Synthese von Peptiden. Von W. GRASSMANN und E. WÜNSCH, Regensburg.

Inhaltsübersicht. Seit ..

Einleitung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 446

I. Theoretische Grundlagen der Peptidsynthese ........................ 447

11. Methodische Voraussetzungen der Peptidsynthese .................... 455-

A. Leicht abspaltbare ex-Amino-Schutzgruppen ....................... 455-

I. Die "Acyl-blockierung" ..................................... 455 a) Carbamidsäureester (Urethane)............................ 455

x) Der "Carbobenzoxy-rest" .............................. 455 ß) Modifizierte "Carbobenzoxy-reste" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 457 y) 'Weitere leicht spaltbare Urethane ....................... 457

b) Thio-urethane ........................................... 458 c) Der "Formyl-rest"....................................... 460 d) Der "Trifluoracetyl-rest" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 460 e) Die "Lactam-Schutzgruppen" ............................ 462

'X) Der 2-Nitrophenoxy-acetyl-rest 462. - ß) Der (2-Nitro-4-carbomethoxyphenyl-)-glycyl-rest 463. - y) Der "Chlor­acetyl- (2-aminophenyl-) -glycyl-rest 463.

f) Der "Phthalyl-rest" ..................................... 464 g) Salze der Carbamid- und Dithiocarbamidsäure ............. 465 h) Der Pyrrolidon-ring ..................................... 466 j) Der p-Toluolsulfonyl-(" Tosyl" -)-rest ....................... 467 k) Phosphatamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 468

2. Die "Alkyl-blockierung" .................................... 468 a) Mono- und Dibenzyl-aminosauren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 468 b) N-Trityl-aminosäuren .................................... 469 c) Die "SCHIFFschen Basen" ................................ 471

3. Die "Ammonsalzbildung" ................................... 471

B. Die nachträgliche Einführung der ex-Aminogruppe ................ 472 1. ex-Halogen-acyl-verbindungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 472 2. ex-Azido-acyl-verbindungen .................................. 472 3. x-Keto-acyl-verbindungen ................................... 472 4. ex,ß-Ungesättigte Acyl-verbindungen .......................... 473

C. Leicht abspaltbare ex-Carbonsäure-Schutzgruppen .................. 474 1. Ester und Alkalisalze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 474 2. N'-Phenylhydrazide ........................................ 476 3. ::-if'-Carbobenzoxy-hydrazide .................................. 476

A. Chatterjee et al., Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe / Progress

in the Chemistry of Organic Natural Products / Progrès dans la Chimie

des Substances Organiques Naturelles © Wien · Springer-Verlag 1956

W. GRASSMANN und E. WÜNSCH: Synthese von Peptiden. 445

Seite

D. "Mehrfunktionelle" Aminosäuren und ihre Einbeziehung in die Syn-these ......................................................... 477 I. Die w-Aminogruppe ........................................ 477 2. Die w-Guanidogruppe ...•.................................. 479 3. Die heterocyclischen Ringsysteme ............................ 481

a) Imidazole ............................................... 481 b) Indole...................... ........................... 482

4. Die alkoholische Hydroxylgruppe ............................ 482 5. Die phenolische Hydroxylgruppe ............................ 484 6. Die Sulfhydrylgruppe ...................................... 487

a) Das "Cystin-verfahren" .................................. 487 b) Das "S-Benzyläther-verfahren" ........................... 489 c) S-Aminoacyl-derivate .................................... 490

7. Die "Thioäther" ........................................... 490 8. Die w-Carboxylgruppe ...................................... 491

a) Synthesen mit ungeschützter w-Carboxylgruppe ............ 491 b) Synthesen mit veresterter w-Carboxylgruppe . . . . . . . . . . . . . .. 491

9. Die primäre Carbonsäureamid-gruppe ........................ 492 a) Synthesen mit ungeschützter -CONH2-gruppe . . . . . . . . . . . .. 492 b) Nachträglicher Aufbau der -CONH2-gruppe ............... 492

10. Aminozucker und Phosphorsäureester . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 493

III. Methoden der Peptidknüpfung ..................................... 494 E. Esterkondensationen ........................................... 494

I. Diketopiperazine und ihre Aufspaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 494 2. Freie lineare Esterkondensation .............................. 494 3. Cyclische Esterkondensation ................................. 495 4· Systematische Esterkondensation ............................ 495

a) Energiereiche "O-Ester" .................................. 495 b) Energiereiche "S-Ester" .................................. 496

F. O-Acyl-halbacetale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 498 G. Gemischte Anhydride aus Acylaminosäure und anorganischen bzw.

organischen Säuren ............................................ 499 I. Die "FISCHERsche Säurechlorid-methode" ..................... 499 2. Die "CuRTIUssche Azid-methode" ............................ 501 3. Anhydride der Phosphorsäure ............................... 503 4. Anhydride der Phosphorigsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 504 5· Anhydride der Arsenigsäure ................................. 505 6. Thiosäuren ................................................ 506 7. Anhydride der Schwefel- und Schwefligsäure .................. 507 8. Anhydride aliphatischer und aromatischer Carbonsäuren ....... 508 9. Anhydride der Kohlensäure ................................. 510

a) Bisanhydride ............................................ 510 b) Anhydride der Mono-alkyl-kohlensäure ..................... 510

10. Die N(Im)-Acyl-imidazole ................................... 512 11. Das "Carbodiimid-Verfahren" ................................ 513 12. Cyclische "innermolekulare" Anhydride ...................... 514

a) Die N-Carbonsäure-anhydride (Oxazolid-2.5-dione) .......... 514 b) Die Mercapto-thiazolone (Thio-thiazolidone) ................ 521 c) Oxazolone und "Azlactone" .............................. 522 d) N-Acyl-oxazolidone ...................................... 524 e) Spezielle innermolekulare Anhydride ....................... 524

\V. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

Seite

H. Energiereiche "X-Derivate" der Aminosäureester ................. 527

1. X -Carbonyl-aminosäureester (iX-Isocyanat-fettsäureester) ........ 527

2. Phosphatamide ............................................. 528

3. N -Phosphorigsaure-derivate (Phosphitamide, -imide und Phos-phorazokörper) ............................................. 529

4. Arsenitamide ............................................... 536

J. Spezielle Umlagerungsreaktionen ................................ 536

1. Symmetrische N-Trifluoracetyl-aminosäureanhydride ........... 536

2. O-(iX-Aminoacyl)-salicylsäuren bzw. -amide .................... 537

Literaturverzeichnis ............................................... 537

Einleitung. Seitdem das wesentliche Bauprinzip der Eiweißstoffe in der amid­

artigen Verknüpfung von Aminosäuren erkannt war, ist die Peptid­synthese eine der wichtigsten Aufgaben der Eiweißforschung gewesen. Synthetische Polypeptide sind erstmals von CURTIUS (II4) hergestellt worden. Die von ihm aufgefundene Selbstkondensation freier Amino­säureester konnte ihrer Natur nach nur zu Gemischen von undefinierter Kettenlänge führen. Hingegen zeigen seine, unter Verwendung von Hippurylchlorid und Hippurylazid durchgeführten Synthesen von Glycin-Polypeptiden bereits die wesentlichen Merkmale der zum Aufbau definierter Peptide üblichen Schritte: Die Verwendung von Schutz­gruppen zur Abdeckung der Aminogruppe und von energiereichen und reaktionsfähigen Derivaten der Carboxylgruppe. Aber die von CL'RTIUS eingeführte Benzoylgruppe kann nicht unter Bedingungen abgespalten werden, unter denen die Peptidbindung widerstandsfähig ist; die Her­stellung freier Peptide ist daher CURTIUS auf dem von ihm eingeschlagenen Wege nicht gelungen.

Dieser Erfolg blieb EMIL FISCHER (I44) und seiner Schule vorbehalten: Die halbseitige Öffnung der Diketopiperazine, die Verwendung von iX-Halogen-acylchloriden und ihre nachfolgende Aminierung und die Ver­wendung der Säurechloride der Aminosäuren sind die wesentlichen Schritte der peptidsynthetischen Verfahren FISCHERS. Aber die Methoden FISCHERS haben sich, namentlich im Hinblick auf die Synthese lang­kettiger und unter Beteiligung polyfunktioneller Aminosäuren auf­gebauter Peptide, als weniger allgemein anwendbar erwiesen, als man dies zunächst erhofft hatte. So folgte dem von FISCHER erarbeiteten und von seinem Schüler ABDERHALDEN bis an die Grenze der damaligen experimentellen Möglichkeit weitergeführten methodischen Fortschritten eine Periode des Stillstandes. Das eigentliche Zeitalter der systematischen Peptidsynthese begann erst, als BERGMANN und ZERVAS (56) mit der Ein­führung des Carbobenzoxyrests die lange angestrebte, leicht wieder rück-

Synthese von Peptiden. 447

gängig zu machende Maskierungsmöglichkeit der Aminogruppe verwirk­lichten.

Im Laufe des letzten Jahrzehnts hat, angeregt durch wichtige Er­kenntnisse über die Funktion der Eiweißkörper und getragen von ent­scheidenden Fortschritten der eiweiß-analytischen Methodik, eine impo­nierende Neuentwicklung auf dem Gesamtgebiet der Eiweißforschung eingesetzt. Dieser Entwicklung laufen bedeutende Fortschritte der Peptidsynthese parallel. Sie sind gekennzeichnet durch die Auffindung zahlreicher neuer Schutzgruppen, die Verwendung energiereicher Ester, Thioester und Anhydride, sowie durch weitere neuere Synthesemethoden, die praktisch auf eine Aktivierung der Aminogruppe hinauslaufen. Auch die Theorie der zur Knüpfung der Peptidbindung führenden Reaktionen beginnt sich abzuzeichnen.

Eine zusammenfassende detaillierte Darstellung der Peptidsynthese hat FRUTON (I75) 1949 gegeben. Die stürmische Entwicklung der letzten Jahre auf diesem Gebiet hat dazu geführt, daß nicht nur diese Darstellung überholt ist, sondern in wesentlichen Teilen auch die kürzeren neueren Übersichtsreferate, die von TH. WIELAND (452, 453), SHAPIRO (382) sowie FROMAGEOT und JUTISZ (I74) gegeben wurden.

Die folgende Darstellung soll diese Lücke schließen. Sie beschränkt sich auf die Wege der rein chemischen Synthese und wird das wichtige Problem der enzymatischen und biologischen Eiweiß- und Peptidsynthese nur gelegentlich streifen. Eine erschöpfende Behandlung dieses Fragen­komplexes wäre nur im Zusammenhang mit den Gesamtproblemen der Peptidase- und Proteinasewirkung möglich.

I. Theoretische Grundlagen der Peptidsynthese. Die zur Synthese der Säureamid- und damit auch der Peptidbindung

führenden Reaktionen sind bimolekulare nucleophile Substitutionen (SN.); ihr wesentlicher Teilvorgang ist die Anlagerung des freien Elek­tronenpaares des Stickstoffs an das positivierte Kohlenstoffatom der Carboxylgruppe [vgl. z. B. SCHWYZER (379)].

~ R'-N-C=O + HX H I

R

Die Aminokomponente reagiert daher nur in der Form der freien Base, nicht als Ammonsalz; und die Reaktion der freien Basen ihrerseits ist -

\Y. GRASSMANN und E. \\"UNSCH:

abgesehen von sterischen Einflüssen (25, 446) - erschwert, wenn ihr freies Elektronenpaar durch Mesomerie beansprucht wird, wie dies z. B. bei aromatischen Aminen der Fall ist. Demzufolge wird man erwarten dürfen, daß die Bereitschaft der freien Base zur aminolytischen Sub­stitution etwa mit der Basenstärke parallel geht. Sie ist am größten beim Benzylamin, dann folgen Aminosäureester und primäre aliphatische Amine, während gewisse sekundäre Amine, wie z. B. Piperidin und schließ­lich das schwächer basische Anilin, am Ende der Reihe stehen (373):

H 2N-Ar < H 2N-Alk < H 2N-CH 2--Ar

Ar = aromatischer Rest, Alk = aliphatischer Rest.

Die Umsetzungsgeschwindigkeit kann nach BETTS und HAMMETT (70), sowie SCHWYZER (375) durch Basenkatalyse (Alkoholat, tertiäres Amin) erheblich gesteigert werden. Nach der Hypothese dieser Autoren spielt die durch intermolekulare Protonenverschiebung entstehende Imino­Anionform als nuc1eophiles Reagens eine bedeutende Rolle für den Reaktionsablauf.

Bei Umsetzungen von Estern in flüssigem NH3 oder Aminen ist inter­essanterweise von AUDRIETH und Mitarb. (I34, 28, I89) auch ein katalyti­scher Einfluß von Säuren, und zwar besonders der Essigsäure, beobachtet worden, ein Befund, der von SCHWYZER (375) bestätigt wird [vgl. auch SHATENSHTEIN (383), JUNG, MILLER und DAY (25I); vgl. dagegen BETTS und HAMMETT (70)].

In der Carbonylkomponente hängt die positive Polarisierung von der Natur der Reste X und R ab; alle Änderungen dieser beiden Substituenten, welche die Positivierung des Carbonyl-Kohlenstoffatoms fördern, werden die Neigung zur Aminolyse begünstigen. Nach dem Einfluß des Restes R lassen sich die Carbonsäuren und Derivate etwa in der folgenden Reihe fallender Reaktionsfähigkeitordnen (469, 373, 420):

<x-Halogenacyl > Formyl > N-Acylaminosäuren > Acetyl> langkettige und verzweigte aliphatische sowie aromatische Säuren.

Die hohe Reaktionsfähigkeit der halogen-substituierten Säuren ist dabei dem induktiven Effekt der elektronen-anziehenden Halogene, der Unterschied zwischen Formyl- und Acetylverbindung dem Fehlen bzw. Vorhandensein der Hyperkonjugation zuzuschreiben. Die geringe Reak­tionsfähigkeit der letzten Gruppe anderseits dürfte, abgesehen von sterischen Hinderungen (420), zurückzuführen sein auf die elektronen­abstoßende Wirkung großer und verzweigter Alkylgruppen, die der Positivierung des Carbonyl-C-Atoms entgegenwirkt, im Falle der aro­matischen Carbonsäuren auch auf die Resonanzstabilisierung des aro-

Synthese von Peptiden. 449

matischen Systems, in die die Elektronen des Carbonyls mit einbezogen werden.

Die angeführte Reihenfolge, die besonders auch für das Verhalten gemischter Säure anhydride wichtig ist (s. unten), geht im großen und ganzen der Dissoziation der zugrunde liegenden Säuren parallel. Dies ist zu erwarten; denn Elektronenmangel am Carboxyl-C ist gleichbedeutend mit verstärkter Tendenz zur Abstoßung des Protons von der Hydroxyl­gruppe und zum Übergang in die anionische Form. Auch die Bedeutung der Funktionsgruppen X für die positive Polarisierung des Carbonyl­Kohlenstoffs und damit für die Neigung zur Amidbildung kann unter ähnlichen Gesichtspunkten verstanden werden.

Carbonsäuren (X = OH) und Thio1carbonsäuren (X = SH) werden der Reaktion zugänglich sein in Form der undissozierten Säure,

01 /

R-C

'" OH

-(-i 01

(+)",-R-C bzw.

'" OH

01 /

R-C

'" SH

nicht (oder im Fall der Thio1carbonsäuren nur schwer) dagegen in Form des Säureanions, in dem wegen der Mesomerie A ~ Beine Grenzform (C) mit positiviertem Kohlenstoffatom kaum gebildet wird.

/ 01 01 /-

-H 01

(+)/-R-C R-C R-C

"'- ~ "'-21 21 21 (A) (B) (C)

Damit lassen sich zunächst die Verhältnisse für die Umsetzungen der Carbonsäuren und Thio1carbonsäuren mit Aminen in wäßrigen oder wasserähnlichen Medien überschauen: Durch Erhöhung der Wasser­stoffionen-konzentration wird die Dissoziation der Carboxylgruppe zu­rückgedrängt, gleichzeitig aber die Aminkomponente in die Ammonium­form übergeführt; die COOH-Gruppe, nicht aber die Aminkomponente, hat einen der Reaktion günstigen Zustand. Bei Erhöhung des PR-Wertes erfolgt das Umgekehrte: Das Amin ist reaktionsbereit, nicht aber die nun zum Anion ionisierte Carboxylgruppe. Bei aliphatischen Carbonsäuren und aliphatischen Aminen und erst recht bei den in mittleren pR-Bereichen ausschließlich als Zwitterionen vorliegenden Aminosäuren gibt es im allgemeinen in wäßriger Lösung keinen PR-Bereich, in dem undissoziierte Carboxylgruppe und freies Amin in größerer Konzentration coexistent sind. Bei größerem Abstand zwischen Amino- und Carboxylgruppe, also bei längeren Peptiden, rücken, verglichen mit den Verhältnissen bei

Fortschritte d. ehern. org. Naturst. XIII.

\V. GRASSMA~N und E. WÜNSCH:

Aminosäuren, die PK-Werte der Carboxylgruppen zu höheren, die der Aminogruppen zu niedrigeren pwWerten. Die an sich sehr ungünstigen energetischen Voraussetzungen für eine direkte Kondensation zwischen Amino- und Carboxylgruppe werden dadurch etwas verbessert (452).

Im Falle der reaktionsfähigen Thiolsäuren sollte die Reaktions­geschwindigkeit in wäßriger Lösung dem Produkt aus den Konzentra­tionen der undissoziierten Thiolsäure [-SH] und des freien Amins [-NH2J proportional sein, und der PH-Wert maximaler Umsetzungs­geschwindigkeit sollte dem Mittel der PK-Werte von beiden entsprechen. Daß diese Beziehung annähernd gilt, ist von SCHWYZER (373) gezeigt worden: pHmax = 1/2 (pKSH + pKNH2).

Bei Umsetzungen von Thiolcarbonsäuren und den meisten anderen Carbonsäure-derivaten in wäßriger Lösung ist zu berücksichtigen, daß die Aminolyse mit der Hydrolyse zu konkurrieren hat und daß die tatsäch­lichen Ausbeuten an Amid das Ergebnis dieser beiden Konkurrenz­reaktionen sind. Da im wäßrigen Medium das molekulare Verhältnis Wasser: Amin sehr stark nach der Seite des Wassers gelegen ist, muß die Geschwindigkeitskonstante der Aminolyse bedeutend höher sein als die der Hydrolyse, wenn beträchtliche Ausbeuten erhalten werden sollen. Für den Fall der Thiolcarbonsäuren und ihrer Ester liegt das Verhältnis der beiden Geschwindigkeitskonstanten beispielsweise in der Größen­ordnung von 400 (373).

Die Frage, durch welche substitutionschemischen oder katalytischen Einflüsse die Aminolyse spezifisch, also ohne gleichzeitige Beschleunigung der Hydrolyse, begünstigt werden kann, bedarf weiterer Untersuchung. Im Falle der Umsetzung von Thiolcarbonsäureestern mit Aminen kommt den Ionen des Ag, Cu, Hg und Pb eine solche spezifische Wirkung zu, nach einer hypothetischen Vorstellung SCHWYZERS (377) wahrscheinlich deswegen, weil diese positiven Ionen Elektronen vom Schwefel und damit indirekt auch vom Carbonyl-Kohlenstoff abziehen und zugleich durch ihre komplexe Bindung an das Amin dieses in die räumliche Nähe des positivierten C-Atoms bringen.

o

R-C--'>S-R"

H y

R'-N ···-+Ag H

o I,

R-C + i

R'-NH

Ag-S--R"

H+

Auf diesem Wege ist von SCHWYZER die Synthese von Benzoylanilid und Hippursäure aus Benzoyl-pantethein und Anilin bzw. Glykokoll in wäßriger Lösung unter Bedingungen durchgeführt worden, unter denen sie ohne Schwermetallzusatz nicht gelingt. Die Bedeutung solcher Reak­tionen als Aminoacylase-Modelle wird allerdings eingeschränkt durch die

Synthese von Peptiden. 45 1

Tatsache, daß für die Reaktion nicht katalytische, sondern stöchio­metrische Schwermetallmengen benötigt werden. Dies ist zu erwarten, da das Schwermetall an der entstehenden Sulfhydrylverbindung ge­bunden bleibt. Wird an Stelle von Schwermetallionen das gleichfalls elektrophile Jod verwendet, so entsteht kein Amid, sondern es erfolgt rasch Hydrolyse der COS-Bindung. Auch diese Reaktion gelingt aber nicht mit katalytischen, sondern nur mit stöchiometrischen Mengen, weil Jod mit der gebildeten SH-Verbindung zum Disulfid weiterreagiert.

Ersetzt man in der Formel (I) (S. 447) das Carboxylhydroxyl (X) durch Reste von höherer Elektronenaffinität (-OR", -SH, -SR", -Na, -Cl), so gelangt man zu reaktionsfähigen und energiereichen Säure­derivaten, von denen die meisten schon lange als Acylierungsmittel von Bedeutung sind. Die gesteigerte Elektronen-affinität dieser Reste be­günstigt die Elektronen-verarmung am Carbonylkohlenstoff und zugleich die nachfolgende Abspaltung von X in anionischer Form. Weiterhin wird durch die Einführung dieser Reste (mit Ausnahme der SH-Gruppe) die Ausbildung der der Amidbildung nicht oder kaum zugänglichen Carboxylat-anionen verhindert, so daß es nun keine Schwierigkeiten macht, sowohl in wäßrigen wie in nicht-wäßrigen Medien Bedingungen zu wählen, unter denen die Aminkomponente als freie Base vorliegt. Bei Umsetzung in wäßrigen Medien aber bleibt natürlich auch hier die Hydro­lyse als Konkurrenzreaktion zu beachten.

Da die Reste -SH, -SR", -Na, -Cl (und im weiteren Sinne auch -OR") Säurereste sind, kann man die entsprechenden substituierten Carboxylderivate auch als gemischte Anhydride auffassen und sie den in neuerer Zeit zu Peptidsynthesen vielfach herangezogenen gemischten Säureanhydriden mit Phosphor-, Phosphorig-, Schwefel-, Schwefliger­und Kohlensäure als Anhydridpartner an die Seite stellen. Daß die Säurestärke der zugrunde liegenden freien Säuren HX und die Fähigkeit, in Bindung an die Acylgruppe R-CO-X die Positivierung des Carbonyl­kohlenstoffs zu begünstigen, parallel gehen sollten, ergibt sich daraus, daß die Fähigkeit, die Protonen festzuhalten und die Fähigkeit, Elek­tronen vom Carbonylkohlenstoff abzuziehen, offenbar gegenläufig sein müssen. Dementsprechend sind in der Aminolyse Phenylester und Enol­ester reaktionsfähiger als gewöhnliche Alkylester, und Thioester reaktions­fähiger als die entsprechenden Sauerstoffester.

Schließlich läßt sich die Reaktionsfähigkeit von Carbonsäureestern und Thio1carbonsäureestern, denen die sehr schwachen Säuren Alkohol bzw. Thioalkohol zugrunde liegen, durch Einführung negativer Sub­stituenten in den Rest R" (Substituenten mit 1--Wirkung) beträchtlich steigern. Der negative Substituent vermindert durch einen zusätzlichen Induktionseffekt die Elektronendichte am Carbonyl-C-Atom vor und während des nucleophilen Angriffs, wodurch die Reaktionsgeschwindigkeit

29*

452 \Y. GRASSMANN und E. "'UNseR:

erhöht wird. Als besonders geeignet hat sich der Cyanmethylester (R" = -CH2CN) erwiesen; etwas weniger reaktionsfähig und zum Teil auch aus anderen Gründen weniger geeignet sind z. B. Carbäthoxy­(R" = -CH2COOC2H5), Dicarbäthoxy- [R" = -CH2(COOC2Hs)2J und Acetomethylester (R" = -CH2COCH3) sowie p-Nitrobenzylester. Auch die Ester des Cholins sind wegen der I--\Virkung der quarternären Ammoniumgruppe hierher zu zählen (379, 376, 375).

In der Reihe der Thiolcarbonsäureester sind von SCHWYZER (J73) auch Carboxymethyl- (R" = -CH2COOH) und die ß-Carboxyäthyl­ester (R" = -CH2CH2COOH) als Ester von hoher Reaktionsfähigkeit verwendet worden. Dabei ist zu beachten, daß nur die undissoziierte Carboxylgruppe dieser Thioestersäuren als reaktions-erleichternder r--Substituent anzusprechen ist, nicht dagegen deren Anion; für die pR-Abhängigkeit ihrer Umsetzung mit Aminen in wäßriger Lösung er­geben sich damit ähnliche Verhältnisse wie sie oben für die Thiolcarbon­säuren geschildert worden sind.

Durch die Begrenzung der Polarisierbarkeit des Sauerstoffs und wohl auch des Schwefels ist allerdings der Erfolg des I--Effekts beschränkt. Die Einführung mehrerer negativer Substituenten in die Methylgruppe der Ester führt nicht zu einer Beschleunigung der Aminolyse, sondern zu einer Änderung des Reaktionsablaufs; unter Regenerierung der Carbon­säure wird die OH-Gruppe des Alkohols gegen den Aminrest ausgetauscht (IOO) , z. B.:

o 7

R-C CCl3 " / O-CH

'" CH2:'{°2

Eine Aktivierung des Acylrests kann schließlich durch Bindung an die saure Iminogruppe des Imidazols und verwandter Verbindungen [Purin derivate und dgl.; vgl. GERNGROSS (I84), BERGMANN (54), WIELAND (465)J erreicht werden. Der Elektronenmangel des Imidazol-Stickstoffs, dessen Elektronenpaar durch Einbeziehung in das heterocyclisch-aro­matische System weggenommen ist, führt hier zur Positivierung des Carbonyl-C-Atoms.

7 R-C

'" ° R"

O-CH-OR'"

Den aktivierten Estern werden häufig, aber zu Unrecht, als eine weitere Gruppe von Verbindungen mit aktiven Acylgruppen die Verbindungen der allgemeinen neben­stehenden Formel also z. B. die "Methoxymethylester" (379) oder die "Ester" des x-Oxytetrahydropyrans (248)

zugezählt. Der Partner des Säurerests ist in diesem Falle kein Alkohol, sondern ein in der Halbacetalform vorliegender Aldehyd. Es handelt sich also um Acyl­halbacetale ; ihr Reaktionsverhalten steht dem der aktivierten Ester nahe.

Synthese von Peptiden. 453

Als letzte und zugleich als eine der für die neuere Peptidsynthese wichtigsten Gruppen von Verbindungen mit aktivierten Acylgruppen seien die symmetrischen und die unsymmetrischen (oder "gemischten") Säureanhydride angeführt. Die Verwendung von Säureanhydriden zu Acylierungen ist lange bekannt. Aber Anhydride von Acylaminosäuren sind erstmals fast gleichzeitig von WIELAND (46I) , VAUGHAN (4I6) und BOISSONNAS (75) hergestellt und für die Peptidsynthese verwendet worden. Eine große Bedeutung haben dabei insbesondere auch die gemischten Säureanhydride mit anorganischen Säuren (S.499) gewonnen. Von den nicht N -acylierten Aminosäuren sind bisher nur in einigen wenigen Fällen gemischte Anhydride mit Phosphorsäure beschrieben (42,254); im all­gemeinen dürften diese Anhydride wegen der gleichzeitigen Anwesenheit einer ungeschützten Aminogruppe und einer aktivierten Carboxylgruppe sehr wenig beständig sein.

In den Säureanhydriden sind die C-Atome beider Carbonylgruppen durch die elektronen-anziehende Wirkung sowohl der Carbonyl-sauer­stoffe wie des Brückensauerstoffs positiviert und der Aminolyse deswegen leicht zugänglich. Wegen der Resonanz zwischen den beiden symmetri­schen Grenzformen

sind dabei energetisch die symmetrischen Anhydride gegenüber den unsymmetrischen begünstigt, so daß bei gemischten Anhydriden mit einer Disproportionierung zu rechnen ist:

0 0 0 /' /' /'

R'-C R'-C R"-C

'" '" '" 2 0 0 + 0 / / /

R"-C R'-C R"-C '\. '\. '\.

0 0 0

Bei der Aminolyse symmetrischer Anhydride wird bekanntlich einer der beiden Säurereste als Amid, der andere als freie Säure erhalten und man gewinnt, unabhängig davon, welche der beiden mesomeren Grenz­formen reagiert hat, immer 50% der vorhandenen Säure als Amid. Bei der Verwendung unsymmetrischer Säureanhydride einer Acylaminosäure und einer (anorganischen oder organischen) "Hilfssäure" wird man diese

454 \Y. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

und die Bedingungen so wählen müssen, daß die Disproportionierung weitgehend vermieden und die Aminolyse an der Aminosäure-Hälfte und nicht an der Hilfssäure verläuft (vgl. S. 504).

