FLUORESZENZ POLARISATIONS IM M UNOASSAYS ZUM QUALITATIVEN NACHW EIS VON SUCHTDROGEN IN URINM . Jalalian und B. Reckm ann

E. Merck, Forschung Diagnostica Frankfurter Straße 250, D-6100 Darmstadt, FRG

Einleitung

Die E. Merck dau-TRAK® Assays beruhen auf dem Prinzip des Fluoreszenz- polarisations-Immunoassays (FPIA). Dieses Verfahren ist grundsätzlich für den qualitativen Nachweis von Drogen, deren Metaboliten, sowie von Medikamenten in Urin vorgesehen und wird am Merck VITALAB Eclair® Analyser durchgeführt.Dau-TRAK® Reagenzien für das immunologische Screening der Parameter und Parametergruppen Opiate, Cannabis, Kokain, Benzodiazepine, Barbiturate, Phencyclidin, Methadon, Amphetamin/Methamphetamin und Morphin stehen zur Verfügung.

Prinzip

Die Drogen oder deren Derivate aus der Patientenprobe konkurrieren mit einem fluoreszenzmarkierten Derivat der Droge (Tracer) um die Bindungsstelle der spezifischen Antikörper. In Abhängigkeit von der Konzentration der Analyten in der Probe werden die fluoreszenzmarkierten Tracer aus den Komplexen mit den Antikörpern verdrängt. Dabei verändert sich die gemessene Fluoreszenz­polarisation des Reagenzes, wobei mit steigender Analytkonzentration der gemessene Polarisationswert kleiner wird.Die Schwellenkonzentration wird als Referenz zur Unterscheidung zwischen negativen und positiven Proben eingesetzt. Proben, bei denen das Polarisations­signal kleiner oder gleich dem der Schwellenkonzentration ist, sind positiv. Proben, deren Polarisationssignal größer als das der Schwellenkonzentration ist, sind negativ.

484 Alcohol, Drugs and Traffic Safety - T92Ed. by Utzelmann / Berghaus / KrojVerlag TÜV Rheinland GmbH, Köln -1993

Experim enteller Teil

Pipettierschema

Probenleerwert Probe(1) (2)

Puffer 1000 ul -Reagenz - 1000 ulProbe 10 ul 10 |il

In Meßröhrchen 1 (Probenleerwert) und Meßröhrchen 2 (Probe) werden die Reagenzien wie oben pipettiert, gemischt und mindestens 12 Minuten im Inkuba­tionsblock des Gerätes Eclair® bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Fluores­zenzpolarisation des Leerwertes und der Probe gemessen. Der Eclair® berechnet automatisch die Differenz und druckt das Ergebnis als positiv oder negativ aus.Die Kalibrierung des Merck VITALAB Eclair® erfolgt mit Hilfe der Multi- kontroile für die Schwellenkonzentration (cut-ofj). Die Kontrollen "hoch" und "niedrig" können zur Qualitätskontrolle eingesetzt werden.Die Reagenzien sind bei 2-8°C 18 Monate haltbar. Nach erstmaligem Öffnen beträgt die Haltbarkeit der Reagenzien bei 2-8°C 8 Wochen.

Einfaches Screening nach Suchtdrogen in Urin

Beim FPIA dau-TRAK® handelt es sich um einen qualitativen Nachweis der Drogen. Die Zuordnung für positiv oder negativ erfolgt im Eclair® durch Vergleich des mP Wertes der Schwellenkonzentration mit dem der zu bestim­menden Probe. Der Eclair® berechnet und druckt das Ergebnis als positiv oder negativ aus. Durch Vergleich der mP Werte der Probe mit den Werten der Schwellenkonzentration und der "hoch" Kontrolle kann für positive ein grober Konzentrationsbereich abgeschätzt werden.Ein besonderer Vorteil des dau-TRAK® Systems besteht darin, daß zur Bestim­mung eines frei wählbaren Drogenspektrums aus einer nur eine Leerwertmessung notwendig ist. Dadurch ist es möglich, auch bei kleinen Serien bis hin zur Einzel­probe in kürzester Zeit ohne großen Aufwand ein vollständiges Drogenscreening durchzuführen.

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Nach weisgrenze

Als Nachweisgrenze ist die unterste meßbare Konzentration definiert, die mit einer 95 %igen Konfidenz von Null unterschieden werden kann.

Param eter ng / mlAmph/Methamphetamin 20Barbiturate 40Benzodiazepine 50Cannabis 5Kokain 40Methadon 20Morphin 40Opiate 20Phencyclidin 2

K reuzreaktivität

Die Qualität der FPIA dau-TRAK® Assays ist dadurch ausgezeichnet, daß die meisten Vertreter einer Stoffklasse und deren wichtige Metaboliten erfaßt werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß mit den 100 am häufigsten verordneten Arznei­stoffen keine Störung der Screening Tests erfolgt. Als Beispiel ist die Kreuz­reaktivitäten für Opiate in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Folgende Substanzen gaben bei den angegebenen Konzentrationen ein Signal, das dem Signal der Schwellenkonzentration entspricht.

| Substanz 1 mg / 1 1 Kreuzreaktivitäten (%) |

Apomorphin 100 < 1Buprenorphin 500 < 0,1Codein 0,38 79Dextromethorphan 6,5 4,6Diacetylmorphin 0,6 50Diamorphin 0,5 60Dihydrocodein 0,4 75Ethylmorphin 0,2 150Hydrocodon 1 30Hydromorphon 0,25 120Methadon-Metabolit 10 3Morphin-3-glucuronid 0,3 100Morphin-6-acetat 0,1 300Naloxon 100 < 1Naltrexon 100 < 1Nicomorphin 0,5 60Normorphin 35 0,8Oxycodon 0,5 60Oxymorphon 5 6Pentazocin 100 < 1Phenazocin 100 < 1Pholcodin 0,4 75Thebain 3,5 8,6

