

durch Watson-Crick Basenpaarung an die Target Sequenz der RNA binden und diese

durch den DNAzym Kern katalytisch gespaltet wird [58]. Der Vorteil gegenüber

anderen Antisense-vermittelten Strategien ist, dass DNAzyme eine hohe Zahl an

Target-RNA Moleküle durch wiederholtes Binden und Spalten degradieren können.

Einleitung

22

Abbildung 6 Schema eines 10-23 DNAzyms (D. A. Baum und S. K. Silverman, Cell. Mol. Life Sci.,

Vol. 65 2008)

Schema eines 10-23 DNAzyms mit Enzymregion und flankierenden Bindedomänen. Der Pfeil zeigt

den Angriffspunkt für die enzymatische Spaltung des Zielgens an.

Eines der heute am häufigsten für Therapieansätze verwendete DNA-haltige

katalytische Molekül ist das 10-23 DNAzym [59]. Der Name beruht auf der Art des

Selektionsprozesses (Anzahl der Selektionsrunde und Nummer des selektierten Klons)

der DNAzyme, da diese nicht natürlich vorkommen, sondern aus einem Molekül Pool

über Aktivitätsassays selektiert werden [57, 60]. Es besteht aus einem 15 Nukleotide

umfassenden Kern und schneidet das Target sequenzspezifisch zwischen einem

ungepaarten Purin und einem gepaarten Pyrimidin [61]. Die enzymatische Aktivität des

Kerns ist dabei stark von bestimmten Kationen, oft Magnesium, im umgebenden

Medium abhängig und steigt mit steigender Mg2+ Konzentration [59]. Verschiedene

Studien haben gezeigt, dass die optimale Länge der Bindearme eines DNAzyms

(spezifische Bindung des Targets) sequenzabhängig variieren kann, meist aber

zwischen 7 und 10 Nukleotiden liegt [62, 63]. Um DNAzyme vor enzymatischem Abbau

zu schützen und somit zu stabilisieren werden oft weitere Modifikationen eingebaut.

Ein inverses Nukleotid (Thymin) am 3`-Ende des DNAzyms erhöht den Schutz vor

Exonuklease-vermittelten Abbau und verlängert die Stabilität auf bis zu 22 Stunden in

humanem Serum/Plasma (vorher nur ca. 1 Stunde) [64].

3.4.2 Mögliche Off-Target Effekte und die Notwendigkeit eines Kontroll-

DNAzyms

Da DNA-Moleküle wie zum Beispiel DNAzyme CpG Motive in der katalytischen

Domäne enthalten, muss in in vivo Studien gewährleistet sein, dass die Wirkung

sequenzspezifisch und nicht aufgrund von sogenannten off-target Effekten auftritt.

CpG Motive oder auch CpG Inseln kommen sehr selten in Vertebraten DNA vor,

sondern sind häufig im bakteriellen Genom zu finden [65]. Deshalb können sie als

Einleitung

23

Gruppe der PAMPs (pathogen-associated molecular pattern) durch Aktivierung von

Pattern Recognition Rezeptoren (wie TLRs oder Nod-like Rezeptoren) eine

Immunantwort häufig mit Beteiligung von B-Zellen auslösen [66-68]. Deshalb muss im

Vorfeld ein solcher Wirkmechanismus basierend auf off-target Effekten durch

DNAzyme ausgeschlossen werden [69].

Um weiterhin einen unspezifischen Effekt der DNAzyme ausschließen zu können, ist

es notwendig eine Kontroll-DNAzym behandelte Versuchsgruppe zu untersuchen.

Dieses Kontroll-DNAzym besteht aus einem katalytischen Kern, der identisch zu dem

des DNAzyms ist. Die Nukleotide in den Bindearmen wurden allerdings so mutiert,

dass eine spezifische Bindung des Targets nicht möglich ist [70]. Die Behandlung mit

einem Kontroll-DNAzym kann außerdem Aufschluss über off-target Effekte geben

(siehe oben).

3.4.3 Bisherige Studien über DNAzym-basierte Therapiestrategien

Eine Vielzahl von Studien über DNAzym-basierte Therapieabsätze bei

Krebserkrankungen, Asthma oder Multipler Sklerose zeigen das Potential, das hinter

diesem neuen Verfahren steckt. Im Folgenden sollen ausgewählte Publikationen

vorgestellt werden.

Ein c-Jun spezifisches DNAzym, Dz13, wurde im Zusammenhang mit einer potentiellen

Behandlung von Osteosarkomen und Hautkrebs getestet. Es konnte gezeigt werden,

dass eine Reduzierung von c-Jun, einer Untereinheit des Protoonkogens AP-1 [71, 72],

zu einem verminderten Osteosarkom Wachstum in vitro und zu einer verminderten

Hautkrebsrate im Mausmodell führt [73, 74].

Eine andere Studie behandelte Integrin alpha-4 als mögliches Target für eine DNAzym

Therapie bei der Behandlung von Multipler Sklerose. Die Gruppe konnte zeigen, dass

das Integrin alpha-4 DNAzym RNV143 in vitro zu einer sehr effizienten Erniedrigung

des Transkripts führt [75]. Weitere Tests könnten dieses DNAzym als therapeutischen

Ansatzpunkt bestätigen.

Die Gruppe um Harald Renz und Holger Garn veröffentlichte 2015 im NEJM die

Ergebnisse einer klinischen Studie eines GATA-3 DNAzym bei der Behandlung von

allergischem Asthma. Sie konnten in einer randomisierten, doppelverblindeten,

Placebo-kontrollierten klinischen Studie sehen, dass das GATA-3 spezifische DNAzym

SB010 in Patienten zu einer signifikant verringerten Allergiereaktion der Lunge führt im

Vergleich zur Placebo-behandelten Kontrollgruppe [76].

Einleitung

24

2001 wurden die Ergebnisse einer klinischen Studie mit Alicaforsen (ISIS-2302)

veröffentlicht. Dieses Antisense-Oligonukleotide gegen ICAM-1 (intercellular adhesion

molecule 1) wurde erstmalig erfolgreich bei Patienten mit Morbus Crohn angewendet

[77, 78]. ICAM-1 wird nach Stimulation durch z.B. TNF-α vermehrt auf der Oberfläche

von Immunzellen gebildet. Eine der wichtigsten Aufgaben von ICAM-1 ist die

Beteiligung an der Einwanderung von Leukozyten zum Entzündungs-Hotspot [77].