Es besteht hier die bereits oben geschilderte Reihenfolge der Reak­tionsbereitschaft verschiedener Säurereste. WIELA~D und seine Schule (469) haben festgestellt, daß in jedem Falle diejenige Acylhälfte bevorzugt dem Angriff nucleophiler Reagenzien unterliegt, deren Esterderivate z. B. leichter der Hydrolyse anheimfallen. Im ganzen gesehen besteht auch hier die schon oben diskutierte Parallelität mit den Dissoziationskonstanten der freien Säuren. Bei der Aminolyse gemischter Anhydride aus Acyl­aminosäure und anorganischer Säure, wie z. B. Phosphor- oder Schwefel­säure, aber tritt der Stickstoff immer an den organischen Säurerest, während der Brückensauerstoff grundsätzlich am anorganischen Rest verbleibt; dies entspricht vollkommen den Verhältnissen bei der Hydrolyse anorganischer Säureester.

Den geschilderten Verfahren der Peptidsynthese, denen eine Akti­vierung der Carboxylgruppe zugrunde liegt, kann man im gewissen Sinne eine Gruppe in neuerer Zeit aufgefundenen Peptidsynthesen gegenüber­stellen, deren Wesen in einer "Aktivierung" der Aminogmppe gesehen wird. In Wahrheit handelt es sich dabei nicht um eine wirkliche Akti­vierung der Aminogruppe, deren freies Elektronenpaar zu einer nucleo­philen Reaktion keiner besonderen Aktivierung mehr bedarf, sondern um Säureamid- bzw. -imidverbindungen, deren ungesättigtes Säure-zentral­atom sich an die Carboxylgruppierung anzulagern vermag. Zum Beispiel setzen sich Isocyanate (N-Carbonylderivate von primären Aminen) in völli­ger Analogie zum Keten mit Carbonsäuren zu den thermodynamisch labilen gemischten Anhydriden - in diesem Falle von N-Carbonsäuren (II) -um. Diese in einigen Fällen ge faßten Zwischenprodukte (IIb) (J28) ent­halten den Stickstoff und das positivierte Carbonyl-C-Atom in räumlicher günstiger Lage und zerfallen daher besonders leicht unter CO2-Abspaltung zu den stabileren Säureamiden (IH). In völliger Analogie erfolgt die Umsetzung von substituierten Phosphat-, Phosphit- (einschließlich der "Phosphorazo" -verbindungen) und Arsenit-amide mit Carbonsäuren.

R-COOH + O=C=N-R'

o R-C/ :?\:-R'

'" O-C

OH

(Il a.)

o 11

R--C(+)

H :?\:-R'

" 1 ~O(-) C

o (II b.)

o -co. / ---. R-C

'" NH-R'

(III.)

Synthese von Peptiden. 455

Die Knüpfung der Amidbindung als solche ist vom rein präparativen Standpunkt weitgehend gelöst. Die Übertragung auf das Peptidgebiet ist jedoch mit einer erheblichen Schwierigkeit verbunden. Sie resultiert daraus, daß die miteinander zu verbindenden Komponenten gleichzeitig Amino- und Carboxylgruppen im Molekül enthalten, und als Zwitterionen vorliegen. Jeder Versuch einer "Aktivierung" dieser Systeme - wenn sie in der Zwitterionen form überhaupt möglich wäre - würde sofort zu einer unkontrollierbaren Polykondensation ausarten. Um die Voraus­setzung für eine gelenkte "systematische", nucleophile Addition zu schaffen, ist es daher notwendig, die zweite Funktion des Aminosäuremoleküls zu blockieren. Man erreicht aber damit mehr als die Verhinderung einer unerwünschten Reaktion: erst durch die Blockierung der Carboxylgruppe wird die Aminogruppe statt in der Ammoniumform als freie Base und erst durch die Blockierung der Amino- die Carboxylgruppe als freie Carbonsäure verfügbar und für die oben besprochenen Aktivierungs­reaktionen zugänglich. Erst in zweiter Linie sind die hierfür heran­gezogenen Derivate "Schutzgruppen". Selbstverständlich werden nur solche "Blockierungs"- bzw. "Schutz"-gruppen der Carboxyl- wie Amino­gruppierung für die Peptidsynthese brauchbar sein, die nachher leicht, ohne jeglichen Angriff auf die gebildete Peptidbindung, wieder entfernt werden können.

II. Methodische Voraussetzungen der Peptidsynthese. A. Leicht abspaltbare iX-Amino-Schutzgruppen.

I. Die "Acyl-blockierung".

a) Carbamidsäureester (Urethane).

iX) Der "Carbobenzoxy-rest". Der Anwendungsbereich der von FISCHER und von CURTIUS gegebenen Methoden zur Synthese der Peptidbindung blieb durch das Fehlen von leicht abspaltbaren iX-Aminoschutzgruppen -auch der Carbäthoxyrest hatte den langjährigen Bemühungen FISCHERS getrotzt (S. 499) - doch sehr beschränkt. Wie erwähnt, leiteten BERG­MANN und ZERVAS (56) einen neuen Abschnitt der Peptidehernie ein. Die verhältnismäßig leichte Abspaltbarkeit von 0- und N-Benzylgruppen durch katalytische Hydrierung (347, I72, SI) veranlaßte die BERGMANN­Schule, nach ihren Mißerfolgen mit den Acetylderivaten (5I, 48, 55, 68) die Darstellung von "Carbobenzoxy-aminosäuren" und ihre Verwendung in der Peptidsynthese zu versuchen.

Das hierzu benötigte "Carbobenzoxychlorid" (Chlorkohlensäure-benzylester) ge­winnt man leicht aus Phosgen und Benzylalkohol in Toluol (56, 97) bzw. neuerdings (I32) besonders rein und bei 0° jahrelang haltbar, direkt aus den Komponenten bei _20° bis - 30°; dieses kuppelt leicht mit Aminosäuren bzw. deren Estern zu den gewünschten substituierten Urethanen.

\V. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

R' R'

-HCI ! CsHsCHzO-COCI + HzNCHCOOR" Cbo-NHCHCOOR" ~ '--,,--

Cbo-R'

H 2(Pd) ---> CsH sCH3 + H 2NCHCOOR" -co,

R' = Aminosäure-(AS)-Seitenkette. R" = H oder Alkyl.

Bei den optisch-aktiven Ausgangsmaterialien tritt hierbei keine Racemisieruug ein. Durch einfache katalytische Hydrierung wird die Carbobenzoxy-verbmdung in Toluol, Kohlendioxyd und Aminoderivat gespalten (s. oben).

Dieses Verfahrens haben sich bis in die heutige Zeit zahlreiche Autoren bedient. Nachdem es gelungen war, zusätzliche Abspaltungs­reaktionen für den Carbobenzoxyrest erfolgreich zu verwerten, hat sich der Anwendungsbereich noch umfangreicher gestaltet.

So empfehlen zur Entfernung dieser Schutzgruppe : \\"HITE (45I) verdunnte Salzsäure bei 60°, DUVIGNEAUD und Mitarb. (393, 293) ~atrium in flussigem Ammoniak, HARINGTON und MEAD (2I7) Phosphoniumjodid in Eisessig bei 40° (83), WALDSCHMIDT-LEITZ und KÜHN (434) Jodwasserstoff in Eisessig, ANDERSOl'i ([9). BEN-IsHAI (39), sowie BorSSONNAS (77) Bromwasserstoff in Eisessig bzw. ALBERTSON und McKAY (I5) in Nitromethan, BOISSONNAS und PREITNER (77) schließlich Chlor­wasserstoff in Eisessig. Die letztgenannten Autoren geben in ihrer Arbeit eine Zu­sammenstellung über die Abspaltbarkeit von Carbo-alkoxy-, Carbo-aryloxy-, Tosyl-, Formyl- und Phthalylresten nach den genannten Methoden an.

Im Gegensatz zur hydrierenden Spaltung ermöglichen diese Ent­acylierungsmethoden die Heranziehung von Carbobenzoxy-verbindungen S-haltiger Aminosäuren zur Peptidsynthese (37, I9I). (Zur Darstellung von Methioninpeptiden unter Anwendung dieser Verfahren s. auch S.490.)

Der Abspaltung des Carbobenzoxyrestes mittels Halogenwasser­stoffen in Eisessig liegt nachstehendes Schema einer durch Protonen katalysierten Solvolyse zugrunde. Besonders dieses Verfahren der Urethanspaltung hat sich gut bewährt: Die Benzyl-thioäther (z. B. S-Benzylcystein), primäre Carbonsäureamid- und die Estergruppierung bleiben hierbei unangegriffen (76, 40). Entgegen der Mitteilung von BEN-IsHAI können wir die vollkommene Beständigkeit der Benzylester nicht bestätigen (207).

1+) CsHsCHz-O-CO-XH-R'

H

CsHsCHz(+) + Br(-) ---.> CsH sCH2Br

R' = Aminosaure- oder Peptidrest.

Synthese von Peptiden. 457

Als bislang zutage getretene Nachteile der Carbobenzoxygruppierung muß ihre nicht vollkommene Alkalibeständigkeit genannt werden. So ent­stehen aus den Carbobenzoxy-peptidestern bei ihrer Verseifung als Nebenprodukte Harnstoff- bzw. Hydantoinderivate (359, 437, 2°7); vgl. auch S. 492-493.

C6H 5 CH20CO-NHCHCO-NHCHCO-NH ...... COOR" i I

R' R'

l NaOH

R'

HC-CO

I "'N-CHCO-NH ...... COOH / '

HN-CO R'

H(+) r lOHH

HOOCCHNH-CO-NHCHCO-NH ...... COOH

I I R' R'

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Neuerdings ist man zur Verseifung der Ester mit verdünnter Salzsäure (r8), insbesondere nach vorgehender Entfernung des Carbobenzoxyrestes mit Halogen­wasserstoffen in Eisessig, übergegangen (4r8).

Weiterhin beschränkt die verhältnismäßig große Unbeständigkeit der Carbobenzoxy-aminosäurechloride, die sich leicht zu N-Carbonsäure­anhydriden zersetzen, die Anwendung der ausgezeichneten "FISCHERschen Säurechloridmethode" oft weitgehend. Anderseits aber stellt diese Reak­tion einen der bedeutendsten Wege zur Gewinnung der Oxazoliddione dar.

ß) Modifizierte "Carbobenzoxy-reste". In den letzten Jahren wurde durch Einführung von p-substituierten Carbobenzoxy-resten die Kristallisationsfreudigkeit verschiedener Aminosäurederivate und Peptid­zwischenprodukte erheblich erhöht und damit deren Handhabung sowie die Herstellung von Peptiden verbessert. In Analogie zum "normalen" Carbobenzoxy-rest ist auch die p-Brom- von CHANNIG und Mitarb. (98) bzw. die p-Nitro-verbindung von CARPENTER und GISH (96, I87) leicht wieder abspaltbar.

y) Weitere leicht spaltbare Urethane. STEVENS und W AT AN ABE (404) konnten zeigen, daß das Allylchlorocarbonat mit Aminosäuren sehr gut kristallisierte Derivate liefert. Die Carballyloxy-schutzgruppe ist durch Phosphoniumjodid oder Bromwasserstoff (77) in Eisessig quantitativ abspaltbar, mit Hilfe der katalytischen Hydrierung bzw. der Einwirkung

W. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

von Natrium in flüssigem Ammoniak jedoch nur zu 70-80%. Ein Teil des Carballyloxy-restes wird hierbei zur hydrogenolytisch-unangreifbaren N-Carbo-propyloxy-gruppierung reduziert. BorssoNNAs und PREITNER konnten ferner N -Carbo-phenoxy- und N -Carbo-p-tolyloxy-aminover­bindungen mit Natrium in flüssigem Ammoniak bzw. durch katalytische Hydrierung quantitativ spalten und somit für die Peptidsynthese nutzbar machen (77).

b) Thio-urethane.

EHRENsvÄRD (I26) hat den Phenyl-thiocarbonyl-rest (PTC) als Aminoschutzgruppe vorgeschlagen. Seine besonderen Vorzüge sollten die relative Säurebeständigkeit bzw. eine leichte Abspaltung mittels Bleiacetat in 70%igem Alkohol oder Bleihydroxyd + O,I n-Natronlauge sein. HOFMANN und Mitarb. (289) konnten jedoch zeigen, daß bei der Abspaltung des PTC-restes unter genannten Bedingungen keinesfalls freie Peptide oder Peptidester erhalten werden. Zwar wird unter dem

o R'

C6H.S-C--~H-CH + Pb/z(++)

, "

HX-CO -CeHaSPb/z ----~

R'--CH ,

COOR"

RmgscbIuß -----_.~-- -+

OHR' ii i ,

(+)C-N-CH

HN-CO ,

R'-CO

COOR"

(IV.)

NH-CH-R' / I

O=C/ !

K-C=O ,

R'-CH ,

COOR"

(VI.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = H oder Alkyl.

Einfluß von Pb++-Ionen Bleithiophenolat gebildet, doch das dabei ent­stehende N-Carbonyl-kation (IV) lagert sich spontan in das Isocyanat (V) um, das nun seinerseits durch innermolekularen Ringschluß Hydan­toin-essigsäure (-ester) (VI) ergibt. Diese Reaktion wurde neuerdings von WESSELY und seiner Schule (444) erfolgreich beim Peptidabbau an­gewandt. NOGUCHI und HAYAKAWA (p8) nutzen die enorme Alkali­empfindlichkeit der PTC-Aminosäuren aus, um durch Erhitzen in Dioxan in Gegenwart von Pyridin Polypeptide zu erhalten.

Synthese von Peptiden. 459

KOLLONITSCH und Mitarb. (275) ist es vor kurz"em gelungen, die Thiourethangruppierung in Richtung freies Amin zu spalten und der Peptid synthese nutzbar zu machen: Phenylthiocarbonyl-peptidester (VII)

R' R'

C SH 5 S-CO-NHCHCO-NHCHCOOR"

(VII.)

Perbenzoesaure 1-10°

R' R' R' R' o pH4-5 I I

C 6H 5-S-CO-NHCHCO-NHCHCOOR -----;. H 2NCHCO-NHCHCOOR" o -co, (VIII.) (IX.)

+ CSH 5-S02H

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

lassen sich durch oxydative Behandlung mit Wasserstoffperoxyd in Eisessig, Ozon oder am besten mit organischen Persäuren und folgende milde saure Hydrolyse des Oxydationsprodukts (VIII) in guter Ausbeute in die freien Peptide ster überführen.

\Veiter konnte KOLLONITSCH mit Einführung besonders der Benzyl­thiocarbonyl-gruppierung (BTC) die sehr störende Alkali-empfindlichkeit der PTC-Verbindungen bannen. Der aus Benzylmercaptan und Phosgen in Gegenwart katalytischer Mengen Aluminiumchlorid leicht erhält­liche Chlorkohlensäureester (X) kuppelt mit Alkalisalzen von Amino­säuren in wäßrig-bicarbonatalkalischer Lösung. Bei optisch-aktiven Aminosäuren tritt hierbei keine Racemisierung ein. Die erhaltenen Benzylthiocarbonyl-aminosäuren (XI) sind im Gegensatz zu den PTC­Derivaten der Peptidknüpfung mittels der WIELAND-BorsSONNAS­V AUGHANschen Anhydrid- sowie der SHEEHANschen Carbodiimid-methode (SS. 5IO, 5I3) zugänglich.

R' I

C sH 5 CH2S-COCl + H 2NCHCOOH

Alel.

-Hel

NaHeO. --......

(MgO)

(X.)

R' I

CSH 5 CH2 S-CO-NHCHCOOH

(XL)

R' = Aminosäure-Seitenkette.

Erwähnenswert ist ferner die Beständigkeit der Benzylthio-urethane gegenüber Bromwasserstoff-Eisessig (275).

\Y. GRASSMANN und E. \VÜNSCH'

c) Der "Formyl-rest".

Über die Verwendung des Formyl-rests zur Maskierung der ::x-Amino­gruppe berichtet WALEY (435). N-Formyl-aminosäuren lassen sich nach der "Anhydrid-methode" mit Aminosäureestern (hier speziell Benzyl­estern) kuppeln; die erhaltenen N-Formyl-derivate spalten leicht die schützende Gruppe beim Behandeln mit 0,5 n-alkoholischer (-benzyl­alkoholischer) Salzsäure ab. W ALEY gelang so die Darstellung von L-Tyrosy l-e-carbo benzoxy -L-lysin benzylester -h ydrochlorid.

O=CH-NHCHCO-O-COOR" + H 2NCHCOOR'" ---+

I R' R'

HCI HCI -+ O=CH-NHCHCO-NHCHCOOR'" ------+ H 2NCHCO-NHCHCOOR'"

I I -HCOOH I i R' R' R' R'

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl. R'" = Benzyl.

HILLMANN (228) hatte auf schlechte Ausbeuten bei der Synthese von Formyl­peptiden aus Formyl-aminosäuren und Aminosäuren (Natriumsalze) mittels der "Anhydridmethode" hingewiesen. Dies bestätigen neuerdings KING und :\fitarb. (269), die fanden, daß das gemischte Anhydrid aus N-Formyl-glycin und Chlor­kohlensäureester mit p-Aminobenzoesäure-natrium in wäßriger Lösung knapp 50<j~ des gesuchten Derivats liefert. Als sie den entsprechenden Ester als Kupplungs­komponente wählten, erhielten sie jedoch den N-Carbäthoxy-aminobenzoesäureester. Zur Begründung dieses Reaktionsverlaufs wird eine völlig abnormale Bildung des Kations R"OOC+ an Stelle von OHC-NHCH2CO<+) angenommen (269).

d) Der "Trifluoracetyl-rest".

WEYGAND und Mitarb. (448 a) haben durch Einwirkung von Tri­fluoressigsäure-anhydrid "TFA-Aminosäuren" (XII) in sehr guter Aus­beute synthetisiert. Diese sind sehr beständige und zum Teil im Vakuum sublimierbare Körper, die aber rasch der Spaltung mit verdünnter Natronlauge (448), Bariumhydroxyd-lösung (4II) oder selbst wäßrigem Ammoniak bei PR 10 unterliegen (358). Damit stellt diese Schutzgruppe die einzige alkalisch leicht spaltbare Amino-Blockierung dar, ohne daß unter diesen Bedingungen die Gefahr einer Hydrolyse der Peptidbindung besteht. Interessanterweise wird die sonst relativ säurebeständige Amid­bindung von alkoholischer Salzsäure unter Regenerierung der freien Aminogruppe angegriffen (450), eine Tatsache, die mit Erfolg zur Dar­stellung von Peptidester-hydrochloriden angewandt werden kann.

Die TFA-Aminosäuren lassen sich mit Thionylchlorid in Benzol glatt in die zur Peptidknüpfung geeigneten Säurechloride (XIII) überführen (448), die nach WEYGAND und REIHER (450) mittels Dicyc1ohexylamin­azid in die TFA-Aminosäureazide (XIV), nach CALVIN und Mitarb. (358) mittels Thiophenol in die Thioester (XV) umwandelbar sind. In

Synthese von Peptiden.

R' R' I I

H 2NCHCO-NH CHCOOH

jNaoH

R' R' I I

CFaCO-~HCHCO-NHCHCOOH

R' I + SOC1,

CFaCO-NHCHCOOH

R' I

H2NCHCOONa R' I

CFaCO-NHCHCO-SC6H S

(xv.)

Thiophenol t I ~----- ----i

R' R' I

CFaCO-NHCHCOCl

(XII.) (XIII.)

DicycIohexyl-amin-azid 1 f

(CF.CO)20

~

/' P

R' I

NCHCOOR"

I "'NHCHCOOR" I I I R'

R' I

R'

CFaCO-NHCHCONa (XIV.)

R'

R' I

I

R' I

CFaCO-NHCHCO", I

CF aCO-NHCHCO-NHCHCOOR"

_____ 1 no·,",o,,,, + H,NCHCOOR

CFaCO (XVl.)

o /

I f' I H 2NCHCOOB. ~

R' I

CFaCO-NHCHCO", /COCFa

0+0

/ '" CFaCO-NHCHCO COCFa I

R' (XVII.)

R' R' I I

H 2NCHCO-NHCHCOOR"

,HCl

R' I

CF aCO-NHCHCOOH +

R' I

+ H 2NCHCOOH +

+CFaCOOBz + CFaCOOH

R' = Aminosäure-Seitenkette. RN = Alkyl. Bz = Benzyl. (Betr. Phosphorazokörper s. die Fußnote auf S. 533.)

Formelübersicht I.

besonders gelagerten Fällen der Peptidsynthese können diese energie­reichen Derivate - trotz ihrer umständlichen Darstellungsweise - von erheblicher Bedeutung sein (Formelübersicht I).

\V. GRASS MANN und E. WÜNSCH:

Darüber hinaus sind für die Synthese von Peptiden aus TFA-Amino­säuren brauchbar: 1. die Phosphorazomethode (I95, 450) und 2. die Bildung von gemischten Anhydriden mit Trifluoressigsäure (XVI, S. 46r) und deren Umsetzung mit Aminosäureestern.

Als empfmdliche Nachteile wurden hierbei beobachtet: die vollständig ein­tretende Racemisierung bei der unsymmetrischen Anhydridbildung (Ausnahme: TFA-L-Prolin) und eme anormale Rückbildung der Ausgangs-TFA-Aminosäure bei der Kupplung mit Aminosäurebenzylestern. In diesem Falle scheint als Ursache eine plötzlich ausgelöste Disproportionierung des gemischten in die beiden sym­metrischen Anhydride (XVII) maßgebend zu sein (449, 447, 450).

Versuche einer Peptidknupfung mit Hilfe der WIELAND-BOISSONNAS-VAUGHAN­schen Anhydndmethode waren unbefriedigend (450). Die aminolytische Aufspaltung eines TFA-Alamn-benzoesäureanhydrids durch Anilin z. B. verlief in beiden mög­lichen Richtungen; zudem erwies sich die Trennung der beiden Reaktionsprodukte (Benzanihd und TFA-Alanin-anilid) als undurchführbar.

Über die peptid-synthetische Verwendung symmetrischer TFA-Aminosäure­anhydride (s. S.536), der aus TFA-Aminosäuren und Aldehyden darstellbaren N-TFA-Oxazolidone (s. S.524).

Eine zusätzliche Darstellungsmethode für TFA-Aminosäuren be­schreiben neuerdings CALVIN und Mitarb. (358); als acylierendes Agens verwenden sie Trifluoressigsäure-thioäthylester (224) in wäßriger Lösung bei PR 8-9. Unter diesen Bedingungen gelingt es, u. a. Tyrosin, Tryptophan, Asparagin und Arginin glatt in ihre N,,-TFA-Verbindungen zu überführen. Als wichtig ist ferner die geglückte direkte w-Acylierung der freien Aminosäuren Lysin und Ornithin zu verzeichnen (vgl. auch S. 479).

e) Die "Lactam-Schutzgruppen".

Schon PLÖCHL (332) hatte eine rasche Lactam-cyclisierung bei o-Aminophenyl-glycin, THATE (4I2) bzw. ]ACOBS und HEIDELBERGER (249) eine solche von o-Aminophenoxy-essigsäure beobachtet, die neuer­dings HOLLEY und HOLLEY in einer Reihe von Arbeiten für den Auf- und Abbau von Peptiden verwertet haben (234, 235, 236). Als Aminoschutz­gruppen werden von diesen Autoren empfohlen:

IX) Der 2-Nitrophenoxy-acetyl-rest. (2-Nitrophenoxy)-acetyl-amino­säuren lassen sich nach der Azid- oder "Anhydrid"-methode mit Amino­säureestern umsetzen; nach Reduktion der o-Nitro- zur o-Amino-gruppe wird die cyclisierende Entacylierung durch Erwärmen mit Wasser auf IOOO unter Freiwerden des gewünschten Peptids erreicht.

R' 1. Azid· oder Anhydndmethode

CO-NHCHCOOH 2. VerseJfllng

Synthese von Peptiden.

o ~v '" R'

I. Reduktion I II 1Hz j' I -~---I CO-NHCHCO-NHCHCOOH 2. ""asser, 100°

~A NOs

R' R'

I I + HzNCHCO-NHCHCOOH

o ~V '" I

iI CHz

'I I I, co '\A /

NH R' = Aminosäure-Seitenkette.

ß) Der (2-Nitro-4-carbomethoxy-phenyl-)-glycyl-rest. Diese Gruppierung, die mittels 2-Nitro-4-carbomethoxy-phenyl nach SANGER eingeführt werden kann, dient praktisch jedoch nur dem systematischen Abbau von Peptiden.

NH

~V '" l I1 CHz R' R' I1 i I I / ~A CO-NHCHCO-NHCHCOOH

ROOC NOz

1. Redukhon

2. \Yasser, 100 ')

NH ~v '" R' R

1'

I I' CH 1-, 1 2 + HzNCHCO-NHCHCOOH

! li CO AA/

ROOC NH

R' = Aminosäure-Seitenkette. R = Methyl.

•

y) Der "Chloracetyl- (2-amino-Phenyl-)-glycyl-rest". Chloracetylpeptide, nach dem FISCHERschen Verfahren des öfteren hergestellt (S. S0l), lassen sich vom Chloracetylrest befreien, indem man sie mit o-Phenylen­diamin zum o-Aminophenyl-glycylpeptid umsetzt und durch anschließen­des Erhitzen mit Wasser die "Lactam-cyclisierung" auslöst:

R' R' 1 1

CICHzCO-NHCHCO-NHCHCOOH

0-Phenylendiamin 1 NH NH

~v '" Ov '" l :1 CHz R' R' Wasser I1 CHz , i 1 1 --...... I I + Peptid

~Ä CO-NHCHCO-NHCHCOOH 100· ,I", /CO

NH2 NH R' = Aminosäure-Seitenkette.

\\', GRASSMANN und E, \VÜNSCH:

f) Der "Phthalyl-rest".

Die Aufspaltung der Phthalamido-gruppierung mit Hydrazinhydrat zum freien Amin und Phthalhydrazid wurde bereits von RADENHAUSEN beobachtet (34I ) , später von ING und MANSKE (246) näher untersucht. Jedoch erst 1948 berichten KIDD und KING (267) über eine neue Methode der Synthese von Glutamylpeptiden unter Verwendung des Phthalyl­restes als leicht abspaltbare Schutzgruppe. Etwas später veröffentlichten SHEEHAN und FRANK (385) nachstehenden allgemeingültigen Weg der Peptiddarstellung :

A-co r J":-CO R'

! 11 ": ' "11 ": I 11 0 + H 2NCHCOOH --> I I N-CHCOOH -->

1 1I J I, J -co ' I, co ":J ~J-

J":-CO R' i' SOC12 I 11 ": H,NCHCOOR"

----> N-CHCOCl--oder PCl, I 'I, J

1 I' CO ~J-

f": R' R' (/ li-CO": I 1

i N-CHCO-NHCHCOOR" , , J ~, }-CO '<:::/

co JV ": R' R'

r. H.N-NH2,H20 -----+

2. HC1,N a,CO, oder Essigsaure

1 I' NH I 11 i + H 2NCHCO-NHCHCOOR" I!: NH "\A J

CO

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = H bzw. Na,

Nach diesem Schema haben SHEEHAN und FRANK (385) sowie GRASS­MANN und SCHULTE-UEBBING (202) einige Di- und Tripeptide in guter Ausbeute synthetisiert. In der Folgezeit haben KING, KIDD und Mit­arbeiter (272, 27I, 273), sowie SHEEHAN u. a. (384) zunächst die Dar­stellung der Ausgangs-phthalylaminosäuren unter Erhaltung der vollen optischen Aktivität geklärt [so auch SHEEHAN und Mitarb. (386 a)]. Die Vorteile der Phthalylmethode gegenüber den anderen liegen in:

1. hoher Kristallisationsneigung der Ausgangs- und Zwischenprodukte 2. glatter Entacylierung auch S-haltiger Verbindungen mittels Hydrazin hydrat; 3. besserer Beständigkeit und Handhabung der Phthalyl­aminosäurechloride ; 4. höchster Widerstandsfähigkeit gegenüber den zur Abspaltung der anderen Schutzgruppen gebräuchlichen Reagenzien (77).

Synthese von Peptiden.

Unter Verwendung des Carbobenzoxyhydrazid-rests als Carboxyl­maskierung wurde auch die CURTIussche Azidmethode zur Synthese von Phthalylpeptiden ermöglicht (23I). In guter Ausbeute haben solche Peptide ferner BorSSONNAS und Mitarb. (75, 369), WIELAND u. a. (466), sowie KING u. a. (269) nach dem Anhydridverfahren hergestellt. SCHUMANN und BorSSONNAS (369) berichten ferner über die geglückte Verseifung von Phthalyl-peptidestern zu den Phthalyl-peptiden mittels verdünnter Natronlauge; demgegenüber weisen SHEEHAN (384), sowie HANSON und ILLHARDT (2I6) auf eine erhebliche Alkaliempfindlichkeit des Phthalylrests hin. Besser bewährt sich nach SHEEHAN und Mitarb. (386 a) die Verseifung mit Aceton-Salzsäure. KING, KIDD und Mitarb. (268, 269) zeigen anderseits die Spaltung von Phthalylpeptidestern mit Hydrazinhydrat zu den entsprechenden freien Estern auf:

;f'- R' R' (/ "--11 co I ! "'N~CHCO~NHCHCOOR" 1I / ,~~/~CO

n-NaOH .j.---~~-

/'" R' R'

I I. H,N-NH" H,O 2. HCl -------.j.

