Forschungsschwerpunkt Genomforschung und Bioinformatik · In der Abteilung Molekulare Genetik werden die zwei-und dreidimensionale Struktur des menschlichen Genoms sowie die tumorspezifischen

351

Forschungsschwerpunkt H Genomforschung und Bioinformatik Übersicht

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt Genomforschung und BioinformatikSprecher Priv. Doz. Dr. Peter Lichter

Um eine effiziente Zusammenarbeit sämtlicher im engerenSinne der Genomforschung zuzuordnenden Abteilungenzu gewährleisten, wurden 1996 - nach der Zustimmungdes Kuratoriums im Juni 1995 - diese Aktivitäten imForschungsschwerpunkt „Genomforschung und Bioinfor-matik“ zusammengefaßt. Hierbei wird eine zentrale Struk-tur für die Genomanalyse geschaffen, die den bestehen-den Aktivitäten zur Genlokalisation, der genetischen Kar-tierung, der Bioinformatik und vor allem der funktionellenAnalyse krebsrelevanter Genombereiche, die bislang aufverschiedene Forschungsschwerpunkte verteilt waren, diezwingend notwendige Basis und Infrastruktur gibt. Dietheoretisch arbeitenden Arbeitsgruppen des Schwerpunktsverbinden ihre Ansätze aus der Mathematik, Statistik, Phy-sik und Informatik mit computergestützten Simulations-verfahren und schlagen dadurch eine Brücke zwischendiesen theoretischen Disziplinen und den experimentellenArbeitsrichtungen der Krebsforschung. Durch Kooperatio-nen mit zahlreichen Abteilungen des DKFZ finden die me-thodischen Entwicklungen des Schwerpunktes direktenEinsatz in der molekularen und genomischen Struktur-forschung, in der Krebsdokumentation, in der medizini-schen Bildverarbeitung und in der biostatistischen Auswer-tung experimenteller und klinischer Daten.

In der Abteilung Molekulare Genetik werden die zwei-und dreidimensionale Struktur des menschlichen Genomssowie die tumorspezifischen Veränderungen dieser Struk-tur untersucht. Die räumliche Organisation des Genomsinnerhalb der Zellkerne wird in Beziehung zur Gen-expression, d.h. in Hinsicht auf eine funktionelle Zellkern-architektur, untersucht. Die Analyse von tumorassoziiertengenomischen Veränderungen zielt auf die Identifikationvon genetisch definierten Krankheitssubentitäten und aufdie Isolation und Charakterisierung von pathogenetisch re-levanten Genen mit onkogenem Potential. Ein wichtigerAspekt ist auch die Entwicklung neuer Methoden mitSchwerpunkt auf DNA-Chip-Technologie für die Analysegenomischer Imbalancen.

Ziel der Arbeit der Abteilung Molekulare Genomanalyseist die Identifizierung von Genen, bei denen MutationenErbkrankheiten hervorrufen können und die Entwicklungvon Techniken, welche die Identifikation von Genen ver-einfachen und beschleunigen. Im Rahmen dieser Ziele hatsich die Abteilung in den letzten Jahren erfolgreich mit derEntwicklung und Etablierung von Technologien zur Isolie-rung von funktionellen Sequenzen aus großen genomi-schen Bereichen beschäftigt. Parallel dazu wurde die sys-tematische molekulare Analyse einer 10 Megabasen gro-ßen Region des menschlichen X-Chromosoms durchge-führt (Xq27.3-qter). Diese Arbeit dient als Modell für diemolekulare Analyse des gesamten men schlichen Genomsund umfaßt die Kartierung, Klonierung und die Isolierungaller Gensequenzen dieser Region.

Medizinische und Biologische Informatik (H0100)Prof. Dr. sc.hum. Hans-Peter Meinzer (kommissarisch)� 06221 42-2366, FAX 06221 42-2345e-mail: [email protected]

Molekulare Biophysik (H0200)Prof. Dr. rer. nat. Sándor Suhai� 06221 42-2369, FAX 06221 42-2333e-mail: [email protected]

Theoretische Bioinformatik (H0300)Dr. rer. nat. Martin Vingron (jetzt MPI Berlin)

Klassische und Molekulare Zytogenetik (H0400)Prof. Dr. rer. nat. Manfred Schwab� 06221 42-3220, FAX 06221 42-32 81e-mail: [email protected]

Biophysik der Makromoleküle (H0500)Prof. Dr. rer. nat. Jörg Langowski� 06221 42-3390, FAX 06221 42-3391e-mail: [email protected]

Molekulare Genomanalyse (H0600)Prof. Dr. habil. (PhD) Annemarie Poustka� 06221 42-4742, FAX 06221 42-3454e-mail: [email protected]

Abteilung Molekulare Genetik (H0700)Prof. Dr. rer. nat. Peter Lichter� 06221 42-4609, FAX 06221 42-4639e-mail: [email protected]

Funktionelle Genomanalyse (H0800)Dr. rer. nat. Jörg Hoheisel� 06221 42-4680, FAX 06221 42-4682e-mail: [email protected]

Intelligente Bioinformatik Systeme (H0900)Dr. rer. nat. Roland Eils� 06221 42-3600, FAX 06221 42-3610e-mail: [email protected]

Zentrale Einheit Biostatistiktik (R0700)Dr. Lutz Edler� 06221 42-2392, FAX 06221 42-2397e-mail: [email protected]

352



Die Arbeiten der Abteilung Funktionelle Genomanalysezielen auf die Entwicklung und unmittelbare Anwendungneuer Technologien zur Analyse ganzer Genome hinsicht-lich der zellulären Umsetzung der genetischen Informationund der Regulation dieser Vorgänge. Basierend auf tech-nischen Entwicklungen werden zahlreiche funktionelleAspekte analysiert. Ein Schwerpunkt liegt im Gebiet derDNA-, Protein- und Peptid-Microarrays. Dabei werdenbiophysikalische und chemischen Fazetten der Chipher-stellung sowie Aspekte der Datenanalyse weiter entwickeltund unmittelbar zur Anwendung gebracht. Die Bestim-mung der Expression aller Gene einer Zelle oder einesGewebes ist dabei ein wichtiges Thema. Neben der Analy-se der biologischen Effekte bestimmter (speziell karzino-gener) Substanzen auf molekularer Ebene, sollen Syste-me zur Frühdiagnose, Krankheitsprognose und zur beglei-tenden Analyse des Behandlungserfolgs etabliert werden.Vergleichende Studien der Transkription und Protein-expression aller Gene und der sich daraus ergebenden(phänotypischen) Konsequenzen sind im Gange und wer-den weiter vertieft. Gleichzeitig wird die Genotypisierungvon Patienten- und Kontrollgruppen sowie von pathoge-nen Organismen und Viren verfolgt, die auch Aussagenüber epigenetische Veränderungen erlaubt. Daneben istdie Abteilung auch in der Kartierung und Sequenzierungganzer Genome aktiv, wobei sich daran meist eine weiter-gehende funktionelle Analyse anschließt. Viele dieser Pro-jekte werden in nationalen oder internationalen Kooperati-on und Kollaboration durchgeführt. Ein weiteres Ziel ist dieEtablierung neuartiger Methoden zur Untersuchungen derKorrelation von DNA-Struktur und Enzymaktivität, mit Per-spektiven in der reinen Analytik, dem grundlegenden Ver-ständnis von Protein-Nukleinsäure Wechselwirkungen so-wie zur Nutzung der DNA als Grundlage nicht-binärer Re-chenoperationen.

Die Forschung der Abteilung Klassische und MolekulareZytogenetik zielt auf die Ermittlung des Beitrages geneti-scher Veränderungen zu humanen Krebserkrankungen ab.Dabei spielen sowohl strukturelle Analysen von Chromo-somen- und Genveränderungen wie auch funktionelle Ver-änderungen der Biochemie der Genfunktion eine Rolle.Der Schwerpunkt zukünftiger Arbeiten wird zum einen aufder Analyse des kindlichen Nervenzellkrebses, des Neuro-blastoms, zum anderen auf Untersuchungen hereditärerund sporadischer Formen von Colon- und Brustkrebs lie-gen. Bei Colontumoren gelang der Abteilung der Nachweiseines Tumormodifikationslokus in 1p35, dessen AnalyseGegenstand zukünftiger Untersuchungen sein wird.

Die Abteilung Molekulare Biophysik untersucht moleku-lare und genomische Strukturprobleme mit Hilfe biophysi-kalischer und computerwissenschaftlicher Methoden undentwickelt computergestützte Simulationsverfahren für ihreModellierung auf den genomischen, molekularen und elek-tronischen Ebenen. Auf der phänomenologischen Ebeneder Genomforschung konzentriert sie sich auf die Ausar-beitung eines integrierten Datenmodells für die Darstel-lung aller relevanten Daten für die komplexen Genome hö-herer Organismen (topologische und genetische Genom-karten, molekulare Sequenz- und Strukturdaten, klinische

Daten für krankheitsbezogene Gene usw.), und für dieEntwicklung neuer Methoden zur Analyse genomischerSequenzdaten. Diese Aktivitäten bilden einen Teil des eu-ropäischen Projektes zur Entschlüsselung des menschli-chen Genoms, und die Abteilung entwickelt und pflegt dasEuropean Data Resource for Human Genome Analysis amDKFZ. Auf der molekularen Ebene werden artifizielle neu-ronale Netze, genetische Algorithmen und moleküldyna-mische Simulationsverfahren entwickelt und zur Modellie-rung der Raumstruktur von Genprodukten eingesetzt. DasZiel dieser Forschung ist, aufgrund der genomischen DNAbzw. Aminosäuresequenz durch neuronale Netze zuver-lässige Sekundär- und Tertiärstrukturvoraussagen für ver-schiedene Eiweißmoleküle zu erhalten, und mit Hilfe die-ser Strukturdaten Simulationen zu ihrer biologischen Funk-tion durchzuführen. Die Abteilung arbeitet auch an derWeiterentwicklung mikrophysikalischer Methoden zur Un-tersuchung intermolekularer Wechselwirkungen in Biopoly-meren (DNA-Protein, Protein-Ligand usw.) und verwendetsie zur Simulation spezifischer molekularer Vorgänge inZusammenarbeit mit verschiedenen experimentellenGruppen am DKFZ.

Die 1995 gegründete Abteilung Theoretische Bioinfor-matik soll diesen Forschungsschwerpunkt weiter verstär-ken. Angesichts der Flut neuer Sequenzdaten, die vonden verschiedenen Genomprojekten generiert werden, istder Computer ein wesentliches Hilfsmittel bei der Sichtungdieser Daten geworden. Die Abteilung befaßt sich mit derAnalyse von Sequenzen, Sequenzfamilien und Genomen.Insbesondere werden Fragen der Funktionsvorhersageund der molekularen Evolution studiert werden. Die ent-wickelten Verfahren werden implementiert und in Zusam-menarbeit mit experimentellen Gruppen zum Einsatz ge-bracht. Der Leiter der Abteilung hat einen Ruf der MPGangenommen.

Das Hauptziel der Arbeit der Abteilung Biophysik der Ma-kromoleküle ist es, die Mechanismen von intramolekula-ren Wechselwirkungen in großen DNA-Molekülen und de-ren biologische Bedeutung für die Regulation der Genex-pression zu verstehen. Anhand des Modellsystems super-helikaler DNA von einigen kb-Größe konnte der experi-mentell beobachtete Effek t von lokaler DNA-Krümmungerklärt werden. Die strukturelle Basis der sequenzabhän-gigen DNA-Krümmung wird derzeit mit Hilfe von Zirkular-dichroismus und depolarisierter dynamischer Lichtstreu-ung untersucht. Die in der Abteilung vorhandenen Metho-den sind auch für die Untersuchung anderer großer Bio-moleküle von Bedeutung; so können z.B. dynamischeLichtstreuung und analytische Ultrazentrifugation für dieMessung der Dimensionen der Aggregation und der inter-nen Bewegungen filamentöser Proteine oder für die Opti-mierung der Kristallisation von Biomolekülen verwendetwerden.

Die Abteilung Medizinische und BiologischeInformatik arbeitet zum einen an Problemen der medi-zinisch digitalen Bildverarbeitung zur Unterstützung vonDiagnose und Therapie wie auch an der Computersimu-lation von komplexen biologischen Prozessen. Nachdemdas Problem der Visualisierung medizinischer Objekte (Or-

353



gane) aus CT-, MR- und Ultraschallbildquellen verstandenist, muß es nun in die klinische Routine eingebettet wer-den. Dazu arbeitet die Gruppe an der Beschleunigung derBildberechnung durch Parallelisierung und der interaktivenSteuerung der Visualisierungs- und Segmentationspro-zesse (Projekt EVIMED). Die Kooperation verschiedenerRadiologen, Chirurgen und spezialisierter Bildverarbeiterwird im Projekt MEDICUS vorangetrieben. Gegenstandder Aktivitäten der Gruppe Simulation biologischer Prozes-se ist die Untersuchung der Zellpopulationsdynamik desEpithels der interstinalen Krypte. Das Ziel der Untersu-chungen ist das Verständnis der strukturellen und funktio-nellen Organisation des hochproliferativen Gewebes.

Als Bindeglied zwischen Biomedizin und Statistik liegendie Aufgaben der Zentrale Einheit Biostatistik in der com-puterunterstützten Beratung, der projektbegleitenden Mit-arbeit und der statistischen Methodenforschung. In demAufgabenbereich der biometrischen Beratung werden sta-tistische Methoden der Versuchplanung für biomedizini-sche Projekte angepaßt und entwickelt und es wird durchdas Labor für Statistical Computing die Möglichkeit der in-teraktiven Auswertung und der Visualisierung von Datenermöglicht. Moderne statistische Verfahren der Klassifikati-on und Regression werden auf Probleme der Vorhersagevon Proteinstrukturen angewendet und mit neuen Metho-den des Biocomputing verglichen. Für die Risikobeurtei-lung karzinogener Stoffe werden Wege des Transportsund des Metabolismus durch pharmakokinetische Modellebeschrieben und ihre statistischen Eigenschaften unter-sucht. Mechanistische Modelle der Krebsentstehung wer-den an Daten aus mehrstufigen Karzinogenese-Experi-menten auf der Mäusehaut validiert. Da die Modellvorher-sagen analytisch berechnet werden können, ist es mög-lich, Modelle zu falsifizieren, um damit Einblick in den Me-chanismus der Krebsentstehung zu gewinnen und neueModelle entwickeln zu können. Weiteres Engagement be-steht in der biometrischen Methodenforschung für die Pla-nung und Durchführung von Phase I und II Studien in Zu-sammenarbeit mit der Arbeitsgemeinschaft für Internisti-sche Onkologie (AIO) in der Deutschen Krebsgesellschaft.

354

Forschungsschwerpunkt H Genomforschung und Bioinformatik

AbteilungH0100Medizinische und Biologische Informatik


Wissenschaftliche MitarbeiterDr. Uwe EngelmannDipl.-Inform. Med. Volker Braun*Dipl.-Inform. Andre Schröter*Dipl.-Inform. Med. Markus Schwab*Dipl.-Inform. Med. Cordula Söllig*

PostdocsDr. Manuela MakabeDr. Gerald Glombitza

GastwissenschaftlerAitor Gonzalez (Spanien) (15.11.01-31.03.02)Hitesh Sharma (Indien) (15.05.-31.07.01)

SekretariatIrmhild Kocks

Techn. MitarbeiterThomas Wolf

DoktorandenDipl.-Inform. Med. Carlos Cardenas*Dipl.-Inform. Med. Christoph GießDipl.-Inform. Med. Markus GumbelDipl.-Inform. Med. Peter Hassenpflug*Dipl.-Inf. Dipl.-Ing. (FH) Mark Hastenteufel*Dipl.-Phys.Marc Heiland*Dipl.-Inform. Med. Tobias Kunert*Dipl.-Biol. Ute Platzer*Dipl.-Inform. Med. Matthias Thorn*Dipl.-Ing. Marcus Vetter*Dipl.-Phys. Ivo Wolf

DiplomandenHelene Billewitz*Amir Eid*Urs Eisenmann*Marco Knödler*Kilian Lorenz*Marco Nolden*Max Schöbinger*Ingmar Wegner*

AuszubildendeSven HeislerThomas Williamson

* Finanzierung über Projektmittel

Der Begriff Medizinische Informatik (MI) ist sehr weitgefasst und umspannt alles, was mit der Informationsver-arbeitung in medizinischen Anwendungen zu tun hat. DieAnfänge der MI gehen auf die Anfänge der 60er Jahre zu-rück. Eines der acht Gründungsinstitute des DKFZ in je-nen Jahren war deshalb folgerichtig auch dieser themati-schen Ausrichtung gewidmet. Die Vorläufer der MI sindbiomathematische Arbeiten, u.a. angewandte Statistik(z.B. Epidemiologie) und angewandte Mathematik (z.B. Si-mulation biologischer Experimente). Das wichtigste Ar-beitsgebiet der damals jungen MI war die medizinisch-kli-nische Datenerfassung und -verarbeitung in RichtungKrankenhausinformationssystem (KIS).In den 70ern entwickelte sich eine zweite große Ausrich-tung innerhalb der MI: die Signalverarbeitung (EKG, EEG,Bildverarbeitung). Seither ist die MI aufgrund der verwen-deten Techniken, Ausbildungen und Anwendungen in dermedizinischen Versorgung umfassend und unabdingbarmultidisziplinär wie kaum eine andere wissenschaftlicheFachrichtung. Folgerichtig arbeiten heute unter dem Dachder Medizinischen Informatik Mediziner, Naturwissen-schaftler und Ingenieure zusammen, oft auch mit doppel-ten akademischen Ausbildungen. Die Medizinische Infor-matik ist an den Fakultäten der theoretischen Medizin an-gesiedelt und leistet nicht nur in der Administration im Ge-sundheitswesen, sondern auch in Forschung, Diagnostikund Therapie einen wertvollen Beitrag.Die Bioinformatik beschäftigt sich mit der Klärung biologi-scher Fragestellungen mit Methoden der Informatik. Vorallem wird darunter die Analyse der durch die fortgeschrit-tene Technik in der Molekularbiologie immer größer wer-denden Datenmengen, u. a. Sequenzdaten, verstanden.Des weiteren gehören aber auch die Analyse und Simula-tion biologischer Prozesse, wie zum Beispiel Entwick-lungsvorgänge, dazu. Die Computersimulation ermöglichtdas schnelle und kostengünstige Testen von Hypothesen,die im Experiment nur schwer zu untersuchen sind. Ma-thematische Modelle biologischer Prozesse führen oft zueiner formalisierten Darstellung komplexer biologischerSachverhalte, die dann durch eine Computeranalyse leich-ter durchschaut werden können. Seit ihren Ursprüngen hatsich die Bioinformatik von einer reinen Hilfswissenschaftzu einer selbständigen Forschungsdisziplin entwickelt, inder Informatiker und Biologen, aber auch Mathematiker,Physiker und Chemiker beschäftigt sind.

Abteilung Medizinische und Biologische Informatik (H0100)Leiter: Prof. Dr. sc. hum. Hans-Peter Meinzer (komm.)

355




Virtuelle Planung von LeberresektionenG. Glombitza, M. Thorn, C.E. Cardenas,M. Schöbinger, H.-P. Meinzer

In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Chr. Herfarth, Dr. W. Lamadé,PD Dr. Th. Lehnert, Dr. L. Fischer, Chirurgische UniversitätsklinikHeidelberg, Prof. Dr. G. Kauffmann, Dr. G.W. Richer, L.Grenacher, Abt. Radiodiagnostik, Chirurgische UniversitätsklinikHeidelberg.

Ziel des Projektes ist die computer-unterstützte Planungeiner Teilentfernung (Resektion) der Leber. Hierdurch sollsowohl die Auswahl der Patienten durch quantitative An-gaben über das geschätzte Operationsrisiko objektiviertwerden als auch die eigentliche Operation selbst unter-stützt werden. Grundlage für diese präoperative Analysesind die in der Routine aufgenommenen Computertomo-graphiedaten.

Die bei der Operation verfolgte Strategie hängt von dergenauen Lage des zu entfernenden Tumors im Verhältniszu den Gefäßbäumen der Leber ab. Je nach Art der Auf-nahme werden in diesem Projekt der portale oder beidevenösen Gefäßbäume analysiert [1].

Hierfür wurden seit Beginn des Projekts Grundlagen fürdie quantitative und die qualitative Auswertung der Bild-daten entwickelt. Zu den qualitativen Aspekten zählt diedreidimensionale Visualisierung der Gefäßbaumstruktur,des Tumors, seines Sicherheitsbestandes und der Leber-hülle. Wichtige quantitative Größen sind die Volumenmes-sungen der Leber und des Tumors sowie die Abschätzungdes nach der Operation verbliebenen gesunden Leber-volumens [2].

Die Operationsstrategie wird am Bildschirm geplant undanhand der aktualisierten Volumenschätzungen beurteilt.Die Ergebnisse stehen dem Chirurgen intraoperativ übereinen Touch-Screen-Monitor zur Verfügung, so dass wäh-rend der Operation auf die dreidimensional rekonstruiertenCT-Daten und die entsprechenden Volumenauswertungenzugegriffen werden kann [3].

Die zukünftigen Entwicklungen zielen in Richtung derEvaluation des entwickelten Systems. Dabei sollen dieentwickelten Algorithmen anhand von Versuchen an Tier-modellen evaluiert werden. Daneben ist die Integration derOperationsplanung in den klinischen Ablauf ein zweiterSchwerpunkt der zukünftigen Arbeiten.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] Thorn, M., Vetter, M., Cárdenas, C., Hassenpflug, P., *Fischer,L., *Grenacher, L., *Richter, G.M., *Lamade, W., Meinzer, H.-P.:Interaktives Trennen von Gefäßbäumen am Beispiel der Leber. InLehmann, T. et al. (Eds): Informatik Aktuell - Bildverarbeitung fürdie Medizin 2001 - Algorithmen, Systeme, Anwendungen. 147-151, Springer 2001[2] Cardenas, C., Glombitza, G., Thorn, M., Heid., V., Vetter, M.,Hassenpflug, P., *Lamade, W., *Richter, G., Meinzer, H.P.: Aradiological software module for computer aided operationplanning in oncological liver surgery (Poster). In Lemke, H.U. etal. (eds): CARS 2000 - Computer Assisted Radiology andSurgery. Proceedings of the 14th International Congress and Ex-hibition. Amsterdam: Elsevier (2000) 986

[3] Thorn, M., *Fischer, L., Cárdenas, C., Vetter, M., Hassenpflug,P., *Grenacher, L., *Richter, G.M., *Lamade, W., Meinzer, H-P.:Integration der Operationsplanung in den OP-Saal für dieonkologische Leberchirurgie. In Lehmann, T. et al. (Eds): Infor-matik Aktuell - Bildverarbeitung für die Medizin 2001 - Algorith-men, Systeme, Anwendungen. 104-108, Springer 2001

Ultraschallgestützte Navigation in deronkologischen LeberchirurgieM. Vetter, P. Hassenp flug, H.-P. Meinzer

In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Chr. Herfarth, PD Dr. W.Lamadé, Chirurgische Klinik, Univ. Heidelberg, Prof. Dr. G.Kauffmann, Prof. Dr. G. M. Richter, Abt. Radiodiagnostik, Univ.Heidelberg

Die computergestützte Chirurgie soll durch eine Kombina-tion aus präoperativer Planung und intraoperativer Bild-gebung auch bei Weichteiloperationen Einzug erhalten.Zielsetzung des Projektes ist die Untersuchung der Reali-sierbarkeit eines solchen Navigationssystems am Beispielder onkologischen Leberchirurgie.

Eine Systemanalyse der klinischen Abläufe und medizini-schen Erfordernisse wurde durchgeführt [1]. Es wurde einPrototyp konzipiert, der die computergestützte Navigationin der Leberchirurgie ermöglichen soll. Zwei Schlüssel-ideen dieses Prototypen wurden als internationales Patentangemeldet: die Registrierung über Gefäßmerkmale [2]und die Aufrechterhaltung der Registrierung über Naviga-tionshilfen [3]. Die Übertragung der Ergebnisse der com-putergestützten Operationsplanung auf die intraoperativfreiliegende Leber erfordert die Aufnahme dreidimensiona-ler Ultraschalldatensätze. Dazu wurde eine Software fürdreidimensionalen Freihandultraschall in den Prototyp in-tegriert. Zur Erfassung von Schallsonde, chirurgischem In-strument und Punkten in der Leber wurde ein elektroma-gnetisches Tracking-System in den Prototypen integriertund für den Einsatz im Operationssaal evaluiert [4]. Zurbildgestützten Navigation wurde eine Visualisierungs-Soft-ware entwickelt und in den Protoypen integriert. Die Soft-ware steuert einen autostereoskopischen Monitor an, wo-durch ein dreidimensionale Wahrnehmung von Leber undInstrument erreicht wird. In einer Studie wurde mit Chirur-gen die Übertragbarkeit eines virtuellen Operationsszena-rios auf die reale Welt evaluiert [5].

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] Vetter, M., Hassenpflug, P., Thorn, M., Cárdenas, C.,Glombitza, G., *Lamadé, W., *Richter, G.M., Meinzer, H.P.: Navi-gation in der Leberchirurgie - Anforderungen und Lösungsansatz.In Wörn, H. et al. (eds): Rechner- und sensorgestützte Chirurgie,Procs. LNI P-4:92-102, GI, Bonn, 2001.[2] Glombitza, G., Vetter, M., Hassenpflug, P., Cárdenas, C., Wolf,I., Braun, V., Gieß, C., Evers, H., *Lamadé, W., Meinzer, H.P.:Verfahren und Vorrichtung zur Navigation bei medizinischen Ein-griffen. Internationale Patentanmeldung PCT/DE010397223.101,München, 2001.[3] Vetter, M., Hassenpflug, P., Glombitza, G., Wolf, I., Meinzer,H.P.: Verfahren, Vorrichtung und Navigationshilfe zur Navigationbei medizinischen Eingriffen. Internationale PatentanmeldungPCT/DE01/03971, München, 2001.

356




[4] Hassenpflug, P., Vetter, M., *Schneeberger, M., *Liebler, T.,*Richter, G.M., Thorn, M., Cárdenas, C., *Lamadé, W., *Herfarth,C., Meinzer, H.P.: Influence of the operating room on magnetictracking. Proc. of SPIE Medical Imaging Vol. 4681: Visualization,Image-Guided Procedures, and Display, Sunday-Tuesday 24-26February 2002, San Diego, CA, USA.[5] Vetter, M., Hassenpflug, P., Thorn, M., Cárdenas, C.,*Grenacher, L., *Richter, G.M. , *Lamadé, W., *Herfarth, C.,Meinzer, H.P.: Superiority of auto-stereoscopic visualization forimage-guided navigation in liver surgery Proc. of SPIE MedicalImaging Vol. 4681: Visualization, Image-Guided Procedures, andDisplay, Sunday-Tuesday 24-26 February 2002, San Diego, CA,USA.

Computerunterstützte Operationsplanung inder HerzchirurgieI. Wolf, M. Hastenteufel, M.H. Makabe, G. Glombitza,M. Heiland, H.-P. Meinzer

In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. S. Hagl, PD Dr. R. De Simone,PD Dr. Chr. F. Vahl, Dr. Sibylle Mottl-Link, Herzchirurgie, Chirurgi-sche Klinik, Univ. Heidelberg

Zielsetzungen des Projekts sind die Entwicklung und An-passung von neuen Methoden der bildgebenden Diagno-stik an herzchirurgische Patienten, insbesondere die Ent-wicklung spezifischer Software zur funktionellen und ana-tomischen Analyse des Herzens, sowie ihre Verfügbar-machung und Applikation im klinischen Alltag, um patien-tenbezogene und krankheitsspezifische Fragestellungenzu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk liegt auf derEtablierung von dreidimensionalen diagnostischen Metho-den. Um diese Ziele zu erreichen wird ein System entwik-kelt, das die Visualisierung und Beurteilung des Herzensund seiner dynamischen und pathologischen Verhältnisseprä-, intra- und postoperativ erlaubt. Als Grundlage dienenvierdimensionale Bilddaten, die mit Hilfe von Ultraschall,CT und MRT gewonnen werden.

Der Schwerpunkt der Forschungstätigkeit der vergange-nen zwei Jahre bestand darin, die im Rahmen des Pro-jekts neu entwickelten Methoden für den klinischen Rou-tineeinsatz verfügbar zu machen, sie anzuwenden, zuevaluieren und weiter zu entwickeln [1]. Voraussetzunghierfür war ein sämtliche Methoden zur Verfügung stellen-des, einfach bedienbares Softwaresystem [2, 6]. Das ausdiesem Grunde neu entwickelte, integrierte Softwaresy-stem EchoAnalyzer™ enthält zur Zeit interaktive, vierdi-mensionale Volumenvisualisierung von wahlweise separa-ter oder kombinierter Morphologie-/Doppler-Information[3], Quantifizierung und Darstellung des zeitlichen Verlaufsdes Regurgitationsvolumens mit dem in der ersten Phaseeingeführten und inzwischen weiterentwickelten Verfah-ren, Segmentierungsalgorithmen [4, 8] zur Messung vonEjektionsfraktion, Herzzeitvolumen, zur Verbesserung derGenauigkeit der Regurgitationsvolumen-Bestimmung undzur Annulus-Segmentierung, hybride Visualisierung dessegmentierten Annulus zusammen mit der Morphologie-verschiedener Bauformen und Implantationsorientierun-gen von künstlichen Herzklappenprothesen. Alle Funktio-nen sind sowohl unter Windows als auch unter Unix/Linuxund als Chili®-PlugIn verfügbar und/oder der Blutfluss-In-formation [5], die Doppler-Signal-basierte Herzzeitvolu-

men-Quantifizierung der sphärischen Integration von Ge-schwindigkeitsvektoren (SIVV), sowie die winkelkorrigierteDarstellung von Flussprofilen [7] in Arealen annähernd la-minaren Flusses zur Beurteilung verschiedener Baufor-men und Implantationsorientierungen von künstlichenHerzklappenprothesen. Alle Funktionen sind sowohl unterWindows als auch unter Unix/Linux und als Chili®-PlugInverfügbar und auf einem normalen PC lauffähig.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] *De Simone, R., Wolf, I., Hastenteufel, M., Glombitza, G.,Link, S., Meinzer, H.P.: Neue dreidimensionale diagnostische Ver-fahren in der Herzchirurgie. In Wörn, H. et al. (Eds): LectureNotes in Informatics - Proceedings, Rechner- und sensorgestützteChirurgie. Bonn: Gesellschaft für Informatik. (2001) 298-305.[2] Wolf, I., *De Simone, R., Glombitza, G., Meinzer, H.P.:EchoAnalyzer - A system for three-dimensional echocardiographicvisualization and quantification. Lemke, H.U. et al. (Eds). CARS2001: Proceedings of the 15th International Congress and Exhibi-tion. Amsterdam: Elsevier (2001) 902-907.[3] Glombitza, G., *De Simone, R., Wolf, I., Heid, V., *Hagl, S.,Meinzer, H.P.: Volumetrische Analyse und Visualisierungkardiologischer Ultraschalldaten. Radiologe 40 (2000), 168-175.[4] Wolf, I., Glombitza, G., *De Simone, R., Meinzer, H.P.:Automatic segmentation of heart cavities in multidimensionalultrasound images. In Hanson K et al (eds). Image Processing.Vol. 3979. Bellingham: SPIE (2000) 273-283.[5] Wolf, I., Hastenteufel, M., *De Simone, R., Glombitza, G.,*Vahl, C.F., *Hagl, S., Meinzer, H.P.: Three-dimensional annulussegmentation and hybrid visualisation in echocardiography, IEEEComp. in Cardiol. (2001) 105-108.[6] Wolf, I., *De Simone, R., Glombitza, G., Lorenz, K., Meinzer,H.P.: Klinische Erprobung eines echokardiographischen Auswerte-systems. In Lehmann, T. et al. (Eds): Informatik Aktuell - Bild-verarbeitung für die Medizin 2001 - Algorithmen, Systeme, An-wendungen. 300-304, Springer 2001[7] Wolf, I., Glombitza, G., *De Simone, R., Meinzer, H.P.: Modell-basierte Analyse der Blutfluß-Dynamik in der Aorta mittelsDoppler-Echokardiographie. In Horsch, A. et al. (Hrsg.): Bild-verarbeitung für die Medizin 2000. 299-303, Springer 2000[8] Wolf, I., *De Simone, R., Hastenteufel, M., Kunert, T.,Glombitza, G., Meinzer, H.P.: Segmentation strategies forechocardiographic images. In Kim, M.-H. et al. (eds.): The fifthKorea-Germany Joint Workshop on Advanced Medical ImageProcessing. 7 S., Seoul: Ewha Womans University 2001

Computerunterstützte Lehre in derKinderkardiologie und HerzchirurgieI. Wolf, M.H. Makabe, M. Thorn, H.-P. Meinzer

In Zusammenarbeit mit: Prof. R. Van Praagh, Prof. S. VanPraagh, Dr. G. Greil, Children’s Hospital Boston, Harvard MedicalSchool, Boston, USA

Die genaue Kenntnis der kardialen Anatomie angeborenerHerzfehler ist Voraussetzung für Diagnostik und Therapie.Neben Lehrbüchern vermitteln diese Kenntnisse vor allempathologische Sammlungen. Zugang zu diesen ist weltweitnur in wenigen Zentren möglich, und für viele Präparatesteht nach Verlust kein Ersatz zur Verfügung. Im Rahmendes Projektes entsteht eine CD-ROM, mit der die einzigar-tigen Präparate des „Cardiac Registry“ des Children’sHospital Boston (Harvard Medical School) reproduziertund über elektronische Medien weltweit für Lehre und For-schung zur Verfügung gestellt werden [1]. Die dabei einge-

357




setzte Heidelberger Raytracing-Technik erlaubt, die Präpa-rate dreidimensional abzubilden und auf dem Bildschirmzu bewegen. Zusätzliche 3D-Effekte werden mit Stereo-brillen bei Betrachtung des virtuellen Modells am Monitorerzeugt. Text, Ton und Videosequenzen dienen dabei derUntermauerung der Lehrinhalte. Darüber hinaus ergänzenlaserlithographisch erstellte Kunststoffmodelle des Origi-nals, die sich durch hohe Detailtreue auszeichnen, die di-daktischen Möglichkeiten. Neben automatischen Kompo-nenten zur Segmentierung wurden interaktive Tools zurKontrolle und gegebenenfalls Korrektur des Ergebnissesentwickelt, um die Vorlage bestmöglich zu reproduzieren.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] *Greil, G., Makabe, M.: 3D Computer Modeled RareCongenital Heart Defects. Proceedings of 20th ICDE WorlConference on Open Learning and Distance Education, 2001.

Interaktive Volumenvisualisierung undSegmentierung von mehrdimensionalenBildaufnahmen für die rechnergestützteOperationsplanungT. Kunert, M. Hastenteufel, I. W olf, M. Nolden, A. Eid,I. Wegner, M. Knödler, K. Lorenz, Ch. Gieß,C.E. Cardenas, G. Glombitza, H.-P. Meinzer

In Zusammenarbeit mit: Prof. R. Dillmann, Institut für Prozess-rechentechnik und Robotik, Karlsruhe, Prof. J. Mühling, PD Dr. Dr.S. Hassfeld, Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie mit Poliklinik,Heidelberg, Prof. S. Hagl, Herzchirurgie, ChirurgischeUniversitätsklinik, Heidelberg

Für die Herzchirurgie und auch die Mund-Kiefer-Gesichts-chirurgie ist die Planung des notwendigen Eingriffs ein we-sentlicher Bestandteil des Forschungsprogramms im SFB414 “Informationstechnik in der Medizin - Rechner- undSensorgestützte Chirurgie”. In den uns zugeteilten Quer-schnittsprojekten „Interaktive Volumenvisualisierung undIntegration von Softwaremodulen“ und „Interaktive 3D-Segmentierung“ konzentrierten sich die Forschungsarbei-ten auf die Entwicklung von interaktiven Werkzeugen zurDarstellung und Bearbeitung von medizinischen Volumen-daten für die weitergehende Operationsplanung [1, 2]. DieVisualisierungsmethoden, die in den vorangegangenenJahren bereits entwickelt worden waren, wurden hinsicht-lich ihrer Funktionalität erweitert [3, 4] und zu einer inte-grierten Arbeitsumgebung zusammengefügt. Dabei warendie Bedienbarkeit durch den klinischen Anwender, die Aus-führbarkeit auf Low-Cost-Plattformen wichtige Gesichts-punkte. Um die Analyse und Manipulation der Bildaufnah-men zu erleichtern, wurden neue Werkzeuge für die Seg-mentierung entwickelt. Neben regionen- und konturbasier-ten Segmentierungsverfahren [5, 6, 7] wurden auch neueAnsätze für die Benutzerinteraktion untersucht. Besonde-res Augenmerk lag hierbei auf dem Einsatz von hapti-schen Eingabegeräten, deren Einsatz für die rechnerge-stützte Operationsplanung evaluiert wurde. In dem Folge-projekt „Evaluation und Einsatz von interaktiven Segmen-tierungsverfahren in der klinischen Routine“ werden dieWerkzeuge in Zusammenarbeit mit den klinischen Part-nern in Hinblick auf ihre Benutzerschnittstelle weiterent-wickelt. Dabei werden auch neuere Segmentierungsan-

sätze miteinbezogen, die zunächst um geeignete Mecha-nismen für eine Interaktion erweitert werden müssen. EineEvaluation der Arbeitsumgebung wird schließlich den Nut-zen in der klinischen Routine aufzeigen.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] *Haßfeld, St., *Brief, J., *Krempien, R., *Raczkowsky, J.,*Münchenberg, J., Gieß, H., Meinzer, H.P., *Mende, U., *Wörn,H., *Mühling, J.: Computerunterstützte Mund-, Kiefer- undGesichtschirurgie. Der Radiologe 40 (2000) 218-226, SpringerVerlag[2] Glombitza, G., *De Simone, R., Wolf, I., Heid, V., *Hagl, S.,Meinzer, H.P.: Volumetrische Analyse und Visualisierungkardiologischer Ultraschalldaten. Der Radiologe 40 (2000) 168-175, Springer Verlag[3] Heid, V., Evers, H., *Henn, Chr., Glombitza, G., Meinzer, H.-P.:5D Interactive Realtime Doppler-Ultrasound Visualization of theHeart. In Chen, C. et al (eds.): Physiology and Function fromMultidemensional Images. Vol. 3978 (2000) 494-500, Bellingham:SPIE 2000[4] Giess, Chr., Evers, H., Heid, V., Meinzer, H.-P.: Design of aDistributed CORBA Based Image Processing Server. InWestwood, J.D. et al (eds.): Medicine Meets Virtual Reality 2000 -Technology and Informatics 70 (2000) 86-88, Amsterdam: IOSPress 2000[5] Hastenteufel, M., Cárdenas, C., Giess, Ch., Glombitza, G.,Hassenpflug, P., Meinzer, H.-P.: Evaluierung von interaktiven,texturanalytischen Segmentierungsverfahren. In Lehmann, T. etal. (Eds): Informatik Aktuell - Bildverarbeitung für die Medizin2001 - Algorithmen, Systeme, Anwendungen. 232-236, Springer2001[6] Kunert, T., Heiland, M., Meinzer, H.-P.: Interaktive Segmentie-rung von zweidimensionalen Datensätzen mit Hilfe von AktivenKonturen. In Lehmann, T. et al. (Eds): Informatik Aktuell - Bild-verarbeitung für die Medizin 2001 - Algorithmen, Systeme, An-wendungen. 257-261, Springer 2001[7] Wolf, I., *DeSimone, R., Hastenteufel, M., Kunert, T.,Glombitza, G., Meinzer, H.-P.: Segmentation strategies forechocardiographic images. In Kim, M.-H. et al. (eds.): The fifthKorea-Germany Joint Workshop on Advanced Medical ImageProcessing. 7 S., Seoul: Ewha Womans University 2001

Klinische Integration und Telematik-AnwendungenU. Engelmann, A. Schröter, M. Schwab,U. Eisenmann‚ C. Söllig‚ H.-P. Meinzer

In Zusammenarbeit mit: Klinikum Nord Nürnberg, ClinicaFemenia, Palma de Mallorca, Spanien, Sanatorio del Rosario,Madrid, Spanien, Fa. Pointercom, Rom, Italien, Fa. Matla, Madrid,Spanien, Fa. Sirius, Brüssel, Belgien, Fa. Systemas Espertos,Madrid, Spanien, Universität Avignon, Frankreich, PolytechnicalUniversity Madrid, Spanien, E. Borälv, University Uppsala,Schweden, Steinbeis-Transferzentrum Medizinische Informatik(STZ-MI), Heidelberg.

Die Forschung auf dem Gebiet der medizinischen Bildana-lyse kann nicht nur Selbstzweck sein. Die Ergebnisse sol-len entsprechend der Philosophie unserer Abteilung auchden Weg zum Arzt und Patienten finden. Daher wurde An-fang der 90er Jahre der Aspekt der klinischen Integrationvon Telematik-Anwendungen als Schwerpunktthema die-ser Arbeitsgruppe gewählt. In EU-geförderten Projektender Gruppe wurden und werden technologische Grundla-gen für Informationssysteme gelegt, mit denen die Erstel-lung und der Betrieb von klinischen Informationssystemen

358




erleichtert wird. Diese werden nun in Telematik-Anwen-dungen (mit Schwerpunkt Teleradiologie) integriert [1].

Es ist und kann nicht Aufgabe einer Großforschungsein-richtung sein, Software auf Produktniveau in der wissen-schaftlichen Umgebung zu entwickeln, bei Anwendern ein-zuführen und in der Routine zu pflegen. Daher wurde ausder Abteilung eine Technologietransfer-Firma ausgegrün-det: Das Steinbeis-Transferzentrum Medizinische Informa-tik (STZ-MI). Dieses hat sich als eines von über 400 Trans-ferzentren der Steinbeis-Stiftung als sehr praktikable Lö-sung erwiesen. In mehreren Projekten konnte so eine Auf-teilung der Aufgaben in wissenschaftliche Konzeption undEvaluation auf DKFZ-Seite und Software-Entwicklung, Be-nutzerschulung, Hotline und Softwarewartung im STZ-MIvorgenommen werden (http://www.chili-radiology.com/).

In den durchgeführten Projekten steht nicht mehr die Tele-radiologie im Vordergrund, obwohl die Tele-Funktionalitätauch hier eine wichtige Rolle spielt. Statt dessen wird hiereine neue Generation einer allgemeinen radiologischenWorkstation konzipiert und vom STZ-MI realisiert.

Das wichtigste neue Konzept ist die nachträgliche Erweite-rungsfähigkeit von fertigen Programmen. Ein sog. PlugIn-Mechanismus wurde in unserer Abteilung konzipiert, derden Zusatzmodulen den Datenaustausch und die nahtloseIntegration in die Gesamtsoftware erlaubt. Dieser Mecha-nismus ist ein Schlüsselelement, um zukünftig Entwicklun-gen aus der Grundlagenforschung, wie zum Beispiel Ope-rationsplanungssysteme, schnell und ohne viel Aufwand indie Klinik zu integrieren [2].

Die im Sonderforschungsbereich 414 (s.o.) von verschie-denen Universitäten entwickelten Softwarekomponentenwerden als CHILI-PlugIns realisiert. Auch die Projekte derAbteilungen im Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim set-zen auf diesem PlugIn-Konzept auf. So konnten die Ent-wicklungszeiten verkürzt werden und neue Methodenschneller und einfacher evaluiert und in die klinische Rou-tine eingeführt werden.

Wichtige Forschungsarbeiten wurden im Rahmen der Eva-luation von Teleradiologie-Netzwerken durchgeführt undpubliziert. Hierbei stehen quantitative Analysen‚ verwende-te und notwendige Transferprotokolle‚ Anwendungsszena-rien und Auswirkungen der Teleradiologie im Vordergrund[3, 4].

Neue Konzepte von digitalen Bildarchiven (PictureArchiving and Communications Systems: PACS) sind einneues Forschungsgebiet der Abteilung. Insbesonderespielen hier die Speicherung von Daten in unternehmens-weiten Archivsystemen und die Integration der instituts-übergreifenden Telemedizin als integraler Bestandteil vonPACS-Systemen eine wichtige Rolle [5].

In den Berichtsjahren wurde in einem EU-geförderten Pro-jekt (MTM-Pojekt im IST-Förderprogramm) mit der Kon-zeption‚ Entwicklung und Evaluation von mobilen (Tele-)Radiologiesystemen begonnen [6, 7]. Dies geschah in Zu-sammenarbeit mit Firmen und Forschungseinrichtungen inBelgien‚ Frankreich‚ Italien und Spanien. Diese Arbeitenwurden mit dem @Roentgen-Preis der deutschen Rönt-

gengesellschaft, dem Europäischen IST-Preis von Euro-case und der Kommission der Europäischen Union ausge-zeichnet.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] Engelmann U, Schröter A, Schwab M, Meinzer HP.: Realityand perspectives in teleradiology: a personal view based onpersonal experiences. International Journal of MedicalInformatics, Vol. 64 (2-3) (2001) 449-459.[2] Engelmann U, Schröter A, Schwab M, Eisenmann U, MeinzerHP.: Openness and Flexibility: From Teleradiology to PACS In:Lemke HU et al. (Eds). CARS’99. Amsterdam: Elsevier (1999)534-538.[3] Engelmann U, Ellsässer C, Schwab M, Söllig C, Schröter A,Meinzer HP.: Evaluation des CHILI-Teleradiologienetzwerkes nachdrei Jahren im klinischen Einsatz. In Jäckel A (Hrsg).Telemedizinführer Deutschland. Ausgabe 2001. Ober-Mörlen:Deutsches Medizin Forum AG (2000) 343-345.[4] Engelmann, U, Schröter A, Schwab M, Eisenmann U, BahnerML, Delorme S, Hahne H, Meinzer HP.: The Linux-based PACSproject at the German Cancer Research Center. In Lemke HU(Eds): CARS 2000: Computer Assisted Radiology and Surgery.Proceedings of the 14th International Congress and Exhibition.Amsterdam: Elsevier (2000) 419-424.[5] Engelmann U, Schwab M, Schröter A, Rusu R, Meinzer HP.:Evaluation des CHILI-Teleradiologienetzwerks nach 4 Jahren imklinischen Einsatz. Der Radiologe 2 (2002) 87-93.[6] Engelmann U, Schweitzer T, Schröter A, Borälv E, MeinzerHP.: Mobile Teleradiologie mit CHILI. In Jäckel A (Hrsg.):Telemedizinführer Deutschland Ausgabe 2002. Ober-Mörlen: Me-dizin-Forum AG (2001) 171-177.[7] Engelmann U, Schröter A, Borälv E, Schweitzer T, MeinzerHP.: Mobile Teleradiology: All Images Everywhere. In Lemke HUet al. (Eds): CARS 2001: Proceedings of the 15th InternationalCongress and Exhibition. Amsterdam: Elsevier (2001) 798-803.

Simulation und Analyse vonZelldifferenzierung und -migrationU. Platzer, V. Braun, M. Gumbel, H. Billewitz,H.-P. Meinzer

In Zusammenarbeit mit: Dr. Ricardo Azevedo, Albert EinsteinUniversity, New York, USA; Prof. Dr. Gaetan Borgonie, UniversitätGent, Belgien; Dr. Hidde de Jong, INRIA, Grenoble, Frankreich;Prof. Dr. Armand Leroi, Imperial College, London, Großbritannien;Prof. Dr. Bengt Sandblad, University Uppsala, Uppsala; Prof. Dr.Ralf Schnabel, Universität Braunschweig; Prof. Dr. Nicolas Wright,ICRF, London.

Im Bereich der Simulation und Analyse von Zelldifferenzie-rung und -migration wurde Software entwickelt, die es Bio-logen ermöglichen soll, verschiedene Prozesse der Zelldif-ferenzierung und Zellmigration am Computer nachzustel-len und zu untersuchen. Drei verschiedene Teilaspektewurden untersucht. Ein Projekt bestand darin, eine Soft-ware zur dreidimensionalen Repräsentation von Zellen zuentwickeln, die es ermöglicht, komplexe Vorgänge wie z.B.Zellmigration aufgrund von differentieller Adhäsion zu si-mulieren [1]. Mit dieser Software wurde ein Modell desEmbryos des Fadenwurms Caenorhabditis elegans simu-liert. Dabei gelang es, die Gastrulation der Darmzellen al-lein aufgrund der simulierten Oberflächeneigenschaftender Zellen im Computer zu simulieren. Außerdem konntedie Bildung und Anordnung von Regionen aus Zellen glei-

359




cher Abstammung, wie sie in Laborexperimenten beob-achtet wurde, erfolgreich nachgebildet werden.