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K alibrationsstabilität und Präzision von Tag zu Tag

Die Kalibrierung des Merck VIT AL AB Eclair® erfolgt mit Hilfe der Multi­kontrolle für die Schwellenkonzentration.Der Standard für die Schwellenkonzentration wurde täglich über 10 Tage ge­messen. Die Tests haben hervorragende Impräzisionen mit einem Variations- koeffizient (bezogen auf Millipolarisation, mP) kleiner als 2 % und sind für min­destens 2 Wochen kalibrationsstabil (Cannabis 1 Woche).Die Impräzisionen von Tag zu Tag, gemessen an 10 aufeinanderfolgenden Tagen, sind auch für die "niedrig" und "hoch" Kontrolle sowie die Schwellen­konzentration in der Tabelle angegeben. Diese Ergebnisse zeigen, daß FPIA dau-TRAK® aufgrund der einfachen und wenig störanfälligen Reagenzformulierung eine ausgezeichnete Präzision aufweist und somit auch in der manuellen Durch­führung hohe Zuverlässigkeit bietet.

Parameter Konzng/ml

NIEDRIGMWmP s cv%

SCHWELLENWERTKonz MW ng/ml mP s cv%

Konzng/ml

HOCHMWmP s cv%

Amph/Methamph.

100 155 0,72 0,47 300 141 1,10 0,78 2000 113 1,44 1,27

Barbiturat 100 138 1,68 1,22 300 131 1,42 1,08 2000 107 1,82 1,08

Benzodiazepin 100 121 2,30 1,90 300 108 2,14 1,99 2000 79 ,2 0,79 1,00

Cannabis 50 155 3,59 2,32 100 145 3,81 2,63 1000 110 1,31 1,19

Kokain 100 137 0,91 0,67 300 126 1,33 1,05 2000 95,3 1,17 1,23

Methadon 100 220 2,36 1,07 300 210 1,88 0,89 2000 168 1,28 0,76

Morphin 100 167 1,39 0,83 300 156 1,27 0 ,82 2000 123 2,38 1,93

Opiat 100 156 1,32 0 ,85 100 144 1,68 1,18 2000 120 1,27 1,06

Phencyclidin 20 161 1,08 0,67 300 136 1,49 1,09 1000 88,0 1,26 1,43

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M it über 110 Patientenproben wurde ein M ethodenvergleich von FPIA dau-

TRAK® gegen etablierte immunologische N achw eism ethoden sowie D ünn-

schichtchromatographie(DC) durchgefiihrt. Die Ergebnisse des FPIAdau-TRAK® zeigen sehr gute Übereinstimmung mit DC und mit etablierten Immunoassays

Methodenvergleich

Parameter Eclair®

pos / neg

etablierteImmunoassays

pos / neg

DC

pos / neg

Benzodiazepin 48 / 611)

46 / 63 48 / 61

Barbiturat 16 / 92D

15 / 93 16 / 92

Cannabis 23 / 872)

19 / 91 22 / 88

Opiat

3)

18 / 91 19 / 90 19 / 90

Kokain 2 / 1075)

3 / 106 2 / 107Amph/

Methamph. 2 / 107 2 / 1074)

3 / 106

1) abweichende Proben sind in der DC positiv

2 ) 3 Proben DC - positiv0̂)1 DC - negative Probe w ird von dau-TRAK als positiv erkannt.(1?)

3) 1 DC - positive Probe w ird von dau-TRAK n ich t erkannt (M a trixe ffek t)

4) 1 DC - positive Probe w ird von beiden Im munoassays n ich t erkannt

5) abweichende Probe is t in der DC negativ

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Morphin Test

Mit dem spezifischen Morphin-Test des FPIA dau-TRAK® wird ausschließlich freies Morphin nachgewiesen. Der spezifische Morphin-Test erlaubt die Unter­scheidung zwischen Proben, die nur Codein und Derivate enthalten (z.B. aus Hustenmittel) und mißbräuchliche Suchtdrogen (Heroin, Morphin)

spezifischer Morphin - Test

Opiat - Test Opiat - Test Morphin - Test

Anzahlder

Proben

DC Eclair®etablierteImmuno­ Eclair®assays

pos / neg pos / neg pos / neg

11 Morphin 11 10i)

10 / 1 11 / 0

5 Codein 5 / 0 5 / 02)

1 / 4

1 Dihydrocodein 1 / 0 1 10 01 1

1) 1 DC - positive Probe wird n ich t e rk an n t (Matrixeffekt)

2) 1 Codein - Probe wird im spez if ischen Morphin - T e s t als pos i t iv identifiziert ( s e h r w ahrsche in lich en th ä l t die Probe freies e n d o g e n e s Morphin

d u rch C odeinm etabo lism us)

Zusam m enfassung

Die E. Merck dau-TRAK® Assays zeichnen sich durch folgender Eigenschaften aus:

□ einfache und schnelle Handhabung durch gebrauchsfertiges Flüssigreagenz

□ Drogenprofil auch von Einzelproben in kürzester Zeit□ hohe Präzision und Zuverlässigkeit der Ergebnisse□ hervorragende Kreuzreaktivitäten□ spezifischer Morphin-Test zur Unterscheidung des Morphins von

anderen Opiaten

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