R' R'

I I 1 I~CO I I

. I ~N-~HCO-NHCHCOOH H 2N CHCO-NHCHCOOR"

~rCO ,HCl

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Den Phthalylrest mittels Phenylhydrazin als weniger agressives Reagenz zu entfernen, wird neuerdings von SCHUMANN und BorSSONNAS (367, 368) empfohlen.

~"'~CO R' R'

I ~i "'N ~~HCO~NH~HCOOH I /

~/-CO

Pbenylhydrazin

R' = Aminosäure-Seitenkette.

R' R'

I H2NCHCO~NHCHCOOH

+ co

(V "'N-~ ~ i il ~H "'~_/ ~A /

co

g) Salze der Carbamid- und Dithiocarbamidsäure.

Die systematische Peptidsynthese mittels N-Carbonsäureanhydriden von Aminosäuren bzw. ihrer Dithio-analoga (33, I07) basiert auf einer Ver-

Fortschritte d. ehern. org. Naturst. XIII. 30

\\'. GRASSMA:-IN und E. \VUNSCH:

einigung von Aminoschutzgruppe und eines energiereichen Anhydrids in einem cyclischen System. Nach der ersten Stufe der Aminolyse sind, wie aus dem folgenden Schema ersichtlich, als iX-Aminoschutzgruppe die Ammonsalze der N-Carbonsäure (bzw. Dithio-analogon) mit tertiären Basen erkennbar, die bei der anschließenden Behandlung - Erwärmen auf Zimmertemperatur oder Umsatz mit alkoholischer Salzsäure -unter Freiwerden des Peptidesters zersetzt werden.

Erwarmen

-co,

R' H 2C-CO

! '"

R'

CH2CO -NHCHCOOR"

XH-COOH, X(R"')a R'

CH2CO-NHCHCOOR" + X(R"')a I I

NH2

R' I

CH2CO-NHCHCOOR"

1

I /s + H 2NCHCOOR"

HN-CS NH-CSSH, N(R"')a

R' HCl

HCl, H 2NCH 2CO-NHCHCOOR" + CS2 + (R"')aN,HCI

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Ester-alkyl. R'" = tert. Basen-alkyl.

h) Der Pyrrolidon-ring.

Eine bereits von der Natur vorgezeichnete Blockierungsmöglichkeit der iX-Aminogruppe ist der Glutaminsäure eigentümlich. Unter Wasser­abspaltung - die z. B. schon beim Kochen der wäßrigen Lösung vor sich

CH2CH2 COOH

1

CH-NH2 I

COOH

R' I

H,NCHCOOR"

CH2-CH2 ! 1

co CH-COOH "'/ ),fH

CH2 "iH2

Saurechlorid oder -azid

R' alkohol. Hel

CO CH-CO-NHCHCOOR"

"'/ NH

CH2CH2COOR"

1

CHCO-NHCHCOOR"

1 1

Hel, NH2 R'

R' = Ammosäure-Seltenkette. R" = Alkyl.

Synthese von Peptiden.

geht - tritt Lactam-Ringschluß zwischen x-Amino- und y-Carboxyl­gruppe ein; die Pyrrolidoncarbonsäure läßt sich nunmehr mittels der Säurechlorid-, -azid- oder dergleichen Methode leicht in einen Pyr­rolidonyl-aminosäure- bzw. -peptidester überführen (340). Anschließende Ringöffnung durch Behandeln mit alkoholischer Salzsäure in der Wärme ergibt den gewünschten x-Glutamyl-(-y-ester)-peptidester in Form des Hydrochlorids. BooTHE und Mitarb. (23) machen hiervon bei der Darstellung von x-Glutamylglutaminsäure-triäthyl-, und dem nächst höheren homologen -tetraäthylester Gebrauch.

Über Tosyl-pyrrolidoncarbonsäure vgl. S. 493.

j) Der p-Toluolsulfonyl-(" Tosyl" -)-rest.

Die Entdeckung FISCHERS (I48) , daß p-Tosyl-aminosäuren durch Reduktion mit Jodwasserstoff und Phosphoniumjodid das Ausgangs­produkt unverändert zurückgeben, machte sich SCHÖNHEIMER (362) zu­nutze. Er konnte zeigen, daß unter den Bedingungen der Entfernung des Tosylrests die Peptidbindung nicht angegriffen wird. Damit war eine geeignete Schutzgruppe für die Säurechlorid- und -azidmethode gefunden.

HacC6H4s02-NHCHCONa + HzNCHCOOR" I I

R' R' Verseifen

H aCC 6H 4 S02-NHCHCO-NHCHCOOR" I I

R' R'

H 2NCHCO-NHCHCOOH + H aCC6H 4SH I I

R' R'

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Du VIGNEAUD und BEHRENS (426) zeigten, daß sich der Tosyl-, analog dem Carbobenzoxy-rest, reduktiv mit Natrium in flüssigem Ammoniak abspalten läßt. Auf Grund dieser Tatsache sieht neuerdings die Toluol­sulfonyl-schutzgruppe einer erfolgreichen Verwendung entgegen (477, I30, 4°7, 262, 43I, 333), vor allem bei der Darstellung solcher Peptide, bei denen mehrere (zusätzliche) funktionelle Gruppen zeitlich verschieden geschützt werden sollen. Interessant ist eine Feststellung von HILLMANN (228), wonach Tosyl-glycyl-(TSG)-aminosäuren und -peptide beim Er­wärmen mit 4-5 n-alkoholischer Salzsäure unter Abspaltung des TSG­restes Aminosäure- bzw. Peptidester-hydrochloride in 6o--8o%iger Aus­beute ergeben. In der gleichen Arbeit wird auf die Nichtverwendbarkeit der "Anhydrid-methoden" bei N-Tosyl-aminosäuren hingewiesen, da der stärker acide Wasserstoff der Sulfonamid-gruppe zu Nebenreaktionen Anlaß gibt (228).

\V. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

k) Phosphatamide.

GOLDSCHMIDT und Mitarb. (I96, I94) konnten zeigen, daß sich substituierte Phosphatamide nur unter sehr energischen Bedingungen, z. B. in der Schmelze über 150°, der Umsetzung mit Carbonsäuren zum Säure amid unterwerfen lassen (vgl. S.529). ZERVAS (479 a) hat diese Reaktionsträgheit der substituierten Dialkyl-phosphorsäureamide als a-Aminoschutzgruppe ausgenutzt. N-Di-(p-nitrobenzyl)-phosphatamino­säuren (XVIII) z. B. lassen sich mit Hilfe der FISCHERschen Säurechlorid­methode mit Aminosäuren zu den substituierten Peptiden (XIX) kuppeln. Die Abspaltung des Phosphatrests gelingt durch katalytisch erregten Wasserstoff in Gegenwart von Wasserstoffionen, da die P-N-Bindung des zuerst erhaltenen Phosphorsäure-monoamids (XX) bei PR 4 sehr leicht hydrolysiert wird. R' R'

° I I -HCI (02NCsH4CH20)2-P-NHCHCOCl + H 2NCHCOOH ---->

(XVII!.)

R' R'

° i H,/Pd (02NCsH4CH20)2-P-NHCHCO-KHCHCOOH - .-->

(XIX.)

R' R' R' R'

o ! H+ (HO)2P-NHCHCO-NHCHCOOH --> H 2KCHCO-NHCHCOOH

(xx.) + H aP04

R' = Aminosäure-Seitenkette.

2. Die "A l1?yl-blockierung".

a) Mono- und Dibenzyl-aminosäuren.

Die Verwendung von N-Benzyl-DL-asparaginsäure (I69) zur Synthese von Asparagyl-peptiden beschreiben erstmals LIWSCHITZ und ZILKHA (292). Über ein gemischtes Anhydrid mit Chlorkohlensäure (XXI) einerseits bzw. ein daraus entstehendes "innermolekulares Anhydrid" (XXII) anderseits erfolgt Peptidknüpfung mit Aminosäureestern. Nach Verseifung läßt sich die N-Benzylgruppe mit PdC12-C-Katalysator bei 60-70° und geringem Druck hydrogenolytisch abspalten. Gemäß nach­stehendem Schema werden die Synthesen von a-Asparagyl-peptiden aus (XXI), der ß-Isomeren aus (XXII) beschrieben:

CH2-COOH

I CH-COOH

I NB-Bz

CH2-COOH CH2-COOH

I

cOC!, CH-CO-O-COCI H,NR CH-CO-NH-R

I I

KH-Bz NH-Bz

(xx!.)

I-co, ",-HCI

, I. \' ersclfung 12. H 2/Pd-C

iH2CO-NH-R

CH-COOH

I NH-Bz

lI. Verseifung 2. H,/Pd-C

CH2C O-);'HCHCOOH

CHCOOH R'

I NH2

Synthese von Peptiden.

);,H-Bz

(XXII.)

R'

CH2-COOH

I CHCO-NHCHCOOH

I R'

R = -CHCOOR". R' = Aminosäure-Seitenkette.

R'" = Alkyl. Bz = CSH 5CH2 •

Unabhängig von den letztgenannten Autoren haben VELLUZ und Mitarb. (422) die Verwendung des N-Benzyl- bzw. N,N-Dibenzylrests als iX-Aminoschutzgruppe mit Erfolg bearbeitet. N,N-Dibenzyl- bzw. N -Benzylaminosäuren * lassen sich mittels Phosphorpentachlorid in Benzol in die Säurechlorid-hydrochloride überführen, die schließlich mit Aminosäureestern in wäßrigem Dioxan bei PR 7-8 unter Bildung von Dibenzy 1-(Benzyl ) -peptide ster -hydrochloriden reagieren. [Dieser Reak­tionsverlauf entspricht praktisch der Blockierung der iX-Aminogruppe durch Salzbildung (S. 471); doch wird durch den zusätzlichen N-Benzyl­rest eine erhebliche Stabilität gegenüber den iX-Aminosäurechlorid-hydro­chloriden erreicht.] Die Verseifung zu den N-benzylierten Peptiden er­fordert allerdings Erhitzen mit 2o%iger methanolischer Kalilauge (vgl. dazu die alkalische Hydrolyse von N-Trityl-aminosäureestern, S.470). Dagegen gelingt die Abspaltung der Aminoschutzgruppe glatt und in hervorragender Ausbeute mit katalytisch erregtem Wasserstoff (Pd­schwarz) in Eisessig bei 80°. Bei N,N-Dibenzylaminosäuren war auch eine Peptidknüpfung mittels der WIELAND-BorsSONNAS-V AUGHANschen Anhydridmethode mit sehr gutem Erfolg möglich (422 b). Nach diesen beiden Verfahren haben VELLUZ und Mitarb. (422, 422 b) mehrere Di­und Tripeptide synthetisiert.

b) N-Trityl-aminosäuren.

Die Darstellung von Trityl-aminosäuren wird erstmals von HELFERICH (227), später von HILLMANN und Mitarb. (229) be-

* Diese werden zum Beispiel durch Umsetzung von Aminosäureestern mit Benzaldehyd bei Gegenwart von wasserfreiem Natriumsulfat, folgende Hy­drierung der SCHIFFschen Base und anschließende alkalische Verseifung der N-Alkyl­ester erhalten. Weitere Darstellungsmöglichkeiten für Benzylderivate vgl. (422), für N,N-Dibenzylaminosäuren ANATOL und Mitarb. (I7), VELLUZ und Mitarb. (422 a).

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\\'. GRASSMANN und E. \\'UNseR:

schrieben. Die Umsetzung von Tritylchlorid mit zwei Äquivalenten Aminosäureester in Benzol verläuft nahezu quantitativ, während die folgende alkalische Verseifung zu den freien Säuren nur teilweise befrie­digend ist.

(C6H5)aCCI + 2 H 2NCHCOOR"

I

R'

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Eine Vereinfachung der Trityl-aminosäureester-darstellung gibt neuer­dings ZERVAS (480) an; Aminosäureester-hydrochloride reagieren glatt mit Tritylchlorid in Gegenwart von Triäthylamin. Die Schwierigkeit der folgenden Verseifung nimmt, wie ZERVAS weiter zeigen konnte, vom Glycin- zum Phenylalanin-derivat enorm zu, mit steigender Peptidketten­länge dagegen ab. Für eine Hydrazidbildung gelten analoge Verhältnisse. ZERVAS umgeht diese Klippe durch direkte Tritylierung von Amino­säuren in Isopropanol-Wasser bei 20° in Gegenwart von Diäthylamin. Die Verwendung von Trityl-aminosäuren (XXIII) zur Peptidsynthese

R'

Trt-NHCHCOOH

(XXIII.)

______ +_PC_l, ___ r I

R' I

Trz-NHCHCO-O-COOR'"

(XXIV.) (XXV.)

1 _____________ , ~_______ J R I R

t I H,NCHCOOR" 1 H 2NCHCOOR"

Tri-NHCHCO-NHCHCOOR" R'

I

R' R' Tri-NHCHCOOH

+ R' I

(XXV!.) R"'OOC-::\HCHCOOR"

Tri = Trityl. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Esteralkyl der Aminosäure­Komponente. R'" = Esteralkyl der Kohlensäure.

Synthese von Peptiden. 47 1

gelingt nach ZERVAS (480) in guter Ausbeute über Tritylaminosäure­chlorid-hydrochloride (XXIV), die sich in indifferenten Lösungsmitteln mittels Phosphorpentachlorid herstellen lassen, sowie über die gemischten Kohlensäureanhydride (XXV) nach WIELAND-BoISSONNAS-VAUGHAN. ZERVAS konnte zeigen, daß die Umsetzung mit Aminosäureestern nach letzterem Verfahren wegen Hinderung durch den Tritylrest nur beim Glycinderivat erfolgreich ist [vgl. auch HILLMANN (229) J, während beim Phenylalanin-analogen Carbäthoxy-aminosäureester (XXVI) entstehen. Wiederum führt eine Verlängerung der Peptidkette (schon ab Trityl­dipeptid) eindeutig zur Bevorzugung der gewünschten Amidbildung.

Die Abspaltung des Tritylrests läßt sich unter schonenden Bedin­gungen durch Säuren sowie auch mittels katalytisch erregtem Wasserstoff leicht bewerkstelligen; für eine einwandfreie Synthese von Peptidthio-ester-hydro chloriden hat diese Möglichkeit große Bedeutung (229). .

c) Die "ScHlFFschen Basen".

Aus Arbeiten der BERGMANN-Schule (45, 53) sind seit langem Erd­alkali- bzw. Alkaloidsalze von Alkyliden- bzw. Aryliden-verbindungen der Aminosäuren bekannt. Erstmals haben WIELAND und Mitarb. (463) Kaliumsalze der Benzyliden-derivate rein hergestellt und diese auch zu Umsetzungen herangezogen, die in unmittelbarer Verwandtschaft zu Peptidknüpfungs-methoden stehen. Mit Chlorkohlensäureestern gelang die Bildung eines gemischten Anhydrids, das mit Thiophenol zum S-Phenylester weiterreagierte. Nach Ansäuern wurde sofort das Thio­ester-hydrochlorid erhalten.

-KCI C6H sCH=N-CH2COOK + CICOOR" -- C6H sCH=N--CH2COO-COOR" --

HSC.Hs HCI ---+ CsHsCH=N-CH2CO-S-CsHs --+ H 2NCH2CO-S-CsH s + CsHsCHO

,HCI

R" = Alkyl.

3. Die "Ammonsalzbildung".

Diese Salzbildung an der x-Aminogruppe ermöglicht die Umsetzung der von FISCHER (I39) I905 aufgefundenen Aminosäurechlorid-hydro­chloride mit einer freien "Aminokomponente" , z. B. mit einem Amino­säure- oder Peptide ster in indifferenten Lösungsmitteln, nicht jedoch mit Salzen von Aminosäuren in wäßriger Lösung. Im letzteren Falle würde als erstes die Blockierung der NHz- als NHa + -Gruppierung aufgehoben; auf der anderen Seite scheint die Zersetzungstendenz der Aminosäure­chloride in wäßrig-alkalischer Lösung doch auch so enorm zu sein, daß in diesem Falle eine systematische Säureamidbildung unmöglich wird.

Vgl. auch S. 469, über die Verwendung der Ammonsalze von N-Benzyl-, N,N­Dibenzyl- bzw. N -Trityl-aminosäurechloriden zur Peptidsynthese.

472 W. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

B. Die nachträgliche Einführung der iX-Aminogruppe.

I. iX-Halogen-acyl-verbindungen.

In Ermangelung von leicht wieder ab spaltbaren iX-Aminoschutz­gruppen hatten FISCHER und OTTO (I59) die Halogenfettsäuren in die Peptidsynthese einbezogen. Die im Enderfolg stets erhaltenen iX-Halogen­acyl-aminosäuren bzw. -peptide tauschen beim Behandeln mit konz. Ammoniak ihr Halogen gegen die Aminogruppe aus, geben also die gewünschten Peptide.

Leider ist dieser Austauschvorgang von Nebenreaktionen in mehr oder weniger umfassendem Maße begleitet. Neben den iX-Amino- können sich disubstituierte Imino-, iX-Oxy- und (unter Halogenwasserstoff-abspaltung) iX,ß-Dehydroderivate bilden, die stets, und das ist das besonders Unerfreuliche, ninhydrin-negative Sub­stanzen darstellen, so daß ihre Anwesenheit durch die lange Zeit üblichen chromato­graphischen Untersuchungsmethoden nicht festgestellt werden konnte. So berichtet u. a. bereits die FISCHERsche Schule über "Ausnahmefälle" bei der Aminierung von iX-D-Brom-isocapronyl-L-prolin (I6o) und -N-phenylglycin (IS4) bzw. iX-Brom-ß­phenylpropionyl-glycin (ISO), wobei iX-Oxyacyl-aminosäureamide bzw. bei letzterem ein Zimtsäurederivat entstanden. Der Heranziehung von flüssigem an Stelle von wäßrigem Ammoniak zur Aminierung durfte zur Vermeidung einer Hydrolyse und zur Unterdrückung der Bildung von sekundären Aminen der Vorzug zu geben sein. (Bezuglich der Herstellung optisch-aktiver Peptide vgl. S.501.)

2. iX-Azido-acyl-verbindungen.

Die Verwendung von iX-Azido- an Stelle der iX-Halogenfettsäuren (395, I73, 69) ist vom präparativen Standpunkt weitaus günstiger, da durch katalytische Hydrierung die Überführung in die iX-Aminogruppe glatt gelingt. Die soeben genannten Nebenprodukte scheiden hier aus.

R' R' i

N 3CHCO-);"HCHCOOH

H,/Pd ------+

-N,

R' R'

I

H 2XCHCO-NHCHCOOH

R' = Aminosäure-Seltenkette.

Wegen der umständlichen Herstellung der iX-Azido- aus den entsprechenden iX-Halogen-verbindungen blieb diese Methode bislang auf die Synthese von Amino­säuren beschränkt; nur vereinzelt findet sie Eingang in peptid synthetische Arbeiten (239). Neuerdings berichtet eine amerikanische Arbeitsgruppe (3IS) über die Dar­stellung von O-Glycyl-serin aus O-Azidoacetyl-serin.

3. iX-Keto-acyl-verbindungen.

Fußend auf der Aminosäuresynthese von HARTUNG (222) haben SHEMIN und HERBST (39I) iX-Keto-acyl-aminosäuren in Form ihrer Oxime durch katalytische Hydrierung in freie Peptide übergeführt :

Synthese von Peptiden. 473

R' -C-CO-NHCHCOOH H./Pd

11 I

H 2NCHCO-NHCHCOOH

I ! NOH R' R' R'

R' = Aminosäure-Seitenkette.

HARTUNG und Mitarb. (438, 439) schlagen einen etwas anderen Weg ein. Die von ihnen bevorzugten iX-(O-Benzyl-oximino)-acyl-derivate (XXVII) lassen sich gleichfalls katalytisch hydrieren, wobei jedoch die Gegenwart von Wasserstoffionen hauptsächlich zur Bildung von Diketo­piperazinen (XXVIII) neben nur sehr wenig Peptid (XXIX) Anlaß gibt. Die Ausführung der Hydrierung in ammoniakalischem Medium hin­gegen (223) liefert das gewünschte freie Peptid (XXIX).

R' -C= NO-CH2C6H 5

I CO-NHCHCOOH

I R'

(XXVII.)

H2/Pd-C ~-- -li(j--) ---

R'-CH-NH-CO H 2NCHCO-NHCHCOOH

I I I I CO-NH-CH-R' R' R'

(XXVII!.) (XXIX.)

R' = Aminosäure-Seitenkette.

4. iX,ß-Ungesättigte Acyl-verbindungen.

FISCHER und KOENIGS (IS6) gelang die Synthese von iX- bzw. ß-Aspara­gyl-peptiden, als sie den aus Fumarsäurechlorid und Glycinester erhaltenen Fumaryl-bis-glycinester nach Verseifung mit konz. Ammoniak bei IOO O

behandelten. Über eine durchsichtigere Synthese gleicher Art berichten

CH-CO

I1 "-I /0 + H2NiHCOOR" -

CH-CO R'

CH-CO-NHCHCOOR"

11 I

CH-COOH R'

(XXX.)

R' I

CH2CO-NHCHCOOR" I I. Verseifung CH-COOH ---+. (XXXI.)

2. Hz/Pd

NH-CH2C6H.

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

474 \V. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

neuerdings LIWSCHITZ und ZILKHA (292). Maleinsäureanhydrid setzt sich mit Aminosäureestern zu einem Fumarsäure-halbamid (XXX) um; aus diesem wird durch Anlagerung von Benzylamin, anschließende Verseifung und.Abhydrierung des N-Benzylrestes ein Peptid der DL-Asparaginsäure (XXXI) erhalten.

C. Leicht abspaltbare iX-Carbonsäure-Schutzgruppen.

I. Ester und Alkalisalze.

Das Problem eines Schutzes der Carboxylgruppe im engeren Sinn, also ihre Blockierung zu dem Zwecke, sie einer unerwünschten Reaktion zu entziehen, tritt sichtbar nur in Erscheinung bei der Synthese von Peptiden der Aminodicarbonsäuren. In den Halbestern dieser Säuren, die auf verschiedenem Wege herstellbar sind (vgl. SS. 491,526), kann die freie Carboxylgruppe durch Umsetzung mit Isocyanat oder Phosphorazo­aminosäureestern oder durch Umwandlung in das Säurechlorid und fol­gende Kupplung zum Peptid verknüpft werden, während die veresterte Carboxylgruppe sich nicht an der Reaktion beteiligt. Umgekehrt ist die veresterte Carboxylgruppe auf dem Wege über Hydrazid und Azid oder, falls es sich um Ester genügend hoher Reaktionsfähigkeit handelt, auch direkt der Peptidverknüpfung zugänglich, während die freie Carboxyl­gruppe an diesen Reaktionen nicht teilnimmt. Gerade das Beispiel der Veresterung macht aber die in Kap. I erwähnte doppelte Funktion solcher "Schutzgruppen" besonders deutlich. Denn die wesentliche und all­gemeine Bedeutung der Veresterung - insbesondere der iX-Carboxyl­gruppe - für die Peptidsynthese liegt in der Rückwirkung, die sie auf die Reaktionsfähigkeit der Aminogruppe ausübt. Erst nach der Aufhebung der Zwitterionenform durch die Veresterung der Carboxylgruppe ist die freie Aminogruppe für die nucleophile Addition verfügbar.

Die Verwendung der Aminosäureester zur Peptiddarstellung geht daher auf die Anfänge der synthetischen Arbeiten auf diesem Gebiet zurück.

Als Herstellungsvariationen für die Gewmnung der Ester-hydrochloride der Aminosäuren und der Peptide. aus denen die freien Ester nach verschiedenen lange bekannten Verfahren gewonnen werden können. seien die Veresterung mit HCI­Alkohol (409) oder mit Thionylchlorid-Alkohol (86) bzw. der Umweg über Carbobenz­oxy-aminosäureester [Veresterung der N-acylierten Säuren mit Diazoalkanen oder mit HCI-Alkohol (204)J oder über die N-Trityl-aminosäureester-hydrochloride (480) mit folgender Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe oder schließlich die Ring­öffnung von N-Carbonsäureanhydriden mit alkoholischer HCI (65. 82) angeführt. Über Nebenreaktionen bei der Veresterung von Peptiden. insbesondere von solchen der Oxyaminosäuren. vgl. (242).

Die mit der Aufhebung der Zwitterionen struktur verbundene erhöhte Reaktionsbereitschaft der Aminogruppe ist, mindestens in gewissem Grade. allerdings auch bei den Alkalisalzen der Aminosäuren gegeben und

Synthese von Peptiden. 475

man kann daher diese ebenso wie die freien Aminosäure- bzw. Peptidester mit den verschiedensten reaktionsfähigen Derivaten acylierter Amino­säuren, z. B. den FISCHERschen Acylaminosäurechloriden, den Phosphor-, Schwefelsäure-, Alkylkohlensäureanhydriden, Thiophenylestern usw. unter Peptidknüpfung im wäßrigen Medium zur Umsetzung bringen. Dabei haben aber doch die Ester die größeren Vorzüge. Erlauben doch die Acylpeptidester (XXXII) stets eine saubere Abtrennung von den Ausgangsmaterialien auf Grund ihres neutralen Charakters in Verbindung mit der Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, speziell Essigester.

R'

CH-CO-X

NH-Ac

R' I

H,NCHCOOR" -----.....

R' R' I

Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + HX

(XXXI!.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. RU = Alkyl. Ac = Acyl. X = Anhydrid-komponente.

Vorsichtige Verseifung der reinen Acylpeptidester (XXXII) liefert das Acylpeptid, das nach Abspaltung der Aminoschutzgruppe das ge­suchte Peptid in hervorragender Reinheit ergibt.

Da in letzter Zeit festgestellt wurde, daß bestimmte End-aminosäure­ester in Peptiden sich schwer (vor allem alkalisch) verseifen lassen (beson­ders die höheren Acyl-peptidester), und daß bei einem Überschuß an Alkali die Gefahr eines Angriffs an der iX-Aminoschutzgruppe (speziell dem meistbenutzten Carbobenzoxyrest) gegeben ist (359, 207), geht man in steigendem Maße zu Peptidsynthesen mit Hilfe von Benzylestern über (65, 2°7, 2I8, 397, 2I5, I65, 82, 84, 359, 352 , 437, 354, 4I9)· Diese durch katalytische Hydrierung, aber auch mittels Natrium in flüssigem Ammoniak (346) leicht spaltbaren Ester sind teilweise durch die übliche Veresterung mit HCl-Benzylalkohol schon von ABDERHALDEN und SUZUKI (II) erhalten worden [so auch SACHS und BRAND (353), DU VIGNEAUD und Mitarb. (345) J; weiters wurden dieselben bereitet: von FISCHER (I4I) aus Aminosäurechlorid-hydrochloriden, von MILLER und WAELSCH (304) bzw. ERLANGER und HALL (I29) unter Verwendung von Benzolsulfo- bzw. Polyphosphorsäure als Veresterungsmittel, von BRAND und Mitarb. (I27) durch Alkoholyse von N-Carbonsäure­anhydriden bei HCl-Gegenwart und schließlich von BEN-IsHAI und BERGER (40) auf dem Weg Carbobenzoxy-aminosäure, -benzylester [so auch BAER und MAURUKAS (JI)J, Aminosäure-benzylester-hydro­bromid. iX- bzw. y-Benzylester acylierter Glutaminsäure lassen sich über deren inneres Anhydrid (66, 337) oder durch partielle Verseifung der entsprechenden Di-benzylester (2I5) gewinnen; das gleiche gilt für die Benzylester der N-Acyl-asparaginsäure (I65). Für die direkte Darstellung des freien Glutaminsäure-iX- bzw. -y-benzylesters aus der Aminosäure

W. GRASSMANN und E. \VÜNSCH:

sind lediglich die von SACHS und BRAND (352), HANBY und :YIitarb. (2I 5), sowie BLOuT und KARLSON (73 a) beschriebenen Methoden brauchbar.

2. N'-Phenylhydrazide.

Im Zusammenhang mit enzymatischen Peptidsynthesen aus Carbo­benzoxy-aminosäuren und N-Aminoacyl-N'-phenylhydrazid konnten WALDSCHMIDT-LEITZ und KÜHN (434) zeigen, daß das nach Entfernen des Carbobenzoxy-rests erhaltene N-Dipeptidyl-N'-phenylhydrazid (XXXIII) durch Erwärmen mit Cuprisalzlösung unter Regenerierung der Carboxylgruppe zum Peptid gespalten werden kann.

H J I EIsessIg

(XXXIII.)

Hj,H2NCH2co--NHCH2co-NHNH-CaH5

'-HJ t Cupnacetat, 95 0

H 2NCH2CO-NHCH2COOH

Cbo = Carbobenzoxy.

,\Is Varianten sollen sich auch Mono- und Dinitrophenylhydrazide verwenden lassen (434).

