48 WISSENSCHAFT · SPECIAL: DURCHFLUSSZYTOMETRIE

DANIEL-CHRISTOPH WAGNER, KAROLINE MÖLLER, CLAUDIA PÖSEL

FRAUNHOFER-INSTITUT FÜR ZELLTHERAPIE UND IMMUNOLOGIE, LEIPZIG

Cerebral stroke is one of the most important causes for death and dis -ability. Despite its considerable socio-economic burden, causal therapy isavailable for only 20 percent of patients. It has been shown that post-stroke immune responses significantly influence neurological outcome.Understanding these mechanisms could unveil novel targets for stroketreatment. Here we describe the use of flow cytometry for studying post-stroke sterile brain inflammation.

DOI: 10.1007/s12268-014-0407-4© Springer-Verlag 2014

Sozioökonomische Bedeutung desSchlaganfallsó In Industrienationen ist der Schlaganfalldie dritthäufigste Todesursache und der häu-figste Grund für erworbene Behinderungenim Erwachsenenalter. Die Wahrscheinlichkeit,einen Schlaganfall zu erleiden, steigt im Alterstark an; angesichts des demografischen Wan-dels ist in den nächsten Jahrzehnten von einerdeutlichen Zunahme der Fallzahlen auszu-gehen. Der erfreulichen Tatsache, dass dankverbesserter medizinischer Versorgungimmer mehr Patienten einen Schlaganfallüberleben, stehen die explodierenden Ge -sundheitskosten aufgrund von Nachbehand-lung, Pflege und Berufsunfähigkeit gegenü-ber. Untersuchungen zufolge belaufen sichdie Schlaganfall-bedingten Kosten alleine inDeutschland auf bis zu 7,1 Milliarden Europro Jahr [1].

Der ischämische Schlaganfall kann bislangnur auf eine Art behandelt werden: durch diemedikamentöse Auflösung des gefäßver-schließenden Thrombus (Thrombolyse). Die-se Notfallbehandlung ist jedoch limitiertdurch ein kurzes therapeutisches Zeitfenstersowie durch eine Reihe von Begleitumstän-den, die eine Behandlung ausschließen. Ins-gesamt bleiben über 80 Prozent aller Schlag-anfallpatienten unbehandelt. Das Ziel deraktuellen Schlaganfallforschung ist die Ent-wicklung neuer Therapiekonzepte, die einekausale Behandlung jenseits der bisher beste-henden Einschränkungen erlaubt. Einen mög-lichen Angriffspunkt könnten die komplexenimmunologischen Veränderungen nach einemSchlaganfall darstellen.

Sterile Entzündungsreaktion nacheinem SchlaganfallEin Schlaganfall wird in etwa 80 Prozent derFälle durch einen akuten Gefäßverschlussausgelöst (ischämischer Schlaganfall). DieMinderdurchblutung des Hirngewebes führtzu einem Kollaps des Funktions- und Erhal-tungsstoffwechsels und schließlich zumAbsterben von Hirnzellen und der Freiset-zung von Schaden-assoziierten Molekülen

Neuroimmunologie

Entzündung ohne Erreger – Rolle desImmunsystems nach Schlaganfall

BIOspektrum | 01.14 | 20. Jahrgang

˚ Abb. 1: Durchflusszytometrische Differenzierung leukozytärer Subpopulationen. A, Die Ver-wendung z. B. eines Acht-Farb-Panels erlaubt die Unterscheidung von mindestens acht verschie-denen Zellpopulationen. B, Durch das Zusammenfassen mehrerer Hauptpopulationen in einemFluoreszenzkanal (lineage) stehen die übrigen Kanäle für die Detektion hierarchisch untergeordne-ter Subpopulationen zur Verfügung. C, beispielhafte gating-Strategie, in der sukzessive die Haupt-populationen aus der heterogenen Suspension entfernt werden, bis die zahlenmäßig geringePopulation des Interesses (hier inflammatorische Monozyten) spezifisch abgegrenzt werden kann.TH-Zellen: T-Helferzellen; CTL: zytotoxische T-Zellen; Gran: Granulozyten.

A

C

B

(DAMPs, damage-associated molecular pat-terns) sowie von Zytokinen der Interleu-kin-1-Familie [2]. Diese Mediatoren bewir-ken in den ersten Stunden bis Tagen einensequenziellen Einstrom verschiedener Ent-zündungszellpopulationen in das geschä-digte Hirngewebe. Diese Entzündungsre-aktion wird als steril bezeichnet, da sienicht durch klassische Pathogene wie Bak-terien, Viren oder Pilze verursacht wird.Es wäre jedoch falsch, diese Immunreak-tion grundsätzlich als schädlich zubetrachten. Eine Reihe immunologischerProzesse ist erforderlich, um die stö-rungsfreie Resorption des nekrotischenGewebes und die Ausbildung einer reiz-freien Narbe oder Defekthöhle zu orches-trieren. Eine kürzlich veröffentlichte Stu-die beschreibt die vitale Rolle von Makro-phagen bei der Verhinderung sekundärerBlutungen, einer häufigen Komplikationdes Schlaganfalls [3]. Auf der anderen Sei-te ist eine ganze Reihe von sterilen Ent-zündungsprozessen bekannt, die den neu-rologischen Zustand des Patienten nochTage nach dem Schlaganfall erheblichbeeinflussen könnten [4, 5]. Die Förde-rung protektiver und Unterdrückungschädlicher Mechanismen der sterilen Ent-zündungsreaktion stellen daher eineninteressanten Ansatz für die Behandlungdes Schlaganfalls dar. Die Erforschung die-ser Thematik findet aktuell vor allem inkleinen Labornagern (Ratten und Mäuse)statt, weil nur so die komplexe Interaktionzwischen dem Immunsystem und demgeschädigten Hirngewebe studiert werdenkann.