Das zweite Projekt beschäftigte sich mit der Analyse derZelllinien von Nematoden. Ziel dabei war es, grundlegen-de Fragen der Embryonalentwicklung anhand der Auswer-tung der komplexen Zelllinien zu klären. Dazu wurde einSoftware-Framework zur Zelllinienanalyse in internationa-ler Kooperation entwickelt. Die Software ermöglicht dasAuffinden von Zellen, die bei der Entwicklung eines Phä-notyps eine ausgezeichnete Rolle spielen. Des weiterenkönnen damit verschieden Nematoden bezüglich ihrer Effi-zienz bei der Zellverteilung verglichen werden. Um Hypo-thesen zur Topologie der Zelllinie und zur Schicksalsver-teilung zu testen, wurden verschiedene, aus der Phyloge-netik kommende Wahrscheinlichkeitsmodelle zur Generie-rung von künstlichen Zelllinien implementiert. Eine Anbin-dung an eine Visualisierungskomponente erlaubt die 3DDarstellung von Zellen zu einem Zeitpunkt und zum ande-ren die Generierung von Filmen, bei denen die kompletteEmbryogenese dreidimensional dargestellt ist und die fürdie Zelldifferenzierung wichtigen Zellen hervorgehobensind.

Das dritte Projekt beschäftigt sich mit der Simulation derZelldifferenzierung im Wurmembryo. Ausgehend von derbefruchteten Eizelle werden im Embryo unterschiedlicheZelltypen gebildet, aus denen später verschiedene Gewe-betypen entstehen. Diese Vorgänge werden durch ein ge-netisches Netzwerk, d.h. eine Gruppe miteinander inter-agierender Gene, mRNAs und Proteine, reguliert. In die-sem Projekt wurden die aus der Literatur bekannten Datenüber die molekularen Interaktionen benutzt, um das gene-tische Netzwerk zusammenzustellen, und mit der in derAbteilung entwickelten Software „Gene-O-Matic“ simuliert.Dabei konnte erfolgreich die Entwicklung bis zu einemStadium von 22 Zellen und die Entstehung von sieben ver-schiedenen Zelltypen nachvollzogen werden.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] Gumbel, M., *Schnabel, R., Meinzer, HP.: Analysis of CellMigrations in C. elegans using Computer Simulations. In: R. vanLandeghem (eds). Proceedings of the 14th European SimulationMulticonference. SCS Publications (2000) 605-611.

Buchbeiträge

Gumbel, M., Vetter, M., Cardenas, C.: Java StandardLibraries. München: Addison-Wesley 2000.

360


AbteilungH0200Molekulare Biophysik


Wissenschaftliche MitarbeiterRüdiger Bräuning (07/00 - )Peter ErnstDr. Mechthilde FalkenhahnKarl-Heinz GlattingDr. Béla PaizsDr. Barbara Pardon (05/00 - )Dr. Clemens Suter-Crazzolara ( - 06/00)Dr. Mark van der Linden (04/00 - )

Gastwissenschaftler:Dr. István Andrejkovics (Debrecen, Ungarn, 12/01 - )Enikö Bende (Debrecen, Ungarn, 12/01 - )Dr. István Csonka (Budapest, Ungarn, 10/2000 - 09/01)Anna Gaitova (Novosibirsk, Russland, div. mehrmonatigeAufenthalte)Dr. Karl Jalkanen (Lyngby, Dänemark, 12/01 - )Artem Tarassenko (Novosibirsk, Russland, - 12/00)Dr. Coral del Val (Granada, Spanien, 10/00 - )

DoktorandenAna-Nicoleta Bondar (07/00 - )Bastien Chevreux ( - 03/00)Christof Köhler (03/00 - )Thomas Niehaus ( - 10/00)Thomas Pfisterer ( - 03/00)Hong-Yi Zhou ( - 06/00)

Technische MitarbeiterMichaela Knapp-Mohammady

SekretariatAnke Retzmann

Die Abteilung Molekulare Biophysik untersucht molekulareund genomische Strukturprobleme mit Hilfe biophysika-lischer und computerwissenschaftlicher Methoden undentwickelt computergestützte Simulationsverfahren für ihreModellierung auf den genomischen, molekularen und elek-tronischen Ebenen.

W2H: Eine WWW Schnittstelle zum GCG/HUSAR SequenzanalysepaketR. Bräuning, K.-H. Glatting, P. Ernst, S. Suhai,C. del Va l

MOTIVATION: Die grafische X-Windows Oberfläche WPI desGCG Sequenzanalysepakets kann von Anwendern häufignicht genutzt werden, da auf MS Windows PCs und Mac-intosh Computern üblicherweise kein X-Server zur Verfü-gung steht. Da WWW Browser wie Netscapes Navigatoroder Microsofts Internet Explorer auf diesen Plattformenweit verbreitet sind, haben wir uns für die Entwicklung vonW2H entschieden: Eine WWW Schnittstelle zum GCG/HU-SAR Sequenzanalysesoftwarepaket basierend auf derFunktionalität der X-Windows Oberfläche WPI [27].

ERGEBNISSE: Die neue WWW Oberfläche (W2H) unterstütztmoderne Webtechnologien wie “Client-Pull” Methodenoder die Nutzung von eingebetteten Programmskriptenund ist dabei weitgehend plattformunabhängig. DieSchnittstelle bietet eine reiche Funktionsvielfalt wie zumBeispiel einem Sequenz-Auswahlwerkzeug, einem Aus-wahlfenster für Datenbank-Teilmengen zur Sequenzsuche,einem Werkzeug zur Erstellung von Enzymtabellen oderWerkzeuge zum hochladen (upload) von Benutzerdatenauf den Applikationsserver, wie auch Werkzeuge zur Visu-alisierung und Manipulation von grafischen oder auch text-basierten Ausgaben von Analyseprogrammen. Danebenunterstützt W2H die Bedürfnisse nach Vertraulichkeit derbehandelten Daten durch Zugangskontrollen und ver-schlüsselter Datenübertragung. Für spezielle Umgebun-gen wie Schulungen oder Konferenzen steht ein speziellerModus (Intranet mode) mit geringeren Sicherheitsein-schränkungen zur Verfügung. Um den unterschiedlichenAnforderungen von Anfängern und erfahrenen Benutzerngerecht zu werden, werden zwei unterschiedliche Ausprä-gungen der WWW Schnittstelle angeboten: Ein EinfacherModus (simple mode) mit Schwerpunkt auf Übersichtlich-keit und Benutzerführung und ein Fortgeschrittenen Mo-dus (advanced mode) mit voller Funktionalität und schnel-lem Zugriff auf die verschiedenen Werkzeuge der WWWSchnittstelle. Die Kontrolle von W2H geschieht durchge-hend durch Meta-Daten. Diese Daten beschreiben die ein-zelnen Applikationen und werden verwendet, um dieHTML Seiten von W2H dynamisch zu generieren. Durchdie Verwendung von Meta-Daten ist die Integration neuerApplikationen in die Schnittstelle ohne Programmier-aufwand möglich.

Die Entwicklung von W2H erfolgte in Kollaboration mitMartin Senger, European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), Hinxton, UK.VERFÜGBARKEIT: W2H ist frei verfügbar unterhttp://www.w2h.dkfz-heidelberg.de/

Molekulare Biophysik (H0200)Leiter: Prof. Dr. Sándor Suhai

361




Der deutsche EMBnet-Knoten undgenomische DatenbankenR. Bräuning, K.-H. Glatting, S. Suhai

In Zusammenarbeit mit Dr. Agnes Hotz-Wagenblatt, Steinbeis-Transferzentrum für Genominformatik, Heidelberg

Der deutsche EMBnet-Knoten - GENIUSnet - ist eine Bio-computing-Einrichtung für deutsche Wissenschaftler (der-zeitige Gesamtzahl der Benutzer: 1600), die für interakti-ven Zugang zu allen wichtigen internationalen Datenban-ken sorgt und Analysemethoden im Bereich der Molekular-biologie bzw. Genetik zur Verfügung stellt. Im Jahre 1990hat das Bundesministerium für Forschung und Technolo-gie das Deutsche Krebsforschungszentrum in Heidelbergmit dem Aufbau und der Pflege dieser Einrichtung beauf-tragt. Seine Forschungsaktivitäten sind in die AbteilungMolekulare Biophysik eingegliedert, und seine Dienst-leistungen stellen eine Erweiterung der Dienstleistungender Zentralen Datenverarbeitung des DKFZ dar.

File- andBatchserverAnonymous ftp News

Services of the German EMBnet Node

HUSAR

GenomeDatabases(EMBL, PIR,Kabat,...)

GopherWAIS

SequenceDatabases

IGDentrez

(OMIM, GDB,...)

Automatische Verarbeitung genomischerSequenzenB. Chevreux, T. Pfisterer, S. Suhai

Die Gewinnung von DNA Sequenzdaten ist heutzutage einin weiten Teilen automatisierter Prozess, wie es durch di-verse Großprojekte wie z.B. dem Humangenomprojektnotwendig geworden ist. Um hohe Durchsatzraten zu er-reichen, ist es erforderlich, bei niedriger Fehlerwahr-scheinlichkeit den manuellen Nachbearbeitungsaufwandzu minimieren und dazu die vorhandenen Daten optimalzu nutzen. Hierzu wurden in dreijähriger EntwicklungszeitMethoden entwickelt und implementiert, die eine engeVerbindung von Assemblierung und Editierung ermögli-chen, obwohl beide Programme auch separat verwendetwerden können.

Die Schlüsseleigenschaften unseres neuen MIRA-Assem-blers sind eine primäre Nutzung von Sequenzfolgen mitniedriger Fehlerwahrscheinlichkeit im Zusammenspiel mitzusätzlich vorhandenen Informationen wie Regionen mithoher Fehlerwahrscheinlichkeit, Signaldaten, Klonidentifi-zierungsdaten oder Markern für repetitive Regionen. Wei-terhin wurde ein automatischer Sequenzeditor EDIT ent-wickelt, der auf der Basis der zugrundeliegenden Signal-

daten arbeitet. Komplexe Fehlersituationen werden in ele-mentare Editieroperationen zerlegt, die durch neuronaleNetze entschieden werden. Durch geeignete Lernstich-proben kann der Editor einfach an neue Sequenzierver-fahren angepaßt werden. Der Editor kann sowohl alleineals auch zusammen mit dem Assembler arbeiten. Er ver-feinert die der Assemblierung zugrundeliegenden Sequen-zen und das komplette Projekt. Zugleich erlaubt der auto-matische Editor dem Assembler eine effiziente Erkennungund Markierung von bislang nicht erkannten, repetitivenSequenzen und verhindert so falsche Assemblierungen.

Tests mit Daten aus dem Maus- und Humangenom erzie-len vielversprechende Ergebnisse sowohl bezüglich derAssemblierungsqualität - welche die vom Humangenom-projekt gesetzte Fehlerrate von einem Fehler in 10 Kilo-basen erreichen kann - als auch bei der Erkennung undVerhinderung von falschen Assemblierungen bei langenund unmarkierten repetitiven Sequenzen, selbst in Projek-ten bei denen Basenwahrscheinlichkeitswerte nicht zurVerfügung stehen. Durch den Einsatz des Editors konntedie Fehlerrate merklich verringert werden. Aktuelle Versio-nen des MIRA Assemblers und des automatischen EditorsEDIT sind als ausführbare Programme unter http://www.dkfz.de/mbp-ased/ für SGI, i386 Linux und SUNSolaris Systeme frei verfügbar.

Helmholtz Netzwerk für BioinformatikP. Ernst, M. Falkenhahn, K.-H. Glatting,M. van der Linden, B. Pardon, S. Suhai

In Zusammenarbeit mit verschiedenen Instituten der Her-mann von Helmholtz-Gemeinschaft (GBF, GSF, GMD,MDC) und dem EMBL, Heidelberg, dem MPI für Moleku-lare Genetik und dem Ressourcenzentrum, Berlin und derUniversität Köln entwickelt unsere Gruppe eine integrierteBioinformatik-Plattform, um mehrere lokale Entwicklungenin den o.g. Instituten zu vereinheitlichen. Als Ziel wird an-gestrebt, ein effizientes und umfassendes Bioinformatik-Portal für die deutsche biomedizinische Forschergemeindeim post-genomischen Zeitalter bereit zu stellen. Die Haupt-bestandteile des zu entwickelnden Systems umfassenkomplexe biologische Sequenzanalyse, neue Methodenzur Vorhersage von biologischen Funktionen aus genomi-schen Sequenzen, die Analyse von Proteinfamilien, funk-tionelle Klassifikation und systematische Genomanalyse,Methoden zur Analyse von Genregulation und Genoman-notation, homologie-basierte Modellierung und strukturelleKlassifikation, Target-Identifikation in pharmazeutischenAnwendungen, molekulares Docking und computer-ge-stütztes Medikamentendesign, etc. Ein WWW-basiertesund benutzerfreundliches Design wird einen einfachen Zu-gang zu den Programmen und Datenbanken ermöglichenund durch begleitende Kurse wird die Nutzung des Sy-stems bei komplexen wissenschaftlichen Fragestellungenerleichtert.

362




Computersimulation der strukturellen undspektroskopischen Eigenschaften von Bio-molekülenM. Elstner, M. Knapp-Mohammady, K. Jalkanen,B. Paizs, S. Suhai

Die relative Stabilität der verschiedenen Konformationenvon Nukleinsäuren und Proteinen, die bei verschiedenenbiologischen Prozessen von zentraler Bedeutung ist,hängt vom Gleichgewicht mehrerer Kräfte ab. Diese Kräftebeeinflussen z. B. Protein-Ligand und Karzinogen-DNAWechselwirkungen und spielen eine wichtige Rolle beimProtein-Engineering bzw. rationellen Drug-Design [9, 10,11].

Für die phänomenologische Voraussage der Sekundär-stukturen in Proteinen und für ihre Zuordnung zu Faltungs-klassen haben wir statistische Verfahren und neuronaleNetze eingesetzt [21]. Die darüber hinaus gehende, exak-te rechnergestützte Modellierung solcher Molekülkonfor-mationen setzt auch die quantenmechanische Berechnungder intermolekularen Wechselwirkungen mit Hilfe von abinitio Verfahren voraus. Eine der stärksten Kräfte, die elek-trostatische Wechselwirkung, wurde bei Computersimula-tionen bisher unzulänglich behandelt, da die Beschreibungder dielektrischen Eigenschaften der Biomoleküle auf sehrvereinfachten physikalischen Modellen basierte. Wir ent-wickelten daher eine besser fundierte, quantenmechani-sche Theorie der dielektrischen Abschirmung für Biopoly-mere, die alle wichtigen (elektronischen und Gitter-) Pola-risationsmöglichkeiten berücksichtigt und gleichzeitig auchden strukturellen Randbedingungen (z. B. kaum beweg-liche Sekundärstruktur-Elemente) Rechnung trägt [12, 13,14].

Neben der statischen Struktur sind die zeitabhängigenKonformationsänderungen (Schwingungen) der Biopoly-mere für ihre biologische Funktion von großer Bedeutung.Die Aufklärung der physikalischen Mechanismen solcherSchwingungen trägt nicht nur zum besseren Verständnisihrer biologischen Funktion bei, sondern liefert auch einenSchlüssel zu ihrer gezielten Veränderung (Protein Engi-neering). Durch die Anwendung der Theorie der Phono-nenspektren haben wir das kooperative Verhalten mehre-rer Molekülbausteine simuliert und molekulare Vorgängemit langsamem Zeitverhalten auch energetisch charakteri-siert. Das Wissen um die explizite Form der oben erwähn-ten dielektrischen Matrix definierte den Ausgangspunkt inunserer Arbeit zur Berechnung der dynamischen Matrixdes Elektronen-Kern Systems der Moleküle in der harmo-nischen Approximation. Als nächsten Schritt haben wirPhononenspektren einfacher DNA- und Polypeptid-Model-le berechnet. Ein besseres Verständnis der Phononen-energien wird es ermöglichen, eine Reihe biologischerProbleme in Biopolymeren, wie die Rolle der weichenPhononmodi, konformationelle Phasenübergänge und an-dere thermodynamische Prozesse, Schmelz- und Trans-porteigenschaften usw., genauer zu diskutieren [16, 17].

Hydratationseffekte in BiopolymerenK. Jalkanen, M. Knapp-Mohammady, S. Suhai

Wir haben zahlreiche Untersuchungen an Modellsystemenfür Peptide und Nukleotide durchgeführt, um die Auswir-kungen der Hydratation auf die strukturellen und spektro-skopischen Eigenschaften dieser Moleküle zu verstehen[3, 15, 22]. Insbesondere haben wir intramolekulare undintermolekulare Schwingungsfrequenzen, Absorptionsei-genschaften und zirkuläre Dichroismen theoretisch be-rechnet. Mit Hilfe von künstlichen neuronalen Netzwerkenist es uns auch gelungen, von spektroskopischen Datendurch eine inverse Transformation die Strukturkoordinatender Moleküle zu konstruieren. Dieses Verfahren ermöglichtuns, u. a. die Entwicklung von Sekundärstrukturelementenin Proteinen zu analysieren.

Modellstudien zur Konformation undFunktion von BacteriorhodopsinN. Bondar, B. Pa izs, S. Suhai

Das transmembrane Protein Bacteriorhodopsin (BR) dientals Modellsystem für eine größere Gruppe von Proteinmo-lekülen (z. B. G-Protein gekoppelte Rezeptoren). Die Si-mulation der Struktur von BR und die Untersuchung derWechselwirkungen seines Chromophors mit Licht und mitdem aktiven Zentrum des Proteins eröffnet uns den Weg,interessante Auskünfte über den Ablauf des Proton- undIonentransportes in dieser Molekülklasse zu bekommen[1, 2, 8, 20]. Als ersten Schritt haben wir Dichtefunktional-Berechnungen für eine Serie von Schiff’schen Basenstruk-turen durchgeführt und die Protonaffinität in Abhängigkeitvon der Länge und Konformation des konjugierten Elektro-nensystems analysiert. Um den Mechanismus der Lichtab-sorption am Chromophor zu verstehen, berechneten wirauch die Potentialfläche der elektronisch angeregten Zu-stände des Retinals. In diesen Untersuchungen haben wirin einem weiteren Schritt auch die Wechselwirkung desRetinals mit den Aminosäuren der Chromophor-Tascheberücksichtigt, sowohl im Grund- als auch im angeregtenZustand, und lichtinduzierte Konformationsänderungendes Retinals modelliert. Mit Hilfe dieser Daten können wirdie Translokation eines Protons im Protonen-Transportka-nal verfolgen. Wir haben dazu nicht-lineare Transportmo-delle weiterentwickelt, die auf dem Soliton-Mechanismusbasieren.

Entwicklung eines neuen quantenmechani-schen Verfahrens zur Simulation der Struk-tur und der intermolekularen Wechselwir-kungen in BiomolekülenK. Jalkanen, M. Knapp-Mohammady,C. Köhler, T. Niehaus, S. Suhai

In Zusammenarbeit mit Dr. Marcus Elstner und Prof. Dr. ThomasFrauenheim, Universität Paderborn

Die empirischen Kraftfelder, die für die dynamischen Simu-lationen großer Strukturen anhand von ab-initio Rechnun-gen früher von uns parametrisiert worden sind, sind jedoch

363




nicht in der Lage, echte chemische Reaktionen im aktivenZentrum des biologischen Systems zu beschreiben. Letz-teres besteht in der Regel unter Einbeziehung von Lö-sungsmittelmolekülen aus mehreren 100 bis zu einigen1000 Atomen. Für derartige Systemgrößen müssen quan-tenmechanische Methoden bereitgestellt werden, welchedie chemische Genauigkeit und Übertragbarkeit von Post-Hartree-Fock bzw. DFT-Rechnungen mit der Effizienz undEinfachheit von stärker genäherten semiempirischen Ver-fahren verbinden.

Die ladungsselbstkonsistente Dichtefunktional-Tight-Bin-ding Methode (SCC-DFTB) basiert auf einer Entwicklungdes Kohn-Sham Energiefunktionals nach Ladungsdichte-fluktuationen an einer gegebenen Referenz-Elektronendi-chte [4, 7, 24, 25]. Während die Variation des Energieaus-druckes in 0. Ordnung auf ein nichtselbstkonistentes Stan-dard-Tight-Binding Schema führt, erhält man durch dieVariationsbehandlung der in 2. Ordnung genäherten Kohn-Sham Energie Kohn-Sham-Gleichungen, in der die verall-gemeinerten Hamiltonmatrixelemente eine selbstkonsis-tente Einstellung (Umverteilung) von Mulliken-Ladungenberücksichtigen. Der zugehörige Gesamtenergieausdruckschließt dabei neben den üblichen Bandstruktur- und kurz-reichweitigen repulsiven (Kern-Kern plus “double-coun-ting”) Energietermen auch einen expliziten Coulomb-termein, welcher die Wechselwirkungen der auftretenden La-dungsfluktuationen enthält.

Durch die eingeführten Näherungen bleibt die Einfachheitdes üblichen Tight-Binding-Ansatzes erhalten, so daß dieRechenzeit allein durch die Lösung eines allgemeinenEigenwertproblems einer vorab berechneten und tabellier-ten Hamilton- und Überlappungsmatrix bestimmt wird. AufGrund der Selbstkonsistenz in der Ladungsverteilung er-hält man aber gegenüber dem Standardvorgehen eine we-sentlich höhere Genauigkeit und chemische Transferabili-tät. Wir haben dieses Verfahren bisher für Biomoleküle mitmehreren hundert Atomen verwendet, um helixbildendeEigenschaften von Peptiden, strukturelle Probleme in Nuk-leinsäurekomplexen, Protontransportvorgänge im aktivenZentrum von Enzymen u. ä. zu modellieren. Die laufendeEntwicklung wird auch zum Einsatz dieser Methode für dieSimulation der Kurzzeitdynamik in Biopolymeren führen.

Computergestütztes Modellieren vonMassenspektren in ProteinenI. Csonka, B. Paizs, S. Suhai

Die Massenspektrometrie ist in den letzten Jahren zu ei-nem wertvollen Werkzeug für die Peptid- und Proteinfor-schung geworden. Dies beruht hauptsächlich auf der Ent-wicklung von „weichen“ Ionisationsmethoden wie MALDIund der Elektrosprayionisation, die die Bildung von einzelnoder mehrfach geladenen Peptiden und Proteinen in derGasphase ermöglichen. Wegen der Komplexität und derriesigen Menge von Fragmentationsdaten stützt sich dasmassenspektrometrische Sequenzieren von Proteinen aufden umfangreichen Gebrauch von Sequenzierungspro-grammen und Protein/DNA-Datenbanken. Trotz der Be-deutung der Massenspektrometrie bei der Proteinanalyse

ist die Fragmentation der protonierten Peptide bisher nurauf der empirischen Ebene erforscht und die genauen De-tails der Fragmentationswege sind noch nicht bekannt.Dies ist jedoch nicht erstaunlich, da die Massenspektrenvon protonierten Peptiden in der Regel zu kompliziert sind,um alle Linien eindeutig zuordnen zu können, und sie sel-ten detaillierte Strukturinformationen über die untersuch-ten Moleküle bieten. Die fehlenden Energie- und Struktur-daten werden innerhalb unseres Projektes sehr effizientmit Hilfe von quantenchemischen Berechnungen gewon-nen. Die bisherigen Studien haben interessante Ergebnis-se für die Mobilität von protonierten Peptiden und für dieEntstehung der a2

+ und b2+ Ionen von Peptiden geliefert

[5, 6, 18, 19, 23].

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] M. Elstner, Th. Frauenheim*, E. Kaxiras*, G. Seifert* and S.Suhai: A self-consistent charge density-functional based tight-binding scheme for large biomolecules, Phys. stat. sol. (b) 217,357-376 (2000).[2] E. Tajkhorshid, J. Baudry*, K. Schulten* and S. Suhai: Molecu-lar dynamics study of the nature and origin of retinal’s twistedstructure in bacteriorhodopsin, Biophys. J. 78, 683-693 (2000).[3] K. Frimand, H. Bohr*, K. J. Jalkanen and S. Suhai: Structures,vibrational absorption and vibrational circular dichroism spectra ofL-alanine in aqueous solution: a density functional theory andRHF study, Chem. Phys. 255, 165-194 (2000).[4] Th. Frauenheim*, G. Seifert*, M. Elstner, Z. Hajnal*, G.Jungnickel*, D. Porezag*, S. Suhai and R. Scholz*: A self-consistent-charge density-functional based tight-binding methodfor predictive materials simulations in physics, chemistry andbiology, Phys. stat. sol. (b) 217, 41-62 (2000).[5] I. P. Csonka, B. Paizs, G. Lendvay* and S. Suhai: Protonmobility in protonated peptides: a joint molecular orbital andRRKM study, Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 417-431(2000).[6] B. Paizs, Z. Szlávik*, G. Lendvay*, K. Vékey* and S. Suhai:Formation of a2

+ ions of protonated peptides. An ab initio study,Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 746-755 (2000).[7] W.-G. Han, M. Elstner, K. J. Jalkanen, T. Frauenheim* and S.Suhai: Hybrid SCC-DFTB/molecular mechanical studies of H-bonded systems and of N-Acetyl-(L-Ala)n N’-Methylamide helicesin water solution, Int. J. Quant. Chem. 78, 459-479 (2000).[8] E. Tajkhorshid and S. Suhai: The dielectric effect of theenvironment on the pKa of the retinal Schiff base and on thestabilization of the ion pair in bacteriorhodopsin, J. Mol. Struct.(Theochem) 501-502, 297-313 (2000).[9] M. Elstner, K. J. Jalkanen, M. Knapp-Mohammady, Th.Frauenheim* and S. Suhai: DFT studies on helix formation in N-acetyl-(L-alanyl)n-N’-methylamide for n=1-20, Chem. Phys. 256,15-27 (2000).[10] I. P. Csonka, B. Paizs and S. Suhai: Evaluating the formationof salt-bridges. a molecular orbital study, Chem. Phys. Lett. 326,129-142, (2000).[11] B. Paizs, J. Baker*, S. Suhai and P. Pulay*: Geometryoptimization of large biomolecules in redundant internalcoordinates, J. Chem. Phys. 113, 6566 - 6572 (2000).[12] T. A. Niehaus, M. Elstner, Th. Frauenheim* and S. Suhai:Application of an approximate density-functional method to sulfurcontaining compounds, J. Mol. Struct. (THEOCHEM) 541, 185-194 (2001).[13] B. Paizs, P. Salvador, A. G. Császár, M. Duran* and S. Suhai:Intermolecular bond lengths: extrapolation to the basis set limit onuncorrected and BSSE-corrected potential energy hypersurfaces,J. Comp. Chem. 22, 196-207 (2001).

364




[14] M. Elstner, K. J. Jalkanen, M. Knapp-Mohammady, T. Frauen-heim* and S. Suhai: Energetics and structure of glycine andalanine based model peptides: Approximate SCC-DFTB, AM1 andPM3 methods in comparison with DFT, HF and MP2 calculations,Chem. Phys. 263, 203-219 (2001).[15] K. J. Jalkanen, R. M. Nieminen*, K. Frimand, J. Bohr, H.Bohr*, R. C. Wade*, E. Tajkhorshid and S. Suhai: A comparison ofaqueous solvent models used in the calculation of the Raman andROA spectra of L-alanine, Chem. Phys. 265, 125-151 (2001).[16] M. Elstner, P. Hobza*, T. Frauenheim*, S. Suhai and E.Kaxiras*: Hydrogen bonding and stacking interactions of nucleicacid base pairs: A density-functional-theory based treatment, J.Chem. Phys. 114, 5149-5155 (2001).[17] P. Salvador, B. Paizs, M. Duran* and S. Suhai: On the effectof the BSSE on intermolecular potential energy surfaces.Comparison of a priori and a posteriori BSSE correction schemes,J. Comp. Chem. 22, 765-786 (2001).[18] B. Paizs, I. P. Csonka, G. Lendvay* and S. Suhai: Protonmobility in protonated glycylglycine and N-formylglycylglycinamide: a combined quantum chemical andRKKM study, Rapid Commun. Mass Spectrom. 15, 637-650(2001).[19] B. Paizs and S. Suhai: Theoretical study of the mainfragmentation pathways for protonated glycylglycine, RapidCommun. Mass Spectrom. 15, 651-663 (2001).[20] T. A. Niehaus, S. Suhai, F. Della Sala*, P. Lugli*, M. Elstner,G. Seifert* and Th. Frauenheim*: Tight-binding approach to time-dependent density-functional response theory, Phys. Rev. B 63,85108-1 - 85108-9 (2001).[21] L. Edler, J. Grassmann and S. Suhai: Role and results ofstatistical methods in protein fold class prediction, Math. andComp. Modelling 33, 1401-1417 (2001).[22] H. G. Bohr*, K. Frimand, K. J. Jalkanen, R. M. Nieminen* andS. Suhai: Neural-network analysis of the vibrational spectra of N-acetyl L-alanyl N’-methyl amide conformational states, Phys. Rev.E 64, 21905-1 - 21905-13 (2001).[23] B. Paizs and S. Suhai: Combined quantum chemical andRRKM modeling of the main fragmentation pathways ofprotonated GGG. I. Cis-trans isomerization around protonatedamide bonds, Rapid Commun. Mass Spectrom. 15, 2307-2323(2001).[24] C. Köhler, Z. Hajnal*, P. Deák*, Th. Frauenheim* and S.Suhai: Theoretical investigation of carbon defects and diffusion in�-quartz, Phys. Rev. B 64, 85333-1 - 85333-7 (2001).[25] B. Torralva*, T. A. Niehaus, M. Elstner, S. Suhai, Th. Frauen-heim* and R. E. Allen*: Response of C60 and Cn to ultrashort laserpulses, Phys. Rev. B 64, 153105-1 - 153105-4 (2001).[26] R. Bräuning, M. van der Linden, B. Pardon und S. Suhai:Bioinformatik - Lichtblick am Ende des Datentunnels?Biospektrum 1, 72-75 (2001).[27] C. d. Val, P. Ernst, R. Bräuning, K.-H. Glatting and S. Suhai:PATH: a task for the inference of phylogenies, Bioinformatics (inpress).

365



Wissenschaftliche MitarbeiterDr. med. Hanxiang AnDr. Christian PramlDr. Larissa SavelyevaDr. med Tobias Schilling ( - 06/00)Dr. Frank Westermann (01/00 - )

GastwissenschaftlerDr. Nazarena Bui ( - 01/00) Genf, Schweiz

DoktorandenKatrin Arnold (01/01 - )Detlev Bannasch ( - 07/00)Anja Bauer ( - 05/00)Stefan BrouwersAndras Claas ( - 04/01)Kai-Oliver HenrichMin-Kyoung Kim (10/00 - )Britta Mädge ( - 10/01)Isabel MatznerAndrea Pillmann (-07/01)Ruprecht WiedemeyerIsabel WittkeSabine Zitzmann

Technisches PersonalSonja Ortmann ( - 05/01)Young-Gyu Park (08/00 - )

SekretariatIngrid Cederlund ( - 12/00)Cornelia Kirchner (01/01 - )

Genetische Veränderungen gelten heute als zentraler Me-chanismus der Entstehung von Krebserkrankungen.Forschungsthema der Abteilung ist die Ermittlung der Rol-le genetischer Veränderungen bei unterschiedlichen hu-manen Krebserkrankungen. Im Mittelpunkt steht dabei einKrebs des Nervenzellsystems bei Kindern, das Neuro-blastom, sowie erbliche Formen von Brustkrebs. In Hin-blick auf die genetische Analyse der humanen Krebszelleund auf die Ermittlung von Mechanismen der Krebsent-stehung setzen wir in der Kombination experimentelle An-sätze der klassischen und molekularen Zytogenetik, derMolekulargenetik und der Proteinbiochemie ein.

Genetische Veränderungen beiNeuroblastomen und Brustkrebs.M. Schwab

1. NeuroblastomIn Zusammenarbeit mit: Dr. Javed Khan, NCI, AdvancedTechnology Center, Gaithersburg, USA; Prof. Frank Berthold,Univ.-Kinderklinik, Köln.

Das Neuroblastom ist der häufigste solide Tumor beiKleinkindern. Zwei Arten genetischer Veränderungen sindhäufig mit Neuroblastomen assoziiert: a.) Amplifikation desOnkogens MYCN; und b.) Veränderungen, zumeist Dele-tionen oder Translokationen, im distalen Chromosom 1p-Bereich, welche die Anwesenheit eines Tumorsuppressor-gens signalisieren. Amplifikation von MYCN wird klinischals ein wichtiger molekularer Parameter zur Therapiege-staltung eingesetzt. Patienten mit Amplifikation haben un-günstige Prognose und werden daher intensiver therapiertals Patienten ohne Amplifikation; und Patienten mit einemNeuroblastom bestimmten Stadiums haben keinen Vorteilvon einer Chemotherapie, wenn Amplifikation fehlt. Bei derIdentifizierung der Funktionen des MYCN Proteins gelangvor allem der Nachweis, daß Überexpression in Kombina-tion mit Interferon-Gamma effiziente Apoptose der Neuro-blastomzellen auslöst. Wir prüfen, ob sich hieraus Per-spektiven für neue Therapieformen ergeben könnten. Veränderungen in distalem 1p-Bereich werden bei etwa70-80% der diploiden Neuroblastome beobachtet, besit-zen aber offensichtlich keine klinische Signifikanz. In derRegel handelt es sich um Deletionen, aber wir haben auchreziproke oder nicht-balancierte Translokationen identifi-ziert, die uns Zugang zum vermuteten Tumor-Suppressor-gen ermöglichen sollten. Das derzeit vor allem hinderlicheProblem der geringen Information über die genomischeStruktur und die informative Komplexität der distalen 1pRegion hoffen wir durch eine konzentrierte Genomanalysedieser Region zu überwinden. Die Akquisition der notwen-digen Materialien in Form von YACs sowie die Ausarbei-tung der entsprechenden Strategie zur genetischen Ana-lyse gelang im Berichtszeitraum.

2. Erbliche Formen von BrustkrebsIn Zusammenarbeit mit: Prof. Peter Schlag, Prof. SiegfriedScherneck, Max-Delbrück-Centrum, Berlin-Buch.

Brustkrebs gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen,er tritt in der Regel bei Frauen auf, zu einem geringen Pro-zentsatz aber auch bei Männern. Etwa 10-15% aller Brust-krebserkrankungen sind erblich bedingt. Als genetischeDeterminanten wurden bei einem Teil der Familien Keim-bahnmutationen des Gens BRCA1, bei einem anderenTeil Mutationen des Gens BRCA2 identifiziert. Risikopa-tienten besitzen in allen Körperzellen ein normales und einmutiertes Allel. Sobald das normale Allel mutiert, kommtes zum Ausfall der betreffenden Genfunktion mit der Kon-sequenz des Brustkrebs. Die anfänglichen Befunde wie-sen auf ein etwa 90%iges Risiko für Brustkrebserkrankungbis zum Alter von 70 Jahren hin. Dementsprechend war

Abteilung Klassische und Molekulare Zytogenetik (H0400)Leiter: Prof. Dr.rer.nat. Manfred Schwab

366


AbteilungH0400Klassische und Molekulare Zytogenetik


die Euphorie anfänglich sehr hoch, einen prädiktiven ge-netischen Marker für die präsymptomatische Identifizie-rung von Hochrisiko-Patienten gefunden zu haben. Erstdie sorgfältige weitere genetisch-epidemiologische Analy-se führte zu der Einsicht, daß dieses hohe Risiko aufHochrisikofamilien beschränkt ist, ebensolche, die zurIdentifizierung der BRCA1/2 Gene als besonders geeignetausgewählt worden waren, solche Familien sind aber rela-tiv selten. Das statistische Risiko nicht besonders ausge-wählter Populationen erwies sich als wesentlich niedriger,etwa 55% bis zum Alter von etwa 70 Jahren. Derzeit läßtsich also das reale Risiko nach Identifizierung einerBRCA1/2 Mutation nicht abschätzen, es kann in Gegen-wart derselben Mutation bei der einen Familie hoch, beider anderen niedrig sein. Offensichtlich wird die Höhe desRisikos durch weitere genetische Faktoren determiniert -sogenannter Modifikationsgenen. Die Existenz solcherModifikationsgene deutet sich auch durch zwei weiterePhänotypen an: dieselbe BRCA2 Mutation bedingt in man-chen Familien Brustkrebsrisiko bei männlichen, in anderenbei weiblichen Mitgliedern; und wiederum dieselbe Mutati-on bedingt bei manchen Familien ausschließlich Brust-krebs, bei anderen Familien treten aber auch andere Ty-pen von Krebs auf.

Da die sichere Bestimmung des Brustkrebsrisikos hoheBedeutung besitzt, wird intensiv nach Modifikationsgenengesucht. Zwei Möglichkeiten existieren: zum einen die ge-netische Kopplungsanalyse, die aber gerade bei Genenmit geringer oder variabler Penetranz problematisch ist.Zum anderen die zytogenetische Analyse, die zunächstauf den Nachweis zusätzlich konstitutioneller Chromoso-menveränderungen abzielt. So gelang uns kürzlich in Zel-len von Hochrisiko-Patienten mit BRCA2 Mutation erst-mals der Nachweis der Koexistenz von distaler 9p Chro-mosomeninstabilität. Diese Patienten besitzen also bereitsin ihren normalen Zellen sowohl die BRCA2 Mutation wieauch die 9p Instabilität. Sollte in distalen 9p einer der ge-suchten Modifikationsfaktoren lokalisiert sein? Gerade fürdie Klärung solcher Fragen dürfte die etablierte Sequenzdes Humangenoms als hervorragendes Werkzeug dienen.

3. Fragile sitesFragile sites sind nicht-zufällig verteilte instabile Chromo-somenregionen, die durch unterschiedliche Noxen, z.B.Tabakrauch, induzierbar sind. Sie erscheinen bei mikro-skopischer Betrachtung von Chromosomen als Brüche.Die Reparatur der entsprechenden DNA-Defekte ist gele-gentlich unvollständig, und es können genetische Schä-den in der Zelle entstehen. Über die molekulare Identitätder entsprechenden DNA-Sequenzen an den etwa 120fragile sites des humanen Genoms herrscht noch weitge-hende Unklarheit. Es ist ein Ziel unserer Arbeiten, dieseDNA-Sequenzen möglichst vollständig zu isolieren, zucharakterisieren, und ihre vermutete Rolle bei der Entste-hung humaner Krebserkrankungen zu ermitteln. Wir habenhierzu ein genetisches Verfahren ausgearbeitet, welchesdie Markierung und Isolierung sämtlicher fragile site DNA-Sequenzen des humanen Genoms ermöglichen wird.

Publikationen (* = externer Koautor)[1] Amler, L.C., Bauer, A., Corvi, R., Dihlmann, S., Praml, C.,*Cavenee, W.K., Schwab, M., Hampton, G.M.: Identification andcaracterization of novel genes locate at the t(1;15)(p36.2;q24)translocation breakpoint in the neuroblastoma cell line NGP.Genomics 64, 195-202 (2000)[2] Claas, A., Savelyeva, L., Pillmann, A., Schwab, M.: Chromoso-mal mapping of human genes by radioactive hybridization ofcDNAs to Centre d’Etude du Polymorphisme Humain high densitygridded filter sets. Cancer Letters 156, 19-25 (2000)[3] *Müller, S., *van den Boom, D., *Zirkel, D., *Köster, H., *Bert-hold, F., Schwab, M., *Westphal, M., Zumkeller, W.: Retention ofimpriting of the human apoptosis-related gene TSSC3 in humanbrain tumors. Human Mol. Genet. 9, 757-763 (2000)[4] *Müller, S.; *Zirkel, D., *Westphal, M., Zumkeller, W.: Genomicimprinting of IGF and H19 in human meningiomas. EuropeanJournal of Cancer 36, 651-655 (2000)[5] *Solovei, I., *Kienle, D., *Little, G., Eils, R., Savelyeva, L.,Schwab, M., *Jäger, W., *Cremer, T.: Topology of double minutes(dmins) and homogeneously staining regions (HSRs) in nuclei ofhuman neuroblastoma cell lines. Genes, Chromos. Cancer, 29,297-308 (2000).[6] *Fulda, S., Lutz, W., Schwab, M., Debatin, K.-M.: MycNsensitizes neuroblastoma cells for drug-triggered apoptosis.Medical and Pediatric Oncology 35, 582-884 (2000)[7] *O’Neill, S., *Ekstrom, L., *Lastowska, M., *Roberts, P.,*Brodeur, G.M., *Kees, U.R., Schwab, M., *Bown, N.: MYCNAmplification and 17q in Neuroblastoma: Evidence for StructuralAssociation. Genes, Chromosomes & Cancer 90, 30-87 (2001)[8] Wittke, I., Mädge, B., Wiedemeyer, R., *Kimchi, A., Schwab,M.: DAP-5 is involved in MycN/IFN� induced apoptosis in humanneuroblastoma cells. Cancer Letters 162, 237:243 (2001)[9] *Rössler, J., Schwab, M., *Havers, W., *Schweigerer, L.:Hypoxia promotes apoptosis of human neuroblastoma cell lineswith enhanced N-myc expression. Biochemical and BiophysicalResearch Communication 281, 272-276 (2001)[10] *Boon, K., *Caron, H.N., *van Asperen, R., *Velantijn, L.,*Hermus, M.-C., *van Sluis, P., *Roobeek, I., Weis, I., *Voute,P.A., Schwab, M., *Versteeg, R.: N-myc enhances the expressionof a large set of genes functioning in ribosome biogenesis andprotein synthesis. EMBO Journal 20, 1-11 (2001)[11] Würfel, J., *Seiter, S., Stassar, M., Claas, A., *Kläs, R., Rösel,M., Marhaba, R., Savelyeva, L., Schwab, M., *Matzku, S., Zöller,M.: Cloning of the human homologue of the metastasis-associated rat C4.4A. Gene 262, 35-41 (2001)[12] Schilling, T., *Bürck, J., *Sinn, H.-P., *Clemens, A., *Otto, H.F., *Höppner, W., *Herfahrth, C., *Ziegler, R., Schwab, M., *Raue,F.: Prognostic value of codon 918 (ATG-ACG) RET proto-onco-gene mutations in sporadic medullary thyroid carcinoma. Int. J.Cancer (Pred. Oncol.) 95, 62-66 (2001)[13] Savelyeva, L., Schwab, M.: Amplification of oncogenesrevisited: From expression profiling to clinical application, CancerLetters 167, 115-123 (2001)[14] *Khan, J., *Wei, J.S., *Ringnér, M., *Saal, L.H., *Ladanyi, M.,Westermann, F., *Berthold, F., Schwab, M., *Antonescu, C.R.,*Peterson, C., *Meltzer, P.S.: Classification and diagnosticprediction of cancers using gene expression profiling and artificialneural networks. Nature Medicine 7, 673-679 (2001)[15] Bauer, A., Savelyeva, L., Claas, A., Praml, C., *Berthold, F.,Schwab, M.: Smallest region of overlapping deletion in 1p36 inhuman neuroblastoma: A 1-Mbp cosmid and PAC contig. Genes,Chromosomes & Cancer 31, 228-239 (2001)[16] Savelyeva, L., Claas, A., Matzner, I., *Schlag, P., *Hofmann,W, *Scherneck, S., *Weber, B., Schwab, M.: Constitutionalgenomic instability with inversions, duplications and amplificationin 9p23-24 in BRCA2 mutation carrires. Cancer Research 61,5179-5185 (2001)

367


AbteilungH0400Klassische und Molekulare Zytogenetik


[17] Claas, A., Savelyeva, L., Pillmann, A., Schwab, M.: Chromo-somal mapping of human genes by radioactive hybridization ofcDNAs to CEPH-YAC high density gridded filter sets. CancerLetters 162, 125-131 (2001)[18] Zhang, J., *Spring, H., Schwab, M.: Neuroblastoma tumorcell-binding peptides identified through random peptide phagedisplay, Cancer Letters 171, 153-164 (2001)[19] Bannasch, D., Mädge, B., Schwab, M.: Functional interactionof Yaf2 with the central region of MycN. Oncogene 20, 5913-5919(2001)[20] Schwab, M.: MYCN amplification in neuroblastoma.. In:Brodeur, G.M., Sawada, T., Tsuchida, Y. & Voûte, P.A. (eds.)Neuroblastoma. Elsevier Science B.V., Amsterdam pp. 75-83(2000)[21] Schwab., M.: Cover Story: Audrey Evans. Cancer Research60 (2000)[22] Schwab, M.: Krebs und Gene. BioSpektrum 3.01, 7. Jahr-gang, 211-212 (2001)[23] Schwab, M.: Cancer Research, An Encyclopedic Reference.992 S., Springer-Verlag, 2001

368


AbteilungH0500Biophysik der Makromoleküle


Wissenschaftliche MitarbeiterDr. Konstantin KleninDr. Karsten Rippe (- 09/01)Dr. Katalin TóthDr. Waldemar WaldeckDr. Malte Wachsmuth (08/01 -)

GastwissenschaftlerGabriella Csík (Budapest, Ungarn, 05 + 09/00)Marianna Egyeki (Budapest, Ungarn, 07/01)Kirsten Groener (11/01)Dr. Filip Lankas (04-07/00 + 09/01 -)Lisa Pope (11/01)

Doktoranden/DiplomandenLala Adueva (- 09/00) Nina Baudendistel (05/01 -)Malte Bussiek (- 12/01)Maiwen Caudron (04-08/00 + 04-08/01)Jean-Baptiste Dross (02-03/00 + 01-02/01)Nicolas Dross (11/00 -) Katalin Fejes Tóth (- 09/01)Ingo Janke (- 05/00) Felix Kepert (04-12/01)Tobias Knoch Jan Lubitzki (11/00 -)Alexandra Schulz (- 09/00) Samuel Tran (05-07/01)Sabine Vogel (12/00 -) Malte Wachsmuth (- 07/01)Gero Wedemann (- 02/00) Thomas Weidemann

Technische AssistentenNathalie Brun Norbert MückeGabriele Müller

SekretariatErika Stolte (Teilzeit) (- 10/01)

Das Hauptziel der Arbeit der Abteilung Biophysik der Ma-kromoleküle ist es, die dreidimensionale Organisation desgenetischen Materials und ihre Beziehung zu seiner Funk-tion an Hand einfacher theoretischer und experimentellerModelle zu verstehen. Insbesondere interessieren uns derEinfluss lokaler Strukturänderungen auf die globale Kon-formation größerer DNA-Domänen, die Rolle der Strukturder DNA bei der Regulation der Transkription aus der Di-stanz, sowie die Dynamik des Chromatins im Interphasen-kern. Wir untersuchen als Modell die Struktur von super-helikaler DNA, von Komplexen von DNA mit regulatori-schen Proteinen und von Oligonukleosomen. Dazu bedie-nen wir uns verschiedener biophysikalischer Technikenwie Lichtstreuung, analytischer Ultrazentrifugation, Raster-kraftmikroskopie sowie Fluoreszenz- und Absorptions-spektroskopie. Aussagen der Modelle über den Effekt derDNA-Struktur auf die Transkriptionsregulation aus der Di-stanz werden auch durch in vitro-Transkriptionsexperi-mente quantitativ verifiziert. Die experimentellen Datenwerden mit numerischen Modellen verglichen, die dieStruktur und Dynamik von DNA, Chromatin und ganzenChromosomen quantitativ beschreiben.Ein besonderer Schwerpunkt unserer Arbeit liegt in derEntwicklung und Anwendung von Einzelmolekültechnikenwie Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS). In Ver-bindung mit anderen Fluoreszenztechniken wie Photo-bleaching können damit quantitative Aussagen über dieDynamik fluoreszenzmarkierter Proteine und Nukleinsäu-ren in lebenden Zellen erhalten werden.Die in unserer Abteilung etablierten biophysikalischen Ver-fahren sind auch für andere Gruppen des DKFZ von Inter-esse, die die Struktur größerer Biopolymere in vitro und invivo untersuchen wollen.Allgemeine Informationen über die aktuellen Forschungs-aktivitäten können auf unserer WWW-Seite eingesehenwerden:http://www.dkfz.de/Macromol

Abteilung Biophysik der Makromoleküle (H0500)Leiter: Prof. Dr. Jörg Langowski

369




Kompaktierung und Fernwechselwirkungenin DNADie DNA eines menschlichen Zellkerns hat eine Gesamt-länge von ~2m, befindet sich aber in einem Zellkern vonnur ca. 10µm Durchmesser bzw. ~500µm3 Volumen. Diesentspricht einem Kompaktierungsgrad von ~2x105. Umdas Genom sowohl im Zellkern zu verpacken als auch sei-nen biologischen Funktionen effizient zugänglich zu ma-chen, ist eine komplexe mehrstufige dreidimensionaleKompaktierung: Die DNA Doppelhelix windet sich um einHistonoktamer und bildet die Nukleosomen, welche wie-derum zur Chromatinfiber kondensieren, die zu Schleifengefaltet ist, die Aggregate bilden, aus denen Chromoso-men bestehen, die wiederum spezifisch im Zellkern ange-ordnet sind.

Die räumliche Anordnung der Sequenzen im Genom be-einflusst ihre Funktion z.B. bei der Regulation von Genen‚aus der Entfernung‘, d.h., durch Transkriptionsfaktoren,die an Enhancer-Sequenzen entfernt vom Promotor bin-den. Auch proteininduzierte oder sequenzabhängige per-manente Krümmungen in DNA können die Transkriptionüber mehrere hundert Basenpaare Entfernung steuern.Das zur Zeit favorisierte Modell zur Erklärung solcher Pro-zesse ist die Bildung einer DNA-Schleife zwischen Promo-tor und Enhancer.