3. N' -Carbobenzoxy-hydrazide.

Diese erstmals von HOFMANN und Mitarb. (23I) eingeführte Carboxyl-schutzgruppe ist nur für die Darstellung von Acylpeptid­hydraziden und N-Peptidyl-N'-carbobenzoxy-hydraziden brauchbar, nicht aber für die Darstellung freier Peptide, da es nicht gelingt, den Hydrazid­rest ohne Gefährdung der Peptidbindung abzubspalten. Doch wird die Heranziehung dieser Zwischenprodukte für die Synthese höherer Peptide sicher nicht erfolglos sein. Die Synthese von N-Aminoacyl­N'-carbobenzoxy-hydraziden (XXXIV) gelingt über die Mercapto-

R'

CH

/'" R'

HN CO + H 2NNH-Cbo H 2NCHCO-NHNH-Cbo

(XXXIV.) I '

Sc--s

!\-CO ~' "I '" • I., N-CHCOCI

j'

CO R' H,NNH-Cbo ,1",/ '",,- I

) I I: N-CHCO-NHNH-Cbo

~/'" / -HCl

co l !! / ",,)-CO

(XXXV.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. Cbo = Carbobenzoxy.

Synthese von Peptiden. 477

thiazolone, von N-Phthalylaminoacyl-derivaten (XXXV) aus Phthalyl­aminosäurechloriden .

Die Variationsmöglichkeiten bei der Verwendung gerade dieser Derivate (XXXV) sind leicht abzusehen, wenn man bedenkt, daß sowohl der Phthalyl- wie der Carbobenzoxyrest selektiv ab spaltbar sind (For.mel­übersicht 2).

R' I

PhthN-CHCO-NHNH-Cbo

R' I

H 2NCHCO-NHNH-Cbo

R' I

PhthNCHCON,

R' R' I I

(XXXV.)

I I

Phth~CHCO-NHCHCO-NHNH-Cbo

R'

1. H,/Pd 2. HNO, 3. H,NCHCOOBz

R'

I

I R'

R' I

PhthXCHCO-NHCHCO-NHCHCOOBz

1 H,/Pd

R' R' R' I I I

Phth~CHCO-NHCHCO-NHCHCOOH

1 H,NNH"H,O

R' R' R'

H 2XCHCO-NHCHCO-NHCHCOOH

H./Pd ---I

R' I

PhthN-CHCO-NHNH2

I 1. HNO,

1 2 • H.N1HCOOBZ

.f R'

R' R' I I

PhthNCHCO-NHCHCOOBz

H,/Pd

R' R' f

PhthNCHCO-NHCHCOOH I 1 H.NNH,.H,O

R' R' I

H 2NCHCO-NHCHCOOH

R' = Aminosäure-Seitenkette. Bz = Benzyl. Cbo = Carbobenzoxy. Phth = Phthalyl.

Formelübersteht 2.

D. "Mehrfunktionelle" Aminosäuren und ihre Einbeziehung in die Synthese.

I. Die w-Aminogruppe.

Diese zusätzliche funktionelle Gruppe der Diaminosäuren - vor allem des Lysins und Ornithins - ist leicht und einwandfrei durch Über-

~w. GRASSMANN und E. \VÜNSCH:

führung in w-Acylamide zu blockieren, wobei als leicht abspaltbare Reste hauptsächlich Carbobenzoxy bzw. Tosyl gewählt wurden. Während die Verwendung von iX,W-Di-acyl-diaminosäuren als "Kopf" -Aminosäuren bei den Synthesen von Peptiden denen der Monoaminosäuren völlig analog ist, müssen dort, wo es gilt, Lysin, Ornithin und dgl. als mittel­bzw. endständig einzuführen, die Mono-w-acylderivate bzw. deren Ester als Ausgangssubstanzen zur Verfügung stehen. Hierfür wurden bislang die drei Wege a) bis c) eingeschlagen.

a) Na, w-Dicarbobenzoxy-verbindungen (XXXVI) werden mittels PCls oder PBr3 in die Säurehalogenide übergeführt, die beim Erwärmen in indifferenten Lösungsmitteln unter Abspaltung von Benzylhalogenid

HN-COOCH2CoH s

i (CH 2 )n

/C~ PCls, 50°

HN COOH -C,H,CH.Cl

I CO I

OCH2CoH s

(XXXV!.)

HN-COOCH2CaH s I

(CH 2)n

I CH

/'" H 2N COOH

(XXXVIII.)

r n-HCl

HN-COOCH2CoH s I

(CH 2)n I alkohol.

CH

/'" HCl

HN CO

HX-COOCH2CoH s I ,

CH

/'" I I CIH, H2~ COOR"

OC-----O

lXXXVII )

R" = Alkyl.

(XXXIX.)

in die N,,-Carbonsäureanhydride (XXXVII) (vgl. S.5I5) der Nw-Acyl­aminosäuren übergehen. Die Aufspaltung mit wäßriger HCl führt zu den freien Nw-Carbobenzoxy-diaminosäuren (XXXVIII), mit alkoholischer HCl zu den entsprechenden Esterhydrochloriden (XXXIX). Nach erst­mals von BERGMANN und Mitarb. (65) für s-Carbobenzoxy-lysin und das zugehörige Methylester-hydrochlorid gegebenen Vorschriften [vgl. auch BRAND und Mitarb (82); WALEY und WATSON (437) ] wurden später auch die entsprechenden Ornithin-derivate synthetisiert (4°9, 26I).

b) Kupfer-Komplexsalze (XL) des Lysins und Ornithins sind lange bekannt. KURTz (279) hat darauf eine Isolierungsmethode für die erstere Aminosäure begründet, indem er den Kupfer-komplex in schwach alkalischem Medium mit Benzoylchlorid zum s-Benzoyl-lysin-kupfer kuppelte. NEUBERGER und SA~GER (3I3) haben erstmals s-Carbobenz-

Synthese von Peptiden. 479

oxy-lysin-kupfer bzw. durch Zerlegen mit Schwefelwasserstoff die freie e-Acyl-verbindung hergestellt [vgl. SCHLÖGL und FABITSCHOWITZ (359)J.

NH2 HN-CO-R

I I (CH2)n (CH 2)n I R-COCl I H 2S

CH ------* CH

/"" NaOH / ""

(XXXVII!.)

HaN co H 2Y co

I I 1/2Cu--O 1/2CU--O

(XL.)

R = Acyl-Seitenkette.

SYNGE (409) sowie HARRIS und WORK (22I) synthetisierten nach diesem Verfahren <5-Carbobenzoxy-L-ornithin; BRAND und Mitarb. (I30) <5-Tosyl-L-ornithin, und STEVENS und WATANABE (404) e-Carballyl­oxy-L-Iysin. Damit zeigt sich eine allgemeine Anwendbarkeit im Gegen­satz zu Weg a), der auf Carboalkoxy-verbindungen beschränkt ist. Nach SYNGE (409) gelingt die Veresterung von w-Carbobenzoxy-aminosäuren glatt mit alkoholischer HCI bei Zimmertemperatur.

c) Als dritten und neuesten Weg empfehlen SCHALLENBERG und CALVIN (358) die Umsetzung von freiem Lysin bzw. Ornithin mit Tri­fluoressigsäure-thioestern (~LI) zum w-Acyl-derivat (XLII).

rÄqu.NaOH ------+

CH-COO(-) cF,COS2C2H,

I (XLI.)

(+)~H 3

NH-COCF3

I (CH 2)4

I

~H-COO(-) + HSC 2Hs + NaCl

I (+)NH3

(XLII.)

2. Die w-Guanidogruppe.

Der natürliche Vertreter ist das Arginin, dessen Einbeziehung in die Peptidsynthese ein sehr wichtiges, aber schwieriges Problem darstellt.

a) Die einzige bislang brauchbare Blockierungsmöglichkeit der w-Guanidogruppe ist durch ihre Nitrierung gegeben. Nw-Nitroarginin wurde erstmals von KOSSEL und KENNAWAY (276) synthetisiert; BERG­MANN und Mitarb. (64) haben später gezeigt, daß diese N02-Gruppe durch katalytische Hydrierung ohne Veränderung des Arginin-moleküls abgespalten werden kann [vgl. auch VAN ORDEN und SMITH (320)]. Doch brachte die Verwendung dieser Substanz zur Synthese von Arginin­peptiden nur teilweise Erfolg (Einsatz als End-aminosäure), da die Her-

----- ~--- ----~--- ._-

\i\'. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

stellung des Säurechlorids bzw. -hydrazids von N,,-Carbobenzoxy-Nw-

nitroarginin - wie später auch die von w-acylierten Argininderivaten (I88) - mißlang. Mit Heranziehung der "gemischten Anhydride" der Alkyl-kohlensäure konnte in der Folge diese Schwierigkeit überwunden werden (232, 232a, 320) (Formelübersicht3).

I. Carbobenzoxylierung 2. CICOOR" -i- N(R'''I,

3. H 2NCHCOOR" I

R'

H 2K-CH-COOH

R' I

I I. Veresterung I 2. Cbo-NHCHCOCl

I R'

l'iH-N02

I C=NH

I

Cbo-NHCHCO-:t-;HCHCOOR"

1 I. Verseifung

2. H2/Pd

NH2

I C=i",,'H

I NH

I

~H-~02

! C=~H

I NB I

(CH 2)a I

R' I

Cbo-NHCHCO-:t-;HCHCOOR"

NH2

I C=NH I

NH

I

I I. Verseifung , 2. H./Pd

R'

I

H 2NCHCO-NHCHCOOH

R' (CH2la i I R' = Aminosäure-Seitenkette.

H 2NCHCO-NHCHCOOH Rn = Alkyl. R'" = tert. Basen-alkyl.

Formelubersicht 3.

b) Arginin mit völlig ungeschützter Guanido-gruppe wurde bereits von BERGMANN (48, 68) als "End"-aminosäure-komponente zum Umsatz mit "Azlactonen" herangezogen, wobei allerdings im allgemeinen Diastereomere auftreten. Neuerdings veröffentlichen GISH und CARPENTER (I87, I88) , sowie ANDERSON (I8) Synthesen von Arginylpeptiden: N,,-carbobenzoxylierte Argininderivate wurden nach der Säurechlorid­bzw. der Pyrophosphit-methode mit Aminosäureestern gekuppelt.

Synthese von Peptiden.

c) Als dritter Weg kann der nachträgliche Aufbau der w-Guanido­gruppe bei N",-acylierten, aber Nw-freien Ornithin-peptiden gegangen werden; ihm liegen langbekannte Reaktionen der Aminogruppe mit Cyanamid (38, 366), Guanidin (342), am günstigsten aber mit S-Methyl­isothioharnstoff bzw. O-Methyl-isoharnstoff (252, 2IO, 370, 4I4) zugrunde.

NH2 , HX 1

(CH2)3

1

Ac-NHCHCOOH

"fNH

HaCO-C"

NH. --~

-CH.OH

NH 11

Ac-NHCHCOOH

Ac = Acyl. X = Cl, N03 und dergleichen.

3. Die heterocyclischen Ringsysteme.

a) Imidazole.

Die Einbeziehung des Histidins in die Synthese von Peptiden der Zusammensetzung "X-His" bot keine Schwierigkeiten; mit Hilfe der Säurechlorid- bzw. -azidmethode konnten schon von FISCHER und CONE (I5I), von ABDERHALDEN und GOHDES (5) und vor allem von DUVIGNEAUD und seiner Schule (243, 244, 428, 393) zahlreiche Peptide erhalten werden. Von einigen unwesentlichen Versuchen abgesehen (8, I63, 55), blieb jedoch die Darstellung von Peptiden der Formel "His-X" unbearbeitet, obgleich DUVIGNEAUD und BEHRENs (426) mit der Darstellung von N(Im)­Benzyl-histidin (XLIII) durch Umsetzung von Histidin mit Natrium in flüssigem Ammoniak + Benzylchlorid eine reversible Maskierungs­möglichkeit der NH-Imidazol-gruppierung aufgezeigt hatten. Diese wird neuerdings von KATCHALSKI und PATCHORNIK (258) für die einwandfreie Darstellung von Poly-histidin (XL V) über das N (Im)-Benzylhistidin­N-carbonsäureanhydrid (XLIV) herangezogen [vgl. auch OVERELL und PETROW (32I) ] :

CH=CH-CH2CHCOOH IH~ ?H-CH2CHCOOH 1 1

N NH ~/

CH

Na/NHa C.H,CH,CI

---------> N N NH2

~/'" CH CH2

CaHs (XLIII.)

CH=CH-CH -CH-CO I. Carbobenzoxyl. 2. pels, 50° 1 1 2 I ""

HCI,:N N /0 ~ / '" NH-CO CH CH2

Fortschritte d. Chem. org. Naturst. XIII. 31

\V. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

. CH CH-CH2CHCO- ..

I

Base N X NH-- .. ''\ / '\

Na/NH3 (XLV.)

-co, CH CH2

Erst 1954 gelang HOLLEY und SONDHEIMER (236) und etwas später R. F. FISCHER und WHETSTONE (I64) die Isolierung von Carbobenzoxy­histidin-azid aus carbonat-alkalischer Lösung und damit der Einsatz des Histidins als "Kopf" -aminosäure. Mit dem N (Im)-Trityl-histidin-methyl­ester-hydrochlorid hat ZERVAS (479,480) in letzter Zeit ein weiteres, zur eindeutigen Peptidsynthese brauchbares Imidazolring-geschütztes Histi­dinderivat geschaffen.

b) Indole.

Die Synthese von Peptiden des ß-Indolyl-alanins (Tryptophan) wurde, von einer Veröffentlichung der ABDERHALDENschen Schule (6) abgesehen, erst in neuerer Zeit mit Arbeiten von FRUTON (I77) und SMITH (396) be­gonnen; sie gelang mit Hilfe der Säurechloridmethode unter Verwendung der Carbobenzoxy-schutzgruppe. Weitere wichtige Erkenntnisse stammen von KATcHALsKI u. a. (324) mit der Darstellung bzw. Polymerisation von Tryptophan-N-carbonsäureanhydrid, sowie von V AUGHAN und EICHLER (4I 9) , denen die Synthese von Tryptophan-peptiden mittels der "An­hydridmethode" gelang. In keinem Falle wurden durch das Indolring­system bedingte Nebenreaktionen beobachtet [vgl. auch WIELAND und HÖRLEIN (460)J.

4. Die alkoholische Hydroxylgruppe.

Die Zahl der aliphatischen Oxy-aminosäuren ist stetig angewachsen; neben dem biologisch wichtigen Serin, Threonin, Oxyprolin und Oxylysin konnten weitere dieser trifunktionellen Aminosäuren als spezifische Bau­steine gewisser Eiweißkörper bzw. von Alkaloiden aufgefunden werden. Die Synthese von Oxyaminosäure-peptiden blieb ähnlich der Histidin­analoga neben einigen unwesentlichen Versuchen über die Diketopiper­azine (I45, 49, 3) praktisch den letzten 15 Jahren vorbehalten; 1942 konnten FRuToN (I76) und später SMITH und BERGMANN (397) zeigen, daß auch Carbobenzoxy-serin bzw. -oxyprolin in ihre Azide überführbar sind. Diese kuppeln mit Aminosäureestern zu den entsprechenden Carbobenzoxy-peptidestern (XLVI), sofern durch Einhaltung niedriger Temperaturen jegliche Nebenreaktionen als Resultat einer voraus­gehenden Umlagerung zum Isocyanat (XLVII) weitgehend zurück­gedrängt werden. Nach diesem Verfahren sind in der Folgezeit eine

Synthese von Peptiden.

Anzahl Serin- (477, 220, 4°5, I64, 30, I4, 230 a) bzw. Oxyprolin-peptide (3I4) mit guten Ausbeuten synthetisiert worden:

CH20H 250

I

Cbo-NHCHCONs

R' 4 0 I I

-I H.NCHCOOR"

CH20H R'

I Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR"

(XLV!.)

[ CH20H 1

Cbo-NH~H-N = C=O

(XLVII.)

CH2--O

I ~CO Cbo-NHCH-NH

R' = Aminosäure-Seitenkette. Rn = Alkyl.

Neuerdings berichten WIELAND und Mitarb. (462), sowie SCHWYZER (37I) über die Synthese von substituierten Oxysäure-amiden, wobei sie die gemischten Anhydride der Oxysäure mit Alkylkohlensäure her­stellten und im gewünschten Sinne aminolytisch umsetzten. Die über­tragung dieser Methodik auf N-acylierte Oxyaminosäuren wurde von GRASSMANN und WÜNSCH (204) bei der Darstellung von Oxyprolyl-glycin mit ausgezeichnetem Erfolg angewandt.

Die Darstellung von Serinpeptiden der Formel "X-Ser" nach dem FISCHERschen Säurechlorid-verfahren beschreiben in letzter Zeit BOT­WINIK und Mitarb. (79, 80); z. B. kuppelt Phthalyl-(oder Tosyl)-glycyl­chlorid mit Serinester in Dioxan in Gegenwart von Diäthylanilin zum N-Phthalyl-glycylserinester (80), während der Einsatz von zwei Äqui­valenten Säurechlorid zum N,O-Bis-acylderivat führt.

Eine Möglichkeit der Maskierung aliphatischer Hydroxylgruppen bietet die Veresterung zu O-acylierten Oxyaminosäuren (44, 50, 408, 356). Doch haben bislang nur FRANKEL und HALMANN (I67) , sowie SHEEHAN und Mitarb. (386 a) bei der Synthese von Poly-O-acetyl- und Poly-O­carbobenzoxy-serin bzw. N-Phthalyl-O-acetyl-serylpeptiden hiervon Ge­brauch gemacht.

Als eine zweite Möglichkeit diskutiert· FRuToN (I75) die Verwendung von O-Benzyläthern. GRASSMANN und WÜNSCH (205) haben diesen Vor­schlag aufgegriffen und die peptid-synthetische Verwendung von O-Benzyl-serin erprobt. Der Benzyläther ist leicht und rasch durch katalytische Hydrierung in Serin und Toluol spaltbar:

CH20-CH2C6H5

I R-NHCHCOORn

H./Pd CH20H I

R-NHCHCOORn + CeH.CHs

R = H oder Acyl. Rn = H oder Alkyl.

\Y. GRASSMANN und E. \YUNSCH:

Nach 'WOODS und KRAI\IER (475), sowie PARHA:\1 und A~DERSON (323) addiert sich Dihydropyran (XL VIII) leicht an alkoholische H ydroxyl­gruppen; die entstandenen alkalibeständigen Acetale können mit Säuren unter Regenerierung des Alkohols wieder gespalten werden. SCHWYZER und Mitarb. (248) haben daraus eine zusätzliche O-Blockierung der aliphatischen bzw. aromatischen Oxyaminosäuren abgeleitet, indem sie N-Carbobenzoxy-oxyaminosäureester (XLIX) mit Dihydropyran zum Acetal (L) umsetzen. Nach alkalischer Verseifung der Estergruppe wird die N,O-blockierte Oxyaminosäure (LI) z. B. in der Form des aktivierten Esters (s .S. 495) mit Aminosäureestern zum Peptidderivat (LII) ge­kuppelt. Ein kleiner Nachteil liegt in der Isolierung und weiteren Um­setzung von (LI), da die Säure wegen des Auftretens eines zusätzlichen asymmetrischen C-Atoms am Tetrahydropyranring als Isomerengemisch vorliegt.

CHpH I

Cbo-NHCHCOOR" + A

I ,,/

o

CH2-0~() o

Cbo-NHCHCOOR"

n-NaOH

(XLIX.) (XLVIII.) (L.)

A CH-OJ /1

2 " I 0 Cbo-NHCHCOOH

(LL)

C1CH2CN tert. Amin

-_ .. _-->-

H 2NCHCOOR" I

R'

A

CH2-0-l) I 0

Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR"

(LII.) R'

Cbo = Carbobenzoxy. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Je nach \Vunsch kann das Dipeptid-derivat (LII) durch selektive Abspaltung der drei Schutzgruppen als Ausgangsmaterial für weitere Umsetzungen zu höheren Peptiden dienen.

Ein natürliches Esterpeptid des Serins liegt im Antibioticum "Aza­serin" vor (I82). Auf Grund neuerer Ergebnisse kann ferner auch mit der Existenz von "O-Serinpeptiden" bei natürlichen Eiweißkörpern ge­rechnet werden (I99). Die Synthese dieser Verbindungsklasse wurde bereits in Angriff genommen (3°9, 3I5).

5. Die phenolische Hydroxylgruppe.

Von den in der Natur vorkommenden Aminosäuren dieser Klasse (Tyrosin, 3 A-Dioxyphenylalanin , Jodgorgosäure und Thyroxin) sind Peptide des Tyrosins schon seit längerer Zeit Gegenstand synthetischer Arbeiten. Wie Histidin und die aliphatischen Oxy-aminosäuren läßt sich auch das Tyrosin mit ungeschützter phenolischer Hydroxylgruppe als carboxyl-endständige Komponente (Natriumsalz bzw. Ester) mit tX-Ha-

Synthese von Peptiden.

logenacyl-halogeniden (I47) , mit Carbobenzoxy-aminosäurechloriden (g, I), -aziden (I64) bzw. -anhydriden (67, 420) glatt zur Vorstufe des ge­wünschten Peptids kuppeln. Auch die Umsetzung von N-Acyl-tyrosin­aziden (46, 2I9, I64) und -gemischten Anhydriden nach der Pyrophosphit­Standardmethode (I9, 43I) führt ohne Nebenreaktionen zum Ziel. Die Übertragung der FISCHERschen Säurechlorid-methode auf N-Acyl-tyrosin (vorwiegend N-Carbobenzoxy-verbindungen) verlangte jedoch eine Schutzgruppe für das phenolische Hydroxyl; nachdem schon ABDER­HALDEN und BAHN (2) die O-carbobenzoxylierte Verbindung dafür

----------

50° I

t O-COCHs I /~ I il I I

~/ I CH2

I CH-CO I ~ I /

NH-CO

(LIla.)

o

I R'

H N~HCOOR" t 2

O-COCHs I

("" 11

~/ I

CH2 R' I I

O-COCHa I

/"" 1 I1

~/ I

CH2

I Cbo-NHCHCOCI

~_~_-I- __ ~~_-. , R' I I 1 H 2NCHCOOR"

O-COCHs I

/"" I 1 V

I CH2 R' I I

Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR"

1. alkal. VpfSeifung 2. H2/Pd

OH I n y

CH2 R' I I

H 2NCHCO-NHCHCOOH H 2NCHCO-NHCHCOOR" Ba(OH)2

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Formelübersicht 4.

CH2

[

\\'. GRASS MANN und E. "'ÜNsCH:

I. C.H.CH.Br I 2. H,S NaOH t

O-CH2CsH 5

[

#'~ I 11

Cbo-chlond ""'/ HCl·Alkohol

NaOH [ CH2

[

H 2XCHCOOH

Cbo-NHCHCO-NHCH2COOR" ,

: NaOH I H,/Pd .j. OH

[

() ~/

[

CH2

[

PCl.(Pyndmj Cbo-NHCH2COOH

NaOH 1 H2/Pd ~ OH [ /~

I li V

[

CH2

I H 2NCHCO-NHCH2COOH H 2XCH2CO-XHCHCOOH

Cbo = Carbobenzoxy. R" = Alkyl.

Formelübersicht 5,

Synthese von Peptiden.

herangezogen hatten, nehmen BERGMANN und Mitarb. (67) das O-Acetyl-, HARINGTON und PITT RIVERS (2I9) das O-Benzoyl-derivat zu Hilfe, deren Spaltung nach erfolgter Umsetzung mittels alkalischer Hydrolyse ohne Angriff auf die Peptidbindung gelingt (Formelübersicht 4).

Von BARKDoLL und Ross (37) wird nach dieser Methode die Synthese von Tri-tyrosin, von BAILEY (33) diejenige einer Anzahl von Di- und Tripeptiden des Tyrosins über das N-Carbonsäureanhydrid (LIla) be­schrieben [vgl. auch KATCHALSKI und SELA (259L SCHWYZER u. a. (247), OVERELL und PETROW (32I); die letzteren konnten zeigen, daß die O-Carbobenzoxylierung auch direkt über den Kupferkomplex gelingt]. GRASSMANN und Mitarb. (206) haben erstmals den Benzyläther des L-Tyrosins auf einfache Weise hergestellt und mit sehr gutem Erfolg zu peptid-synthetischen Arbeiten (Phosphorazo-methode) herangezogen. Wie im Falle des Serins ist der O-Benzylrest in der Folge leicht mit katalytisch erregtem Wasserstoff oder Natrium in flüssigem Ammoniak [vgl. auch DUVIG",EAUD (424) ] unter Regenerierung der freien phenolischen Hydro­xylgruppe abspaltbar (Formelübersicht 5).

In völliger Analogie zum Serin (s. oben) addiert sich Dihydropyran auch an die phenolische Hydroxylgruppe; SCHWYZER und Mitarb. (247, 248) machen von dieser Blockierungsmöglichkeit bei der Synthese von Tyrosinpeptiden Gebrauch.

6. Die Sulfhydrylgruppe.

Die große physiologische Bedeutung des Cysteins führte schon früh­zeitig - vor allem seit der Entdeckung des Glutathions durch HOPKINS (238) - zum Bedürfnis nach der Synthese von Peptiden dieser Amino­säure. Die neuen Arbeiten über Coenzym A, Penicillin, Oxytocin-Vaso­pressin und verwandte Substanzen, die als entscheidenden Faktor Cystein (Cystin) bzw. Cysteamin im Molekül enthalten, haben die Richtigkeit dieser Forderung bestätigt. Nach einigen ersten Schritten der FIscHERsehen Schule (I62a, I53), sowie von ABDERHALDEN (7, I2) glückte BERGMANN und ZERV AS (56) mittels des Carbobenzoxy-verfahrens der entscheidende Vorstoß. Die Wege a) und b), die beide auf einer eindeutigen Blockierung der Sulfhydrylgruppe basieren, erwiesen sich besonders für Peptide der Formel "Cys-X" gangbar.

a) Das "Cystin-verfahren".

Nach BERGMANN und ZERVAS (56) läßt sich Cystin in die N,N'-Di­carbobenzoxy-verbindung (LIlI) überführen, diese mit Phosphorpenta­chlorid in das zugehörige Bis-säurechlorid (LIV). Die übliche "FISCHER­Synthese" führt zu den gewünschten Dicarbobenzoxy-cystin-peptiden (bzw. -estern). Die Abspaltung der Schutzgruppe, die hier durch Hyd­rierung nicht möglich ist, gelang dann WHITE (45I ) , HARINGTON und MEAD (2I7), sowie LORING und DUVIGNEAUD (293) auf den auf S. 456 an-

--------- ------ -------

\V. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

geführten Wegen. Bei der Abspaltung mit Phosphoniumjodid oder Natrium in flüssigem Ammoniak tritt gleichzeitig reduktive Öffnung der Disulfid-brücke auf, die bei nichtreduktiver Entfernung der Schutzgruppe in einem gesonderten Schritt mit Natrium in flüssigem Ammoniak (425) bzw. mit Zink und Säure (329) erfolgen muß. Auf der anderen Seite ist die Überführung der Cystein- in die Cystin-peptide mittels Luftoxydation leicht wieder zu bewerkstelligen (293, 2I9, 2II, 43I). Neuerdings machen

CH2-S-S-CH2 I ,

Cbo-NHCH CHNH-Cbo

COOH COOH

(LU!.)

I PCI. t

Cbo-NHCH CHNH-Cbo

COCI COCI (LIV.)

R' I 1 H.NCHCOOR"

CH2-S-S-CH2

I I Cbo-NHCH CHNH-Cbo

co co HCI

~H2-S- I CH-NH

'" co I Co- -0/ _ _2

(LV.)

R' I

t H.NCHCOOR"

-CH2-S--

co I I --------->

l~H ~H NH -C.H,CH,Cl ,

I I

R'-CH R'-CH CH-R'

COOR" I

COOR"

PH,] oder N a/NH.I

I

COOR"

1 r

co

NH

_2

______ ~i I Zn/HCI oder Na/:--fH3

R' -CHCOOR"

R' = .\minosäure-Seitenkette. R" = H bzw. Alkyl.

Formelübersicht 6.

Synthese von Peptiden.

jedoch sowohl HOLLY und Mitarb. (237), als auch GOLDSCHMIDT und JUTZ (I9I) darauf aufmerksam, daß die direkte Carbobenzoxylierung des Cystins in alkalischem Medium keine reinen Produkte liefert. BAILEY (33) gelangte über das Carbobenzoxy-cystiny1chlorid (LIV) zum Bis-N-Carbonsäure­anhydrid (LV), das seinerseits für die Synthese von Cystinpeptiden Ver­wendung finden kann (Formelübersicht 6).

b) Das "S-Benzyläther-verfahren".

DUVIGNEAUD (425) hat mit der Darstellung des S-Benzyläthers des Cysteins und der Feststellung, daß diese Blockierung der Sulfhydryl­gruppe mittels Natrium in flüssigem Ammoniak ebenso leicht wieder rückgängig gemacht werden kann, den bahnbrechenden Hinweis für alle synthetischen Arbeiten auf dem Cystein-Cystin-gebiet gegeben (293):

CH2-SH I

CH-NH2

I

COOH

CH2-SNa Na/NH. I

CH-NH2 I Na/NH.

