Erfahrungen mit den neuen mikrobiologischen ... · Wahl der Verdünnungen bei den MPN-Verfahren 4. Bedingungen bei Anwendung der Membranfiltration 5. Umgang mit Werten unter- und

Erfahrungen mit den neuen mikrobiologischen

Untersuchungsparametern nach

EU-Badegewässerrichtlinie 2006/7/EG

Dr. Alfons Hack

Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt

im Gesundheitswesen

Erfahrungsaustausch Badegewässer

Friedberg

25.03.2010

Die Publikation ist ausschließlich als Download beim UBA verfügbar.

http://www.umweltbundesamt.de/gesundheit/badegewaesser/index.htm

Herausgeber: Umweltbundesamt

Postfach 14 06

06813 Dessau-Roßlau

Tel.: 0340/2103-0

Telefax: 0340/2103 2285

Internet: http://www.umweltbundesamt.de

Redaktion: Dr. Regine Szewzyk

Dessau-Roßlau, Juli 2009

Empfehlung zur praktischen Umsetzung der

EG-Badegewässerrichtlinie (UBA 2009)

Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg

http://www.umweltbundesamt.de/gesundheit/badegewaesser/index.htm

Inhalt der UBA-Empfehlung zur praktischen

Umsetzung der EG-Badegewässerrichtlinie


1. Konformitätsbestimmung in der Übergangszeit

- E. coli

- Intestinale Enterokokken

2. Angabe der Untersuchungsergebnisse, Vergleichbarkeit

mikrobiologischer Untersuchungsverfahren

3. Wahl der Verdünnungen bei den MPN-Verfahren

4. Bedingungen bei Anwendung der Membranfiltration

5. Umgang mit Werten unter- und oberhalb der Nachweis-

bzw. der Bestimmungsgrenze

Referenzmethoden

Parameter

(Dimension)

Norm Methodik

Intestinale Enterokokken

(KBE/100 mL)

DIN EN ISO 7899-1

DIN EN ISO 7899-2

MPN

MF

Escherichia coli

(KBE/100 mL)

DIN EN ISO 9308-3

(DIN EN ISO 9308-1) *

MPN

(MF)


* = Die Methode ist nicht in die deutsche Musterverordnung des Bund-Länder-Arbeits-

kreises "Badegewässer" und in die hessische Badegewässerverordnung von 07.2008

aufgenommen worden. Sie ist für Wasser mit hohem Keimgehalt nicht geeignet.

MPN = Most-Probable-Number-Verfahren

MF = Membranfiltrations-Verfahren


Membranfiltration

Membranfilter,

Porengröße 0,4 µmEdelstahlfritte

Absaug-

vorrichtungAbstellhahn

Nachweis und Zählung von Intestinalen Enterokokken

DIN EN ISO 7899-2:2000 (Membranfiltration)

• Membranfiltration

• Inkubation auf Enterokokken-Agar nach Slanetz und

Bartley 44 4 h bei 36°C

• Charakteristische Kolonien erfassen

(Kolonie erhaben, rot, kastanienbraun oder rosa im

Zentrum oder insgesamt Verdacht auf Enterokokken)

• Filter auf Galle-Äsculin-Azid Agar transferieren

und 2 h bei 44°C inkubieren

• Gelbbraune bis schwarze Färbung im umgebenden Medium

Intestinale Enterokokken!


Enterokokkennachweis

DIN EN ISO 7899-2

Galle-Aeskulin-AgarSlanetz-Bartley-Agar

Filteroberseite


Anzuchtkultur auf

Slanetz-Bartley-Agar

Identifizierung auf

Galle-Aeskulin-Agar

Filterrückseite

KenngrößenA B

bei Wasserqualität

konstant sehr gut

oder gut

Cbei Wasserqualität

ausreichend

oder schlechter

Ansatzvolumen (mL) 100 10 5 1

Untere Bestimmungs-

grenze (KBE/100 mL)1 10 20 100

Obere Bestimmungs-

grenze (KBE/100 mL)200 2000 4.000 20.000

Varianten des Membranfiltrationsverfahrens

bei erwarteter

Verschmutzung

zusätzlich zu B

im Regelfallnicht

empfohlen


Anwendung


Miniaturisiertes MPN-VerfahrenDIN EN ISO 7899-1 und DIN EN ISO 9308-3

Mikrotiterplatte

mit Nährsubstrat

Multipipette mit

sterilen Spitzen

Petrischale mit Probe

1:2 bzw. 1:20

verdünnt

Probe

original

Bestimmung von Escherichia coli und Intestinalen

Enterokokken mittels MPN-Verfahren

• Probenverdünnungen im allgemeinen 1:2 oder (1:2 und 1:20)

• Mikrotiterplatten füllen (200 µL / Vertiefung):

96 x 1:2-Verdünnung oder

64 x 1:2-Verdünnung + 32 x 1:20-Verdünnung

• Escherichia coli:

Nährmedium mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid (MUG).