Um solche Prozesse quantitativ zu verstehen und zu be-schreiben, müssen Modelle für die physikalische Basisvon Fernwechselwirkungen in DNA entwickelt werden. Ei-ner der Schwerpunkte unserer Forschung ist die Untersu-chung der Struktur und Dynamik superhelikaler DNA alsModellsystem für DNA-Domänen unter topologischemStress und sequenzspezifische intramolekulare Wechsel-wirkungen.

Einfluss gekrümmter Sequenzen aufFernwechselwirkungen in superhelikaler DNAM. Bussiek, K.V. Klenin, J. Langowski

In Zusammenarbeit mit Claus Seidel (MPI für BiophysikalischeChemie, Göttingen)

In diesem Teilprojekt wurden Fernwechselwirkungen insuperhelikalen (sc) DNA-Molekülen mit und ohne ge-krümmte Sequenzen untersucht. Grundlage war der ausvorhergehenden Arbeiten gut belegte Befund, dass ein ge-krümmter Sequenzbereich bevorzugt eine Endschleifen-position in scDNA einnimmt. Daraus sollte eine festgelegtedreidimensionale scDNA-Konformation resultieren, die dieWechselwirkungswahrscheinlichkeit von Orten in der DNAbeeinflussen sollte, die von der Krümmung weit entferntliegen können.

Der Einfluss einer Krümmungssequenz auf Fernwechsel-wirkungen in scDNA wurde durch kinetische Messungender intramolekularen Vernetzung zweier sequenzspezi-fisch biotinylierter Stellen in der DNA über Streptavidinquantitativ charakterisiert. Plasmid-DNAs wurden zweifachso biotinyliert, dass eine Krümmungsequenz (A4-Typ undA5/6-Typ) zwischen beiden Markern lag. Diese wurden miteinem Kontrollplasmid ohne Krümmung verglichen (A1-

Typ). Die Biotinylierungsstellen befanden sich in symmetri-scher oder in verschiedenen asymmetrischen Anordnun-gen relativ zur Krümmung (Tab.1). Die Marker waren 501-609 bp in etwa 2500 bp großen scDNA-Molekülen vonein-ander entfernt.

Bei der Reaktion dieser Moleküle mit Streptavidin entste-hen kompetitiv Komplexe, die entweder intramolekular ver-netzt sind oder an die zwei Streptavidine gebunden sind.Nach Analyse der Produkte per Rasterkraftmikroskopie er-laubt ein kinetisches Modell die Berechnung der lokalenKonzentration jM einer Biotinposition in der Umgebung deranderen und der intramolekularen Reaktionskonstante k2

aus dem Verhältnis vernetzter zu zweifach Strptavidin-markierter Produkte.

Die aus den Vernetzungsraten errechneten Reaktionskon-stanten k2 (Tab. 1) belegen einen Zeitbereich intramoleku-larer Reaktionen in scDNA im Millisekundenbereich, wasverschiedene theoretische Vorhersagen bestätigt. Die er-mittelten jM -Werte wurden mit Computersimulationen vonjM für die untersuchten Plasmide verglichen (Tab. 1). Dasverwendete Computerprogramm sagt einen starken Ein-fluss einer Krümmung auf die Gesamtkonformation vonscDNA voraus. Für scDNA ohne Krümmung stimmten ex-perimentelle und simulierte Befunde nahezu exakt über-ein. Weiterhin sank jM in quantitativer Übereinstimmung mitden Simulationen für zunehmend asymmetrische Positio-nen der Marker in Relation zur A5/6-Krümmung. Allerdingswaren die absoluten jM-Werte in allen scDNAs mit Krüm-mung deutlich geringer als die simulierten Werte. Dies istwahrscheinlich auf eine sterische Behinderung des initialan einer biotinylierten Stelle gebundenen Strept-POD inder Superhelix zurückzuführen. Der Effekt trat in scDNAmit Krümmung, dessen Bewegungsfreiheitsgrade wegender Endschleifenposition der Krümmung reduziert sind,deutlich hervor. Beim Vergleich beider Krümmungstypenkonnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden(Tab. 1).

In Verbindung mit den Simulationen deuten die Befundedarauf hin, dass eine Krümmung die Konformation vonscDNA über große Entfernungen beeinflussen kann. Einsterischer Effekt kann dabei jedoch die Erhöhung der loka-len Konzentration im Hinblick auf die intramolekulare Re-aktivität überlagern. Dies ist ein Hinweis darauf, dass inzellulären Systemen, in denen entfernt voneineinder andie DNA bindende Proteine miteinander wechselwirken,eine bestimmte räumliche Struktur erfüllt sein muss, damiteine Krümmung einen stimulierenden Effekt besitzenkann.

370




Transkriptionsregulation und Schleifenbildungvon NukleinsäurenK. Rippe, A. Schulz, S. V ogel, F. Kepert

Ein Schlüsselschritt bei der Regulation der Transkriptionist die Kontrolle der Initiationsphase. Eine bestimmte Klas-se von Aktivatorproteinen bindet an spezifische DNA-Se-quenzen, die als Enhancer bezeichnet werden, und initiiertdurch Wechselwirkung mit dem Transkriptionskomplex amPromoter die Genexpression. Dabei kann die Distanz zwi-schen Enhancer und Promoter in vivo mehrere tausendBasenpaare betragen. Durch Schleifenbildung der DNA(DNA-Looping) kommt es dann zu einem Kontakt zwi-schen am Enhancer und am Promoter gebundenen Protei-nen, der zur Initiation der Transkription führt. Die Interak-tionswahrscheinlichkeit zwischen zwei Orten, die durchDNA verbunden sind, kann sowohl für freie DNA als auchfür die zu einer Chromatinfiber kondensierte DNA berech-net und mit quantitativen Experimenten verglichen werden[4, 14, 15].

Als einfaches Modellsystem für diesen Prozeß wurde dieAktivierung des E. coli RNA-Polymerase-�54 Holoenzyms(RNAP·�54) durch den Aktivator NtrC untersucht. NtrCbindet vom Promoter entfernt an die DNA und kann durchLooping der DNA mit dem RNAP·�54 Holoenzym am Pro-moter interagieren. Dabei katalysiert NtrC unter ATP-Hy-drolyse das Aufschmelzen der DNA (“open complex”) undstartet so die Transkription. In in vitro Transkriptionsexpe-rimenten wurde im NtrC/RNAP-�54 System der Einflußder DNA-Konformation auf die Rate der Transkriptionsakti-vierung untersucht und mit den theoretischen Vorhersagenverglichen [15]. Die Ergebnisse zeigen, dass die DNA-Konformation die Aktivierungsrate um bis zu zwei Größen-ordnungen verändern kann. Dies entspricht den theoreti-schen Vorhersagen über die Kontaktwahrscheinlichkeit.

In anderen Experimenten wurde die Bindung von NtrC anDNA durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)untersucht [13]. Dies geschah mit dem in der Abteilungentwickelten FCS-System mit zwei-Farben-Detektion [9,10]. Bei der Kreuzkorrelation zwischen zwei Farben(FCCS) werden die Intensitätsfluktuationen zweier unter-schiedlicher Farbstoffe in separaten Detektionskanälengemessen und miteinander korreliert. Dementsprechendzeigen nur Moleküle, die beide Farbstoffe besitzen, einKreuzkorrelationssignal. So konnte untersucht werden, obder Oktamer-Komplex von NtrC-P am Enhancer einenzweiten DNA Duplex bindet [13]. Eine quantitative Analyseder Bindungsaffinität konnte ebenfalls durchgeführt wer-den [13, 19].

Schlißlich wurde in dem mit NtrC verwandten EvgAS/BvgAS System der Assoziationszustand des Enhancer-bindenden Proteins sowie der entsprechenden Histidin-Kinase mittels analytischer Ultazentifugation untersucht.Es zeigte sich, dass die nicht-phosphorylierten EvgA/BvgAAktivator-Proteine als Dimere und die EvgS/BvgS Sensor-domänen als Monomer vorliegen [1, 3, 12].

Struktur und Dynamik von Chromatin in vivo undin vitro

K. Tóth, N. Brun, J. Langowski

Die Struktur des Grundbausteines von Chromatin, desNukleosoms, ist seit einiger Zeit in atomarem Detail be-kannt. In der Chromatinfiber ist die DNA in regelmäßigenAbständen um Histonoktamere gewunden; wie die so ge-bildeten Nukleosomen dreidimensional zu einer überge-ordneten Struktur arrangiert sind, ist jedoch noch nicht ge-klärt. Wir versuchen hier, durch Untersuchungen der DNA-Struktur in der Nähe des Histonkerns Aussagen über sol-che Strukturen zu gewinnen. Dazu werden Nukleosomenauf DNA-Fragmenten von 150-220 bp Länge rekonstitu-iert, die an den Enden mit jeweils einem Donor- und einemAkzeptor-Fluorophor markiert sind. Nach Bindung der DNAan den Histonkern wird durch FRET der mittlere Abstandzwischen den Fluorophoren als Funktion der DNA-Länge,der Salzkonzentration und der Anwesenheit von Linker-Histon H1 bestimmt. Dieser Abstand nimmt mit der Längeder DNA monoton zu, was darauf hindeutet, dass sich dieArme der Linker-DNA im Mononukleosom nicht überkreu-zen. Außerdem scheint die durch H1 induzierte, in EM-Aufnahmen festgestellte sog. ‚Stem-Geometrie’ auch infreier Lösung zu existieren [16].

In Gegenwart von H1 und höheren Salzkonzentrationenbildet die Nukleosomenkette reguläre sog. ‚Chromatin-fiber’-Strukturen. Als einer der strukturbildenden Faktorenwird hier die Neutralisierung der elektrostatischen Absto-ßung zwischen freien DNA-Bereichen durch das Linker-Histon vermutet. Wir finden in unseren FRET-Messungenan Mononukleosomen, dass Histon H1 den Abstand zwi-schen den Linker-DNA-Enden für alle untersuchten DNA-Längen um 5-10 Å verringert. Zunahme der NaCl-Konzen-tration von 5 auf 100 mM vermindert den Abstand nur sehrwenig (< 5Å), wogegen MgCl2-Zugabe von 0-2 mM beiNaCl-Konzentrationen von 5 mM den Abstand monotonum bis zu 10 Å verringert. Diese Salzeffekte zeigen sich inanaloger Weise mit oder ohne Histon H1.

Bei Salzkonzentrationen unterhalb der physiologischenWerte zerfallen rekonstituierte Nukleosomen langsam in

Table 1. Intramolekulare Reaktionskonstanten k2 und lokale Konzentrationen jMPlasmid (pUC18) Ds (bp)(1) k2 (s-1) jM (µM) jM (µM), simuliert für r = 15, 20 nm (2)

A5/6- Typ, symm. 1 192.8 (±11.3) 3.63 (±0.21) 21.6, 9.10A5/6- Typ, asymm. 1 49 174.6 (±3.9) 3.30 (±0.07) 18.0, 8.80A5/6- Typ, asymm. 2 84 115.1 (±11.2) 2.17 (±0.20) 11.7, 7.60A4- Typ, asymm. 81 117.1 (±10.0) 2.20 (±0.18) 9.80, 6.60A1- Typ, ungekr. - 92.3 (±8.9) 1.74 (±0.25) 2.60, 1.40(1) Differenz der Abstände beider Biotine zum Zentrum der Krümmungssequenz.(2) r entspricht dem Reaktionsradius um eine markierte Basenposition, in den die zweite markierte Position eintreten muss, damit eine

Reaktion stattfinden kann. Für die Vernetzungsreaktion ist ein Reaktionsradius im Bereich von 15-20 nm gültig.

371




ihre Einzelkomponenten. Mögliche Ursachen dieses Effek-tes werden über thermische Denaturierungsstudien unter-sucht.

Computersimulationen der Struktur und Dynamiksuperhelikaler DNAK.V. Klenin, J. Langowski, G. W edemann

In Zusammenarbeit mit Giuseppe Chirico, Universität Milano, Itali-en

Für die theoretische Beschreibung der Experimente ansuperhelikaler DNA und Chromatin haben wir Computer-modelle entwickelt, in denen der lange DNA-Faden durcheine Kette steifer Segmente angenähert wird, die durchelastische Biege-, Torsions- und Streckpotentiale zusam-mengehalten werden und durch die Lösung über elektro-statische und hydrodynamische Wechselwirkungen aufein-ander einwirken. Die Kette kann zu einem Ring bzw.Superhelix mit definierter Topologie geschlossen werden.Zusätzlich können in regelmäßigen Abständen Protein-komplexe bestimmter Geometrie angeknüpft werden, zwi-schen denen anziehende oder abstoßende Wechselwir-kungen herrschen und die z.B. dazu dienen können,Nukleosomen zu beschreiben.

Basierend auf dieser geometrischen Beschreibung wirddann mit Hilfe von Monte-Carlo-Verfahren ein Ensembleminimaler freier Energie im thermodynamischen Gleichge-wicht berechnet. Die Dynamik von DNA-Strukturen undder Wechselwirkung zwischen entfernten DNA-Segmentenkann zusätzlich durch Brownsche-Dynamik-Verfahren imZeitbereich von Millisekunden beschrieben werden [6, 7,8].

Modellierung der 30nm-ChromatinfiberG. Wedemann, M. Caudron, J. Langowski

In Zusammenarbeit mit Lisa Pope, Kirsten Groener und JanGreve, Universität Twente, Enschede, Niederlande

In unserem Computermodell der Chromatinfiber wird dieDNA durch eine Kette von zylinderförmigen Segmentendargestellt, auf der die Nukleosomen in regelmäßigenAbständen als flache Zylinder repräsentiert sind. Die Nuk-leosomen wechselwirken miteinander über ein schwachanziehendes Potential; die elektrostatische Wechselwir-kung der DNA-Segmente wird in der Debye-Hückel-Nähe-rung dargestellt. Konfigurationen der Polynukleosomen-kette im thermodynamischen Gleichgewicht werden danndurch einen Metropolis-Monte Carlo-Algorithmus erzeugt.Das Simulationsprogramm wurde in C++ optimiert für par-allele Rechnersysteme entwickelt.

Simulationen von 100 Nukleosomen langen Ketten beiphysiologischer Ionenstärke führen zu Strukturen, die dieexperimentell bekannten Eigenschaften von Chromatin-fibern wie Durchmesser, Massenbelegungsdichte und Nei-gungswinkel der Nukleosomen zur Fiberachse gut repro-duzieren. Besonders bemerkenswert ist, dass die simulier-te Chromatinfiber eine spiralförmige Struktur hat, d.h., deräußere Aspekt ist ähnlich dem Solenoidmodell, wobei aber

anders als bei letzterem keine starke Krümmung der Lin-ker-DNA zwischen Nukleosomen notwendig ist [18].

Erste Simulationen zur Streckung der kondensierten Chro-matinketten zeigen im Vergleich mit experimentellen Daten[Bennink, M. L.et al. (2001). Nat Struct Biol 8(7), 606-10]ein qualitativ ähnliches Verhalten und geben Aufschlussüber eventuelle geometrische Veränderungen der Chro-matinkette bei Streckung. Diese Prozesse spielen einewichtige Rolle bei der Genaktivierung durch Öffnen vonChromatinstrukturen. In Zukunft soll das Modell dahinge-hend erweitert werden, dass das experimentell nachge-wiesene ‚Abrollen’ der DNA vom Nukleosom bei Streckungbeschrieben und sein Einfluss auf die Struktur der gesam-ten Chromatinfiber untersucht werden kann.

Sequentielle und dreidimensionaleGenomorganisationT.A. Knoch, W. W aldeck, J. Langowski

In Zusammenarbeit mit Felix Bestvater und Eberhard Spiess(DKFZ), sowie M. Göcker (Uni Tübingen) und R. Lohner (UniKarlsruhe)

Trotz der grossen Erfolge von Sequenzierprojekten ist bisdato die räumliche Organisation des humanen Genomsweitgehend im Dunkeln geblieben. Für die Faltung derChromatinfiber im Interphasechromosom wurden verschie-dene Hypothesen vorgeschlagen: Im Random-Walk/Giant-Loop (RW/GL) Modell sind ~3-5Mbp grosse Chromatin-schleifen durch ein Proteinrückgrat verbunden, im von unsvorgeschlagenen Multi-Loop-Subcompartment (MLS) Mo-dell bilden kleine Chromatinschleifen Rosetten, die durchAbschnitte freien Chromatins verbunden sind. Im soge-nannten Inter-Chromosomal Domain (ICD) Modell wirdzwischen den Chromosomenterritorien ein kanalartigesNetzwerk postuliert.

Um zwischen diesen Modellen zu unterscheiden und mitExperimenten zu vergleichen, wurden einzelne Chromoso-men und ganze Zellkerne mit 46 Chromosomen mit MonteCarlo und Brownschen-Dynamik-Methoden simuliert. DieChromatinfaser wurde hierzu durch eine Polymerkette auszylindrischen Segmenten angenährt, die einem Streck-und Biegepotential, sowie einer Volumenausschlusswech-selwirkung unterliegen. Ausgehend von einer Startkonfigu-ration, die einem Metaphasechromosom entsprach, wur-den Interphasekonfiguration um das thermische Gleichge-wicht erzeugt. Das MLS und das RW/GL Modell bildetenbeide Chromosomenterritorien, jedoch mit unterschiedli-cher Morphologie: Die Rosetten des MLS Modells führtenzu Subkompartimenten, die der lichtmikroskopisch mess-baren Kernmorphologie entsprechen. Im Gegensatz hierzuführt das RW/GL Modell zu einer sehr diffusen Chromatin-verteilung [11]. In Übereinstimmung mit jüngsten Experi-menten beobachten wir, dass die Position der Chromoso-menterritorien in der Interphase von der Anordnung derChromosomen in der Metaphase abhängt.

Die Struktur der simulierten Chromatinfiber skaliert unter-schiedlich in Abhängigkeit von der Längenskala. Diesesmulti-skalierende Verhalten kann man der Fasertopologiezuordnen: im MLS Modell ist z.B. eine Feinstruktur sicht-

372




bar, die sich auf die Schleifen der Rosetten zurückführenlässt. Ein ähnliches multi-skalierendes Verhalten mit einerFeinstruktur lässt sich auch in der sequentiellen Organisa-tion des humanen Genoms wiederfinden (s. u.). Dies deu-tet auf eine enge Verknüpfung zwischen sequentieller unddreidimensionaler Organisation von Genomen hin. Selbstkleine Änderungen in den Modellparametern lassen sich insimulierten elektronenmikroskopischen (EM) oder konfo-kalen Laser-Scanning mikroskopischen (CLSM) Bildernnachvollziehen. Diese Modellierungen sollen es in Zukunftermöglichen, im Vergleich mit experimentellen Modellsys-temen für die Transformation von Zellkulturen in Tumorzel-len, auf Kernmorphologie basierende Krebsdiagnostik mitveränderter Chromatinorganisation auf molekularer Ebenein Beziehung zu setzen.

Um den Einfluss der dreidimensionalen Chromatinvertei-lung auf die Mobilität von Molekülen, die Zugänglichkeitvon Kernregionen und die Hypothesen des ICD Modells zuuntersuchen, wurde die Diffusion von Kugeln mit Brown-scher Dynamik in computergenerierten Zellkernen simu-liert. Eine reine morphologische Betrachtung zeigte durchdas Auftreten grosser Zwischenräume, dass die meistenOrte im Zellkern frei zugänglich sein müssten. Ein kanal-artiges Netzwerk zwischen den Chromosomenterritorienwar nicht vorhanden. Abschätzungen des Chromatinvo-lumenanteils im Kern ergaben Werte <30%, d. h. dass>70% des Kernvolumens zur Diffusion zur Verfügung ste-hen. Der mittlere Abstand zwischen den Chromatinfasernbeträgt 29-82nm für Kerne mit Durchmessern von 6-12µm.Dies stimmt mit der simulierten mittleren Verrückung eines10nm grossen Teilchens von 1-2µm in 10ms überein. Diesbedeutet, dass die Diffusion von biologisch relevanten Mo-lekülen nur schwach behindert wird. Der charakterisieren-de Anomalieparameter lag zwischen 2.0 und 4.0 in Über-einstimmung mit den Experimenten [17]. Die Behinderungwar proportional zur Kerndichte, dem Faserdurchmesser,der Wechselwirkung der Kugeln mit der Faser und demKugeldurchmesser. Folglich können kleine Moleküle oderProteine jeden Ort im Zellkern mit energieunabhängigerDiffusion und ohne spezielles kanalartiges Netzwerk errei-chen.

Bisherige Markierung des Chromatins sind entweder, wieFISH, nicht in vivo möglich oder führen durch toxische Re-aktionen zu Präparationsartefakten und dem Tod der Zel-len. Mit der Entwicklung von Fusionsproteinen zwischenallen Histonen H1.0, H2A, mH2A1.2, H2B, H3, H4 undfluoreszenten Proteinen CFP, GFP, YFP, DsRed1, DsRed2und Expression in HeLa, LCLC103H, Cos7 and ID13 ge-lang es, die Chromatinverteilung und Chromatindynamik invivo zu visualisieren. Prozesse in Abhängigkeit des Zell-zyklus, nach Applikation von Chemikalien oder Strahlungkönnen nun ebenfalls artefaktfrei in vivo untersucht wer-den. Die gefundene Chromatinverteilung entspricht quali-tativ der Verteilung, wie sie bei der Simulation ganzer Ker-ne mit dem MLS Modell auftritt. Fraktale Analysen sind be-sonders geeignet, um diese Chromatinverteilung des Zell-kerns zu quantifizieren. Erste fraktale Analysen der Chro-matinverteilung in vivo ergaben signifikante Unterschiedefür verschiedene Morphologien und favorisieren ebenfalls

ein dem MLS-Modell ähnliche Chromatinverteilung. Fürdie quantitative Beschreibung der Chromatindynamik wur-den Zeitserien der Kondensation des Chromatins währendder Zellteilungen und induzierten Apoptose mit konfokalerLaser-Scanning-Mikroskopie untersucht. Die Markierungeignet sich darüberhinaus für zahlreiche weitere Anwen-dungen, wie zum Beispiel für Kolokalisationsexperimentevon Proteinen und anderen Substanzen, oder zur Zu-standsüberwachung einer Zellkultur auf Basis einer mor-phologischen Begutachtung der Zellkernstruktur.

Die Technik führte auch zur Entdeckung von DNA-Kon-struktveränderungen bei simultanen Kotransfektionen, einweit verbreitetes Vorgehen bei in-vivo-Vielfarbenmarkie-rungen mit fluoreszenten Proteinen verschiedener spektra-ler Signatur [2]. Die Kotransfektionen führen zu falsch po-sitiven Ergebnissen aufgrund der spektralen Veränderung,die in Standardtransfektionen in ~8%, in Abhängigkeit derDNA Präparation jedoch in bis zu 26% der Zellen zu ver-änderten Fusionsproteinen führen. Diese Veränderungensind unabhängig von der Transfektionsmethode oder demZelltyp. Die Konstruktkonversionen beruhen auf homolo-ger Rekombination/Reparatur/Replikations (RRR) Prozes-sen zwischen den Sequenzen der beteiligten fluoreszen-ten Proteine. Die Konversionen können durch sequenziel-le Transfektion oder geringe Sequenzhomologie der Vek-toren verhindert werden. Die gefundene Konversion er-laubt auch den einfachen Austausch der spektralen Eigen-schaften von Fusionsproteinen, die Möglichkeit zur DNA-Bibliothekserstellung, und zur DNA-Konstrukterstellung invivo.

Fluoreszenzfluktuationsmikroskopie (FFM)M. Wachsmuth, T. Weidemann, J. Langowski

Ein konfokaler Fluoreszenzaufbau beruht auf der geeigne-ten Einkopplung eines Lasers in ein Mikroskop, die zur Be-leuchtung eines mikroskopischen Beobachtungsvolumensvon ca. 0.1 fl in der Fokalebene des Objektivs führt, sowieeiner konfokalen Detektionseinheit, die nur Licht aus die-sem Beobachtungsvolumen erfasst. Aufgrund der hohenSensitivität und guten räumlichen Auflösung sind konfoka-le Aufbauten für Untersuchungen in lebenden Zellen be-sonders geeignet. Verschiedene Methoden können damitangwandt werden:

In der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wer-den die Konzentrationsfluktuationen frei beweglicher Mole-küle im Beobachtungsvolumen ausgenutzt, um die Kon-zentrationen (typischerweise 1 nM) und Diffusionskoeffi-zienten verschiedener Spezies mit Hilfe einer Autokorrela-tionsanalyse des Fluoreszenzsignals zu bestimmen. In ei-nem Zwei-Farben-Aufbau kann die Bindung unterschied-lich markierter Moleküle aus der Kreuzkorrelation der Fluo-reszenzsignale erhalten werden.

Das Prinzip der konfokalen Laserscanningmikroskopie(CLSM) ist folgendes: Bewegt man das Beobachtungs-volumen systematisch durch eine Probe, z.B. eine Zellemit fluoreszenzmarkierten Strukturen, und nimmt das Si-gnal synchronisiert auf, so kann die räumliche Verteilung

373




der Fluoreszenz mit hoher räumlicher Auflösung digital re-konstruiert werden.

Binden fluoreszenzmarkierte biologisch aktive Molekületransient an immobile Strukturen, so kommt es zu einemGleichgewicht von Assoziation, Dissoziation und Diffusion.Kontinuierliche Anregung und Photodestruktion der Fluo-reszenz an einem Ort (continuous photobleaching, CP) er-laubt eine quantitative Bestimmung des gebundenen An-teils und der Dissoziationsrate (M. Wachsmuth et al., inVorbereitung).

Ein bestehendes, in unserer Arbeitsgruppe entwickeltesZwei-Farben-FCS-Modul, das an den Videoaausgang ei-nes inversen Mikroskops angeschlossen werden kann [M.Tewes und J. Langowski (1996), Deutsche Patentanmel-dung 196 49 605.5; [9]], Determination of DNA-ligandinteractions by fluorescence correlation spectroscopy. In:Protein-DNA Interactions: A Practical Approach, OxfordUniversity Press, Oxford], wurde um eine Scanningeinheiterweitert, die eine genaue Positionierung (ca. 25 nm) desBeobachtungsvolumens in der Probe erlaubt [M. Wachs-muth und J. Langowski (2001), Deutsche Patentanmel-dung; M. Wachsmuth (2001), Dissertation]. Der Vorteil die-ses Fluoreszenzfluktuationsmikroskops (FFM) gegenüberkommerziellen Geräten ist die Modularität und Flexibilitätbei hoher mechanischer und optischer Stabilität. Die obengenannten Methoden wurden für intrazelluläre Mobilitäts-messungen weiterentwickelt und angepasst und könnenmit dem FFM durchgeführt werden. Neben in vitro-Experi-menten zur Tripelhelixbildung von Oligonukleotiden, derBindung von NtrC an seine Erkennungssequenz und derMultimerisierung von Vimentin sind zahlreiche in vivo-Ex-perimente zur molekularen Beweglichkeit durchgeführtworden, s.u.

Die Beweglichkeit fluoreszierender Moleküle inlebenden ZellkernenM. Wachsmuth, T. Weidemann, T.A. Knoch, W.W aldeck, J. Langowski

In Zusammenarbeit mit Ingrid Grummt (DKFZ) und PernetteVerschure (Freie Universität Amsterdam, Niederlande)

Zahlreiche Prozesse, die während der Interphase in euka-ryontischen Zellkernen stattfinden wie Transkription, Repli-kation, Reparatur oder Spleißen, erfordern und bewirkeneinen effizienten Transport von Molekülen verschiedensterGröße innerhalb des Kerns. Dessen dreidimensionaleStruktur weist einen signifikanten Einfluss auf die moleku-lare Beweglichkeit auf und besitzt möglicherweise regu-latorische Funktionen. Ziel unserer Experimente ist es,den Zusammenhang zwischen Struktur und Mobilität zuquantifizieren.

Mit FCS wurde die Diffusion von EGFP (enhanced greenfluorescent protein) und einem EGFP-�-gal-Fusionsproteinin COS-7- und AT-1-Zellen mit einer räumlichen Auflösungvon ca. 300 nm beobachtet: Überall in der Zelle ist die Vis-kosität etwa 5 mal höher als in wässriger Lösung. Insbe-sondere im Zellkern kommt es zu einer Abweichung vonfreier Diffusion, die entweder als weitere, 10- bis 100fachlangsamer diffundierende Komponente oder mit anomaler

Diffusion erklärt werden kann. Letztere tritt insbesonderein Gegenwart statistisch verteilter Hindernisse wie Chro-matin als Polymer auf und erscheint als die geeignetereInterpretation [17]. Fluoreszenzmarkierte Dextranmolekü-le, die in HeLa-Kerne mikroinjiziert wurden, zeigen quali-titativ ebenfalls anomale Diffusion, jedoch ist der Grad derBehinderung größer als für ähnlich große Proteine. Un-spezifische Wechselwirkungen der Dextrane mit zellulärenStrukturen können dies erklären, da dadurch der Anoma-lieeffekt der Diffusion verstärkt wird. Erste Experimente mitHeLa-Zellen, die gleichzeitig das rot fluoreszierende Pro-tein DsRed und ein Histon-EYFP-Fusionsprotein expri-mieren, erlauben die Vermutung, dass die Abweichungvon freier Diffusion mit der Chromatindichte korreliert ist.

Die Beweglichkeit des ribosomalen bzw. nukleolaren Tran-skriptionsterminationsfaktors TTF-I wurde als Modellsys-tem für ein biologisch aktives Protein mit einem entspre-chenden EGFP-Konstrukt in HeLa-Zellen untersucht. Da-bei zeigte sich neben der erwarteten nukleolaren Lokali-sierung, dass dort mehr als 90 % der Proteine im Gleich-gewicht gebunden sind und an ihrer Bindungsstelle für ca.13 sec verharren. Anschließend scheinen sich die Molekü-le diffusiv im Kern zu bewegen, bis sie wieder gebundenwerden.

Quantitative Untersuchung der Verteilung,Mobilität und Bindung fluoreszenzmarkierterHistone in vitro und in vivo mitFluoreszenzfluktuationsmikroskopieT. Weidemann, M. W achsmuth, T .A. Knoch,G. Müller, W. W aldeck, J. Langowski

Das Nukleosom bildet die erste Kompaktierungsstufeeukaryontischer Genome, auf der alle höheren Strukturenaufbauen und spielt für zahlreiche molekulare Prozessean der DNA eine zentrale Rolle. Die räumliche Verteilungder Nukleosomen im Zellkern sowie der Bindungszustandund die Mobilität der Histone wurden in der lebenden Zelleuntersucht. Die Beobachtung der Histone erfolgte überFluoreszenz: Es wurde eine Zellinie etabliert, die konstitu-tiv das Fusionsprotein H2B-EYFP (H2B-enhanced yellowfluorescence protein) exprimiert (Klon H2B-Y). Lichtmikro-skopisch sind diese Zellen von normalen HeLa-Zellennicht unterscheidbar, zeigen jedoch bei Fluoreszenzan-regung intensiv leuchtende Kerne. Die Histone werdensehr effektiv in den Zellkern transportiert und in funktiona-les Chromatin integriert.

Zur Analyse der Verteilung und Mobilität der fluoreszieren-den Proteine in der Zelle wurde eine Kombination vonFluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), konfokalerLaser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und kontinuierlichemBleichen der Fluoreszenz (CP) im gleichen optischen Auf-bau, dem Fluoreszenzfluktuationsmikroskop (FFM), ange-wendet. Mit Hilfe konfokaler Bildnahme und zugehörigerSoftware kann der Laserfokus vom Anwender mit hoherPräzision in der Zelle positioniert werden. Über FCS-Mes-sungen im Cytoplasma konnte die molekulare Fluores-zenzausbeute einzelner Fluorophore bestimmt und die imkonfokalen Bild aufgezeichneten Intensitäten in absolute

374




Konzentrationen von Fluorophoren umgerechnet werden.Die Mobilität der abgebildeten Moleküle wurde in einemweiteren Schritt mit CP untersucht: Bleicht und detektiertman gleichzeitig die Fluoreszenz an einer Position, so las-sen sich die immobilisierten und frei beweglichen Fluores-zenzanteile quantitativ bestimmen.

Die Einbaurate der Histonkonstrukte in die Chromatinfiberwurde in vitro bestimmt. Nukleosomenketten unterschiedli-cher Länge wurden aus den fluoreszierenden Kernen bio-chemisch isoliert. Eine Quantifizierung der Fragmentlän-gen der nukleosomalen DNA ergab eine signifikant vergrö-ßerte Wiederholungslänge der Nukleosomen auf dergenomischen DNA (203 ± 4 Bp) verglichen mit nicht-fluo-reszierenden HeLa-Zellen (185 ± 10 Bp). Per Western-Blot wurde das Histonkonstrukt identifiziert und auf Poly-acrylamidgelen über Proteinfärbung dargestellt. Die fluo-reszierenden Nukleosomenketten wurden in freier Lösungmit Ein-Farben-FCS untersucht. Messungen an Mono- bisHeptameren ergaben in Übereinstimmung mit Protein-mengen auf Gelen, daß 5% der in die Nukleosomen derZelle integrierten H2B-Domänen mit einem fluoreszieren-den EYFP fusioniert sind. Dies bedeutet, daß an der Chro-matinfiber etwa jedes zehnte Nukleosom eine EYFP-Do-mäne trägt.

Die synthetisierten Histonkonstrukte diffundieren in Kon-zentrationen von etwa 200 nM frei im Cytoplasma. Die be-obachteten Teilchen zeigten in 80% der Zellen eine ein-heitliche molekulare Helligkeit unabhängig von ihrer Kon-zentration, d.h. es wurden einzelne H2B-EYFP-Molekülebeobachtet. Die fluoreszierenden Histone diffundierenwahrscheinlich im Komplex mit endogenen Proteinen,Histonen und/oder Histonchaperonen wie z.B. NAP-1. Je-doch war in 20% der Zellen die molekulare Helligkeit aufetwa das zweifache erhöht bei einer gleichzeitig halbiertenKonzentration, was auf eine Multimerisierung der fluores-zierenden Histonkonstrukte in bestimmten Phasen des

Zellzyklus hinweist. Durch aktive Transportmechanismenwerden die Histone in den Zellkern transportiert. CP-Mes-sungen ergaben im Nukleoplasma eine zehnfach erhöhteKonzerntration an frei diffundierendem H2B-EYFP (~2µMin Klon H2B-Y). Die Nukleoli erscheinen in den Fluores-zenzbildern dunkel, was auf geringe Nukleosomenkonzen-trationen hinweist. CP ergab, daß auch das Reservoir anfreien Histonen in den Nukleoli, im Vergleich mit chromo-somalen Regionen des gleichen Kerns, um etwa 20% re-duziert ist. Dies könnte mit einem hohen Ausschlußvolu-men dieser dichten Struktur in Zusammenhang stehen.

Quantitativ ausgewertete Fluoreszenz-bilder von HeLa-Kernen in der Interphase ergeben mittlere Nukleosomen-konzentrationen zwischen 110 und 140 µM. Die Konzen-trationswerte der Nukleosomen variieren zwischen 50 und200 µM auf Längenskalen von einigen µm. Trägt man dieabgebildeten Nukleosomenkonzentrationen in Histogram-men auf, so findet man die Werte gleichmäßig um einenMittelwert verteilt. In keinem der Kerne wurden je zwei se-parate Maxima einer höheren oder niedrigeren Dichte ge-messen, die direkt mit Hetero- oder Euchromatin assoziiertwerden könnten, jedoch ist die Form der Histogramme fürdie meisten Kerne leicht zu niedrigen Konzentra-tionswerten verkippt. Dies könnte mit zwei unterschiedli-chen Kondensationszuständen der Chromatinfiber in derInterphase korrespondieren. Chromosomen in der Ana-phase zeigten eine dreifach höhere Konzentration alsChromatin in der Interphase mit einem Mittelwert von etwa300 µM und Maximalwerten bis zu 450 µM.

Selektive Strukturänderungen in Bacteriophagendurch PorphyrinderivateK. Tóth

In Zusammenarbeit mit Gabriella Csík und Marianna Egyeki,Semmelweis-Universität, Budapest, Ungarn

Porphyrinderivate finden weite Anwendung in der photo-dynamischen Behandlung von Krebs und anderen Krank-heiten, sowie bei der Desinfektion von Flüssigkeiten, aller-dings sind weder der molekulare Wirkungsmechanismusnoch die Zielmoleküle gut genug bekannt. Wir haben denBakteriophagen T7 als Modellszstem verwendet, um diedurch verschiedene Porphyrinderivate ausgelösten Struk-turänderungen an einem Nukleoproteinkomplex bei derPhotoreaktion und im Dunkeln zu untersuchen. Die Bin-dung der Porphyrine an T7 und DNA wurde durch Absorp-tions- und Fluoreszenzspektroskopie (konventionell sowiezeitlich aufgelöst) verfolgt. Strukturänderungen im Nukleo-proteinkomplex wurden durch thermische Denaturierung,DNA-Läsionen durch PCR charakterisiert. Die optischenSignale symmetrisch substituierter Tetraphenylporphyrinezeigten in Gegenwart von T7 oder DNA keine Änderung.Asymmetrisch substituierte Moleküle binden im Dunkelnan T7, aber nicht an freie DNA, wie die Fluoreszenzmes-sungen zeigen. Für die kationischen Derivate sind diespektralen Veränderungen in Gegenwart von T7 oder DNAähnlich. Die Photoreaktion der drei untersuchten Meso-Tetraphenylporphyrine zeigt sich durch Schädigung desviralen Kapsids, ohne nachweisbare Veränderungen der

375




DNA-Struktur. Andererseits destabilisieren die kationi-schen Porphyrine die DNA-Helix. Die Veränderungen inden verschiedenen Denaturierungsparametern korrelierengut mit den Ergebnissen der PCR-Analyse und der Pha-geninaktivierungsrate. Die Dunkelreaktion mit neutralenPhenylporphyrinen hat keinen Effekt auf die thermischeStabilität der Phagen, und zeigt keine nachweisbarenDNA-Läsionen in der PCR-Analyse. Tetramethyl-4-pyridyl-porphyrin führt schon im Dunkeln zu Destabilisierung derDNA [5].

Flexibilität von IntermediärfilamentenN. Mücke, R. Kirmse, J. Langowski

In Zusammenarbeit mit Tatjana Wedig und Harald Herrmann(DKFZ)

Intermediärfilamente sind die Hauptkomponenten desZytoskeletts von Metazoen. Im besonderen scheinen siefür die mechanische Stabilität der Zellen verantwortlich zusein. Aus diesem Grund haben wir Intermediärfilamentemittels Rasterkraftmikroskopie untersucht, um neue Infor-mationen über ihre Struktur und die mechanischen Eigen-schaften zu erhalten. Hierfür wurden Filamente aus re-kombinantem humanen Vimentin in vitro gebildet, unddann auf Glimmer gebracht und in Luft sowie in Flüssigkeitvermessen. Für eine standard-elektronenmikroskopischeDarstellung werden Filamente mit Glutaraldehyd fixiertund mit Uranylacetat kontrastiert. Solchermaßen drasti-sche Behandlung kann in der Rasterkraftmikroskopiedurch Messungen in Flüssigkeit vermieden werden, d.h.die Filamente können direkt in physiologischem Puffer ver-messen werden. Nur wenn man die Präparate in Luft ana-lysiert, muß noch fixiert werden, um ein Auflösen derFilamente beim Entfernen des Salzes zu verhindern.

In einer ersten Serie von Experimenten wurden die Kontu-ren der Filamente vermessen und die Persistenzlängenmit Hilfe des mittleren quadratischen End-zu-End-Abstan-des bestimmt. Die Persistenzlänge der Filamente beträgtca. 1µm.

Form und Komplexbildung löslicher Vorstufenvon IntermediärfilamentenN. Mücke, J. Langowski

In Zusammenarbeit mit Tatjana Wedig und Harald Herrmann(DKFZ) sowie Peter M. Steinert und Uli Aebi (Biozentrum Basel,Schweiz)

Intermediärfilamente sind in salzhaltigen Puffern unlöslich.Werden sie aber aus einem denaturierenden Puffer, z.B.8M Harnstoff, in einen niedrig-ionischen Puffer dialysiert,bleiben sie in gelöstem Zustand. Es wurden verschiedeneIntermediärfilamentproteine mittels analytische Ultrazentri-fugation untersucht und ihr Multimerisierungszustand be-stimmt. Aus den Molekulargewichten der Komplexe undderen s-Wert konnte dann die Form abgeschätzt werden.Diese stimmt mit elektronenmikroskopischen Daten über-ein. Auch ein zusätzlicher Vergleich mit chemischen Ver-netzungsdaten ergab das z.B. Vimentin in einem niedrig-ionischen Puffer mit pH 8.4 ein reines Tetramer bildet. MitHilfe dieser Methodik ist es nun möglich die Grundbau-

steine zu charakterisieren, aus denen die Filamente beste-hen. Dieses ist ein wichtiger Schritt für das Verständnisder Filamentbildung und der Eigenschaften dieser Grund-bausreine der Cytoplasmas.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] *Bantscheff, M., *Perraud, A. L., *Bock, A., Rippe, K., *Weiss,V., *Glocker, M. & *Gross, R. (2000). Structure-functionrelationships in the Bvg and Evg two-component phosphorelaysystems. Int. J. Med. Microbiol. 290(4-5), 317-23.[2] Bestvater, F., Knoch, T. A., Langowski, J. & Spiess, E. (2002).Construct conversions caused by simultaneous co-transfection:„GFP- walking“. Biotechniques 32(4), 844, 846, 848-50 passim.[3] *Bock, A., *Bantscheff, M., *Perraud, A. L., Rippe, K., *Weiss,V., *Glocker, M. O. & *Gross, R. (2001). Rational design andmolecular characterization of a chimaeric response regulatorprotein. Journal of Molecular Biology 310(2), 283-290.[4] *Dekker, J., Rippe, K., *Dekker, M. & *Kleckner, N. (2002).Capturing chromosome conformation. Science 295(5558), 1306-11.[5] *Gabor, F., *Szolnoki, J., Toth, K., *Fekete, A., *Maillard, P. &Csik, G. (2001). Photoinduced inactivation of T7 phage sensitizedby symmetrically and asymmetrically substituted tetraphenylporphyrin: comparison of efficiency and mechanism of action.Photochem Photobiol 73(3), 304-11.[6] Klenin, K. V. & Langowski, J. (2001a). Diffusion-ControlledIntrachain Reactions of Supercoiled DNA: Brownian DynamicsSimulations. Biophys. J. 80(1), 69-74.[7] Klenin, K. V. & Langowski, J. (2001b). Intrachain Reactions ofSupercoiled DNA Simulated by Brownian Dynamics. Biophys. J.81(4), 1924-1929.[8] Klenin, K. V. & Langowski, J. (2001c). Kinetics of intrachainreactions of supercoiled DNA: Theory and numerical modeling.Journal of Chemical Physics 114(11), 5049-5060.[9] Langowski, J. & Tewes, M. (2000). Determination of DNA-ligand interactions by fluorescence correlation spectroscopy. InProtein-DNA Interactions: A Practical Approach (Travers, A. &Buckle, M., eds.), pp. 95-111. Oxford University Press, Oxford.[10] Langowski, J., Wachsmuth, M., Rippe, K. & Tewes, M.(2000). Biomolecular shape and interactions determined byfluorescence correlation spectroscopy. In Energies et forces del’interaction entre macromolécules biologiques: l’aspect quantitatif(Frénoy, J.-P., ed.), Vol. 2, pp. 65-77. Publications CNRS, Paris.[11] Münkel, C., Eils, R., Zink, D., Dietzel, S., Cremer, T. &Langowski, J. (1999). Compartmentalization of interphasechromosomes observed in simulation and experiment. Journal ofMolecular Biology 285(3), 1053-1065.[12] Perraud, A. L., Rippe, K., Bantscheff, M., Glocker, M.,Lucassen, M., Jung, K., Sebald, W., Weiss, V. & Gross, R. (2000).Dimerization of signalling modules of the EvgAS and BvgASphosphorelay systems. Biochimica et Biophysica Acta 1478(2),341-354.[13] Rippe, K. (2000). Simultaneous binding of two DNA duplexesto the NtrC-enhancer complex studied by two-color fluorescencecross-correlation spectroscopy. Biochemistry 39(9), 2131-2139.[14] Rippe, K. (2001). Making contacts on a nucleic acid polymer.Trends in Biochemical Sciences 26(12), 733-740.[15] Schulz, A., Langowski, J. & Rippe, K. (2000). The effect ofthe DNA conformation on the rate of NtrC activated transcriptionof E. coli RNA Polymerase �54 holoenzyme. Journal of MolecularBiology 300(4), 709-725.[16] Tóth, K., Brun, N. & Langowski, J. (2001). Trajectory ofnucleosomal linker DNA studied by fluorescence resonanceenergy transfer. Biochemistry 40(23), 6921-6928.

376




[17] Wachsmuth, M., Waldeck, W. & Langowski, J. (2000).Anomalous diffusion of fluorescent probes inside living cell nucleiinvestigated by spatially-resolved fluorescence correlationspectroscopy. J. Mol. Biol. 298(4), 677-689.[18] Wedemann, G. & Langowski, J. (2002). Computer simulationof the 30-nanometer chromatin fiber. Biophys J 82(6), 2847-59.[19] Weidemann, T., Wachsmuth, M., Tewes, M., Rippe, K. &Langowski, J. (2002). Analysis of Ligand Binding by Two-ColourFluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Single Molecules3(1), 49-61.[20] K. Klenin, M. Hammermann, J. Langowski: Modellingdynamic light scattering of superhelical DNA. (2000)Macromolecules 33, 1459-1466.[21] M. Hammermann, N. Brun, K.V. Klenin, R. May*, K. Tóth, J.Langowski: The diameter of the DNA superhelix decreases withsalt oncentration: SANS measurements and Monte Carlosimulations. (2000) J. Appl. Cryst. 33, 526-529.[22] F. Lankas, J. Sponer*, P. Hobza*, J. Langowski: Sequence-dependent elastic properties of DNA. (2000) J. Mol. Biol. 299,697-712.[23] M. Hammermann, K. Tóth, C. Rodemer, W. Waldeck, R.May*, J. Langowski: Salt-dependent compaction of di-andtrinucleosomes studied by small angle neutron scattering. (2000)Biophys. J. 79, 584-594.[24] K. Klenin, J. Langowski: Computation of writhe in superhelicalDNA. (2000) Biopolymers 54, 307-317.[25] I. Hofmann, N. Mücke, J. Reed, H. Herrmann, J. Langowski:Physical characterization of Plakophilin 1 reconstituted with andwithout Zinc. (2000) Eur. Biophys. J. 267, 4381-4389.[26] J. Langowski, C. Mehring, M. Hammermann, K. Klenin, C.Münkel, K. Tóth, G. Wedemann: The genome as a flexible poly-mer chain: recent results from simulations and experiments. In:Genomics and Proteomics – functional and computationalaspects, ed. S. Suhai; (2000) Plenum Press, New York, 121-131.[27] H. Bornfleth*, C. Cremer*, T. Cremer*, S. Dietzel*, P. Edel-mann*, R. Eils*, W. Jäger*, D. Kienle*, G. Kreth*, P. Lichter, G.Little, C. Münkel, J. Langowski, I. Solovei*, E. H. K. Stelzer*, D.Zink*: Analysis of chromosome territory architecture in the humancell nucleus. Overview of data from a collaborative study. In:Genomics and Proteomics – functional and computationalaspects, ed. S. Suhai; (2000) Plenum Press, New York, 133-140.[28] G. Chirico*, M. Collini*, K. Tóth, N. Brun, J. Langowski:Rotational dynamics of DNA fragments studied by fluorescencepolarization anisotropy. (2001) Eur. Biophys. J. 29(8), 597-606.[29] K. Tóth, N. Brun, J. Langowski: Trajectory of nucleosomal lin-ker DNA studied by fluorescence resonance energy transfer.(2001) Biochemistry 40, 6921-6928.[30] G. Westphal, S. van den Berg-Stein, K. Braun, T.A. Knoch,M. Dümmerling, J. Langowski, J. Debus, E. Friedrich: Detection ofthe NGF receptors TrkaA and p75NTR and effect of NGF on thegrowth characteristics of human tumor cell lines. (2002) J. Exp.Clin. Cancer Res., in press.[31] G. Westphal, E. Niederberger, C. Blum, Y. Wollman, T.A.Knoch, M. Dümmerling, W. Rebel, J. Langowski, J. Debus, E.Friedrich: Erythropoietin receptor in human tumor cells: Expressi-on and aspects regarding functionality. (2002) Tumori, in press.[32] K. Braun, P. Peschke, R. Pipkorn, S. Lampel, M. Wachsmuth,W. Waldeck, E. Friedrich*, J. Debus: A biological transporter forthe delivery of peptide nucleic acids (PNAs) to the nuclearcompartment of living cells. (2002) J. Mol. Biol., in press.[33] F. Lankas, T. E. Cheatham III*, N. Spackova*, P. Hobza*, J.Langowski, J. Sponar*: Critical effect of the N2 amino group onstructure, dynamics and elasticity of DNA polypurine tracts. (2002)Biophys. J. 82, 2592-2609.