COONa

Na/NH. t I C.H.CH.Cl -C.R,CH. I t H( + )

CH2-S-CH2C6H s I CH-NH2

I

COOH

[,.

H2-

S-1 CH-NH2 I

COOH

Zahlreiche Veröffentlichungen, die vor allem die Synthesen von Glutathion und neuerdings von Oxytocin bzw. Vasopressin behandeln, bedienen sich mit bestem Erfolg des S-Benzyl-cysteins in Form der Carbobenzoxy-verbindung bzw. des Esters. Als besonders vorteilhaft erwies sich dabei, daß mittels Halogenwasserstoffen in indifferenten Lösungsmitteln eine selektive Abspaltung des Carbobenzoxyrests möglich ist (2I8, 430, 429, 452, 3°3, 2I9, 274, 225, 37, I9I , 345, 43I , 427):

CH2-S-CH2 C6H s I

Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR" I

R' HC1-Alkohol

CH2-S-CH2 C6H s I

CH2-S-CH2C6H s I

Cbo-NHCHCO-NHCHCOOH H 2NCHCO-NHCHCOOR", HCl

I I R' R'

Cbo = Carbobenzoxy. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

\Y. GRASSMANN und E. \YUNSCH:

Die Darstellung der ::'\-Phthalyl-verbindung des S-Benzylcysteins ist neuerdings B."LE~OVIC und Mitarb. (34) gelungen; sie wurde jedoch noch nicht zu Peptidsyn-thesen herangezogen.

c) S-Aminoacyl-derivate.

Einen neuen, äußerst interessanten Weg zur Synthese von Cystein­peptiden der Formel "X-Cys" haben WIELAND und Mitarb. (458) auf­gezeigt. Unter bestimmten Reaktionsbedingungen setzen sich S-Amino­acyl-derivate des Cysteins (die als nicht isolierbare Zwischenprodukte einer Umesterung Thiophenyl-: S-Cysteinester entstehen), spontan zu N-Aminoacyl-cystein um (vgl. auch S.49(,).

R' R'

C6H 5-S-CO-CHNH2

+ OC-CH:\H2

SH NH I I 2

CH2-CHCOOH CH 2-CHCOOH

R' = Aminosaure-Seitenkette.

7. Die "Thioäther".

R' i

OC-CH::'\H2

i

SH ::'\H I

CH2-CHCOOH

Neben Methionin und Lanthionin als natürliche Vertreter dieser Aminosäureklasse ist der synthetische S-Benzyläther des Cysteins zu be­achten. Im allgemeinen gelten somit die auf S. 489 gegebenen Hinweise. In einigen Fällen der Synthese von Methionin-peptiden war es sogar möglich, den Carbobenzoxy-rest mit katalytisch erregtem Wasserstoff zu entfernen (I25). Wählt man eine Abspaltung der Aminoschutzgruppe mittels Natrium in flüssigem Ammoniak, so ist für eine nachträgliche Methylierung von hierbei entstehendem Homocystein-derivat zu sorgen (I25, 403, 86 a, 230 a), während die Halogenwasserstoff-solvolyse in Eis­essig CDEKKER (I24) ] zu Austauschreaktionen Anlaß gibt. So werden Methioninderivate (LVI) m S-Benzyl-homocystein-derivate (LVII) über­geführt:

S

CH3

(Ln.)

HX

Eisessig

HX,NH 2CHCO-R

-CH,X ----.,

S

Cbo = Carbobcnzoxy. R = OH, ORn oder -::'\HCHCOOH(R"). Rn = Alkyl.

R'

Synthese von Peptiden. 49 1

8. Die w-Carboxylgruppe.

Peptide der Amino-dicarbonsäuren, insbesondere der in natürlichen Eiweißkörpern stark vertretenen Glutamin- und Asparaginsäure, sind mehrfach, vor allem seit der Einführung der Carbobenzoxy-methode, synthetisiert worden. Die Heranziehung von "inneren" Anhydriden von Derivaten der beiden Aminosäuren - in gewissem Sinne doch eine Blockierung derw-Carboxylgruppe-ist auf SS. 524-526 diskutiert.' Eine weitere Maskierungsmöglichkeit ist mit Hilfe des Pyrrolidonrings für die Glutaminsäure gegeben (S.466). Zwei weitere spezifische Verfahren a) und b) wurden beschrieben:

a) Synthesen mit ungeschützter w-Carboxylgruppe.

Nach BERGMANN und Mitarb. (6I) gelingt die Überführung von N-Acyl-glutamyl-aminosäure-monoestern bzw. -peptid-monoestern in die Azide und die weitere Umsetzung dieser zu höheren Acyl-peptidestern, ohne daß die hierbei ungeschützt verbleibende w-Carboxylgruppe zu Nebenreaktionen Anlaß gibt (23I). HEGEDÜS (225) sowie LE QUESNE und YOUNG (]38) beschreiben die Darstellung von Carbobenzoxy-glutamyl­mono aziden und deren Verwendung zur Synthese von (X- und y-Glutamyl­peptiden. Jedoch erheben neuerdings SACHS und BRAND (355) berechtigte Einwände, da sie bei der Nachbearbeitung dieses Verfahrens jeweils beide Derivate isolieren konnten. Eindeutig dürfte dagegen die Synthese über N -Acyl-glutaminsäure-(X- bzw. -y-thiophenylester verlaufen (470, 355 a).

b) Synthesen mit veresterter w-Carboxylgruppe.

w-Halbester der Asparagin- bzw. Glutaminsäure sind lange bekannt (330, 2I4, 58), seit 1933 auch das N-Carbobenzoxy-derivat des Glutamin­säure-y-esters (IO). Die Darstellung gelingt durch direkte Carbobenzoxy­lierung des freien y-Esters in schwach alkalischem Medium (IO, 3I7, 225, 2I5, 337) [für den (X-Ester siehe SACHS und BRAND (353)J, ferner durch Alkoholyse der N-Acylaminodicarbonsäure-anhydride (hierbei werden (X- und y-Ester gebildet; vgl. S. 526) und schließlich durch partielle Ver­seifung N-acylierter Diester (2I5). Die so erhaltenen N-Acyl-amino­dicarbonsäure-monoester lassen sich nun nach beliebigen Methoden mit Aminosäuren bzw. Peptiden (Natriumsalze bzw. Ester) kuppeln. In der Folge ist die Verseifung der w-Estergruppe durchzuführen; sie ist quantitativ nur mit überschüssiger Lauge zu erreichen, was bei der Alkali­empfindlichkeit des Carbobenzoxy-restes wenig vorteilhaft erscheint. Die Heranziehung von w-Benzylestern (2I5, 352) ist daher wünschenswert (vgl. auch SS.525-526).

Für die Synthese von y-Glutamyl- bzw. ß-Asparagyl-peptiden über die (X-Ester der beiden Aminosäuren gelten analoge Verhältnisse; vgl. auch S. 475.

- -----------------------------

492 \\". GRASSMANN und E. \\"i;NSCH:

9. Die primäre Carbonsäureamid-gruppe.

Wie bekannt, beteiligen sich Glutamin bzw. Asparagin in weitgehen­dem Maße am Aufbau natürlicher Eiweißkörper. Neuerdings wurde Glycinamid als Baustein der Hormone Oxytocin und Vasopressin auf­gefunden; Peptide mit endständiger primärer ex-Carbonsäureamid-gruppe haben Bedeutung für enzymatische Arbeiten erlangt (46, 47, 230).

a) Synthesen mit ungeschützter -CONH2-gruppe.

Schon frühzeitig gelang FISCHER und KOENIGS (IS6, IS7) , sowie THIERFELDER und v. CRAMM (4I3) die Kupplung von Asparagin bzw. Glutamin mit Halogen-acylchloriden nach SCHOTTEN-BAUMANN; die Aminierung der ex-Halogenacylderivate lieferte die gesuchten Peptide. Erst neuerdings haben sich DU VIGNEAUD und Mitarb. (262, 43I, 427) wieder des Säurechlorid-verfahrens zur Darstellung der Glutaminyl­asparaginyl-gruppierung bedient, wobei sie Magnesiumoxyd in Wasser als HCl-bindendes Agens benutzten. Gleichzeitig synthetisierten SONDHEIMER und HOLLEY (399) Glutaminylpeptide nach der CURTIUsschen Azid-methode, nachdem ihnen die Darstellung von Carbobenzoxy-glutaminylhydrazid bzw. -azid aus dem entsprechenden Methylester gelungen -war (398) [vgl. auch BOISSONNAS und Mitarb. (76)J.

b) Nachträglicher Aufbau der -CONH2-gruppe.

MELVILLE (299), später HARINGTON und MEAD (2I8) , sowie FRuToN und BERGMANN (I79) führten Carbobenzoxy-glutamylderivate in die y-Säurechloride über und diese in die y-Säureamide. Allgemeiner anwend­bar erwies sich aber die Aminolyse von Estern mittels alkoholischem Ammoniak, die vor allem die BERGMANN-Schule (46, 47, 230, I78) studierte. Sie wurde von MILLER und WAELSCH (30S) zur Synthese von Glutaminylpeptiden, von RESSLER und DU VIGNEAUD (34S) zur

R' R'

Cbo-:C-;-HCHCO-NHCHCOOR"

___ 11 ____ _

~--NH, NH, R' R' R'

Cbo-XHCHCO-NHCHCONH2

1 H 2/Pd

CH-CO~

I / R' R' i'm-co

R'

N-CHCONH2

(LIX.) H 2NCHCX-XHCHCONH2

(LVII!.) R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Synthese von Peptiden. 493

Darstellung von Peptidamiden (LVIII) benutzt. Nach BERGMANN und FRUTON (I78,) nimmt jedoch diese Reaktion bei Carbobenzoxy­phenylalanyl- bzw. -leucylglycinestern einen abnormalen Verlauf: Unter Freiwerden von Benzylalkohol bilden sich die Amide der substituierten Hydantoin-essigsäuren [LIX, s. auch (I25)].

Für den Aufbau von Glutaminyl-peptiden hat die in den letzten Jahren von DU VIGNEAUD und seiner Schule (407), sowie gleichzeitig von RUDINGER und Mitarb. (349,35°) aufgefundene Ringöffnung von N-Tosyl­pyroglutamylaminosäuren bzw. -peptiden (LX) einen sehr erheblichen Fortschritt gebracht:

R'

CH2CH2COOH I

Tos-NHCHCOOH

I H 2NCHCOOH

PCl,

R' !

CH2

/'\ OC CH2

i Tos-N--CH-COCl

Tos-N--CHCO-NHCHCOOH Tos-NHCHCO-NHCHCOOH

(LX.) R'

Tos = p-Toluolsulfonyl. R' = Aminosäure-Seitenkette.

IO. Aminozucker und Phosphorsäureester.

Auf Grund vierfacher Erfahrungen [vgl. z. B. GRASSMANN und KÜHN (200) ] darf mit dem Auftreten von Aminozuckern als Bausteine natür­licher Eiweißkörper gerechnet werden. Die Einbeziehung dieser Körper­klasse in die Peptidsynthese - von BERGMANN und ZERVAS (57) mit der Darstellung von Glycyl- bzw. Alanyl-glucosamin begonnen [so auch (69)J - wird notwendig.

Analoge Gesichtspunkte ergeben sich für die Phosphorsäureester der Oxyaminosäuren; aus Casein-hydrolysaten (Trypsin-abbau) wurden z. B. Phosphoserin (290), Phosphothreonin (423), Phospho-seryl-glutamin­säure (285) und höhere Peptid-phosphorsäureester (334) isoliert. Mit der Synthese von Phospho-peptiden hat man sich erst verhältnismäßig spät befaßt. POSTERNAK und GRAFL (335) beschreiben erstmals Phospho­tyrosin-peptide; die Einführung des Phosphorsäurerestes gelang mittels Phosphoroxychlorid. Interesse verdienen ferner die Ergebnisse von W AGNER-J AUREGG (33I): durch Wasserstoffionen hervorgerufene N: 0-Acylwanderung ermöglicht die einwandfreie Darstellung von Oxyamino­säure-O-phosphorsäureestern. Erst in letzter Zeit veröffentlichten BAER und MAURUKAS (3I), sowie WILSON und Mitarb. (472) ein allgemein an­wendbares Phosphorylierungsverfahren für Oxyaminosäuren, das auch auf Peptide übertragbar ist:

494 \V. GRASS MANN und E. \VÜNSCH:

o CI P(OC,H.) ,

CH20~P(OC6H5)2 i 0 HBr

- --~ Cbo-);HCHCOOR"

CH20~P(OC6H5)2

Cbo~);HCHCOORu EIsessIg

! 0 CH20~P(OH)2 , 0 NaOH

H 2 );CHCOOR" H2~CHCOOH

Rn = Alkyl. Cbo = Carbobenzoxy.

III. Methoden der Peptidknüpfung. E. Esterkondensationen.

I. Diketopiperazine u,nd ihre Au,fspaltu,ng.

Fußend auf einer Arbeit von ABENIUS und WIDMAN (I3) gelang FISCHER und FOUR~EAU (I52) I90I durch saure Hydrolyse von Diketo­piperazin zum ersten Male die künstliche Herstellung eines Peptides:

Diese :Methode versagte bei den symmetrischen "Anhydriden" des Alanins und Leucins (I35); erst die vorsichtige Hydrolyse mit ver­dünntem Alkali bei Raumtemperatur führte zum Erfolg (I39). In der Folge wurde jedoch festgestellt, daß hierbei ganz oder teilweise Racemi­sierung eintrat (I55, I6I). LEVENE (286) und BERGMANN (63) zeigten später, daß die optische Aktivität der Diketopiperazine bzw. der Peptide vor allem im alkalischen Medium verlorengeht, viel weniger dagegen im sauren (209, 52). Gemischte (asymmetrische) Diketopiperazine ergeben Mischungen der beiden möglichen Dipeptide, die meist kaum trennbar sind (I6I) [vgI. aber BERGMANN und TIETZ:lIAN (52)].

Neuerdings lassen sich die "Aminosäure-anhydride" auch direkt aus den Aminosäuren durch vVasserabspaltung bei höherer Temperatur er­halten (357, 363). Wie MEGGY (298) am Beispiel des Glycins zeigen konnte, verläuft diese Piperazin-dion-z,s-darstellung bei 170-180° unter gleichzeitiger Bildung von höheren Peptiden und sogar polymeren Pro­dukten, worauf bereits :;\IAILLARD (296) hingedeutet hatte.

2. Freie lineare Esterkondensation.

Schon 1883 hatte CURTIUS (II3, II6) die spontane Umwandlung yon Glycinmethylester zur "Biuretbase" (Tetraglycinmethylester) beob­achtet. Triglycinmethylester wiederum unterliegt beim Erwärmen größtenteils einer Dimerisation zum Hexaglycinester (I42); als Neben­produkte entstehen Polyglycinester mit einer Kettenlänge bis zu 100

Synthese von Peptiden. 495

Glycinresten (322). Mit analogem Erfolg verlief die Reaktion bei Leucyl­glycyl-glycin- und Alanyl-glycyl-glycinmethylester (I43). FRANKEL und KATCHALSKI (I68) , sowie PACSU und WILSON (322, 47I) haben dann das Studium dieser Polykondensationen auf breiter Grundlage untersucht [vgl. auch KATCHALSKI (255)]. Neuerdings befaßten sich SCHRAMM und Mitarb. (364,365), BROCKMANN und Musso (88,89), YOUNG und Mitarb. (344), sowie RYDON und SMITH (35I) mit den zur Polykondensation von Aminosäure- bzw. Peptidestern führenden Bedingungen.

3. Cyclische Esterkondensation.

Neuerdings machen BROCKMANN u. a. (90) auf die Bildung cyclischer Peptide als Nebenprodukte bei der Polykondensation von Tripeptid­methylestern (in Methanol in Gegenwart von Ammoniak bzw. Piperidin) aufmerksam. Es gelang ihnen die Isolierung gut kristallisierter Ver­bindungen, in denen weder freie Amino- noch Carboxylgruppen nach­weisbar waren, deren Hydrolysat jedoch alle Aminosäuren des ein­gesetzten Peptidesters lieferte [so auch SCHRAMM und THUMM (365)J. Selbstverständlich ist hierher auch die Bildung der symmetrischen bzw. unsymmetrischen Diketopiperazine aus Aminosäure- bzw. Dipeptidestern zu zählen (vgl. S.494).

4. Systematische Esterkondensation.

a) Energiereiche "O-Ester".

Beim Zusammenschmelzen von Benzoylglycinester mit Glycin fand CURTIUS (II4) im Reaktionsgemisch Benzoylhexaglycin. Die damit an­bahnte Erkenntnis, daß Ester acylierter Aminosäuren energiereiche Ver­bindungen sind, erlaubte E. FISCHER (I35) die Synthese eines Carbäthoxy­tripeptidesters, als er Carbäthoxy-glycyl-glycinmethylester mit Leucin­ester unter Alkoholabspaltung kondensierte. Es ist ein Verdienst SCHWYZERS (379, 376, 375, 378) sich dieser fast vergessenen Peptid­knüpfung angenommen zu haben. Er hat hierbei auf die schon im Zu­sammenhang mit den Arbeiten über Thioester gemachten Erfahrungen (s. unten) zurückgegriffen und versuchte, durch Einführung negativer Substituenten in die Alkohol-komponente die Reaktionsfähigkeit der Carbonsäure-methylester gegenüber dem nucleophilen Angriff zu steigern. Als solche aktivierende Gruppen erwiesen sich die Cyan-, Carboäthoxy-, Dicarbäthoxy-, Aceto-, Nitrophenyl- und Diäthylamino-äthyl-gruppe (in fallender Stärke; abnehmender I--Effekt); vgl. S. 451.

Als weitaus am geeignetsten behaupteten sich jedoch nur die Ester des Glykolsäurenitrils (LXI). Die Vorteile dieser "Cyanmethylester­methode" seien wie folgt dargelegt: 1. Leichte Zugänglichkeit der akti­vierten Ester durch direkten Umsatz von Acylaminosäuren bzw. -peptiden

\Y. GRASS~IA~~ und E. \VÜNSCH:

mit Chloracetonitril in Gegenwart tertiärer Basen. z. Gute Stabilität und Lagerfähigkeit ; ausgezeichnete Kristallisationsfreudigkeit und leichte Reinigung. 3. Die aminolytische Aufspaltung durch Aminosäureester gelingt rasch und in guter Ausbeute, am besten in Essigester oder Tetra­hydrofuran (+ 1/10-1/20 Mol Eisessig als Katalysator) und bei genügend hoher Konzentration der Reaktionspartner. 4. Darstellung und Um­setzung der Cyanmethylester verlaufen unter Erhalt der optischen Rein­heit, sofern man hohe Temperaturen vermeidet [so dazu ISELIN, FEURER und SCHWYZER (247)].

R' R'

Cbo-XHCHCOOH + ClCH2CN

tert. -----+

Amin Cbo-XHCHCOOCH2 CN

(LX!.) R' I

H 2NCHCOOR" R' R'

I I

Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR" + HOCH2CK

(LXI!.)

Cbo = Carbobenzoxy. R' = Aminosäure-Seitenkette. Rn = Alkyl.

Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die erforderliche Anwendung eines Überschusses der Endkomponente, da nur so die hohen Ausbeuten er­zielbar sind (375). Eine Störung des Reaktionsverlaufs dagegen durch eine mögliche Kondensation des als Nebenprodukt entstehenden Glykol­säurenitrils (Cyanmethylalkohol) mit der Aminokomponente wurde nicht beobachtet (379).

BODAXSZKY (74) veröffentlichte eine kurze Mitteilung über die Synthese von Peptiden mit Hilfe von Nitrophenylestern. In Dioxan lassen sich Acylaminosäure-nitrophenylester mit Aminosäureestern in ausgezeich­neten Ausbeuten zu Acylpeptidestern kondensieren. Dem Autor gelang nach dieser Methode die Darstellung von S-Benzyl-cysteinyl-prolyl­leucyl-glycin-benzyl-ester-hydrochlorid sowie einiger Phthalyl-peptid­amide (74a).

b) Energiereiche "S-Ester" .

In die Arbeiten auf dem peptidsynthetischen Gebiet wurden von der WIELAND-Schule auch die Thiophenylester von Acyl-aminosäuren ein­bezogen (464). Ihre Darstellung gelingt über die Säurechloride oder besser über die gemischten Anhydride von Kohlensäureestern durch Umsetzen mit Thiophenol. Die S-Phenylester acylierter Amino-thiosäuren (LXIII) zeigen eine beträchtliche Hydrolysebeständigkeit. Dagegen ist die amino­lytische Aufspaltung relativ viel rascher erzielbar, obgleich es hier gegen­über den vorher besprochenen gemischten Anhydriden schärferer Reak­tionsbedingungen bedarf (längere Dauer und höhere Temperatur). Dieses

Synthese von Peptiden. 497

Verhalten läßt sogar das Arbeiten in alkoholischem Medium zu. Schwer­metallkationen, vor allem Silber-ionen fördern spezifisch die Aminolyse (372); vgl. s. 450).

R' I

Ac-NHCHCO-SCeHs (LXIII.)

R' I

H"NCHCOOR" ------~,.~

R' R' I I

R' 0(-) l I I

AC-NHCH-j-SCsHs J (+)NH

L I 2

R'-CHCOOR"

Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + HSCeHs

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl oder Na.

Die Ausbeute an Carbobenzoxy-di- und -tripeptiden nach dieser Methode, die im Enderfolg auf eine Aminolyse der COS-Bindung analog den Mercapto-thiazolonen (72) bzw. Thiazoliddionen (27, 265) hinaus­läuft (vgl. S. 52!) ist eine sehr gute.

WIELAND und Mitarb. gelang auch die Darstellung der freien Amino­säure- bzw. Di- und Tripeptid-thiophenylester (463, 457, 455), die sich durch Erwärmen oder unter dem Einfluß von tertiären Basen (z. B. in Aceton) polykondensieren lassen. Schließlich konnten aus den energie­reichen Thiophenylestern durch Umacylierung S-Acyl-derivate ali­phatischer Mercaptane synthetisiert werden (458). Auch diese sind wiederum in der Lage, den Acyl-(bzw. Aminoacyl-)-rest zu übertragen, besonders schnell auf in "idealer Nachbarschaft" befindliche Amino­gruppen des gleichen Moleküls (vgl. S.490).

Fast gleichzeitig haben sich auch SCHWYZER und Mitarb. (373, 377) mit aliphatischen Thioestern und ihrer Aminolyse befaßt. Sie konnten zeigen, daß negative Substituenten der Alkoholkomponente - analog zu den geschilderten Ergebnissen der aktivierten O-Ester - den nucleo­philen Angriff auf die Thiocarbonsäureester-gruppierung erleichtern. Besonders erfolgreich verliefen die Versuche mit den Carboxy-thiomethyl­estern (LXVI), die leicht und in guter Ausbeute durch Umsatz der ge­mischten Carbonsäure-alkylkohlensäure-anhydride (LXIV) mit Thio­glykol säure (LXV) entstehen (377, 374). Diese Thioester (LXVI) stellen

CICOOR" HSCH.COOH R-COOH ---+ R-CO-O-COOR" -+ R-CO-SCH2COOH --

tert. Amin

H.NCH,COO(-)

pH6, Ag(+)

(LXIV.) (LXV!.)

R-CO-NHCH2cod-) + HSCH2 COOH

(LXV.)

R = Carbonsäure-substituent. R" = Alkyl.

Fortschritte d. Chern. org. Naturst. XIII. 32

W. GRASSMANN und E. VViJNSCH:

durchaus stabile und teilweise aus Wasser umkristallisierbare Yerbin­dungen dar, die, am zweckmäßigsten in nicht zu verdünnter Lösung, mit Aminosäure-natriumsalzen unter Amidbildung reagieren. Besonders günstig verlief die Umsetzung bei PR 6 und in Gegenwart von Silberionen.

Freie Aminosäure- bzw. -peptid-thioglykolester, die besondere Bedeutung für Polykondensationen besitzen, sind in Form ihrer Hydrobromide leicht durch Spaltung der entsprechenden Carbobenzoxy-derivate mit Bromwasserstoff-Eisessig zugänglich

(374)·

Im Zusammenhang mit dem biochemischen Prozeß der Acyl-über­tragung durch das "Coenzym A" (z. B. S-Acetyl-Coenzym A, als "akti­vierte Essigsäure" bezeichnet) (294), wird eine biologische Synthese von Peptiden über Aminoacyl-thioester in den Bereich des Möglichen gerückt (295)·

F. O-Acyl-halbacetale.

Im Rahmen ihrer Arbeiten über aktivierte Ester haben SCHWYZER und Mitarb. (379, 248) unter anderem "Methoxy-methyl"- (LXVII) und "z-Oxy-tetrahydropyranyl"-ester (LXXI) hergestellt und auf ihre peptid­synthetische Verwendung geprüft. So reagiert zwar (LXVII) rasch mit Amino-verbindungen (LXVIII) unter Amidbildung ; doch reagiert auch der als Nebenprodukt anfallende Methoxy-methylalkohol (LXIX) - bzw. dessen Zerfallsprodukte Formaldehyd und Methanol - spontan mit der nucleophilen Komponente (LXVIII) zur SCHIFFschen Base (LXX), so daß mindestens zwei Äquivalente von (LXVIII) eingesetzt werden müssen, um eine quantitative Umsetzung von (LXVII) zu erreichen (379).

N(R"J, R-COOH + ClCH20CH2 ----> R-COOCH20CH3 ---'

(LXVII.) H 2N-R' (LXVII!.)

--' R-CO-NH-R' + HOCH20CH3 (LXIX.)

HOCH20CHa (LXIX.)

H 2NR' (LXVIII.) --' CH2 = N-R' + CHaOH + H 20

(LXX.)

R = Carbonsäure-substituent. R' = Amin-substituent. Rn = Alkyl.

Die Darstellung der "OxytetrahydropYlanyl-ester" (LXXI) gelingt leichter als diejenige von (LXVII) durch Anlagerung von Dihydropyran an freie Carboxylgruppen. Die Reaktionsfähigkeit dieser Derivate liegt etwas unterhalb der erwähnten Cyanmethylester.

A R-COOH + l)

°

A R-coo-l)

(LXX!.) ° R = Carbonsäure-substituent.

Synthese von Peptiden. 499

Eine interessante Entdeckung machte ARENS (24); er fand, daß Acylaminosäuren und Aminosäureester in indifferenten Lösungsmitteln durch Zugabe von Methoxy-acetylen (LXXII) zum Acylpeptidester (LXXIV) kondensiert werden:

R' R' CH2

I I iI Ac-NHCHCOOH + HC-C-OCHa ---.. Ac-NHCHCO-O-C-OCHa

(LXXII.) (LXXIII.)

R' R' R' CH I . 'I 2

H NCHCOOR" I I . _2 ________ Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + HO-C-OCHa ---> CHaCOOCHs

(LXXIV.) (LXXV.) (LXXV!.)

Ac = Acyl. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Wie ersichtlich, lagert sich die Carboxylkomponente an die Äthin­bindung von (LXXII) an unter Bildung eines O-Acylhalbketals (LXXIII) des Methylenketons (Ketens); (LXXIII) reagiert mit dem nucleo­philen Aminosäureester unter Bildung des Acylpeptidesters (LXXIV) und des Halbacetals des Ketens (LXXV), das sich spontan in Essigester (LXXVI) umlagert.

Eine Acyl-übertragung durch Halbacetale (-ketale) könnte auch in vivo z. B. als biologische Peptidsynthese erfolgen, wobei in erster Linie an die Halbacetal-Hydroxylgruppen der Zucker zu denken ist.

G. Gemischte Anhydride aus Acylaminosäure und anorganischen bzw. organischen Säuren.

I. Die "FIscHERsehe Säurechlorid-methode".

Wie bekannt, versuchte FISCHER (I49) 1903 zum ersten Male Peptide durch systematischen Aufbau zu synthetisieren. Durch Behandeln von N-Carbäthoxy-aminosäuren bzw. -peptiden mit Thionylchlorid konnten die entsprechenden Säurechloride erhalten werden, die mit Aminosäuren nach SCHoTTEN-BAuMANN oder mit zwei Äquivalenten Aminosäure­estern in Chloroform der Äther kuppelten (I36). Im letzteren Falle mußte der erhaltene Ester verseift werden. Mit Wiederholung der Operation war die Möglichkeit der Kettenverlängerung gegeben. Die Herstellung der freien Peptide scheiterte jedoch an dem Fehlen einer geeigneten Ab­spaltungsreaktion der N-Carbäthoxygruppe unter gelinden Bedingungen. Bei längerer alkalischer Hydrolyse erhielt FISCHER (I3S) ein Produkt, das er als die N-Carbonsäure des gesuchten Peptids ansprach. Es blieb WESSELY (44I, 442) vorbehalten, das "FISCHERsche Verseifungsprodukt" als Carbonyl-bisglycin (Harnstoff-N,N'-diessigsäure) (LXXVII) zu identi­fizieren.