Inkubation bei 44°C mindestens 36 h, höchstens 72 h

• Intestinale Enterokokken:Nährmedium mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucosid (MUD). Inkubation bei 44°C mindestens 36 h, höchstens 72 h

• Ablesung unter UV-Licht (366 nm)

Blaue Fluoreszenz E. coli bzw. Enterokokken Charakteristische Zahl

• Ablesen der Wahrscheinlichkeitszahl „MPN“

• Ergebnisangabe als KBE / 100 mL (wissenschaftlich korrekt: MPN / 100 mL)



MPN-Test auf E. coli

1:2-Verdünnung

10 von 96 positiv

MPN-Tabelle: 10 110 KBE / 100 mL

95%-Intervall: 59 - 204


Varianten des Mikrotiterverfahrens


Kenngrößen Ansatz bei

Wasserqualität

konstant sehr gut,

konstant gut

Ansatz bei

Wasserqualität

ausreichend,

mangelhaft

Verdünnung(en) 1:2 1:2 und 1:20

MT-Platten-Ansatz,

Verdünnungen96 x 1:2

64 x 1:2

32 x 1:20

Untere Bestimmungsgrenze

(KBE/100 mL)< 10 < 15

Obere Bestimmungsgrenze

(KBE/100 mL)4.564 34.659

Angabe bei „vermeidbarer

Überschreitung“ (UBA)9.128 -

Ist auf Grund äußerer Umstände, der Wetterlage oder auf Grund bisheriger Erfahrungen damit zu rechnen (z.B. bei kurz-

zeitigen Verschmutzungen oder Havarien), dass die obere Bestimmungsgrenze von 4.564 KBE/100 mL überschritten wird,

ist die Untersuchung von Anfang an mit den zwei Verdünnungsstufen 1:2 und 1:20 durchzuführen (UBA, Juli 2009).

*

*

Grenzwerte für Binnengewässer

KBE/100 mL (Perzentil)

Parameter Ausgezeichnete

Qualität

Gute

Qualität

Ausreichende

Qualität

Intestinale

Enterokokken200 (95-%) 400 (95-%) 330 (90-%)

E. coli 500 (95-%) 1000 (95-%) 900 (90-%)


Maßnahmen bei hohen Einzelwerten


Wird bei der Badegewässerüberwachung für den Parameter Escherichia coli ein Ein-

zelwert von mehr als 1.800 KBE/100 mL oder für den Parameter Intestinale Entero-

kokken ein Einzelwert von mehr als 700 KBE/100 mL festgestellt, so ist eine sofortige

Nachkontrolle durchzuführen. Werden die Werte wieder überschritten, wird ein zeit-

weiliges Badeverbot erlassen.

Das Verbot ist aufzuheben, wenn der geometrische Mittelwert von mindestens drei an

repräsentativen Stellen des Badegewässers entnommenen Wasserproben (oder das

Ergebnis einer flächenintegrierten Probenahme von mindestens drei Stellen) einen

Wert von unter 280 KBE/100 mL bei Escherichia coli und unter 100 KBE/100 mL bei

den Intestinalen Enterokokken ergeben hat.

Empfehlung der Badewasserkommission – Musterverordnung des BLAK

Verordnung über die Qualität und die Bewirtschaftung der Badegewässer (VO-BGW)

Bedingung für die Aufhebung von Badeverboten

Wenn durch Messungen festgestellt wird, dass mindestens

wieder ausreichende Qualität vorliegt.

I. Bewertung mittels 90-Perzentil:

< 900 KBE/100 mL (E. coli)

< 330 KBE/100 mL (Enterokokken)

Es sind relativ viele Proben nötig.

II. Bewertung mittels 50-Perzentil (= Median, geom. Mittel):

< 280 KBE/100 mL (E. coli)

< 100 KBE/100 mL (Intestinale Enterokokken)

Es sind nur wenige Proben nötig (mindestens 3).