377


AbteilungH0600Molekulare Genomanalyse


Molekulare Genomanalyse (H0600)Leiterin: Prof. Dr. Annemarie Poustka

Wissenschaftliche MitarbeiterDr. Regina Albert (08/01-) Dr. Dorit Arlt (10/01-)Dr. Detlev Bannasch Dr. Stephanie Bechtel (09/01-)Dr. Lee Bergman (01/02-) Dr. Kim BeyerDr. Frank Breitling Dr. Johannes Coy (-07/01)Dr. Birgit Guilleaume (09/01-) Dr. Petra HeidrichDr. Nina Heiss (-09/00) Dr. Patrick Herde (07/01-)Dr. Wolfgang Huber Dr. Sabine KlauckDr. Heike Koepf Dr. Thorsten Kohl (09/01-)Dr. Anja Kolb Dr. Ulrike Korf (04/01-)Dr. Inge Krebs Dr. Vladimir Kuryshev (08/01-)Dr. Alexander Mehrle (08/01-) Dr. Jan MollenhauerKarl-Heinz Nolte (09/01-) Effi ReesHeiko Rosenfelder (09/01-) Dr. Anke SchrothDr. Ingo Schupp (09/01-) Dr. Volker Stadler (07/01-)Dr. Holger Sültmann Dr. Markus Vogt (09/01-)Dr. Ruth Wellenreuther Dr. Stefan WiemannDr. Dorothea Zink

GastwissenschaftlerDr. Frank Bergmann (Göttingen) (06/00-12/01)

DoktorandenKatharina Finis Florian HallerCeline Hoff (-10/00) Gaby KollenderStefan Lyer Meher MajetyMamatha Sabbela Rüdiger SalowskyJörg Schneider Markus SeilerKlaus Steiner Ben Waldau (-07/00)Rainer Will Friederike Wilmer (-12/00)Rainer Wittig

Technisches PersonalEsther Backes Hanna Bausbacher (11/01-)Sara Burmester Nina Claudino (07/01-)Tanja Detzel (-09/01) Angelika DudaSabine Epp Ute ErnstKerstin Feßler Carmen Götz (-06/00)Daniela Heiss Kerstin Hettler (07/01-)Gabriele Hoock Yvonne Keßler (08/01-)Michaela Klein Tatjana Kraus (10/00-03/02)Thorsten Kühlwein Ewald MünstermannRita Schatten Liane SchmittEdda Schoepe (-07/00) Markus SchusterMarkus Stauch Stefanie Süß (08/00-03/02)Regina Zahn (10/01-)

IngenieureMelanie Roth Simone Schleeger (09/01-)Christian Schmidt (09/01-)

SekretariatJanine Moegelin

Die Abteilung Molekulare Genomanalyse hat es sich zumZiel gesetzt, innerhalb der Humangenomforschung mit derBearbeitung unterschiedlichster Fragestellungen zum Ver-ständnis der Biologie des menschlichen Organismus unddessen Funktionen beizutragen. Der Schwerpunkt allerProjekte verfolgt die Aufklärung von Ursachen und Ent-wicklung komplexer sowie monogener Erkrankungen. Indiesem Rahmen liegt der Fokus bei den krankheits-relevanten Projekten auf der Identifizierung von krebs-induzierenden Genen sowie Genen verantwortlich fürneuropsychiatrische Störungen. Ausgewählte Gene fürmonogene Krankheiten werden gezielt hinsichtlich derFunktion ihrer Genprodukte untersucht. Als ein Teil desKernbereichs des Nationalen Genomforschungsnetz-werkes (NGFN) werden gezielt Technologien zur funktio-nellen Genomik und Proteomik einschließlich der integra-tiven Bioinformatik mit hohem Durchsatz entwickelt.Die Abteilung arbeitet sehr eng mit dem Ressourcen-zentrum des Deutschen Humanen Genomprojekts (RZPDGmbH), dessen Heidelberger Zweig aus der Abteilung Mo-lekulare Genomanalyse hervorgegangen ist, auf dem Ge-biet der Charakterisierung menschlicher Gene und derenGenprodukten zusammen.

378




I. Monogene und komplexe Krankheiten1. Monogene Krankheiten1.1 Systematische Analyse von in Xq28

lokalisierten GenenA. Kolb, S. Klauck, P. Kioschis, A. Poustka

Innerhalb der vielfältigen Projekte der Abteilung konntenaufgrund der systematischen Bearbeitung eines ausge-suchten Genombereichs, dem distalen langen Arm desmenschlichen X-Chromosoms, Incontinentia Pigmenti ,aber auch durch die Technologieentwicklung zur Identifi-zierung von Krankheitsgenen in anderen Genom-bereichen, essentielle Beiträge zu den genetischen Ursa-chen von monogenen Krankheiten geleistet werden.

In den letzten Jahren wurden im Verlauf der Genkartener-stellung in Xq28 systematisch Kandidatengene für Erb-krankheiten isoliert. Dazu gehörte die Identifizierung desDKC1-Gens verantwortlich für den Krankheitsverlauf derDyskeratosis congenita, das auch weiterhin analysiert wird(siehe I.1.2). Weiterhin wurde eine Mutation im MECP2-Gen als Ursache für eine besondere Form mentaler Retar-dierung [1] gefunden. Die systematische Erstellung vonphysikalischen und Transkript-Karten ermöglichte die Iden-tifizierung der meisten in dieser Region befindlichen Gene,auch im Hinblick auf mögliche Krankheitsgene [2-3]. Dieakkumulierten Ressourcen machen diese Region des X-Chromosoms zu einer der am besten analysierten Regio-nen des menschlichen Genoms [4-10]. Über die RegionXq28 hinaus genutzte Ressourcen führten zu einer Reihevon Erkenntnissen bei unterschiedlichen Krebsarten [11-14].

Die Analyse der subchromosomalen Region Xq28 dientals Modellsystem für die systematische Analyse des hu-manen Genoms. Das besondere Interesse an dieser 10Mb großen Region auf dem langen Arm des humanen XChromosoms gilt sowohl der hohen Konzentration an Ge-nen als auch der Vielzahl von Erbkrankheiten, die mit die-ser Region gekoppelt sind. Die Gene dieser Region sind inVerbindung mit der Etablierung von Klon- und Transkript-karten sowie der Sequenzierung des Genoms nahezu voll-ständig identifiziert, oder liegen zumindest partiell alsESTs (”Expressed Sequence Tags”) vor. Ausgehend vonden Gensequenzen ist jedoch eine Aussage über dieFunktion der Gene nur eingeschränkt möglich, dh. bishersind nur einzelne Gene genauer charakterisiert. Durch die-ses mangelnde Funktionsverständnis ist eine effizienteKorrelation einzelner Gene oder Genfamilien zu genetischbedingten Erkrankungen bzw. den jeweiligen Phänotypennicht möglich. Die im Rahmen dieser chromosomenspe-zifischen Studie durchgeführten Expressionsanalysen, aufder Basis der RNA in situ Hybridisierung, sollen zu einembesseren Funktionsverständnis der Gene beitragen. Diesesystematische Expressionsanalyse wurde mit den zu denin Xq28 lokalisierten Genen orthologen Mausgenen durch-geführt [15]. Das Ziel der gegenwärtigen Arbeiten ist dieDurchführung der in situ Hybridisierungen für alle in Xq28lokalisierten Gene.

1.2 Mutationsanalysen und funktionelleCharakterisierung von DKC1

I. Krebs, N.S. Heiss, R. Salowsky, A. Kolb,A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: I. Dokal, S.W. Knight, T. Vulliamy (Imperi-al College School of Medicine, London, UK); D. Bächner (Institutfür Zellbiochemie und klinische Neurobiologie, Hamburg)

Die Dyskeratosis Congenita (DKC, MIM 305000) ist eineMultisystemerkrankung, die in 90% der Fälle aufgrund vonKnochenmarksversagen in einem mittleren Alter von 16Jahren zum Tode führt. Ein Teil der zusätzlich bei DKC-Pa-tienten auftretenden Symptome deuten auf einen Prozessdes vorzeitigen Alterns hin. Überwiegend Missense-Muta-tionen im DKC1-Gen, welches in der ChromosomenregionXq28 lokalisiert ist, führen zur X-gekoppelten rezessiv ver-erbten Form der DKC [16-18] sowie zum Hoyeraal-Hreidarrson-Syndrom, einer schwerwiegenden allelischenVariante der DKC [19].

Das DKC1-Gen ist hochkonserviert vom Menschen bis hinzu Hefen und Bakterien [17] und kodiert für das nukleoläreProtein Dyskerin, welches als Pseudouridinsynthase undals eines von vier Basisproteinen der ‘box H+ACAsnoRNPs´ (small nucleolar ribonucleoprotein particles) of-fensichtlich Funktionen in der Modifizierung und Reifungvon ribosomalen RNAs ausübt und somit in die Riboso-menbiogenese involviert ist. Desweiteren spielt Dyskerinals Komponente des Telomerasekomplexes eine Rolle inder Erhaltung und/oder der Stabilität von Telomeren. Diesist in Übereinstimmung mit der Beobachtung des erhöhtenRisikos von DKC-Patienten zur Entwicklung von Tumorenund zum vorzeitigen Altern und weist auf eine essentielleFunktion von Dyskerin in Zellen mit hoher proliferativer Ka-pazität hin.

Analysen des Dkc1 Expressionsmusters mittels RNA insitu Hybridisierungen auf verschiedenen embryonalen undadulten Geweben der Maus zeigen eine ubiquitäre Vertei-lung des Dkc1-Transkriptes [20]. Eine verstärkte Dkc1-Ex-pression ist jedoch nicht nur in Zellen mit hoher Prolifera-tionskapazität wie den Epithelien sondern auch in spezifi-schen differenzierten Neuronen des Gehirns (Purkinje undMitral-Zellen) zu beobachten [20]. Promotoranalysen derbeiden orthologen DKC1-Gene in Mensch und Maus mit-tels Reportergen- und EMSA-Untersuchungen identifizier-ten Basispromotorbereiche sowie funktionelle Bindungs-stellen von Transkriptionsfaktoren [21]. Die Identifizierungweiterer cis-regulatorischer Elemente soll der Aufklärungvon DKC1-gewebespezifischen Funktionen dienen.

Unsere Forschungsarbeiten konzentrieren sich derzeit so-wohl auf die Entwicklung eines in vitro Modelles zur Auf-klärung der funktionellen Auswirkungen von DKC1-Mis-sense-Mutationen auf die Ribosomenbiogenese sowie aufdie Telomererhaltung/-Stabilität als auch die Generierungeines Mausmodells, in dem die gewebespezifische undinduzierbare Inaktivierung von Dkc1 Aufschluß über des-sen in vivo Funktionen geben soll. Hierzu waren die Isolie-rung genomischer Klone sowie die Determinierung derDkc1 Exon-Intron Struktur [20] die Voraussetzungen zur

379




Generierung des Knockout-Konstruktes und zur Identifizie-rung homolog rekombinierter ES-Klone.

1.3 Mutationen im NEMO-Gen (NF�B essentialmodulator) sind verantwortlich für dieErbkrankheit Incontinentia Pigmenti (IP)

N.S. Heiss, S. Klauck, P. Kioschis, S. W iemann,A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: A. Smahi, A. Munnich (Department ofGenetics, Unité de Recherches sur les Handicaps Génétiques del‘Enfant, Paris, Frankreich); T. Esposito, A. Ciccodicola, M. D‘Urso(International Institute of Genetics and Biophysics, Neapel, Itali-en); H. Woffendin, S.J. Kenwrick (Wellcome Trust Centre for theStudy of Molecular Mechanism in Disease and University of Cam-bridge, UK); S. Aradhya, R.L. Lewis, D.L. Nelson (Department ofMolecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Hou-ston, Texas, USA)

Incontinentia Pigmenti (IP, MIM 308310) ist eine X-chro-mosomal dominant vererbte neurokutane Genodermatosemit pränataler Lethalität beim männlichen Geschlecht. ImRahmen des internationalen Incontinentia Pigmenti Con-sortiums sind Mutationsanalysen in über 20 Kandidaten-genen, die in der chromosomalen Region Xq28 lokalisiertsind, durchgeführt worden [22-23]. Die Identifizierung vongenomischen Rearrangements sowie von ‘Frameshift´-Mu-tationen im NEMO-Gen (NFkB essential modulator) der IP-Patienten zeigten, das dieses Gen in seiner verändertenForm zur Erkrankung Incontinentia Pigmenti führt [24].Das NEMO Protein ist essentiell für die Aktivierung desTranskriptionsfaktors NF�B und spielt somit eine zentraleRolle in Signaltransduktionswegen, die immonologische,apoptotische und entzündliche Prozesse regulieren. In ei-nigen IP-Patienten konnte bereits eine drastische Redukti-on von NF�B nachgewiesen werden. Die IP ist die erstebeschriebene erbliche Erkrankung, deren Ursache in ei-nem Defekt des NF�B-Signaltransduktionsweges liegt.

2. Krebs2.1 Mutationsanalyse und Charakterisierung von

DMBT1

J. Mollenhauer, G. Kollender, S. Lyer, I. Krebs,L. Schmitt, K. Fessler, S. W iemann, A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: U. Holmskov (Immunologie und Mikrobio-logie, Institut für Medizinische Biologie, Odense Universität,Odense, Dänemark); H.-J. Gröne (Zelluläre and Molekulare Pa-thologie, DKFZ); B. Helmke (Institut für Pathologie, UniversitätHeidelberg); M. Deichmann (Hautklinik, Universität Heidelberg)

Deleted in Malignant Brain Tumors 1 (DMBT1) lokalisiertauf Chromosom 10q25.3-q26.1 und kodiert für ein Proteinder Scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) Superfami-lie. Seine Isolierung geht auf die ursprüngliche Beobach-tung zurück, daß dieses Gen Deletionen in malignen Ge-hirntumoren aufwies. Analoge Beobachtungen sowie einhäufiger Verlust seiner Expression wurden ebenfalls fürepitheliale Tumoren der Lunge und des Gastrointestinal-traktes gemacht, so daß DMBT1 als Kandidaten Tumor-suppressor Gen vorgeschlagen wurde.

Zwar zeigt der DMBT1-Lokus in malignen Gehirntumorenhäufig Verluste der Heterozygotie [25], dennoch ist sein

Expressionsmuster im normalen Zentralen Nervensystem(ZNS) und in assoziierten Tumoren, wie Glioblastoma mul-tiforme und Medulloblastomen, ungewöhnlich für ein kon-ventionelles Tumorsuppressor Gen. Sie lassen eher aufprotektive Funktionen in Analogie zum SRCR-Protein Mac-2 binding protein schließen [26-27]. Des weiteren konntenDeletions-Polymorphismen innerhalb des Gens in der Nor-malbevölkerung festgestellt werden [26]. Diese Variationenführen zu einer verringerten Anzahl bzw. zu einer verän-derten Anordnung von Domänen, die voraussichtlich Inter-aktionen mit anderen Proteinen vermitteln.

Die Charakterisierung von DMBT1 deutet darauf hin, daßes sich um ein multifunktionelles Protein handeln muß. Esspielt möglicherweise eine Rolle in der zellulären Immun-antwort sowie beim Schutz und in der Differenzierung vonEpithelien und ist in seinen Eigenschaften nicht nur demMac-2 binding protein sondern auch den sogenannten Mu-zinen sehr ähnlich [27-30]. Basierend hierauf wurde einZweistufen-Modell zur Rolle von DMBT1 bei der Entste-hung epithelialer Tumoren vorgeschlagen [28-29]. Dele-tions-Polymorphismen interferieren mit seinen Schutzfunk-tionen und könnten ein erhöhtes Risiko für bestimmte epi-theliale Tumoren vermitteln, wie es für Muzine bekannt ist.Sekundäre genetische Veränderungen oder ein Verlustseiner Expression interferieren mit seinen Funktionen inder Differenzierung und fördern so das Tumorwachstum.Dieses Modell wird momentan auf genetischer und funktio-neller Ebene überprüft. Die bereits erfolgte Generierungeiner knockout Maus soll ebenfalls Aufschluß über dieFunktionen von DMBT1 in vivo gewinnen.

2.2 Kandidatengene für sporadischen Brustkrebsin der Region 17p13.3

H. Koepf, C. Hoff, B. W aldau, P. Seranski, A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: U. Hamann (DKFZ); L. Füzesi (Institut fürPathologie, Universität Göttingen); H. Lehrach (MPI für Molekula-re Genetik, Berlin); Ch. Schwartz (Greenwood Medical Center,Greenwood, USA); W. Scheurlen (Universitäts-Kinderklinik, Mann-heim)

Der kurze Arm des menschlichen Chromosoms 17 ist einederjenigen Regionen im Genom, die überdurchschnittlichhäufig von chromosomalen Veränderungen betroffen unddadurch mit zahlreichen menschlichen Tumorarten sowiemit neurologischen Erkrankungen assoziiert ist. Durch diesystematische Kartierung und Isolierung von Kandidaten-genen aus diesen tumorrelevanten Regionen sollen Rück-schlüsse auf die molekularen Mechanismen der Tumorent-stehung gezogen werden. Im Rahmen der gesamten Kar-tierung des kurzes Arm des Chromosoms 17 wurden bis-her die Bereiche 17p11.1-11.2 und 17p13.3 untersucht. Inder Region 17p11.2 wurden durch den kombinierten Ein-satz von cDNA-Selektion, Exon-Trapping und genomi-scher Sequenzierung eine Transkriptkarte über 1,5 Mb er-stellt und dabei 53 neue Transkripte identifiziert. Weiterhinwurde ein Kandidatengen aus dieser Region, RAI1, aufseine potentielle Rolle beim Smith-Magenis Syndrom hinuntersucht [31]. Der zweite Bereich in 17p13.3 spielt imZusammenhang mit der Identifizierung neuer tumorrele-vanter Gene insbesondere in Bezug auf sporadischen

380




Brustkrebs eine wichtige Rolle. Durch Allelverlustanalysen(LOH) auf Tumor/Normal DNA-Paaren von Brustkrebs-Pa-tienten konnte die Kandidatenregion auf zirka 100-150 kbeingegrenzt werden [32]. Basierend auf einer von uns eta-blierten Transkriptkarte dieser Region konnten so Kandi-datengene identifiziert und isoliert werden [33-34].

2.3 Expressionsprofil-Analyse zur Identifizierungtumorspezifischer Gene durch komplexeHybridisierung auf cDNA Arrays

H. Sültmann, M. V ogt, K. S teiner, F. Bergmann,J. Schneider, K. Finis, F. Haller, F. Wilmer, R. Wi ttig,A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: A. v. Heydebreck, M. Vingron (MPI fürMolekulare Genetik, Berlin); B. Gunawan, L. Füzesi (Institut fürPathologie, Universität Göttingen); H. Steiner, C. Herold-Mende(Kopfklinik, Heidelberg); P. Kioschis, M. Hafner (FH Mannheim);B. Korn (RZPD Heidelberg); J. Volz, D. Schadendorf (KlinikumMannheim); G. Sawitzki (Statlab Heidelberg); P. Lichter, R. Eils,O. Krebs (Molekulare Genetik, DKFZ); I. Berger (Pathologie Hei-delberg); G. Riggins (Duke University, Durham, USA), A. Benner(Biostatistik, DKFZ); B. Brors, O. Krebs (IntelligenteBioinformatiksysteme, DKFZ)

Tumorzellen unterscheiden sich genetisch von normalenZellen und weisen typische Genexpressionsmuster auf.Die Kenntnis über diese Unterschiede kann zur molekula-ren Charakterisierung von Tumoren genutzt werden undsomit zur Diagnose und Prognose von Tumorerkrankun-gen dienen. Zur Identifizierung derartiger Muster folgtenwir zwei verschiedenen methodischen Ansätzen: Einer-seits wurde die Expression von ca. 31500 Genen inmenschlichen Primärtumoren (Niere, Brust, Gehirn, gas-trointestinale Stromatumoren) verschiedener Stadien undden entsprechenden Normalgeweben bestimmt. Aus dengewonnenen Daten wurden tumortypische Genexpres-sionsprofile erstellt. DNA-Produkte dieser Gene wurdenanschliessend zur Konstruktion tumorspezifischer Gen-chips auf Glasobjektträger aufgebracht, die für weiterge-hende Analysen zur Tumordiagnose und -prognose zurVerfügung stehen [35]. Darüber hinaus wurden dieselbenProtokolle verwendet, um Gene zu finden, die mit der Che-moresistenz bzw.-sensitivität in Zelllinien des malignenMelanoms assoziiert sind. In dem zweiten methodischenAnsatz wurden mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierungneue tumorrelevante Gene im klarzelligen Nierenzellkar-zinom identifiziert [36].

In dem Projekt zur Analyse des Nierenzellkarzinoms wur-den 37 Tumor- und Normalproben aus chirurgischenResektaten eingesetzt, um auf Arrays ca. 31500 cDNAFragmente humaner Gene mit bekannter oder unbekann-ter (ESTs) Funktion auf differenzielle Expression zu testen[37]. Ausgehend von poly-A+ RNA aus den Geweben wur-de radioaktiv markierte cDNA hergestellt und auf dieArrays hybridisiert. Die Intensität der Hybridisierungssig-nale jeder cDNA auf dem Array ist proportional zu derHäufigkeit der cDNA in der Probe und damit zu dem Ex-pressionsniveau des entsprechenden Gens. Es wurdenmehr als 1700 differenziell exprimierte Gene/ESTs identifi-ziert. Bei der Analyse wurde festgestellt, dass bestimmtezelluläre Prozesse in Tumoren durch mehr differenziell

exprimierte Gene vertreten sind als im Normalgewebe (z.B. Zell-Zell-Adhäsion, immunologische Prozesse, Signal-transduktion). Umgekehrt finden sich andere Prozesse, dieim Normalgewebe durch mehr Gene vertreten sind (z. B.Energiestoffwechsel, Ionentransport, Sauerstoff- und Radi-kalstoffwechsel). Gene, deren differenzielle Genexpres-sion im Nierenzellkarzinom bereits durch andere Publika-tionen bekannt war, wurden in unserer Studie ebenfalls alsdifferenziell identifiziert. Die Datenanalyse ergab darüberhinaus einen Satz von ca. 450 Genen/ESTs, die zur Unter-scheidung von den zwei häufigsten Untergruppen vonNierentumoren verwendet werden können.

Mit Tumor- und Normalgewebe aus Gehirn-, Brust- undgastrointestinalen Stromatumoren (GIST) wurden in analo-gen Experimenten differenziell exprimierte Gene/ESTs ge-funden. Wie auch im Fall der Nierenkarzinome wurdendiese zur Herstellung von cDNA Chips eingesetzt, mit de-nen die Validierung der vorhandenen Daten sowie die mo-lekulare Klassifizierung der Tumoren durchgeführt werden.Diese indikationsspezifischen Chips (Niere, Gehirn, Brust,GIST) enthalten zwischen 3000 und 6900 cDNA Klone.Die Nierentumor-spezifischen Chips wurden mit weiteren45 Patientenproben hybridisiert. Erste Analysen ergabenca. 40 Gene, die als Klassifikatoren für den chromosoma-len Status klarzelliger Nierenzellkarzinome dienen können.Da eine Aberration des langen Arms von Chromosom 5qmit einer günstigen Prognose der Tumorprogression asso-ziiert ist [38], bedeutet dies, dass eine molekulare Sub-klassifizierung von Nierentumoren anhand von Genex-pressionsdaten möglich ist.

Drei Melanomzellinien mit in vitro erworbenen Resistenzengegen Zytostatika wurden mittels cDNA Array-Hybridisie-rung bezüglich ihrer mRNA Expression mit einer sensitivenZellinie verglichen. Von den primär identifizierten 126 Kan-didatengenen wurden mittels indikationsspezifischencDNA Chips 57 Gene als differenziell exprimiert verifiziert.Ausserdem fanden sich 209 tumorassoziierte Gene alsdifferenziell exprimiert zwischen verschiedenen chemo-resistenten und chemosensitiven Zelllinien. Die Korrelationvon Expressionsdaten mit chromosomalen Aberrationenund der Vergleich von Expressionsmustern der resistentenSublinien untereinander erlaubte eine weitere Fokussie-rung auf vielversprechende Kandidatengene, deren Rele-vanz für den chemoresistenten Phänotyp in funktionellenAnalysen geprüft wird.

Datenmanagement und Analyse fürMicroarrayexperimenteW . Huber, P. Herde, A. Poustka

Das Datenmanagement umfasst die Teilbereiche Array-Belegung, Klonannotationen, Patientendaten, histopatho-logische Gewebsklassifikationen und Laboratory Informati-on Management System (LIMS) zur Array-Herstellung undProtokollierung der Experimente. Die Datenanalyse um-fasst das Chipdesign, experimentelles Design, Qualitäts-kontrolle, Identifikation differenziell exprimierter Gene undPathways, Identifikation koexprimierter Gencluster, mole-kulare Pathologie, Krankheitsklassifikation und Prognostik.

381




Hierfür erstellten wir auf Basis der MathematiksoftwareMatlab und der Statistikumgebung R eine Reihe von Da-tenanalysetools. Diese erlauben eine umfassende Auswer-tung der vorhandenen Microarrayexperimente, unter Ein-bindung des weltweit umfangreichsten Repertoires vonstate-of-the-art statistischen Methoden der Regressions-analyse, Clusterung, Klassifikation und Visualisierung [39].

Im Verlauf der Auswertung der Expression-Profiling Expe-rimente ergaben sich eine Reihe offener methodischerFragestellungen. So stellt sich bei Microarrayexperimentenmit Gewebebiopsien von Patientenreihen die Frage nachder Existenz, Signifikanz und Charakterisierung potenziel-ler Patienten- oder Gewebsteilmengen mit unterschiedli-chen Transkriptionsprofilen. Hierzu wurde eine neue, derbiologischen Fragestellung und der Natur der Daten ange-passte Scoring- und Clustermethode entwickelt [40-41].Zwei fundamentale Probleme bei der Analyse von Micro-arraydaten sind deren Kalibrierung [42] und die Bewertungder statistischen Signifikanz der gemessenen Signalverän-derungen. Mit einem neuartigen methodischen Ansatzkonnten wir ein praktikables Verfahren zur simultanen Lö-sung beider Problem vorstellen, welches sensitiver undspezifischer als die anderweitig verwendeten Verfahren ist[43-45].

Zur Erfassung und konsistenten und nachhaltigen Bereit-haltung der Daten entwickeln wir ein auf dem Datenbank-system Oracle aufbauendes Datenbanksystem und -inter-face, welches den oben erwähnten Spezifikationen für dasDatenmanagement entspricht, Datensicherheit, sowohlhinsichtlich Zugriff wie auch Schutz vor Verlust, gewährlei-stet, eine einfache Bedienung durch Laborpersonal für dieDatenerfassung, -kuration und präliminäre Analyse ermög-licht, und den emergenten internationalen Standards(MGED) genügt.

Zum besseren Verständnis der Vorgänge bei der Produkti-on und Verarbeitung von cDNA Chips von Seiten der nichtbiologischen Disziplinen wurde ein kurzer Videofilm zu die-sem Thema veröffentlicht [46].

3. AutismusS. Klauck, K. Beyer, S. Epp, T. Kraus, A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: F. Poustka (Klinik für Psychiatrie und Psy-chotherapie des Kindes-und Jugendalters, J.W. Goethe-Universi-tät Frankfurt); The International Molecular Genetic Study ofAutism Consortium (IMGSAC) (http://www.well.ox.ac.uk/~maestrin/iat.html); A. Benner (Biostatistik, DKFZ)

Autismus ist eine schwerwiegende Entwicklungsstörung,die durch stark eingeschränkte Sozialkontakte, verzögerteSprachentwicklung und stereotype, sich wiederholendeVerhaltensweisen gekennzeichnet ist. Die Erkrankung be-trifft drei- bis viermal mehr männliche als weibliche Patien-ten und setzt mit einer Prävalenzrate von mindestens 5 in10.000 bereits in den ersten drei Lebensjahren ein. Diestarke genetische Komponente der Ätiologie des Autis-mus, die durch Familien- und Zwillingsstudien belegt ist,macht es sinnvoll, mit Kopplungsstudien nach Genen fürdiese komplex vererbte Erkrankung zu suchen.

Das Ziel unserer Studie ist, mit zwei verschiedenen Ansät-zen nach Anfälligkeitsgenen für Autismus zu suchen. Dazugehört zum einen die genomweite Kopplungsanalyse mitHilfe der ”affected sib-pair”-Methode, die in Zusammenar-beit mit dem ”International Molecular Genetic Study ofAutism Consortium” (IMGSAC) durchgeführt wird. Im zwei-ten Ansatz werden gezielt definierte Genloci oder Kandi-datengene mit Assoziationsstudien im zur Verfügung ste-henden Patientenkollektiv untersucht, als auch direkt ander Ätiologie des Autismus beteiligte Genvarianten durchMutationsanalysen gesucht.

Die erste genomweite Kopplungsanalyse des IMGSA-Kon-sortiums an einem Kollektiv von 99 Geschwisterpaarenhatte Kandidatenregionen auf sechs Chromosomen identi-fiziert [IMGSAC, Hum. Mol. Genet. 7 (1998) 571-578; 47],wobei der höchste LOD-Wert für die Region 7q31-q35 ge-funden wurde (MLS 3,55). Die Region auf Chromosom 7qkonnte sowohl durch Untersuchungen anderer Konsortienals auch durch eine Folgestudie von IMGSAC in einem er-weiterten Kollektiv von 153 Geschwisterpaaren (nebenweiteren Kandidatenregionen auf Chromosom 2q, 16p und17q) bestätigt werden (MLS 3,37 für D7S477 in 7q22) [48].Dabei lag die Region mit den höchsten Kopplungswertenin dieser Studie etwa ca. 25 cM proximal des Peaks derersten IMGSAC-Studie. Assoziationsstudien fanden zweiRegionen auf Chromosom 7q mit signifikanten Werten,eine unter dem Peak der zweiten Kopplungsanalyse, dieandere ca. 27 cM weiter distal [49-50]. Um die assoziiertenMarker in der distalen Region (7q31-q32) wurde eine inte-grierte 3 Mb BAC- und Transkript-Karte erstellt [50-51], diezur Identifizierung von Anfälligkeitsgenen für Autismus füh-ren soll. Für den zweiten Ansatz wurden gezielt mehrereKandidatengene für Autismus zumeist in Assoziations-studien untersucht. Aus der Kandidatenregion in 7q wur-den polymorphe Marker in den Genen WNT2 und Reelin[50], FOXP2 [52], sowie PEG1/MEST, COPG2, CPA1 undCPA5 [53] analysiert, allerdings konnte ein größerer Ein-fluß auf die Ätiologie des Autismus in den untersuchtenPatientenkollektiven ausgeschlossen werden. Auch Analy-sen von Kandidatengenen in anderen Genomregionen(HOPA, Xq13, Assoziationsstudie [50, 54]; MECP2, Xq28,Mutationsanalyse [50, 55]), ergaben keinen Beleg für dieBeteiligung dieser untersuchten Gene an der Entstehungdes autistischen Krankheitsbildes.

II. Funktionelle Genomik und Proteomik1. Generierung und systematische

Sequenzierung von Volle-Länge-cDNAshumaner Gene

R. Wellenreuther, D. Heiss, N. Claudino, R. Albert, P.Heidrich, I. Schupp, S. Burmester, U. Ernst, M.Stauch, S. W iemann, A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: Deutsches cDNA Konsortium; L. Füzesi(Georg-August-Universität, Göttingen); G. Schumann (UniversitätMannheim); M. Schachner (Universität Hamburg)

Langfristiges Ziel des Humangenomprojektes (HGP) istes, alle menschlichen Gene zu identifizieren sowie derenFunktion aufzuklären. Volle-Länge-cDNAs, die die kom-

382




plette Protein-kodierende Region eines Gens enthalten,sind eine unschätzbare experimentelle Ressource für dieFunktionsaufklärung eines Gens.

Im Rahmen unserer Arbeit generieren wir von verschie-densten menschlichen Geweben cDNA-Bibliotheken, diefür volle-Länge-Klone angereichert sind. Wir haben bei derBibliotheken-Generierung eine Methode entwickelt, defi-nierte cDNA-Größenfraktionen zu amplifizieren und zu klo-nieren, um cDNAs anzureichern, die in konventionell-her-gestellten Bibliotheken stark unterrepräsentiert sind unddaher unentdeckt blieben. Diese Bibliotheken stellen dieKlonressource für die systematische Hochdurchsatz-Se-quenzanalyse im Deutschen cDNA-Konsortium dar. DasZiel des Konsortiums ist es, möglichst viele cDNAs zuidentifizieren, die neue, bisher nicht-bekannte Gene reprä-sentieren und für jede dieser cDNAs einen Volle-Länge-Klon zur Verfügung zu haben. Die cDNAs werden überdas Ressourcen-Zentrum (www.rzpd.de) allgemein zu-gänglich gemacht; die Sequenzen werden in die EMBL-Datenbank eingespeist.

Bis Dezember 2001 sequenzierte das gesamte Konsorti-um 5263 cDNA-Klone mit insgesamt 14,5 Mb, wovon inder Abteilung Molekulare Genomanalyse rund 1,3 Mb(~ 500 cDNAs) generiert wurden. Die Sequenzen werdenzunächst zu MIPS (Munich information center for proteinsequences) in München geschickt, dort analysiert und an-notiert, bevor sie in öffentlich zugänglichen Datenbankenhinterlegt werden. Von mittlerweile 4930 annotiertencDNAs zeigen 2240 einen kodierenden Bereich (CDS).Hiervon lässt sich für 1020 Klone ein vollständiger offenerLeserahmen (ORF) nachweisen [56-57]. Weitere Informa-tionen sind unter folgender Internetadresse zugänglich:www.dkfz-heidelberg.de/abt0840/GCC/.

2. Entwicklung und Anwendung vonMethoden zur systematischenProteinexpression und funktionellenProteinanalyse

D. Arlt, S. Bechtel, U. Korf, L. Bergman, A. Duda,B. Guilleaume, K. Hettler, T. Kohl, M. Majety,M. Sabbela, S. Schleeger, C. Schmidt, R. Wi ll,R. Zahn, S. W iemann, A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: R. Pepperkok (EMBL, Heidelberg); M.Schnölzer, G. Moldenhauer (DKFZ)

Mit Hilfe der Gateway-Rekombinations-Strategie werdendie als neuartig identifizierten offenen Leserahmen ausdem cDNA Konsortium für ihre nähere Charakterisierungin eine Auswahl von Expressionsvektoren überführt: Ge-genwärtig werden verschiedene pro- wie eukaryotischeGFP-, GST- His-, StrepTagII- und Myc-Tag Expressions-vektoren in z.B. Lokalisationsstudien sowie für die Herstel-lung rekombinanter Proteine (E.coli, BVE) eingesetzt [58-60].

Zunächst wird die Primärstruktur des rekombinaten Prote-ins in Zusammenarbeit mit der Zentralen Proteinanalytikanhand des MALDI-Fingerprintings verifiziert. Ausgewähltegereinigte, rekombinante Proteine werden für die Gewin-nung von Antikörpern oder für sogenannte Pull-Down-Ex-

perimente eingesetzt. Die in Pull-Down-Experimentenidentifizierten Interaktionspartner werden wiederum mitHilfe von massenspektrometrischen Ansätzen identifiziert.Um einen Großteil der inzwischen mehr als 1000 Kandi-datengene im angemessenen zeitlichen Rahmen charak-terisieren zu können, wird gegenwärtig eine für den Hoch-durchsatz geeignete Automatisierungsstrategie erprobt.Parallel hierzu werden ausgewählte Kandidaten im Hefe-2-Hybrid-System (”Yeast Two-Hybrid”) einer Suche nachInteraktionspartnern unterworfen. Auch hier ist eine Auto-matisierung des Verfahrens beabsichtigt.

Als weiteres Verfahren ist die Protein-Array Technologieetabliert worden. Mit diesem Ansatz können u.a. Unter-schiede in Proteinexpressionsprofilen aufgespürt und ggf.mit den analogen Daten aus RNA-Arrays verglichen wer-den. Zudem ist ein weiterer Ausbau der Protein-ArrayTechnologie zu einem quantitatives Werkzeug für die Bio-logie beabsichtigt, das sich für das Modellieren von Stoff-wechselvorgängen eignet und es ermöglicht, biologischeRegelkreise systematisch zu erfassen.

Für die Ergänzung der Daten bezüglich der Lokalisations-studien und Proteinuntersuchungen werden funktionelleAssays in etablierten Säugetier-Zelllinien durchgeführt.Die Zielsetzung ist die Identifizierung von Genen innerhalbder neu charakterisierten ORFs, die eine potentielle Rollebei der Onkogenese spielen. Zur systematischen Untersu-chung von Funktionen der von den ORFs kodierten Protei-nen innerhalb zellulärer Signaltransduktionswege, Apop-tose und Proliferation werden Zell-basierte Assays durch-geführt und mit Hilfe von Fluoreszensmikroskopie unddem Fusion-Multi-Detektions-Analysesystem die Datenerfasst und ausgewertet. Mit Hilfe einer Datenbank (MS-SQL) werden die Daten aus den Einzelexperimenten mitInformationen aus Sequenzvergleichen und -analysen in-tegriert und über ein Web-interface zur Auswertung verfüg-bar gemacht.

3. Experimentelle Verifikation vonvorhergesagten alternativen SpleißvariantenD. Zink, A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: S. Haas, E. Coward, M. Vingron (MPI fürMolekulare Genetik, Berlin); B. Korn (RZPD Heidelberg)

Eine große Anzahl von humanen EST Clustern (expressedsequence tags) und mRNAs lassen sich nicht zu einer ein-zigen Konsensussequenz zusammenfügen; es entstehendaher mehrere Konsensussequenzen innerhalb eines Clu-sters. Die Unterschiede in den Konsensussequenzen kön-nen u.a. durch alternatives Spleißen bedingt sein. Das Er-gebnis dieser Berechnungen ist graphisch in einer Daten-bank (SpliceNest) dargestellt. Zur Überprüfung von vorher-gesagten alternativen Spleißvarianten wurden 17 ESTCluster der Chromosomen 21 und 22 analysiert.

Sehr einfach können mittels RT-PCR solche Spleißmusterverifiziert werden, die durch ”Exon skipping” entstehen.Die Analysen wurden an 40 verschiedenen humanen Ge-weben, und in Zukunft an 12 Zelllinien, durchgeführt. ZurKontrolle wurden alle gefundenen Spleißvarianten, vor al-lem solche die größer bzw. kleiner sind als die zu erwar-

383




tenden Spleißmuster, durch Sequenzieren verifiziert. Vonden insgesamt 17 analysierten EST-Clustern (SpliceNest,Version Sep 98; Coward et al. Trends Genet 18 (2002) 53-55) konnten 59% der vorhergesagten Spleißvarianten be-stätigt werden. In Zukunft sollen die Analysen auf ca. 100Cluster (62 Cluster/Gene auf Chromosom 21; 22 Gene aufXq28 und 20 Apoptose-relevante Gene) erweitert werden.

Nach der erfolgreichen Etablierung der Technologie unddem Abschluss der Pilotexperimente wurden die Laborrou-tinen am RZPD auf einem entsprechenden Laborroboterprogrammiert. Somit entsteht die Möglichkeit mit stark er-weitertem Durchsatz das Projekt fortzuführen. Darüberhinaus wird gegenwärtig eine Anpassung der RZPD Da-tenbank durchgeführt, die es erlauben wird, die experi-mentellen Ergebnisse dieses Projekts in relationaler Formzu speichern und in direkte Beziehung zu allen bekanntenGenen des Menschen zu setzen. Schließlich soll dieQuantifizierung von verschiedenen Spleißvarianten einigerGene mittels ”Real-Time-PCR” durchgeführt werden.

4. Datenbanken und DatenintegrationD. Bannasch, V. Kuryshev, A. Mehrle, K.-H. Nolte,H. Rosenfelder, M. Seiler

In Zusammenarbeit mit: K.-H. Glatting (DKFZ)

Aufgabe der ‚GFP-Datenbank’ ist die Speicherung von An-notationsdaten und die Verwaltung von experimentellenDaten. Als Ausgangsdaten dienen die im Rahmen descDNA-Konsortiums generierten volle-Länge cDNA-Se-quenzen inklusive der zugehörigen Annotationsdaten. Ex-perimentelle Daten entstehen bei der Klonierung der ent-sprechenden cDNAs in unterschiedliche Expressionsvek-toren. (-> Datenbank als Laborinformationssystem) sowiebei den mit Hilfe der Expressionsvektoren durchgeführtenfunktionellen Experimenten. Hierbei werden u. a. Datenvon Experimenten zur subzellulären Lokalisation von GFP-Fusionsproteinen, die in Kollaboration mit der Gruppe vonRainer Pepperkok am EMBL durchgeführt werden, erfasst.

Als Datenbank-Management-System (DBMS) kommt einMicrosoft SQL-Server 2000 unter Windows 2000 Serverzum Einsatz. Die gewonnenen experimentellen Daten wer-den zusammen mit den Annotationsdaten der Öffentlich-keit zugänglich gemacht. Der Zugriff geschieht über einWeb-Interface (Webserver: IIS von Microsoft, program-miert unter Verwendung von ASP und VBScript). Über einähnliches Interface können die Kollaborationspartner aufdie Datenbank zugreifen, wobei in diesem Fall auch dieEingabe von Daten ermöglicht wird.

5. Automatisierte Produktion von monoklo-nalen Hybridom-Antikörpern und kleinen,stabilen bispezifischen Antikörpern

F. Brei tl i ng, A. Poustka

In Zusammenarbeit mit: G. Moldenhauer (DKFZ); S. Dübel(Lifebits; Universität Heidelberg)

Aufgrund der fortschreitenden Genomprojekte gibt es mitt-lerweile eine Vielzahl von neu entdeckten Genen, für de-ren Genprodukte noch keine monoklonalen Antikörper

exisitieren. Ziel des Projektes ist die schnellere Herstel-lung von monoklonalen Antikörpern. Dies soll durch dieAutomatisierung der Hybridomproduktion und durch dieHerstellung von Antigenarrays mit Roboterhilfe erreichtwerden. Dadurch können deutlich mehr Kulturüberständeauf darin enthaltene Antigen-spezifische monoklonale Anti-körper durchsucht werden [61]. In einem weiteren Projektwird die Herstellung eines 60kd großen bispezifischen An-tikörpers, der zwei aus Fv-Antikörpern bestehende Bin-dungsmoleküle enthält, entwickelt [62-66]. Diese haben ineinzelnen klinischen Versuchen und in vielen Modellenmittlerweile ihre Wirksamkeit in der Tumortherapie bewie-sen.

6. Herstellung von PeptidarraysF. Breitling, V. Stadler, A Poustka

In Zusammenarbeit mit: F.R. Bischoff (DKFZ)

Ziel ist die Entwicklung eines Verfahrens, mit dem Millio-nen von unterschiedlichen Oligomeren auf einem Trägersynthetisiert werden können. Das Verfahren beruht aufMonomer-Partikeln, die aus einem bei Raumtemperaturfesten Lösungsmittel bestehen, in das die Aminosäuren-Bausteine eingebettet sind. Diese Partikel können z.B. miteinem modifizierten Laserdrucker auf den Träger aufge-bracht werden. Jeweils nach dem Auftragen einer neuenDruckschicht werden die Aminosäuren durch einen wär-meinduzierten Phasenwechsel des Lösungsmittels vonfest nach flüssig aus den Monomer-Partikeln freigesetzt.Unter diesen Bedingungen erfolgt die Kopplung der Ami-nosäuren an den Träger bzw. an die bereits synthetisiertenPeptidketten. Nach dem Entfernen der Hilfsstoffe erfolgenweitere Synthesezyklen bis zur Fertigstellung der Peptide.Durch den Einsatz trockener Partikel können die techni-schen Probleme bei der Herstellung hochkomplexerArrays (z.B. die Diffusion der Monomere) verblüffend ein-fach vermieden werden. Darüber hinaus ermöglicht die di-gitale Drucktechnik eine sehr schnelle Reaktion auf dieWünsche eines Kunden, der z.B. ”seine eigenen” Arraysdesignen und über das Internet bestellen kann. U.a. des-halb wurde die DKFZ-Ausgründung PEPperPRINT ins Le-ben gerufen [67-68].