500 W. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

NH-CH2

1

co co I NaOH

XH --->

CH2

i

COOR"

NH-CH2 I

OC co ""/ K

COOH

R" = Alkyl.

KH

COOH

(LXXVI!.)

Mit der Einführung leicht abspaltbarer Schutzgruppen hat diese Methode der Verwendung von Säurechloriden eine neue Blütezeit erlebt (384, 432), besonders bei der Synthese von Tryptophan- (J96) und Arginin-peptiden (I88).

R' R' R' R' I I -HCI I !

Cbo-NHCHCOCl + H 2NCHCOOR" Cbo-XHCHCO-KHCHCOOR"

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = H oder Alkyl. Cbo = Carbobenzoxy.

PACSU und WILSON (J22) erheben Bedenken gegen eine Verwendung dieser Derivate zur Synthese höherer Peptide und weisen darauf hin, daß bei der Darstellung von Acyl-peptidchloriden auch eine Einwirkung auf die Peptidbindung gemäß: -CO-NH- -C=N- -C=N-

I OH Cl

in Betracht zu ziehen ist [vgl. aber FRANKEL u. a. (I7I), sowie WIELAND (463) ].

Der nächste erfolgreiche Schritt zur Darstellung der freien Peptide gelang wiederum FISCHER und seiner Schule (I59). iX-Halogenfettsäure­chloride kuppeln leicht mit Aminosäure- bzw. Peptidestern in orga­nischen Lösungsmitteln zu den entsprechenden iX-Halogenacyl-derivaten, wobei der freiwerdende Chlorwasserstoff durch ein Äquivalent des Esters oder einer tertiären Base gebunden wird. Nach vorsichtiger Verseifung liefert die erhaltene iX-Halogenacyl-aminosäure bzw. das -peptid (die auch direkt nach SCHOTTEN-BAUMANN aus iX-Halogenfettsäurechlorid und Aminosäure bzw. Peptid in alkalischem Medium erhalten werden können) beim Behandeln mit konzentriertem, besser mit flüssigem Ammoniak das jeweils höhere Peptid:

R' R' R' R' I

Br-CHCOCl + H 2NCHCOOR" Br-CHCO-NHCHCOOR"

R' R'

NH3 H 2NCHCO-NHCHCOOR"

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl, Na bzw. H.

Synthese von Peptiden.

Durch Heranziehung entsprechender iX-Halogenfettsäuren konnten in der Folgezeit neben Glycyl- auch DL-Alanyl (I37) , DL-Leucyl- (I39), DL-Phenylalanyl- (I38) und DL-Prolyl-peptide (I62, 9) synthetisiert werden. Einen erweiterten Anwendungsbereich fand diese Methode durch:

I. Überführung der gewonnenen iX-Halogenacyl-aminosäuren bzw. -peptide in die entsprechenden Säurechloride [vgl. aber P ACSU und WILSON (322)J und erneute "FIScHER-Synthese". Erst in der letzten Stufe werden dann durch den Ersatz des iX-Halogen atoms durch die NH2-Gruppe die höheren Peptide selbst erhalten.

2. Verwendung der Säurechloride optisch-aktiver iX-halogenierter Säuren (I40). Letztere konnten mittels Racematspaltung bzw. aus optisch-aktiven Aminosäuren durch Behandeln mit Nitrosylbromid (433) erhalten werden. Allerdings mußte bei der folgenden Aminierung eine WALDENsche Umkehrung in Kauf genommen werden (I43, 3I2). Die volle Erhaltung der optischen Aktivität wird jedoch neuerdings ange­zweifelt (363).

Bekanntlich krönte FISCHER sein Werk mit der Synthese eines Oktadeca-peptids (I46); ABDERHALDEN und FODoR (4) gelang, ein Nona­deca-peptid aufzubauen.

Zur Darstellung von Glycyl-peptiden ist diese Synthese bis heute wertvoll geblieben (343, 2I2), obgleich beim Umsatz der iX-Halogenkörper mit konz., wäßrigem Ammoniak die Bildung z. B. sekundärer Amine in Betracht zu ziehen ist. Ferner wird über Ausnahmefälle bei der Aminierung von iX-D-Brom-isocapronyl-L-prolin und -N-phenylglycin (I60, I54), sowie von iX-Brom-ß-phenyl-propionyl-glycin (I50) berichtet, wobei iX-Hydroxyacyl-aminosäureamide bzw. bei letzterem unter Brom­wasserstoff-abspaltung ein Zimtsäure derivat entstehen (vgl. S.472).

Die von FISCHER vorgenommene Heranziehung der nicht substitu­ierten iX-Aminosäurechloride hat trotz einiger anfänglicher Erfolge (I39 , I4I, I58, 6) in der Folgezeit nicht befriedigt. Neuerdings empfehlen LEVINE (287), sowie FRANKEL und Mitarb. (I7I) verbesserte Darstellungs­vorschriften für Aminosäure- bzw. Peptidchloride [vgl. auch WIELAND u. a. (457)]. FRANKEL gelang deren Polymerisation durch mehrstündiges Erhitzen im Hochvakuum auf 180°.

Auch der Vorschlag, an Stelle der ~-Halogen- die ~-Azidoacylchloride (69, I73) zu benutzen, deren Azidogruppe schließlich durch katalytische Hydrierung gegen die Aminogruppe ausgetauscht wird, hat wenig Anklang gefunden (vgl. auch S. 472).

2. Die "CURTIussche Azid-methode".

Die umfangreichen Arbeiten von CURTIUS zeigten u. a. die Verwend­barkeit der Säureazide für die "SCHOTTEN-BAUMANN-Reaktion". In Über-

-~--~----

W. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

tragung auf die Peptidsynthese gelang ClJRTIUS und seinen Mitarb. die Darstellung benzoylierter Di- bis Hexapeptide (II5, I22, I20, II7-II9) in guter Ausbeute. Bei der Verwendung von Aminosäureestern als Kupplungskomponente erwies es sich als glücklich, daß der entstehende Stickstoffwasserstoff gasförmig aus dem Reaktionsgemisch austrat; daher war im Gegensatz zur Säurechloridmethode kein zweites Äquivalent Aminosäureester bzw. tertiäres Amin mehr erforderlich. Mit der Auf­findung leicht abspaltbarer Amino-schutzgruppen trat die Azid-methode einen Siegeszug an (62). Sie stellt auch heute eine der bedeutendsten Methoden zur Knüpfung der Peptidbindung, vor allem bei der Synthese höherer Peptide (83) dar, da es mit ihrer Hilfe möglich ist, auch Aminodi­carbonsäuren (6I, 225, 338) und Oxyaminosäuren (I76, 397), sowie primäre Aminosäureamide (Asparagin, Glutamin, Glycinamid) (J99, 76) ohne Ver­wendung besonderer Schutzgruppen einzubeziehen. Eine Racemisierung, selbst in geringem Maße, wurde dabei nicht beobachtet.

R' R' I HNO I

Cbo-NHCHCO-NHNH2 --'-. Cbo-NHCHCONa --.....

R' 1

H.NCHCOOR" -----.....

R' R'

I I Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR" + HNa

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

In Erweiterung der Methode gelang MAGEE und HOFMANN (295a) die Darstellung hochpolymerer Glycinpeptide, als sie Triglycin-hydrazid­hydrochlorid mit Nitrit und dann mit Alkali behandelten.

HN02

H2NCH2CO-(NHCH2CO)2-NHNH2 -- ..... H 2NCH2CO-(NHCH2CO)2N a---+ ,HCI ,HCI

Alkali ~-........ -CO-(NHCH2CO-NHCH2CO-NHCH2CO)x- ..•

Bei der Umsetzung mit salpetriger Säure erhält somit die Azidbildung vor der möglichen Desaminierung den Vorzug; beim Alkalischmachen kann dann die Azid- mit der freien Aminogruppe in Reaktion treten. Wird dagegen mit Bicarbonat bei 0-4 0 gearbeitet, so erfolgt nach SHEEHAN und RICHARDSON (390) Ringschluß zum makrocyclischen Peptid (387, 36) [vgl. auch RYDON und SMITH (35I)].

Über eine weitere Verwendung der Azidmethode zur Synthese von cyclischen Polypeptiden berichten FRUTON und Mitarb. (473). Carbo­benzoxy-tripeptidazide werden mit katalytisch-erregtem Wasserstoff unter Einhaltung des "Verdünnungsprinzips" behandelt, wobei Cyclisierung eintritt [vgl. auch BorssoNNAs und SCHUMANN (78); S. 5I2J.

Synthese von Peptiden.

Cbo-~H~HCO-NHCH2CO-NHCH2CONa

Cbo = Carbobenzoxy.

Auch bei der Azidmethode sind einige Nebenreaktionen festgestellt worden. So findet gelegentlich eine Umlagerung des Azids zum Iso­cyanat statt, das dann mit Aminogruppen unter Harnstoffbildung (59) bzw. mit benachbarten Hydroxylgruppen unter cyclischer Urethan­bildung (LXXVIII) reagiert (I76, 405).

NH

Ac-NHCHCONa

fAC-NHiH-N =C=Oj / '" Ac-NH-CH CO

I CHOH I

R

CHOH I

R

R = H oder CHa.

I I CH--O I

R

(LXXVIII.)

Ferner berichten PRELOG und WIELAND (336) über die Isolierung von Dicarbobenzoxy-Iysinamid bei der Verwendung von Dicarbobenzoxy­lysinazid zu Synthesen [vgl. auch BRENNER und BURCKHARDT (85)].

3. Anhydride der Phosphorsäure.

CHANTRENNE (99) sowie SHEEHAN und FRANK (386) veröffentlichten Arbeiten über energiereiche Anhydride aus Carbobenzoxy- bzw. Phthalyl­aminosäuren und substituierten Phosphorsäuren (Phenyl- bzw. Dibenzyl­ester), die bei PH 7A und 37° mit Aminosäuren unter Peptidbildung reagieren.

37° -­pu 7,4

R' , 0 I ,/'

Cbo-NHCH-C 0(-) '" / O-P=O

'" OCaHs 0(-)

/ Cbo-NHCHCO-NHCHCOoH + HO-P=O

~,~, "'OCaHs

Cbo = Carbobenzoxy. R' = Aminosäure-Seitenkette.

Diese Reaktionsfolge schlägt eine Brücke zur biologischen Peptid­synthese, für die als wahrscheinliche Zwischenstufen Acyl-phosphate angenommen werden (29I, dort S. I5z) [vgl. AVISON (29)).

--~~-~--- --~-----------------

\V. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

Die präparative Anwendung der Synthese ist durch die umständliche Darstellung der gemischten Phosphorsäure anhydride aus dem Säurechlorid einer Acylaminosäure und dem Ag-salz der substituierten Phosphorsäure sehr eingeschränkt. Bemerkenswert ist ferner die Umlagerung der unsym­metrischen Anhydride in symmetrische beim Stehen (386, 456).

Neuerdings haben BENTLER und NETTER (42) freie Aminophosphor­säureanhydride auf folgendem Wege aufgebaut:

ex-Azido-fettsäurechlorid + Dibenzylphosphorsäure-Ag

l-Agcl

C\:-Azido-fettsäure-(dibenzyl)-phosphorsäureanhydrid

tX-Aminosäure- (di benzyl) -phosphorsäureanhydrid

1 H.

tX-Aminosäure-phosphorsäureanhydrid

Die Umkehr der CHANTRENNE-SHEEHANschen Methodik ist vor kurzem KATCHALSKY und PAECHT (254) geglückt: Umsetzung der Silber­salze von Carbobenzoxy-aminosäuren mit Dibenzyl-chlorophosphat (LXXIX) ergab in glatter Reaktion die gemischten substituierten An­hydride (LXXX), die beim Behandeln mit gasförmigem Bromwasserstoff in Tetrachlorkohlenstoff in die freien Aminosäure-phosphorsäureanhydride (LXXXI) übergehen. Diese polymerisieren beim Aufbewahren in wäßriger Lösung. Im Falle der w-Anhydride der Asparagin- bzw. Glutaminsäure ließ sich die aminolytische Aufspaltung der gemischten Anhydride mit konz. Ammoniak zum w-Amid (LXXXII) mit guter Ausbeute bewerk­stelligen.

CH2COOAg I

Cbo-NHCHCOOC7H 7

4 HBr

o Cl-P(OC,H,).

---.----~-~

(LXXIX)

~---- H 2NCHCOOH -4 C,H,Br

-co. (LXXX!.)

o CH2COO-P(OC 7H 7)2

i

Cbo-NHCHCOOC 7H 7

(LXXX.)

CH2CONH2 + H aP04

NH3 I H 2NCHCOOH

(LXXXII.)

Cbo = Carbobenzoxy.

4. Anhydride der Phosphorigsäure.

ANDERsoN und Mitarb. (2I, 22) stießen auf das bereits von COOK u. a. (Io9) beschriebene Diäthylchlorophosphit als Anhydridbildner; wegen der

Synthese von Peptiden.

leichteren Darstellung und größeren Beständigkeit wurde dann das o-Phenylen-analogon vorgezogen. Nach diesem Schema wurden einige Peptide synthetisiert (Racemisierung wurde bei Dipeptiden nicht beob­achtet) :

OR" / -Hel

Cbo-NHCHCOOH + CI-P

~, "OR"

/ Cbo-NHCHCOO-P

" R'

OR"

OR"

~--~---~

H.NCHCOOR" I

Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR" + HOP(OR")2

I I R' R' R'

Cbo = Carbobenzoxy. R' = Aminosäure-Seitcnkette. R" = Alkyl.

Wie bei den gemischten Phosphorsäure anhydriden , verläuft auch hier eine Umlagerung im Sinne: 2 Mol unsymmetrisches ~ je I Mol sym­metrisches Anhydrid,

2 R-COO-P(OR")2 -+ (R-CO)20 + (R"O)2P-O-P(OR")2

R = Carbonsäure-substituent. R" = Alkyl.

also u. a. zu einem tetraalkyliertem Pyrophosphit (LXXXIII). Dieses bildet im Gegensatz zu dem entsprechenden Phosphorsäurederivat erneut mit Carbonsäuren ein gemischtes Anhydrid (LXXXIV) (I9) , mit Aminogruppen zur Knüpfung der Peptidbindung energiereiche Phosphit­amide (s. auch S. 530).

Cbo-NHCHCOOH + I

R'

R"O OR" " / P-O-P

/ " R"O OR"

(LXXXIII.)

OR" OR" / /

--+ Cbo-NHCHCOO-P + HO-P

~, "OR" "OR"

(LXXXIV.)

Cbo = Carbobenzoxy. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Dieses Verhalten führte zur Ausarbeitung einer "Standard-methode" mit Tetra­äthyl-pyrophm;phit als Anhydrid- und Phosphitamid-bildner (vgl. SS. 530-531).

5. Anhydride der Arsenigsäure.

Wie V AUGHAN (4I5) fand, liefert das Diäthyl-chloro-arsenit (297) gleich seinem Phosphoranalogon (s. oben) mit Acylaminosäuren gemischte Anhydride, die ohne vorherige Isolierung mit Aminosäureestern in inerten

---- --------- ------ ----------------

5°6 W. GRASS MANN und E. WÜNSCH:

Lösungsmitteln Acyl-peptidester in 60-75 %iger Ausbeute ergeben. (Das als Nebenprodukt entstehende Diäthylarsenit wird von Wasser zu Arsen­trioxyd zersetzt.)

OR" OR" / /

Cbo-NHCHCOOH + Cl-As -- Cbo-NHCHCOO-As

I "'0 R" I "'OR" R' R'

R' I

H.NCHCOOR"

R' R' I

OR"

----- / Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR" + HO-As

" OR"

Cbo = Carbobenzoxy. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

6. Thiosäuren.

Daß organische Thiosäuren hervorragende Acylierungsreagentien dar­stellen, erkannte zuerst PAWLEWSKI (326, 327). Neuerdings haben CRONYN und ]ru (IIO) , sowie SHEEHAN und ]OHNSON (389) die Her­stellung von Acylthio-aminosäuren (LXXXV) aus gemischten Anhydriden bzw. Säurechloriden beschrieben.

Ac-NHCHCOO-COOR" Ac-NHCHCOCl

I R'

I R'

H.S + N(R), ---~ ~--. Nasi!---­Ac-NHCHCOSH

I R'

(LXXXV.)

Ac = Acyl. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl. R = tert. Basen-alkyl.

In Dimethylformamid als Lösungsmittel lassen sich diese Thiosäuren (LXXXV) mit den Natriumsalzen oder Estern von Aminosäuren bzw. Peptiden glatt zu den Peptiden (LXXXVI) umsetzen:

-H.S Ac-NHCHCOSH + H 2NCHCOOR" Ac-NHCHCO-NHCHCOOR"

I I I R' R' R' R'

(LXXXV.) (LXXXV!.)

Ac = Acyl. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Freie Amino-thiosäuren, sowie deren überftihrung in Carbobenzoxy-derivate beschrieben \VIELAND und Mitarb. (467, 468, 459).

Synthese von Peptiden.

7. Anhydride der Schwefel- und Schwefligsäure.

Leitet man Schwefeltrioxyd in Dimethylformamid unter Kühlung ein, so entsteht ein S03-Dimethylformamidkomplex (LXXXVII), der seiner­seits mit wasserfreien Salzen im gleichen Lösungsmittel sich zu einem gemischten Anhydrid (LXXXVIII) umsetzt. In wäßriger Phase reagiert das letztere mit den Natriumsalzen von Aminosäuren nach folgendem Schema:

SOa(-) i' so. Ac-NHCHCOO(-)

0=CH-N(CHa)2 -----+ (+'O=CH-N(CHa)2 ----O=CH-N(CH.,.

(LXXXVI!.)

R' R' I I H 2NCHCOO(-)

--+ Ac-NHCHCOO-SOa(-) -----+

(LXXXVIII.)

R' R' I I

--+ Ac-NHCHCO-NHCHCOO(-) + (-)O.SOa(-)

R' = Aminosäure-Seitenkette.

Tosyl-DL-alanyl-glycin, Carbobenzoxy-glycyl-phenylalanin (DL undL) und Carbobenzoxy-glycyl-phenylalanyl-glycin (DL und L) wurden u. a. mit guter Ausbeute synthetisiert (263).

Schon vorher hatten WIELAND und BERNHARD (456) über gemischte Anhydride aus zwei Äquivalenten Acylaminosäure und ein Äquivalent Sulfuryl- bzw. Thionylchlorid berichtet. Bei der Aminolyse wurden jedoch stets nur Ausbeuten unter 50% an Acylpeptiden erzielt. Am Bis-anhydrid (LXXXIX) konnte beobachtet werden, daß die Disproportionierungs-

Ac-NHCHCO-O-S-O-COCHNH-Ac I 0 I

R' R' (LXXXIX.)

1 Disproportionierung

Ac--NHCHCO-O-COCHNH-Ac + S02 I I

R' R' (XC,)

1 HoNiHCOOR"

R'

R' R' R'

I I I Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + Ac-NHCHCOOH

Ac = Acyl. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

508 \Y. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

tendenz solcher Anhydride sehr groß ist. Für die Peptidknüpfung kommt dann nur mehr das symmetrische Acylaminosäure-anhydrid (XC) in Be­tracht, wodurch zwangsläufig nur Ausbeuten bis 50% möglich werden.

Diese Disproportionierung durfte mehr oder minder bei allen unsymmetrischen .\nhydriden stattfinden, wodurch als Xebenprodukt der aminolytischen Umsetzung kleinere oder größere Mengen Ausgangsmaterial anfallen. Beim Umsatz mit ~atrium­salzen von Aminosauren besteht dann die Gefahr, daß sich Acylaminosäure und Acylpeptid beim Aufarbeiten des Reaktionsgemisches nicht trennen lassen (vgl. auch S. SII).

8. Anhydride aliphatischer und aromatischer Carbonsäuren.

CURTIUS (III, II2) berichtete über eine Reaktion, mit der er praktisch zum Begründer der modernen "Anhydrid-methode" wurde. Bei der Ein­wirkung von Benzoylchlorid auf Glycin-silber in siedendem Benzol, die zum Zwecke der Benzoylierung der Aminosäure vorgenommen war, fanden sich im Reaktionsprodukt neben Hippursäure auch Benzoyl­diglycin und -hexaglycin vor. CURTIUS schlug damals als Erklärung vor, daß aus Benzoylchlorid und Glycin-silber (XCI) Hippursäure (XCII) ent­steht, die dann von einem weiteren Molekül Benzoylchlorid in das Säure­chlorid (XCIII) übergeführt wird, welches sich schließlich mit Glycin­silber zum Benzoyldipeptid (XCIV) kondensiert.

C 6H sCOCl + H 2NCH2COOAg

(XC!.)

CsHsCO-~HCH2COOH

(XCII.)

H 2NCH 2COOAg CsHsCOOH + CsH sCO-NHCH2COCl ------,>

(XCIII.)

CsH sCO-NHCH2 CO-NHCH2 COOH

(XCIV.)

CURTIGS sprach auch die bereits von KRAGT und HARTMANN (277) geäußerte Vermutung aus, daß die erste Stufe über ein gemischtes Anhydrid (XCV) verläuft:

H 2NCH 2COO-COCsH s

(XCV.)

CsH sCO-NHCH2COOH

(XCV!.)

Es ist einleuchtend, daß sowohl aus (XCV) wie (XCVI) mit einem weiteren Molekül Benzoylchlorid das gemischte Anhydrid (XCVII) ent­stehen kann, wobei der gebildete Chlorwasserstoff durch Glycin-silber als Silberchlorid unter Freiwerden eines Glycin-moleküls gebunden wird. Dieses setzt sich mit dem Anhydrid (XCVII) zum Benzoyldipeptid (XCVIII) um:

Synthese von Peptiden.

-HCl (XCV) oder (XCVI) + ClCOC6H 5 ----+ C6H5CO-XHCH2COO-COC6H5

(XCVII.)

HCl

C6H5CO-NHCH2COO-COC6Hs + H 2NCH2COOH

(XCVIL)

C 6H sCO-NHCH2CO-NHCH2COOH + C6H SCOOH

(XCVIII.)

Nach dem gleichen Schema kann nun die Synthese weiter über Tri-, Tetra-, Penta- zum Hexaglycin-derivat verlaufen.

Neuerdings haben WIELAND und Mitarb. (46I, 466, 454, 469) diese Reaktion für die systematische Synthese von Peptiden nutzbar gemacht. Dabei zeigte sich, daß eine Isolierung bzw. Reindarstellung der gemischten Anhydride nicht erforderlich ist. Sie bilden sich besonders glatt aus acy­lierten Aminosäuren bzw. Peptiden und einem "Fremdsäurechlorid" unter Zusatz von ein Äquivalent tertiärer Base in indifferenten Lösungsmitteln. Die aminolytische Aufspaltung kann nach zwei Wegen hin verlaufen:

Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + C6H sCOOH I !

R' R' (C.)

r Weg A

Ac-NHCHCO-O-COC 6H s + H 2NCHCOOR"

! I

R' R' (IC.)

1 WegE

Ac-NHCHCOOH + C 6H 5CO-NHCHCOOR"

I R' R'

(CL)

(JC.) Gemischtes Anhydrid. - (C.) Acyl-peptid. - (CL) "Fremd"-acyl­aminosäureester. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Na oder Alkyl.

Für die Synthese von Peptiden ist nur der Weg A, d. h. Freiwerden der "Fremdsäure" und Knüpfung der Peptidbindung Acylaminosäure­Aminosäure-(ester) brauchbar.

Die Aufspaltungsweise dieser unsymmetrischen Anhydride durch nucleophile Reagenzien wird vom Elektronenmangel der beiden kon­kurrierenden -C=O-Zentren bestimmt und davon die Geschwindigkeit der Addition der nucleophilen an dieelektrophile Gruppierung (vgl. S. 453).

Mit Hilfe einer eleganten Methode hat WIELAND und seine Schule (454, 469) die Verwendbarkeit von "Hilfssäuren" als Anhydridpartner

- ------------ -----

510 \Y. GRASS MANN und E. WÜNSCH:

festgestellt. Als reaktionsschwächste und damit Weg B verwerfende Acylhälften haben sich Benzoesäure, verzweigte aliphatische Carbon­säuren [vgl. V AUGHAN und OSATO (42o)J, des weiteren Trifluoressigsäure (S. 462) und vor allem Kohlensäureester (s. unten) erwiesen. Eine An­zahl von teils optisch-aktiven Peptiden wurde nach diesem Verfahren in meist ausgezeichneter Ausbeute hergestellt (466, 420, 437, 345).

9. Anhydride der Kohlensäure.

Die Einbeziehung der Anhydride der Kohlensäure bzw. substituierter Kohlensäure mit Acylaminosäuren in die Peptidsynthese brachte einen besonders guten Erfolg. Sie sind bequem und billig herstellbar und liefern die gewünschten Verbindungen in hoher Reinheit und bester Ausbeute. Neben der Azid- ist wohl diese Methode der Peptidknüpfung zur meist angewandten geworden; so berichten u. a. über die Synthese von teilweise höheren Peptiden BOIssoNNAs (75), BRAND (354,355, I30) und VAUGHAN (4I 9)·

a) Bisanhydride.

Wie SEHRING fand, bildet auch Phosgen mit Acylaminosäuren in indifferenten Lösungsmitteln in Gegenwart tertiärer Basen "gemischte Anhydride" (CIl), deren Tendenz, unter Disproportionierung zu zerfallen, jedoch selbst bei 0 0 groß ist. Hierbei entstehen die symmetrischen An­hydride der Acylaminosäuren (CIlI) (456):

Ac-XHCHCO-O-CO-O-COCHNH-Ac

I I R'

(CIl.)

I-co,

R'

Ac-NHCHCO-O-COCHNH-Ac

I I R' R'

(CIII.)

R' = Aminosäure-Seitenkette.

Wenngleich diese Tatsache für die Peptidsynthese wenig günstig ist, so stellt doch die leicht und nebenprodukt-freie Bildung symmetrischer Anhydride einen Fortschritt dar.

Über ein gemischtes Anhydrid der Chlorkohlensäure berichten LIWSCHITZ und ZILKHA (292) (vgl. S. 468).

b) Anhydride der Mono-alkyl-kohlensäure.

Es wurden von WIELAND und seiner Schule (456) verschiedene Halb­esterchloride der Kohlensäure mit positivem Resultat als Anhydrid-

Synthese von Peptiden.

bildner erprobt. Hält man die Temperatur unter 0°, so wird jedwede Disproportionierung des gemischten Anhydrids zurückgedrängt; dies äußert sich u. a. am Ausbleiben einer Kohlendioxyd-Entwicklung. Die aminolytische Aufspaltung durch Aminosäuren verläuft in Richtung Acyl-peptid + Kohlensäurehalbester (CIV), der sofort in Kohlendioxyd und einen Alkohol zerfällt.

Fast gleichzeitig veröffentlichten auch BOISSONNAS (75) und VAUGHAN (4I6, 42I) analoge Arbeiten. Einheitlich wird festgestellt, daß längere und vor allem verzweigte Alkylreste als Substituenten der Kohlensäure­acylhälfte die Ausbeute an Acylpeptiden steigern. Der Grund liegt hier in einer Beeinflussung der Elektronenkonfiguration an der Carbonsäure­anhydridgruppierung zugunsten der für eine erfolgreiche Anlagerung der nuc1eophilen Amino-Verbindungen notwendigen Kationisierung der Acyl­aminosäure-hälfte. Diese Kationisierung äußert sich auch in der Er­schwerung der hydrolytischen Spaltung solcher Ester und ihrer Hydrazid­bildung bei der Einwirkung von Hydrazinhydrat.

Ac-NHCHCOOH + CI-COOR'" !

R' !-HCI

Ac-NHCHCO-O-COOR'" +-->

I R'

R' 0

I "+-/' Ac-NHCH-C

R"'O-C

" ,,­o / '\­

o I H.N~HCOOR" {. R'

o -/' -co.

Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + HO-C -- R"'OH

I I "'OR'" R' R'

(CIV.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = R'" = Alkyl.

Es erwies sich auch vorteilhafter (75, 4I6, 278), als Kupplungskomponente Aminosäureester in indifferenten Lösungsmitteln an Stelle der Natriumsalze der Säuren zu verwenden; in einigen Fällen wurde eine nicht abtrennbare Verunreinigung des Acylpeptids mit dem Acyl-ausgangsmaterial nachgewiesen (359. 478).

In weiteren Arbeiten stellten V AUGHAN und Mitarb. (4I7, 4I8) die Bedingungen fest, unter denen ganz oder teilweise Racemisierung während der Reaktion erfolgen kann. Vor allem tritt dies bei der Darstellung höherer Peptide aus Acyl-, aber auch Carbobenzoxy-peptiden auf, sofern

W. GRASSMANN und E. ~'ÜNSCH:

die das Anhydrid bildende letzte Aminosäure optisch-aktiv ist. Als maß­gebender Faktor scheint hierbei das indifferente Lösungsmittel zu fungieren: so wurde z. B. in Dioxan bzw. Tetrahydrofuran im Gegensatz zu Chloroform-Toluol kaum eine Racemisierung beobachtet.