Zielsetzung der Arbeit

25

4 Zielsetzung der Arbeit

In der vorgelegten Arbeit sollen in verschiedenen experimentellen Colitis Modellen in

der Maus neuartige entzündungsreduzierende Therapieansätze getestet werden.

Hierzu werden katalytisch aktive DNA-Moleküle, sogenannte DNAzyme, die spezifisch

den TH1 Transkriptionsfaktor T-bet oder den TH2 Transkriptionsfaktor GATA-3

inhibieren, im Mausmodell während einer TNBS- oder Oxazolon-induzierten Colitis

appliziert. Dadurch soll getestet werden, ob sich durch diese Behandlung eine

Verbesserung des Colitis-Verlaufs erzielen lässt. Im Anschluss soll über

molekularbiologische und immunologische Methoden der zugrundeliegende

Wirkmechanismus der verschiedenen DNAzym-Therapien aufgeklärt werden. Dafür

wird zunächst analysiert, ob eine Reduktion der Expression der oben genannten

Transkriptionsfaktoren durch die DNAzym-Behandlung erreicht werden kann. Darüber

hinaus soll eine Zytokin Sekretionsassay Aufschluss darüber geben, ob die pro-

inflammatorischen Zytokine, die von TH1 und TH2 Zellen während der Colitis

Entstehung und des Verlaufs sekretiert werden, verringert produziert werden, nachdem

die Versuchstiere die DNAzyme verabreicht bekommen haben. Im weiteren Verlauf

sollen Cryoschnitte vom Colon Gewebe der Versuchstiere für histologische Färbungen

verwendet werden, um zu analysieren, ob Entzündungsparameter wie Krypten

Verdickung und Immunzell-Infiltration durch die DNAzym Verabreichung reduziert

werden können. Darüber hinaus sollen Immunfluoreszenzfärbungen von Colon

Cryoschnitten weiter Aufschluss über die Präsenz von Entzündungsparametern wie

zum Beispiel MPO-produzierende Zellen geben. Weiterhin sollen die DNAzyme als

mögliche therapeutische Behandlung auch bei weiteren Entzündungsmodellen wie

spontane Ileitis (TNFΔARE) oder chronischer TNBS Colitis getestet werden, um einen

Einfluss des gewählten Versuchsmodells ausschließen zu können. Ferner soll eine

neue Applikationsform für das T-bet spezifische DNAzym etabliert werden, da man mit

der rektalen Gabe lokal auf das Colon und Rektum beschränkt ist, eine Wirkung aber

im gesamten Gastrointestinaltrakt durch zum Beispiel orale Applikation wünschenswert

wäre. Hierfür soll die Passagezeit einer Kapsel spezifischer Größe mittels

Computertomographie-Messung ermittelt werden, um dann anschließend eine Kapsel

herstellen zu können, die das DNAzym innerhalb dieser ermittelten Zeitspanne freisetzt

(zeitverzögerte Freisetzung).

Ziel dieser Versuche ist es, innovative Therapieformen für Colitis ulcerosa und Morbus

Crohn Patienten mit Hilfe experimenteller Modelle zu erforschen und DNAzyme als

Medikation für klinische Studien vorzubereiten und zu verbessern.