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] Klauck, S.M., Lindsay, S.*, Beyer, K.S., Splitt, M.*, Burn, J.*,Poustka, A. A mutation hot spot for non-specific X-linked mentalretardation in the MECP2 gene causes the PPM-X syndrome. Am.J. Hum. Genet. 70 (2002) 1034-1037[2] Briault, S.*, Villard, L.*, Rogner, U., Coy, J., Odent, S.*, Lucas,J.*, Passage, E.*, Zhu, D.*, Shrimpton, A*, Pembrey, M*, Till, M.*,Guichet, A.*, Dessay, S.*, Fontes, M.*, Poustka, A, Moraine, C.*Mapping of X chromosome inversion breakpoints [inv(X)(q11q28)]associated with FG syndrome: a second FG locus [FGS2]? Am. J.Med. Genet. 95 (2000) 178-181[3] Copley, L.M.*, Zhao, W.D.*, Kopacz, K.*, Herman, G.E.*,Kioschis, P.*, Poustka, A.*, Taudien, S.*, Platzer, M.* Exclusion ofmutations in the MTMR1 gene as a frequent cause of X-linkedmyotubular myopathy. Am. J. Med. Genet. 107 (2002) 256-258.[4] Reichwald, K.*, Thiesen, J.*, Wiehe, T.*, Weitzel, J.*, Strätling,W.H.*, Kioschis, P., Poustka, A., Rosenthal, A.*, Platzer, M.*.Comparative sequence analysis of the MECP2-locus in man andmouse reveals novel transcribed regions. Mammalian Genome 11(2000) 182-190

384




[5] Los, M.*, Neubuser, D.*, Coy, J. F., Mozoluk, M.*, Poustka, A.,Schulze-Osthoff, K.*. Functional characterization of DNase X, anovel endonuclease expressed in muscle cells. Biochemistry 39(2000) 7365-7373[6] Mallon, A.M.*, Platzer, M.*, Bate, R.*, Gloeckner, G.*,Botcherby, M.R.*, Nordsiek, G.*, Strivens, M.A.*, Kioschis, P.,Dangel, A.*, Cunningham, D.*, Straw, R.N.*, Weston, P.*, Gilbert,M.*, Fernando, S.*, Goodall, K.*, Hunter, G.*, Greystrong, J.S.*,Clarke, D.*, Kimberley, C.*, Goerdes, M.*, Blechschmidt, K.*,Rump, A.*, Hinzmann, B.*, Mundy, C.R.*, Miller, W.*, Poustka, A.,Herman, G.E.*, Rhodes, M.*, Denny, P.*, Rosenthal, A.*, Brown,S.D.*. Comparative genome sequence analysis of the Bpa/Strregion in mouse and man. Genome Res. 10 ( 2000) 758-775[7] Aradhya, S.*, Woffendin, H.*, Bonnen, P.*, Heiss, N.S.,Yamagata, T.*, Esposito, T.*, Bardaro, T.*, Poustka, A., D’Urso,M.*, Kenwrick, S.*, Nelson, D.L.* Physical and geneticcharacterization reveals a pseudogene, an evolutinary junction,and unstable loci in distal Xq28. Genomics 79 (2002) 31-40[8] Coy, J.F., Wiemann, S., Bechmann, I.*, Bächner, D.*, Nitsch,R.*, Kretz, O.*, Christiansen, H.*, Poustka, A. Pore membraneand/or filament interacting like protein 1 (POMFIL1) ispredominantely expressed in the nervous system and encodesdifferent protein isoforms. Gene (2002) im Druck[9] McPherson, J.D.*, Marra, M.*, Hillier, L.*, Waterston, R.H.*,Chinwalla, A.*, Wallis, J.*, Sekhon, M.*, Wylie, K.*, Mardis, E.R.*,Wilson, R.K.*, Fulton, R.*, Kucaba, T.A.*, Wagner-PcPherson, C.*,Barbazuk, W.B.*, Gregory, S.G.*, Humphray, S.J.*, French, L.*,Evans, R.S.*, Bethel, G.*, Whittaker, A.*, Holden, J.L.*, McCann,O.T.*, Dunham, A.*, Soderlund, C.*, Scott, C.E.*, Bentley, D.R.*,Schuler, G.*, Chen, H.C.* Jang, W.*, Green, E.D.*, Idol, J.R.*,Maduro, V.V.*, Montgomery, K.T.*, Lee, E.*, Miller, A.*, Emerling,S.*, Kucherlapati; R.*, Gibbs, R.*, Scherer, S.*, Gorrell, J.H.*,Sodergren, E.*, Clerc-Blankenburg, K.*, Tabor, P.*, Naylor, S.*,Garcia, D.*, de Jong, P.J.*, Catanese, J.J.*, Nowak, N.*,Osoegawa, K.*, Qin, S.*, Rowen, L.*, Madan, A.*, Dors, M.*,Hood, L.*, Trask, B.*, Friedman, C.*, Massa, H.*, Cheung, V.G.*,Kirsch, I.R.*, Reid, T.*, Yonescu, R.*, Weissenbach, J.*, Bruls, T.*,Heilig, R.*, Branscomb, E.*, Olsen, A.*, Doggett, N.*, Cheng,J.F.*, Hawkins, T.*, Myers, R.M.*, Shang, J.*, Ramirez, L.*,Schmutz, J.*, Velasquez, O.*, Dixon, K.*, Stone, N.E.*, Cox,D.R.*, Haussler, D.*, Kent, W.J.*, Furey, T.*, Rogic, S.*, Kennedy,S.*, Jones, S.*, Rosenthal, A.*, Wen, G.*, Schilhabel, M.*,Gloeckner, G.*, Nyakatura, G.*, Siebert, R.*, Schlegelberger, B.*,Korenberg, J.*, Chen, X.N.*, Fujiyama, A.*, Hattori, M.*, Toyoda,A.*, Yada, T.*, Parl, H.S.*, Sakaki, Y.*, Shimizu, N.*, Asakawa, S.*,Kawasaki, K.*, Sasaki, T.*, Shintani, A.*, Shimizu, A.*, Shibuya,K.*, Kudoh, J.*, Minoshima, S.*, Ramser, J.*, Seranski, P.*, Hoff,C.*, Poustka, A.*, Reinhardt, R.*, Lehrach H.*, The InternationalHuman Genome Mapping Consortium. A physical map of the hu-man genome. Nature 409 (2001) 934-941[10] Nadeau, J.H.*, Balling, R.*, Barsh, G.*, Beier, D.*, Brown,S.D.*, Bucan, M.*, Camper, S.*, Carlson, G.*, Copeland, N.*,Eppig, J.*, Fletcher, C.*, Frankel, W.N.*, Ganten, D.*, Goldowitz,D.*, Goddnow, C.*, Guenet, J.L.*, Hicks, G.*, de Angelis, M.H.*,Jackson, I.*, Jacob, H.J.*, Jenkins, N.*, Johnson, D.*, Justice,M.*, Kay, S.*, Kingsley, D.*, Lehrach, H.*, Magnuson, T.*, Meisler,M.*, Poustka, A., Rinchik, E.M.*, Rossant, J.*, Russell, L.B.*,Schimenti, J.*, Shiroishi, T.* Skarnes, W.C.*, Soriano, P.*,Stanford, W.*, Takahashi, J.S.*, Wurst, W.*, Zimmer, A.*Sequence interpretation. Functional annotation of mouse genomesequence. Science 291 (2001) 1251-1255[11] Finzer, P., Soto, U., Delius, H., Patzelt, A., Coy, J.F., Poustka,A., zur Hausen, H., Rösl, F. Differential transcriptional regulationof the monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1) gene intumorigenic and non-tumorigenic HPV 18 positive cells: the role ofthe chromatin structure and AP-1 composition. Oncogene 19(2000) 3235-3244[12] Götte, K.*, Hadaczek, P. *, Coy, J.F., Wirtz, H.W. *, Riedel, F.*, Neubauer, J. *, Hörmann, K. * Fhit expression is absent orreduced in a subset of primary head and neck cancer. AnticancerRes. 20 (2000a) 1057-1060

[13] Götte, K.*, Riedel, F.*, Coy, J.F., Spahn, V.*, Hörmann, K.*Salivary gland carcinosarcoma: immunohistochemical, moleculargenetic and electron microscopic findings. Oral Oncol. 36 (2000b)360-364[14] Götte, K.*, Riedel, F.*, Schafer, C:*,. Coy, J., Hörmann, K.*Cylindrical cell carcinomas of the paranasal sinuses do not showp53 alterations but loss of heterozygosity at 3p and 17p. Int. J.Cancer 85 (2000c) 740-742[15] Kolb, A. Systematische Expressionsanaylse von in Xq28 loka-lisierten Genen auf der Basis der RNA in situ Hybridisierung in derMaus. Dissertation, Universität Heidelberg (2001)[16] Heiss, N.S., Megarbane, A.*, Klauck, S.M., Kreuz, F.R.*,Makhoul, E.*, Majewski, F.*, Poustka, A. One novel and tworecurrent missense DKC1 mutations in patients with dyskeratosiscongenita (DKC). Genet. Couns. 12 (2001) 129-136[17] Heiss, N.S., Poustka, A. Dyskeratosis Congenita. In: Hisama,F.M., Weissman, S.M., Martin, G.M. (Ed): Chromosomal Instabilityand Aging: Basic Science and Clinical Implication, Marcel DekkerInc., New York (2002) im Druck[18] Heiss, N.S., Poustka, A. Dyskerin (DKC1 Gene). In:Creighton TE (Ed): Encyclopedia of Molecular Medicine, JohnWiley & Sons Publishers, New York (2002)[19] Yaghmai, R.*, Kimyai-Asadi, A.*, Rostamiani, K.*, Heiss,N.S., Poustka, A., Eyaid, W.*, Bodurtha, J.*, Nousari, H.C.*,Hamosh, A.*, Metzenberg, A.* Overlap of dyskeratosis congenitawith Hoyeraal-Hreidarsson syndrome. J. Pediatr. 136 (2000) 390-393[29] Heiss, N.S., Bächner, D.*, Salowsky, R., Kolb, A., Kioschis,P., Poustka, A. Gene structure and expression of the mousedyskeratosis congenita gene. Genomics 67 (2000) 153-163.[21] Salowsky, R., Heiss, N.S., Benner, A., Wittig, R., Poustka, A.Basal transcription activity of the dyskeratosis congenita gene ismediated by Sp1 and Sp3 and a patient mutation in a Sp1 bindingsite is associated with decreased promoter activity. Gene (2002)im Druck[22] Aradhya, S.*, Nelson, D.L.*, Heiss, N.S., Poustka, A.,Woffendin, H.*, Kenwrick, S.*, Esposito, T.*, Ciccodicola, A.*,Bardaro, T.*, D’Urso, M.*, Smahi, A.*, Munnich, A.*, Herman,G.E.*, Lewis, R.A.*. Human homologue of the murine Barepatches/Striated gene is not mutated in Incontinentia PigmentiType 2. Am. J. Med. Genet. 91 (2000) 241-244[23] Aradhya, S.*, Ahobila, P.*, Lewis, R.A.*, Nelson, D.L.*,Esposito, T.*, Ciccodicola, A.*, Bardaro, T.*, D’Urso, M.*,Woffendin, H.*, Kenwrick, S.*, Smahi, A.*, Heuertz, S.*, Munnich,A.*, Heiss, N.S., Poustka, A., Chishti, A.H.*. Filamin (FLN1),plexin (SEX), major palmitoylated protein p55 (MPP1), and von-Hippel Lindau binding protein (VBP1) are not involved inIncontinentia pigmenti type 2. Am. J. Med. Genet. 94 (2000) 79-84[24] Smahi, A.*, Courtois, G.*, Vabres, P.*, Yamaoka, S.*,Heuertz, S.*, Munnich, A.*, Israel, A.*, Heiss, N.S., Klauck, S.M.,Kioschis, P., Wiemann, S., Poustka, A., Esposito, T.*, Bardaro, T.*,Gianfrancesco, F.*, Ciccodicola, A.*, D’Urso, M.*, Woffendin, H.*,Jakins, T.*, Donnai, D.*, Stewart, H.*, Kenwrick, S.J.*, Aradhya,S.*, Yamagata, T.*, Levy, M.*, Lewis, R.A.*, Nelson, D.L.*.Genomic rearrangement in NEMO impairs NF-�B activation and isa cause of incontinentia pigmenti. The International IncontinentiaPigmenti (IP) Consortium. Nature 405 (2000) 466-472[25] von Deimling, A.*, Fimmers, R.*, Schmidt, M.C.*, Bender, B.*,Fassbender, F.*, Nagel, J.*, Jahnke, R.*, Kaskel, P.*, Duerr, E.M.*,Koopmann, J.*, Maintz, D.*, Steinbeck, S.*, Wick, W.*, Platten,M.*, Muller, D.J.*, Przkora, R.*, Waha, A.*, Blumcke, B.*, Wellen-reuther, R., Meyer-Puttlitz, B.*, Schmidt, O.*, Mollenhauer, J.,Poustka, A., Stangl, A.P.*, Lenartz, D.*, von Ammon, K.*.Comprehensive allelotype and genetic analysis of 466 humannervous system tumors. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 59 (2000)544-558.

385




[26] Mollenhauer, J., Herbertz, S., Holmskov, U.*, Tolnay, M.*,Krebs, I., Merlo, A.*, Schroeder, H.D.*, Maier, D.*, Breitling, F.,Wiemann, S., Gröne, H.-J., Poustka, A. DMBT1 encodes a proteininvolved in the immune defense and in epithelial differentiationand is highly unstable in cancer. Cancer Res. 60 (2000) 1704-1710[27] Herbertz, S. Herstellung und Charakterisierung eines mono-klonalen Antikörpers gegen DMBT1 und immunhistochemischeAnalyse der Expression von DMBT1 in menschlichen Geweben.Dissertation, Universität Heidelberg (2000)[28] Mollenhauer, J., Herbertz, S., Helmke, B.*, Kollender, G.,Krebs, I., Madsen, J.*, Holmskov, U.*, Sorger, K.*, Schmitt, L.,Wiemann, S., Otto, H.F.*, Grone, H.J., Poustka, A. Deleted inMalignant Brain Tumors 1 is a versatile Mucin-like molecule likelyto play a differential role in digestive tract cancer. Cancer Res. 61(2001) 8880-8886[29] Mollenhauer, J., Helmke, B.*, Müller, H., Kollender, G., Lyer,S., Diedrichs, L., Holmskov, U.*, Ligtenberg, T.*, Herbertz, S.,Krebs, I., Wiemann, S., Madsen, J.*, Bikker, F.*, Schmitt, L., Otto,H.F.*, Poustka, A. Sequential changes of the DMBT1 expressionand location in normal lung tissue and lung carcinomas. GenesChrom. Cancer (2002) im Druck.[30] Deichmann, M.*, Mollenhauer, J., Helmke, B.*, Thome, M.*,Hartschuh, W.*, Poustka, A., Näher, H.* Analysis of losses ofheterozygosity of the candidate tumour suppressor gene DMBT1in uncultured malignant melanomas. Oncology (2002) im Druck[31] Seranski, P., Hoff, C., Radelof, U.*, Hennig, S.*, Reinhardt,R.*, Schwartz, C.E.*, Heiss, N.S., Poustka, A. RAI1 is a novelpolyglutamine encoding gene that is deleted in Smith-Magenissyndrome patients. Gene 270 (2001) 69-76[32] Hoff, C., Mollenhauer, J., Waldau, B., Hamann, U., Poustka,A. Allelic imbalance and fine mapping of the chromosome17p13.3 subregion in sporadic breast carcinomas. Cancer Genet.Cytogenet. 129 (2001) 145-149[33] Hoff, C. Cartographie physique et cartographie detranscription de la region 17p13.3 frequemment deletee dans lecancer du sein. Dissertation, Universität Straßburg (2000)[34] Hoff, C., Seranski, P., Mollenhauer, J., Korn, B., Detzel, T.,Reinhardt, R.*, Ramser, J.*, Poustka, A. Physical andtranscriptional mapping of the 17p13.3 region that is frequentlydeleted in human cancer. Genomics 70 (2000) 26-33[35] Sültmann, H., Poustka, A. Indikationsspezifische cDNA Chipsfür die Krebsdiagnose. GenomXpress 4 (2001)15-17[36] Wilmer, F. Differenzielle Genexpression im klarzelligenNierenzellkarzinom. Dissertation, Universität Mainz (2001)[37] Boer, J.M., Huber, W.K., Sültmann, H., Wilmer, F., vonHeydebreck, A., Haas, S., Korn, B., Gunawan, B.*, Vente, A.*,Füzesi, L.*, Vingron, M., Poustka, A. Identification andclassification of differentially expressed genes in renal cellcarcinoma by expression profiling on a global human 31,500-element cDNA array. Genome Res. 11 (2001) 1861-1870[38] Gunawan, B.*, Huber, W., Holtrup, M.*, von Heydebreck, A.,Efferth, T.*, Poustka, A., Ringert, R.H.*, Jakse, G.*, Füzesi, L.*Prognostic impacts of cytogenetic in clear cell renal cellcarcinoma: gain of 5q31-qter predicts distinct clinical phenotypewith favourable prognosis. Cancer Res. 61 (2001) 7731-7738[39] Pitman, M.C.*, Huber, W., Horn, H.*, Krämer, A.*, Rice,, J.E.*,Swope W.C.*. FLASHFLOOD: A 3D field-based similarity searchand alignment method for flexible molecules. J. Computer-AidedMolecular Design 15 (2001) 587-612.[40] Von Heydebreck, A.*, Huber, W., Poustka, A., Vingron, M.*Identifying splits with clear separation: a new class discoverymethod for gene expression data. Intelligent Systems in MolecularBiology Meeting 2001. Bioinformatics 17 (2001) S107-S114[41] Von Heydebreck, A.*, Huber, W., Poustka, A., Vingron, M.* -Method, System and Use of the Method and the System forClassifying Gene Data. Provisional patent application filed 4 May01, number 01 110 154.0 (EPO) (2001)

[42] Beissbarth, T., Fellenberg, K., Brors, B., Arribas-Prat, R.,Boer, J., Hauser, N., Scheideler, M., Hoheisel, J., Schütz, G.,Poustka, A., Vingron, M.* Processing and quality control of DNAarray hybridization data. Bioinformatics 16 (2000) 1014-1022[43] Huber, W., von Heydebreck, A.*, Sültmann, H., Poustka, A.,Vingron, M.*, Data preprocessing and quality control for DNAarray expression profiling experiments. Currents in ComputationalMolecular Biology, Les Publications CRM, Montreal (2001).[44] Huber, W., von Heydebreck, A.*, Sültmann, H., Poustka, A.,Vingron, M.* Variance stabilization applied to microarray datacalibration and to the quantification of differential expression.Bioinformatics (2002) im Druck[45] Huber, W., Poustka, A., von Heydebreck, A.*, Vingron, M.*Variance stabilization applied to microarray data calibration and tothe quantification of differential expression. Provisional patentapplication filed Mar 28 (EPO) (2002).[46] Huber, W., Sawitzki, G. *, Sültmann, H., cDNA microarrays forgene expression analysis (Videofilm: http://www.dkfz.de/abt0840/). (2001)[47] Poustka, F.*, Klauck, S., Bölte, S.*, Poustka, A. Ergebnissekonzeptueller und genetischer Untersuchungen des Autismus. In:Aktuelle Forschung in der Kinder- und Jugendpsychiatrie. F.Poustka (Hrsg.), Lengerich: Pabst Verlag (2000) 69-90[48] International Molecular Genetic Study of Autism Consortium(IMGSAC). A genome wide wide screen for autism: strongevidence for linkage to chromosome 2q, 7q and 16p. Am. J. Hum.Genet. 69 (2001) 570-581[49] International Molecular Genetic Study of Autism Consortium(IMGSAC). Further characterization of the autism susceptibilitylocus AUTS1 on chromosome 7q. Hum. Mol. Genet. 10 (2001)973-982[50] Beyer K. Molekulargenetische Untersuchungen beim Autis-mus mit Schwerpunkt auf Chromosom 7q. Dissertation, Universi-tät Ulm (2001)[51] Beyer, K.S., Klauck, S.M., Wiemann, S., Poustka, A.Construction of a physical map of an autism susceptibility regionin 7q32.3-q33. Gene 272 (2001) 85-91[52] Newbury, D.F.*, Bonora, E.*, Lamb, J.A.*, Fisher, S.E.*, Lai,C.S.L.*, Baird, G.*, Jannoun, L.*, Slonims, V.*, Stott, C.M.*,Merricks, M.J.*, Bolton, P.F.*, Bailey, A.J.*, Monaco, A.P.*, Interna-tional Molecular Genetic Study of Autism Consortium (2002)FOXP2 is not a major susceptibility gene for autism or specificlanguage impairment. Am. J. Hum. Genet. 70 (2002) 1318-1327[53] Bonora, E.*, Bacchelli, E.*, Levy, R.E.*, Blasi, F.*, Marlow,A.*, Monaco, A.P.*, Maestrini, E.*, and IMGSAC. Mutationscreening and imprinting analysis of four candidate genes forautism in the 7q32 region. Molecular Psychiatry 7 (2002) 289-301[54] Beyer, K.S., Klauck, S.M., Benner, A., Poustka, F.*, Poustka,A. Association studies of the HOPA dodecamer duplication variantin different subtypes of autism. Am. J. Med. Genet.(Neuropsychiatric Genet.) 114 (2002) 110-115 [55] Beyer K.S., Blasi F.*, Bacchelli E.*, Klauck S.M., MaestriniE.*, Poustka, A., International Molecular Genetic Study of AutismConsortium (IMGSAC). Mutation analysis of the coding sequenceof the MeCP2 gene in infantile autism. Human Genetics (2002) imDruck [56] Wiemann, S., Weil, B.*, Wellenreuther, R., Gassenhuber, J.*,Glassl, S.*, Ansorge, W.*, Böcher, M.*, Blöcker, H.*, Bauersachs,S.*, Blum, H.*, Lauber, J.*, Düsterhöft, A.*, Beyer, A.*, Köhrer, K.*,Gruber, C.*, Mewes, W.*, Ottenwälder, B.*, Obermaier, B.*,Tampe, J.*, Heubner, D.*, Wambutt, R.*, Korn, B., Klein, M.,Poustka, A.. Towards a reference set of human genes andproteins: Sequencing and analysis of 500 novel full protein codingcDNAs. Genome Res. 11 (2001) 422-435[57] Thullner, S., Gesellchen, F., Wiemann, S., Pyerin, W., Kinzel,V., Bossemeyer, D. The protein kinase A catalytic subunit Cbeta2- Molecular characterization and distribution of the splice variant.Biochem. J. 351 (2000) 123-132

386




[58] Simpson, J.C. *, Wellenreuther, R., Poustka, A., Pepperkok,R.*, Wiemann, S. Systematic subcellular localization of novelproteins identified by large scale cDNA sequencing. EMBO Rep 1(2000) 287-292[59] Pepperkok, R. *, Simpson, J.*, Wiemann, S. Being in the rightlocation at the right time. Genome Biol 2 (2001) Reviews 1024[60] Simpson, J.C. *, Neubrand, V.E.*, Wiemann, S. andPepperkok, R.* Illuminating the human genome. Histochemistryand Cell Biology 115 (2001) 23-29[61] Breitling, F., Moldenhauer, G., Poustka, A. Selektion vonmonoklonalen Antikörpern. Am 11.01.2000 PCT Anmeldung unterder Nummer PCT DE00/00079. Internationale PatentanmeldungWO 00/42176-A1.[62] Schmiedl, A.*, Breitling, F., Winter, C.H. *, Queitsch, I. *, Dü-bel, S. * Effects of unpaired cysteines on yield, solubility andactivity of different recombinant antibody constructs expressed inE. coli. J. Immunol. Methods. 242 (2000) 101-114[63] Breitling, F., Dübel, S.* Construction of scFv from hybridomaby two-step cloning of the VH and VI domain. Chapter 2.2Antibody Engineering in Lab Manuals, Springer (2000)[64] Schmiedl, A.*, Breitling, F., Dübel, S.* Expression of abispecific dsFv-dsFv’ antibody fragment in E. coli. Protein Engi-neering 13 (2000) 725-734[65] Koch, J.*, Breitling, F., Dübel, S.* Rapid titration of multiplesamples of filamentous bacteriophage (M13) on nitrocellulosefilters. Biotechniques 29 (2000) 1196-1198, 2002[66] Rondot, S.*, Koch, J.*, Breitling, F., Dübel, S.* A helper phageto improve single-chain antibody presentation in phage display.Nat. Biotechnol, 19 (2001) 75-78Preise:[67] Breitling, F., Bischoff, R., Saffrich, R., Poustka, A., Hoffmann,T., Groß, KH., Breitling, F. 2. Preis im vom Land Baden-Württem-berg organisierten Businessplan Wettbewerb “Genius BiotechAward” (2001)[68] Breitling, F., Bischoff, R., Wallich, R.*, Poustka, A., Stadler, V.und Breitling, F. Gewinn des Innovationswettbewerbs Medizin-technik (2001).

387




GastwissenschaftlerProf. Xuan Liu ( - 09/00, Beijing, China)

Technische MitarbeiterAntje Seidel-RenkertMichaela SchleicherMichael GilbertChristian Baisch (11/01 - )

Molekulargenetik des MammakarzinomsU. Hamann

In Zusammenarbeit mit: S. Würtz, J. Hoheisel, C. Hoff, J. Mollen-hauer, A. Poustka, DKFZ; H. Frenzel, H.U. Ulmer, Städtisches Kli-nikum Karlsruhe; H.-P. Sinn, Pathologisches Institut der Universi-tät, Sektion Gynäkologische Pathologie, Heidelberg; H. Brauch,IKP, Stuttgart; T. Brüning, BGFA, Bochum; Y. Ko, Med. Poliklinik,Bonn; H. E. Wichmann, GSF-Forschungszentrum, Neuherberg; S.Narod, A. Liede, University of Toronto, Canada; N. K. Burki, A.Amin, SKMCH, Lahore, Pakistan; Breast Cancer Linkage Consor-tium

Das Mammakarzinom ist die häufigste bösartige Tumorer-krankung der Frau. Ungefähr jede zehnte Frau erkranktim Laufe ihres Lebens an einem Mammakarzinom. Diemeisten Mammakarzinome treten sporadisch auf und ent-stehen durch zufällige, nicht vererbbare Veränderungen inGenen. Etwa 5-10% der Mammakarzinome beruhen aufeiner genetischen Prädisposition, die in Familien vererbtwerden kann. Das Ziel unserer Arbeit ist die Identifizie-rung von genetischen und nicht-genetischen Faktoren, diean der Pathogenese des familiären und sporadischenMamma- und Ovarialkarzinoms beteiligt sind. Die Identifi-zierung dieser Faktoren und ihrer Veränderungen solldazu beitragen, die Entstehung und Progression desMammakarzinoms besser zu verstehen sowie die Früher-kennung dieser Erkrankungen zu verbessern.

1. Molekulare Analyse des familiärenMammakarzinoms

Bis heute sind nur wenige Gene bekannt, die für Mamma-und Ovarialkarzinome prädisponieren. Zu diesen gehörenBRCA1 (BReast CAncer gene 1) auf dem langen Arm vonChromosom 17 und BRCA2 (BReast CAncer gene 2) aufdem langen Arm von Chromosom 13. Die Art und Häufig-keit von BRCA1- und BRCA2-Keimbahnmutationen unter-scheiden sich stark in ethnischen Gruppen und Populatio-nen.

1.1 Founder-Mutation im BRCA1-GenDas Mutationsspektrum von BRCA1 umfasst hauptsäch-lich kleine Nukleotidveränderungen, die in den meistenFällen zum Abbruch der Translation führen. Die meistender angewandten Screening-Methoden beruhen auf PCR-basierenden Testsystemen an genomischer DNA. Mit die-sen Methoden ist es nicht möglich, große genomischeDNA-Alterationen zu erkennen. Dies könnte erklären, wa-rum bisher nur wenige große genomische Veränderungenidentifiziert wurden. Vor kurzem wurde eine 6-kb-Duplika-tion von Exon 13 identifiziert, welche zu einer Verschie-

bung des Leserahmens führt. Diese Mutation trat in dreinicht miteinander verwandten amerikanischen Familieneuropäischer Abstammung und einer portugiesischen Fa-milie auf.

Um die Häufigkeit und geographische Verschiedenheit vonTrägern dieser Mutation zu bestimmen, wurde eine inter-nationale Screening-Studie in 19 Ländern durchgeführt [1].3580 Studienteilnehmer hatten eine positive Familienvor-geschichte an Mamma- und Ovarialkarzinom und 934 wie-sen ein frühes Erkrankungsalter auf. Die 6 kb-Duplikationwurde in zehn Englisch-sprachigen Familien aus Austra-lien, Kanada, Amerika und Großbritannien und einer nichtEnglisch-sprachigen belgischen Familie festgestellt.Haplotyp-Analysen zeigten, daß diese Familien vermutlicheinen gemeinsamen Vorfahren nordbritischer Herkunft ha-ben. Auf grund dieser Ergebnisse wurde den Laboratorienin Englisch-sprachigen Ländern oder solchen, die mitGroßbritannien in geschichtlichem Zusammenhang ste-hen, empfohlen, diese nicht PCR-basierte Methode in ihrBRCA1-Screening Protokoll aufzunehmen.

1.2 BRCA1-Mutationsstatus als progostischerParameter

Es ist unklar, ob sich die Prognose des hereditären Mam-makarzinoms von der des sporadischen Mammakarzi-noms unterscheidet. Pathologische Parameter lassen ver-muten, daß Unterschiede zwischen den beiden Krank-heitsformen bestehen. Weitere Hinweise auf biologischeUnterschiede können Überlebenszeitstudien liefern.

Um festzustellen, ob dem BRCA1-Mutationsstatus eineprognostische Bedeutung zukommt, wurde der klinischeKrankheitsverlauf bei Patientinnen mit einer familiären Be-lastung mit dem BRCA1-Mutationsstatus korreliert. Dabeistellte sich heraus, daß Patientinnen mit einer BRCA1-Mu-tation ein deutlich schlechteres krankheitsfreies Überlebenaufwiesen als Patientinnen ohne eine BRCA1-Mutation[2]. Aufgrund des wesentlich niedrigeren Erkrankungsal-ters der Patientinnen mit einer BRCA1-Mutation wurde derKrankheitsverlauf in Abhängigkeit vom Lebensalter in Un-tergruppenanalysen bestimmt. Es zeigte sich, daß Patien-tinnen, die vor dem 41. Lebensjahr an einem Mammakar-zinom erkrankt waren, einen vom BRCA1-Mutationsstatusunabhängigen, signifikant ungünstigeren Verlauf aufwie-sen als Patientinnen, die nach dem 41. Lebensjahr er-krankt waren. In beiden Altersklassen hatte die BRCA1-Mutation keinen zusätzlichen ungünstigen Einfluß auf dasÜberleben. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß derBRCA1-Mutationsstatus keinen unabhängigen Prognose-faktor darstellt.

1.3 BRCA2-Genotyp-Phänotyp-KorrelationenFrauen mit einer BRCA2-Mutation haben ein hohes Risiko,im Laufe ihres Lebens an einem Mamma- oder Ovarialkar-zinom zu erkranken, während Männer erhöhte Risiken fürMamma- und Prostatakarzinome haben.

Um zu klären, ob Veränderungen in den Erkrankungsrisi-ken mit unterschiedlichen Mutationen assoziiert sind, wur-

Arbeitsgruppe: Molekulargenetik des Mammakarzinoms (H0602)Priv.-Doz. Dr. Ute Hamann

388




den Genotyp-Phenotyp-Korrelationsanalysen an 164BRCA2-positiven Mamma/Ovarialkarzinomfamilien in einergroßen multizentrischen Studie mit dem Breast CancerLinkage Consortium durchgeführt. Die Ergebnisse bestä-tigten, daß Familien mit Mutationen in der zentralen Gen-region, der sogenannten Ovarian Cancer Cluster Region(OCCR), einen signifikant höheren Anteil von Ovarialkarzi-nomen aufwiesen als Familien mit Mutationen außerhalbdieser Region. Weiterhin zeigte sich, daß OCCR-Mutatio-nen bei Frauen mit einem signifikant niedrigeren Risiko fürMammakarzinome und einem signifikant höheren Risikofür Ovarialkarzinome assoziiert sind und bei Männern miteinem niedrigeren Risiko für Prostatakarzinome [3]. DieBestimmung von Genotyp-Phänotyp-Korrelationen istwichtig für die genetische Beratung und das klinische Ma-nagement von BRCA2-Mutationsträgern.

2. Mammakarzinomrisiko und prädiktiveFaktoren: Assoziation mit genetischenPolymorphismen und Expression vonEnzymen des Fremdstoffmetabolismus

Ein Schwerpunkt dieser Arbeiten ist die Identifizierung vonRisikofaktoren und prädiktiven Faktoren für das Mamma-karzinom. Auf der klinischen Grundlage einer Fall- undprospektiven Therapiestudie wird die Bedeutung einerReihe von potentiell relevanten Polymorphismen in fremd-stoffmetabolisierenden Enzymen, Tumorsuppressoren,Signaltransportern und Wachstumsfaktoren durch Geno-typ/Phänotyp-Korrelationen bei gesunden und erkranktenFrauen sowie durch Expressionsstudien an Mammakarzi-nomen untersucht. Die epidemiologischen, molekularbio-logischen, immunhistochemischen und klinischen Datensollen in univariater und multivariater Analyse auf ihre Aus-sagefähigkeit bezüglich eines Mammakarzinomrisikosund/oder Tumoransprechbarkeit ausgewertet werden.

Das Gesamtkollektiv wird 600 inzidente Brustkrebsfälleund 1200 Bevölkerungskontrollen umfassen. Die Abschät-zung der Risiken äußerer Einflüsse wie Ernährung, Rau-chen, Beruf und Umwelt sowie die Abhängigkeit von dengenetischen Polymorphismen für die Entstehung desMammakarzinoms soll einen Beitrag für die Entwicklungvon wirksamen Ansätzen zur Prävention dieser Krankheitleisten.

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] The BRCA1 exon 13 duplication screening group (2000) Theexon 13 duplication in the BRCA1 gene is a founder mutationpresent in geographically diverse populations. Am. J. Hum.Genet. 67:207.[2] Hamann, U. and *Sinn, H.-P. (2000) Survival and tumorcharacteristics of German hereditary breast cancer patients.Breast Cancer Res. Treatment 59:185.[3] *Thompson, D., *Easton, D., on behalf of the Breast CancerLinkage Consortium (2001) Variation in cancer risks by mutationposition in BRCA2 mutation carriers. Am. J. Hum. Genet. 68:410.[4] *Lakhani, S.R., *Gusterson, B.A., *Jacquemier, J., *Sloane,J.P., *Anderson, T.J., *van de Vijver, M.J., *Venter, D., *Freeman,A., *Antoniou, A., *McGuffog, L., *Smyth, E., *Steel, C.M.,*Haites, N., *Scott, R.J., *Goldgar, D., *Neuhausen, S., *Daly,P.A., *Ormiston, W., *McManus, R., *Scherneck, S., *Ponder,B.A.J., *Futreal, P.A., *Peto, J., *Stoppa-Lyonnet, D., *Bignon, Y.-J., *Struewing, J.P., *Bishop, D.T., *Klijn, J.G.M., *Devilee, P.,*Cornelisse, C.J., *Lasset, C., *Lenoir, G., *Barkardottir, R.B.,*Egilsson, V., Hamann, U., Chang-Claude, J., *Sobol, H., *Weber,B., *Easton, D.F. and *Stratton, M.R. (2000) The pathology offamilial breast cancer: Histological features of cancers in familiesnot due to mutations in BRCA1 or BRCA2. Clin. Cancer Res.6:782.[5] Hoff, C., Mollenhauer, J., Waldau, B., Hamann, U. andPoustka, A. (2001) Allelic imbalance and fine mapping of thechromosome 17p13.3 subregion in sporadic breast cancer.Cancer Genet. Cytogenet. 129:145.

389


AbteilungH0700Organisation komplexer Genome


Wissenschaftliche MitarbeiterPD Dr. Stefan JoosDr Jörg Kalla (-12/00))Dr. Manfred Küpper (-12/00)Dr. Stefan Lampel (-06/00)Dr. Antoaneta MinchevaDr. Armin PschererDr. Karsten RichterDr. Claudia SchaffnerDr. Anja Soder (-08/00)Dr. Solinas-ToldoDr.Stephan WolfDr. Michelle NeßlingDr. Meinhard Hahn (07/01-)Dr. Bernhard Radlwimmer (12/01-)Dr. Kai Neben (06/01-)

GastwissenschaftlerDr. Anton Hopman (-06/00)Prof. Donald Olins (03-04/00) und (02-03/01)Prof. Ada Olins (03-04/00) und (02-03/01)Dr. Swen Wessendorf (01-12/00)Dr. Carsten Schwänen (01/00-)

Doktoranden Technische MitarbeiterMartyna Adamowicz (12/00-) Heidi KramerBjörn Fritz (01/00-) Frauke DevensSabine Görisch (010/00 -) Sibylle OhlFelix Kokocinski (05/00-) Magdalena SchlotterChristian Korz (03/00 -) Tajana SalviDaniel Mertens Kathrin WildenbergerLars Hummerich (08/01 -) Andrea WittmannMarkus Scheuermann (05/00-) Petra SchröterGunnar Wrobel Daniela BodemerJörg Schlingemann (11/01-)Cordula Tschuch (03/01-)

DiplomandenTina Schwarz (-06/01)Indira Umareddy (-12/01)Olaf Thürigen (11/01-)

EngineerDaniel Göttel

SekretärinMargit Michaeli-MacLeod

Im Zentrum der Arbeiten der Abteilung Molekulare Gene-tik stehen folgende Themen: (I) Die Untersuchung der ge-netischen Veränderungen bei bestimmten hämatolo-gischen Neoplasien (maligne Lymphome und myeloischeLeukämien) und soliden Tumoren (Schwerpunkte: Tumo-ren des zentralen Nervensystems, Weichgewebe-sarkome). Die Charakterisierung rekurrenter Veränderun-gen wird mit dem Ziel durchgeführt, a) neue prognostischeMarker von klinischer Relevanz zu identifizieren, b) einenBeitrag zur Klassifizierung von Tumoren unter Verwen-dung genetischer Daten zu leisten und insbesondere c)neue genomische Regionen mit pathogenetisch relevan-ten Sequenzen zu identifizieren. Ein wichtiges Ziel der Ar-beiten dieser Abteilung ist die Isolation und Charakterisie-rung neuer Tumorsuppressorgene aus einigen ausgesuch-ten Regionen, die bei bestimmten Leukämien rekurrentverändert sind. Dies erfolgt mit Hilfe von Verfahren der po-sitionellen Klonierung. (II) Entwicklung neuer diagno-stischer Verfahren unter Verwendung von DNA-Chip-Tech-nologie. Das in der Abteilung kürzlich entwickelte Verfah-ren der sog. Matrix-CGH (”Matrix Comparative GenomicHybridization”) soll automatisiert werden, um es sowohl fürmolekulargenetische Analysen als auch für klinisch-dia-gnostische Anwendungen im großen Maßstab zugänglichzu machen. (III) Charakterisierung der räumlichen Organi-sation des Genoms von Mensch und Maus. Hierzu wirddie in situ- Verteilung spezifischer genomischer Regioneninnerhalb von Chromosomenterritorien im Zellkern sowiedie Verteilung interchromosomaler, nuklearer Komponen-ten untersucht. Mit diesen Arbeiten soll u.a. ein Modell zur3-D-Genomorganisation getestet werden, welches vorher-sagt, dass transkriptionell aktive Gene in einem sog. Inter-chromosomen-Domänen-Kompartiment angeordnet sind,das durch die Peripherie der Chromosomenterritorien defi-niert wird und in dem Transkription, Prozessierung undTransport von RNAs stattfindet. (IV) Chromosomale Kar-tierung von Genen bei Mensch und Maus, um Informationüber die lineare Organisation von Genfamilien zu erhalten,und um über die Kartierung Hinweise auf genetischeKrankheiten (Erbkrankheiten bzw. Krebs) zu erhalten, beidenen diese Gene eine Rolle spielen könnten.

Abteilung Molekulare Genetik (H0700)Leiter: Prof. Dr. Peter Lichter

390




Räumliche Organisation des SäugergenomsK. Richter; P. Lichter

Zur Untersuchung der Genomorganisation werden zweiThemenkomplexe bearbeitet: die lineare Anordnung vonGenomabschnitten entlang der Chromosomen, und die Ar-chitektur des Interphasezellkerns.

Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) spezifischer,markierter DNA-Sequenzen auf Metaphasechromosomenerlaubt die Lokalisation der entsprechenden Genomab-schnitte mit einer Genauigkeit von etwa 2 MBp. Neben derZuordnung bekannter Gene auf Metaphasebanden wirddie Technik zur Detektion von krebsverantwortlichenRelokalisationen eingesetzt.

Moderne Verfahren zur Lokalisation spezifischer Zellkern-moleküle legen nahe, dass der Interphasezellkern in funk-tionelle Domänen gegliedert ist. Ausgehend von der Beob-achtung, dass sich die Chromosomen auch im Interphase-Zellkern nicht vermischen, sondern getrennt voneinandersogenannte Chromosomenterritorien ausfüllen arbeitenwir an der Fragestellung, ob dem Raum zwischen den Ter-ritorien eine funktionelle Bedeutung zukommt (ICD: inter-chromosomal domain). Es wird vermutet, dass Transport-vorgänge im ICD schneller ablaufen als innerhalb derChromosomenterritorien, und dass deswegen transport-abhängige Prozesse, wie z.B. die RNA-Transkription, anden ICD gebunden sind. Das Konzept des ICD wird ge-stützt durch die Beobachtung, dass Anreicherungen vonProteinen oder Nukleoproteinen im Zellkern (“nuclearbodies” wie z.B. interchromatin granule clusters, Cajalbodies, PML-bodies) mit den Chromosomenterritoriennicht kolokalisieren. Auch ektopisch im Zellkern expri-mierte Proteine sind häufig fokal konzentriert. Bridger etal. J. Cell Sci 111 (1998) 1241-1253 konnten für dasModellsystem NLS-Vimentin explizit zeigen, dass die sichim Zellkern akkumulierenden Proteinaggregate nicht mitden Chromosomenterritorien vermischen.

Methodisch haben wir Protokolle zur FISH (Fluorescence-In-Situ-Hybridization ) spezifischer Nukleisäuresequenzenund zur Lebend-Fluoreszenzmarkierung spezifischer Pro-teine etabliert die es erlauben, deren Verteilung im Zell-kern zu untersuchen. Mit einem moderen konfokalen Licht-mikroskop kann die Dynamik der Signale in lebenden Zel-len aufgezeichnet werden, eine Methode zur korrelieren-den Elektronenmikroskopie ermöglicht die strukturauflö-sende Analyse der Fluoreszenzsignale.

Für den Nachweis eines funktionellen ICD beschäftigenwir uns mit folgenden Themen:- Gemäss der ICD-Hypothese und älterer Untersuchun-

gen unserer Arbeitsgruppe sollten aktive Gene zur Peri-pherie der Chromosomenterritorien orientiert sein.Tajbakhsh et al. [4] verglichen die räumliche Verteilungvon AT-reichen und CG-reichen Sequenzen innerhalbidentifizierter Chromosomen nach FISH-Markierung. DasAt-reiche, genomisch inaktive Chromatin konzentriertsich im Innern der Chromosomenterritorien, sodass ander Peripherie CG-reiche Sequenzen dominieren.[Scheuermann et al. in Vorbereitung]

- Der Chromosomensatz des indischen Muntjak, ein Paar-hufer, besteht aus nur drei. Autosomen. Das Chromatineiner weiblichen Zelle kann also mit nur vier Farbenkomplett chromosomenspezifisch markiert werden. Aneiner solchen Markierung hoffen wir die räumliche Aus-dehnung des kompletten ICD einer Zelle zeigen zu kön-nen. Die Entwicklung der entsprechenden Chromoso-menpaints ist eine Zusammenarbeit mit A. Murmann(Chicago).

- Das Transkript des Human T-Cell Leucaemia Virus(HTLV) enthält Nukleotidsequenzen, die den Export insNucleoplasma verhindern. Verschiedene gentechnischeModifikationen sind bekannt, deren Transkript zum Teil ingrossen Mengen retikulär im Zellkern akumuliert (Bridgeret al. in preparation). Der Zusammenhang der Verteilungdieser spezifischen RNA und der territorialen Ausdeh-nung der Chromosomen soll im weiteren gezeigt wer-den.

- Im Zusammenhang mit den Versuchen mit NLS-Vimen-tin, eine Zusammenarbeit mit Harald Herrmann (DKFZ),untersuchen wir die Verteilung anderer endo- und exo-gener Proteine im Zellkern. Kolokalisationsexperimentezeigen, dass Proteinaggregate unterschiedlicher Spezi-es mit auffälliger Häufigkeit in direkter Nachbarschaft lo-kalisieren.

Entwicklung von DNA-Chips für diegenomische DNA-Analyse von TumorenM. Nessling, P. Lichter

Ein auf DNA-Microchips basierender Ansatz der verglei-chenden genomischen Hybridisierung (Matrix-CGH), beidem die Metaphase-Chromosomen durch geordnete, aufeiner Glasoberfläche immobilisierte DNA-Fragmente, er-setzt werden, liefert im Vergleich zur konventionellen CGHneben einer höheren Auflösung (abhängig von der Größeder DNA-Fragmente) auch eine Grundlage für die automa-tisierte Analyse genomischer Imbalancen. Mit einer ver-gleichenden genomischen Hybridisierung gegen eine sol-che Matrix aus DNA-Proben (wie z.B. Cosmide, PACsoder BACs) werden aus dem Verhältnis der Fluoreszenz-signale von Test- und Kontroll-DNA Zugewinne oder Verlu-ste an genetischem Material mit einer Auflösung von biszu ca. 100 kB nachgewiesen. Im Rahmen der Automatisie-rung des Matrix-CGH Verfahrens, das insbesondere dieProduktion der DNA-Microchips und die Auswertung derFluoreszenzen betraf, erfolgte eine weitere Anpassungund Optimierung des bereits entwickelten Protokolls [40].

Im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzes(NGFN) bestehen mit verschiedenen Kliniken und For-schungseinrichtungen Kollaborationen, um das Verfahrender Matrix-CGH gezielt für die Bearbeitung definierter Fra-gestellungen einzuetzen. Für die jeweilige fokussierte An-wendung wurden spezifische DNA-Microarrays von unsgeneriert:� Ein krankheitsspezifischer DNA-Microchip, der die

schnelle und parallelisierte Analyse der prognostisch re-levanten chromosomalen Veränderungen der B-CLLund MCL (siehe oben) ermöglicht. Ein entsprechender

391




Chip wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Döhner (Uni-versität Ulm) entwickelt und intensiven Tests unterzo-gen. Derzeit wird in einer „Blindstudie“ die Sensitivitätdes B-CLL-Chips an einer Serie von Tumorprobenüberprüft [47].

� Zur Eingrenzung pathogenetisch relevanter Kandida-tengenregionen und Identifizierung der betroffenenGene, wie im Fall von Amplifikationen oder Deletionen,können DNA-Microarrays eingesetzt werden, die über-lappende oder benachbarte chromosomale Sequenzenals Targets beinhalten. Die Feinkartierung von Amplifi-kationen, die mit chromosomaler CGH in Glioblastomenund B-Zell Lymphomen auf Chromosom 13 und 12nachgewiesen wurden (in Kollaborationen mit Prof.Reifenberger, Universität Düsseldorf, Dr. Bentz, Univer-sität Ulm und R. Kucherlapati, Albert Einstein CollegeNew York, USA) und die Definition der minimal dele-tierten Region auf Chromosom 4 in Ovarialkarzinomen(Kollaboration mit Prof. Arnold, Universität Kiel) werdenderzeit mit solchen Chips angestrebt.

� Ein Onkogen/Tumorsuppressorgen-spezifischer Chipläßt es zu, in einem einzigen Experiment genomischeImbalanzen dieser pathogenetisch relevanten Gene in-nerhalb eines Tumors nachzuweisen. Ein solcher Chip,bestehend aus spezifischen DNA-Fragmenten für 60Onkogene und 29 Tumorsuppressorgene, wurde in un-serer Gruppe aufgebaut und wird zur Untersuchung vonMammakarzinomen, non-Hodgkin Lymphomen [48](Kollaboration mit Dr. Bentz, Universität Ulm), Liposar-komen [46] (Kollaboration mit Dr. Mechtersheimer, Uni-versität Heidelberg) und verschiedenen Gehirntumoren(Kollaboration mit Prof. Reifenberger, Universität Düs-seldorf) eingesetzt.

Expression-Profiling durch MicroarraysM. Hahn, L. Hummerich, F. Kokocinski, P. Lichter,K. Neben, J. Schlingemann, O. Thürigen, G. W robel

In Zusammenarbeit mit: Peter Angel, DKFZ; Hartmut Döhner,Martin Bentz, Stephan Stilgenbauer und Thomas Gress, InnereMedizin, Universität Ulm; Guido Reifenberger, Neuropathologie,Universität Düsseldorf; Alwin Krämer, Medizinische Poliklinik, Uni-versität Heidelberg; Gunhild Mechtersheimer, Pathologie, Univer-sität Heidelberg; Klaus K. Wilgenbus, Boehringer Ingelheim; Ada& Don Olins, Scarborough, Maine, USA und vielen anderen, hiervor allem Kollegen im Rahmen des Nationalen Genom-forschungsnetzwerks (NGFN).

Genprodukte entfalten ihre biologische Wirkung in einemkomplexen, zeitlich und räumlich geordneten Muster, wel-ches u. a. in Abhängigkeit von der molekularen und zellu-lären Umgebung steht. Die Kenntnis der qualitativen undquantitativen Genexpressions-Muster bzw. “Profile” inner-halb eines Zell- oder Gewebetyps ist deshalb von zentralerBedeutung für das Verständnis der Funktion und Aktivitätspezifischer Genprodukte innerhalb komplexer biologi-scher Prozesse. Umfassende (“globale”) Genexpressions-profile eines gegebenen Zell- oder Gewebetyps könnenauf Ebene des Transkriptoms analysiert werden, welcheswesentlich daran beteiligt ist, den komplexen molekularenPhänotyp einer Zelle zu determinieren. Die Analyse sol-cher globalen Expressionsprofile gestattet es, dynamische

molekulare Änderungen zu erfassen, die u.a. einhergehenkönnen mit Zelldifferenzierung, Zellproliferation, Apoptose,spezifischen Entwicklungsstufen und Krankheitszuständen(z.B. Tumorerkrankungen) oder der zellulären Antwort aufpharmazeutische Wirkstoffe und Behandlungen.

In unserer Gruppe sind wir vorrangig daran interessiert,Genexpressionsprofile menschlicher Tumoren zu analysie-ren. Hierdurch sollen wichtige Erkenntnisse gewonnenwerden, z.B. über die Aktion/Regulation von Genen unbe-kannter Funktion oder über krankheitsspezifische zelluläreRegulationswege (“pathways”). Für die Bearbeitung dieserFragestellung setzen wir in unserem Labor die Microarray-Technik ein. Hierzu werden auf einer Glasoberfläche PCR-amplifizierte, gen-spezifische cDNA-Fragmente immobili-siert, mit denen anschließend die aus der Tumorprobe iso-lierten Transkripte in Form Fluorophor-markierter cDNAanalysiert werden. Wir haben u. a. einen “OncoChip” mitüber 4000 verschiedenen genspezifischen Sonden entwik-kelt, welche für Gene mit bekannter onkologisch / hämato-logischer Bedeutung (u.a. involviert in Zellzyklus, Apopto-se-Induktion, Erythropoese, Mitose) spezifisch sind. Hier-über können umfassende Expressionsprofile Krebs-rele-vanter Gene erstellt werden. Dieser Microarray wird so-wohl zur Profilierung hämatologischer Neoplasien genutztals auch von Tumoren des zentralen Nervensystems (z. B.Meningiome). Diese Studien werden ergänzt und verifiziertdurch quantitative real-time-PCR-Versuchsreihen(TaqMan-PCR). So konnten an der promyeloischen Zell-linie HL-60, die sich bei Stimulus mit TPA oder Retinsäureunterschiedlich differenziert, wichtige Erkenntnisse zur Re-gulation dieses Differenzierungsgeschehens gewonnenwerden.

In Zusammenarbeit mit Dr. Klaus Wilgenbus und dessenKollegen von Boehringer Ingelheim wurden zudem umfas-sende Analysen der Expressionsprofile von B-Zellen ausB-CLL-Patienten durchgeführt. Hierbei kamen verschiede-ne kommerziell verfügbare Microarray-Plattformen zumEinsatz. Es konnte eine Reihe von Genen identifiziert wer-den, die in den aus peripherem Blut gewonnenen B-Zellendieser B-CLL-Patienten eine erhöhte Expression aufwies.Solche Gene dieser Gruppe, die in chromosomalen Berei-chen mit häufigen, tumorspezifischen Alterationen lokali-sieren, sind vorwiegend an der Zellzykluskontrolle und Re-gulation der Apoptose beteiligt. Weitere, über ihre verän-derte Expression identifizierte Gene zeigen ihre zelluläreFunktion hingegen vorwiegend in der Zell-Zell-Interaktion.

Weiterhin wurde ein Microarray für die Analyse murinerExpressionsprofile hergestellt, der 10.000 verschiedeneGene der Maus repräsentiert (10k-Microarray). Hierdurchkann nun auch das für die Tumorforschung äußerst wichti-ge Tiermodell “Maus” mittels dieser Technik erschlossenwerden. In ersten Studien konnten zahlreiche Gene identi-fiziert werden, die in der Maus an der mehrstufigen Entste-hung von Hauttumoren unter Einfluß des TumorpromotersTPA beteiligt sind. Diese Ergebnisse wurden durch quanti-tative real-time-PCR bestätigt. Aufbauend auf den Erfah-rungen mit dem 10k-Microarray befindet sich ein muriner20k-Microarray in der Entwicklung.