Die Synthese von hydroxyl-haltigen Peptiden mit Hilfe der gemischten Alkylkohlensäureanhydride erwies sich ebenfalls als gangbar, wie SCHWYZER (37I ) , KING (270) bzw. GRASSMANN und Mitarb. (242, 204) zeigen konnten. SCHWYZER gelang gleichzeitig die Darstellung von höchst säureempfindlichen Amiden des Äthylenimins, als er die entstehende Esterkohlensäure mit einem Äquivalent einer tertiären Base blockierte.

Als BOISSONNAS und SCHUMANN (78) dieses Anhydrid-verfahren auf das freie Tripeptid D-Leucyl-glycyl-glycin (CV) übertrugen, erhielten sie eine ninhydrin-negative Substanz, die sie als ein Cyclopeptid (CVI) an­sprechen:

CHa CO-NH-CH I I I Z

CH-CHz-CH CO C1COOR" I I :

CH2 CHa NH NH I i

H 2NCHCO-NHCH2CO-NHCH2COOH CO---- --CH2

(CV.) (CVI.) Rn = Alkyl.

IO. Die N(Im)-Acyl-imidazole.

Aus Untersuchungen von GERNGROSS ist bekannt, daß N-acylierte Imidazole, wie N-Benzoylimidazol (I84, I85) oder N,N(Im)-Dibenzoyl-histi­dinester (I86), äußerst leicht durch Wasser gespalten werden. BERGMANN und ZERVAS (54) haben festgestellt, daß der Imidazolacyl-rest noch rascher der aminolytischen Abspaltung unterliegt; es gelang ihnen u. a. die Darstellung von Benzoyl-diglycin aus N,N(Im)-Di-(benzoyl-glycyl)­histidinmethylester (CVII) und Glycin-Natrium:

HC~=C-CH2CHCOOR"

I I N K

/ "" / H,NCH.COOH OC C

i H ~H2

C6H sCO I

NH-COCH2NH I I

HC ~~- ~C-CH2CHCOOR" . I

HN N

""/ C H

+ CsHsCO-NHCH2CO-NHCH2COOH

NH-COC 6Hs

(CVII.) R" = Alkyl.

Synthese von Peptiden.

Da nach ZERVAS und BERGMANN auch Benzoyl-theobromin befähigt ist, seinen Acylrest auf "auffangbereite" Verbindungen, wie Amino­säuren, Zucker usw., zu übertragen, liegt es auf der Hand, daß allen Purinen und damit den Nucleinsäuren diese Fähigkeit zukommen dürfte. Somit steht neben energiereichen Phosphaten, S-Acyl-derivaten und O-Acyl-halbacetalen eine vierte Möglichkeit der biologischen Peptid­synthese offen es. auch STADTMAN und WHITE (40I)].

Neuerdings haben WIELAND und SCHNEIDER (465) das Studium dieser Verbindungsklasse weitergeführt.

II. Das "C arbodiimid-Verfahren".

Die bisher einfachste und eleganteste Methode der Peptidknüpfung wurde von SHEEHAN und HESS (388) aufgefunden. Acylaminosäuren (Carbobenzoxy- oder Phthalylderivate) kuppeln mit Aminosäureestern in indifferenten Lösungsmitteln und bei Raumtemperatur nach Zugabe von ein Mol N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid (CVIII) (360, 36I) in guter Aus­beute zu den gewünschten Acylpeptidestern (CXI). Der als Nebenprodukt anfallende N,N' -Dicyclohexyl-harnstoff (CXII) ist schwer löslich und leicht abzutrennen.

Cbo-c"BCHCOOH + RN=C=NR I R'

RN=C-NHR I o I c=o I CH-R'

I NH-Cbo

(CIX.)

(CVIII.)

Umlagerung

WegE

R' R' I I

WegA

o 11

o

R-N-C-NHR

I O=C

I CH-R'

I NH-Cbo

(CX.)

Cbo-NHCHCO-NHCHCOOR" + RNH-C-NHR

(ex!.) (eXI!.)

R = Carbodiimid-substituent. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Nach KHORANA (266) erfolgt als erste Stufe des Reaktionsverlaufs die Addition der Carboxylkomponente zum O-Acyllactim (CIX), das sich leicht durch Acylwanderung in ein N-Acyl-ureid (CX) umlagert. Nach

Fortschritte d. ehern. org. Naturst. XII!. 33

\Y. GRASSMA:-lN und E. WÜNSCH:

KENT (264) \vird dann (CX) aminolytisch zum Säureamid (CXI) und disubstituierten Harnstoff (CXII) gespalten (Weg A)*.

Nach Auffassung der Verfasser dürfte jedoch eine nucleophile Additionsreaktion der Aminoverbindung an das O-Acyl-Iactim (CIX), die letztlich zu den gleichen Endprodukten führt (Weg B), wahrschein­licher sein.

Die Vorteile dieser Peptidsynthese werden noch durch folgende Um­stände gesteigert (388): 1. Feuchtigkeit ist ohne Einfluß auf den Reak­tionsablauf; die Umsetzung läßt sich sogar in wasserhaltiger Lösung er­möglichen. z. Die Einbeziehung von Oxy-aminosäuren gelingt einwand­frei, ohne zusätzliche O-Schutzgruppen es. auch SHEEHAN und NIitarb. (386 a) J. 3. Racemisierung wurde selbst beim Aufbau von höheren Peptiden aus Carbobenzoxy-dipeptiden mit carboxyl-endständiger, optisch-aktiver Aminosäure nicht beobachtet.

I2. Cyclische "innermolekulare" Anhydride.

a) Die Carbonsäure-anhydride (Oxazolid-z,s-dione).

In Fortsetzung der FISCHERschen Arbeiten mit Carbäthoxy-amino­säuren fand LEucHs (282), daß sich Carbäthoxy-glycylchlorid (CXIII) beim Erwärmen unter Abspaltung von Chloräthyl (CXIV) zu Glycin­N-carbonsäure-anhydrid (CXV) zersetzt:

R' HN-- --CH-R' I I

R"CI + OC co ~~

R"O-C O-~HCHCOCl

(CXIII.) (CXIV.)

j(' = H. R" = Äthyl.

o (CXV.)

Bessere Ausbeuten wurden bei Verwendung der Carbomethoxy-ver­bindungen erhalten; schließlich erwiesen sich die Carbobenzoxy-amino­säurechloride als günstigstes Ausgangsmaterial (56). Auf diesem Wege wurden fast alle, auch die optisch-aktiven Aminosäuren, ohne Racemi­sierung in ihre N-Carbonsäureanhydride übergeführt (65, 26I, I67, I28, 33, 2I5) , wobei weitere funktionelle Gruppen geschützt sein müssen. Die leichter erfolgende Cyclisierung von Carboalkoxy-aminosäure-bromiden beschreiben BE~-IsHAI und KATCHALSKI (4I).

Einen zweiten wichtigen Weg zur Darstellung der Oxazoliddione be­schritt FucHs (I8I) durch direkte Einwirkung von Phosgen auf N-Phenyl-

* Ein ähnlicher Umsetzungsmechanismus energiereicher N-Diacyl-verbindungen - man denke an N-Acyl-diketopiperazine, sowie an die N(Im)-Acylimidazole könnte auch in vivo verlaufen.

------- ----- - --Synthese von Peptiden.

glycin. Diese direkte "Phosgenierung" hat eine englische Forschergruppe neuerdings auf N-unsubstituierte DL- und L-Aminosäuren übertragen und in zahlreichen Arbeiten [FARTHING, COLEMAN u. a. (9I, 288, I33, I32, I02, IOI) ] die günstigsten Reaktionsbedingungen (speziell in Dioxan und Tetrahydrofuran) ermittelt.

R' I

H2~CHCOOH COCl,

-2 HCI

HN--CH-R'

I

OC CO ""/ o R' = Aminosäure-Seitenkette.

BRUCKNER und Mitarb. (95), sowie BIRKOFER und KACHEL (73) konnten nach diesem Verfahren erstmals die N-Carbonsäureanhydride von ß-Aminosäuren gewinnen. Während im Falle des Asparaginsäure-lX­äthylesters der direkte Ringschluß gelang, erhielt BIRKOFER aus ß-Alanin als erstes Produkt eine N-Chloroformyl-ß-aminosäure, die schließlich unter Einwirkung tertiärer Basen das gewünschte Derivat lieferte. Weitere Darstellungsmethoden für Oxazoliddione stammen von CURTIUS (I2I) bzw. HURD und BUESS (245), die von der Umlagerung der "Halbazide" bzw. "Halbhydroxamsäuren" substituierter Malonsäuren (CXVI bzw. CXVII) Gebrauch machen:

COOH /

R-CH

" CO~3 (CXVl.)

COOH /

R-CH

/COOH

" N=CO

COOH /

R-CH R-CH

"" CO-)mOH

(CXVII.)

'" CO-NHO-COC6H s

R' I CH--NH

I OC co ""/ o

r /COOH

R-CH

"" CO-N-Na

i 0-COC 6Hs

R = R' = Aminosäure-Seitenkette.

Bereits LEUCHS und MANAssE (284) hatten die leichte aminolytische Aufspaltbarkeit des N-Carbonsäureanhydrids von N-Phenylglycin (CXVIII) festgestellt. Hierbei entsteht, wie auch FUCHS (I8I) später auf­zeigte, sogleich das Amid der substituierten Aminosäure (CXIX), da durch einen Basenüberschuß als Folgereaktion die N-Carboxylgruppe abge­spalten wird.

33*

516 \Y. GRASS~IA~N und E. \\'l:NSCH

CsH s-X---CH2

I

OC CO

""/ o (CXVIII.)

H.K-R ---- - ---+ (-)00C-N-CH 2CO-XH-R

I

CsHs

H,N-R ------.. CsH s-NHCH2CO-1\"H-R + R-1\"H-COot-)

(CXIX.)

R = Amino-substituent.

WESSELY und seine Schule (440, 394, 445) haben diese Reaktion am Phenylalanin-N-carbonsäureanhydrid näher untersucht. Dabei gelang ihnen erstmals die Synthese von Peptiden, als sie auf das genannte Oxa­zoliddion die Natriumsalze von Aminosäuren bzw. Peptiden in wäßriger Lösung einwirken ließen. Die aminolytische Aufspaltung mit Amino­säureestern beschrieben später HUNT und DU VIGNEAUD (243). Doch hat erst BAILEY (32, 33) einen die Nebenreaktionen ausschließenden Weg der Synthese aufgefunden: Die gleichzeitige Einwirkung von Aminosäureestern und tertiären Basen auf die "inneren Anhydride" (CXV) in indifferenten Lösungsmitteln bei tiefen Temperaturen (-ro bis -70°) liefert das carbaminsaure Salz eines Peptidesters (CXX). Bei 25-40° erfolgt thermische Spaltung in tertiäre Base, Kohlendioxyd und Peptide ster (CXXI); Behandeln mit zwei Äquivalenten alkoholischer Salzsäure liefert u. a. das Peptidester-hydrochlorid (CXXII).

R'

CH--- co

HN 0 ""/ C o

(CXV.)

R' I

H 2NCHCOOR"

N(R"'1 3

-c02 1-- ._. __ ._. R' R'

I ,

I N(R''')3 + H 2NCHCO-NHCHCOOR"

N(R"'la

(cxx!.)

R' R'

H1\"CHCO-1\"HCHCOOR"

i

COOH, N(R"'la

(cxX.)

12 HC! t -co,

R' R'

I I H 21\"CHCO-NHCHCOOR" + (R''')3N ,HCI

,HCI

(CXXII.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = RN! = Alkyl.

Als Verbesserung dieses Reaktionsweges schlagen LA:s'GENBECK und KRESSE (280) die Verwendung von Tribenzylamin als tertiäre Base vor, wegen der Schwerlöslichkeit des carbaminsauren Salzes. - Außer der

Synthese von Peptiden.

aminolytischen hatte LEUCHS auch die hydrolytische Spaltung der N-Carbonsäureanhydride untersucht. Es zeigte sich, daß zur völligen Hydrolyse unzureichende Mengen Wasser unter Kohlendioxyd-Ent­wicklung ein unlösliches, hochmolekulares Produkt ergeben (283). Seit den Arbeiten von K. H. MEYER u. a. (300) werden so gebildete Stoffe als echte Polypeptide angesehen (I6, 9I). WOODWARD und SCHRAMM (476) haben Polymere des Leucins und Phenylalanins erhalten, als sie deren Oxazolid­dione in gewöhnlichem Benzol aufbewahrten; hierbei leiten Spuren von Wasser mit der Aufspaltung des Ringsystems einiger Anhydrid-moleküle die Polymerisation ein.

R' I CH---CO

I I HN 0 "'/ co

(CXV.)

'R' I I I ,

CH-COOH

R'

I , I I

jNH2

R'

H20

I I

CHCO~NHCHCOOH

I

NH~COOH

R'

CH~COOH

I

~H~COOH

-c02

R' R'

-C02 I :

Ir'

CH~COOH

I

NH2

CHCO~NHCHCOOH usw.

NH2

R' = Aminosäure-Seitenkette.

Die Polymerisation gelingt auch leicht in Gegenwart tert. Basen [(26); betr. Mechanismus vgl. (452-455) J.

Als spezielle Polypeptide konnten so Poly-lysin (256, 257, 32I), Poly-ornithin und daraus Poly-arginin (260), Poly-glutaminsäure (2I5. 92. 32I. 94) und -glutamin (93). Poly-ß-asparaginsäure (95). Poly-N-ß-benzyl-asparagin (I70). Poly-serin (I66), sowie Poly-histidin (258). Poly-prolin (43) und Poly-tyrosin (259. 32I) synthetisiert werden. ~euerdings berichten KATCHALSK1 und Mitarb. (324) über die Darstellung des Poly-tryptophans. die aus dem N-Carbonsäureanhydrid bei 1500 und Hoch­vakuum unter Kohlendioxyd-Abspaltung gelang. Vernetzung zwischen iX-Carboxyl­und Indol-NH-Gruppen trat nicht ein.

Auch die Synthese unregelmäßig gemischter Polypeptide, z. B. von Lysin: Tyrosin (302, 32I), Lysin: Glutaminsäure (32I) und Glutamin­säure: Tyrosin (32I) wird neuerdings beschrieben.

In den letzten Jahren sind zahlreiche Arbeiten über den Mechanismus dieser Polykondensationsreaktion veröffentlicht worden [so auch KAT­CHALSKY (254)]. So zeigten WALEY und WATSON (436), daß die Poly­kondensation von N-Methyl-glycin-N-carbonsäureanhydrid (CXXIII) auch

5 18 \Y. GRASS~IANX und E. \YUNSCH:

durch geringe Mengen eines niedermolekularen Poly-sarkosin-diäthylamids (CXXIV) eingeleitet werden kann:

R'

(CXXIII.) (CXXI\'.I

1- co,

R'

/ H-(N-CH CO-) -N

2 n+I" /

R" (CXXIII.)

R"

R' = Methyl. R" = Äthyl.

US\\',

Analogen Gesetzmäßigkeiten gehorcht nach HEYNS und BROCKMANK (227a) die thermische Zersetzung der LEucHsschen Körper, wobei das gebildete Kohlendioxyd eindeutig vom N-Carboxyl stammt (Isotopen­methode) :

13 CH2-CO

, / , 0

/ NH-CO

Vakuum 13 -----.. Glycin-Polymeres--(C)

,-...., IIZo, -C02

SELA und BERGER (380) isolierten eine substituierte Hydantoinessig­säure (CXXV) vom Reaktionsgemisch einer thermischen Polymerisation; ähnliche Ergebnisse erzielten auch WESSELY und Mitarb. (443, 7I). Damit scheint festzustehen, daß das gemischte innermolekulare N-Carbonsäure­anhydrid (CXV), wenn auch nur im geringen Maße, neben dem vor­herrschenden Polarisationszustand (CXXVI) auch den entgegengesetzten (CXXVII) ausbilden kann. Mit Weg B ist stets ein Kettenabbruch des Systems verbunden.

Synthese von Peptiden.

R' 0 I / CH-C

" d­o d+/

NH-C ~ o

(CXXVII.)

I R' WegB I I 1 HoNCHCOOH

R' I CH-COOH I

HN-CO-NHCHCOOH

I R'

R' I CH-CO

I )0 NH-CO

(CXV.)

R' 0 I d+/ CH-C

'" d­o /

NH-C ~ o

(CXXVI.)

R' WegA' I

~ H,NCHCOOH

R' R' I I CHCO-~HCHCOOH

XH-COOH

5 19

II :; ?~~XVI.) Jn--I R'

CH-CO

~H-CO

R' I '" N-CHCOOH

/

(CXXV.)

R' R'

~HCO-(~HCHCO)n-OH

NH-COOH

R' = Aminosäure-Seitenkette.

BAMFORD und Mitarb. (35) konnten die Hydantoin-essigsäurebildung in teilweise erheblichen Prozentsätzen neben der von cyclischen Poly­peptiden ebenfalls feststellen, als sie N-Carbonsäureanhydride (CXVa) in N,N-Dialkyl-formamid mit in diesem Lösungsmittel löslichen anorgani­schen Salzen oder tertiären Basen behandelten. Sie legen folgenden Mechanismus, zugrunde:

CH2-CO

I " i 0 + Li<+) I /

CH2-CO

I "0 + H(+) I /

NH-CO N~~C-OLi

(CXVa,) (CXXVIII.)

CH 2-CO

~ I "/0 (CXV) + (CXXVIII) + H(+) , Li(+l

N--CO

I

CH2-C-OH + Li

I )0 NH-CO (CXXIX.)

"V. GRASSMANN und E. \VUNSCH:

Das zunächst gebildete N -Aminoacyl-N -carbonsäureanhydrid (CXXIX) reagiert mit weiteren Molekülen des Ausgangsmaterials (CXV) zu N-"Peptidyl"-oxazoliddionen (CXXX), bis zum Kettenabbruch durch innermolekularen Ringschluß, zum Cyclo-polypeptid (CXXXI) unter CO2-Abspaltung (Weg C); es erfolgt jedoch auch eine innermolekulare Umlagerung zum Hydantoinderivat (CXXXII) (Weg D):

U rnlagerung (CXXIX.)

I n(CXV.) t Wege

CH2~CO"

WegD

CH2~CO

I " . N~CH2COOH

/ NH--CO

(CXXXII.)

, 0 + nC02 I/-co, N--CO !

(OCCH2NH)n-COCH2NH2

(CXXX.)

(COCH 2NH)n + I

(CXXXI.)

Die gleichfalls diskutierte Möglichkeit, daß die Polykondensation der K -Carbon­säureanhydride über freie Radikale verlaufen könnte, wird ausgeschlossen durch einen Versuch von COLEMAN und FARTHING (ro2), bei dem Acrylester als Lösungs­mittel benutzt wurde. Eine Polymerisation des Acrylesters, die im Falle eines Radikal-Mechanismus zu erwarten wäre, trat dabei nicht ein.

Auch die Ringöffnung der Oxazoliddione mittels Alkohol- bzw. Mercaptan-Chlorwasserstoff zu Ester- (65) und Thioester-hydrochloriden (455) ist für die Peptid synthese eine Bereicherung (vgl. S. 475). In Über­tragung auf das Serin als Verbindung mit einer Alkohol-funktion gelang MOORE und Mitarb. (]09) die Synthese des O-Glycyl-L-Serins und daraus des tumor-hemmenden Antibioticums "Azaserin":

Cbo-NHCHCOOH + HN----CH2 Cbo-NHCHCOOH

I I I Hel I CH2

I O~COCH2NH2' HCI

OC CO ,,/ o

H 2NCHCOOH

1. H2/Pd I -------~

2. NaNO, CH2

O~COCHN2

Azasenn.

Cbo = Carbobenzoxy.

-------- --

Synthese von Peptiden. 521

b) Die Mercapto-thiazolone (Thio-thiazolidone).

In einer Reihe von Arbeiten berichten HEILBRON, COOK, LEVY und Mitarb. (Io3, I04) [vgl. auch die Zusammenfassung von HEILBRON (226)] über die Darstellung und Eigenschaften von Dithio-analoga der N-Carbon­säureanhydride, der "z-Mercapto-thiazolone" (CXXXIII).

o -I'

R'-CH-C

I ", NH NH2

I CSSH

R'-CH-CN I NH 2

cS2

R'-CH-~CO

H(+) 1 -I R'-CH-~C=NH

I I HN S

"'/ C S

(CXXXIII.)

-NH.

H 20

I I HN S "'/ C

S

R' = Aminosäure-Seitenkette.

(oder tautomere Formen)

Dieses heterocyclische Ringsystem unterliegt den Oxazoliddionen analogen Spaltungsreaktionen. Durch Einwirkung von primären und sekundären Aminen wird die -CO-S-Bindung unter Amidknüpfung ge­öffnet (72, I05, Io6, 27, 265). Mit Aminosäureestern in Gegenwart von Trialkylaminen bilden sich die Ammoniumsalze der Dipeptidester-N­dithiocarbaminsäure (CXXXIV), woraus nach Zugabe von zwei Äqui­valenten HCl die Peptidester-hydrochloride (CXXXV) resultieren (I07, I08).

R' I

(CXXXIII.) + H 2NCHCOOR"

R' 2 HCI I

N(R"'),

R' I I

R' R' I i CHCO-NHCHCOOR"

I NH-CSSH, N(R"')a

(CXXXIV.)

-cS2

CHCO-NHCHCOOR" + (R"')aN,HCl

NH2 , HCl

(cxxxv.) R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = R'" = Alkyl.

Die Peptidknüpfung kann auch mit den Natriumsalzen der Amino­säuren in wäßriger Lösung erfolgen. Der Vorzug der Thio-thiazolidone

522 \V. GRASSMANN und E. \VÜNSCH:

gegenüber ihren O-Analoga ist die viel größere Beständigkeit. Anderseits scheint die synthetische Verwendung auf die Darstellung von Glycyl­peptiden eingeschränkt werden zu müssen, da substituierte Mercapto­thiazolone, z. B. das Alanin-derivat, nach erfolgter Kupplung beim An­säuern unverändert zurückerhalten werden (I08) , ferner optisch wenig beständig sind und rasch racemisieren (I23). HOF~dAXX u. a. (23I) be­nutzen diese Thio-thiazolidone zur Darstellung der N-Aminoacyl-N'­carbobenzoxy-hydrazide (vgl. S.476).

c) Oxazolone und "Azlactone".

Schon frühzeitig berichteten MOHR und Mitarb. (306~308) über eine weitere Klasse zur Knüpfung der Amidbindung energiereicher Körper, den substituierten Oxazolonen (CXXXVI), die man als innere Anhydride der Lactimform (CXXXVII) acylierter Aminosäuren ansehen kann. Aus letzteren gelingt ihre Darstellung durch Wasserabspaltung mittels Essig­säureanhydrid, wobei WIELAXD (452) als Zwischenstufe ein unsym­metrisches Acetyl-anhydrid (CXXXVIII) annimmt. Auch der Weg über die Säurechloride (CXXXIX) hat in verschiedenen Variationen zum Er­folg geführt (253).

R'-CH--COOH

I :\H

" CO I I

Ar(Alk)

R'--CH-COOH

I j'\ OH '\/

C

Ar(Alk)

(CXXXVII.)

PCI,

R'-CH--COCl

I X OH '\/

C

Ar(Alk)

(CXXXIX.)

(CH3CO),ü t (CH3CÜ}20 --- - -- -----i t - HC)

o

R'-iH- C-OCOCHa

X OH \' /

C

Ar(Alk)

(CXXXVII!.)

-CH,COOH

R' ---CH -- CO

I ! N 0

'\. / C

Ar(Alk)

(CXXXV!.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. A y = Aryl. Alk = Alkyl.

O'BRIE:-< und NIEl'IIANN (3I9) führen diese Oxazolon-bildung auf eine durch \Vasserstoff-ionen katalysierte Cyclisierung der Acylaminosäuren zurück:

R'

CH-C

o /

'"

Synthese von Peptiden.

R' OH

(+J/ CH-- --C

-H,O

R' o /

CH--C

HX 0 OH I '" HN 0 OH I I

HN(+) 0

"'/ C

R

"'/ C

R

R' o /

CH---- C

I '" HN(+) OH OH

~/ C

R

~/ C

R

R'

CH--C

N 0 ~/

C

I R

(CXL.)

R = Aryl oder Alkyl. R' = Aminosäure-Seitenkette.

o /

Die substituierten Oxazolone - die MOHRsche Schule befaßte sich mit den von Benzoylaminosäuren abgeleiteten 2-Phenyl-derivaten -setzen sich leicht mit Aminen, Aminosäureestern und auch mit Natrium­salzen von Aminosäuren in wäßriger Lösung zu den entsprechenden Amiden um (28I):

R'-CH ---co R' R' R' ! I I

X 0 + " / C6H sCO-NHCHCO--NHCHCOOR"

C I C6H s R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl oder Natrium.

BERGMANN und Mitarb. (SI) bestätigten diese Ergebnisse an Hand der z-Methyl-oxazolone.

Einer völlig analogen Verwendung unterliegen natürlich die von ERLENMEYER jr. (I3I) entdeckten 4-Alkyliden-z-alkyl(-aryl-)-oxazolone (CXLI) , die "Azlactone". Die nach einer "Peptidkupplung" erhaltenen

R'

I N 0 H,NCHCOOR"

~/ C

I CHa

(CXL!.)

CsHsCH=C-CO-NHCHCOOR"

I I NH R' I COCHa

(CXLII.)

\Y. GRASSMA:-i:-/ und E. \Y(:~SCH:

C6H 5CH 2CHCO-:\HCHCOOR"

I H 2:\CHCO-:\HCHCOOH

I I H 2/Pt :'fH R R'

I

COCH3

(CXLlIl.) (CXLlV.)

R' = Aminosiwre-Seltenkette. R" = Alkyl.

Acyl-dehydropeptide (CXLII) lassen sich katalytisch zur gesättigten Ver­bindung (CXLIII) hydrieren; milde saure Hydrolyse soll zu den freien Peptiden (CXLIV) führen (SI, 48, 68).

Die Anwendung dieser Methode ist jedoch weitgehend einzuschränken, da 1. die Synthese optisch-aktiver Peptide ausgeschlossen ist, bis auf jene wenigen Fälle, bei denen die Acylpeptid-diastereomeren sich durch frak­tionierte Kristallisation trennen lassen; und da z. die verhältnismäßig schwere Abspaltbarkeit der Acylreste durch saure Hydrolyse zur Bildung von Diketopiperazinen und bei höheren Peptiden sicherlich zur Sprengung der -CO-NH-Bindungen führt.

d) N -Acyl-oxazolidone.

Beim Übertragen der genannten "Azlacton"-synthese auf Trifluor­acetyl-aminosäuren erhielten WEYGAND und Mitarb. (449, 450) aus TF A-glycin, Benzaldehyd, Trifluoressigsäureanhydrid und N atrium­trifluoracetat eine Verbindung, die sich schließlich als S-Oxo-z-phenyl-3-trifluoracetyl-oxazolidin (CXL V) erwies. Dieser Verbindungstyp ließ sich in siedendem Tetrahydrofuran leicht aminolytisch zum Säureamid aufspalten; mit Aminosäure-estern bzw. -amiden konnten in hervor­ragender Ausbeute die TFA-peptidester (CXL VI) bzw. -amide erhalten werden:

(CXLV.) RN = Alkyl.

e) Spezielle innermolekulare Anhydride.

BERGMA~N und ZERV AS (56) haben mit der Ringöffnung des Carbo­benzoxy-glutaminsäureanhydrids (CXLVII) eine klassische Synthese von Glutamyl- und Glutaminylpeptiden begründet. Ihre Wegweiser dürften PAULY und WEIR (325), sowie NICOLET (3I6) gewesen sein. Nach BERG­MANN und ZERVAS wird das Anhydrid (CXLVII) - aus der Acylamino-

Synthese von Peptiden.

dicarbonsäure beim Behandeln mit Acetanhydrid in der Wärme (56), besser bei Zimmertemperatur (337), erhalten - leicht aminolytisch auf­gespalten. Die Einwirkung von Ammoniak sollte eindeutig das (X-Amid (Carbobenzoxy-isoglutamin) (56) von Glycinester (20I, 6o), Glycyl­glycinester (6I) , Glutaminsäurediester (56) usw. stets Carbobenzoxy­a-glutamyl-peptide ergeben:

CH2 /~

CH2CH2COOH Acetanhydrid Cbo~NHCH CH2

I -------> I I Cbo~NHCHCOOH oc co "'/ o

(CXLVII.)

H,N-R

CH2CH2 COOH

I Cbo~NHCHCO~NH~R

H,/Pd

CH2 CH2COOH

I H2NCHCO~NH~R

Cbo = Carbobenzoxy. R = Amin-substituent. Ac = Acetyl.