Material und Methoden

26

5 Material und Methoden

5.1 Material

5.1.1 Fertigkits

Kit Firma

NucleoSpin® RNA Macherey-Nagel

iScriptTM cDNA Synthesis Kit Bio Rad

SensiFASTTMSYBR® No-ROX Kit Bioline

Foxp3/Transcription Factor

Fixation/Permeabilization Kit eBioscience

Mouse IL-5 ELISA Max Standard BioLegend


Mouse IL-13 ELISA Ready-SET-Go! eBioscience


Mouse IL-9 ELISA Kit Cusabio

Mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! eBioscience

Lamina Propria Dissociation Kit, mouse Miltenyi Biotec

CD4 (L3T4) MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec

5.1.2 Primärantikörper

Antikörper Firma Verdünnung/

Konzentration Verwendung

Anti-human CD4

Klon: OKT4 BioLegend 1:50 Immunfluoreszenzfärbung

Anti-human/mouse/rat

MPO

polyklonal

Thermo Fisher

Scientific 1:50 Immunfluoreszenzfärbung

Anti-human/mouse/rat

GATA-3

polyklonal

Santa Cruz

Biotechnology 1:50 Immunfluoreszenzfärbung

Anti-mouse CD4

Klon: GK1.5 eBioscience 1:50 Immunfluoreszenzfärbung

Anti-human/mouse

GATA-3 eFluor660

Klon: TWAJ

eBioscience 1:20 FACS Färbung

Anti-human/mouse T-

bet APC MACS Miltenyi 1:20 FACS Färbung


27

polyklonal

Anti-human CD4

PE/APC

Klon: RPA-T4

BioLegend 1:100 FACS Färbung

Anti-mouse CD3

Klon: 17A2 BioXCell 4µg/ml Stimulation von T-Zellen

Anti-mouse CD28

Klon: 37.51 BioXCell 4µg/ml Stimulation von T-Zellen

5.1.3 Sekundärantikörper

Antikörper Firma Verdünnung Verwendung

Goat anti-rabbit Alexa

Fluor 555

Thermo Fisher


Goat anti-rat Alexa

Fluor 488

Thermo Fisher


Goat anti-mouse Alexa

Fluor 488

Thermo Fisher


5.1.4 PCR Primer

Primer Human/Maus Firma Order#/Sequenz

h1GATA-3 fw Human Metabion GAG ATG GCA CGG GAC ACT

ACC T

h1GATA-3 rev Human Metabion TGG TTG TGG TGG TCT GAC AGT

TC

Hs_RRN18S_1_SG Human Qiagen QT00199367

Hs_TBX21_1_SG Human Qiagen QT00042217

Mm_Foxp3_1_SG Maus Qiagen QT00138369

Mm_Gata3_1_SG Maus Qiagen QT00170828

Mm_Il10_1_SG Maus Qiagen QT00106169





Mm_Rn18s_3_SG Maus Qiagen QT02448075


28

5.1.5 Substanzen

Artikel Firma Artikelnummer/

PZN

1xPBS (Dulbecco`s Phosphate

Buffered Saline) Sigma-Aldrich P5493

4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-

oxazolin-5-one (Oxazolon) Sigma-Aldrich E0753

Aceton ROTIPURAN® Carl Roth 9372.5

Amphotericin B solution Sigma-Aldrich A2942

Aqua B. Braun Braun 0082479E

DTT Agilent Technologies Santa

Clara USA 0281

eBioscience™ Permeabilization

Buffer (10X) Thermo Fisher Scientific 00-8333-56

EDTA Solution Carl Roth 9152.1

Entellan Merck 1079610100

Fetales Kälberserum PAA Cölbe MT35016CV

FORENE® 100% (V/V) Abbvie 2594.00.00

Gentamicin solution Sigma-Aldrich G1397

HBSS (Hanks' Balanced Salt

Solution) no calcium, no

magnesium

Thermo Fisher Scientific 14170112

Hoechst Sigma-Aldrich 861405

Ketamin Inresa Inresa Arzneimittel GmbH 4089014

Kulturmedium RPMI

Luminol L-012 Wako Chemicals Europe 120-04891

Methanol ROTIPURAN® Carl Roth 4627.5

Mowiol Carl Roth 0713-2

Olivenöl Sigma-Aldrich O1514

Protein-Block Serum-Free DAKO X0909

Rompun® 2% (Xylazin) BAYER 6293841.00.00

SensiFAST™ SYBR® No-ROX

Kit Bioline BIO-98050

Tissue-Tek® O.C.T.TM

Compound Sakura 4583

Tween-20 Merck 817072

Eosin Merck 1159350025

Hämalaunlösung sauer nach

Mayer Carl Roth T865.1


29

Roti®-Histol Carl Roth 6640.1

HEPES (1M) Thermo Fisher 15630106

Flüssigstickstoff Linde München -

Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML

2-Propanol Carl Roth 0733.1

PMA Sigma Aldrich P1585

Ethanol >99,5%, Ph.Eur., reinst Carl Roth 5054.3

Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061

2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid

solution (TNBS) Sigma-Aldrich P2297

Roti®-Histofix 4,5% Carl Roth 2213.5

5.1.6 Puffer und Lösungen

Puffer/Lösung Herstellung

2M H2SO4 56,24ml Schwefelsäure; add 500ml Aqua dest.

Aceton-Olivenöl 4 : 1 (Aceton : Olivenöl) Volumenverhältnis

PBS-T 1xPBS mit 0,1% Tween-20

FACS-Puffer 1xPBS mit 2% FCS

MACS-Puffer 1xPBS mit 2% FCS und 10mM EDTA

5.1.7 Tiere

Die benötigten C57BL/6 und BALB/c Versuchstiere wurden bei Charles River

Laboratories geordert (weiblich je 6-12 Wochen alt) und anschließend im hausinternen

Tierstall unter SPF (spezifisch Pathogen-freien) Bedingungen gehalten. Die

konditionalen GATA-3 CD4 und Tbx21 CD4 KO Tiere (7-10 Wochen alt) wurden

ebenfalls im hausinternen Tierstall unter SPF Bedingungen gehalten. Die TNFR1/R2

KO Tiere (10-15 Wochen alt) und die TNFΔARE Mäuse (3-15 Wochen alt) wurden auch

unter SPF Bedingungen gehalten. Die tierexperimentellen Versuche fanden nach

tierschutzrechtlichen Richtlinien der Regierung von Unterfranken und ethischen

Richtlinien der Friedrich-Alexander-Universität statt.


30

5.1.8 Software

Name Verwendung für Hersteller/Firma

CFX Manager 3.1 Auswertung der qRT-PCR Bio-Rad Laboratories, Inc.

Excel 2010 Auswertung der qRT-PCR,

der Gewichtsdokumentation

und der ELISA-Analysen

Microsoft

GraphPad Prism 6 Erstellen der Diagramme und

der Gewichtskurven;

statistische Auswertung

GraphPad Software, Inc.

IrfanView 4.51 Auswertung der Endoskopie

Videos

Irfan Skiljan

ImageJ 1.52a Auszählung der

Immunfluoreszenzfärbung

Wayne Rasband

Powerpoint 2010 Erstellen der Bildtafeln Microsoft

SimpleViewer 1.3.0.0 Auswerten der CT-Scan

Bilder

Rigaku

5.1.9 Geräte

Gerätename Hersteller

Accuri C6 Durchflusszytometer BD Heidelberg

Analysenwaage ABS-N/ABJ-NM KERN & SOHN Balingen-Frommern

CFX Real-Time System Bio-Rad Hercules U.S.A.

Chirurgische Pinzette Fine Science Tools Heidelberg

Chirurgische Schere Fine Science Tools Heidelberg

CO2 Brutschrank HERAcell® 150 Thermo Scientific Rockford U.S.A.

Dewargefäß Karlsruher Glastechnisches Werk KGW-

Isotherm Karlsruhe

Durchlichtmikroskop DMI4000 B Leica Mikrosysteme Wetzlar

Gefrierschrank -20°C Liebherr Strullendorf

Gefrierschrank -80°C Thermo Scientific Rockford U.S.A.

gentleMACS™ Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Bergisch Gladbach

Isofluran Verdampfer Eickemeyer - Medizintechnik für Tierärzte KG

Tuttlingen

IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer Waltham U.S.A.

Konfokal-Mikroskop TCS SP5 II Leica Mikrosysteme Wetzlar

Kryostat CM3050 S Leica Mikrosysteme Wetzlar

Kühlschrank +4°C Liebherr Strullendorf

Laborabzug 2-453-DAND Köttermann Uetze/Hänigsen


31

Microplate Reader Infinite M200 Tecan Group Männedorf Schweiz

Mini-Endoskop Carl Storz Tuttlingen

Nanodrop ND-1000 NanoDrop Technologies Wilmington U.S.A.

Neubauer Zählkammer Carl Roth Karlsruhe

Pipettierhilfe Pipettboy/-girl Integra Biosciences Fernwald

Quantum GX microCT Imaging System PerkinElmer Waltham U.S.A.

Rotator MACSmix Miltenyi Bergisch Gladbach

Sauerstoffkonzentrator OxyVet Eickemeyer - Medizintechnik für Tierärzte KG

Tuttlingen

Schwingmühle MM 400 Retsch Haan

Scientific Industries SI™ Vortex-Genie™ 1

Touch Mixer Thermo Scientific Rockford U.S.A.

Sicherheitswerkbank HERAsafe KS Thermo Scientific Rockford U.S.A.

T100 Thermal Cycler Bio-Rad Hercules U.S.A.