392




Durch umfassende methodische Optimierungsarbeiten,die u.a. die Art der verwendeten Glasoberfläche, Spotting-Pufferrezeptur, Minimierung der Hintergrund-Fluoreszenzund erzielbare Spott-Dichte umfassten, konnte ein Proto-koll entwickelt werden, welches die Aufbringung von bis zu40.000 genspezifischen Sonden auf einer Glasoberflächeermöglicht. Hierdurch sind nun selbst geringe MengenProbenmaterial der Analyse durch die Microarray-Technikzugänglich, zahlreiche tumorrelevante Fragestellungenlassen sich deshalb hierüber experimentell untersuchen.

Die genannten Microarray-Typen werden im Rahmen zahl-reicher wissenschaftlicher Kooperationen für Forschungs-zwecke genutzt, hier vor allem innerhalb des NGFN-Ver-bundes. Expressionsprofile werden in der nahen Zukunftzahlreiche Aspekte biochemischer Pathways, die an denPathomechanismen der untersuchten Tumortypen beteiligtsind, entschlüsseln. [29, 49]

Solide TumorenS. Joos, P. Lichter

Kollaboration mit G. Mechtersheimer, Pathologie der UniversitätHeidelberg. Raju Kucherlapati, Dept. of Molecular Genetics, Al-bert-Einstein College of Medicine, New York, USA.

Ein Schwerpunkt unserer Untersuchungen lag in der Ana-lyse zytogenetischer Veränderungen von Weichteiltumo-ren. Mittels der CGH fanden sich in einer Serie von14 Leiomyosarkomen eine hohe Anzahl chromosomalerImbalancen [18]Die am häufigsten überrepresentiertenSubregionen waren 5p15.2-p15.3 und Xp11.3-p21.3(50%), sowie 8q24, 15q25-q26 und 17p11-p12 (43%). Ins-gesamt 20 distinkte Amplifikationen wurden identifiziert,wobei bestimmte Regionen in verschiedenen LMS Fällenwiederholt betroffen waren (5p12, 17p11-p12 und Xp11.3-p21). Auffallend war die Häufigkeit der chromosomalenVerluste von Chromosom 13 (80%) und 10q (43%). Insge-samt ergaben sich aus dieser Studie eine Anzahl für diePathogenese der LMS wichtigen Kandidatengene, wiez.B. MYC (8q24), und dessen Antagonisten MAD (2p13)und MXI1 (10q25), sowie die für die Ubiquitin-vermittelteProteindegradation wichtigen Gene SKP2 (5p13), TRE(17p11-p12) und UBE1 (Xp11.3).

Untersuchungen an Liposarkomen betrafen vor allem denpleomorphen und dedifferenzierten Subtyp [42, 46, 52].Unter diesen zeigten sich mittels CGH klar unterschiedli-che Muster chromosomaler Imbalancen. In pleomorphenLiposarkomen wurden vor allem Zugewinne der Subban-den 5p13-p15, 1p21, 1q21-q22 und 7q22 identifiziert,während die dedifferenzierten Fälle alle durch hochgradi-ge Amplifikationen der Region 12q13-q21 charakterisiertwaren. Durch den Einsatz der Matrix-CGH konnte mit Hilfeeines in unserem Labor hergestellten DNA-Chips, der diemeisten heute bekannten Onkogene und Tumorsupres-sorgene enthält („Onkochip“) [40] häufig Zugewinne derOnkogene MYB, Cyclin D1, Cyclin D2, MDM2, CDK4, undGLI identifiziert werden. In einigen Fällen korellierte diesmit einer erhöhten Genexpression, was durch c-DNA „ex-pression profiling“ und quantitative RT-PCR gezeigt wurde.Schließlich konnte mit einem weiteren DNA-Chip, der 112

BAC Klone entlang des langen Arms von Chromosom 12enthielt, die Struktur der hochgradigen Amplifikationen indiesen Tumoren mit hoher Auflösung analysiert werden.

Maligne LymphomeIn Kollaboration mit Peter Möller, Pathologie der Universität Ulm;Prof. Michael Pfreundschuh, Abt. Innere Medizin der UniversitätHomburg/Saar, Prof. Lorenz Trümper, Abt. für Hämatologie undOnkologie der Universität Göttingen.

In Zusammenarbeit mit der Gruppe um Prof. Peter Möllerwurde das Primär Mediastinale B-Zell Lymphom (MBL) un-tersucht [25, 50, 51]. Mittels CGH und Interphase-FISHfanden sich charakteristische Zugewinne des kurzen Armsvon Chromosom 9 in über 70% der Fälle. Ein wichtigesKandidatendgen innerhalb dieser Region ist das Januski-nasegen JAK2 (9p24), welches eine Schlüsselrolle bei derSignaltransduktion bestimmter Zytokine spielt. Ein weitererSchwerpunkt lag auf Untersuchungen von Hodgkin Lym-phomen [27, 39, 52]. Hier liegt der Anteil der eigentlichenTumorzellen (sog. Hodgkin- und Reed-Sternberg-Zellen)bei nur etwa 1%, sodaß diese Zellen für zytogenetischeUntersuchungen zunächst mittels Mikrodissektion isoliertwerden mußten. Nach universeller PCR und CGH konntencharakteristische Chromosomenveränderungen in40 Hodgkin Lymphomen identifiziert werden. Vor allem Zu-gewinne des kurzen Arms von Chromosom 2 und vonChromosom 9p traten in etwa 50% bzw. 25% aller Fälleauf. Aufgrund weiterer Untersuchungen mittels Interphase-Zytogenetik erscheinen die Onkogene MDM2, JAK2 undcREL eine wichtige Rolle bei der Entstehung des HodgkinLymphoms zu spielen.

Tumor-spezifische Veränderungen der Chromatinstrukturwurden schließlich an Zelllinien des Burkitt-Lymphoms un-tersucht. Mittels sogenanter Halo-Präparationen von Zell-kernen, die mit spezifischen DNA-Proben hybridisiert wur-den, konnte eine bestimmte Region 3´ des MYC-Onko-gens definiert werden, welche auf translozierten Chromo-somen am Kernchromatin fixiert ist. MYC-Allele, die aufnicht-translozierten Chromosomen liegen, zeigten in die-ser Region keine Chomatinfixierung [38].

Publikationen (* = externe Koautoren)[1] Weber, T., Weber, R.G., *Kaulich, K., Actor, B., *Meyer-Puttlitz,B., Lampel, S., *Büschges, R., *Weigel, R., Deckert-Schlüter, M.,Schmiedek, P., Reifenberger, G., Lichter, P. (2000) Characteristicchromosomal imbalances in primary central nervous systemlymphomas of the diffuse large B-cell type. Brain Pathol. 10, 73-84[2] *Olins, A.L., Herrmann, H., Lichter, P., *Olins, D.E. (2000)Retinoic acid differentiation of HL-60 cells promotes cytoskeletalpolarization. Exp. Cell Res. 254, 130-142[3] Dohna, M., *Reincke, M., Mincheva, A., *Allolio, B., Solinas-Toldo, S., Lichter, P. (2000) Adrenocortical carcinoma ischaracterized by a high frequency of chromosomal gains and highlevel amplifications. Genes Chromosom. Cancer 28, 145-152[4] Tajbakhsh, J., *Luz, H., *Bornfleth, H., Lampel, S., *Cremer,C., Lichter, P. (2000) Spatial distribution of GC- and AT-rich DNAsequences within human chromosome territories. Exp. Cell Res.255, 229-237[5] *Barth, T.F.E., Benner, A., *Bentz, M., *Döhner, H., *Möller, P.,Lichter, P. (2000) Risk of false positive results in comparativegenomic hybridization. Genes Chromosom. Cancer 28, 353-357

393




[6] Schaffner, C., Idler, I., *Stilgenbauer, S., *Döhner, H., Lichter,P. (2000) Mantle cell lymphoma is characterized by inactivation ofthe ATM gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2773-2778[7] Joos, S., Küpper, M., Ohl, S., *von Bonin, F., *Mechtersheimer,G., *Bentz, M., *Marynen, P., *Möller, P., *Pfreundschuh, M.,*Trümper, L., Lichter, P. (2000) Genomic imbalances includingamplification of the tyrosine kinase gene JAK2 in CD30+ Hodgkincells. Cancer Res. 60, 549-552[8] Reichenzeller, M., Burzlaff, A., Lichter, P., Herrmann, H. (2000)In vivo observation of a nuclear channel-like system: Evidence fora distinct interchromosomal domain compartment in interphasecells. J. Struct. Biol. 129, 175-185[9] *Campbell, H.D., *Fountain, S., *Young, I.G., Weitz, S., Lichter,P., Hoheisel, J.D. (2000) Fliih, the murine homologue of theDrosophila melanogaster flightless-I gene: genomic structure,chromosomal mapping and overlap with Llglh. DNA Seq. 11, 29-40[10] Taraviras, S., Mantamadiotis, T., Dong-Si, T., Mincheva, A.,Lichter, P., *Drewes, T., *Ryffel, G.U., Monaghan, A.P., Schütz,(2000) Primary structure, chromosomal mapping, expression andtranscriptional activity of murine hepatocyte nuclear factor 4g.Biochim. Biophys. Acta 1490, 21-32[11] *Hübener, C., Mincheva, A., Lichter, P., *Schraven, B.,*Bruyns, E. (2000) Genomic organization and chromosomallocalization of the human gene encoding the T-cell receptor-interacting molecule (TRIM). Immunogenetics 51,154-158[12] *Betz, R., *Rensing, C., *Otto, E., Mincheva, A., *Zehnder, D.,Lichter, P., *Hildebrandt, F. (2000) Children with ocular motorapraxia type Cogan carry deletions in the gene (NPHP1) juvenilenephronophthisis. J. Pediatr. 136, 828-831[13] *Bentz, M., *Plesch, A., *Bullinger, L., *Stilgenbauer, S., *Ott,G., *Müller-Hermelink, H.K., Baudis, M., *Barth, T.F., *Möller, P.,Lichter, P., *Döhner, H. (2000) t(11;14)-positive mantle celllymphomas exhibit complex karyotypes and share similarities withB-cell chronic lymphocytic leukemia. Genes Chromosom.Cancer 27, 285-294[14] *Bullinger, L., *Leupolt, E., Schaffner, C., Mertens, D., *Bentz,M., Lichter, P., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S. (2000) BCL10 is notthe gene inactivated by mutation in the 1p22 deletion region inmantle cell lymphoma. Leukemia 14, 1490-1492[15] *Beuschlein, F., *Strasburger, C.J., *Siegerstetter, V.,*Moradpour, D., Lichter, P., *Bidlingmaier, M., *Blum, H.E.,*Reincke, M. (2000) Acromegaly caused by growth hormonesecretion by a malignant non-Hodgkin’s lymphoma. New Engl. J.Med. 342, 1871-1876[16] Cziepluch, C., Lampel, S., Grewenig, A., Grund, C., Lichter,P., Rommelaere, J. (2000) H-1 parvovirus-associated replicationbodies: a distinct virus-induced nuclear structure. J. Virol. 74,4807-4815[17] Weber, R.G., *Pietsch, T., *von Schweinitz, D., Lichter, P.(2000) Characterization of genomic alterations inhepatoblastomas: A role for gains on chromosome 8q and 2 aspredictors for poor outcome. Am. J. Pathol. 157, 571-578[18] *Otano-Joos, M., *Mechtersheimer, G., Ohl, S., *Wilgenbus,K.K., *Scheuerlen, W., *Lehnert, T., *Willeke, F., *Otto, H.F., Lich-ter, P., Joos, S. (2000) Detection of chromosomal imbalances inleiomyosarcomas by comparative genomic in situ hybridizationand interphase cytogenetics. Cytogen. Cell Gen. 90, 86-92[19] Kalla, J., *Stilgenbauer, S., Schaffner, C., Wolf, S., *Ott, G.,*Greiner, A., *Rosenwald, A., *Döhner, H., *Müller-Hermelink,H.K., Lichter, P. (2000) Heterogeneity of the API2-MALT1 generearrangement in MALT-type lymphoma. Leukemia 14, 1967-1974[20] *Ostendorff, H.P., *Bossenz, M., Mincheva, A., *Copeland,N.G., *Gilbert, D.J., *Jenkins, N.A., Lichter, P., *Bach, I. (2000)Functional characterization of the gene Eecoding RLIM, thecorepressor of LIM homeodomain factors. Genomics 69, 120-130

[21] Mertens, D., Wolf, S., *Bullinger, L., Ohl, S., Schaffner, C.,*Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2000) BCMSUN, acandidate gene for B-cell chronic lymphocytic leukemia andmantle cell lymphoma, has an independently expressed homologon 1p22-p31, BCMSUN-like. Int. J. Cancer 88, 692-697[22] *Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Benner, A., *Leupolt, E.,*Kröber, A., *Bullinger, L., *Döhner, K., *Bentz, M., Lichter, P.(2000) Genomic aberrations predict survival of patients with B-cellchronic lymphocytic leukemia. New Engl. J. Med. 343, 1910-1916[23] *Mezzelani, A., *Sozzi, G., Nessling, M., *Riva, C., *DellaTorre, G., *Testi, M.A., *Azzarelli, A., *Pierotti, M.A., Lichter, P.,*Pilotti, S. (2000) Low grade fibromyxoid sarcoma. a further low-grade soft tissue malignancy characterized by a ringchromosome. Cancer Genet. Cytogenet. 122, 144-148[24] Hofmann, T.G., Mincheva, A., Lichter, P., Dröge, W., Schmitz,M.L. (2000) Human homeodomain-interacting protein kinase-2(HIPK2) is a member of the DYRK family of protein kinases andmaps to chromosome 7q32-q34. Biochimie 82, 1123-1127[25] *Bentz, M., *Barth, T.F.E., *Brüderlein, S., Bock, D., *Schwe-rer, M.J., *Baudis, M., Joos, S., *Viardot, A., Lichter, P., *Döhner,H., *Möller, P. (2001) Gain of chromosome arm 9p is characteristicof primary mediastinal B-cell lymphoma - a comprehensivecytogenetic analysis and presentation of a novel MBL cell line.Genes Chromosom. Cancer 30, 393-401[26] Weber, R.G., *Rieger, J., *Naumann, U., Lichter, P., Weller,M. (2001) Chromosomal imnbalances associated with response tochemotherapy and cytotoxic cytokines in human malignant gliomacell lines. Int. J. Cancer 91, 213-218[27] Küpper, M., Joos, S., *von Bonin F., *Daus, H.,*Pfreundschuh, M., Lichter, P., *Trümper, L. (2001) MDM2 geneamplification and lack of p53 point mutations in Hodgkin andReed-Sternberg cells: Results from single cell polymerase chainreaction and molecular cytogenetic studies. Br. J. Haematol. 112,768-775[28] *Wallrapp, C., *Hähnel, S., *Boeck, W., Soder, A., Mincheva,A., Lichter, P., *Leder, G., *Gansauge, F., *Sorio, C., *Scarpa, A.,*Gress, T.M. (2001) Loss of the Y chromosome is a frequent chro-mosomal imbalance in pancreatic cancer and allowsdifferentiation to chronic pancreatitis. Int. J. Cancer 91, 340-344[29] *Stratowa, C., *Löffler, G., Lichter,P., *Stilgenbauer, S.,*Haberl, P., *Schweifer, N., *Döhner, H., *Wilgenbus, K.K. (2001)CDNA microarray gene expression analysis of B-cell chroniclymphocytic leukemia proposes potential new prognostic markersinvolved in lymphocyte trafficking. Int. J. Cancer 91, 474-480[30] *Büschges, R., *Boström, J., *Wolter, M., *Blaschke, B., We-ber, R.G., Lichter, P., *Collins VP, *Reifenberger G. (2001) Analy-sis of human meningiomas for aberrations of the MADH2,MADH4, APM-1 and DCC tumor suppressor genes on the longarm of chromosome 18. Int. J. Cancer 92, 551-554[31] Wagner, K., Mincheva, A., Korn, B., Lichter, P., Pöpperl, H.(2001) Pbx4, a new Pbx family member on mouse chromosome8, is expressed during spermatogenesis. Mech. Dev.103, 127-131.[32] Wolf, S., Mertens, D., Schaffner, C., Korz, C., *Döhner, H.,*Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2001) B-cell neoplasia associatedgene with multiple splicing (BCMS): the candidate B-CLL gene on13q14 comprises more than 560 kb covering all critical regions.Hum. Mol. Genet. 10, 1275-1285[33] *Scheuerpflug, C.G., Lichter, P., Debatin, K.M., Mincheva, A.(2001) Assignment of TRADD to human chromosome band 16q22by in situ hybridization. Cytogenet. Cell Genet. 92, 347-348[34] *Olins, A.L., Herrmann, H., Lichter, P., *Kratzmeier, M.,*Doenecke, D., Olins, D.E. (2001) Nuclear envelope andchromatin compositional differences comparing undifferentiatedand retinoic acid- and phorbol ester-treated HL-60 cells. Exp. CellRes. 268,115-127

394




[35] *Boström, J., *Meyer-Puttlitz, B., *Wolter, M., *Blaschke, B.,Weber, R.G., Lichter, P., *Ichimura, K., *Collins, V.P.,*Reifenberger, G. (2001) Alterations of the tumor suppressorgenes CDKN2A (p16(INK4a)), p14(ARF), CDKN2B (p15(INK4b)),and CDKN2C (p18(INK4c)) in atypical and anaplasticmeningiomas. Am. J. Pathol. 159, 661-669[36] *Hübener, C., Mincheva, A., Lichter, P., *Schraven, B.,*Bruyns, E. (2001) Complete sequence, genomic organization,and chromosomal localization of the human gene encoding theSHP2-interacting transmembrane adaptor protein (SIT).Immunogenetics 53, 337-341[37] Berrar, D., Dubitzky, W., Solinas-Toldo, S., Bulashevska, S.,Granzow, M., Conrad, C., Kalla, J., Lichter, P., Eils, R. (2001) Adatabase system for comparative genomic hybridization analysis.IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 20, 75-83[38] Rätsch, A., Joos, S., Kioschis, P., Lichter. P. (2002)Topological organization of the MYC/IGK locus in Burkitt’slymphoma cells assessed by nuclear halo preparations. Exp. CellRes. 273, 12-20[39] Joos, S., *Menz, C.K., *Siebert, R., *Geske, S., Ohl, S.,Wrobel, G., *Mechtersheimer, G., *Trümper, L., *Möller, P., Lich-ter, P., *Barth, T.F.E. (2002) Classical Hodgkin’s lymphoma ischaracterized by recurrent copy number gains of the short arm ofchromosome 2. Blood 99, 1381-1387[40] Wessendorf, S., Fritz, B., Wrobel, G., Nessling, M., Lampel,S., Goettel, D., Kuepper, M., Joos, S., Hopman, T., Kokocinski, F.,*Döhner, H., *Bentz, M., Schwaenen, C., Lichter, P. (2002)Automated screening for genomic imbalances using matrix-basedcomparative genomic hybridization (matrix-CGH). Lab. Invest.82, 47-60[41] Korz, C., Pscherer, A., Benner, A., Mertens, D., Schaffner, C.,*Leupolt, E., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2002)Evidence for distinct pathomechanisms in B-cell chroniclymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma by quantitativeexpression analysis of cell-cycle and apoptosis-associated genes.Blood 99, 4554-4561[42] *Rieker, R., Joos, S., *Bartsch, C., Willeke, F., *Schwarzbach,M., *Otano-Joos, M.., Ohl, S., *Högel, J., *Lehnert, T., Lichter, P.,*Otto, H.F., *Mechtersheimer, G. (2002) Distinct chromosomalimbalances in pleomorphic and high grade dedifferentiatedliposarcomas. Int. J. Cancer 99, 68-73[43] Mertens, D., Wolf, S., Schroeter, P., Schaffner, C., *Döhner,H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2002) Downregulation ofcandidate tumor suppressor genes within chromosome band13q14.3 is independent of the DNA methylation pattern in B-cellchronic lymphocytic leukemia. Blood 99, 4116-4121[44] Actor, B., *Cobbers, J.M.L., *Büschges, R., *Wolter, M.,*Knobbe, C.B., Lichter, P., *Reifenberger, G., Weber, R.G. (2002)Comprehensive analysis of genomic alterations in gliosarcomaand its two tissue components. Genes Chromosom. Cancer (imDruck)[45] *Kröber, A., *Seiler, T., Benner, A., *Bullinger, L., *Brückle, E.,Lichter, P., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S. (2002) VH mutationstatus, CD38 expression level, genomic aberrations, and survivalin chronic lymphocytic leukemia. Blood (im Druck)[46] Fritz, B., *Schubert, F., Wrobel, G., Schwaenen, C., Wessen-dorf, S., Nessling, M., Korz, C., *Rieker, R, *Bentz, M.,*Montgomery, K., *Kucherlapati, R., *Mechtersheimer, G., Eils, R.,Joos, S., Lichter, P. (2002) Microarray based copy number andexpression profiling in dedifferentiated and pleomorphicliposarcoma. Cancer Research 62, 2993-2998[47] Schwaenen.,C., Nessling, M., Wessendorf, S., Göttel, D.,Wrobel, G., Fritz, B., *Stilgenbauer, S., *Döhner, H., *Bentz, M.,Lichter, P. Automated genomic profiling in Chronic LymphocyticLeukemia using microarray based hybridization (Matrix-CGH).Blood 98 (11), 763a, 2001

[48] Wessendorf, S., Schwaenen, C., Barth, T.F.E., Doerfel, J.,Kohlhammer, H., Nessling, M., Wrobel, G., Fritz, B., Müller, P.,*Döhner, H., Lichter, P., *Bentz, M. Automated genomic profilingusing microarray based hybridization (Matrix-CGH) – a powerfultechnique for the detection of DNA amplifications in aggressivelymphoma. Blood 98 (11), 464a, 2001[49] Schlingemann, J. (2001) Entwicklung und Einsatz einesmurinen cDNA-Microarrays für das Erstellen von Expressions-profilen am Beispiel TPA-induzierter epithelialer Zellen. Diplomar-beit, Fakultät für Biologie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg[50] Lichter, P., Joos, S., Bentz, M., Lampel, S. (2000)Comparative genomic hybridization: Uses and limitations. Semi-nars in Hematology 37: 348-357.[51] Barth, T.F.E, Leithäuser, F., Joos, S. und Möller, P. (2002)Mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma now canonised in theWHO classification of malignant lymphomas: where do we stand?The Lancet Oncology, 3: 229-234.[52] Joos, S. Schwänen, C. und Lichter, P.(2002) Comparativegenomic hybridization on metaphase chromosomes and DNA-chips; in “FISH: A Practical Approach”, eds. Beatty, B., Mai, S. andSquire, J.A. Oxford University Press; in press.

395


AbteilungH0800Funktionelle Genomanalyse


WissenschaftlerDr. Markus Beier (-03/00)Dr. Tim Beißbarth (07/01-)Dr. Benedict Brors (-06/01)Dr. Robert Fleischer (06/01-)Dr. Marcus Frohme (12/00-)Dr. Anette Jacob (05/00-)Dr. Stefan Matysiak (-02/00)Dr. Marcel Scheideler (01-04/01)Dr. Iana Syagailo (11/01-)Dr. Dimitrij Zubakov (09/00-)

GastwissenschaftlerTim Binnewies (11/00-01/01)Dr. Nicole Hauser (Stuttgart; 06/01-)Dr. Li Zheng (Schanghai, China; 10/01-)Dr. Dimitrij Zubakov (Irkutsk, Russland; -08/00)

DoktorandenVerena Aign Andrea BauerBoris Beckmann (04/00-) Jürgen Beigel (09/01-)Ole Brandt (08/00-) Frank DiehlKurt Fellenberg (01/01-) Marcus Frohme (-11/00)Susanne Grahlmann Nicole Hauser (-08/00)Steffen Heber (-03/01) Rainer König (01/01-07/01)Tamara Korica (04/00-) Wladislaw Kusnezov (04/01-Anja Petersohn Marcel Scheideler (-12/00)Diana Stjepandic Simone Würtz

Technisches PersonalSonja Bastuck (-05/01) Melanie BierClaudia Czink Carmen Fischer (-07/01)Mareike Grees (-06/01) Maria KünzerAndreas Mücke (05-09/00) Yvonne Reile (-12/00)Felix Reuthner (-09/00) Marita SchrenkSieglinde Schück Sandra SchwarzAchim Stephan Jessica Werdermann (08/01-

DiplomandenTim Binnewies (-10/00) Nadine Kellner (04/01-

12/01)Georg Sposny (04/01-12/01) Alexandra Walijew (11/01-)

StudentenPhilipp Angenendt (08/00-01/01)Bernd Binder (-11/00) Christian Fischer (08-11/01)Andreas Maurer (09/99-10/00)Heiko Nieke (11/00-01/01) Kerstin Schmitz (04-06/01)Daniel Schwarz (09/00-02/01)

AuszubildendeCaroline Böhm (-09/00) Tarik Hamid (06/01-)Andrea Hinz (10/00-09/01) Jessica Kimmel (09/01-)Melanie Lehr (09/01-) Ulrike Rothermel (-07/00)Christina Weber (07/00-08/01)

SekretariatAnke Mahler

Die Arbeiten der Abteilung Funktionelle Genomanalysezielen auf die Entwicklung und unmittelbare Anwendungneuer Technologien zur Analyse ganzer Genome hinsicht-lich der zellulären Umsetzung der genetischen Informationund der Regulation dieser Vorgänge. Basierend auf tech-nischen Entwicklungen werden zahlreiche funktionelleAspekte analysiert. Ein Schwerpunkt liegt im Gebiet derDNA-, Protein- und Peptid-Microarrays. Dabei werden bio-physikalische und chemischen Fazetten der Chipherstel-lung sowie Aspekte der Datenanalyse weiter entwickeltund unmittelbar zur Anwendung gebracht. Die Bestim-mung der Expression aller Gene einer Zelle oder einesGewebes ist dabei ein wichtiges Thema. Neben der Analy-se der biologischen Effekte bestimmter (speziell karzino-gener) Substanzen auf molekularer Ebene, sollen Syste-me zur Frühdiagnose, Krankheitsprognose und zur beglei-tenden Analyse des Behandlungserfolgs etabliert werden.Vergleichende Studien der Transkription und Proteinex-pression aller Gene und der sich daraus ergebenden (phä-notypischen) Konsequenzen sind im Gange und werdenweiter vertieft. Gleichzeitig wird die Genotypisierung vonPatienten- und Kontrollgruppen sowie von pathogenen Or-ganismen und Viren verfolgt, die auch Aussagen über epi-genetische Veränderungen erlaubt. Daneben ist die Abtei-lung auch in der Kartierung und Sequenzierung ganzerGenome aktiv, wobei sich daran meist eine weitergehendefunktionelle Analyse anschließt. Viele dieser Projekte wer-den in nationalen oder internationalen Kooperation undKollaboration durchgeführt. Ein weiteres Ziel ist die Eta-blierung neuartiger Methoden zur Untersuchungen derKorrelation von DNA-Struktur und Enzymaktivität, mit Per-spektiven in der reinen Analytik, dem grundlegenden Ver-ständnis von Protein-Nukleinsäure Wechselwirkungen so-wie zur Nutzung der DNA als Grundlage nicht-binärer Re-chenoperationen.Außer in wissenschaftlichen Publikationen schlugen sichdie Ergebnisse der Abteilung im Zeitraum 2000/2001 auchin 14 Patentanmeldungen nieder.

Abteilung für Funktionelle Genomanalyse (H0800)Leiter: Dr. Jörg Hoheisel

396




Funktionelle GenomanalyseJ.D. Hoheisel, V. Aign, A. Bauer, B. Beckmann,M. Beier, J. Beigel, T. Beißbarth, T. Binnewies,O. Brandt, B. Brors, F. Diehl, K. Fellenberg,R. Fleischer, M. Frohme, S. Grahlmann,N.C. Hauser, S. Heber, A. Jacob, R. König, T. Kor ica,W . Kusnezov, S. Matysiak, A. Petersohn,M. Scheideler, D. St jepandic, I. Syagailo, S. Würtz,L. Zheng, D. Zubakov.

In Kooperation mit: H. Arlinghaus, Universität Münster; J. Arnold,University of Georgia, Athens, USA; N. Becker, DKFZ; M. Bevan,John Innes Centre, Norwich, Großbritannien; A. Brown, Universi-tät Aberdeen, Großbritannien; C. Clayton, ZMBH, Universität Hei-delberg; K. Dekker, MPI für Züchtungsfoschung, Köln; R. Frank,GBF, Braunschweig; T. Gress, Universität Ulm; M. Harder, Merck,Darmstadt; M. Hecker, Universität Greifswald; M. Hrabe deAngelis, GSF, München; M. von Knebel-Doeberitz, UniversitätHeidelberg; W. Mewes; GSF, München; M. Nees, Universität Hei-delberg; Karen Nelson, TIGR, Rockville, USA; P. Nielsen, Kopen-hagen, Dänemark; S. Oliver, Universität Manchester, Großbritan-nien; W. Pfleiderer, Universität Konstanz; R. Paro, ZMBH, Univer-sität Heidelberg; F. Sauer, ZMBH, Universität Heidelberg; M.Schnölzer, DKFZ; U. Schulte, Universität Düsseldorf; A. Simpson,Ludwig Institut; Sao Paulo, Brasilien; B. Tümmler, MedizinischeHochschule Hannover; J. van der Waarde, Bioclear, Groningen,Niederlande; M. Vingron, DKFZ und andere.

DNA-Microarray/DNA-Chip TechnologieMit der Entschlüsselung der vollständigen Sequenzinfor-mation in einer Vielzahl von Organismen werden experi-mentelle Verfahren zur Analyse der zellulären Umsetzungder dort kodierten Information essentiell für weiterführen-de, funktionelle Studien. In den letzten Jahren hat sich dieDNA-Chip Technologie zu einem wichtigen Werkzeug fürsolche Untersuchungen entwickelt. Über Modifikationendes grundlegenden Ansatzes sind viele, verschiedene An-wendungen möglich.

Technische Entwicklungen zur Herstellung hoch-qualitativer MicroarraysFür chip-basierende Analysen werden unterschiedlicheMicroarray-Systeme verwendet, die als Sensormoleküleentweder Oligonukleotide oder lange DNA-Fragmente tra-gen. In der Herstellung unterscheiden sie sich noch da-durch, ob Oligomere in situ synthetisiert werden oder DNA(Oligomer oder PCR-Produkt) als vorgefertigtes Fragmentaufgebracht werden. Verschiedene Aspekte der Herstel-lung, die die Qualität der DNA-Microarrays maßgeblich be-einflussen, wurden untersucht und verbessert.

Fotolithografische Produktion vonOligonukleotid-Chips(BMBF finanziert)

Die Qualität der Oligonukleotide auf einem DNA-Chip hatimmense Konsequenzen auf die Genauigkeit, Sensitivitätund Messdynamik von Microarray Analysen. Die Qualitätder fotolithografischen in situ Synthese hängt von der Effi-zienz der Fotoentschützung ab. Mittels eines neu entwik-kelten Prozesses konnte unter Ausnutzung von 5'-[2-(2-Nitrophenyl)-Propyloxycarbonyl]-2'-DeoxynucleosidePhosphoramiditen die schrittweise Syntheseausbeute imVergleich zu bestehenden Verfahren um mindestens 12%verbessert werden. Gleichzeitig läßt sich die Gesamtaus-

beute an jeder individuellen Chip-Position durch eine neuentwickelte Methode genau bestimmen.

Synthese fotolabiler 5'-O-Phosphoramidite für diefotolithografische Herstellung von Microarraysmit invers-orientierten Oligonukleotiden(BMBF finanziert)

Es wurden fotolabile 3'-O-[2-(2-Nitrophenyl)-Propoxycar-bonyl]-geschützte 5'-Phosphoramidite hergestellt. Auf-grund ihrer einzigartigen Charakteristik kann die lichtge-steuerte in situ Oligonukleotid-Synthese auf dem Chip in5'-3' Richtung erfolgen. Dadurch sind die Oligonukleotideauf dem Chip invers ausgerichtet, wodurch ihre 3'-Endenals Substrat für nachfolgende Polymerasereaktionen die-nen können.

Produktion von DNA-Microarrays mit hoherHomogenität der Belegpunkte und geringemHintergrundsignal(BMBF finanziert)

In Analysen auf DNA-Microarrays, die durch das Aufbrin-gen („spotting“) vorgefertigter DNA-Fragmente entstehen,spielt die Qualität der Belegpunkte und die Stärke desHintergrundsignals auf dem Glasträger eine wichtige Rol-le. Durch den Zusatz von Betaine wurde die Bindungs-effizienz und die Homogenität der Belegpunkte wesentlichverbessert. Zusätzlich konnte das unspezifische Hinter-grundsignal stark verringert werden, indem die Blockie-rung der Aminogruppen auf der Chip-Oberfläche mitSuccinylanhydrid durch die Gegenwart des unpolaren,nicht-wässrigen Lösungsmittels 1,2-Dichloroethan und desKatalysts N-Methylimidazol verbessert wurde.

Herstellung und Nutzung komplexer Oligonuk-leotid Microarrays aus licht-kontrollierter in situSyntheseIn Kooperation mit der Firma febit, nutzen wir als �-Test-partner das Geniom-Gerät zur Herstellung komplexerOligonukleotid-Microarrays. Durch die Kombination mit un-seren Entwicklungen auf dem Gebiet licht-gesteuerterOligomersynthese (s.o.), sind eine Vielzahl verschiedenerAnwendungen möglich, wie etwa Untersuchungen vonTranskriptmengen, Studien im Bereich molekulare Epide-miologie und Genotypisierung,, Typisierung von HPV-Virenund die Durchführung enzymatischer Reaktionen direktauf dem Chip.

Epigenetische AnalysenIn einem gemeinsamen Projekt mit der Firma Epigeneticsund der GBF in Braunschweig untersuchen wir den epi-genetischen Zustand bestimmter genomischer Bereiche.Ziel ist eine umfassende Analyse regulativ wirkender Fak-toren - Methylierung, Transkriptionsaktivität und tatsächli-che Proteinexpression - für eine besseres molekularesVerständnis der Interaktion zwischen verschiedenen Ebe-nen der Regulation.

Markierungsfreier Nachweis von Hybridisierex-perimenten auf „Peptide Nucleic Acids“ (PNAs)(finanziert durch BMBF und VDI)

Die Verwendung von PNA-Oligomeren als chip-gebunde-ne Sensor-Moleküle wurde in der Arbeitsgruppe entwik-

397




kelt. Im Vergleich zu DNA-Oligonukleotiden hat PNA we-sentliche Vorteile:

• Die Schmelz- bzw. Dissoziationstemperatur liegt we-sentlich höher als bei vergleichbaren DNA-Oligonukleo-tiden mit dabei

• gleichzeitig höherer Selektivität und Spezifität der Aus-bildung von Doppelstrang mit DNA bzw. RNA.

• PNA ist auch in Lösung ein ungeladenes Molekül, sodass im Hybridisierungspuffer keine Ionen notwendigsind, um die Abstoßung zu kompensieren, die aufgrundihrer negativen Ladung zwischen zwei Nukleinsäure-Strängen vorliegt. Durch das Fehlen positiver Ionen lie-gen die zu hybridisierenden Sondenmoleküle in einer„gestreckten“, einzelsträngigen Konformation vor, dasich intramolekulare Sekundär- und Tertiärstrukturennur schwer ausbilden können, wodurch eine sterischeBehinderung der Bindung an die Chip-Oligomere ver-hindert wird.

• Da PNA keine Phosphatgruppen besitzt, lässt sich dieBindung von Nukleinsäuremolekülen direkt - markie-rungsfrei und ohne Amplifikation des Ausgangsmateri-als - über die Phosphatgruppen massenspektrometrischnachweisen.

Die vollautomatische, parallele Synthese von mehrerenTausend PNA-Molekülen wurde im Labor etabliert. Desweiteren existieren Methoden zur Aufreinigung der Mole-küle und Herstellung hoch-dichter PNA-Chips. Da PNA-Synthese chemisch betrachtet eine Peptid-Synthese dar-stellt, lassen sich diese Verfahren auch für die Herstellungkomplexer Peptid-Chips nutzen.

Ganz-genomische Untersuchungen von Trans-kriptionsänderungenZiel der Studien ist der gleichzeitige Nachweis der Tran-skriptmengen aller Gene eines Organismus. Für alle Genewerden repräsentative PCR-Produkte in einem geordne-ten Raster auf Microarrays aufgebracht. Auf diese DNA-Chips wird mit Gesamt-RNA hybridisiert, und der Grad derTranskription der individuellen Gene durch eine Detektionder Signalintensitäten an jeder Position des Rasters be-stimmt. Gleichzeitig zur experimentellen Durchführungwurden in Kollaboration mit der Abteilung TheoretischeBioinformatik von Martin Vingron Algorithmen und Daten-banken zur Auswertung solcher Datensätze entwickelt.

Etablierung und Nutzung eines Microarrays mitkrebs-assoziierten Genen(BMBF-finanziert)

Aufbauend auf Untersuchungen an Colonkrebs wurdeeine Microarray mit etwa 12.000 Fragmenten von solchenGenen entwickelt und angewandt, die in verschiedenenKrebsformen ein differenzielles Transkriptionsverhaltengezeigt hatten. Neben etwa 6.000 DNA-Fragmenten vonGenen, die mittels Datenbank- und Literaturrecherchenidentifiziert wurden, wurden etwa 6.000 weitere Fragmenteaufgebracht, die aufgrund von eigenen Untersuchungenals krebsrelevant erkannt werden konnten. Durch einPCR-basierendes Verfahren - Repräsentative DifferenzAnalyse (RDA) - wurden in Zusammenarbeit mit der FirmaMerck und anderen, klinischen Partnern selektiv Tran-

skripte amplifiziert und kloniert, die in einer Reihe von ver-schiedenen Geweben Unterschiede in den Transkript-mengen zwischen Krebs- und Normalgewebe aufweisen.

„MouseExpress“: In silico Analyse der Expres-sionsprofile von Mausmutanten(BMBF-finanziert)

In Zusammenarbeit mit der GSF in München wurden zweiMicroarrays mit Genen der Maus etabliert. Einmal wurden48.000 cDNA-Klone amplifiziert, die in silico als nicht-red-undant ausgewählt wurden. Parallel dazu wurde einsequenz-verifizierter Satz von 20.000 Genfragmenten derFirma LION bioscience amplifiziert und auf Glas-Objektträ-ger aufgebracht. Die molekulare Ähnlichkeit zwischenMensch und Maus hinsichtlich Genomstruktur, Stoffwech-sel, Physiologie und Entwicklungsmechanismen macht dieMaus zum wichtigsten Modell für Studien von Vererbungs-krankheiten im Menschen. Zur Integration der vorliegen-den genomischen (Sequenz-) Information und biologischerund biomedizinischer Forschung wird ein systematischerAnsatz zur Identifizierung von Genfunktionen durchge-führt. Mausmutanten aus dem „ENU Mutagenesis Screen“der GSF werden innerhalb des Projekts auf Änderungender Genexpression hin untersucht.

Funktionelle Analysen in Drosophila melano-gaster(BMBF-finanziert)

In Kooperation mit dem ZMBH wurde ein Microarray mit21.000 Genfragmenten der Fruchtfliege Drosophila eta-bliert. Durch eine Kombination mit den Möglichkeiten derGenetik in Drosophila werden die molekularen Mechanis-men untersucht, die für komplexe zelluläre Prozesse ver-antwortlich sind.

Veränderungen des Expressionsmusters inArabidopsis thaliana.(BMBF-finanziert)

Für 13.000 Gene von A. thaliana wurden repräsentativePCR-Produkte in einem geordneten Raster auf feste Trä-ger aufgebracht. Unter anderem wurde die Reaktion aufInfektion mit einem Pathogen untersucht und mit Änderun-gen in Stoffwechselwegen korreliert.

Untersuchung komplexer Veränderungen desExpressionsmusters in Saccharomycescerevisiae.(EU-finanziert)

Mit den PCR-Produkten aller etwa 6.200 Gene von S.cerevisiae wurden einmal grundlegende methodische As-pekte bearbeitet. Zum anderen dienen sie für Untersu-chungen an einem kleinen Satz an Genen, der für die Auf-rechterhaltung einer eukaryontischen Zelle notwendig ist.Expressionsstudien an diesem Gesamt-Gensatz sind des-halb von hoher Relevanz nicht nur für die Hefe selbst, son-dern auch für das Erfassen dieser Vorgänge in höherenOrganismen, um so mehr als Homologie, zum Teil sogarfunktioneller Art, zwischen menschlichen (Krankheits- undKrebs-) Genen und ihren Äquivalenten in Hefe besteht.Insgesamt wurden bisher Daten für etwa 190 Bedingun-gen akkumuliert.

398




Transkriptionelle Studien an mikrobiellen Sys-temen.(finanziert durch BMBF und DFG)

Neben unserer Teilnahme an der Kartierung und Sequen-zierung ganzer Genome verschiedener Organismen wur-den DNA-Microarrays für vier mikrobielle Organismen eta-bliert. Dabei wurden hauptsächlich genomische Fragmen-te genutzt, die aufgrund der hohen Gendichte gleichzeitigeine gute Repräsentation der Gene darstellen, dochgleichzeitig auch Untersuchungen anderer (regulativer)Sequenzbereiche erlauben. So wurde beispielsweise inKollaboration mit dem ZMBH ein Microarray mit mehr als20.000 PCR-Produkten des Erregers der SchlafkrankheitTrypanosoma brucei erstellt.

Isolation und Charakterisierung von Krank-heitsgenenIsolation und Charakterisierung von Genen, diefür die Pankreas-Karzinogenese des Menschenvon Bedeutung sind(EU- und Krebshilfe-finanziert)

Am Beispiel des Pankreaskarzinoms wurden unter Anwen-dung neuartiger Methoden Gene identifiziert, die in derKarzinomausbildung eine Rolle spielen. Das Pankreas-karzinom wurde als Fallbeispiel ausgewählt, da es an diefünfte Stelle der Rangliste der Krebstodesursachen ge-rückt und die Inzidenz etwa gleich der Mortalitätsrate ist.Auch gibt es, im Gegensatz zu anderen bösartigen Erkran-kungen, nur wenige Daten, die zum Verständnis der Mole-kularbiologie des Pankreaskarzinoms beitragen. ÜberDifferenzanalysen wurden Gene identifiziert, die mit derAusbildung des Tumors korreliert sind; neben bekanntenwurden auch unbekannte Gene gefunden, die jetzt weiterauf ihre Funktion hin untersucht werden. Weiterführendwird ein Chip etabliert, der nicht nur zur Früherkennungdes Pankreaskrebses herangezogen werden soll, sonderngleichzeitig auch eine individuelle Prognose für jeden Pati-enten wie auch eine Evaluierung des Behandlungserfolgserlauben soll.

Isolation und Charakterisierung von Genen, diefür die Colon-Karzinogenese des Menschen vonBedeutung sind(BMBF-finanziert)

Für Colonkrebs Gewebeproben wurden auf dem Krebs-Microarray Gene identifiziert, die im Vergleich zu Normal-gewebe differenziell transkribiert werden. Diese Gene wer-den einmal auf ihre Funktion hin untersucht, zum anderengenutzt, um über Untersuchungen an Patientenmaterialiendiejenigen zu identifizieren,die für eine Diagnose- undPrognosestellung am be-sten geeignet sind.

Identifizierung und Charakterisierung von Krank-heitsgenen(finanziert durch Merck, Hoffman a Roche, Knoll und BMBF)

In Zusammenarbeit mit Merck, Hoffman la Roche undKnoll wurden an Gewebepaaren eine Analyse zur Identifi-zierung von Krankheitsgenen durchgeführt. Dabei wurdeu.a. eine große Zahl an krebsrelevanten Transkriptions-unterschieden gefunden. Einige Gene werden im Detailweiter untersucht, während die große Menge als Sensor-moleküle auf einem globalen Krebs-Chip dienen.

Genom Kartierung und SequenzierungFür die Sequenzierung ganzer Genome ist das Vorhan-densein von Genomkarten immer noch vorteilhaft, auchwenn der Großteil der tatsächlichen Sequenzinformationüber „Shotgun“-Sequenzierung gewonnen wird. ZurAssemblierung in Sequenz-“Contigs“ wie zur Überprüfungder Co-Linearität von Genom und Sequenz sind Klon-karten aber immer noch unverzichtbar, auch für Institutewie „The Institute for Genome Research“ (TIGR). Dies wirddurch die Zusammenarbeit mit TIGR zur Sequenzierungvon Pseudomonas putida dokumentiert.

Kartierung und Sequenzierung des Genoms vonArabidopsis thaliana(EU-finanziert)

Als Teil des EU-Programms zu Sequenzierung des Ge-noms des Modellorganismus Arabidopsis thaliana wurdevon uns ein Bereich von etwa 16 Mb auf Chromosom 4kartiert und als Klone an die Sequenzierlabors verteilt. DieSequenzierung von Chromosom 4 ist mittlerweile abge-schlossen.

Kartierung und Sequenzierung der Chromoso-men 2 und 5 von Neurospora crassa(DFG-finanziert)

In einem internationalen Projektverbund, dessen deut-scher Teil durch die Universität Düsseldorf koordiniert wird,wird das gesamte Genom von N. crassa sequenziert. In-nerhalb dieser Analyse generieren wir eine vollständigeKarte der Chromosomen 2 und 5 (zusammen etwa 16Mb), die anschließend sequenziert wurden.

Kartierung, Sequenzierung und funktionelle Ana-lyse des 6,1 Mb Genoms von Pseudomonaspudita(BMBF-finanziert)

Innerhalb eines nationalen Netzwerks bestehend aus derMedizinischen Hochschule Hannover, der GBF in Braun-schweig, QIAGEN in Hilden und uns sowie in Kollaborati-

Abbildung: Genotypisierungvon Patientenproben aufOligonukleotid-Chip. Jweilseine Reihe von 12 Oligonuk-leotiden (dreifache Redun-danz) wird für die Bestimmungeines Genotyps genutzt.

399




on mit TIGR (U.S.A.) wurde das gesamte Genom von P.pudita kartiert und sequenziert. Zusätzlich werden überDNA-Chip Analysen transkriptionelle Daten produzieren,die mit biologischen Informationen der anderen deutschenTeilnehmer in Korrelation gebracht werden.

Kartierung, Sequenzierung und funktionelle Ana-lyse des 2,7 Mb Genoms von Xylella fastidiosa(FAPESP-finanziert)

In Kollaboration mit dem brasilianischen Genomprojekt,wurde von uns das Genom von X. fastidiosa vollständigkartiert. Die Klone wurden innerhalb des brasilianischenNetzwerks zur Sequenzierung verteilt und sequenziert. ImRahmen direser Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt,Lücken in der Abdeckung eines Genoms zu schließen.

Publikationsliste (* = externe Koautoren)[1] Beier, M. & Hoheisel, J.D. (2000). Production by quantitativephotolithographic synthesis of individually quality-checked DNAmicroarrays. Nucleic Acids Res. 28, e11.[2] Beier, M., Matysiak, S., Hauser, N., Scheideler, M., Würtz, S.,Fellenberg, K., Vingron, M. & Hoheisel, J.D. (2000). DNAmicrochips; transcriptional profiling and beyond. Chimia 54, 29-30.[3] Hoheisel, J.D. & Vingron, M. (2000). Transcriptional profiling: isit worth the money ? Res. Microbiol. 151, 113-119.[4] *Simpson, A.J.G., et al., Hoheisel, J.D., et al. & *Setubal, J.C.(2000). The genome sequence of the plant pathogen Xylellafastidiosa. Nature 406, 151-157.[5] Hoheisel, J.D. & Beier, M. (2000). DNA-Chips/elektronischeChips, grundverschieden und doch ähnlich. Dechema Tätigkeits-bericht 1999, 8-11.[6] Hoheisel, J.D. (2000). ... and counting: DNA-microarrays.Proceedings Int. Conf. Genomics and Proteomics: Functional andComputational Aspects (Suhai, S., Hrsg.), Plenum Publishing,New York, 1-3.[7] *Wambutt, R., et al., Hoheisel, J.D., et al. & *Bevan, M. (2000).Progress in Arabidopsis genome sequencing and functionalgenomics. J. Biotechnol. 78, 281-292.[8] Frohme, M., *Scharm, B., Delius, H., *Knecht, R. & Hoheisel,J.D. (2000). Use of representational difference analysis andcDNA-arrays for transcriptional profiling of tumour tissue. Ann.N.Y. Acad. Sci. 910, 85-104.[9] Frohme, M., *Camargo, A.A., Heber, S., Czink, C., *Simpson,A.J.D., Hoheisel, J.D. & *de Souza, A.P. (2000). Mapping analysisof the Xylella fastidiosa genome. Nucleic Acids Res. 28, 3100-3104.[10] Frohme, M., Hauser, N., Scheideler, M., Diehl, F., Beier, M.,Würtz, S. & Hoheisel, J.D. (2000). Chips, arrays and otherhybridisation based techniques for genome and transcriptomecharacterisation. Molecular Pathogenesis of Pancreatic Cancer(Gress, T., Hrsg.), IOS Press, Amsterdam, 88-94.[11] Heber, S., Hoheisel, J.D. & Vingron, M. (2000). Application ofbootstrap-techniques to physical mapping. Genomics 69, 235-241.[12] Hoheisel, J.D. (2000). DNA-Chips. BIOforum 12/00, 825.[13] Heber, S., Stoye, J., Hoheisel, J.D. & Vingron, M. (2000).Contig selection in physical mapping. Proc. Fourth Ann. Internat.Conf. Comput. Mol. Biol. (RECOMB 2000), 155-164.[14] *Campbell, H.D., *Fountain, S., *Young, I.G., Weitz, S., Lich-ter, P. & Hoheisel, J.D. (2000). Fliih, the murine homologue of theDrosophila melanogaster flightless-I gene: genomic structure,chromosomal mapping and overlap with Llglh. DNA Sequence 11,29-40.