Durchflusszytometrische Analysevon GewebenDie Durchflusszytometrie ist eine zentra-le Methode der immunologischen For-schung. Antikörperfärbungen gegen Ober-flächenmarker, Zytoplasma- oder Kern-proteine erlauben die spezifische Identi-fikation und Quantifizierung von Zellenin einer Suspension. Moderne Durch-flusszytometer können bis zu zwölf ver-schiedene Fluoreszenzfarbstoffe differen-zieren; Antikörperkombinationen odergemeinsame lineage-Färbungen ermög-lichen sogar die Detektion von zahlenmä-ßig geringen Subpopulationen (Abb. 1).Dabei ist die Durchflusszytometrie der his-tologischen Analyse, die in der Regel nichtmehr als vier verschiedene Parametergleichzeitig differenziert, weit überlegen.

BIOspektrum | 01.14 | 20. Jahrgang

Zudem erlaubt die Durchflusszytometrieeine Hochdurchsatz analyse von Gewebemit teilweise mehr als 500.000 Ereignis-sen; diese Dimensionen sind mit histolo-gischen Ansätzen undenkbar.

Um ein Gewebe durchflusszytometrischzu analysieren, muss es über mehreremechanische und enzymatische Arbeits-schritte in eine Einzelzellsuspension über-führt werden [6]. Dieser Prozess ist beiGehirngewebe besonders kritisch, da beieiner mangelhaften Aufreinigung vieleEntzündungszellen in den Geweberesi-duen verbleiben und nicht im Durch-flusszytometer detektiert werden. Auf deranderen Seite drohen bei einem übergro-ßen mechanischen Zellstress und zu hocheingesetzten Enzymkonzentrationen dasAbsterben von Zellen sowie die Internali-sierung von Rezeptoren, die möglicher-weise entscheidend für die Identifikationder Zellen sind.

Ein klarer Nachteil dieser Methode istder Verlust der Gewebestruktur und derräumlichen Verteilung der analysiertenZellen. Daher ist es immer sinnvoll, einedurchflusszytometrische Analyse inzusätzlichen Proben histologisch zu beglei-ten, um auffällige Zellpopulationen imGewebe verorten zu können.

Entzündungszellen akkumulierenim geschädigten HirngewebeBereits einen Tag nach experimentellemSchlaganfall kann eine deutliche Zunah-me von Entzündungszellen in der geschä-digten Hirnhemisphäre beobachtet wer-den (Abb. 2). Die sterile Entzündungsre-aktion führt zur Ausschüttung von Zyto-kinen und Chemokinen, die die Reifungund Freisetzung von Entzündungszellenaus dem Knochenmark und der Milz stei-gern und die gerichtete Bewegung dieserZellen in das geschädigte Gehirn vermit-teln. Wie bei allen Entzündungsreaktio-nen wird die Frühphase der Schlaganfall-bedingten Entzündung durch die Prota-gonisten des angeborenen Immunsystemsvermittelt: Zahlreiche Granulozyten wan-dern in das ischämische Gewebe ein undsind dort wahrscheinlich für eine weitereZunahme des Gewebeschadens verant-wortlich. Apoptotische Granulozytenlocken wiederum zirkulierende Monozy-ten an, die im Gewebe in phagozytierendeMakrophagen und dendritische Zellen aus-differenzieren [7]. Eine Besonderheit desGehirns sind die ortsständigen Makro-

phagen, die Mikrogliazellen. Diese werdendurch den Schlaganfall aktiviert und sind his-tologisch nicht mehr von den infiltriertenMakrophagen zu unterscheiden. Durchfluss-zytometrisch können Mikrogliazellen jedochanhand einer reduzierten Expression vonCD45 identifiziert werden (Abb. 2). T- undB-Lymphozyten sowie natürliche Killerzellen(NK-Zellen) sind zu diesem frühen Zeitpunktnach dem Schlaganfall noch nicht vermehrtim Hirngewebe zu finden (Abb. 3). Verschie-dene Untersuchungen zeigen jedoch, dass ins-besondere die T-Zellen einen langfristigenEinfluss auf den Heilungsverlauf nach einemSchlaganfall aufweisen [8].