Thermomixer comfort Eppendorf Hamburg

Tierhaarschneider Aesculap Exacta B. Braun Melsungen AG Melsungen

Tierwaage Denver Instrument Bohemia U.S.A.

Zentrifuge 5424 R Eppendorf Hamburg

Zentrifuge Multifuge X1R Thermo Scientific Rockford U.S.A.


32

5.2 Methoden

5.2.1 RNA-Isolation

Die RNA aus Colon-Gesamtgewebe wurde mit dem NucleoSpin® RNA Kit von

Macherey-Nagel isoliert. Dabei wurde nach dem angegebenen Protokoll vorgegangen.

Es wurde lediglich zur Lyse des Gewebes statt β-Mercaptoethanol 10mM DTT

verwendet.

5.2.2 cDNA Synthese

Es wurden standardmäßig 500ng RNA für die Umschreibung in cDNA eingesetzt.

Hierfür wurde das iScriptTM cDNA Synthesis Kit von BioRad verwendet. Die

Umschreibung wurde nach Protokoll ohne Änderungen durchgeführt.

5.2.3 quantitative Realtime-PCR

5.2.3.1 qRT-PCR mit humaner cDNA

Zur Genanalyse der humanen cDNA wurde diese im Vorfeld 1:50 mit Nuklease-freiem

Wasser verdünnt. Anschließend wurde 1µl der cDNA-Verdünnung pro Ansatz

eingesetzt. Das Volumen eines Ansatzes beträgt 20µl. Die Primer der jeweiligen

untersuchten Gene wurden 1:10 pro Ansatz eingesetzt. Als Fluoreszenz-Format wurde

die SYBR-Green Methode ausgewählt. Der SYBR-Green-Mix aus dem

SensiFASTTMSYBR® No-ROX Kit wurde 1:2 pro Ansatz eingesetzt. Anschließend

wurde das Volumen des Ansatzes mit Nuklease-freiem Wasser aufgefüllt.

5.2.3.2 qRT-PCR mit muriner cDNA

Die cDNA-Proben aus der Maus wurden vorher 1:10 mit Nuklease-freiem Wasser

verdünnt. Der qPCR-Ansatz wurde wie unter 5.2.3.1 beschrieben pipettiert.

5.2.3.3 Auswertung der qRT-PCRs

Für die Auswertung der qRT-PCR wurde die relative Expression in Relation zum

Haushaltsgen 18srRNA berechnet. Dieses Haushaltsgen wird im Colon konstitutiv

ohne Schwankungen und unabhängig von Entzündungsparametern exprimiert [79, 80].

Für die Berechnung wurde folgende Formel verwendet:

𝑟𝑒𝑙. 𝑚𝑅𝑁𝐴 𝐸𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠𝑖𝑜𝑛 = 2−[𝑐𝑡(𝑢𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑢𝑐ℎ𝑡𝑒𝑠 𝐺𝑒𝑛)−𝑐𝑡(𝐻𝑎𝑢𝑠ℎ𝑎𝑙𝑡𝑠𝑔𝑒𝑛)]

ct meint hier den ct-Wert (Zyklus der PCR-Amplifikation), bei dem das

Fluoreszenzsignal des verwendeten Farbstoffes SYBR Green (lagert sich in die neu


33

synthetisierte doppelsträngige Nukleinsäuren ein) das „Hintergrundrauschen“

übersteigt.

5.2.4 Isolation der CD4+ Zellen aus der Milz

Zunächst wurde die Milz entnommen und mit Hilfe zweier Objektträger (zwischen den

rauen Beschriftungsfeldern) zerrieben. Die herausgelösten Zellen wurden in etwas

MACS-Puffer aufgenommen und einmal über einen 100µm Filter filtriert, um

Gewebereste zu entfernen. Die anschließende Isolation der CD4+ Milzzellen erfolgte

unter Verwendung des CD4 (L3T4) MicroBead Kits von Miltenyi Biotec. Die Isolation

wurde nach Protokoll ohne Änderungen durchgeführt.

5.2.5 LPMC-Isolation aus dem Colon

Zu Beginn wurde das Colon entnommen, längs aufgeschnitten und anschließend in

circa 1 bis 2cm große Stücke zerkleinert. Um Stuhlreste zu entfernen wurden die

Colon-Stücke in 1xHBSS gelegt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT)

gewaschen. Anschließend wurden die LPMCs mit Hilfe des Lamina Propria

Dissociation Kits von Miltenyi Biotec isoliert. Das Protokoll wurde wie folgt abgeändert:

Um eine ausreichend große Menge an vitalen Zellen zu erhalten, wurde der

Verdauschritt auf 15 Minuten verkürzt.

5.2.6 Kultivierung von primären Zellen

Die isolierten LPMCs und CD4+ Milzzellen wurden im Anschluss wenn nötig kultiviert.

Dazu wurden 2,5 Millionen Zellen in 1ml Medium auf eine 48-Well Platte ausgesät. Das

Kulturmedium bestand aus RPMI mit folgenden Zusätzen: 10% FCS, 1%

Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin. Um spezifisch T-Zellen zu stimulieren

wurde die Zellsuspension mit anti-CD3 und anti-CD28 (je 4µg/ml) versetzt und für 48

Stunden bei 37°C mit einer CO2 Konzentration von 5% inkubiert.

5.2.7 FACS-Färbung von Zellen

Die durchflusszytometrische Färbung der Zellen fand wie folgt statt. Die Zellen wurden

geerntet und in FACS-Röhrchen überführt. Um restliches Medium zu entfernen wurden

500µl FACS-Puffer zugegeben und die Zellsuspension kurz gemischt (bei RT).

Anschließend wurden die Zellen bei 329 x g für 5 Minuten (bei RT) ab zentrifugiert und

der Überstand verworfen (Waschschritt). Für die Oberflächenfärbung wurde die

Zellsuspension mit der entsprechenden Menge an gewünschtem Antikörper versetzt

und 15 Minuten bei 4°C lichtgeschützt inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wie

oben beschrieben gewaschen und zentrifugiert. Daraufhin wurden die Zellen mit Roti®-


34

Histofix 15 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt fixiert und im Anschluss erneut

gewaschen und zentrifugiert. Danach wurden die Zellen für intrazelluläre Marker

gefärbt. Dazu wurde die Zellmembran permeabilisiert, um ein Eindringen der

Antikörper ins Zellinnere zu gewährleisten (Inkubation mit eBioscience™ 1x

Permeabilization Buffer für 5 Minuten lichtgeschützt bei Raumtemperatur). Daraufhin

wurde der entsprechende Antikörper zur Zellsuspension gegeben und erneut 15

Minuten bei Raumtemperatur und lichtgeschützt inkubiert. Im Anschluss wurden die

Zellen wie oben beschrieben gewaschen, zentrifugiert und im Durchflusszytometer

analysiert. Um FoxP3 intrazellulär zu färben, wurde das Foxp3/Transcription Factor

Fixation/Permeabilization Kit von eBioscience verwendet. Die Färbung fand nach dem

eBioscience Protokoll statt.