[15] Heber, S., Stoye, J., Frohme, M., Hoheisel, J.D. & Vingron,M. (2000). Contig selection in physical mapping. J. Comput. Biol.7, 395-408.[16] Beißbarth, T., Fellenberg, K., Brors, B., Arribas-Prat, R.,Boer, J., Hauser, N.C., Scheideler, M., Hoheisel, J.D., Schütz, G.,Poustka, A. & Vingron, M. (2000). Comparison and qualitymeasures of DNA array hybridisation data. Bioinformatics 16,1014-1022.[17] Hoheisel, J.D. (2000). Das Humangenomprojekt. Human-genetisches Symposium 29, 11-16.[18] *Tümmler, B., *Kiewitz, C., *Weinel, C., Hoheisel, J.D.,*Düsterhöft, A., *Hilbert, H., *Moore, E., *Strätz, M., *Timmis,K.N., *Nelson, K.E. & *Fraser, C.M. (2000). Sequenzierung undFunktionsanalyse des Pseudomonas putida KT2440 Genoms:Methodik und Ressourcen. Biologische Sicherheit (Hartmann, A,Hrsg.), Forschungszentrum Jülich (ISBN 3-89336-255-X), 251-257.[19] *Shen, H.H., *Huang, A.-M., Hoheisel, J.D. & *Tsai, S.-F.(2001). Identification and characterization of a SET/NAP proteinencoded by a brain-specific gene, MB20. Genomics 71, 21-33.[20] Hoheisel, J.D. (2001). DNA in me that‘s not my DNA. TrendsBiotechnol. 19, 155-156.[22] Hoheisel, J.D. & *Conway, P.J. (Hrsg.) (2001). AnalyticalBiotechnology. Curr Opin. Biotechnol. 12 (1)[23] Aign, V., Schulte, U. & Hoheisel, J.D. (2001). Hybridisation-based mapping of Neurospora crassa linkage groups II and V.Genetics 157, 1015-1020.[24] Diehl, F., Grahlmann, S., Beier, M. & Hoheisel, J.D. (2001).Manufacturing DNA-microarrays of high spot homogeneity andreduced background signal. Nucleic Acids Res. 29, e38.[25] Frohme, M., *Camargo, A., Czink, C., *Matsukuma, A.Y.,*Simpson, A.J.G., Hoheisel, J.D. & *Verjovski-Almeida, S. (2001).Directed gap closure in large scale sequencing projects. GenomeRes. 11, 901-903.[26] Hauser, N.C., Fellenberg, K., *Rosario, G., Bastuck, S.,Hoheisel, J.D. & *Perez-Ortin, J.E. (2001). Whole genomeanalysis of a wine yeast strain. Comp. Funct. Genom. 2, 69-79.[27] Matysiak, S., Reuthner, F. & Hoheisel, J.D. (2001). Newdevelopments in Spot-synthesis of PNA-arrays. Innovation andPerspectives in Solid Phase Synthesis and CombinatorialChemical Libraries (Epton, R., Hrsg.), Mayflower Worldwide, Bir-mingham, 71-74.[28] Beier, M., Stephan, A. & Hoheisel, J.D. (2001). Synthesis ofphotolabile 5'-O-phosphoramidites for the photolithographicproduction of microarrays of inversely oriented oligonucleotides.Hel. Chim. Acta 84, 2089-2095.[29] Fellenberg, K., Hauser, N.C., Brors, B., *Neutzner, A.,Hoheisel, J.D. & Vingron, M. (2001). Correspondence analysisapplied to microarray data. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10781-10786.[30] Petersohn, A., *Brigulla, M., Haas, S., Hoheisel, J.D., *Völker,U.& *Hecker, M. (2001). Global analysis of the general stressresponse of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183, 5617-5631.[31] Matysiak, S., Reuthner, F. & Hoheisel, J.D. (2001).Automating parallel peptide-synthesis for the production of PNA-library arrays. BioTechniques 31, 896-904.[32] Hoheisel, J.D., Diehl, F., Scheideler, M., Hauser, N., Aign, V.,Matysiak, S. & Beier, M. (2001). Improving DNA-chip technology;chemical aspects. Novel Approaches in Biosensors and RapidDiagnostic Assays (Liron, Z., Brohmberg, A. and Fisher, M.,Hrsg.), Kluwer Academic/Plenum Publishers, London, 165-172.[33] Hoheisel, J.D., Fellenberg, K., Brors, B., Diehl, F., Hauser,N.C. & Vingron, M. (2001). Transkriptionelle Untersuchungen aufDNA-Microarrays; Aspekte der Daten-Evaluation und Interpretati-on. BIOforum 12/01, 908-910.

400


AbteilungH0900Intelligente Bioinformatik Systeme


WissenschaftlerDr. Benedikt Brors Svitlana BulashevskaChristian Conrad Dr. Werber DubitzkyDr. Martin Granzow Dr. Thomas KochmannDr. Rainer König Dr. Olga KrebsDr. Julian Mattes Falk SchubertDr. Wolfgang Tvarusko Dr. Dietmar VolzDr. Jan Wiemer

GastwissenschaftlerDr. Vijayraghavan Sundararajan

HochschulabsolventenChaitanya Athale Daniel BerrarGaelle Dubois Juntao GaoMatthias Gebhard Daniel GerlichKaan Saracoglu Marco Weismüller

DiplomstudentenJasmin Müller Ming Xu

Technische UnterstützungKarlheinz Groß Rolf Kabbe

SekretärinChristina Grosch

Die Gruppe “Intelligente Bioinformatik Systeme arbeitet ander Entwicklung von Technologien in der Bioinformatik undder computergestützten Biologie zur Interpretation vonkomplexen Daten, die im Verlauf analytischer Prozesse inder molekularen Genetik und Zellbiologie generiert wer-den.In den letzten Jahren wurde eine zunehmende Anzahl vonHochdurchsatz-Rasterungs Systemen in der molekularenund zellulären Biologie entwickelt. Während im letztenJahrzehnt die meisten solcher Techniken sich der Sequen-zierung des Humangenoms und anderer Organismen ver-schrieben haben, sind unlängst Techniken aufgekommen,die genomische Struktur-Funktionsbeziehungen untersu-chen.Ein solches Beispiel ist die DNA-Chip Technologie, welcheein Screening der Genexpression aller Gene in einem Or-ganismus unter verschiedenen Bedingungen erlaubt. Die-se Technologie macht die Untersuchung von der geneti-schen Wirkung verschiedener Pharmazeutika möglich undebnet so den Weg, für ein adaptiv, optimiertes Design vonMedikamenten und Therapien.Die Entwicklung von computergestützten Methoden zurAnalyse komplexer Daten in der molekularen Biologie alsauch die Entwicklung von Modellen und computerbasier-ten Methoden in der Zellbiologie ist zentraler Gegenstandunserer Abteilung, die sich im Jahr 2000 am DKFZ eta-blierte. Die Forschungsgebiete von größtem Interesseschließen ein:

a)Data Mining in der molekularen Genetikb)Datenmanagement und verteiltes Rechnenc)Modellierung und Simulation zellulärer Systemed)Biomedizinische Computer Vision unter Verwendung

von geometrischen und dynamischen Modellen.Die zentralen Ergebnisse der Gruppe enthalten auch meh-rere patentierte Software-Systeme, z.B. zum wissen-basierten Data Mining im Life Science Bereich, zur vollautomasierten Diagnostik in der molekularen Zytokenetikund zum Studium von dynamischen Prozessen in leben-den Zellen. Die Gruppe kollaboriert aktiv mit verschiede-nen Partnern, um die aufgebauten Systeme zu vermark-ten.

Abteilung Intelligente Bioinformatik Systeme (B0900)Leiter: Dr. rer. nat. Roland Eils

401




Data Mining in der molekularen GenetikD. Berrar, B. Brors, W. Dubitzky, R. Ei l s,T. Kochmann, J. Müller, F. Schubert

Moderne molekulare Methoden in der Biologie und Medi-zin produzieren eine noch nie da gewesene Fülle von Da-ten, die allein aufgrund ihres Umfangs die Unterstützungaus der Informatik erfordern. Computerbasierte Methodenwurden bisher für Sequenzdaten entwickelt, während Da-ten von DNA Chips, Proteomanalysen durch 2D-Gelelek-trophorese oder Massenspektrometrie, vergleichender ge-nomischer Hybridisierung (CGH), Mehrfarben-Fluores-zenz-In-Situ-Hybrisisierung (MFISH), Loss-Of-Heterozy-gosity Analysen (LOH) und einzelnen Nukleotidpolymor-phismen (SNP) weiterhin eine große Herausforderung fürdie Bioinformatik darstellen.

In unserem Projekt passen wir Methoden aus dem DataMining-Bereich diesen Daten an und entwickeln neue Me-thoden für ihre Analyse [13,16]. Im besonderen streben wirnach Methoden, die uns Verbindungen zwischen solchenmolekular genetischen Daten und klinischen Informationenwie Tumorgröße bzw.Tumorgrad, Krankheitsentwicklungund Ansprechbarkeit auf Chemotherapie aufzeigen[14,17].

Data Mining kann am besten als Prozess verstanden wer-den, der Methoden, Techniken und Werkzeuge aus der In-formatik und Statistik, wie z.B. Datenbanken, Modellierun-gen, maschinelle Lernverfahren, Visualisierungen, statisti-sche Tests und wissensbasierte Systeme umfasst.

Ziel des Data Mining Prozesses ist es, neues Wissen ite-rativ in einem Anwendungsbereich zu entdecken [11]. Je-der Schritt des Data Mining Prozesses beinhaltet eine Teil-aufgabe (z.B. Klassifizierung, Regression, zeitliche Model-lierung oder Clusterung), die durch eine adäquate Technik(z.B. neuronale Netzwerke, Entscheidungsbäume, k-näch-ster Nachbar Klassifikator, Netzwerke nach Bayes undklassische statistische Methoden) gelöst wird [9,14]. Dertypische Arbeitsablauf im Data Mining gestaltet sich dannwie folgt:- Datenvorverarbeitung- Datenvisualisierung, Hypothesengenerierung- Entwurf eines Klassifikators- Training und Validierung eines KlassifikatorsDNA-Mikroarrays stellen ein wichtiges Hilfsmittel auf demWeg des Verstehens von Organismen auf der genomi-schen Ebene dar [8,12]. Transkriptionsaktivitäten von tau-senden Genen können gleichzeitig bestimmt werden undsogar das gesamte Genom eines Organismus kann Ge-genstand einer Untersuchung sein.

Die Anwendung von Datawarehouse-Konzepten und Tech-nologien aus dem Bereich kundenorientierter Geschäfts-prozesse auf genomische Daten ermöglicht ein effizientesData Mining [10]. Wir entwickeln deshalb ein integriertesKonzept, um Mikroarraydaten in einem zentralem Data-warehouse zu speichern und um diese Daten in analysier-ter Form zugänglich zu machen [10, 36]. Dies geschiehtunter Berücksichtigung der Verschiedenartigkeit der expe-

rimentellen Techniken sowie der Beschreibung von Mikro-arrayexperimenten. Darauf aufbauend entwickeln wir Ana-lysetechniken, um allgemeine Analyseprozesse zu etablie-ren wie die Normalisierung von Genexpressionsdaten,Identifizierung von unterschiedlich transkribierten Genenwie auch das Clustering von Proben und Genen in der Da-tenbank.

Zusätzlich wenden wir Techniken an, insbesondere Ent-scheidungsbäume, neuronale Netzwerke und SupportVektor Maschinen. Auf diese Weise können Klassifika-tionssysteme entdeckt und für neue Untersuchungen vor-hergesagt werden. Einige wichtige Beispiele sind die Klas-sifizierung der Ergebnisse von Tumoruntersuchungen aufder Grundlage von bereits vorhandenen Gruppen (Tumor-grad, zytogenetische Daten) oder das Auffinden neuer Un-terklassen in einer Menge von Tumoruntersuchungen ba-sierend auf Genexpressionsprofilen sein.

Wir übertragen solche Analysemethoden auch auf andereDaten der molekularen Genetik, wie CGH, Matrix-CGH,Vielfarben-FISH, LOH Analyse und Proteomanalyse.

DatenmanagementR. Eils, K.H. Groß, R. Kabbe, O. Krebs

Forschungsgruppen am DKFZ und an anderen Partner-instituten erzeugen eine große Menge an Daten im Be-reich der Mikroarray Technologie, die gespeichert und ver-waltet werden müssen.

Um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden, haben wir einArray Informatik System konzipiert und implementiert, dassowohl das Datenmanagement wie auch die Datenanalyseintegriert. Es ist beabsichtigt, RNA Expressionsdaten mitanderen funktionellen genomischen Daten zu integrierenund zu unterstützen. Die Funktionalität der Platform reichtvom Speichern der Daten in relationalen Datenbank-managementsystemen (gegenwärtig Oracle RDBMS aufeinem Unix System), einem Datawarehouse bis zu Front-End Werkzeugen zur Präsentation und Pflege von Daten.

Das Oracle Datenbank-Schema iChip speichert Informa-tionen zur detaillierten Beschreibung von biologischenProben und Klonen, Bilddaten, Hybridisierungsbedingun-gen, Experimentdaten, Genexpressionswerten (Rohda-ten), Qualitätsindikatoren und beschreibende Informatio-nen.

Das Datawarehouse sammelt und transformiert konsisten-te Daten aus einer Vielzahl von Datenquellen und spei-chert diese auf einem separaten Server. Dies kann als dasBereitstellen einer physikalischen Sicht verstanden wer-den, um eine sich anschließende Analyse zu vereinfachen.Der Datenzugriff für OLAP- und Datamining-Tools kann soauf SQL-Ebene erfolgen [15].

Ein kommerzielles Middleware-Produkt, der Oracle Appli-kations Server 9iAS, wird eingesetzt, um Forscher mit ei-nem Web-Interface (Portal) bei interaktiven Suchanfragenan verschiedene interne und öffentliche Datenbanken,Eingaben, Aktualisierungen und der Darstellung der Datenzu unterstützen.

402




Eine integrative Toolbox für den Zellkern aufPortalbasis unterstützt durch Grid-ResourcenR. Eils, V. Sundararajan, W. Tvarusko, M. Xu

In diesem Projekt werden verschiedene Softwareapplika-tionen aus der Bildverarbeitung und Computergraphik mitSimulations- und Modellierungsapplikationen integriert.Diese integrative Darstellung trägt den neuen Herausfor-derungen und Abläufen in der Systembiologie Rechnungund wendet sich mit ihrer offenen, webbasierten Architek-tur an Forscher im Bereich des Zellkerns.

Das traditionelle Modell einer Softwareanwendung wird er-setzt durch ein modernes, weborientiertes Prozeßmodell.Dieser Ansatz erlaubt die Integration von Tools, die aufverschiedenen Platformen innerhalb des LANs laufen. DieArchitektur soll so gestaltet werden, daß auf lange Sichtauch andere Gruppen die Möglichkeit haben, ihre Applika-tion in diesen Single-Point-Of-Access einzubringen. Zu-dem werden diese integrierten Anwendungen auf denDesktops der registrierten Endbenutzer über einen her-kömmlichen Browser unabhängig vom geographischen Ortzugänglich sein. Die Pflege dieser Applikationen wird effi-zienter, zumal aktualisierte Versionen der Tools schnell in-tegriert und so sofort der Forschergemeinschaft zur Verfü-gung stehen. Dies trägt der rasanten Entwicklung, die wirheutzutage in der Bioinformatik erleben, Rechnung.

Zusätzlich können aufgrund der zentralen Verwaltungauch Grid-Computing Resourcen zentral verfügbar ge-macht werden. Die akkurate Simulation von komplexenbiologischen Prozessen macht es erforderlich eine hoheräumliche und zeitliche Auflösung zu erreichen, um auchkleinskalige Details aufzulösen. Die Kopplung mit verteil-ten Resourcen innerhalb eines intgrierten privaten Gridskann in solchen Situationen verwandt werden, um Auflö-sungsbarrieren zu überwinden und so zu neuen qualitativehochwertigen Ergebnissen zu gelangen.

Modellierung und Simulation zellulärer SystemeNach der beinahen Vervollständigung der HumangenomSequence verschiebt sich der Forschungsschwerpunkt zueiner umfassenderen Sicht zellulärer Systeme die ver-schiedene biologische Disziplinen und Prozesse miteinan-der verbindet.

Die Kommunikation der Zelle mit ihrer Umgebung könnteam Anfang einer solchen Sichtweise stehen. Mit der Wei-tergabe von Signalen reagieren Zellen auf äußere Stimuliund ihre Fehlfunktion ist verantwortlich für eine Reihe vonbekannten Krankheiten. Experimentelle Studien könnenergänzt werden durch die Modellierung und die Simulationvon Signalwegen basierend auf großen Transduktions-Da-tenbanken.

Betreten wir den Zellkern, so müßen wir feststellen, daßunser Wissen über die örtliche Verteilung der Signale undiher Verarbeitung gering ist. Das Verständnis von Design-prinzipien , die die Architektur des Zellkerns bestimmen, istdeshalb von großem Interesse. Bildverarbeitungs- undComputergraphikwerkzeuge [2,32,39] zur quantitativenBewertung mikroskopischer Daten und die mathematischeModellierung werden uns helfen die Dynamik des Zusam-

menbruchs und den Wiederzusammenbau des Zellkernswährend der Mitose zu verstehen [7]. Werkzeuge zur Ma-thematische Modellbildung und Simulation werden auchbei der Interpretation von FRAP-Experimenten eingesetzt,um auf diese Weise die Organisationsprinzipien des mole-kularen Transports im Interphasekern zu erforschen [6,18,19].

Neueste Fortschritte in der DNA Microarray Technologieerlauben die Quantität als auch den Expressionslevel vie-ler Gene im Kern synchron zu messen, wenn sie sich überdie Zeit hinweg als Reaktion auf externe Stimuli ändern.Ausgehend von den genomischen Daten, können Bayes-sche Netzwerke die Geninteraktion auf Transkriptionsebe-ne rekonstruieren; sogar auf inverser und quantitativerWeise [20].

Proteinfaltung ist ein fundamentaler Schritt während derGenexpression. Die Evolution der Proteinstrukturen durchgenetische Algorithmen (GA) erforscht die physikalischenPrinzipien hinter dem Faltungsprozeß.

Ein weiterer Schritt hin auf eine systematische Beschrei-bung der Zelle ist die zelluläre Lokalisierung und Morpho-logie der Proteinmaschinerie bei unterschiedlichen Bedin-gungen. Im Verlauf von Hochdurchsatz-Inhaltsassays vonZellen wird unter Verwendung von überwachten neurona-len Bildklassifikatoren bei tausenden von unbekanntenProteinen eine automatische Zuordnung versucht [37]. Dieidentifizierten Proteinsysteme werden modelliert als Netz-werke und assoziiert mit dem Verhalten und der Topologievon gut verstandenen metabolischen Netzwerken. Gen-expressionsprofile liefern die Basis für den Verbund kom-munizierender Netzwerke.

Mit der aufkommenden Flut verschiedener biologischerDaten werden Modellierungs- und Simulationstechnikeneine Schlüsselrolle beim Verständnis zellulärer Systemeund ihren Interaktionen spielen.

SignaltransduktionG. Dubois, R. Eils, M. Weissmüller

Eine fehlerhafte Signalweitergabe führt zu einem anorma-len Zellverhalten. Folglich hat die Signaltransduktion einenbesonderen Stellenwert in der Krebsforschung. Wir model-lieren Signaltranduktionsnetzwerke in silico.

Vom Ansatz her werden gesamte Signalnetzwerke objekt-orientiert modelliert und so auf den Signalfluß geschlos-sen. Da quantitative, experimentelle Daten nur für gut ver-standene Signalwege in Form von Konzentrationen oderAktivitätsraten zur Verfügung stehen, gehen wir bei derModellierung semi-qualitativ vor.

Eine sehr reichhaltige Datenquelle für qualitative Signal-transduktionsdaten ist die Datenbank TRANSPATH(R).Daten werden aus TRANSPATH(R) in eine lokale Daten-bank übergeführt, um daraus Modelbeschreibungen zugenerieren, die als Input für das Swarm-System dienen.Das Swarm-System ist ein Universalsimulator, der mitAgenten arbeitet und in Objective-C implementiert ist.

403




Dynamik des ZellkernsC. Athale, D. Gerlich, R. Eils, D. V olz, W. Tvarusko,M. Xu

Dynamische Prozesse im Zellkern während der Interphaseund der Zellteilung sind Phänomene von langanhaltendemInteresse [2,4,18,19]. Die Organisationsprinzipien des mo-lekularen Transports im Interphasekern sind der Fokus ei-nes Projekts [18,19] während ein anderes sich mit demZusammenbruch und der Rekonstruktion des Zellkernswährend der Zellteilung beschäftigt [7].

Transport-Phänomene im InterphasekernErst kürzlich wurden beim Studium der Transportdynamikvon fluoreszenzierenden Molekülen im Kern die Prinzipiender nuklearen Architektur addressiert. Der letzte Modellie-rungsansatz konnte zeigen [19], daß Annahmen vondurchmischten Kompartments gut übereinstimmen mit ent-sprechenden quantitativen Daten, im Widerspruch zu an-derseits lang gepflegten Modellen. Um diese Widersprü-che zu lösen, sind wir dabei diese Modelle zu verbessern,indem wir auch anisotrope Effekte berücksichtigen. Dieserfordert allerdings Daten höherer Auflösung. Unserer An-satz führt auf zweierlei Probleme, die wie folgt beschrie-ben werden:

a)Das Vorwärts-ProblemAusgehend von biologischen Erkenntnissen der Chrom-matinverteilung im Interphasekern werden verschiedeneSzenarien der Ausgleichsdynamik nach FRAP-Einwirkungsimuliert und mit experimentellen Daten verglichen. Appro-ximativ läßt sich als mathematisches Modell, das dieseDynamik beschreibt, eine Dffusionsgleichung ansetzen,welche mit Hilfe des sogenannten UG-Tools, das im Inter-disziplinären Zentrum für Wissenschaftliches Rechnen(IWR) in Heidelberg entwickelt wurde, gelöst wird. Mit Hilfevon Multigridtechniken und einer optionalen Parallelisie-rung löst UG effizient Transportgleichungen numerisch.Verbesserte Modelle von Transport-Phänomenen im Zell-kern können innerhalb von UG ebenso behandelt werden,z.B. um einen Konvektionsterm mit einzubauen falls nötig.Einer verbesserten Datenakquisition als Folge neuer Ex-perimentiertechniken wird mit exakteren mathematischenMethoden begegnet.

b)Das Inverse-ProblemBei diesem Ansatz wurde die Diffusionsdynamik von intra-nuklearen Molekülen untersucht unter Verwendung vonDaten aus Bleaching-Experimenten hoher Auflösung, umeinen Diffusionstensor zu bestimmen. Das inverse Poblemder Parameterbestimmung wurde gelöst unter Verwen-dung eines Programmcodes, der die Fundamentallösungeiner zeitabhängigen Diffusionsgleichung implementiert.

Dynamik der Zellkern-Architektur während derMitoseEin wesentlicher Schritt zur Interpration von dynamischenBilddaten war die Entwicklung von computerbasierten Me-thoden für eine automatische quantitative Analyse undraumzeitlichen Visualisiierung [2, 4, 23, 32]. Ein detaillier-tes Verständnis der komplexen dynamischen Prozesse wieden Zusammenbruch und die Rekonstruktion des Zell-

kerns während der Mitose kann nur erreicht werden, wennMikroskopie in drei räumlichen Dimensionen über die Zeit(4D-Imaging) durchgeführt wird [7]. Im folgenden Projektwurde eine neue Technik entwickelt, die eine voll automa-tische quantitative Analyse und Visualisierung von Oberflä-chen dreidimensionaler dynamischer Fluoreszenzstruk-turen realisiert. Mit diesem Verfahren wurde die Dynamikder nuklearen Architektur während der Zellkernteilung un-tersucht.

Um die verrauschte Bildqualität in Videoaufnahmen von le-benden Zellen zu kompensieren, wird ein anisotroperDiffusionsfilter angewandt, der nur glättet in Gebieten miteiner homogenen Bildinformation ohne die gesamte Mor-phologie zu stören. Nach Schwellenbildung in segmentier-ten z-Schnitten werden interpolierte 3D Oberflächen re-konstruiert. Dieser Ansatz hat sich angemessen bewährtbei der großen anzutreffenden Anisiotropie der 4D Aufnah-men als Folge der schlechten z-Auflösung. Ein Morphingzwischen den 3D Oberflächen über die Zeit hinweg führtauf eine kontinuierliche Rekonstruktion der gesamten 4DDaten [7]. Gobale Rotations- und Translationsbewegun-gen in einer Zeitserie werden automatisch korrigiert durcheinen rigiden Transfomationsansatz. Die animierte Ober-fächenrekonstruktion ist eingebettet in einen mehrdimen-sionalen Sceneviewer, der Benutzerinteraktion in Echtzeiterlaubt. Die binarisierten Objektrepräsentationen werdenverwandt, um die Volumen- und Fluoreszenzintensitätüber die Zeit zu quantifizieren [32].

Diese Bildverarbeitungs- und Computergraphikmodulewurden verwandt bei der Analyse der Dynamik in Inter-phase- und mitotischen Zellkernen [7]. Insbesondere dieChromosomendynamik im Verlauf der Mitose [26] und dieRekonstruktion der Zellkernhülle wurden detailliert unter-sucht. Weitere Anwendungen der entwickelten Technikanalysierten den Zusammenbruch der nuklearen Hülle[27], die Bewegung von PML-Bodies [28], die Dynamik nu-klearer Speckles [4], die Lokalisierung von Methyl-DNABindungsproteinen [29], die sekretorische Vesikeldynamik[3] und die Bewegung von markierten Centromeren in le-benden Zellen.

Simultane Detektion und Deskrimination der 24menschlichen ChromosomenR. Eils, K. Saracoglu

Mehrfarben-Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (M-FISH)ist eine kombinatorische Färbetechnik zur gleichzeitigenErkennung und Unterscheidung der 24 menschlichenChromosomen. Diese Technik hat sich als recht erfolgreicherwiesen, um strukturelle und numerische Abberrationenin Krebszellen zu identifizieren. Ein automatischer Klassi-fizierungsansatz mit der Bezeichnung goldFISH wurde inder Gruppe entwickelt, der Richtungen im Farbenraum miträumlicher Information kombiniert [33, 34, 35, 41]. DieseMethode kann verwandt werden, um die Klassifizierungs-genauigkeit von herkömmlichen M-FISH Ansätzen zu ver-bessern.

404




Modellierung von pathogenetischen Prozessenin Krebs basierend auf cytogenetischen undgenetischen DatenS. Bulashevska, R. Eils

Fortschritte in der molekularen Genetik haben die Mengevon experimentellen Daten exponentiell ansteigen lassenund erlauben Forschern neue Einsichten in komplexeFunktionen von normalen Genomen und Tumorgenomen.

Entwicklungen in der Zytogenetik machen es möglich dasgesamte Genom im Rahmen eines Experimentes auf chro-mosonale Abweichungen hin zu untersuchen. Diese Me-thoden beinhalten die vergleichende genomische Hybridi-sierung (CGH), verschiedene in situ Hybridisierungstech-niken (FISH) und Mehrfarben-Fluoreszenz-In-Situ-Hybridi-sierung (MFISH), Methoden zur Detektion von Instabilitä-ten in Allelen wie der Loss-Of-Heterozygosity (LOH). Eswurde gezeigt, daß chromosonale Abweichungen verbun-den sind mit der Initiierung und dem Fortschritt von Krebs.Der Verlust von Chromosomenregionen kann zu der Inak-tivierung oder dem Verlust der Funktionalität von soge-nannten Tumor-Suppressor-Genen führen. Die Zunahmevon chromosomalen Regionen kann die annormale Akti-vierung oder Überexpression von Onkogenen, verantwort-lich für annormales Zellwachstum, verursachen. Die Ge-ne, welche für die Zellzyklus-Regulation verantwortlichsind, sowie die resultierenden Transkriptionsfaktoren,Wachstumsfaktoren, Rezeptoren von Wachstumsfaktoren,etc. werden als Konsequenz der Abweichungen deregu-liert. Die zytogenetischen Methoden versorgen die For-scher mit experimentellen Daten, die es erlauben Hypo-thesen über Tumor-Pathogenetische-Prozesse abzuleiten.

Die Mikroarraytechnologie ermöglicht, Expressionslevelvon tausenden von Genen gleichzeitig zu messen, wie siesich über die Zeit hinweg verändern und auf externe Sti-muli reagieren. Unterschiedlich expremierte Gene, wirdpostuliert, gehören zu unterschiedlich funktionalen Grup-pen. Die große Herausforderung in der funktionalen Ge-nomik ist es, die Mechanismen der Genregulation aufzu-decken.

Das Hauptgebiet unserer gegenwärtigen Forschung ist dieAnwendung der Theorie des Lernens und der Folgerung inPropabilistischen Netzwerken. Stochastische Prozessewerden modelliert, um die probabilistischen Abhängigkei-ten in den zugrundeliegenden genetischen und zytogene-tischen Daten aufzudecken.

Die vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) er-laubt die umfassende Detektion von Zunahmen und Verlu-sten chromosomaler Regionen im gesamten Genom. DieHerausforderung unser Arbeit besteht darin, ausgehendvon der Momentaufnahme der genomischen Aberrationen,den möglichen Fluß des Fortschreitens dieser genetischenAbweichungen zu rekonstruieren.

Wir verwenden Bayessche Netzwerke, die es uns ermögli-chen, probabilistische Abhängigkeiten zwischen Zufalls-variablen aufzudecken und zu quantifizieren. Mit dieserMethode, angewandt auf CGH-Daten von Magen-darm-Tumoren, werden Muster der genetischen Aberrationen

gefunden und frühe und späte Aberrationen vorgeschla-gen, die zur Bildung von Tumorphenotypen beitragen.

Ein Teil unseres Projektes war die Entwicklung eines Soft-ware-Tools zum Parsen der zytogenetischen Daten, washerkömmlich mit der besonderen Notation ISCN’95 be-zeichnet wird [20]. Das Konzept unseres ISCN Parsers be-läuft sich kurzum darauf, daß es ISCN als formale Spracheübersetzen kann. Wir haben die Grammatikregeln fürISCN in Extended-Backus-Naur-Form (EBNF) aufgestellt.

Gegenwärtig arbeiten wir an weiteren Anwendungen vonprobabilistischen graphischen Modellen, insbesondere Dy-namische Bayessche Netzwerke angewandt auf Micro-array-Daten mit dem Ziel, die genetischen regulativen Me-chanismen zu identifizieren.

Protein-FaltungR. Eils, V. Sundararajan

Proteinstrukturbestimmug ist eines der faszinierensdenForschungsgebiete für Strukturbiologen. Eines der Haupt-ziele bei der Strukturbestimmung ist es, die Verbindungzwischen der Protein-Sequenz, der -Struktur, -Stabilität so-wie der -Funktion aufzudecken. Wir entwickeln in silicoSimulationsmethoden für die Strukturentstehung von Pro-teinen und Polypeptiden unter Verwendung von evoluti-onsbasierten Techniken wie genetische Algorithmen (GA)[1, 5, 21, 30].

Die Methode zur Proteinstrukturbestimmung basiert aufzwei Hypothesen:a) Die Proteinstruktur evolviert durch jeweiliges Hinzufü-

gen einer oder meherer Aminosäuren .b) Zu Beginn entsteht die Proteinstruktur in Segmenten

sehr schnell, bevor sich die kombinierte, globale Formals native Struktur herausbildet.

Zwei Strategien werden verfolgt, um die aufgeführten Hy-pothesen zu verifizieren.a) Evolution der Moleküle durch Hinzufügen von

Cminosäuren gemäß Genetische Algorithmen.b) Bei der Optimierung wird das Molekül in Fragmente

zerlegt, die unter Verwendung von genetischen Algo-rithmen auf verschiedenen Prozessoren evolvieren undperiodisch global bewertet werden.

Die Haupttorsionswinkel der Molekülketten werden als Ba-sisvariablen zur Berechnung des Energieminimums be-nutzt.

Zelluläre LokalisierungC. Conrad, R. Eils, V. Sundararajan

In lebenden Zellassays können Proteine Bindungen mitdem spektralem Mutanten des Green Fluorescent Proteins(GFP) eingehen und auf diese Weise ein Fluoreszenzpro-dukt bilden, wenn sie in Zellen exprimiert werden. GFPbindene Proteine wie auch mit Fluoreszenz markierte Anti-körper werden verwendet, um die Genexpression und ihreLokalisierung im lebenden Mechanismus zu überwachen.Das manuelle Screening von tausenden von Proteinen ist

405




jedoch sehr arbeitsintensiv und zudem sehr abhängig vonder subjektiven Bewertung des ausgebildeten Personals.

Für diese Problemstellung wird ein neues Softwaresystemzur automatischen, lernbasierten Detektion und Klassifizie-rung verschiedener Zellstrukturen aufgebaut [37]. Nach er-folgter Bildvorverarbeitung und der automatischer Detek-tion von Zellen werden Proteinmuster durch Klassifikato-ren erfaßt, die durch lernende neuronale Netzwerke trai-niert werden. Die Software ordnet automatisch mit großerPräzision markierte Proteine funktionellen Klassen zu. Sokönnen z.B. funktionelle Klassen bezogen werden auffunktionelle Einheiten wie Organellen, das Zytoplasma,Chromatin oder auf funktionelle Zellzustände (wie z.B.Zelltod).

Modellierung Metabolischer NetzwerkeR. Eils, R. König

Metabolische Netzwerke werden der KEGG Datenbankentnommen und unseren Bedürfnissen angepaßt. EinPetri-Netz wird mit Enzymen und Metaboliten als abwech-selnde Knoten aufgebaut. Öffentlich zugängliche Genex-pressionen, z.B. von der Stanford Datenbank, werden be-nutzt, um Abstände zu bestimmen. Die Netztopologie wirduntersucht mit einer Auswahl verschiedener multivarianterDatenanalysetools. Das Verhalten des Netzwerks wird un-ter verschiedenen Einwirkungen, wie Hitze- oder Hunger-streß, und Medikamenteinwirkungen beobachtet.

Biomedizinische Computer Vision unterVerwendung von geometrischen unddynamischen ModellenR. Eils, J. Fierres, J. Gao, M. Gebhard, J. Mattes

Das Projekt konzentriert sich auf die Analyse von Bewe-gungen und Deformationen von räumlichen Datensequen-zen. Einerseits untersuchen wir mit Methoden der Compu-ter Vision die Quantifizierung, Visualisierung und Bewe-gungskorrektur von dynamischen Prozessen [2, 32, 38]und bewerten mit statistischen Methoden die quantifizier-ten Daten [28]. Alle Schritte sind von Bedeutung: Die Bild-segmentierung, die “Non-Rigid Registration”, die compu-tergraphische Visualisierung bis hin zur Modellierung vondynamischen Oberflächen. Entsprechen anderseits dieverschiedenen Datenmengen keinen zeitlichen Sequen-zen sondern eher einer Objektfamilie des gleichen Typs,so steht die Erhaltung anatomischer und topologischerMerkmale im Blickpunkt und Unterschiede werden stati-stisch charakterisiert.

Wir arbeiten an mehereren anwendungsorientierten Pro-jekten, die die Dynamik des Zellkerns und die Erhaltungseiner Architektur zum Gegenstand haben [23], als auchZellmembranbewegungen untersuchen.

Eine Softwareplatform wurde mit Hilfe von C++, OpenInventor und MFC für das Windows Betribssystem entwik-kelt und integriert die unterschiedlichen Module der Reg-istration, Quantifizierung, Bewegungskorrektur und Visuali-sierung [28, 38]. Gegenwärtig wird es mit weiteren Pro-

grammen zur Bestimmung des Confinement Trees und derVisualisierung von Trajektorien in Bildsequenzen vereint,durch neue Routinen erweitert und in Java gekappselt.

MethodenDie Entwicklung von Techniken konzentriert sich gegen-wärtig auf folgende Themengebiete (in Schlüsselwörtern):a) Objektsegmentierung durch deformierbare Modelle

[24]: Level Sets, Aktive Konturen, Gradientenvektorfluß-felder, Optimierungstechniken, Tensorprodukt B-Spline-flächen, Oberflächenrekonstruktion.

b) Objektverfolgung und Visualisierung von Trajektorien[2, 32]: Fuzzy Logik, kubische B-Splines, raumzeitlicheRekonstruktion, Bewegungsanalyse.

c) Schätzung und Analyse von Bewegung und Deformati-on durch Registrierung aufeinanderfolgender Bilddaten-stapel, insbesondere um Bewegung zu quantifizierenund visualisieren [25,31]: Thin-Plate-Splines, 3D-Gra-phik und Visualisierung, geometrische Algorithmen(nächster Nachbar), Ähnlichkeitsmaße, Landmarks.

d) Statistische Analyse für eine prägnante Beschreibungvon quantifizierten Werten [22, 23]: Dichte basierteClusteranalyse, Confinement Tree Analyse, Hauptkom-ponentenanalyse (zur PDM Rekonstruktion), Histo-grammanalyse, und Baumabbildungsmaße.

e) Vergleich der extrahierten Bewegungen mit gegebenenBewegungsmodellen: Dynamische Oberflächenmo-delle, Finite Elemente Analyse, Modellierung von Ge-webe- und Polymerdynamik, starre und affineBewegungsmodelle, physikalische Modelle (Diffusion,Hdrodynamik, Membranen).

Anwendungen:a) Quantifizierung der Erhaltung von Chromosomen-

territorien anhand von FISH Anfärbung zweier verschie-dener Chromosomen.

b) Zusammenbruch des nuklearen Kerns und Bildung desnuklearen Porenkomplexes [27].

c) Charakterisierung von Zelldeformation und –migration.d) Kompensierung von rigiden, affinen und nicht-affinen

Deformationen während der Teilchenverfolgung.e) Kompensierung von Verzerrungen bei einem MRT-Ge-

rät in Bezug auf ein zweites.f) Morphing von Knochen.

Forschungsstipendien1997-1999: Forschungsstipendium innerhalb des DeutschenHumangenom-Projektes (ungefähr 850 000 DM auf drei Jahre);1998-2001: Forschungsstipendium von der Deutsch-IsraelischenGesellschaft für wissenschaftliche Forschung und Entwicklung(G.I.F. no. 6-491-112.13/96; ca. 60 000 DM auf drei Jahre);1998-2001: Forschungsstipendium von der Deutschen For-schungsgemeinschaft, Forschergruppe “Image Sequence Analy-sis” (FOR 240; ca. 240 000 DM auf drei Jahre)1999-2002: Forschungsstipendium innerhalb des DeutschenHumangenom-Projektes (GF KW 01619098; ungefähr 404 000DM auf drei Jahre.1999-2004: BioFuture Stipendiumverliehen durchs BMBF (BEO/31/11880; ungefähr 2.4 Millionen DM auf fünf Jahre).

406




Publikationen[1] L.A. Anbarasu, P. Narayanasamy and V.Sundararajan, MultipleSequence Alignment by Parallely Evolvable Genetic Algorithms.Proceedings of Evolutionary Computing and Parallel ProcessingWorkshop[2] Tvaruskó, W., M. Bentele, T. Misteli, R. Rudolf, C. Kaether,D.L. Spector, H.H. Gerdes, and R. Eils, Time-resolved analysisand visualization of dynamic processes in living cells. Proc NatlAcad Sci U S A, 1999. 96(14): p. 7950-5.[3] (1999) Orlando, USA.Rustom, A., D. Gerlich, R. Rudolf, C.Heinemann, R. Eils, and H.H. Gerdes, Analysis of fast dynamicprocesses in living cells: high-resolution and high-speed dual-color imaging combined with automated image analysis.Biotechniques, 2000. 28(4): p. 722-8, 730.[4] Eils, R., D. Gerlich, W. Tvarusko, D.L. Spector, and T. Misteli,Quantitative imaging of pre-mRNA splicing factors in living cells.Mol Biol Cell, 2000. 11(2): p. 413-8.[5] L.A. Anbarasu, P. Narayanasamy and V. Sundararajan, Multi-ple molecular sequence alignment by island parallel geneticalgorithm. Current Science Vol. 78 (7) (10 April 2000) pp858-63.[6] C. Athale, M. Reichenzeller, H. Herrmann, P. Lichter, R. Eils.Modeling the polymerization kinetics and geometry of proteinassembly in interchromosomal domains (ICD). Abstract at theAmerican Society of Cell Biology ASCB, San Francisco, USA.[7] Gerlich, D., J. Beaudouin, M. Gebhard, J. Ellenberg, and R.Eils. Four-dimensional imaging and quantitative reconstruction toanalyse complex spatiotemporal processes in live cells. Nat CellBiol, 2001. 3(9): p. 852-5.[8] Beißbarth, T., Fellenberg, K., Brors, B., Arribas-Prat, R., Boer,J.M., Hauser, N.C., Scheideler, M., Hoheisel, J.D., Schütz, G.,Poustka, A., Vingron, M. (2001) Processing and quality control ofDNA array hybridization data. Bioinformatics 16:1014-1022.[9] Berrar, D., Dubitzky, W., Granzow, M., Eils, R. (2001) Analysisof gene expression and drug activity data by knowledge-basedassociation mining. In: Proc. Critical Assessment of MicroarrayData Analysis. pp 23-28 (Duke Univ., Durham, NC).[10] Berrar, D., Dubitzky, W., Solinas-Toldo, S., Bulashevska, S.,Granzow, M., Conrad, C., Kalla, J., Lichter, P., Eils, R. (2001) De-sign and implementation of a database system for comparativegenomic hybridization analysis. IEEE Eng. Med. Biol. 20:75-83.[11] Berrar, D., Granzow M., Dubitzky W., Stilgenbauer S.,Wilgenbus K., Döhner H., Lichter P., Eils R. (2001) New insightsin clinical impact of molecular genetic data by knowledge-drivendata mining. In: Proc. 2nd Int. Conference on Systems Biology. pp275-281 (Omnipress, Madison, WI).[12] Dubitzky, W., Berrar, D., Granzow, M., Eils, R. (2001)Detecting broad-band and selective correlation patterns amonggene expression and drug activity data. In: Proc. CriticalAssessment of Microarray Data Analysis. pp 17-22 (Duke Univ.,Durham, NC).[13] Dubitzky, W., Granzow, M., Berrar, D. (2001) Data mining andmachine learning methods for microarray analysis. In: Lin, S.M.,Johnson, K.F. (eds): Methods of Microarray Data Analysis: Papersfrom CAMDA’00. pp 5-22 (Kluwer Academic Publishers, London/New York).[14] Dubitzky, W., Granzow, M., Berrar, D. (2001) Comparingsymbolic and subsymbolic machine learning approaches toclassification of cancer and gene identification. In: Lin, S.M.,Johnson, K.F. (eds): Methods of Microarray Data Analysis: Papersfrom CAMDA’00. pp 151-166 (Kluwer Academic Publishers, Lon-don/New York)[15] Dubitzky, W., Krebs, O., Eils, R. (2001) Minding, OLAPing,and mining biological data: Towards a data warehousing conceptin biology. In: Proc. Network Tools and Applications in Biology(NETTAB). pp 78-82 (Genova, Italy, 17.-18.05. 2001)

[16] Fellenberg, K., Hauser, N.C., Brors, B., Neutzner, A.,Hoheisel, J.D., Vingron, M. (2001) Correspondence anaylsisapplied to microarray data. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.98:10781-10786[17] Granzow, M., Berrar, D., Dubitzky, W., Schuster, A., Azuaje,F., Eils, R. (2001) Tumor classification by gene expressionprofiling: Comparison and validation of five clustering methods.ACM SIGBIO Newsl. 21:16-22.[18] C. Athale, M. Reichenzeller, H. Herrmann, P. Lichter, R. Eils(2001). Imaging and Modeling the Assembly Kinetics of Temper-ature Sensitive Vimentin in the Nuclear Interchromosomal Domain(ICD). Abstract and Poster at The 1st International Symposium onComputational Cell Biology, Lenox, MA, USA.[19] C. Athale , M. Reichenzeller, H. Herrmann, P. Lichter, R. Eils(2001). Imaging and Modeling the Dynamics of fluorescent probesin the Inter Chromosomal (ICD). Short communication at the„ESMTB School- Biology and Mathematics of Cells: Physiology,Kinetics and Evolution. Sigüenza, Spain.[20] Bulashevska S, Groll A, Eils R (2001) “ISCN Parser”: a Soft-ware Tool for Interpreting Cytogenetic Data Notated in The Inter-national System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN1995) In Proc. of NETTAB Network Tools and Applications inBiology Conference, Genoa, Italy.[21] L.A. Anbarasu, P. Narayanasamy and V. Sundararajan, Paral-lel Genetic Algorithms for performance driven sequencealignment. Late breaking Paper, Genetic and EvolutionaryComputation Conference (2001) San Francisco, USA.[22] J. Mattes and J. Demongeot. Structural outlier detection forautomatic landmark extraction . In: SPIE Medical Imaging 2001:Image Processing, San Diego, 19.-22. Feb. 2001, Proceedings ofSPIE 4322 (2001) 602-610[23] J. Mattes, J. Fieres, J. Beaudouin, D. Gerlich, J. Ellenberg,and R. Eils. New tools for visualization and quantification indynamic processes: Application to the nuclear envelope dynamicsduring mitosis. In: MICCAI 2001 Lecture Notes in ComputerScience 2208, Springer-Verlag (2001) 1323-1325[24] Gebhard, M., Mattes, J., Eils, R.: An active contour model forsegmentation based on cubic B-splines and Gradient Vector Flow.In: MICCAI 2001 Lecture Notes in Computer Science 2208,Springer-Verlag (2001) 1373-1375[25] J. Fieres, J. Mattes, R. Eils. A point set registration algorithmusing a motion model based on thin-plate splines and pointclustering. In: B. Radig, S. Florczyk (Eds.) In: Pattern RecognitionDAGM 2001, Munich, Germany, Lecture Notes in ComputerScience 2191, Springer-Verlag (2001) 76-83[26] Gerlich, D., B. Kalbfuss, J. Beaudouin, N. Daigle, J. Ellen-berg, and R. Eils, Inheritance of chromosome topology throughoutmitosis. 2002. In Revision.[27] Beaudouin, J., D. Gerlich, N. Daigle, R. Eils, and J. Ellen-berg, Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina. Cell, 2002. 108(1): p. 83-96.[28] Muratani, M., D. Gerlich, S.M. Janicki, M. Gebhard, R. Eils,and D.L. Spector, Metabolic-energy-dependent movement of PMLbodies within the mammalian cell nucleus. Nat Cell Biol., 2002. 4:p. 106-110.[29] Marhold, J., M. Zbylut, D.-H. Lankenau, M. Li, D. Gerlich, E.Ballestar, B.M. Mechler, and F. Lyko, Stage-specific chromosomalassociation of Drosophila dMBD2/3 during genome activation.Chromosoma, 2002. in press.[30]Multiple Sequence Alignment using parallel adaptive geneticalgorithm, L.A. Anbarasu and V. Sundararajan, InternationalConference on Bioinformatics (InCoB): North-South Networking(2002)Bangkok, Thailand.[31] J. Mattes, J. Fieres, R. Eils. A shape adapted motion modelfor non-rigid registration. In: SPIE Medical Imaging 2002: ImageProcessing, San Diego, 23.-28. Feb. 2002, Proceedings of SPIE4684 (in press)

407




Ausgewählte Patente[32] R. Eils, W. Tvarusko, M. Bentele (1998/9) Time-resolvedanalysis and visualization of dynamic processes in biologicalsystems. German (DPMA 198 58 123.8) and U.S. patent pending.[33] R. Eils, K. Saracoglu, M. R. Speicher (1999) Method andmulti-purpose imaging system for chromosomal analysis based oncolor and region information. European Patent (PCT/EP00/06138)pending.[34] M. R. Speicher, R. Eils et al. (1999) A method for thegeneration of repeat-depleted DNA. European Patent pending.[35] M. R. Speicher, R. Eils et al. (1999) Simultaneousvisualization of eu- and heterochromatin. European patentpending.[36] R. Eils, W. Dubitzky, P. Lichter (2000) Ein Datamining-Systemzur vergleichenden, automatischen Klassifikation von Tumorenbasierend auf chromosomalen Aberrationsmustern. European pa-tent pending.[37] R. Eils, C. Conrad, W. Dubitzky, J. Ellenberg (2000)Classification of subcellular structures by a machine learningapproach. European patent pending.[38] J. Mattes, J. Fieres, R. Eils, and J. Demongeot. QuantitativeAnalyse, Visualisierung und Bewegungskorrektur in dynamischenProzessen (German Patent Pending 101 11 226.2 and 101 44629.2 PCT Patent Application)Dissertationen[39] W. Tvarusko (2000) Zeitaufgelöste Analyse und Visualisie-rung in lebenden Zellen. Ph. D. thesis, University of Heidelberg.[40] K. Sätzler (2000) 3D-Rekonstruktion elektronen-mikroskopischer Serienschnitte. Ph.D. thesis, University of Heidel-berg.[41] K. Saracoglu (2001) Ein automatischer Klassifizierungsan-satz mit der Bezeichnung goldFISH. Ph.D. thesis, University ofHeidelberg.[42] D. Gerlich (2002) Dynamics of nuclear architectureinvestigated by live cell microscopy and quantitative 4Dreconstruction. Ph.D. thesis, University of Heidelberg.