Völlig analoge Verhältnisse sollten auch für die Asparaginsäure zu­treffen, deren Anhydrid (56, 66, 303) mit Ammoniak (56) und Amino­säureestern (20I, 60) (X-Amide lieferte, mit Ausnahme des Tyrosinesters, der zum ß-Peptid kuppelte (67). Im Gegensatz dazu beobachtete MELVILLE (299) nach NH3-Aufspaltung des Carbobenzoxy-glutaminsäure­anhydrids und folgender hydrogenolytischer Entfernung der Schutzgruppe neben Isoglutamin auch 14% Glutamin. BOOTHE und Mitarb. (38I) isolierten beide Tripeptid-isomeren beim Umsatz mit (X-Glutamyl­glutaminsäuretriester, und schließlich brachten die Arbeiten von LE QUESNE und YOUNG (337-339) bzw. SORM und RUDINGER (400) die Klarstellung : Die aminolytische Aufspaltung verläuft im Sinne der Bildung der (X- und y-Isomeren bei der Glutaminsäure, von (X- und ß-Iso­meren bei der Asparaginsäure, die sich als Carbobenzoxypeptide, auf Grund ihrer verschiedenen Acidität, mittels Alkali fraktioniert trennen lassen (250).

Ähnlich verläuft die Alkoholyse der "inneren Anhydride" der acy­lierten Glutamin- bzw. Asparaginsäure: (X- und y- bzw. ß-Ester entstehen jeweils nebeneinander; ihre Trennung erfolgt (337, I9I) durch fraktio­nierte alkalische Extraktion. Die rein erhaltenen Carbobenzoxy-amino­säureester sind das Ausgangsmaterial für die folgenden eindeutigen Peptid­synthesen der Glutamyl- und Asparagylreihe:

1. Überführung der freien Carboxylgruppe in das Säurechlorid (CXLVIII) und folgende FIScHER-Synthese (2I8, 274). HARINGTON und MEAD (2I7) bauten so erstmals das Glutathion auf (238). 2. Umsetzung der freien Carboxylgruppe zum Amid mittels der "gemischten Anhydrid-

526 \\". GRASS:vJA~N und E. 'VÜ:<fSCH: ====

methode" (354) oder mit "energiereichen Aminen" (z. B. Isocyanaten, Phosphorazo-körpern. u. dgl.) (I91). 3. Überführung der "Halbester" (CXLIXa und b) in die "Halbhydrazide" (CLa und b); diese werden nach CURTIUS über die Halbazide (CLI a und b) in ge\yünschtem Sinn umgesetzt (338, 225, 348). Neuerdings machen aber SACHS und BRAND (355) darauf aufmerksam, daß bei der Verwendung von Carbobenzoxy-glutaminsäure­y-azid zur Synthese yon y-Peptiden in folge innermolekularer Umlagerun­gen x- und y-Peptide nebeneinander entstehen (Formelübersicht 7).

1. OCN--R' 2. \'efseIfung

CH 2

Cbo-XHCH "CH2

CH2 CH2 COOH

I C/JO-XHCHCOOR"

(CXLlXa.)

1 SOCl2

CH2CH2COCl

I Cbo-~HCHCOOR"

(CXLVIIl.)

11. H 2N-R' ~ 2. Verselfung

!

co CO " /'

o (CXLVII.)

,R"OH -~

CH2 CH2COO RU

I Cbo-XHCHCOOH

(CXUXb.)

I l H 2NNH 2, H 20

CH2CH2 CONH:N"Hz I

Cbo-XHCHCOOH

(CLb)

! HNO ~ 2

CH2CH2CO-:N"H-H' CH2 CH 2 COX3

I I Cbo-~HCHCOOH CI,o-·-KHCHCOOH

y-Denvat (CUb.)

Cllo = Carbobenzoxy. R' = Amin-substituent 11" = c\lkyl.

Formelubersicht 7.

Die "Verwendung der N-Phthalyl-schutzgruppe bedingt bei der amino­lytischen Aufspaltung der Anhydride die bevorzugte Bildung von y-Glutamyl-amiden und -peptiden bzw. den ß-Analoga bei der Asparagin­säure (272, 268, 269). Jedoch soll nach TANENBAUM (410) bei letzteren das Lösungsmittel eine Rolle spielen. Auch die Alkoholyse ergibt hier beim Asparaginderivat (X- und ß-Ester nebeneinander (270) [vgI. auch ~ -Tosylasparaginsäure-anhyclricl (81) J.

Synthese von Peptiden.

Interessant ist die Aufspaltung von N-Acyl-glutaminsäureanhydrid mit Thiophenol, die beim Phthalylderivat eindeutig zum y-S-Phenylester führt, bei der Carbobenzoxyverbindung hingegen von der zugesetzten tertiären Base gelenkt wird - von Pyridin zu 70% in tX-, von Triäthyl­amin zu 80% in y-Stellung (453, 470).

H. Energiereiche "N-Derivate" der Aminosäureester.

I. N -C arbonyl-aminosäureester (tX-I socyanat-jettsäureester ).

Isocyansäureester (CLII) setzen sich mit Carbonsäuren unter Bildung von substituierten Säureamiden (CLIII) um; dabei wird CO2 frei. Diese Reaktion verläuft über gemischte Anhydride (CLIV) , die zuerst von STAUDINGER vermutet wurden (402) und später auch isoliert werden konnten (]II, 3IO, ]28):

-co, R-COOH + O=C=N-R' ~ R-CO-O-CO-NH-R' --> R-CO-NH-R'

(CLI!.) (CLlV.) (CLIII.)

R = Carbonsäure-substituent. R' = Isocyanat-substituent.

Die Darstellung der erforderlichen Isocyanatfettsäureester durch Einwirkung von Phosgen auf Aminosäureester ist lange bekannt (I83, 240, 24I, 309a), doch hat erstmals SIEFKEN (392) den Carbonyl-glycinester als einfachsten Vertreter dieser Klasse in reiner Form in den Händen gehabt.

GOLDSCHMIDT und WICK (I97) berichten über die Verwendung dieser energiereichen Ester zu Peptidsynthesen. Sie haben (I98) eine große Anzahl bislang unbekannter, teils optisch-aktiver Carbonyl-aminosäure­ester (CLV) hergestellt und ihre Umsetzung mit Carbobenzoxy- bzw. Phthalylaminosäuren (-peptiden) beschrieben. Die Ausbeuten sind her­vorragend.

Die Gewinnung von Carbonyl-peptidestern schlug fehl; es entstanden in intra­molekularer Reaktion der zuerst gebildeten Isocyanate (CLVI) Hydantoin-derivate (CLVII):

R' R' I I

H 2NCHCO-NHCHCOOR" COCl,

--->-

- N-CH-R'

1' i , I

OC CO /

NH i CH-R'

1

COOR"

(CLV!.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

HN--CH-R' 1 I

OC CO "'-/

N

CH-R'

COOR"

(CLVII.)

Die Nachteile dieser sonst erfolgreichen Methode sind: 1. die große Wasserempfindlichkeit; jede Spur Feuchtigkeit bedingt vor der Peptid-

528 \V. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

============================

knüpfung die Bildung von Harnstoffderivaten, deren Abtrennung nicht immer gelingt (478). 2. Acyl-oxyaminosäuren geben Urethane (CLVIII), Acylglutamin bzw. -asparagin N-Acyl-harnstoffe (CLIX) (478):

Ac-:~"HCHCOOH R' Ac-NHCHCOOH R'

I I I I CH20H + O=C=K-CHCOOR" --> CH 20-CO-XHCH

I COOR"

(CLV.) (CLVIII.)

Ac-NHCHCOOH Ac-?\HCHCOOH

R' R'

CO-NH2 + O=C=N-CH CO-KH-CO-NHCH

!

COOR" COOR" (CLV.) (CLIX.)

R' = Aminosäure-SeItenkette. R" = Alkyl.

3. Die Einbeziehung von Carbonyl-asparaginsäure- bzw. -glutamin­säureester in die Peptidsynthese (Umsetzung mit Carbobenzoxyamino­säuren) führt zur Bildung von Carbonyl-bis-aminoderivaten der Amino­dicarbonsäureester, die sich leicht aus dem Reaktionsgemisch isolieren lassen (478). Es dürfte hier, wie schon NAEGELI (3IO) beim Phenyliso­cyan at gezeigt hat, als Konkurrenzreaktion zur Säureamidbildung eine Disproportionierung des gemischten Anhydrid-zwischenproduktes (CLIV) zu einem disubstituierten Harnstoff (CLX) und einem Kohlensäure­bisanhydrid (CLXI) verlaufen; letzteres geht unter CO2-Abspaltung spontan in das symmetrische Anhydrid der Ausgangssäure über (CLXII) :

2 R-CO-O-CO-XH-R'

(CLIV.)

R'-NH-CO-NH-R' + R-CO-O-CO-O-CO-R

(CLX.) (CLXI.)

i-co, (CLXII.) R-CO-O-CO-R

R = Carbonsäure-substituent. R' = Isocyanat-substituent.

Zu diesem Reaktionsverlauf vgl. FRY (I8o).

2. Phosphatamide.

Nach GOLDSCHMIDT und OBERMEIER (r96) gibt auch die Phosphor­säure einige energiereiche, substituierte Amide, die sich mit Carbonsäuren

Synthese von Peptiden.

zu Carbonsäureamiden umsetzen lassen. Interessant ist, daß tri-substi­tuierte Phosphatamide (Monoamiddialkyl-, Diamid-monoalkyl-, Tris­amid-derivate) nur unter sehr energischen Bedingungen, etwa in der Schmelze bei 200-220°, aber mit guten Ausbeuten mit Carbonsäuren reagieren. Diese Reaktionsträgheit der Monoamid-diester der Phosphor­säure erlaubt sogar ihre Verwendung als Aminoschutzgruppe (vgl. S. 468). Erfolgversprechender sind die disubstituierten Verbindungen, wie Mono­amido-monoester bzw. Diamido-derivate, die sich aus den entsprechenden chlorierten Produkten durch Verseifen leicht herstellen lassen. Für Peptidsynthesen eignen sich wegen der Zugänglichkeit nur die Phosphat­diamide (CLXIII). Allerdings muß in der Folge 50% Verlust an Aus­gangsmaterial in Kauf genommen werden, da die Hälfte als Salz der Metaphosphorsäure (CLXIV) zurückerhalten wird.

R' R' R' R' R' I POCl. I 0 OH- ! 0 I

2 CH-)<H2 CH-NH-P-~H-CH CH-NH--P-NHCH

I I I I I I COOR" COOR" Cl COOR" COOR" OH

(CLXIII.)

COOR"

R' I

Ac-NHCHCOOH

R' I

R' R' I

----------? Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + CH-NH 2 , HPOa I COOR"

(CLXIV.)

Ac = Acyl. R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

Die Monoamido-phosphorsäuren (CL XV) sind unbeständig; zwei Moleküle disproportionieren sich wie folgt:

OH 0/

2 C6H s-NH-P ~

OH (CLXV.)

Versuche der Umsetzung mit Carbonsäuren verliefen negativ, was im Hinblick auf oben stehenden Reaktionsmechanismus der Diamido-phosphorsäuren verständlich ist.

3. N-Phosphorigsäure-derivate (Phosphitamide, -imide und Phosphorazo­körper)*.

Die auf S. 5c4 beschriebenen Dialkyl-chlorophosphite (CLXVI) er­wiesen sich nicht nur als Anhydridbildner, sondern auch als Ausgangs-

* Eine ausgezeichnete Zusammenstellung über energiereiche N-Derivate des drei- und fünfbindigen Phosphors geben GOLDSCHMIDT und KRAUSS (I93).

Fortschritte d. Chern. org. Naturst. XIII. 34

530 \Y. GRASS~IANN und E. \YUNSCH:

R' R"O OR"

R'

.-1c-~HCHCOOH + ~ / P-O-p

/ " R"O OR"

R'

/ .4c-~HCHCO-O-P

~

(CLXXII.)

(CLXX.)

OR" R"O

OR" R"O

t + H 2NCHCOOR'" I

R'

R'

R'

"

P-NHCHCOOR'" /

(CLXX!.)

AcNHCHCOOH -- -

I i R' ~ v

R"O OR" Ac-NHCHCO R' R'

~ ~ + P-O-p

/ " R"O OR"

~ o

~ Ac-)l'HCHCO

Ac-NHCHCO-NHCHCOOR'"

(CLXXIII.)

(CLXXI.)

+ R'

, H 2NCHC00R'" I

R'

R' R'

." c-NHCHCO-:0;HCHCOOR'"

(CLXXIII.)

+

R"O

R"O

+

~ P-OH

/

(CLXIX.)

Ac-l\HCHCOOH .-------.- -.-.--------

R'

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Äthyl. R'" = Alkyl.

Formelübersicht 8.

material zur Darstellung der "Phosphitamide" (CLXVII), einer weiteren Form einer aktivierten Aminogruppe, die über einen zur Peptidknüpfung erforderlichen Energiezustand verfügt (2I, 20). Sie bilden stabile, teils destillierbare Öle. Beim Umsatz mit N-Acylaminosäuren z. B. in Diäthyl­phosphit als Lösungsmittel werden die entsprechenden Amide (CLXVIII) in ausgezeichneter Ausbeute erhalten; als Nebenprodukt entsteht Dialkyl­phosphit (CLXIX) :

Synthese von Peptiden.

R'O R'

'" I P-CI + H 2NCHCOOR" / R ln,

(CLXVI.)

R' I

Ac-NHCHCOOH

R' I

R' I '" P-NHCHCOOR"

/ R ,n,

(CLXVII.)

R'

/ Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + HO-P

'" R'II

R no

(CLXVIII.) (CLXIX.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Alkyl.

-0 R'" = R"" = Äthoxy; oder RIII-R"" = )C6H4 (o)

-0

53 1

Das oben Gesagte gilt gleichfalls für Tetraäthylpyrophosphit (CLXX). Es reagiert einmal mit der Carboxylgruppe zu einem gemischten An­hydrid (CLXXII) (vgl. S.505), zum zweiten mit einer freien Amino­gruppe unter Phosphit amid-bildung (CLXX) (Formelübersicht 8). Dies gab ANDERSON und Mitarb. (I9) die Möglichkeit der Ausarbeitung einer "Standard-methode", da in einer Mischung von Acylaminosäure, Amino­säureester und Tetraäthylpyrophosphit in einem inerten Lösungsmittel (Diäthylphosphit) alle Haupt- und Nebenreaktionen über verschiedene Zwischenstufen zu dem Acylpeptidester (CLXXIII) führen. Diese Methode ist in letzter Zeit erfolgreich zur Synthese von Oxytocin und Vasopressin (43I, 427, 76) sowie L-Arginyl-L-leucin (I8) angewandt worden; für die primären Säureamid- bzw. Guanidogruppen war keine Maskierung erforderlich.

GOLDSCHMIDT und OBERMEIER (I96) beschreiben die Umsetzung von Aminosäureestern mit Alkyldichlorophosphit (CLXXIV) in Toluol. Je nach stöchiometrischem Verhältnis der beiden Komponenten lassen sich zwei mögliche Zwischenprodukte diskutieren:

Molverhältnis 3: I

R'

COOR"

(CLXXIV.)

R' R' I

CH-N<>- P-ORIII + 2 CHNH2, HCI ! !

COOR"

(CLXXV.)

COOR"

R' = Aminosäure-Seitenkette. Rn = R III = Alkyl.

Solche N-substituierte Imido-phosphorigsäureester (CLXXV) setzen sich mit Carbonsäuren zu Säureamiden um. Mit Acylaminosäuren ent­stehen Acyl-peptidester in sehr guter Ausbeute:

34*

532 \V. GRASS MANN und E. WÜNSCH:

R'

(CLXXV) + Ac-:\'HCHCOOH

R' R'

Ac-NHCHCO-NHCHCOOR" + l/x(O=P-OR"')x

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = R'" = Alkyl. Ac = Acyl.

Molverhältnis 4: I

R'

4 CHNH2 + CI 2POR'"

I COOR"

R' OR'" R' I

R'

CHNH-P-KHCH + 2 CHXH2 .HCI

COOR"

(CLXX\'I.)

i

COOR" COOR"

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = R'" = Alkyl.

Es wäre gemäß obigen Reaktionsverlaufs ein substituierter Diamido­phosphorigsäureester (CLXXVI) zu erwarten, der mit zwei Molekülen einer Carbonsäure unter Amidbildung reagieren sollte (Weg A, s. unten). Letzeres geschieht auch in der Tat. Da GOLDSCHMIDT und ÜBERMEIER

vergeblich versuchten, den Halbester (CLXXVII) nachzuweisen - stets wurden nur Phosphorigsäure und Phenol aufgefunden -, ferner da das Zwischenprodukt der Umsetzung (Molverhältnis 4: I) mit Wasser eine

Cl /

R"'O-P

'" CI

R' - 2 HCl

+ 2 H 2NCHCOOR" ----+ R"'O·-·P

1-- --(Weg BI - R'''OH

R' R'

R' I

NHCHCOOR"

'" ~ NHCHCOOR"

I R'

(CLXX\·I.)

, 2 R-·COOH (Weg AI

R'

R"OOCCHN ~ P-NHCHCOOR"

(CLXXIX.)

2 R-CO-NHCHCOOR"

12 R-COOH

R'

2 R--CO-NHCHCOOR" + 1/x(HP02 )x

+

R'''O-P

OH /

'" OH

(CLXXVII )

R = Carbonsäure-substItuent. R' = Ammosäure-Seitenkette. R" = Alkyl. R'" = Phenyl.

Synthese von Peptiden. 533

substituierte Diamido-phosphorigsäure (CLXXVIII) ergab, kommen sie zu dem Schluß, daß der zuerst gebildete Diamido-ester (CLXXVI) sofort unter Abspaltung von Phenol in eine "Phosphorazo-verbindung" (CLXXIX) übergeht. Diese reagiert wie üblich mit zwei Molekülen einer Carbonsäure.

Aromatische "Phosphorazo-verbindungen" wurden erstmals von MICHAELIS und SCHROETER (30I) beschrieben, als sie Anilin mit Phos­phortrichlorid zu einem "Phosphorazo-chlorid" (CLXXX) umsetzten, das mit einem weiteren Molekül Anilin Phenyl-phosphorazo-anilid (CLXXXI) lieferte:

H,N-C,H. CaH.-NH2 + PCla ~ CaHsN ~ P-C, ..... CsHs-N ~ P-NH-CßH.

(CLXXX.) (CLXXXI.)*

GRIMMEL und Mitarb. (2I3) gelang es, CLXXXI leicht rein herzu­stellen, als sie fünf Mol eines primären Amins mit einem Mol Phosphor­trichlorid umsetzten. Als definierte Verbindung konnte u. a. N-Phenyl­phosphorazo-anilid erhalten werden. Auf gleiche Art haben GOLD­SCHMIDT und LAUTENSCHLAGER (I90, I9S) verfahren.

Als Verbesserung führten sie zunächst den Umsatz mit nur zwei Mol Amin, ein Mol Phosphortrichlorid und zur Bindung des freiwerdenden Chlorwasserstoffs zu­sätzlichen drei Mol eines tertiären Amins aus; bei der Heranziehung von wasser­freiern Pyridin als Lösungsmittel erübrigte sich schließlich auch das tertiäre Amin, ja es erwies sich als möglich, als Ausgangsmaterial die leichter herzustellenden und zu handhabenden Hydrochloride der Aminkomponente anzuwenden:

3 R-NH, - 5 HCl 2 R-NH2 + PCla ' R-N ~ P-NH-R <---- 2 R-NH + PCI

oder 3 N(R"), (Pyridin) 2 a (CLXXXII.)

R = Amin-substituent. R" = Alkyl.

Die Reaktionsfähigkeit solcher Phosphorazokörper (CLXXXII) ist groß. Wasser wird sofort zu einem "Hydrat" angelagert - von MICHAELIS (30I) als Anilinsalz der Phenylimido-phosphorigen Säure (CLXXXIV) beschrieben -, das im Falle des Anilin-abkömmlings von GRIMMEL u. a. (2I3) kristallin gefaßt wurde und von GOLDSCHMIDT als Di-anilido-phosphorigsäure (CLXXXIIIa oder b) formuliert wird. Diese Verbindung (CLXXXIII) unterliegt (leicht bei Gegenwart von Mineral­säuren) weiterer hydrolytischer Spaltung zu zwei Molekülen Amin und phosphoriger Säure. Mit organischen Carbonsäuren dagegen erfolgt in

* Der Einfachheit halber wird die nebenstehende zunächst von GOLDSCHMIDT und ÜBERMEIER (I96) bevor­zugte Schreibweise beibehalten, obgleich nach den neue­sten Ergebnissen von GOLDSCHMIDT und KRAUSS (I94) die Phosphorazoverbindung in dimerer Form vorliegt.

R-NH

'" P-NH-R /

R-N

'" P=N-R

534 \Y. GRASSMAXX und E. \\"CXSCH;

der Wärme "Amidknüpfung", ebenfalls unter Abscheidung von phos­phoriger Säure, während die ursprünglichen Phosphorazo-yerbindungen (CLXXXII) bei analogem LJmsatz als Kebenprodukt metaphosphorige Säure liefern:

R-N~P-OH

,H2N-R

(CLXXXIV.)

H,O H,O

R-N~P-:\"H-R 2 R'-COOH

-'/x(HPO,)x (CLXXXII.)

2 H,O R-~H 0

"'y P

"'''' R-NH H (CLXXXIIIb.)

z R'-CO-NH-R

"

'" R-NH

P-OH

(CLXXXIIla.)

R = Amin-substituent. R' = Carbonsäure-substituent.

GOLDSCHMIDT und LAUTEN SCHLAGER (I9S) haben diese Reaktion auf die Ausgangsmaterialien der Peptidsynthese übertragen, also auf Amino­säure- bzw. Peptidester und Acylaminosäure bzw. -peptid. Nach fol­gendem Schema wurden hierbei Acylpeptidester mit hervorragender Aus­beute erhalten (I9S, 2°3, 208), im Gegensatz zu der Mitteilung von ANDERsoN u. a. (20). GOLDSCHMIDT und JUTZ (I9I) gelang u. a. eine verbesserte Glutathionsynthese.

R' R' R' PCl,

Z CHNH2 ---> CHX ~ P-KHCH I

CO-R"

-3HCI

CO-R"

R' R' R'

AC-NHbHCO-R" i I

CO_R"

-> Ac-(NHCHCO)n-NHCHCOOR'" + nj", (HP02)",

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = -O-Alkyl oder -NHCHCOORNI

R"' = Alkyl. Ac = Acyl. R'

Als besondere Vorzüge der Phosphorazo-methode seien genannt: 1. Geringer experimenteller Aufwand. 2. Hohe Ausbeuten bei praktisch stöchiometrischen Einsatz der Komponenten. 3. Anwendbarkeit auch auf Peptidester. 4. Direkte Anwendung der Esterhydrochloride. 5. Geringe Feuchtigkeit nach erfolgter Bildung der Phosphorazokörper ist ohne Einfluß auf die Pp-ptidknüpfung. Von großer Bedeutung ist es ferner, daß auch sekundare Amine mit Phosphortrichlorid "energiereiche" Reaktionsprodukte (CLXXXV) geben, die sich mit organischen Carbon­säuren zu Säureamiden umsetzen lassen (r96):

---- ------------Synthese von Peptiden.

R' I

P(NCsH1o)a + 3 CSHlON.HCl (CLXXXV.)

R' I

535

(CLXXXV) + 3 Ac-NHCHCOOH ---> 3 Ac-NHCHCO-NCsH10 + HaPOa

R' = Aminosäure-Seitenkette.

Als Nachteile der Phosphorazo-methode wurden bekannt: 1. Bei der Umsetzung mit Carbobenzoxypeptiden mit carboxyl-endständiger optisch­aktiver Aminosäure tritt im Gegensatz zu den Feststellungen von GOLD­SCHMIDT und Mitarb. (I93, I92) teilweise Racemisierung ein (208). 2. Der Einsatz von Carbobenzoxy-oxyaminosäuren als "Kopfpartner" der Phosphorazo-methode verläuft unbefriedigend. Bei dem neben geringen Mengen an Carbobenzoxy-(oxyaminosäure)-peptidester er­haltenen bicarbonatIäslichen Rohprodukt dürfte es sich (204) um ein Gemisch eines Phosphorigsäureester-derivats der acylierten Oxyarnino­säure (CLXXXVI) bzw. eines entsprechenden Peptids (CLXXXVIII) handeln, die ihren Ursprung in einer Anlagerung der Phosphorazo-grup­pierung an die freie Hydroxylgruppe (CLXXXVI) haben (vgl. dagegen die Ausführungen von GOLDSCHMIDT und OBERMEIER; S.532).

R-NH-P-NH-R

I

OH ° I 1---I-I R-N <-- P-NH-R 1 I

~ /-COOH

N I

Cbo

HO-P-OH I o

1---1 \ )-COOH

N I

Cbo

(CLXXXVII.)

----~

'" r COOH N

(CLXXIX)

+

Cbo

(CLXXXVI.)

HO-P-OH 1

° i-I \ /-CO-NH-R

N

I

Cbo

(CLXXXVIII.)

Cbo = Carbobenzoxy. R = -CH2COOC2Hs'

Gleichfalls über eine Synthese mit Hilfe von Phosphortrichlorid be­richtet Süss (406). Ob hierbei Phosphorazo-körper oder Phosphorigsäure­triamide die energetisch wichtigen Zwischenprodukte sind, ist ungeklärt.

--------- ------

W. GRASSMANN und E. WÜNSCH:

4. Arsenitamide.

In völliger Analogie zu den Phosphorigsäure-derivaten vereinigen sich auch Diäthyl-chloro-arsenit (CLXXXIX) und Aminosäureester zu energiereichen Amiden (CXC) , wobei der freiwerdende Chlorwasserstoff an tertiäre Basen gebunden wird (4I5). Die Umsetzung mit Acylamino­säuren erfolgt, wie aus folgendem Schema ersichtlich, zu den in guter Ausbeute erhältlichen Acylpeptidestern (vgl. auch S. 5(,6).

R' R"O R"O I

'" '" Ac-NHCHCOOH As-Cl + H 2NCHCOOR'" --> As-NHCHCOOR'" ----- --->

R"O/ ~, R"O/~, (CLXXXIX.) (CXC.)

R' R' I I

--> Ac--NHCHCO-NHCHCOOR'" + R"O

'" H.O /As-OH ----.. As20 a

R"O

R' = Aminosäure-Seitenkette. R" = Äthyl. R'" = Alkyl. Ac = Acyl.

J. Spezielle Umlagerungsreaktionen.

I. Symmetrische N-Trijluoracetyl-aminosäureanhydride.

WEYGAND und REIHER (450) konnten die interessante Feststellung machen, daß sich aus symmetrischen N-TFA-aminosäureanhydriden (CXCI) beim Behandeln mit Dicyclohexylamin in Alkohol TFA-peptide und Trifluoressigsäureester bilden. Sie führen diese Reaktion auf einen induktiven Effekt der CF3-Gruppe zurück, wodurch der Imidwasserstoff zur Salzbildung mit dem Amin befähigt wird. Nunmehr erfolgt intra­molekulare Umlagerung mit der in räumlicher Nachbarschaft stehenden C=O-gruppe der zweiten Anhydridhälfte zum Ammoniumsalz einer

o /'" CFaCO-NHCH2CO CO

I NH-CH2

I co I CFa

(CXCI.)

CF aCO-NHCH2CO

HN(C,Hu ). I ------> N-CH2COO-

I

(CXCII.)

(CXClIl.) (CXCIV.)

Synthese von Peptiden. 537

N,N'-Diacyl-aminosäure (CXCII), das schließlich alkoholytisch zum TF A-dipeptid-dicyc1ohexylaminsalz (CXCIII) und Trifluoressigester (CXCIV) gespalten wird. (Diese Synthese ist von Racemisierung be­gleitet.)

2. O-(IX-Aminoacyl)-salicylsäuren bzw. -amide.

Ein neues Prinzip zum Aufbau von Peptidketten erblicken BRENNER und Mitarb. (87) in ihren Beobachtungen über eigenartige Umlagerungs­reaktionen von O-(IX-Aminoacyl)-salicylsäuren (CXCVa) bzw. -amiden (CXCVb) in N-Salicylyl-aminosäuren (CXCVla) bzw. -amide (CXCVlb) unter dem Einfluß von Hydroxylionen:

R' I

OOCCHNHi x­~~/

lJ~ CO-NH-R

(CXCVa.)

OH ~\/ I 11 R' '\/~ I

CO-NHCHCO-NH-R

(CXCVlb.)

R' = Aminosäure-Seitenkette. R = Amid-substituent.

BRENNER (87) gelang so die Darstellung von Salicylylglycyl-phenyl­alanyl-glycinmethylester.

Die Übertragung dieser Methodik auf Serin, Threonin bzw. Cystein an Stelle der Salicylsäure hatte keinen Erfolg [vgl. dazu die intramolekularen Umlagerungs­reaktionen von S-Aminoacyl-cystein (S. 490) und O-Acyl-serin (50, 309) in N-Acyl­aminosäuren J.

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(Eingelaufen am 20. M arz I956.)