5.2.8 Hämatoxylin-Eosin (H&E) Färbung

Für die H&E Färbung wurden die Cryoschnitte zunächst 2 Minuten in Hämalaun-

Lösung gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte für 7 Minuten unter fließendes

Wasser zum Waschen gestellt. Daraufhin sind die Schnitte 7 Minuten mit Eosin

behandelt und anschließend erneut mit Wasser ausgewaschen worden. Um den

Schnitten die Flüssigkeit zu entziehen, wurde danach eine aufsteigende Ethanol-Reihe

durchgeführt (70%iger, 80%iger, 90%iger Ethanol und Isopropanol). Abschließend

wurden die Schnitte 5 Minuten mit Rotihistol behandelt und dann mit Entellan

eingedeckelt. Bis zur Auswertung am Durchlichtmikroskop wurden die Schnitte dunkel

bei Raumtemperatur gelagert.

5.2.9 Immunfluoreszenzfärbung von Cryoschnitten

Die Cryoschnitte wurden zunächst bei Raumtemperatur aufgetaut. Anschließend

wurden die Schnitte fixiert (PFA 15 Minuten, -20°C temperierter Methanol 10 Minuten

oder -20°C temperierter Aceton 5 Minuten), in 1xPBS gewaschen, mit Fettstift

umrandet und mit DAKO Proteinblock für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer

Feuchtklammer blockiert. Anschließend wurden die Schnitte mit der Primärantikörper-

Lösung über Nacht bei 4°C in der Feuchtkammer inkubiert. Nach 24 Stunden wurden

die Schnitte mit PBS-T gewaschen und mit dem Sekundärantikörper für 2 Stunden in

der Feuchtkammer bei Raumtemperatur inkubiert. Sollte ein zweiter Marker gefärbt

werden, wurde das oben beschriebene Protokoll wiederholt. Abschließend wurden die

Schnitte 5 Minuten bei Raumtemperatur HOECHST gefärbt, gewaschen und mit

Mowiol eingedeckelt. Bis zur konfokalen Mikroskopie wurden die Objektträger bei 4°C

lichtgeschützt gelagert.


35

5.2.10 Experimentelle Colitis-Modelle

Um neue Behandlungstherapien testen zu können, wurden experimentelle Colitis-

Modelle mit Mäusen durchgeführt. Diese sollen im Folgenden kurz erläutert werden.

5.2.10.1 akute Oxazolon-Colitis

Das Hapten Oxazolon rektal verabreicht schwere Entzündungen im Colon und dient

daher als Modell, um Colitis ulcerosa zu imitieren. Die Oxazolon- induzierte

Entzündung ist charakterisiert durch eine hohes Maß an einwanderten Immunzellen

wie Makrophagen, Neutrophilen und Lymphozyten und eine Überproduktion an

proinflammatorischen Zytokinen wie IL-5, IL-9 und IL-13 [81, 82]. Zu Beginn des

Modells ist es nötig die Versuchstiere mit einem 3%igem Oxazolon-Aceton-Öl Gemisch

topisch zu sensibilisieren. Aceton fungiert hierbei als Trägerstoff für das Hapten, das

Olivenöl vermeidet verkrustete Exsudate. Das Fell am Bauch der Tiere wird rasiert und

100µl der Sensibilisierungsflüssigkeit direkt auf die Haut gegeben (Abbildung 7). Nach

5 Tagen werden die Tiere mit 100µl 1% Oxazolon in 50%iger Ethanol Mischung über

intrarektale Administration mit Hilfe eines flexiblen Schlauchs behandelt und somit die

akute Entzündung des Colons induziert. Der Ethanol ist in diesem Fall für das

Durchbrechen der Colon Epithelbarriere essentiell, so dass das Oxazolon in die

Mukosa eindringen kann. Dort bindet das Hapten körpereigene Peptide und „maskiert“

sie als körperfremd. Dies löst die Typ 2 vermittelte Immunantwort im Colon aus. Die

Entzündung lässt sich über Mini-Endoskopie an den beiden darauffolgenden Tagen

nach der Auslösereaktion analysieren und dokumentieren (Abbildung 7). An Tag 2

nach der Auslösereaktion ist der Hochpunkt der Entzündung erreicht und die Tiere

können für eine Organentnahmen und weitere Analysen verwendet werden. Um die

Parameter der Oxazolon Entzündung genauer zu analysieren, werden folgende

Methoden während und nach Beendigung des Oxazolon Versuchs angewendet:

Gewichtsdokumentation im Zeitraum der Colitis, in vivo Imaging wie IVIS, Erstellen des

MEICS Scorings, histologische H&E Färbung von Cryoschnitten und MPO-

Immunfluoreszenzfärbung von Cryoschnitten.


36

Abbildung 7 Chemisch-induzierte akute Colitis

Schema der akuten chemisch induzierten Colitismodelle wie Oxazolon und TNBS. Gezeigt sind die

Zeitpunkte der Sensibilisierung, der Challenge und der endoskopischen Aufnahmen

5.2.10.2 akute TNBS-Colitis

Wie Oxazolon induziert auch das Hapten TNBS über rektale Gabe eine akute

Entzündung des Colons. Diese ist charakterisiert durch Immunzell-Infiltration und eine

gesteigerte Ausschüttung von TH1 und TH17 Zytokinen [81] wie Interferon-γ und IL-17.

Darüber hinaus ist beschrieben, dass durch rektale TNBS-Behandlung die Fibrose

Bildung begünstigt wird [81, 83]. Deshalb dient die TNBS-induzierte Colitis als

geeignetes Modell, um eine Morbus Crohn Erkrankung in der Maus zu imitieren. Auch

bei diesem experimentellen Modell ist eine anfängliche Sensibilisierung mit dem

1%igem Hapten-Aceton-Öl Gemisch notwendig. Diese wird ebenfalls wie unter

5.2.10.1 beschrieben durchgeführt. Nach 5 Tagen werden die Versuchstiere mit 100µl

1% TNBS in 40%iger Ethanol Mischung rektal behandelt, um die Colitis zu induzieren.