RingversuchMPN

KBE/100 mLI/2008 Ausschlussgrenze unten 694

Mittelwert 1.167Ausschlussgrenze oben 1.757

III/2008 Ausschlussgrenze unten 87

Mittelwert 228Ausschlussgrenze oben 431

II/2009 Ausschlussgrenze unten 207

Mittelwert 480Ausschlussgrenze oben 856

Ringversuchsergebnisse des NLGA

EU-Badegewässermikrobiologie – E. coli


RV KenngrößenMPN

KBE/100 mLMF

KBE/100 mL

I/2008 Ausschlussgrenze unten 34 172

Mittelwert 191 573Ausschlussgrenze oben 500 1.195

III/2008 Ausschlussgrenze unten 22 170

Mittelwert 124 379Ausschlussgrenze oben 333 665

II/2009 Ausschlussgrenze unten 130 260

Mittelwert 354 494Ausschlussgrenze oben 680 798

Eigene Untersuchungen an realen Proben bestätigen im Grundsatz die Diskrepanz

zwischen den Ergebnissen der beiden Untersuchungsverfahren. MPN < MF

Bebrütungstemperatur 44°C 36°C

Ringversuchsergebnisse des NLGA

EU-Badegewässermikrobiologie – Intestinale Enterokokken


Konzentrationen intestinaler Enterokokken im Wasser aus mittelhessi-

schen Badeseen und Fließgewässern im Sommer 2007 - Vergleich der

Membranfiltermethodik mit dem MPN-Verfahren – DIN-Methoden

10

100

1000

10000

0 10 20 30 40 50 60

En

tero

ko

kk

en

KB

E /

100

mL

Filter SB

MPN DIN

log

Die relativen Standard-

abweichungen der Methodik

wurden an Vergleichsproben

aus Dill und Dietzhölze er-

mittelt (jeweils n = 8)

Bei Werten unter der Bestim-

mungsgrenze wurden die

Werte der Bestimmungs-

grenze für die Darstellung

verwendet.

MF > MPN : 25 Proben

MF < MPN : 12 Proben


E. coli-Konzentrationen im Wasser aus mittelhessischen Badeseen und

Fließgewässern im Sommer 2007 - Vergleich der Membranfiltermethodik

mit dem MPN-Verfahren - DIN Methoden

10

100

1000

10000

0 10 20 30 40 50 60

E. co

li K

BE

/ 1

00

mL

Filter TTC

MPN DIN

log

Die relativen Standard-

abweichungen der Methodik

wurden an Vergleichsproben

aus Dill und Dietzhölze er-

mittelt (jeweils n = 8)

Bei Werten unter der Bestim-

mungsgrenze wurden die

Werte der Bestimmungs-

grenze für die Darstellung

verwendet.

Konformitätsüberprüfung


• Für jedes Badegewässer am Ende der Badesaison

• Grundbedingung: ausreichend viele Bestimmungen von

E. coli und Intestinalen Enterokokken

• Erste Messung kurz vor Beginn der Saison und mindestens

monatlich weitere Messungen bis zum Ende der Saison

• Bewertung 2010 noch nach den Regeln für die Übergangszeit

• Bewertung bis spätestens zum Jahr 2011 (BRD) auf der

Basis von Daten der letzten vier Jahre nach den neuen

Regeln, d.h. Beurteilung anhand von

- 95-Perzentil (sehr gute Qualität und gute Qualität)

- 90-Perzentil (ausreichende Qualität)

Alternative Untersuchungsmethoden

• Alternative Untersuchungsmethoden sind zulässig.

• Die Gleichwertigkeit damit erzielter Ergebnisse mit den

Ergebnissen der Referenzmethoden ist zu belegen.

• Die Kommission verlangt Prüfung nach DIN EN ISO 17994:2004.

• Das Umweltbundesamt stellt die Gleichwertigkeit fest.

• Es veröffentlicht darüber eine Liste im Bundesgesundheitsblatt.


Zur Zeit ist noch keine Alternativmethode verfügbar.

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

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Erfahrungen mit den neuen mikrobiologischen ... · Wahl der Verdünnungen bei den MPN-Verfahren 4. Bedingungen bei Anwendung der Membranfiltration 5. Umgang mit Werten unter- und