Zusammenfassung und AusblickDie durchflusszytometrische Analyse vonGehirngewebe stellt eine wichtige Methodefür die Erforschung der sterilen Entzün-dungsreaktion nach einem Schlaganfall dar.

Neben der mehrdimensionalen phänotypi-schen Charakterisierung von einzelnen Zellenerlaubt die Durchflusszytometrie auch funk-tionelle Untersuchungen, wie z. B. die Bestim-mung von Apoptose oder die Expression funk-tionsbestimmender Zytokine und Rezeptoren.Das Verständnis neuroimmunologischerWechselwirkungen stellt eine wichtige Grund-lage für die Entwicklung neuer Therapiekon-zepte für den Schlaganfall dar. ó

Literatur[1] Kolominsky-Rabas PL, Heuschmann PU, Marschall D et al.(2006) Lifetime cost of ischemic stroke in Germany: resultsand national projections from a population-based stroke regis-try: the Erlangen Stroke Project. Stroke 37:1179–1183[2] Lukens JR, Gross JM, Kanneganti TD (2012) IL-1 familycytokines trigger sterile inflammatory disease.Front Immunol 3:315[3] Gliem M, Mausberg AK, Lee JI et al. (2012) Macrophagesprevent hemorrhagic infarct transformation in murine strokemodels. Ann Neurol 71:743–752

[4] Gelderblom M, Weymar A, Bernreuther C et al. (2012)Neutralization of the IL-17 axis diminishes neutrophil inva-sion and protects from ischemic stroke. Blood 120:3793–3802[5] Shichita T, Sugiyama Y, Ooboshi H et al. (2009) Pivotalrole of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cellsin the delayed phase of ischemic brain injury.Nat Med 15:946–950[6] Moller K, Stahl T, Boltze J et al. (2012) Isolation of inflam-matory cells from rat brain tissue after stroke.Exp Transl Stroke Med 4:20[7] Bratton DL, Henson PM (2011) Neutrophil clearance:when the party is over, clean-up begins.Trends Immunol 32:350–357[8] Chamorro A, Meisel A, Planas AM et al. (2012) The immu-nology of acute stroke. Nat Rev Neurol 8:401–410

Korrespondenzadresse:Dr. Daniel-Christoph WagnerFraunhofer-Institut für Zelltherapie und ImmunologiePerlickstraße 1D-04103 LeipzigTel.: 0341-355365416daniel-christoph.wagner@izi.fraunhofer.de

˚ Abb. 3: Quantifizierung der Leukozyten-Hauptpopulationen einen Tag nach experi-mentellem Schlaganfall. Zellen des angebo-renen Immunsystems sind signifikant erhöht(*p < 0,05; t-Test). Kleines Bild: MRT-Aufnah-me eines Rattenhirns nach Schlaganfall. Dieischämische Läsion ist klar im Cortex abzu-grenzen (Pfeile). Mo/Ma: Monozyten/Makrophagen.

˚ Abb. 2: Angeborene Immunantwort auf einen experimentellen Schlaganfall. A, myeloide Zellenin gesundem und ischämischem Hirngewebe (grün: Iba1; blau: Kernfärbung). Ruhende Mikroglia-zellen weisen einen kleinen Zellkörper mit feinen Fortsätzen auf, aktivierte Mikroglia und infiltrier-te Monozyten/Makrophagen sind dagegen rund und haben kaum Fortsätze. Balken: 20 μm. B, DerSchlaganfall führt zu einer deutlich sichtbaren Zunahme der CD45+-Entzündungszellen im Gehirn.C, Zusätzlich zu den residenten Makrophagen (1) und Mikrogliazellen (2) ist nach dem Schlag -anfall eine CD161+-aktivierte Mikroglia-Population nachweisbar (3).

A B C

50 WISSENSCHAFT · SPECIAL: DURCHFLUSSZYTOMETRIE

BIOspektrum | 01.14 | 20. Jahrgang

AUTORENDaniel-Christoph Wagner2000–2007 Medizinstudium anden Universitäten Marburg undLeipzig. 2006–2009 Promotionam Institut für Klinische Immu-nologie, Universität Leipzig undwissenschaftlicher Mitarbeiteram Fraunhofer-Institut für Zell-therapie und Immunologie (IZI).Seit 2009 Leitung der Arbeits-gruppe Ischämieforschung amFraunhofer IZI.

Karoline Möller1999–2006 Veterinärmedizin-studium an der Universität Leip-zig. 2006–2010 Promotion amVeterinär-Anatomischen Institut,Universität Leipzig. Seit 2010wissenschaftliche Mitarbeiterinam Fraunhofer IZI, Arbeitsgrup-pe Ischämieforschung.

Claudia Pösel2000–2005 Biotechnolo-giestudium an der Hoch-schule Anhalt in Köthen. Seit2008 technische und wis-senschaftliche Mitarbeiterinam Fraunhofer IZI, Arbeits-gruppe Ischämieforschung.Seit 2010 Promotion amFraunhofer IZI und der medi-zinischen Fakultät, Univer-sität Leipzig.