Der Entzündungsverlauf kann wiederrum über mini-endoskopische Aufnahmen

dokumentiert werden, wobei auch bei diesem Modell ein Hochpunkt der Entzündung

am zweiten Tag nach der TNBS-Behandlung erreicht ist (Abbildung 7). Dann können

die Versuchstiere ebenfalls für weitere Analysen verwendet werden (siehe ebenfalls

5.2.10.1).


37

5.2.10.3 chronische TNBS-Colitis

Wie bei der akuten TNBS Colitis wird bei der chronischen Verlaufsform dieses Modells

durch rektale Applikation des Haptens eine Entzündung im Colon hervorgerufen. Durch

mehrmaliges Behandeln mit TNBS im Abstand je einer Woche wird somit ein

Entzündungsmodell induziert, das dem Verlauf einer CED Erkrankung durch sich

wiederholende Entzündungsschübe mit anschließenden Remissionsphasen noch

ähnlicher ist [81, 83] (Abbildung 8). Dabei ist es wichtig zu beachten, dass jede rektale

Auslösereaktion durch TNBS auch eine weitere Sensibilisierung der Versuchstiere

darstellt und man deshalb von Zyklus zu Zyklus die TNBS-Konzentration anpassen

muss, da das Level der Entzündung im Laufe des Versuchs zunimmt. Nach 8 Zyklen

wurden die Versuchstiere dann für die Organentnahme und Zellisolation verwendet.

Abbildung 8 chronische TNBS-Colitis (nach Fichtner-Feigl et al., Mucosal Immunol. 2008)

Schema der chronischen TNBS Colitis über 8 Zyklen mit wöchentlicher TNBS Behandlung und

Outcome an Tag 56

5.2.11 In vivo Imaging

5.2.11.1 Mini-Endoskopie und MEICS Scoring

Für die Mini-Endoskopie Aufnahmen wurden die Versuchstiere zunächst mit Isofluran

narkotisiert. Dazu wurden die Tiere in eine Kammer gesetzt, in der sie über die

Atemluft das einströmende Isofluran einatmeten (1,5-2% Isofluran; 25%

Sauerstoffgehalt). Nach wenigen Minuten waren die Mäuse narkotisiert. Anschließend

wurde die Entzündung mit dem Mini-Endoskop von Karl Storz (Tuttlingen) dokumentiert

und mit Hilfe des Programms IrfanView ausgewertet (Videobegutachtung). Um den

Entzündungsscore (murine endoscopic score of colitis severity, kurz: MEICS) der

Mäuse zu ermitteln, wurden die Endoskopie Videos nach folgenden Kriterien bewertet

[81, 82]:


38

Parameter Score

Durchsichtigkeit 0 – 3

Granularität 0 – 3

Fibrinbildung 0 – 3

Vaskularität 0 – 3

Stuhlbeschaffenheit 0 – 3

Somit kann ein maximaler Entzündungsscore von 15 pro Maus erreicht werden.

5.2.11.2 IVIS-Aufnahmen

Mit Hilfe des IVIS Spektrum in vivo Imaging Systems (PerkinElmer) lässt sich die

Stärke der Entzündung der Versuchstiere genauer bestimmen. Hierfür wurde den

Tieren (am 1. Tag nach der Entzündungsinduktion) zunächst 100µl einer 10mmol

Luminol-Lösung über intraperitoneale Injektion verabreicht. Redox-sensitives Luminol

emittiert Lumineszenz mit einer Wellenlänge von 425nm, wenn es mit einem

oxidierenden Stoff reagiert [84]. Das Enzym Myeloperoxidase (MPO) ist zumeist in

Granulozyten, Neutrophilen und Makrophagen zu finden und ist wichtig für die Bildung

reaktiver Sauerstoffspezies (oxidierende Eigenschaften), die zum Beispiel bei der

Phagozytose benötigt werden [84]. Luminol reagiert mit den oxidierenden

Sauerstoffspezies und emittiert die Lumineszenz, die mit dem IVIS detektiert werden

kann [84]. Da die MPO-produzierenden Immunzellen während einer Entzündung

verstärkt ins Colon einwandern, kann dort verstärkt Lumineszenz gemessen werden.

Mit dem IVIS System lässt sich also nicht nur sagen, wo die Entzündung im Colon

lokalisiert ist (Ort des Signals), sondern auch wie stark die Entzündung im Colon

fortgeschritten ist (Lumineszenzstärke). Nach Luminol-Injektion wurden die

Versuchstiere wie bei der Endoskopie Vorbereitung mit Hilfe von Isofluran in

narkotisiert und anschließend wenige Minuten nach der Luminol Gabe die

Lumineszenz Aufnahmen im IVIS aufgenommen.

5.2.11.3 Quantum FX CT

Für die Messung der Passagezeit einer Kapsel spezifischer Größe durch den

Gastrointestinaltrakt (GIT) wurde der Quantum FX CT Scan verwendet. Die

Versuchstiere wurden nach Schlunden der Kapsel mit Hilfe von Isofluran in Narkose

versetzt (siehe 5.2.11.1) und anschließend im CT Scan untersucht. Dazu wurde das

Tier auf den Untersuchungstisch gelegt, bei dem über eine Atemmaske weiterhin eine


39

Isofluran-Anästhesie möglich ist. Zunächst wurden Übersichtsaufnahmen gemacht, die

ohne eine Rotation der Röntgenquelle der klassischen Röntgenaufnahme ähneln [85].

Diese dienen zu Einstellung des Untersuchungstisches und des Versuchstieres.

Nachdem das Versuchstier über Einstellung des Röntgenschlittens in Position gebracht

wurde, wurde eine Computertomographie Aufnahme erstellt. Durch die Rotation der

Röntgenquelle im Ringtunnel (auch Gantry genannt) entstehen Röntgen-

Absorptionsbilder aus mehreren Richtungen, die anschließend vom Computer

berechnet und in ein Bild umgesetzt werden [85]. Dieses lässt sich anschließend mit

Hilfe der Software SimpleViewer auswerten.