408


R0700Zentrale Einheit Biostatistik


Wissenschaftliches PersonalDipl. Stat. Axel BennerDr. rer. nat. Iris GeislerDr. rer nat. Carina IttrichPD Dr. rer. nat. Annette Kopp-SchneiderDipl. Math. Lothar PilzDr. rer. nat. Werner Rittgen

DoktorandenDipl. Math. Jutta Groos

Wissenschaftliche Hilfskräftecand. math. Yvonne Jasiewicz (Diplom FH Darmstadt)cand. med. inform. Timm Pauli (Diplom FH Heilbronn undUniversität Heidelberg)

Nichtwissenschaftliches PersonalRegina Grunert, SekretariatAnna Hellmann, Dokumentation und DatenbearbeitungRenate Rausch, Datenbearbeitung und -auswertung

Die Zentrale Einheit Biostatistik (ZEB) des DKFZ ist eineZentrale Einrichtung des Zentrums und war im Berichts-zeitraum mit ihrem Forschungsprogramm im Forschungs-schwerpunkt H: ‘Genomforschung und Bioinformatik‘vetreten.Die Aufgaben der ZEB liegen in der Beratung und der For-schung auf dem Gebiet biostatistischer Methoden und ih-rer Anwendung in der Krebsforschung mit dem Ziel, durchEinsatz und Weiterentwicklung biometrischer und stati-stisch quantifizierender Verfahren in der experimentellenund klinischen Krebsforschung einen Beitrag zur Verhü-tung, Entdeckung und Behandlung von Krebskrankheitenzu leisten. Als Bindeglied zwischen den methodischen Fä-chern auf der einen und in der Krebsforschung arbeiten-den biomedizinischen Fächern auf der anderen Seite istdie Biostatistik mit computergestützter Beratung, projekt-begleitender Mitarbeit und statistischer Methodenfor-schung befasst. Schwerpunkte bilden die Entwicklung mo-derner Methoden der rechnergestützten Datenanalyse und-präsentation, die optimale biometrische Versuchsplanung,die statistische Modellbildung zu den Mechanismen derKrebsentstehung und die Methodik in der klinischen Onko-logie; siehe Tabelle 1.

Informationsquellen:http://www.dkfz.de/[email protected] bzw. [email protected].: 06221 - 42 2392, Fax: 06221 - 42 2397

Tabelle 1:Forschungs- und Service Programm der ZE Biostatistik1. Statistisches Labor- Software-Entwicklung und -Evaluation- Statistische Methoden zur Analyse komplexer Daten - Ausbildung in Biometrie und Datenanalyse2. Versuchsplanung und Auswertung- Biometrische Versuchsplanung für Tierexperimente - Auswertungssoftware- Statistik in Genetik und Molekularer Biologie3. Karzinogenesemodelle- Mechanistische Modelle der Krebsentstehung- Pharmakokinetische Modelle- Toxikokinetische Modelle- Risikoabschätzung4. Klinische Onkologie- Biometrie für Planung und Auswertung klinischer Studien- Biometrisches Zentrum für Phase I-III Studien

Statistisches Labor (R0700-01)A. Benner, W. Rittgen, L. EdlerIn Zusammenarbeit mit S. Suhai, DKFZ; AG “Statistische Metho-dik in der klinischen Forschung”, AG “Statistische Auswertungs-systeme’”, GMDS / AG “Computational Statistics”, Deutsche Regi-on der Intern. Biometrischen Gesellschaft; Dr. Carina Ortseifen,URZ Univ. Heidelberg, Dr. Ralf Bender, Univ. Bielefeld; Dr. Bert-hold Lausen, Univ. Erlangen.

Das Labor für ‘Computational‘ Statistik und Datenanalyse[13] hat neue Methoden für die Planung und Auswertungvon Experimenten am DKFZ erarbeitet und Grundlagen fürBeratungsaufgaben und selbständige Auswertungen vonForschern des DKFZ bereitgestellt. Die Themenschwer-punkte im Berichtszeitraum waren Software-Entwicklungund -Evaluierung, Qualitätssicherung, Datenbank-Mana-gement, Ausbildung und Beratung.

Software-Entwicklung und -Evaluierung: Das Statistiksys-tem ADAM wurde auf der Grundlage von Benutzeranforde-rungen in seinem Funktionsumfang erweitert und der Be-dienungskomfort der Dateneingabe und der grafischenDarstellungen wurde verbessert. Darüberhinaus wurdenfür den Benutzer nicht direkt sichtbar Verbesserungenbeim Rechenaufwand vorgenommen. Die so erhöhte Be-nutzerfreundlichkeit hat wesentlich zu einer breiteren Nut-zung im DKFZ geführt. Weitere Arbeiten betrafen dieEvaluierung von Software zur Fallzahlplanung von Experi-menten und klinischen Studien.

Ausbildung: Kurse zu Grundlagen der Statistik, zu statisti-schen Methoden und zur Anwendung statistischer Soft-ware hat Forschern und Doktoranden ermöglicht, selb-ständig statistische Auswertungen durchzuführen. Fortbil-dungsveranstaltungen zu statistischen Methoden werdenregelmäßig angeboten. Daneben wird eine intensive per-sönliche Beratung und Hilfestellung bei der Auswahl stati-stischer Software und deren Anwendung geboten.

Zentrale Einheit Biostatistik (ZEB) (R0700)Leiter: Dr. rer. nat. Lutz Edler

409




Qualitätssicherung und Datenbank-Management: Für dievermehrt durch die ZE Biostatistik betreuten klinischenStudien ist eine adäquate Datenverwaltung unerlässlich.Ein Bereich des statistischen Labors beschäftigte sich da-her mit der Qualitätssicherung statistischer Daten bei Da-teneingabe und Datenbankverwaltung. Die statistischeProgrammierumgebung S-Plus und R werden verwendet,um schnell und effizient problemgerechte Prozeduren zurstatistischen Datenanalyse zu entwickeln. Damit liegt einewichtige Alternative zum Statistischen ProgrammpaketSAS, das nur in einzelnen Modulen zentral am DKFZ ver-fügbar ist, vor.

Im ‘Statistischen Labor‘ entwickelte und bereitgestellteAuswerteverfahren wurden bei verschiedenen experimen-

. Diese Regressionsergebnisse wurden durch beschrei-bende statistische Parameter und grafische Darstellungenunterstützt.

Regressionsmodelle für ordinale Daten werden bislang fürbiomedizinische und epidemiologische Fragestellungen imGegensatz zu landläufig benutzten logistischen Regressi-on zu selten eingesetzt, obwohl sie effizienter Zusammen-hänge aufdecken können. Das ‚proportional odds‘ und das‚continuation ratio‘ Modell wurde deswegen als spezielleVerallgemeinerte Lineare Modelle dargestellt und mittelsSAS und SPlus Software umgesetzt [3]. Dabei konnteauch gezeigt werden, daß auch bei Verletzung gewisserAnnahmen korrekte Auswertungen möglich sind.

Thema Statistische Methodik (Stichworte) Referenz

Elimination von Tumorzellen nach Behandlung mit CD3 x CD19 Tandal Vergleich von Raten [7]Korrelation der Abnormalität von Spermien mit der Prävalenz von AAV-DNA Vergleich von Raten [19]Cytokeratin 20 RT-PCR für molekulares Stagingvon Hodentumoren Cochran-Armitage, Trend-Test [22]Genetische Kopplungsanalyse bei Autismus-Familien Linkage Analyse, LOD-Score [24]Alpha-Fetoprotein RT-PCRfür die Entdeckung disseminierter Korrelationsverfahren [25]hepatozellulärer TumorzellenRisikofaktoren für akute Pouchitis und lokale Sepsis Korrelationsverfahren [26]Muster der hämatogenen Dissemination von kolorektalen Tumorzellen Vergleich von Raten [28]Beta-catenin Mutationen in der Karzinogenese von Kolontumoren Vergleich von Raten [31]Tumormodelle für Oropharynx und Vergleich von Photosensitizers Wachstumsraten im Karzinogenese Zellassay [33]Präprogastrin-Rel. Protein RT-PCR für die Entdeckung von disseminierten Vergleich von Raten [35]NSCLC TumorzellenMarker der Angiogenese beim Multiplen Myelom im dMRI Pharmakokinetik im 2-Kompartment-Modell [37, 38]DNA Reparaturfähigkeitnach Bleomycinbehandlung Fall-Kontroll Design, Odds-Ratios [45]Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren als Markerproteine für Progression ROC-Analysen [49]Angiogenese und Vaskularisierung in Stadien epithelialer Hauttumoren Mehrgruppenvergleich [50]Vollständige und gestutzte HBV Transkripte in der Krankheitsentwicklung Korrelationsanalyse [51]nach Hepatitis B InfektionVerstärkte Ausscheidung von Leukotrienen unter Äthanol Parallelgruppenvergleich [52]Prävalenz von AAV-2 Infektion unter T-Zell Lymphopatischer Leukämie Parallelgruppenvergleich [54]Hämatogene Tumorzelldissemination kurativer Leberresektion Beobachtungsstudie [55]Mikrosatelliten-Instabilität beim kolorektalen Karzinom Diagnosestudie [57]HPV16 E6 und p53 Arginin als Risikofaktoren des Cervix Karzinoms Vergleich von Raten [58]Hepatokarzinogenese bei afrikanischen Murmeltieren Bioassay Verfahren [44]

tellen Untersuchungen erfolgreich eingesetzt. Dazu seiendie folgenden Kooperationen genannt:

Statistische Methoden der Klassifikation und Regressionerlauben eine verbesserte Beurteilung der Gültigkeit undVorhersagekraft von diagnostischen Verfahren und Vorge-hensweisen. Sensitivität und Spezifität von (stetigen) Pa-rametern wurden mittels der Analyse von ROC-Kurven füreine prospektive Kohortenstudie angewendet. So konntegezeigt werden, daß eine einmalige Messung eines be-stimmten konventionellen Parameters (Lactat-Dehydro-genase und CRP) einer Verlaufsmessung zweier Blutser-umparametern (S100 beta und MIA) nicht unterlege-n ist, wenn man Tumorprogression als Kriterium wählt [9]. Dese positiven Ergebnisse zur Lactat-Dehydrogenase und CR konnte durch die Anwendung logistischer Regressionsvrfahren in einer weiteren Studie bestätigt werden [10]-

Versuchsplanung und Auswertung(R0700-02)W. Rittgen, L. Edler, A. Benner, A. Kopp-Schneider,C. IttrichIn Zusammenarbeit mit den Tierschutzbeauftragten des DKFZsowieProf. H. W. Thielmann, DKFZ; Prof. Ludwig Hothorn, LGBioinformatik, Universität Hannover; Prof. Wolfgang Urfer, Fach-bereich Statistik, Universität Dortmund; Dr. Meinhard Kieser, W.Schwabe GmbH, Karlsruhe; Prof. Volker Guiard, Forschungsinsti-tut, Dummerstorf; Prof. Norbert Victor, Institut für Med. Biometrieund Informatik, Universität Heidelberg; Akademie für Weiterbil-dung, Universität Heidelberg; Dipl. inf. Peter Dirschedl, UniversitätMünchen, Prof. Byung S. Kim, Yonsei University, Seoul, Korea.Zusätzliche Finanzierung durch: DFG-KOFEG Projekt 446KOR-113/139/0-1, Partner: Yonsei University, Seoul; NATO ScienceProgram CLG 976042, F823; BMBF-Verbund Projekt, BEO 031/11834.

410




Die Mehrzahl der Projekte dieses Bereichs sind eng ver-bunden mit der grundsätzlichen Dienstleistungsaufgabeder Einheit, die experimentellen Abteilungen des DKFZ beiPlanung, Durchführung und Auswertung von Experimen-ten unterstützen. Dies umfaßt die Beratung bei Versuchs-anträgen unter Berücksichtigung formaler Kriterien derVersuchsplanung und eines optimalen Informationsge-winns und die Übernahme der biometrischen Planung beiTierversuchen einschließlich der Ausarbeitung einerschriftlichen Anlage zur biometrischen Begründung er Tierzahlen und des Versuchsplans. So wurden ıin 200 ¸27 biometrische Versuchspläne und�in 20

¸34 bi etrische Versuchspläne �ausgearbetet. Di angebotenen Dienstleistungen schessen die Beratung von DKFZ-Doktoranden/Innen ein.ıVerg-leichende Untersuchungen von Methoden der stati

stischen Klassifikation und Diskriminanzanalyse wurden -auf die Vorhersage von Proteinstrukturen auf der Basis dr Aminosäuresequenz angewendet und es konnte nachgewesen werden, daß Verfahren der linearen Diskrimina-nzanalyse in bestimmten Fällen Methoden, die auf neuro-nalen Netzwerken beruhen, ebenbürtig sind und eine bes-sere statistische Ergebnisinterpretation erlauben. Für -die bereits früher berichteten statistischen Verfahren zur -Vorhersage von Protein-Faltungsklassen wurden vergleich-ende Konfusionsmatrizen präsentiert, um so die Rolle derstatistischen Verfahren zu verdeutlichen [17]. Die Anwen-dungsmöglichkeiten und Eigenschaften von Projecti-on Pursuit Regression wurden im Einzelnen in einer searaten Arbeit untersucht [27].ıFür ein groß angelegtes P-rojekt der Bestimmung der R

sikopotentials (Suszeptibilität) und prognostischen Wer-tigkeit von Polymorphismen der Glutathione-S-Transferas-e und ihrer Modifikation der Entgiftung von polyzyklishen Aromaten des Zigarettenrauchs wurden Daten einer Fal-Kontrollstudie biometrisch ausgewertet, wobei der logistischen Regression in einer multivariaten Analyse beso-ndere Bedeutung zukam [47]. Die Ergebnisse wurden durch -die Berechnung von ‘odds ratios’ quantifiziert. Polyorphismen der N-acetyltransferase (NAT1, wurden entsp-rechend ausgewertet [56]. Für die zusätzliche Untersu-chung von Polymorphismen des CYP1A1 und ihrer Modulatin des Niveaus von Benzpyren-diolepoxid-DNA-Addukten wrden entsprechende Auswertungen an einer Gruppe vn Koksofen-Arbeitern durchgeführt [48].ıDie Auswerung epidemiologischer Follow-up Studien b

siert häufig auf dem Vergleich der Anzahl der beoba-chteten Todesfälle einer bestimmten Todesursache mit der -erwarteten Anzahl. Dabei tritt aber das Problem auf, -daß bei einem Teil der verstorbenen Mitglieder der Kohorte de genaue Todesursache nicht mehr feststellbar ist. Für di-ese Datenlage wurde ein statistisches Modell entwickelt mit dem die unbekannte Anzahl der Todesfälle einer bestmmten Ursache geschätzt und Konfidenzintervalle für ent-sprechenden Sterberaten berechnet werden können [59].ıDi-e europäischen Richtlinien für Brustkrebs-Screen

ng empfehlen 2-jährlich eine Mammographie mit nachfol-genden diagnostischen Maßnahmen. Bei der Berechnung

der entsprechenden Raten (z.B. Teilnahmerate,Assessmentrate, Biopsierate u.s.w.) treten Schwierigkeitenauf, wenn Teilnehmerinnen mit positiver Mammographievorzeitig die diagnostische Sequenz verlassen und weitereInformationen fehlen. Es wurden statistische Modelle so-wohl für vollständige als auch unvollständige Informationentwickelt [60]. Die statistischen Methoden zur Berech-nung der Tests und deren Güte, der Mindest-Fallzahlenund der Schätzer der Raten einschließlichKonfidenzintervalle können zusammengefaßt dargestelltwerden.

Ziel einer vom BMBF geförderten zweijährigen Prävalidie-rungsstudie ist der Nachweis der Relevanz und Zuverläs-sigkeit eines Protokolls für die Durchführung des „RatLiver Foci Bioassay“ (RLFB) als Kurzzeit-Testsystem invivo zum Nachweis der kanzerogenen Wirkung von Che-mikalien. An dieser Ringstudie sind 5 Laboratorien betei-ligt. Die ZE Biostatistik ist für das Datenmanagement unddie statistische Auswertung verantwortlich. Neben der Un-tersuchung der intra- und interlaboratoriellen Variabilitätder Ergebnisse stehen hierbei die Identifizierung geeigne-ter Endpunkte und darauf basierend die Erarbeitung einesstatistischen Prädiktionsmodells für das kanzerogene Po-tential der untersuchten Testsubstanzen und eines Klassi-fikationsmodells zur Unterscheidung von Promotoren undkompletten Kanzerogenen im Vordergrund.

Angewandte Karzinogenesemodelle:Mechanistische Modellbildung undRisikoabschätzung (R0700-03)A. Kopp-Schneider, I. Geisler, J. Groos, C. Ittrich,L. EdlerIn Zusammenarbeit mit: G. Fürstenberger, P. Bannasch, N.Becker, DKFZ; Dr. Christopher Portier, Dr. Michael Kohn, Dr. NigelWalker, NIEHS, RTP, N.C., USA; Dr. Georg Luebeck, FredHutchinson Cancer Center, Seattle, WA, USA; Prof. AndrejYakovlev, Dr. Alexander Tsodikov, University of Salt Lake City,Utah, USA; Prof. Jürgen Konietzko, Prof. Detlev Jung, UniversitätMainz; Prof. Elart von Collani, Universität Würzburg; Prof. MichaelSchwarz, Institut für Toxikologie, Universität Tübingen; Prof. Wer-ner Lutz, Universität Würzburg; W. Heidenreich, GSF, München;Prof. Christos P. Kitsos, University of Business and Economics,Athen, Griechenland.Zusätzliche Finanzierung durch: DFG Projekt, KO 1886-1-2;EVCAM-Projekt, Partner: Universität Hannover; EU-Projektshared cost action, FIGH-CT 1999-0005; Theme Group in FOSIE,Concerted Action in 5th Framework, EU, QLK1 1999-00156;CCMS-NATO Projekt Pilot Study 2.

In diesem Teilbereich werden biologisch begründete Karzi-nogenesemodelle entwickelt, die biologische Hypothesenwiderspiegeln. Durch Anwendung der Modelle auf entspre-chende Daten können mit statistischen Tests Hypothesengeprüft werden, welche sowohl Mechanismen der Krebs-entstehung und Dosis-Wirkungsbeziehungen für karzino-gene Substanzen betreffen als auch für gesundheitspoliti-sche Fragen der quantitativen Risikoabschätzung von Be-deutung sind.

Im Berichtszeitraum konzentrierte sich die Karzinogenese-modellierung überwiegend auf die Beschreibung der Ent-stehung und des Wachstums von präneoplastischen

411




Leberläsionen. Leberherde werden in der experimentellenLeberkarzinogenese beobachtet unabhängig davon, obdie Karzinogenese durch chemische Substanzen, durchradioaktive Strahlung oder viral ausgelöst wrd [1]. Die Zuverlässigkeit der Leberherde zur Prädiktion der K-arzinomentstehung wird in einem BMBF-Projekt geprüft.

Ein stochastisches Modell für die Entstehung von Leber-herden und ihre Phänotypänderungen wurde auf einenDatensatz aus einem Rattenhepatokarzinogeneseversch angewandt. Dieses Color-Shift-Modell beinhaltet di Hypothese, daß sich der Wechsel eines Herdes zum nächst-en Phänotyp nicht durch Mutation und anschließende kloale Expansion der mutierten Zelle vollzieht, sondern da der gesamte Herd durch einen ‘Feldeffekt‘ irreversibel um nächsten Phänotyp übergeht. Das Modell wurde genutt, um die zeitliche Reihenfolge des Auftretens von dre in dem Versuch beobachteten Phänotypen von Herden zu fnden. Mit einer Monte-Carlo-Simulationsstudie konnte ge-zeigt werden, daß in diesem Fall das Modell mit der Maxi-malen Likelihood zuverlässig das richtige Modell anzeigt,obwohl hier ein Vergleich zwischen nicht hierarchisch ge-schachtelten Modellen durchgeführt wird [29]. Mithilfe derModelle konnte die von Biologen vermutete Sequenz be-stätigt werden. Als alternative Hypothese für die Entste-hung und den Phänotypwechsel von präneoplastischenLeberherden wird diskutiert, daß einzelne Zellen durchMutation in den nächsten Phänotyp übergehen und danndurch klonale Expansion Herde des fortgeschrittenerenPhänotyps entstehen. Diese Hypothese wurde im Vier-stufenmodell formalisiert. Das Modell wurde mathe-matisch untersucht und auf denselben Datensatz angewandt wi das Color-Shift-Modell [20,21]. Es zeigte sich, daßdie Anpassung der Größenverteilung der Herde mit diesem M-odell unzureichend ist und daß die Parameterschätzer -für die Teilungsraten von präneoplastischen Zellen biolgisch unrealistische Werte annehmen.ı �Legende: Das ColorShift-Modell beschreibt die En

s

ehung, das Wachstum und die Phänotypänderung präneoplastischerLeberläsionenı Es wurden Dosis-Wirkungsbeziehungen für -die Tumor

induktion anhand des Zweistufenmodells mit klona-ler Expansion untersucht [30]. Das spezielle Interess-e galt hierbei der Wirkung von Kaffeesäure, die in niedriger -Dosierung die Zellteilung zu inhibieren scheint, während- bei hoher Dosis die Zellkinetik beschleunigt wird. In die-ser Situation kann eine J-förmige Dosis-Wirkungsbeziehun-g für die Tumorinduktion entstehen. Anhand der Wahl von Modelparametern konnten die beobachteten Daten zur Tu-morinduktion reproduziert werden.ıMechanistische mat-hematische Modelle wurden für den

komplexen Vorgang der Entdeckung von Tumoren in Vor-sorgeuntersuchungsprogrammen entwickelt. Dabei wurdeinsbesondere die Rolle der Tumorgröße bei Diagnose be-

trachtet und es wurden Möglichkeiten erforscht, wie dieseInformation in einem quantalen statistischen Modell zurverbesserten Entdeckung von Tumoren genutzt werdenkann. In einem Rückgriff auf frühe Ergebnisse von RobertBartoszynski gelang es, neue Erkenntnisse für den Aufbauoptimaler Vorsorgeprogramme aus theoretischen Untersu-chungen abzuleiten und in Simulationsstudien zu bestäti-gen [2].

In einem von der EU geförderten und von ILSI (Internatio-nal Life Science Institute) Europe koordiniertem Projektwurden federführend innerhalb eines international besetz-ten Expertengremiums quantitative Methoden für dieRisikobeurteilung von Chemikalien in Nahrungsmitteln ent-wickelt und für die Regulation auf europäischer Ebene zu-sammengestellt [15].

Auswirkungen früherer Exposition gegenüber polychlorier-ter Dibenzo-Dioxinen und -Furanen auf das autonomeNervensystem des Menschen wurden an einer beruflichexponierten Kohorte von Arbeitern und Arbeiterinnen derchemischen Industrie untersucht und auf das Vorligen ei-ner Dosis-Wirkungsbeziehung geprüft. Dazu wurdenschädliche Auswirkungen auf die Herzfrequenz und aufdas Farbsehvermögen (erworbene Dyschromatopsie) un-tersucht, wobei im ersten Fall kein statistisch si-gnifikanter Effekt [23] gefunden wurde, jedoch war das Auftretn der erworbenen Dyschromatopsie in höher Exponierten ignifikant erhöht [18].ıı Biometrische Methodik in der kli-nischen Onkologie

R0700-04)� L. Edler, A. Benner, G. Friedrch, L. Pilz, A. Kop

-Schneiderı In Zusammenarbeit mit: M. Volm, Breitkreuz, W. D

öge, M. Pötschke-Langer, DKFZ. Prof. Christian Manegold,Thoraxklinik, Heidelberg; Dr.H. Goldschmidt, Dr. S.Frühau-f, Universitätsklinik, Heidelberd; Phase I/II Studiengruppe d-er AIO: Prof. Wolfgang Kreuser, Regensburg, Prof. Max Scheulen, Ess-en, Prof. Heinz H. Fiebig, Universiätsklinik Freiburg; Prof. olfgang Queißer, Dr. Gernot Hartung, Onkologisches Zentrm, Klinikum Mannheim; Prof. Hartmut Döhner, Dr. R. Schlenk, Dr Stilgenbauer, Universität Ulm; Prof. Norbert Victor, J-. Windeler, Prof. Ulrich Abel, IMBI, Universität Heidelberg; Dr. Ar-min Koch, BfArM Bonn; Dr. Willi Sauerbrei, Prof. Martin Schumachr, Inst. f. Medizinische Biometrie, Universität Freiburg; Al-muth Hörmann, GSF, München; Prof. Constanza Quintero, Departamento deMatematicas y Estadistica, Universidad Nacional Sata Fe de Bogota, Kolumbien. �Zusätzliche Finanzierung: Koon-Rektum-Studiengrup, Onkologisches Zentrum, Prof. Queisser, Klinikum Mannheim; -GemTax Studiengruppe, Prof. Manegold, Thorax-Klinik Heideberg; Studiengruppe, Prof. Ho, Dr. Goldschmidt, Polikinik Heidelberg; Studiengruppe, Prof. Hossfeld,. Dr. Laack, UKE Hambrg; Studiengruppe, Dr. Oehm, Treuenbrietzen; Roche iagnostics, Mannheim.

Die Betreuung klinischer Studien, soweit sie am DKFZ inKooperation mit klinischen Einrichtungen durchgeführtwerden, sind diesem Teilbereich ebenso zugeordnet wieunsere Kooperationen mit klinischen Forschergruppen undnationalen Studiengruppen. Unsere Arbeiten beinhaltendie Beratung bei der Erstellung von Studienprotokollen fürklinische Studien gemäß GCP (Good Clinical Practice).

412




Die Einheit erfüllt damit für aktuelle onkologische Thera-piestudien die Funktion eines Biometrischen Zentrums fürdie Planung, Durchführung und Auswertung klinischer Stu-dien der Phase I-III bei klinischen Kooperationen desDKFZ. Dies umfaßt Randomisation bzw. Patientenmoni-toring, Statistisches Monitoring, Zwischenauswer-tungen, Dokumentation, Dateneingabe und deren Kontrole und die finale biometrische Auswertung.ıEin Mitglied de Einheit arbeitete in einem Sub-Kom

tee der ISCB (Internat. Society of Clinical Biostatistis) an einer Umfrage mit, in welcher Umfang, Auswirkungen und- Einschätzungen von Datenfälschung in klinischen rojekten untersucht wurden. Dies ergab, dass Fälschung ke-ine vernachlässigbare Erscheinung ist und dass eine erhhte Aufmerksamkeit gegenüber den verschiedenartigsten Mglichkeiten der Fälschung von medizinischen Ergebnissen angezeigt ist [46].ı Als biometrisches Zentrum f-ür klinische Studien a DKFZ trug die Einheit zur erfolgreichen Planung und Auswrtung von klinischen Projekten und klinischen Studien desDKFZ bei. Folgende Projekte sind für den Berichtszeitrau zu nennen: ıUntersuchung der Wirkung von L-Carnitin af den inramuskulären GSH-Spiegel in Krebspatienten [4] in e-iner randomisierten Doppelblindstudie;ıUntersuchung derWirkung von N-acetyl-cystein auf imunologische Funktionen und den Albuminspiegel be antiviral behandelten HIV Patienten in einer randomsierten Doppelblindstudie [5];ıUntersuchung des Sticksto-ffmetabolismus und der Proteinsynthese im Zusammenhang mit Gewichtsverlust in HI-V Patienten in einer altersgematchten Fall-Kontrollsudie [6];ıUntersuchung der Veränderungen der Tumorlast im Knchenmark unter sequentieller Hoch-Dosistherapie bei-m Multiplen Myelom in einer Phase II Studie [8].Für die Kontrolle der Behandlung des Melanoms und dieEntdeckung einer Tumorprogression wurden S100 Betaund MIA mittels diagnostischer statistischer Parameter undKorrelationsmaße miteinander verglichen [11].Eine Batterie zellulärer Faktoren (Resistenzproteine, Pro-liferations-, Apoptose-, und Angiogenesefaktoren und Pro-to-Onkogene) wurden auf ihre Vorhersagekraft für Tumor-resistenz gegenüber Zytostatika untersucht. Die Daten ei-nes Kurzzeittests, welcher die Rate des Einbaus von Nu-

kleinsäure-Vorläufern in Tumorzellen mißt, wurden dazumittels Korrelationsanlaysen ausgewertet und über eineprozentuale Prädiktion bewertet [53].

Multivariate Regressionsmodelle wurden mit Erfolg ange-wendet, um einen kategoriellen Risikoscore basierend aufchromosomalen Aberrationen (Deletionen) für die Über-lebensprognose von CDL Patienten zu definieren, welchefür risiko-adaptierte Behandlungsstrategien einsetzbar ist[12].Biostatistische Methodik für die Planung, Durchführungund Auswertung von klinischen Studien und die biostatis-tische Bewertung von Therapieergebnissen wurden in ein-flußreichen Publikationen der klinischen Onkologie darge-stellt [16]. Einen besonderen Schwerpunkt bildete im Be-richtszeitraum die Methodik der klinischen Phase I Studien[14] und die Durchführung von Phase II und Phase III Stu-dien, die untenstehend aufgelistet sind.

In der Rektum I Studie konnte in der abschließenden Aus-wertung auf Äquivalenz gezeigt werden, daß eine Verlän-gerung der Chemotherapie von 6 auf 12 Monate keinenrelevanten Vorteil für die Patienten erbringt. Es konnteauch gezeigt werden, daß die 5-FU-Leukovorin Therapiegut verträglich war und auch bei verlängerter Behandlungkeine erhöhte Toxizität zeigte [43]. Die Pilotstudie REK-TUM II ergab, daß die wöchentliche Hochdosisgabe von 5-FU/Folinsäure i.v. stetig in Kombination mit postoperativerStrahlentherapie nicht für die adjuvante Behandlung desRektum-Karzinoms Stadium II-III empfohlen werden kann.

Die Ergebnisse der randomisierten Studien GEMTAX I undII wurden auf den ASCO und ESMO Meetings mit ihren Er-gebnissen zur Überlebenszeit und tumorfreien Zeit berich-tet. Eine sequentielle Gabe von Gemcitabin und Docetaxelerwies sich als eine erfolgversprechende Alternative zurkonventionellen Kombinationstherapie.Zur Vorbereitung einer multizentrischen randomisierten kli-nischen Studie zur Wirksamkeit des Thalidomid beim Mul-tiplen Myelom in möglicher Kombination mit einer Stan-dardchemotherapie wurden zur Planung einer großenPhase III Studie [39] klinische Daten der Poliklinik Heidel-berg ausgewertet zum Mechanismus von Thalidomid inRelation zur Angiogenese und der Reduktion von Cyto-kinen [42] und zur Bestimmung von prognostischen Fakto-ren für das Ansprechen und das Überleben unterThalidomid [41].

Bezeichnung der Studie Tumorart Typ der Studie Status PublikationMTK5 - Phase I abgeschlossen [40]GEMTAX I NSCLC rand. Phase II abgeschlossenGEMTAX II NSCLC rand. Phase II abgeschlossenGEMVIN NSCLC Phase II offenMA-Vakzin Melanom Phase III offenHD-G1 M. Myelom Phase III offenHD-G2 ALL Phase III offenHD-G3 M. Myelom Phase III offenHD-Pilot M. Myelom Phase II abgeschlossen [39]REKTUM I Rektum Phase III abgeschlossen [43]REKTUM II Rektum Phase II abgeschlossen [43]MTK4 Mamma Ca Phase II abgeschlossen [32]GEMVIN-HH NSCLC Phase II Datenauswertung [34]

413




Publikationen (Autoren der ZEB hervorgehoben)[1] Bannasch P., Nehrbass D., Kopp-Schneider A.: Significanceof hepatic preneoplasia for cancer chemoprevention. IARC Sci.Publ. 154: 223-240 (2001).[2] Bartoszynski R., Edler L., Hanin L., Kopp-Schneider A.,Pavlova L., Tsodikov A., Zorin A., Yakovlev A.Y.: Modeling cancerdetection: tumor size as a source of information on unobservablestages of carcinogenesis. Math. Biosci. 171: 113-142 (2001).[3] Bender R., Benner A.: Calculating ordinal regression modelsin SAS and S-Plus. Biometr. J. 42 (6): 677-699 (2000).[4] Breitkreutz R., Babylon A., Hack V., Schuster K., Tokus M.,Böhles H., Hagmüller E., Edler L., Holm E., Dröge W.: Effect ofcarnitine on muscular glutamate uptake and intramuscularglutathione in malignant diseases. Brit. J. Cancer 82 (2): 399-403(2000).[5] Breitkreutz R., Pittack N., Nebe C.T., Schuster D., Brust J.,Beichert M., Hack V., Daniel V., Edler L., Dröge W.: Improvementof immune functions in HIV infection by sulfur supplementation:Two randomized trials. J. Mol. Med. 78: 55-62 (2000).[6] Breitkreutz R., Wagner J., Tokus M., Benner A., Rossol S.,Pittack N., Stein J., Dröge W., Holm E.: Flux of amino acids andenergy substrates across the leg in weight-stable HIV infectedpatients with acute opportunistic infections: indication of a slowprotein wasting process. J. Mol. Med. 79: 671-678 (2001).[7] Cochlovius B., Kipriyanov S.M., Stassar M.J.J.G., Schuhma-cher J., Benner A., Moldenhauer G., Little M.: Cure of Burkitt’slymphoma in severe combined immunodeficiency mice by T cells,tetravalent CD3 x CD19 tandem diabody, and CD28costimulation. Cancer Res. 60: 4336-4341 (2000).[8] Cremer F.W., Ehrbrecht E., Kiel K., Benner A., Hegenbart U.,Ho A.D., Goldschmidt H., Moos M.: Evaluation of the kinetics ofthe bone marrow tumor load in the course of sequential high-dosetherapy assessed by quantitative PCR as a predictive parameterin patients with multiple melanoma. Bone Marrow Transplant. 26(8): 851-858 (2000).[9] Deichmann M., Benner A., Kuner N., Wacker J., WaldmannV., Naeher H.: Are responses to therapy of metastasizedmalignant melanoma reflected by decreasing serum values ofS100beta or melanoma inhibitory activity (MIA)? Melanoma Res.11: 291-296 (2001).[10] Deichmann M., Benner A., Waldmann V., Bock M., Jäckel A.,Näher H.: Interleukin-6 and its surrogate C-reactive protein areuseful serum markers for monitoring metastasized malignantmelanoma. J. Exp. Clin. Cancer Res. 19 (3): 301-307 (2000).[11] Djukanovic D., Hofmann U., Sucker A., Rittgen W., Schaden-dorf D.: Comparison of S100 protein and MIA protein as serummarker for malignant melanoma. Anticanc. Res. 20: 2203-2207(2000).[12] Döhner H., Stilgenbauer S., Benner A., Leupolt E., Krober A.,Bullinger L., Döhner K., Bentz M., Lichter P.: Genomic aberrationsand survival in chronic lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med. 343(26): 1910-1916 (2000).[13] Edler L.: Statistical computing with the IASC at the eve of2000: Continuation and consolidation -innovation and invention.Comput. Statist. Data Anal. 33 (1): 113-119 (2000).[14] Edler L.: Overview of phase I trials. In: Handbook ofStatistics in Clinical Oncology. Crowley J. (ed), New York: Dekker,pp.1-34 (2001).[15] Edler L.: Quantitative methods for food and diet safetyassessment. In: Bull.Int.Statist.Inst. ISI 53nd Session Book 1.vol.1 pp.309-312 (2001).[16] Edler L.: Statistische Bewertung von Therapieergebnissen.In: Onkologische Chirurgie. vol.II Siewert J.R. (ed), Praxis derViszeralchirurgie. Siewert J.R., Harder F., Rothmund M. Heidel-berg: Springer, pp.305-319 (2001).[17] Edler L., Grassmann J., Suhai S.: Role and results ofstatistical methods in protein fold class prediction. Math. Comput.Model. 33 (12/13): 1401-1417 (2001).

[18] Edler L., Muttray A., Jung D., Rose D.M., Konietzko J., Por-tier C.J., Heinzl H.: Exploring possible dose-responserelationships between exposure to PCDDs/Fs and acquireddyschromatopsia in humans. Organohalogen Comp. 53: 309-312(2001).[19] Erles K., Rohde V., Thaele M., Roth S., Edler L., SchlehoferJ.R.: DNA of adeno-associated virus (AAV) in testis tissue and insemen samples with abnormal spermiogram. Hum. Reproduct.16: 2333-2337 (2001).[20] Geisler I.: Stochastische Modelle für den Mechanismus derEntstehung und der Progression von Krebsvorstufen in der Leber.(Thesis/Dissertation) Fachbereich Statistik, Univ.Dortmund (2001).[21] Geisler I., Kopp-Schneider A.: A model for hepatocarcino-genesis with clonal expansion of three successive phenotypes ofpreneoplastic cells. Math. Biosci. 168 (2): 167-185 (2000).[22] Güdemann C.J., Weitz J., Kienle P., Lacroix J., Wiesel M.J.,Soder M., Benner A., Stähler G., Knebel-Doeberitz M.v.:Detection of hematogenous micrometastasis in patients withtransitional cell carcinoma. J. Urol. 164 (2): 532-536 (2000).[23] Heinzl H., Muttray A., Jung D., Hergert A., Rose D.M.,Konietzko J., Hofmann H.C., Portier C.J., Edler L.: Exploringpossible dose-response relationships between 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin concencentration and heart ratevariability in humans. Organohalogen Comp. 48 (P234): 195-198(2000).[24] Int.Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC),(Benner A.).: Further characterization of the autism susceptibilitylocus AUTS1 on chromosome 7q. Hum. Mol. Genet. 10 (9): 973-982 (2001).[25] Kienle P., Weitz J., Klaes R., Koch M., Benner A., Lehnert T.,Herfarth C., Knebel-Doeberitz M.v.: Detection of isolateddisseminated tumor cells in bone marrow and blood samples ofpatients with hepatocellular carcinoma. Arch. Surg. 135 (2): 213-218 (2000).[26] Kienle P., Weitz J., Reinshagen S., Magener A., AutschbachF., Benner A., Stern J., Herfarth C.: Association of decreasedperfusion of the ileoanal pouch mucosa with early postoperativepouchitis and local septic complications. Arch. Surg. 136 (10):1124-1130 (2001).[27] Klinke S., Grassmann J.: Projection pursuit regression. In:Smoothing and regression. Approaches, computation, andapplication. Schimek M.G. (ed), Wiley Series in probabilities andstatistics. New York, USA: Wiley & Sons, pp.471-496 (2000).[28] Koch M., Weitz J., Kienle P., Benner A., Willeke F., LehnertT., Herfarth C., Knebel-Doeberitz M.v.: Comparative analysis oftumor cell dissemination in mesenteric, central, and peripheralvenous blood in patients with colorectal cancer. Arch. Surg. 136:85-89 (2001).[29] Kopp-Schneider A.: Using a stochastic model to analyze thesequence of phenotypic changes in rat liver focal lesions. Math.Comput. Model. 33: 1289-1295 (2001).[30] Kopp-Schneider A., Lutz W.K.: J-Shaped dose-responserelationship for tumor induction by caffeic acid in the ratforestomach, modeled by non-monotonic dose response for DNAdamage and cell proliferation. Hum. Ecol. Risk Assess. 7 (4): 921-931 (2001).[31] Kösters R., Hans M.A., Benner A., Prosst R., Boehm J.,Gahlen J., Doeberitz M.K.: Predominant mutation of codon 41 ofthe beta-catenin proto-onocogene in rat colon tumors induced by1,2-dimethylhydrazine using a complete carcinogenic protocol.Carcinogen. 22 (11): 1885-1890 (2001).[32] Kröger N., Kleeberg U.R., Mross K.B., Edler L., Sass G.,Hossfeld D.K.: Phase II clinical trial of titanocene dichloride inpatients with metastatic breast cancer. Onkol. 23: 60-62 (2000).

414




[33] Kübler A.C., Reuther T., Staff C., Haase T., FlechtenmacherC., Benner A., Scheer M., Zillmann U.: Klinische Wirksamkeit vonm-THPC-PEG in einem neuen xenogenen Tumortiermodell fürhumane Plattenepithelkarzinome. Mund-Kiefer-GesichtsChir. 5:105-113 (2001).[34] Laack E., Mende T., Benk J., Chemaissani A., Scholtze J.,Lorenz C., Niestroy A., Dalhoff K., Müller T., Walter T., Dürk H.,Edler L., Hossfeld D.K.: Gemcitabine and vinorelbine as first-linechemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: a phase IItrial. Europ. J. Cancer 37: 583-590 (2001).[35] Lacroix J., Becker H.D., Wörner S.M., Rittgen W., Drings P.,Knebel-Doeberitz M.v.: Sensitive detection of rare cancer cells insputum and peripheral blood samples of patients with lung cancerby preproGRP-specific RT-PCR. Int. J. Cancer 92: 1-8 (2001).[36] Mehrabi A., Glückstein C., Benner A., Hashemi B., HerfarthC., Kallinowski F.: A new way for surgical education - developmentand evaluation of a computer-based training module. Comput.Biol. Med. 30 (2): 97-109 (2000).[37] Möhler T.M., Hawighorst H., Neben K., Egerer G., Benner A.,Hillengass J., Max R., Ho A.D., Goldschmidt H., van Kaick G.:Funktionelle Magnetresonanztomographie in Diagnostik undTherapiemonitoring beim muliplen Myelom. Radiologe 40 (8):723-730 (2000).[38] Möhler T.M., Hawighorst H., Neben K., Egerer G., HillengassJ., Max R., Benner A., Ho A.D., van Kaick G., Goldschmidt H.:Bone marrow microcirculation analysis in multiple myeloma bycontrast-enhanced dynamic magnetic resonance imaging. Int. J.Cancer 93: 862-868 (2001).[39] Möhler T.M., Neben K., Benner A., Egerer G., Krasniqi F., HoA.D., Goldschmidt H.: Salvage therapy for multiple myeloma withthalidomide and CED chemotherapy. Blood 98 (13): 3846-3848(2001).[40] Mross K.B., Robben-Bathe P., Edler L., Baumgart J., BerdelW.E., Fiebig H.H., Unger C.: Phase I clinical trial of a day-1, -3, -5every 3 weeks schedule with titanocene dichloride (MKT 5) inpatients with advanced cancer. Onkol. 23 (6): 576-579 (2000).[41] Neben K., Möhler T.M., Egerer G., Krämer A., Hillengass J.,Benner A., Ho A.D., Goldschmidt H.: High plasma basic fibroblastgrowth factor concentration is associated with response tothalidomide in progressive multiple myeloma. Clin. Cancer Res. 7(9): 2675-2681 (2001).[42] Neben K., Möhler T.M., Krämer A., Benner A., Egerer G., HoA.D., Goldschmidt H.: Response to thalidomide in progressivemultiple myeloma is not medicated by inhibition of angiogeniccytokine secretion. Brit. J. Haematol. 115 (3): 605-608 (2001).[43] Queisser W., Hartung G., Kopp-Schneider A., Diezler P.,Hagmüller E., Baur A., Weniger J., Wojatschek C., Janssen N.,Hossfeld D.K., Lindemann H., Schnabel T., Edler L.: Adjuvantradio-chemotherapy with 5-fluorouracil and leucovorin in stage IIand III rectal cancer: 12 months vs. 6 months of therapy. Onkol.23 (4): 334-339 (2000).[44] Radaeva S., Li Y., Hacker H.J., Burger V., Kopp-SchneiderA., Bannasch P.: Hepadnaviral hepatocarcinogenesis: in situvisualization of viral antigens, cytoplasmatic compartmentation,enzymic patterns, and cellular proliferation in preneoplastichepatocellular lineages in woodchucks. J. Hepatol. 33 (4): 580-600 (2000).[45] Rajaee-Behbahani N., Schmezer P., Risch A., Rittgen W.,Kayser K., Dienemann H., Schulz V., Drings P., Thiel S., BartschH.: Altered DNA repair capacity and bleomycin sensitivity as riskmarkers for non-small cell lung cancer. Int. J. Cancer 95 (2): 86-91 (2001).[46] Ranstam J., Buyse M., George S.L., Evans S., Geller N.L.,Scherrer B., Lesaffre E., Murray G., Edler L., Hutton J., Colton T.,Lachenbruch P.: Fraud in medical research: an internationalsurvey of biostatisticians. ISCB Subcommittee on Fraud. Contr.Clin. Trials 21 (5): 415-427 (2000).

[47] Risch A., Wikman H., Thiel S., Schmezer P., Edler L., DringsP., Dienemann H., Kayser K., Schulz V., Spiegelhalder B., BartschH.: Glutathione-S-transferase M1, M3, T1and P1 polymorphismsand susceptibility to non-small cell lung cancer subtypes andhamartomas. Pharmacogen. 11: 757-764 (2001).[48] Rojas M., Cascorbi I., Alexandrov K., Kriek E., Auburtin G.,Mayer L., Kopp-Schneider A., Roots I., Bartsch H.: Modulation ofbenzo(a)pyrene diolepoxide-DNA adduct levels in human whiteblood cells by CYP1A1, GSTM1, and GSTT1 polymorphism.Carcinogen. 21 (1): 35-41 (2000).[49] Schnarr B., Strunz K., Osham J., Benner A., Wacker J.,Mayer D.: Down-regulation of insulin-like growth factor-I receptorand insulin receptor substrate-1 expression in advanced humanbreast cancer. Int. J. Cancer 89: 506-513 (2000).[50] Strieth S., Hartschuh W., Pilz L., Fusenig N.E.: Angiogenicswitch occurs late in squamous cell carcinomas of human skin.Brit. J. Cancer 82 (3): 591-600 (2000).[51] Su Q., Wang S.F., Chang T.E., Breitkreutz R., Hennig H.,Takegoshi K., Edler L., Schröder C.H.: Circulating hepatitis Bvirus nucleic acids in chronic infection : representation ofdifferently polyadenylated viral transcripts during progression tononreplicative stages. Clin. Cancer Res. 7 (7): 2005-2015 (2001).[52] Uemura M., Lehmann W.D., Schneider W., Seitz H.K.,Benner A., Keppler-Hafkemeyer A., Hafkemeyer P., Kojima H.,Fujimoto M., Tsujii T., Fukui H., Keppler D.: Enhanced urinaryexcretion of cysteinyl leukotrienes in patients with acute alcoholintoxication. Gastroenterol. 118 (6): 1140-1148 (2000).[53] Volm M., Rittgen W.: Celllular predictive factors for the drugresponse of lung cancer. Anticanc. Res. 20 (5): 3449-3458 (2000).[54] Walz C.M., Nakamura M., Fukunaga T., Jasiewiecz Y., EdlerL., Schlehofer J.R., Tanaka Y.: Reduced prevalence of serum anti-bodies against adeno-associated virus type 2 in patients withadult T-cell leukaemia lymphoma. J. Med. Virol. 65: 185-189(2001).[55] Weitz J., Koch M., Kienle P., Schrödel A., Willecke F., BennerA., Lehnert T., Herfarth C., Knebel-Doeberitz M.v.: Detection ofhematogenic tumor cell dissemination in patients undergoingresection of liver metastases of colorectal cancer. Ann. Surg. 232(1): 66-72 (2000).[56] Wikman H., Thiel S., Jäger B., Schmezer P., SpiegelhalderB., Edler L., Dienemann H., Kayser K., Schulz V., Drings P.,Bartsch H., Risch A.: Relevance of n-acetyltransferase 1 and 2(NAT1, NAT2) genetic polymorphisms in non-small cell lungcancer susceptibility. Pharmacogen. 11: 157-168 (2001).[57] Wüllenweber H.P., Sutter C., Autschbach F., Willeke F.,Kienle P., Benner A., Bähring J., Kadmon M., Herfarth C., Kne-bel-Doeberitz M.v., Gebert J.: Evaluation of Bethesda guidelinesin relation to microsatellite instability. Dis Col. Rectum 44 (9):1281-1289 (2001).[58] Zehbe I., Voglino G., Wilander E., Delius H., Marongiu A.,Edler L., Klimek F., Andersson S., Tommasino M.: p53 Codon 72polymorphism and various human papillomavirus 16 E6 geno-types are risk factors for cervical cancer development. CancerRes. 61: 608-611 (2001).[59] Rittgen W., Becker N.: SMR-Analysis of historial follow-upstudies with missing death certificates. Biometrics 56 (4): 1146-1151 (2000).[60] Rittgen W., Becker N.: Statistical issues of qality control inorganised breast cancer screening. J. Epidem. Biostat. 6 (6): 425-432 (2001).

Documents

Forschungsschwerpunkt Genomforschung und Bioinformatik · In der Abteilung Molekulare Genetik werden die zwei-und dreidimensionale Struktur des menschlichen Genoms sowie die tumorspezifischen