5.2.12 Statistik

Zur statistischen Untersuchung einer einfaktoriellen Varianz unter mehreren

untersuchten Gruppen (>2) bestehend aus unabhängigen Individuen wurde der One-

Way ANOVA Test durchgeführt [86]. Zur Signifikanzbestimmung von zwei

unabhängigen untersuchten Gruppen untereinander wurde der ungepaarte student`s t-

Test durchgeführt [87], wobei die Proben dabei der Normalverteilung entsprachen. Die

Bewertung des p-Wertes der Signifikanz fand nach folgendem System statt:

* p

Ergebnisse

40

6 Ergebnisse

6.1 Untersuchungen zur Wirkweise eines GATA-3 spezifischen

DNAzyms im experimentellen Colitismodell

6.1.1 Analyse der GATA-3 Expression in humanem Darmgewebe

Zu Beginn wurde die Expression von GATA-3 mit Hilfe einer quantitativen Realtime-

PCR (qRT-PCR) Analyse untersucht. Aus humanen Darmbiopsien wurde hierfür die

RNA isoliert und in sogenannte cDNA (englisch: complementary DNA) umgeschrieben.

Die gemessene GATA-3 Expression wurde auf das Haushaltsgen 18S rRNA

normalisiert, da dieses Gen stabil im Darm ohne Schwankungen durch

Entzündungsprozesse exprimiert wird [79, 80]. Die Proben wurden vom

endoskopierenden Arzt in die Scores 0 bis 3 eingeteilt, wobei bei 0 und 1 eine inaktive

Entzündung und 2 und 3 eine aktive Entzündung im Darm vorlag. Das Ergebnis der

qRT-PCR zeigt, dass das GATA-3 mRNA-Level bei einer aktiven CU-Entzündung (CU

Score 2-3) signifikant ansteigt verglichen mit Proben aus unentzündetem Darmgewebe

(Normalgewebeproben; N) (Abbildung 9 Oben). Dieser Anstieg kann noch deutlicher

veranschaulicht werden, wenn man die CU-Patientenproben in die jeweiligen Scores

(Score 0, 1, 2 und 3) unterteilt und untereinander vergleicht. Bereits bei einer leichten

CU-Entzündung (Score 1) steigt das GATA-3 mRNA-Level signifikant über das in den

Normalgewebeproben detektierbare Level (Abbildung 9 Oben). Vergleicht man die

Proben der Scores 2 und 3 mit den Proben aus unentzündetem Normalgewebe steigt

die GATA-3 Expression höchst signifikant an (Abbildung 9 Oben). Es konnte jedoch

kein signifikanter Unterschied im GATA-3 mRNA-Gehalt zwischen

Normalgewebeproben und Proben von MC-Patienten detektiert werden (Abbildung 9

Oben). Weiterhin wurden die gemessenen Proben nach Montreal Kriterien [88] sortiert

und die gemessene GATA-3 Expression verglichen, um zu analysieren, ob z.B. die

Lokalisation der Entzündung im Colon oder Ileum einen Einfluss auf das GATA-3

mRNA Expressionslevel hat. Bei den verschiedenen Altersstufen der Erstdiagnose der

Erkrankung (A1-A3) konnte kein Unterschied in der GATA-3 Expression detektiert

werden (Abbildung 9 Unten). Betrachtet man das Kriterium Behavior, also

Auffälligkeiten wie Fisteln und Stenosen (B2/3), die normalerweise nur bei einer MC

Entzündung auftreten, erkennt man deutlich, dass die GATA-3 Expression signifikant

sinkt, wenn Fisteln/Stenosen während der Endoskopie beobachtet werden können

(Abbildung 9 Unten). Die Lokalisation der Entzündung wird in die Kriterien L1

(Terminales Ileum), L2 (Colon) und L3 (Ileocolon) eingeteilt. Die GATA-3 Expression ist

Ergebnisse

41

am höchsten wenn die Entzündung im Colon lokalisiert ist und sinkt signifikant, wenn

die Probe aus dem entzündeten Ileum oder Ileocolon entnommen wurde (Abbildung 9

Unten).

Ergebnisse

42

Abbildung 9 GATA-3 mRNA Analyse in humanem CED Gewebe

[Oben] Analyse der GATA-3 mRNA Expression in humanen Proben von CU und MC Patienten und

gesunden Kontrollen mittels qRT-PCR. Signifikanzen sind angegeben (** p

Ergebnisse

43

Abbildung 10 GATA-3 Protein Analyse in humanem CED Gewebe

[Oben] Durchflusszytometrische Analyse humaner LPMCs von CU und MC Patienten und

gesunden Kontrollen, CD4+GATA-3+ Zellen sind gezeigt. Statistische Auswertung mit Signifikanzen

ist angegeben (* p

Ergebnisse

44

6.1.2 Analyse der Gata-3 Expression im Oxazolon-induzierten Colitismodell

Im Anschluss wurde überprüft, ob das Oxazolon-Colitismodell geeignet ist, um die

Funktion von GATA-3 während der Colitisentstehung zu untersuchen. Hierfür wurde

getestet, ob im Darmgewebe Oxazolon-entzündeter Mäuse ein Anstieg der Gata-3

Expression detektierbar ist. Es wurde eine qRT-PCR Analyse mit cDNA Proben aus

Colongesamtgewebe von unbehandelten Kontrollmäusen und Oxazolon-entzündeten

Mäusen durchgeführt. Das Ergebnis (Abbildung 11 Oben) zeigt deutlich, dass im

Vergleich zu Proben aus unbehandelten Mäusen die Proben Oxazolon-behandelter

Mäuse ein signifikant erhöhtes Gata-3 Level aufweisen. Anschließend wurde über eine

Spearman-Korrelation getestet, ob das Gata-3 mRNA-Level mit dem mRNA-Level

wichtiger TH2 Zytokine wie IL-5, -6, -9 und -13 korreliert. In Abbildung 11 Oben wird

ersichtlich, dass das Il-5, Il-6, Il-9 und Il-13 mRNA-Level signifikant mit dem Gata-3

mRNA-Level ansteigt, die Expression der Gene also positiv zueinander korreliert (R-

Wert > 0). Abschließend wurden Cryoschnitte von Colongewebe unbehandelter und

Oxazolon-behandelter Mäuse für Immunfluoreszenzfärbung verwendet und

konfokalmikroskopisch analysiert. Im Gewebe Oxazolon-entzündeter Mäuse konnten

hierbei deutlich mehr GATA-3 produzierende T-Zellen (CD4+GATA-3+) detektiert

werden als im Gewebe unbehandelter Mäuse (Abbildung 11 Unten). Diese Ergebnisse

sprechen dafür, dass das Oxazolon-Colitismodell ein Typ 2-mediiertes

Entzündungsmodell mit Beteiligung von TH2 Zellen darstellt, welches geeignet ist, um

die Funktion von GATA-3 während der Entzündungsbildung zu untersuchen.

Ergebnisse

45

Abbildung 11 GATA-3 Analyse in murinem Colitis-Gewebe

[Oben links] Analyse der Gata-3 mRNA Expression mit cDNA gewonnen aus Colon Gesamtgewebe

von unbehandelten und Oxazolon behandelten Mäusen (n=7-10)

[Oben rechts] Korrelationen nach Spearman für Gata-3 mRNA mit Il-5, Il-6, Il-9 und Il-13 mRNA.

Signifikanzen sind angegeben (* p

Ergebnisse

46

6.1.3 Analyse konditionaler GATA-3 KO Mäuse im Oxazolon-Colitismodell

Um die Funktion von GATA-3 in T-Zellen während der Entstehung einer Colitis zu

untersuchen, wurden konditionale KO (Knockout) Mäuse untersucht, denen GATA-3

ausschließlich in CD4+ Zellen (GATA-3ΔCD4) fehlt. Diese Mäuse wurden zunächst im

Oxazolon-induzierten Colitismodell untersucht. In Abbildung 12 (Oben) erkennt man

deutlich, dass das Fehlen des Transkriptionsfaktors in T-Zellen zu Folge hat, dass die

Mäuse eine reduzierte Entzündungsreaktion im Colon aufweisen. Die konditionalen KO

Mäuse zeigen deutlich weniger Fibrin und eine niedrigere Granularitätsrate als die WT

(Wildtyp) Kontrollmäuse. In der histologischen Färbung Hämatoxylin & Eosin (H&E) der

Colonschnitte der KO Mäuse sieht man, dass weniger Immunzellen in die Mukosa

infiltriert sind und die Krypten Struktur weniger zerstört ist (Abbildung 12 Oben)

verglichen mit Colonschnitten der WT Kontrollmäuse. Die Myeloperoxidase (MPO)-

Immunfluoreszenzfärbung zeigt ebenfalls, dass die konditionalen KO Mäuse weniger

stark entzündet sind, da weniger MPO-produzierende Zellen im Colon detektiert

werden können im Vergleich zu den WT Kontrollen (Abbildung 12 Oben). Im Anschluss

wurden die Überstände der kultivierten und stimulierten LPMCs der WT und der

konditionalen KO Mäuse mittels ELISA auf die Konzentration verschiedener Zytokine

untersucht. Dabei wurde ersichtlich, dass die Zellen der GATA-3ΔCD4 Mäuse weniger

proinflammatorische Zytokine IL-5, IL-6, IL-9 und IL-13 während der Stimulationsphase

in das umgebende Medium sezerniert haben als die Zellen der WT Kontrolltiere.

Allerdings produzierten die Zellen der KO Mäuse im selben Zeitraum mehr anti-

inflammatorisches IL-10 als die Zellen der Kontrolltiere (Abbildung 12 Unten). Darüber

hinaus konnte in den Überständen der LPMCs der GATA-3ΔCD4 Mäuse signifikant

weniger proinflammatorisch-wirkendes IFN-γ detektiert werden. Da dieses Zytokin in

der Regel von TH1 Zellen produziert wird, diese aber den Transkriptionsfaktor GATA-3

nicht exprimieren, wurde im Anschluss untersucht, ob die niedrige Konzentration von

IFN-γ eine Ursache für die reduzierte Entzündung der GATA-3ΔCD4 Mäuse im Oxazolon

Modell sein kann.

Ergebnisse

47

Abbildung 12 Akute Oxazolon Colitis mit konditionalen GATA-3 CD4 KO Tieren und Kontrollen

[Oben] Repräsentative Abbildungen der Mini-Endoskopie, der H&E Färbung von Colon

Cryoschnitten und der MPO-Immunfluoreszenzfärbung von Colon Cryoschnitten des Oxazolon

Experiments

[Unten] Ergebnisse der ELISAs von LPMC Überständen aus dem Oxazolon Experiment für die

Zytokine IL-5, IL-6, IL-13 und IL-10. Statistische Signifikanzen sind angegeben (* p

Ergebnisse

48

6.1.4 Analyse von IFN-γ KO Mäusen im Oxazolon-Colitismodell

Um die Rolle des Zytokins IFN-γ im Oxazolon Colitis Modell zu untersuchen und zu

testen, ob eine Fehlen oder eine Reduktion der Zytokinsekretion einen Einfluss auf die

Entzündung der Mäuse in diesem Modell hat, wurden IFN-γ KO Tiere und WT

Kontrolltiere mit Oxazolon behandelt und der Entzündungsverlauf dokumentiert. An

Tag 2 nach der Entzündungsinduktion mit Oxazolon kann man in der Mini-Endoskopie

erkennen, dass beide Versuchsgruppen ähnlich starke Anzeichen einer Colon

Entzündung aufweisen. Bei beiden Gruppen ist die Fibrinproduktion deutlich gesteigert,

die Darmwand verdickt und die Vaskularität erhöht (Abbildung 13 Links). Dies wird

auch im Entzündungsscore deutlich (Abbildung 13 Rechts Oben) und in der

Gewichtsdokumentation, die zeigt, dass beide Versuchsgruppen ähnlich viel Gewicht

über den Zeitraum des Experiments verlieren (Abbildung 13 Rechts Unten).

Abbildung 13 Akute Oxazolon Colitis mit IFN-γ KO Mäusen und WT Kontrolltieren

[Links] Repräsentative Bilder der Mini-Endoskopie an Tag 2 nach der rektalen Oxazolon-Behandlung

[Rechts Oben] Entzündungsscore der Versuchstiere (n=10)

[rechts Unten] Gewichtsdokumentation der Versuchsgruppen (n=10)

Ergebnisse

49

6.1.5 In vitro Wirkanalyse des Gata-3 spezifischen DNAzyms hgd40

Um die Funktion von GATA-3 weiter zu analysieren, soll eine spezifisch gegen

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Analyse DNAzym-basierter Therapiestrategien bei ... · Analyse DNAzym-basierter Therapiestrategien bei experimenteller Colitis Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität