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Gerichtete Evolution als Methode zur Erzeugung
enantioselektiver Cyclohexanonmonooxygenasen (CHMOs)
für die Katalyse von Baeyer-Villiger-Reaktionen
DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der
Fakultät Chemie der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Diplom-Chemiker
Toni Schneider aus Frankenberg/Eder
Mülheim an der Ruhr
2004
Referrent: Professor Dr. M. T. Reetz
Korrefferent: Professor Dr. M. Feigel
Tag der mündlichen Prüfung:
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von April 2001 bis Oktober 2004 unter der Leitung
von Professor Dr. M. T. Reetz am Max-Planck-Institut für Kohlenforschung in Mülheim an
der Ruhr angefertigt.
Herrn Professor Dr. Manfred T. Reetz danke ich sehr herzlich für die interessante
Themenstellung, die Möglichkeit selbständig und interdisziplinär unter hervorragenden
Bedingungen zu arbeiten, die gewährte Freiheit bei der Bearbeitung des Themas sowie jede
erdenkliche Unterstützung.
Ich danke Herrn Professor Dr. Martin Feigel für die Übernahme des Korreferats und Herrn
Professor Dr. W. S. Sheldrick für sein Auftreten als Drittprüfer.
Allen Mitgliedern des Arbeitskreises danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre, die
Hilfsbereitschaft, die Zusammenarbeit und die gemeinschaftlichen Unternehmungen
außerhalb des Instituts.
Frau Brunner und Herrn Hermes gilt mein Dank für die hervorragende Zusammenarbeit.
Frau Professor Margaret M. Kayser gilt ebenfalls mein Dank für das zur Verfügung gestellte
Expressionssystem.
Der GC-Abteilung und hier insbesondere Frau Ruthe, Herrn Kohler und Frau Rosentreter,
möchte ich für die Unterstützung in gaschromatographischen Angelegenheiten danken.
Für das Korrekturlesen dieser Arbeit sowie hilfreiche und kritische Kommentare bedanke ich
mich herzlich bei meinen Kollegen Frank Schulz und Dr. Frank Hollmann.
Frau Rathofer und Frau Enk möchte ich für die vielen organisatorischen Hilfestellungen
danken.
Bei meinen Bürokollegen Katrin Freitag, Andreas Meiswinkel, Claudia Torre, Andreas
Pletsch und Frank Schulz bedanke ich mich für die angenehme Atmosphäre während der
Arbeit.
Meinen Laborkollegen Dominique Moulin, Claudia Torre, Andreas Meiswinkel, Petra
Wedemann und Franck Daligault danke ich für die ausgezeichnete Atmosphäre im Labor.
Schließlich möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, dass sie mir die Ausbildung
ermöglicht und mich immer unterstützt haben.
Teile der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht:
„Directed evolution as a method to create enantioselective cyclohexanone monooxygenases
for catalysis in Baeyer-Villiger reactions”
M. T. Reetz, B. Brunner, T. Schneider, F. Schulz, C. M. Clouthier, M. M. Kayser, Angew
Chem Int Edit 2004, 43, 4075.
Für meine Eltern
Inhaltsverzeichnis I
1 BIOKATALYSE UND GERICHTETE EVOLUTION 1
2 INDUSTRIELLE BIOTRANSFORMATIONEN 4
3 GRUNDLAGEN DER BIOKATALYSE 15
3.1 Vor-und Nachteile von Biokatalysatoren 15
3.1.1 Vorteile von Biokatalysatoren 15
3.1.2 Nachteile von Biokatalysatoren 17
3.2 Biokatalyse mit isolierten Enzymen oder ganzen Zellen 18
3.2.1 Vor-und Nachteile der Verwendung isolierter Enzyme 18
3.2.2 Vor-und Nachteile der Verwendung ganzer Zellen 19
3.3 Mechanistische Aspekte der Biokatalyse 20
3.3.1 Schlüssel-Schloß-Modell 20
3.3.2 Induced-Fit –Modell 20
3.3.3 Desolvatations Theorie 21
3.3.4 Kinetische Gründe für die Enzym-Selektivität 22
4 KLASSIFIZIERUNG DER BIOKATALYSATOREN 24
4.1 Cofaktoren 25
5 OXYGENASEN[78-81] 26
5.1 Dioxygenasen 26
5.2 Monooxygenasen 27
6 MONOOXYGENASE KATALYSIERTE BAEYER-VILLIGER- OXIDATIONEN 29
6.1 Baeyer-Villiger Oxidation 29
6.2 Baeyer-Villiger-Monooxygenasen 30
6.2.1 Mechanismus von BVMOs 33
6.2.2 Cofaktor Regenerierung 35
6.3 Cyclohexanonmonooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter sp NCIMB 9871 38
7 GENEXPRESSION 41
Inhaltsverzeichnis II
7.1 Klonierung 41
7.2 Expressionssystem der Cyclohexanonmonooxygenase 43
8 GERICHTETE EVOLUTION VON ENZYMEN 44
8.1 Wozu gerichtete Evolution ? 44
8.2 Evolution im Labor 45
8.2.1 Erweiterung der natürlichen Diversität 45
8.2.2 Auswahl einer Evolutionsstrategie 46
9 MUTAGENESEMETHODEN 50
9.1 PCR 50
9.1.1 Geschichte 50
9.1.2 PCR in der Praxis 51
9.1.3 Primer 52
9.1.4 Ablauf 52
9.2 Fehlerhafte PCR 54
9.3 Randomisierte Oligonucleotid-Mutagenese 54
9.4 Ortsgerichtete Mutagenese 55
9.5 Sättigungsmutagenese 55
9.6 Kassettenmutagenese 55
9.7 DNA-Shuffling 55
9.8 Staggered Extension Process (StEP) 56
9.9 Anwendung der gerichteten Evolution von funktionellen Enzymen 58
10 HODURCHSATZSCREENING-SYSTEME AUF ENANTIOSELEKTIVITÄT 59
10.1 UV/VIS-basierende Assays 59
10.2 Enzymgekoppelte-Assays 62
10.2.1 Enzym-Immuno-Assay 62
10.3 Fluoreszenz-basierende Assays 63
10.4 MS-basierende Assays 65
Inhaltsverzeichnis III
10.5 NMR-basierende Assays 66
10.6 Kapillarelektrophorese-basierendes Assay 67
10.7 Circulardichroismus-basierendes Assay 67
10.8 IR-Thermographie-basierendes Assay 68
11 AUFGABENSTELLUNG 70
12 ASSAYENTWICKLUNG 71
12.1 Darstellung der Modellsubstrate 71
12.1.1 Modellsubstrat: 4-Hydroxycyclohexanon 71
12.1.2 Modellsubstrat: 4-Methoxycyclohexanon 73
12.2 Darstellung der racemischen Produkte 73
12.3 Modellreaktionen 74
12.4 Ausarbeitung der Reaktionsbedingungen 75
12.4.1 Umsetzung der Substrate im Erlenmeyerkolben 77
12.4.2 Übertragung der Reaktionsbedingungen auf deep-well Platten 79
12.5 Bestimmung des Extraktionsfaktors 84
12.5.1 Versuchsreihe 1 84
12.5.2 Versuchsreihe 2 86
12.5.3 Versuchsreihe 3 87
13 SEMIAUTOMATISIERTER SCREENING-PROZESS 88
13.1 Anzucht der Kolonien 88
13.2 Anlegen der Gefrier- und Hauptkulturen 89
13.3 Reaktion 90
13.4 Aufarbeitung 90
13.5 Analyse der enzymatischen Umsetzungen – Screening 90
13.5.1 Mitteldurchsatz-Screening System nach KÜHLING 91
13.5.2 Neues Hochdurchsatz-GC-Screening-System 92
13.5.3 Kapillartrennsäule zur Auftrennung der 5-Ring- Lactonenantiomeren 94
13.5.4 Kapillartrennsäule zur Auftrennung der Enantiomeren von 5-Methoxy-2-oxepanon 96
Inhaltsverzeichnis IV
14 ERGEBNISSE AUS DER EVOLVIERUNG VON CHMO AUF DIE BEIDEN MODELLSUBSTRATE 97
14.1 Ergebnisse zum Modellsubstrat 4-Hydroxycyclohexanon 97
14.1.1 Enzymvarianten der ersten Generation 97
14.1.2 Enzymvarianten der zweiten Generation 99
14.1.3 Sättigungsmutagenesen 102
14.1.4 Darstellung der Einzelmutanten durch ortsgerichtete Mutagenese 108
14.2 Screening auf 4-Methoxycyclohexanon 110
15 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 113
16 EXPERIMENTELLER TEIL 115
16.1 Allgemeine experimentelle Bedingungen 115
16.1.1 Verwendete Lösemittel und Chemikalien 115
16.1.2 Verbrauchsmaterialien 116
16.1.3 Verwendetes Enzym und Expressionssystem 116
16.1.4 Vewendete Medien 117
16.1.5 Agarplatten 118
16.1.6 Stammhaltung 118
16.1.7 Anzucht der Bakterienkulturen in LB-Medium 119
16.1.8 Screening-Assay 119
16.1.9 Analytische Methoden 121
16.2 Darstellung literaturbekannter Verbindungen 122
16.2.1 Synthese von 4-Hydroxycyclohexanon 122
16.2.2 Synthese von 4-Methoxycyclohexanon 125
Stufe 3: Darstellung von 4-Methoxycyclohexanon[274] 126
16.2.3 Synthese von 5-(2-Hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on 127
16.2.4 Synthese von 5-Methoxy-2-oxepanon 128
16.2.5 (5-Oxo-tetrahydro-furan-2-yl)-acetaldehyd[280] 129
17 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 130 17.1.1 Laborausrüstung 130
17.1.2 Stämme 131
17.1.3 Plasmide 131
17.1.4 Kommerzielle Kits 131
17.1.5 Puffer- und Reagenzlösungen 132
17.1.6 Medien 132
17.1.7 Reagenzien für die Agarosegel-Elektrophorese 133
Inhaltsverzeichnis V
17.1.8 Reagentien für die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) 134
17.1.9 Lösungen für die DNA Aufreinigung 135
17.2 Reagenzien für die Polymerasekettenreaktion (PCR) 136
17.3 Kultivierung von E. coli Stämmen 139
17.4 DNA-Preparation 139
17.4.1 Mini-Plasmidpreparation 139
17.4.2 Maxi Plasmidpreparation 139
17.5 DNA-Aufreinigung 139
17.5.1 DNA-Fällung 139
17.5.2 PCR-Aufreinigung 140
17.5.3 DNA-Aufreinigung aus dem Agarosegel 140
17.5.4 Gelextraktion 140
17.5.5 Freeze ′N Squeeze Technik 140
17.6 DNA-Modifikationen 141
17.6.1 Restriktionsverdauung 141
17.6.2 Ligation 142
17.6.3 Chemisch kompetente Zellen 142
17.6.4 Transformationsprotokoll 143
17.7 DNA-Seqenzierung 143
17.8 Agarosegel-Elektrophorese 145
17.8.1 SDS-PAGE 146
17.8.2 Protein-Assay 146
17.8.3 Sterilisation 146
18 LITERATUR 147
19 ANHANG 156
Verzeichnis der Abkürzungen VI
Abb. Abbildung MS Massenspektrometrie
Äquiv. Äquivalente NaBH4 Natriumborhydrid
ATP Adenosintriphosphat NaH Natriumhydrid
br breit NAD Nicotinadenindinucleotid
B.-V. Baeyer-Villiger NMR Nuclear Magnetic Resonance
BVMO Baeyer-Villiger-Monooxygenase OD Optische Dichte
Cb Carbenicillin PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
CD Circulardichroismus PCR Polymerase Chain Reaction
d Dublett p-TsOH para-Toluolsulfonsäure
Da Dalton (Molekulargewicht) q Quartett
DC Dünnschichtchromatographie rpm routes per minute
DNA Desoxyribonucleinsäure RT Raumtemperatur
DNaseI Desoxyribonuclease I s Singulett
dNTP Desoxyribonucleotid-Triphosphat SDS Natriumdodecylsulfat
δ chemische Verschiebung StEP Staggered Extension Process
ee Enantiomerenüberschuss t Triplett
E. coli Escherichia coli Tab. Tabelle
epPCR error-prone PCR TAE Tris-Acetat-EDTA
FAD Flavinadenindinucleotid TBE Tris-Borsäure-EDTA
FMN Flavinmononucleotid THF Tetrahydrofuran
g Gramm Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan
GC Gaschromatographie U Unit (1 U = Umsatz von
G6P Glucose-6-Phosphat 1 µmol Substat pro Minute)
HTS High-Throughput -Screening UV ultraviolett
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid Wt Wildtyp
IR Infrarot
J Kopplungskonstante
l Liter
LB Luria-Bertani Medium
m Multiplett
M Molar
MeI Methyliodid
min Minute(n)
Einleitung 1
Einleitung
1 Biokatalyse und gerichtete Evolution Biokatalyse wird in zunehmenden Maße als wettbewerbsfähige Technologie für die
Produktion von Feinchemikalien, Pharmazeutika und Agrochemikalien angesehen. Die
Anzahl an industriellen Biotransformationen verdoppelt sich nahezu alle zehn Jahre.[1]
Anfänglich waren erfolgreiche Anwendungen in der Biokatalyse weitgehend auf
hydrolytische Enzyme, wie Lipasen, Esterasen, Acylasen und Hydantoinasen beschränkt.[2]
Eine höhere Bandbreite an Reaktionen ergab die Erschließung neuer Enzyme für asymetrische
Reduktionen, Oxidationen und Kohlenstoff-Kohlenstoff Verknüpfungen.[3-6] Die Attraktivität
von Enzymen beruht auf ihren hohen Umsätzen und ihrem hohen Maß an Selektivität. Als
limitierender Faktor galt bisher die Verfügbarkeit von Enzymen insbesondere in
benutzerfreundlicher Form. Durch heterologe Genexpression fremder Gene in
nichtpathogenen und gut charakterisierten Organismen wie E. coli kann diese Limitierung als
überwunden angesehen werden.
Wildtypenzyme besitzen oft eine ungewünschte Substratspezifität, zu geringe Stabilität oder
unzureichende Selektivität als dass sie für eine kostenintensive Produktion einer
Feinchemikalie oder eines Zwischenproduktes für ein Pharmakon in Frage kämen. In diesem
Fall hat sich die gerichtete Evolution als mächtiges Werkzeug zur Anpassung natürlicher
Katalysatoren an industrielle Anforderungen erwiesen.[7-11] Mitte der 90er Jahre wurden durch
die Arbeiten von Arnold[12] (sequentielle Zufallsmutagenese) und Stemmer[13] (DNA-
Shuffling) wirkungsvolle Werkzeuge zur Generierung von Mutationen entwickelt. Dies trug
im beträchtlichen Maße dazu bei, dass die gerichtete Evolution zur Modifizierung von
Enzymen für Anwendungen in der Biokatalyse auf eine breite Akzeptanz stieß. Die gerichtete
Evolution kann als Äquivalent zu den kombinatorischen Methoden in der organischen
Synthese zur Leitstrukturidentifikation und Optimierung neuer Therapeutika gesehen werden.
Darüberhinaus kombiniert sie zwei Methoden (Abb. 1). Die einzelnen Schritte sind (a) die
Generierung zufällig erzeugter Genbibliotheken und (b) die Selektion oder das Screening von
Enzymvarianten, welche spezifische Merkmale wie erhöhte katalytische Aktivität, verbesserte
Selektivität oder verbesserte Stabilität, besitzen.[14] Da mehrere Zyklen durchlaufen werden,
die einen „evolutionären Druck“ ausüben, hat die Methode einen darwinistischen Charakter.
Die hohe Anzahl von Enzymvarianten wird entweder über eine in vivo-Selektion
(108-1010 Varianten) oder über eine in vitro-Detektion (105-106 Varianten) der Kolonien auf
Agarplatten unter Benutzung der Bildung von fluoreszierenden oder kolorimetrischen
Einleitung 2
Produkten evaluiert. Alternativ können einzelne Klone beispielsweise in einer 96er-well
Mikrotiterplatte auf Aktivität analysiert werden. Obwohl der Durchsatz hierbei eingeschränkt
ist (103-104 Varianten) liegen die Vorteile in der quantitativen Bestimmung der Aktivität,
inklusive der Möglichkeit zur Automatisierung des Screening-Prozesses.
( n
E
(
AG
D
p
F
2
D
b
s
W
a) Generierung der Mutantenbibliotheke
Transformation
in Bakterium m
lterliches Genb) Evaluierung der Biblio
108 −1010 Varianten
bb. 1: Strategien zur genbibliotheken. (b) zeig
ie Produktion vo
harmazeutische Ind
einchemikalien, Pha
000 überstieg der V
ollar.[16] Die Erforde
iologische Anregun
omit passend zur A
irkstoffe wird auch
Zufalls- utagenese
× 106 −1010 Varianten
theken
Kolooder
105 −
erichteten Evolutt Strategien zur S
n enantiomeren
ustrie von w
rmazeutika, Agr
erkauf an chira
rnis nach chiral
g auf chiralen
symmetrie des
durch die Reg
Mutanten-Bibliothek
Rekombination
Screening
Selektion metrie, FluoreszensChemolumineszens106 Varianten1
V
Analyse
ion von Enzymen. (a) beschreibt die Herstellung deelektion von Enzymvarianten auf.[15]
reinen Verbindungen ist für die chemi
achsender Bedeutung. Der Weltmarkt fü
ochemikalien und Duftstoffen wächst rapide a
len Medikamenten die Grenze von 100 Mill
en Medikamenten ergibt sich aus der Tatsache
Wirkstoffen beruht. Ein effizientes Medikam
Rezeptors sein. Die Einführung enantiom
ularien der amerikanischen und europäischen
03 −104
arianten
Biotransformation mit ganzen Zellen
r varianten
sche und
r chirale
n. Im Jahr
iarden US
, dass eine
ent muss
erenreiner
Behörden
Einleitung 3
für medizinische Produkte zunehmend gefordert. Außerdem ist seit 1992 vorgeschrieben, dass
die physiologische Wirkung jedes Enantiomers eines Pharmawirkstoffes einzeln
charakterisiert werden muss. Die Umstellung auf enantiomerenreine Wirkstoffe wird seit
1997 durch verkürzte Zulassungszeiten von den amerikanischen Behörden belohnt. Neben
den geringeren Dosierungen und besserer Wirksamkeit ist auch eine Verlängerung der
Patentlaufzeiten eine Triebfeder für Pharmafirmen, von einem racemischen Wirkstoff auf die
enantiomerenreine Form umzustellen.
Die wachsenden Anforderungen für die Synthese optisch aktiver Verbindungen lassen sich
auf mehrerlei Art und Weise angehen. Es können chirale Übergangsmetallkatalysatoren[17-20],
Organokatalysatoren[21], katalytische Antikörper[22] und Enzyme.[23-26] eingesetzt werden.
Durch ein umfangreiches Screening können enantioselektive Enzyme gefunden werden.[27] In
den meisten Fällen ist die Enantioselektivität eines gegeben Enzyms für die gewünschte
Reaktion jedoch nicht hoch genug. An diesem Punkt angelangt kann nun die
Stereoselektivität durch ortsgerichtete Mutagenese[26, 28], welche auf theoretischen
Überlegungen beruht, gesteigert werden. Aufgrund der strukturellen Komplexität der Enzyme
ist die Zahl der erfolgreichen Beispiele begrenzt. Deshalb bedient man sich des eingangs
erwähnten Prinzips der gerichteten Evolution, welches weder das Wissen um die Struktur des
Enzyms noch dessen Mechanismus erfordert.[29-31]
Industrielle Biotransformationen 4
2 Industrielle Biotransformationen
In der Geschichte der Menschheit spielten Mikroorganismen immer schon eine große soziale
und wirtschaftliche Rolle. Ohne sich ihrer Bewusst zu sein benutzte man sie in der Produktion
von Nahrungsmitteln und Getränken. Sumerer und Babylonier praktizierten das Bierbrauen
schon 6000 Jahre vor Christus[32]. Erste Hinweise zum Keltern von Wein finden sich in den
Büchern der Generer und die Benutzung von Hefe zum Brotbacken wurde von den Ägyptern
erkannt[32]. Das Wissen um die Produktion von Chemikalien, wie Alkohole und organischer
Säuren, durch Fermentation allerdings ist noch relativ jung. Die ersten Veröffentlichungen
erschienen in der zweiten Hälfte des 19ten Jahrhunderts. Milchsäure ist wohl die erste optisch
aktive Verbindung, die industriell unter Fermentation hergestellt wurde. 1880 ging die erste
Anlage in den USA in Produktion[33].
Im Laufe der Zeit entdeckte man, dass Mikroorganismen in der Lage sind, bestimmte
chemische Verbindungen in einfachen chemischen Reaktionen, welche auch durch Enzyme
katalysiert werden, umzusetzen. Heutzutage nennt man diese Prozesse Biotransformationen.
Die Essigsäure-Herstellung, welche um 2000 vor Christus datiert, ist wahrscheinlich die
älteste und bekannteste mikrobielle Oxidation. Molekularer Sauerstoff wird mittels
Hefebakterien aktiviert und oxidiert Ethanol zu Essigsäure (Abb. 2). Auch heute noch wird
Essigsäure über die Fermentation von Ethanol enthaltenen Lösungen mittels
Essigsäurebakterien hergestellt[34].
OHOH
OBiokatalysator+ H2O+O2
Abb. 2: Biotransformation von Ethanol zu Essigsäure unter Einwirkung von Sauerstoff.
Industrielle Biotransformationen 5
Ein Verfahren zur Herstellung von (R)-1-Phenyl-2-methylaminopropan-1-ol (D-(-)-Ephedrin),
welches 1932 von der Knoll AG als Patent angemeldet wurde, geht auf eine Entdeckung von
Neuberg und Hirsch zurück. Sie beobachteten im Jahr 1921 die hefekatalysierte Kondensation
von Benzaldehyd mit Brenztraubensäure zu (R)-1-Hydroxy-1-phenyl-2-propanon [35].
O
OH
O
O O
OHPyruvat Decarboxylase
-CO2
+
OH
HN
NH2CH3
Pt-Kat. / Al / H2
Abb. 3: Chemoenzymatische Produktion von D-Ephedrin.
Weitere chemische Modifikation durch eine enantioselektiven reduktive Aminierung mit
Methylamin führte zum (D-(-)-Ephedrin) [36]. Dies ist ein weit verbreitetes Medikament und
findet als Antihistaminikum in der Therapie von Asthma-, Bronchitis, Husten sowie
Kreislaufschwäche Verwendung.
Industrielle Biotransformationen 6
Im Jahr 1953 berichteten PETERSON et al. die mikrobielle Umsetzung von Progesteron zu
11α-Hydroxyprogesteron (Abb. 4)[37], welches als Intermediat in der Cortison Synthese dient.
Diese Entdeckung vereinfachte die vielstufige Synthese von Corticosteroid-Hormonen und
deren Derivate. Dadurch fiel der Gesamtpreis für 1g Cortison von $ 200 auf $ 6.
O
O
O
O
HO
O
O
HO OH
O
O
HO OHOH
Rhizopus arrhizus
Progesteron 11α-Hydroxyprogesteron
Cortisol Cortison
O2
Abb. 4:Cortisonsynthese mit mikrobiellen Teilschritt.
Industrielle Biotransformationen 7
Nitrilasen und Nitrilhydratasen setzen organische Cyanide spezifisch zu den entsprechenden
Carbonsäuren und Ammoniak, beziehungsweise zu den entsprechenden Amiden um. Beide
Gruppen sind relevant in der pharmazeutischen und der Agrochemie. [38]
Die Umwandlung von Acrylnitril zu Acrylamid durch eine Nitrilhydratase ist ein prominentes
Beispiel der biokatalytischen Produktion einer wichtigen Grundchemikalie. Der Bedarf an
Acrylamid beläuft sich auf 200.000 Tonnen pro Jahr. In der konventionellen Synthese werden
Kupfersalze zur katalytischen Hydrierung von Nitrilen eingesetzt. Die Nachteile der
chemischen Synthese sind die schwierige Herstellung des Katalysators, die Regenerierung
desselben und die Abtrennung und Aufreinigung des Acrylamids. Die enzymatische
Umsetzung mit einer Nitrilhydratase läuft quantitativ. Die milden Bedingungen des
enzymatischen Prozesses wirken der leichten Polymerisierbarkeit von Acrylamid entgegen
und sind weitaus ökonomischer. Zudem weist das enzymatisch hergestellte Acrylamid eine
höhere Reinheit auf, was die Herstellung von höher molekularen Polyacrylamiden erlaubt.
CNNH2
O
Nitrilhydratase
Acrylnitril Acrylamid
H2O
Abb. 5: Nitrilhydratase katalysierte Umwandlung von Acrylnitril in Acrylamid.
Der industrielle Prozess wird im 20 Kilojahrestonnen Maßstab von Mitsubishi Rayon Co., Ltd
(Tokyo, Japan) geführt. Als Biokatalysator, dient der von Nitto Chemical Industries
optimierte Rhodococcus rhodochrous J1. [39-41]
DuPont entwickelte einen komerziellen Prozess für die Umwandlung von 2-Methylglutarnitril
(MGN), einem Nebenprodukt aus der Produktion von Adiponitril (ADN, Ausgangsstoff für
Nylon-6,6), zu 1,5-dimethyl-2-piperidon (1,5-DMPD, XolovoneTM). Der erste
Reaktionsschritt ist die regioselektive Hydrolyse von MGN zum Ammoniumsalz von
4-Cyanopentanonsäure (4-CPA). Bewerkstelligt wird die Hydrolyse durch den
Industrielle Biotransformationen 8
mikrobiologischen Zellkatalysator Acidovorax facilis 72 W, welcher eine Nitrilase enthält.[42-
44] Das 4-CPA Ammoniumsalz wird in einem zweiten Schritt durch katalytische Hydrierung
in Gegenwart von Methylamin zum 1,5-DMPD umgesetzt.
CN
CN
CN
CO2-NH4
+
NCH3
OH2O CH3NH2
A. facilis72 W
Pd/CH2
MGN 4-CPA 1,5-DMPD
Abb. 6: Einsatz eines Nitrilase aktiven Zellkatalysators zur Synthese von 1,5-DMPD.
5-Cyanovaleriansäureamid (5-CVAM) ist ein Startmaterial für die Synthese eines DuPont
Herbizids, Azafenidin (Milestone®). Die chemische Darstellung ist schwierig und führt zu
einem hohen Anteil an dem Nebenprodukt Adipinsäureamid (ADAM). Pseudomonas
chlororaphis B23 mit Nitrilhydrataseaktivität erwies sich als geeigneter regioselektiver
Katalysator für die Produktion von 5-CVAM (Abb. 7).[45, 46] Die B23 Zellen wurden zur
Stabilisierung des Enzyms und zur leichteren Rückgewinnung und Wiedereinsatz in Calcium
Alignat immobilisiert.
CCN
NC
CN
O
NH2
CC
O
NH2
O
H2N
H2O
H2O
ADN
5-CVAM
ADAM
Abb. 7: Einsatz eines Nitrilhydratase aktiven Zellkatalysators für die Synthese von 5-CVAM.
Die Entdeckung von Penicillin G aus Penicillium notatum durch Fleming im Jahre 1929
revolutionierte die Chemotherapie gegen pathogene Mikroorganismen. Heutzutage sind β-
Industrielle Biotransformationen 9
Lactame als Antibiotika, wie das Penicillin und das Cephalosporin weit verbreitet. Die
meisten β-Lactam Antibiotika werden aus 6-Aminopenicillinsäure (6-APA), 7-
Aminocephalosporinsäure (7-ACA) und 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure (7-ADCA)
hergestellt. Die Herstellung erfolgt entweder durch chemische oder durch enzymatische
Deacylierung, welche mittels immobilisierte Penicillin Amidase von Penicillin G oder V seit
1973 durchgeführt wird (Abb. 8).[47]
HN
N
S
RO
COOH
O
OHH2N
N
S
OCOOH
+
PenicillinAcylase
H2O
Abb. 8:Enzymatische Synthese von 6-Aminopenicillinsäure ( 6-APA).
Durch die enzymatische Reaktion erübrigen sich viele chemische Teilschritte. Zudem entfällt
der Gebrauch von organischen Lösungsmitteln und die Notwendigkeit der Reaktionsführung
bei niedriger Temperatur und wasserfreien Bedingungen. All dies macht den Prozess
kostengünstiger, einfacher und umweltfreundlicher als sein chemisches Pendant.
Industrielle Biotransformationen 10
Einer Kooperation von Toyo Jozo (Japan) und Asahi Chemical (Japan) gelang 1979 die
industrielle Produktion von 7-Aminocephalosporinsäure (7-ACA)[48]. Die Synthese geht von
Cephalosporin aus und läuft über einen chemoenzymatischen zweistufigen Prozess (Abb. 9).
HOOCHN
N
S
O
COOH
O
OO
NH2
HOHN
N
S
O
COOH
O
OO
O
HO
OO
OH
H2N
N
S
O
COOH OO
Cephalosporin C
Glutaryl-7-ACA
7-ACA
Glutarylamidase-
+ H2O2- CO2- NH3
Abb. 9: Produktion von 7-ACA aus Cephalosporin.
Die Freisetzung von Glutarsäure im enzymatischen Prozess führt zu einer Erniedrigung des
pH-Wertes und inhibiert so die Glutaryl-7-ACA Amidase, was die Reaktionsgeschwindigkeit
herabsenkt. Eine genaue Kontrolle des pH-Wertes ist also erforderlich. Für die industrielle 7-
ACA-Produktion wurde ein recirculierender Bioreaktor mit immobilisierter Glutaryl-7-ACA
Amidase und automatischen pH-Regler entwickelt. Über 90 Tonnen von 7-ACA werden so
jährlich produziert.
Industrielle Biotransformationen 11
Lipase-katalysierte Racematspaltungen werden für die industrielle Produktion von chiralen
Carboxylsäuren (Abb. 10) angewendet. Die Firma Tanabe aus Japan stellt so trans-(2R, 3S)-
p-Methoxyphenylglycidinsäure her[49].
O
OO
O
O
OO
O
O
OOH
O
+Lipase
H2O-MeOH
Abb. 10: Lipase katalysierte Racematspaltung von p-Methoxyphenylglycidinsäure.
Die BASF setzt Lipasen für die Herstellung chiraler Amine (z. B. (S)-Phenylethylamin) im
industriellen Maßstab ein (Abb. 11).[50]
NH2
OO
ONH2
HNO
O
++Lipase
Abb. 11: Lipase katalysierte Racematspaltung von Phenylethylamin.
Da bei einer kinetischen Racematspaltung die Ausbeute maximal 50 % ist, wurden
verschiedene Lösungen zur Ausbeuteerhöhung entwickelt. Unter Ihnen die dynamisch
kinetische Racematspaltung durch in situ Racemisierung.[51, 52] Ein interessantes Beispiel für
eine dynamisch kinetische Racematspaltung ist das von der Degussa entwickelte
Hydantoinase-Verfahren zur Darstellung natürlicher und nicht natürlich vorkommender
Industrielle Biotransformationen 12
enantiomerenreiner Aminosäuren (Abb. 12). Diese spielen eine wichtige Rolle in der
Pharmaindustrie. Sie kommen in Infusionslösungen und als chirale Bausteine für
pharmazeutische Wirkstoffe zum Einsatz. Zahlreiche Antibiotika, Herzpräparate und
Krebsmittel enthalten Aminosäuren oder auf Aminosäuren basierende Bausteine. Das
enzymatische Verfahren erlaubt es, eine Vielzahl von D- und L-Aminosäuren aus leicht
zugänglichen Vorprodukten, den Hydantoinen, mit einer nahezu quantitativen Ausbeute
kostengünstig herzustellen. Die D,L-Hydantoine werden in einem Schritt mit Hilfe der
entsprechenden Hydantoinase und noch zwei weiteren Enzymen in die enantiomeren L- oder
D-Aminosäuren umgewandelt. [53, 54]
HNNH
O
R
O
HNNH
O
O
R
HNNH2
COOH
O
R
NH2
COOHR
D,L-Hydantoin
N-Carbamoyl-L-Aminosäure
L-Carbamoylase
L-Hydantoinase
Racemase
L-Aminosäure+ CO2+ NH3
H2O
H2O
H H
H
H
Abb. 12: Hydantoinaseverfahren zur Darstellung enantiomerenreiner D- und L- Aminosäuren.
Industrielle Biotransformationen 13
Eine weitere effiziente Methode wurde in der enantiokonvergenten Produktion des
synthetischen Pyretroid Insektizids ((S)-4-hydroxy-3-methyl-2-prop-2-ynyl-cyclopent-2-
enon) (Abb. 13) angewendet.[55] Die Lipase katalysierte kinetische Racematspaltung erfolgt
durch Hydrolyse des acylierten (S)-Enantiomers. Durch Methansulfonylchlorid erfolgt eine
sofortige Sulfonierung des Alkohols in Gegenwart der acylierten Verbindung. Der
entscheidende Punkt ist nun, dass die Hydrolyse des sulfonierten Enantiomers in der
Gegenwart kleiner Mengen von Calciumcarbonat unter Inversion und die Hydrolyse des
acylierten Enantiomers unter Retention am chiralen Zentrum erfolgt.
O
OAc
OO
OAc
H
OH
HLipase
(R)
(S)
O
O
OAc
H
OSO2CH3
H O
OH
H
+
CH3SO2Cl CaCO3
Abb. 13: Chemoenzymatische enantiokonvergente Synthese eines Pyretroid Insektizids.
Industrielle Biotransformationen 14
Die komplexe chemische Synthese von Kohlenhydraten macht diese Verbindungen zu idealen
Zielen der Biokatalyse. Eine aufwendige Schutzgruppentechnik ist nicht erforderlich und eine
regioselektive Reaktion kann relativ leicht mit einem geeigneten Biokatalysator durchgeführt
werden. Ein wichtiges industrielles Beispiel hierfür ist die Aldolase katalysierte Synthese von
Neuraminsäure (Abb. 14).[56] Es handelt sich hiebei um einen Precursor von Zanamivir,
welches als Wirkstoff gegen Influenza eingesetzt wird.
O
OAcHN
HO
OH
OH
OH
OH
NHAc
HO
HO
HO
COOH
O Aldolase+
COOH
OH
Abb. 14: Aldolase katalysierte Darstellung von Neuraminsäure.
Grundlagen der Biokatalyse 15
3 Grundlagen der Biokatalyse
3.1 Vor-und Nachteile von Biokatalysatoren
3.1.1 Vorteile von Biokatalysatoren
Hohe Katalysatoraktivität
Enzyme sind im Vergleich zu chemischen Katalysatoren weitaus effizienter. Sie vermögen
Reaktionsprozessen um den Faktor 108-1012 zu bescheunigen, was weit über das hinausgeht,
was mit chemischen Katalysatoren erreicht werden kann[57]. So werden chemische
Katalysatoren in einem Molverhältnis zum Substrat von 1/1000 bis 1/100 eingesetzt, während
Biokatalysatoren in einem Molverhältniss von 1/10000 bis 1/1000 verwendet werden.
Aktivität unter milden Bedingungen
Enzyme arbeiten vorzugsweise in wässrigen Medien bei pH 5-9 und in einem
Temperaturbereich von 20-40 °C. Ungewünschte Nebenreaktionen wie Zersetzung,
Isomerisierung, Racemisierung und Umlagerung können aufgrund dieser milden
Reaktionsbedingungen oftmals verhindert werden.
Kompatibilität der Enzyme untereinander
Im Allgemeinen arbeiten Enzyme optimal unter ähnlichen Reaktionsbedingungen (siehe
oben). Wegen dieser Kompatibilität lassen sich mehrere Enzyme in situ zu einer
Reaktionskaskade kombinieren. Reaktionsprozesse werden so vereinfacht, wenn z.B. die
Isolierung eines instabilen Zwischenproduktes vermieden werden kann. Desweiteren kann
durch nachfolgende enzymatische Schritte ein unvorteilhaftes Gleichgewicht zu dem
gewünschten Produkt verschoben werden.
Grundlagen der Biokatalyse 16
Enzyme katalysieren ein breites Spektrum an Reaktionen
Wie alle Katalysatoren beschleunigen Enzyme eine Reaktion, sie haben jedoch keinen
Einfluss auf die Lage des thermodynamischen Gleichgewichts. So können prinzipiell einige
enzymkatalysierte Reaktionen in beide Richtungen ablaufen (z.B. bei Lipasen: Esterbildung
und -Hydrolyse). Zu vielen organischen Reaktion gibt es ein enzymatisches Gegenstück.[58]
Weiterhin gibt es auch Biokatalysatoren, welche Reaktionen ausführen, die chemisch nicht zu
bewerkstelligen sind. Zu nennen wäre da die selektive Funktionalisierung nichtaktivierter
Positionen, wie z.B. die schon eingangs erwähnte Hydroxylierungsreaktion von Progesteron
in der 11α-Position durch Rhizopus arrhizus.
Chemoselektivität
In der komplexen Umgebung eines Organismus ist es erforderlich, dass ein Enzym mit einer
bestimmten funktionellen Gruppe eines Substrates reagiert ohne andere Funktionalitäten
anzugreifen. Dies ist bei chemischen Reaktionen nicht immer gegeben. Enzymreaktionen
laufen, im Gegensatz zu chemischen Reaktionen, meist ohne die Bildung von
Nebenprodukten ab. Eine mühevolle Aufreinigung des Produktes von den Nebenprodukten
entfällt somit größtenteils.
Regio- und Diastereoselektivität
Enzyme sind aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur in der Lage zwischen unterschiedlich
lokalisierten funktionellen Gruppen eines Substrates zu unterscheiden.
Enantioselektivität
Enzyme bestehen aus chiralen Bausteinen, den Aminosäuren und sind daher selbst chiral.[59]
Daher wird Chiralität im Substratmolekül bei der Bildung eines Enzym-Substrat Komplexes
erkannt. So werden prochirale Substrate über eine Desymmetrisierung in optisch aktive
Produkte umgewandelt und zwei Enantiomere eines racemischen Substrates reagieren
gewöhnlich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in einer kinetischen
Racematspaltung.[60]
Nahezu alle wichtigen biochemischen Ereignisse, werden durch Enzyme geregelt. Viele von
ihnen haben eine Substratspezififät, häufig wird nur ein Enantiomer einer chiralen
Grundlagen der Biokatalyse 17
Verbindung erkannt. So verwundert es nicht, dass die Enantiomere einer gegebenen
bioaktiven Verbindung unterschiedliche Effekte verursachen.[61] Ein wohl bekanntes und
zugleich tragisches Beispiel ist das Arzneimittel Thalidomid (Contergan), welches in den 60er
Jahren als Racemat zugelassen wurde. Zu dieser Zeit war nicht bekannt, dass der sedative
Effekt auf dem (R)-Enantiomer beruht und dass das (S)-Enantiomer hoch teratogen ist.[62]
3.1.2 Nachteile von Biokatalysatoren
Limitierung der Reaktionsbedingungen
Wie weiter oben erwähnt, arbeiten Enzyme vorteilhafterweise bei milden
Reaktionsbedingungen. Läuft eine Reaktion allerdings zu langsam ab, dann lassen sich
pH-Wert und Temperatur nur geringfügig ändern, um die Reaktion zu beschleunigen.
Ansonsten besteht nämlich die Gefahr einer Deaktivierung des Enzyms. Auch die
Durchführung von enzymatischen Reaktionen bei niedrigen Temperaturen zur Steigerung der
Selektivität ist durch den engen Temperaturbereich, bei den die Enzyme arbeiten, stark
eingeschränkt.
Enzyme besitzen ihre höchste Aktivität in Wasser
Der hohe Siedepunkt, die hohe Verdampfungswärme und die geringe Löslichkeit der meisten
organischen Substanzen machen Wasser zu einem ungünstigen Lösungsmittel. Der Wechsel
zu einem oranischen Lösungsmittel führt in der Regel zum Aktivitätsverlust.[63]
Cofaktorabhängigkeit von Enzymen
Der Cofaktor dient der Übertragung von Redoxequivalenten, wie NAD(P)H oder von
chemischer Energie, wie ATP. Diese Reagenzien sind allerdings zu teuer um sie in
stöchiometrischen Mengen einzusetzen, deshalb muss ein geeignetes Regenerationssystem für
den Cofaktor gefunden werden.
Inhibierung von Enzymen
Viele enzymatische Reaktionen neigen zur Substrat- oder Produktinhibierung. Bei hohen
Substrat- oder Produktkonzentrationen hört das Enzym auf zu arbeiten. Die
Grundlagen der Biokatalyse 18
Substratinhibierung kann relativ leicht umgangen werden indem das Substrat kontinuierlich
zugegeben wird[64]. Das Problem der Produktinhibierung ist vergleichsweise schwieriger zu
lösen. Eine physikalische Abtrennung des Produktes ist nicht einfach. Der Anschluss eines
weiteren Schrittes, also praktisch eine chemische in situ Entfernung, kann das Problem lösen.
Enzyme kommen in der Natur nur in einer einzigen enantiomeren Form vor
Es gibt keinen allgemeingültigen Weg für die Synthese spiegelbildlicher Enzyme aus D-
Aminosäuren. Will man also die invertierte chirale Induktion einer gegebenen enzymatischen
Reaktion, so bleibt nur die Suche nach anderen Enzymen mit entgegengesetzter
stereochemischer Selektivität.
3.2 Biokatalyse mit isolierten Enzymen oder ganzen Zellen
Biotransformationen lassen sich mit isolierten Enzymen oder ganzen Zellen durchführen,
entweder in freier oder immobilisierter Form. Was letztendlich zum Einsatz kommt hängt
vom Reaktionstyp, der Cofaktorabhängigkeit und dem Maßstab der durchzuführenden
Biotransformation ab.
3.2.1 Vor-und Nachteile der Verwendung isolierter Enzyme
Allgemein kann gesagt werden, dass die Handhabung von isolierten Enzymen einfacher ist.
Es besteht gewöhnlich eine höhere Konzentrationstoleranz gegenüber Substraten und
Produkten im Vergleich zu ganzen Zellen. Nachteilig ist jedoch die Notwendigkeit der
Cofaktorregenerierung.
Gelöst in Wasser
In Wasser zeigen isolierte Enzyme hohe Aktivitäten, welche allerdings zu Nebenreaktionen
führen können. Zudem sind lipophile Substrate in Wasser unlöslich und zur Aufarbeitung ist
eine Extraktion erforderlich.
Grundlagen der Biokatalyse 19
Suspendiert in organischen Lösemitteln
Durch Suspension von Enzymen in organischen Lösemitteln lassen sich lipophile Substrate
lösen. Die Aufarbeitung und Enzymrückgewinnung ist wesentlich einfacher. Es muss
allerdings mit verminderter Aktivität gerechnet werden.
Immobilisation
Immobilisierung von Enzymen gewährleistet eine unkomplizierte Rückgewinnung derselben.
Dies geschieht aber oft auf Kosten der Aktivität.
3.2.2 Vor-und Nachteile der Verwendung ganzer Zellen
Zur Durchführung von Biotransformationen mit ganzen Zellen ist keine
Kofaktorregenerierung erforderlich. Nachteilig sind allerdings die teure Ausrüstung und die
Gefahr von Nebenreaktionen aufgrund von Übermetabolismus.
Wachsende Zellen
Werden für eine Biotransformation Zellen genommen, die sich in der Wachstumsphase
befinden, so werden höhere Aktivitäten erzielt. Demgegenüber stehen eine schwierigere
Prozesskontrolle, mehr Nebenprodukte und hohe Biomassen.
Stationäre Zellen
Biotransformationen mit stationären Zellen bieten eine einfachere Aufarbeitung mit weniger
Nebenprodukten. Die Zellaktivität ist geringer.
Immobilisierte Zellen
Der Arbeit mit immobilisierten Zellen bietet die Möglichkeit der Zell-Wiederverwendung, die
jedoch zu Lasten der Aktivität geht.
Grundlagen der Biokatalyse 20
3.3 Mechanistische Aspekte der Biokatalyse
3.3.1 Schlüssel-Schloß-Modell
1884 stellte E. Fischer ein allgemeines Modell für den Mechanismus einer enzymatischen
Reaktion vor.[65] Er nahm an, dass Enzym und Substrat wie ein Schloss mit einem Schlüssel
interagieren (Abb. 15). Dies erklärt warum enzymatische Reaktionen häufig regio-, und
enantioselektiv ablaufen. Da dieses Modell von einer starren Enzymstruktur ausgeht, erklärt
es nicht, warum manche Enzyme mit großen Substraten interagieren, während sie bei
kleineren Substraten inaktiv sind. Nach Fischers Logik sollten kleinere Substrate sogar mit
höheren Geschwindigkeiten umgesetzt werden, da für sie der Zugang zum aktiven Zentrum
einfacher ist. Fischers Hypothese kann auch nicht erklären, warum viele Enzyme zu den
natürlichen Substraten eine Vielzahl nichtnatürlicher Verbindungen mit strukturell
unterschiedlichen Eigenschaften umsetzen.
Abb. 15: Schlüssel-Schloss Prinzip nach Fischer.[66]
3.3.2 Induced-Fit –Modell
In den späten 60er Jahren entwickelte Koshland Jr. das Induced-Fit-Modell (Abb. 16),
welches davon ausgeht, dass Enzyme nicht völlig starr sind, sondern eher durch flexible
Strukturen repräsentiert werden.[67] Es wird angenommen, dass das Enzym bei der Bindung
des Substrates seine Konformation ändert. Das aktive Zentrum des Enzyms hat erst nach
Grundlagen der Biokatalyse 21
Bindung des Substrates eine dazu komplementäre Form. Diesen Prozess der dynamischen
Erkennung bezeichnet man als induced fit.
Abb. 16: Induced fit Modell nach Koshland.[66]
3.3.3 Desolvatations Theorie
Die Desolvatations Theorie von M.J.S. Dewar beschreibt die Kinetik von Enzymreaktionen
analog zu Gasphasenreaktionen.[68, 69] Gelangt das Substrat an das aktive Zentrum des
Enzyms, so werden alle sich dort befindlichen Wassermoleküle vom Substrat ersetzt. Es
findet eine formale Gasphasenreaktion statt, ohne störendes Lösemittel. In Lösung dagegen
behindern die Wassermoleküle eine Annäherung der Reaktionspartner, was zu einem
Geschwindigkeitsverlust führt. Dies erklärt die hohen Geschwindigkeiten enzymatischer
Reaktionen, welche im Allgemeinen wesentlich schneller sind als chemisch katalysierte
äquivalente Prozesse. Unter anderem lässt sich damit erklären, warum kleine
Substratmoleküle oftmals langsamer umgesetzt werden als ihre größeren Analoga. Die
ersteren nämlich vermögen es nicht alle Wassermoleküle aus dem aktiven Zentrum zu
ersetzen.
Grundlagen der Biokatalyse 22
3.3.4 Kinetische Gründe für die Enzym-Selektivität
Wie in jeder anderen katalytischen Reaktion beschleunigt ein Enzym (E) die Reaktion indem
es die Aktivierungsenergie (Ea) herabsetzt.[70] Dies wird einer Stabilisierung des
Übergangszustandes der Reaktion durch das Enzym zugeschrieben.[71] Es wird angenommen,
dass der Katalysator fester an den Übergangszustand als an den Grundzustand des Substrates
bindet und zwar mit einem Faktor ähnlich der Geschwindigkeitsbeschleunigung.[72] (Abb. 17).
t
unkatalysi
Abb. 17: Energiediagramm ei[ES] = Enzym-Substrat-Komplexan.
Die Stereoselektivität aller E
Übergangszustands-Komplex
enantiomeren Substrate A un
Umgebung des aktiven Ze
Komplexe [EA] und [EB] geb
ihrer Übergagszustände [EA]
(∆∆G≠) der beiden enantiome
als das andere (Abb. 18). Sie
von den Reaktionsgeschwind
unka
ert enzymkatalysi
ner katalysierten vers, P = Produkt, Ea = Akti
nzyme beruht prak
[ES]. In einer ena
d B um das aktive Z
ntrums des Enzym
ildet, welche untersc
≠ und [EB] ≠ besitz
ren Substrate sorgt d
ist ein direktes Maß
igkeiten (vA, vB) der
kat
Reaktionskoordinate
ert
us unkatalysierten Reaktion.[25] E = Enzym, vierungsenergie, ≠ zeigt einen Übergangszustand
tisch auf der Energiediffernz im Enzym-
ntioselektiven Reaktion wetteifern beide
entrum im Enzym. Aufgrund der chiralen
s werden diastereomere Enzym-Substrat
hiedliche Werte für die freie Energie (∆G)
en. Die Differenz der Aktivierungsenergie
afür, dass ein Enantiomer schneller reagiert
für die Selektivität einer Reaktion, welche
enantiomeren Substrate A und B abhängt.
Grundlagen der Biokatalyse 23
Diese Werte sind von äußerster Wichtigkeit, da sie die optische Reinheit des Produktes
bestimmen. ∆∆G≠ setzt sich aus einen Enthalpie- (∆∆H≠) und einem Entropieterm (∆∆S≠)
zusammen. Das Aufbrechen und Neuknüpfen von Bindungen während das Substrat ins
Produkt übergeht, bestimmt im wesentlichen die Aktivierungsenthalpie. Der Entropiebeitrag
beinhaltet die Lage der Reaktanden zueinander, Änderungen konformeller Flexibilität
während des induced fit Prozesses und verschiedene Konzentrations- und Solvationseffekte.
In Tab. 1 sind die Enantiomerenüberschüsse den korrespondierenden ∆∆G≠ -Werten
gegenübergestellt.
E
[EA]
[EA]
E + P
E + P
+ A
+ B
∆∆G≠ = ∆∆H≠ − Τ ∆∆S≠
∆∆G≠ = − RΤ ln (νA /νB)
Abb. 18: Energiediagramm für eine enzymkatalysierte enantioselektive Reaktion.[25] E = Enzym; A und B = enantiomere Substrate, P und Q = enantiomere Produkte; [EA] und [EB] = diastereomere Enzym-Substrat-Komplexe; ≠ zeigt einen Übergangszustand an. ∆∆G, ∆∆H und ∆∆S =Differenz der freien Energie, Enthalpie und Entropie; R = Gaskonstante, T = Temperatur, vA und vB = Reaktionsgeschwindigkeiten von A und B.
Tab. 1: Freie Energiewerte, Reaktionsgeschwindigkeiten und optische Reinheiten[25]
∆∆G≠ [kcal/mol] vA / vB e.e. [%]
0.118 1.2 10
0.651 3 50
1.74 19 90
2.17 39 95
3.14 199 99
4.50 1999 99.9
Klassifizierung der Biokatalysatoren 24
4 Klassifizierung der Biokatalysatoren
Bisher wurden über 3200 Enzyme identifiziert[73-76]. Ältere Schätzungen zufolge sollen über
25000 Enzyme existieren[77]. Jedoch sind es sicherlich mehr. Eine Klassifizierung der Enzyme
ist in Tab. 2 dargestellt. Insgesamt gibt es sechs Kategorien, die sich aus den Reaktionstypen
ergeben.
Tab. 2: Einteilung der Enzyme nach Reaktionstypen.[25]
Enzymklasse Klassifiziert Verfügbar Reaktionstyp Nutzena
1.
Oxidoreduktasen 650 90
Oxidation-Reduktion: Oxygenierung
von C-H, C-C, C=C Bindungen,
Entfernung oder Addition von
Wasserstoffequivalenten
+++
25 %
2.
Transferasen 720 90
Transfer von Aldehyd-, Keto-, Acyl-,
Phosphoryl- oder Methyl Gruppen
+
~5 %
3.
Hydrolasen 636 150
Hydrolyse und Bildung von Estern,
Amiden, Lactonen, Lactamen,
Epoxiden, Nitrilen, Anhydriden,
Glycosiden und Organohalogeniden
+++
60 %
4.
Lyasen 255 35
Addition-Eliminierung von kleinen
Molekülen auf C=C, C=N, C=O
Bindungen
++
~7 %
5.
Isomerasen 120 6
Racemerisierung, Epimerisierung und
Umlagerung
+
~2 %
6.
Ligasen 80 5
Bildung und Spaltung von C-O, C-S,
C-N, C-C Bindungen mit
einhergehender Triphosphatspaltung
+/-
~1 %
a Die geschätzte kommerzielle Nutzung eines Enzyms für eine bestimmte Transformation eines nichtnatürlichen Substrates rangiert von +++ (äußerst nützlich) bis +/- (geringer Gebrauch). Die Prozentwerte geben den Forschungsstand der jeweiligen Enzymklasse für den Zeitraum von 1987-2003 wieder.
Klassifizierung der Biokatalysatoren 25
4.1 Cofaktoren
Cofaktoren (Tab. 3) sind für eine Vielzahl enzymatisch katalysierter Reaktionen erforderlich.
Ihr Molekulargewicht ist relativ gering im Vergleich zum Enzym (wenige hundert Da, im
Gegensatz zu 15 - 1000000 Da für Enzyme). Sie dienen als Lieferant von Redoxäquivalenten,
wie Wasserstoff und Sauerstoff, Elektronen und Kohlenstoffeinheiten.
Tab. 3: Geläufige Coenzyme in Biotransformationen.[25]
Coenzym Reaktionstyp Recyclinga
NAD+/NADH
NADP+/NADP
Addition oder Entfernung
von Wasserstoff
(+) [++]
(+) [+]
ATPb Phosphorylierung (+) [+]
SAM C1-Alkylierung (+) [+/-]
Acetyl-CoA C2-Alkylierung (+) [+/-]
Flavinc Oxygenierung (-)
Pyridoxalphosphat Transaminierung (-)
Biotin Carboxylierung (-)
Metallporphyrin-Komplexec Peroxidierung (-)
a(+) bzw. (-) steht für Cofaktorregenerierung erforderlich bzw. nicht erforderlich. Die Durchführbarkeit, angezeigt in eckigen Klammern, rangiert von durchführbar [++] bis kompliziert [+/-]. bFür andere Triphosphate wie GTP, CTP und UTP ist die Situation entsprechend. cViele Flavin- und Metalporphyrin-abhängige Mono- oder Dioxygenasen erfordern NAD(P)H als zusätzliches indirektes Reduktionsagens.
Die Cofaktoren wie NAD(P)H und ATP sind zu teuer um sie in stoichiometrischen Mengen
einzusetzen. Werden coenzymabhängige Enzyme verwendet, so setzt man die Cofaktoren in
katalytischen Mengen ein und regeneriert sie in situ. Dies ist für einige Reaktionstypen recht
gut entwickelt, andere bedürfen noch weiterer Entwicklung (sieheTab. 3). Die Tatsache, dass
einige Cofaktoren fest am Enzym gebunden sind, macht eine Cofaktorregenerierung
überflüssig. Viele Enzyme erfordern koordinierende Metalle wie Fe, Ni, Cu, Co, V, Zn, Ca,
Mg oder Mn. Diese sind häufig fest an das Enzym gebunden, so dass sie nicht zugesetzt
werden müssen und wenn doch, dann lässt sich das entsprechende Metallion leicht über das
Medium zusetzen.
Oxygenasen 26
5 Oxygenasen[78-81]
Enzyme, die reduktiv Sauerstoff aktivieren und diesen in Substrate einbauen, werden in
Mono[82-84]- und Dioxygenasen eingeteilt, je nachdem, ob ein oder zwei Atome des
molekularen Sauerstoffs auf den Weg zu den Reaktionsprodukten in das Substrat eingeführt
werden.
5.1 Dioxygenasen
Dioxygenasen lassen sich in zwei Hauptklassen einteilen: in haemabhängige, pflanzliche
Eisen-Schwefel Oxygenasen und in Rieske nicht-hämabhängige Eisen-Schwefel Oxygenasen.
Dioxygenasen katalysieren cis-Dihydroxylierungen, aromatische Ringspaltungen und
Hydroperoxidierungen. In allen Fällen wird zuerst eine hochreaktive instabile
Peroxoverbindungen gebildet. Dieses Intermediat lässt sich durch anschließende Reduktion zu
dem entsprechenden (Di)Hydroxyderivat abfangen (Abb. 19).[85]
Sub-H + O2
DioxygenaseSub-O-O-H Sub-OH
Reduktion
z.B. NaBH4
Sub-H + O2Dioxygenase Reduktion
z.B. NaBH4
O
OSub
OH
OHSub
Hydroperoxid
endo-peroxidSub = Substrat
Abb. 19: Grundgleichung für Dioxygenasen
So werden Alkene durch Lipidoxyxgenasen zum Allylhydroperoxid oxidiert und durch
Reduktion zum Allylalkohol umgesetzt. Die Bildung von Lipidperoxiden in lebenden Zellen
wird unter anderem für Ateriosklerose und Krebs verantwortlich gemacht.[86]
Oxygenasen 27
Die Bildung von endo-Peroxiden ähnelt einer Cycloaddition von Singulett-Sauerstoff an
ungesättigte Systeme und kommt in der Biosynthese von Prostaglandinen und Leukotrienen
vor.
Die Dioxygenase katalysierte Cycloaddition von Sauerstoff gilt als Initialschritt des
Metabolismus von aromatischen Verbindungen in prokaryontischen Zellen.[87, 88] In lebenden
mikrobiellen Zellen wird das entstandene endo-Peroxid (Dioxetan) enzymatisch zum
synthetisch nützlichen cis-Glykol reduziert (
Abb. 20).[89, 90]
+ O2O
O
OH
OH
Dioxygenase Reduktase
H2Dioxetan cis-Glykol
Abb. 20: Dioxygenase katalysierte Reaktion als Schlüsselschritt zum Abbau aromatischer Verbindungen.
5.2 Monooxygenasen
Monooxygenasen bauen aus molekularen Sauerstoff ein Sauerstoffatom in Substrate ein,
während aus dem anderen Sauerstoffatom Wasser gebildet wird. Die Sauerstoffaktivierung
geschieht bei allen Monooxygenasen auf gleicher Art und Weise: Sauerstoff wird reduktiv auf
Kosten eines Donors (NADH oder NADPH), aktiviert. Die Erzeugung der eigentlichen
aktiven sauerstoffübertragenden Spezies wird bei den Monooxygenasen durch Systeme
bewerkstelligt, die zu Zweielektronenübertragungen fähig sind, wobei Übergangsmetalle (Fe,
Cu) oder gebundene organische Cofaktoren (Pteridine[91] und Flavine) beteiligt sind. Die
Bildung von Oxometallverbindungen oder anderen oxidierten Intermediaten wird durch die
sukzessive Übertragung von zwei Elektronen auf O2 möglich. In Abb. 21 ist die
Grundreaktion dargestellt.
Oxygenasen 28
Sub + O2 + H+ + NAD(P)HMonooxygenase
SubO + NAD(P)+ + H2O
Sub = Substrat
Abb. 21: Grundgleichung für Monooxygenasen
Monooxygenasen katalysieren eine Vielzahl oxidativer Reaktionen: Hydroxylierungen von
aliphatischen und aromatischen Substraten, die Epoxidierung von Alkenen,
Heteroatomoxidationen und Baeyer-Villiger Transformationen. Der Oxidationstyp hängt im
Allgemeinen von der prosthetischen Gruppe innerhalb des betreffenden Enzyms ab;
Hydroxylierungen und Epoxidierungen werden durch metallabhängige Monooxygenasen vom
Cytochrom P450 Typ katalysiert[92], wobei Heteroatom- und Baeyer-Villiger Oxidationen
durch flavinabhängige Enzyme katalysiert werden[93]. In Abb. 22 sind einzelne
Oxygenierungsreaktionen dargestellt.
H OHH OH
RR
ORn X Rn X O
X = N, S, Se, P
R1 R2
O
R1
O
OR2
Abb. 22: Monooxygenase katalysierte Reaktionen[25]
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 29
6 Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-
Oxidationen
6.1 Baeyer-Villiger Oxidation
Im Jahr 1899 entdeckten Adolf von Baeyer und Victor Villiger die Umwandlung von Ketonen
in Ester oder cyclischen Ketonen in Lactone.[94] In dieser Reaktion wird das Keton von einer
nukleophilen Peroxysäure angegriffen (Abb. 23). Es bildet sich das tetrahedrische sogenannte
„Criegee Intermediat“.[95] Diese instabile Verbindung unterliegt einer Umlagerung, wobei ein
Carboxylation abgespalten wird und eine Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung wandert. Es
bilden sich Ester und Säure. Im Allgemeinen wandert das am höchsten substituierte
Kohlenstoffatom und zwar unter Retention der Konfiguration. Sterische, konformationelle
und elektronische Faktoren haben einen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Umlagerung
und auf die Wanderungstendenz. Auch die Art der Persäure beeinflusst die
Wanderungstendenz.[96] Diese Merkmale machen die Baeyer-Villiger Reaktion zu einem
äußerst interessanten Werkzeug für die Synthese von Lactonen und Estern.
R1 R2
O
R3 OOH
O
O O
R3
OOH
R2R1
R1 O
O
R2+
R3 OH
O
Abb. 23: Mechanismus der Baeyer-Villiger-Oxidation von Ketonen zu Estern.
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 30
Der Gebrauch von Persäuren, wie meta-Chlorperoxybenzoesäure oder
Triflourperoxyessigsäure als Oxidationsmittel, und der Gebrauch von organischen
Lösemitteln hat allerdings einige Nachteile. Erstens erhöhen Reaktionen mit Persäuren im
großen Maßstab das Unfallrisiko, da die Persäuren erschütterungsempfindlich und explosiv
sind. Darüberhinaus sind die allgemeinen Reaktionsbedingungen (halogenierte Reagenzien
und Lösemittel) im ökologischen Sinne nicht nachhaltig. Außerdem macht die hohe
Reaktivität und Oxidationskraft von Persäuren zusätzliche Syntheseschritte zum Schutz
empfindlicher Funktionalitäten notwendig. Um Persäuren zu vermeiden, wurden
Übergangsmetallkatalysatoren[97] und organokatalytische Verbindungen[98-100] entwickelt, die
H2O2 oder Sauerstoff als mildes Oxidationsmittel für die Baeyer-Villiger Reaktion benutzen.
Ein interessantes Beispiel ist die von BOLM et al. entwickelte umweltfreundliche Methode.
Sie benutzt Sauerstoff als primäres Oxidationsmittel und Benzaldehyd oder Pivalaldehyd als
Co-Reduktionsmittel in überkritischen CO2 als Lösungsmittel.[101]
Chirale B.-V. Reaktionen zyklischer Ketone erlauben einen einfachen Zugang zu
asymmetrischen Lactonen, welche als Precursor in der enantioselektiven Synthese
Verwendung finden.[102] Der Einsatz von chiralen organokatalytischen[98] oder chiralen
Organometallreagenzien[97, 103-108] wurde in den letzten Jahren kontinuierlich verbessert,
jedoch sind ihnen Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs) in der Darstellung chiraler
Verbindungen weit überlegen.[109-112]
6.2 Baeyer-Villiger-Monooxygenasen
Das 4a-Peroxyflavin der Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) repräsentiert das
biokatalytische Äquivalent zu den Persäuren. Mit den BVMOs lassen sich neben der Baeyer-
Villiger-Reaktion Oxidationen[113] von Thiolen[114-121], Dithioketalen[122-124] und Suldifen[125],
Alkenylphosphonaten[126], Stickstoff-[127], Bor-[128] und Selenverbindungen[129] durchführen.
Die Biotransformation von Steroiden in Pilzen, welche als erstes Beispiel einer biologischen
Baeyer-Villiger Reaktion gilt, wurde 1948 von Turfitt entdeckt.[130] Seit diesem Zeitpunkt
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 31
wurden Baeyer-Villiger-Oxidationsschritte in biosynthetischen Abläufen, wie der
Aflatoxinsynthese in Pilzen,[131] der Synthese von Iridoiden und Steroiden in Pflanzen,[132, 133]
und der Toxinsynthese in Schalentieren[134] gefunden. Baeyer-Villiger Oxidationsschritte
werden auch recht häufig in mikrobiologischen Abbauprozessen angetroffen. So benutzen
Mikroorganismen BVMOs, um auf aliphatischen Methylketonen[135, 136], alicyclischen
Kohlenwasserstoffen[137-139], aromatischen Verbindungen[140-147] und Terpenen[148, 149] zu
wachsen. Alle heute bekannten BVMOs sind NAD(P)H abhängige Flavoproteine. Sie können
in zwei Gruppen unterteilt werden: Typ I BVMOs enthalten Flavinadenindinukleotid (FAD)
als Coenzym, benutzen NADPH als Elektronenquelle und bestehen aus identischen
Untereinheiten, während Typ II BVMOs Flavinmononukleotid (FMN) als Coenzym
enthalten, NADH als Elektronendonor benutzen und aus α2β-Trimeren bestehen.[110]
Die Baeyer-Villiger Enzyme sind flavinabhängige Monooxygenasen. In Abb. 24 sind die
coenzymatisch aktiven Formen von Riboflavin, der 5′-ADP-Ester, das
Flavinadenindinucleotid (FAD), und das 5′-Phosphat (FMN) dargestellt. Als Abkürzung für
die oxidierte und für die reduzierte Form verwendet man die Symbole FAD und FADH2.
´R = H Riboflavin´R = PO3
2- FMN´R = ADP FAD
N
N
NH
N O
O
OHHO
OH´RO
Abb. 24: Riboflavin und seine coenzymatisch aktiven Formen.
FAD ist das wichtigste Coenzym in flavinabhängigen Monooxygenasen; Es ist fest aber meist
nicht kovalent an das aktive Zentrum gebunden. Sein reaktiver Teil der Isoalloxazinring (Abb.
25) dient als Elektronen-Carrier. Dieser kann zwei Elektronen aufnehmen. Er nimmt dabei ein
Proton und ein Hydridion auf.
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 32
N
N
NH
N O
OHN
N
NH
NH
O
O
R R
+ 2 H+ + 2 e-
oxidierte Form(FAD)
reduzierte Form(FADH2)
Abb. 25: Redoxsystem von FAD/FADH2.
Das BVMO-gebundene Flavin-Coenzym kann nur in seiner reduzierten Form molekularen
Sauerstoff aktivieren. Die zur Reduktion von FAD (FMN) benötigten Reduktionsäquivalente
werden von NAD(P)H (Abb. 26) bereitgestellt, wobei lediglich der Nicotinamidpart (Abb. 27)
die katalytische Aktivität bewirkt. Im Gegensatz zu den Flavinen fungieren
Nicotinamidcoenzyme in der Natur ausschließlich als Hydridakzeptoren- oder donoren.
N
NN
N
NH2
O
PO32-OH
OPO
O-
O
P
O
O-
N
O
OH OH
O
O
H2N
H H
Abb. 26: Strukturformel von NADPH.
N+
O
NH2
R
+ H+ + 2 e-
N
O
NH2
R
HHH
NADP + NADPH
Abb. 27: Redoxsystem NADP+/NADPH.
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 33
6.2.1 Mechanismus von BVMOs
Der allgemein akzeptierte Mechanismus für die enzymatische Baeyer-Villiger Reaktion (Abb.
28) basiert auf den Untersuchungen der Cyclohexanonmonooxygenase (CHMO), welche aus
Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 isoliert wurde (Abb. 28).[150, 151] Das Enzym besitzt
ein Flavinadenindinukleotid (FAD) als prosthetische Gruppe und ist NADPH- und
sauerstoffabhängig. Erster Schritt des biokatalytischen Prozesses ist die Reduktion des fest
gebundenen FAD mittels NADPH (1→2). Die nachfolgende schnelle Oxidation mittels
molekularen Sauerstoffs liefert das Flavin 4a-Peroxidanion (3). Dieses Intermediat stellt die
oxygenierende Spezies in der nachfolgenden Baeyer-Villiger Reaktion dar. Massey und
Mitarbeiter zeigten, dass das Anion zuerst gebildet wird und erst in Abwesenheit eines
Substrates sich ein Gleichgewicht mit dem 4a-Hydroperoxid einstellt.[152] Das Peroxid greift
die Carbonylgruppe des Substrates (4) nucleophil an. Es bildet sich das tetrahedrische Griegee
Intermediat (5). Die Umlagerung dieser Spezies liefert das Produktlacton und das
4a-Hydroxyflavin. Der katalytische Zyklus schließt sich mit der Eliminierung von Wasser,
der Freigabe von FAD, Produkt (6) und Cofaktor.
N
N
NH
N O
O
R
NH
N
NH
N- O
O
R
E-FAD_NADPH
E-FADH-_NADP+(2)
NH
N
NH
N O
O
R
O
E-FADHOO-_NADP+(3)
O
NH
N
NH
N O
O
R
O
O
O-
-O
NH
N
NH
N O
O
R
O
OH
E-FADHOOH_NADP+
Grigee Addukt (5)NH
N
NH
N O
O
R
OH
O
O
E-FADHOH_P_NADP+
E-FAD (1)
NADPH
NADP+
O
O
-H2O
(4)
(6)
Abb. 28: Mechanismus von Flavin-abhängigen Monooxygenasen
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 34
Es wird angenommen, dass die Umlagerung durch die gleichen stereoelektronischen Effekte
wie in der nichtenzymatischen Baeyer-Villiger Oxidation gesteuert wird.[153, 154] Für eine
erfolgreiche Alkylwanderung und Carboxylsäureabspaltung müssen zwei Voraussetzungen
gelten: Zum einen muss die C-C Bindung antiperiplanar zur Peroxybindung sein und zum
anderen muss ein freies Elektronenpaar am Sauerstoffatom anti zur wandernden Alkylgruppe
stehen (Abb. 29).[155]
Über isotopenmarkierte Substrate bestätigten Schwab und Mitarbeiter, dass die
Fragmentierung des tetrahedrischen Intermediats in Analogie zur chemischen Oxidation unter
Retention der Konfiguration am wandernden Kohlenstoffzentrum erfolgt.[156-158]
O
Rm R'H
O
OR
anti
antiperiplanar
Abb. 29: Stereoelektronische Voraussetzungen für eine Umlagerung.
Die CHMO kann die regio- und enantioselektive Oxidation katalysieren, indem es nur einer
C-C Bindungen erlaubt ist antiperiplanar zur O-O Bindung im Griegee Intermediat
vorzuliegen. Da FAD fest am Enzym gebunden ist, beeinflussen die Wechselwirkungen
zwischen dem Substrat und den Aminosäuren im aktiven Zentrum die Ausrichtung und die
Auswahl der wandernden Gruppe. Über die eigentliche 3 D-Struktur der CHMO ist nichts
bekannt. Tatsächlich existierte zu Beginn dieser Arbeit keine einzige Röntgenstrukturanalyse
einer Baeyer-Villigerase. Erst im September 2004 erschien ein Bericht über die
Kristallstruktur der Phenylacetonmonooxygenase, die allerdings Cyclohexanon nicht
akzeptiert.[159]
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 35
6.2.2 Cofaktor Regenerierung
Monooxygenasen sind, wie schon eingangs erwähnt, cofaktorabhängig. Dies erschwert ihren
Einsatz in der organischen Chemie. Die funktionelle Flavingruppe ist gewöhnlich fest am
Enzym gebunden und wird in einem katalytischen Zyklus von NAD(P)H regeneriert. Dieser
Cofaktor muss in stöchiometrischen Mengen eingesetzt werden. Da der Preis für NAD(P)H
recht hoch ist, gilt es ein geeignetes Recyclingsystem für den Cofaktor zu finden.
Hierzu stehen drei Wege zur Verfügung:
• Implementierung einer zweiten enzymatischen Reaktion
• Elektrochemische Regeneration
• Verwendung von ganzen Zellen
Implementierung einer zweiten enzymatischen Reaktion
Das Coprodukt einer Monooxygenasereaktion NAD(P)+ kann durch ein zusätzliches Enzym
auf Kosten eines geeigneten Hilfssubstrates, welches als Hydriddonor agiert, reduziert
werden. Entscheidend ist dabei, dass die Reaktionsbedingungen dieses Regenerationsenzyms
zu denen des Produktenzyms kompatibel sind.
Die verbreiteste Methode für das NADH-Recycling verwendet Formiatdehydrogenase (FDH),
welche die Oxidation von Ameisensäure zu Kohlendioxid katalysiert (Abb. 30).[160] Weder
das Hilfssubstrat noch das Nebenprodukt verursachen Probleme, wie Inaktivierung oder
Inhibierung. Zudem können beide leicht vom Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Da das
Gleichgewicht auf der Seite des gasförmigen CO2 liegt, läuft die Recycling-Reaktion
quantitativ in der gewünschten Richtung ab. FDH ist komerziell erhältlich und kann durch
Immobilisierung stabilisiert werden. Die Entwicklung einer Formiatdehydrogenase aus
Pseudomonas sp. 110,[161] mittels mehrfach ortsgerichteter Mutagenese am aktiven Zentrum
des Enzyms, auf die räumlichen Erfordernisse für NADP+, ermöglichte den Einsatz des
Formiat Dehydrogenase Systems auf Biotransformationen mit isoliertem CHMO-Enzym.[162]
Vor kurzem wurde dieses System erfolgreich für Biotransformationen mit isolierten CHMO-
Zellen verwendet.[163, 164]
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 36
HCOOH
FormiatDehydrogenase
NAD(P)+ NAD(P)H
CO2
Abb. 30: Cofaktorrecycling mit FDH.
Eine weitere Methode zur NADPH Regenerierung ist das Glucose-6-Phosphat
(G6P)/Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase (G6PDH) System (Abb. 31). Aktivierter Zucker
wird enzymatisch zum 6-Phosphoglucolactone oxidiert, welches spontan zum
korrespondierenden Gluconat hydrolisiert. G6PDH aus Leuconostoc mesenteroides ist billig,
stabil und akzeptiert sowohl NAD+ als auch NADP+.[165] Ein entscheidender Nachteil sind
allerdings die hohen Kosten für G6P.
O
O
HOHO
OHOH
P
O
O
HOHO
OH
P
O
OH
O
HOHO
OH
P
COOH
Glucose-6-PhosphatDehydrogenase
NAD(P)+ NAD(P)H
Hydrolyse
Abb. 31: Recyclingsystem mit G6PDH.
Willets und Mitarbeiter entwickelten eine weitaus elegantere Methode der
Cofaktorregenerierung in B.-V.-Oxidationen. Es handelt sich um ein closed-loop System.[166,
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 37
167] Hierbei wird eine gereinigte BVMO gekoppelt mit einer Alkoholdehydrogenase aus
Thermoanaerobium brockii (Abb. 32). Die Dehydrogenase wandelt den Substrat-Alkohol
unter Reduktion von NADP+ zu NADPH in das Keton um. Im nachfolgenden enzymatischen
Schritt setzt die BVMO das Keton zum Lacton um und regeneriert zugleich NADP+.
HO
O
O
O
Thermoanaerobiumbrockii
Dehydrogenase
NADP+ NADPH
CHMO
Abb. 32: Closed-loop Cofaktorrecycling durch ein Dehydrogenase/Oxygenase System.
Anstatt eines Hydroxysubstrates als Precursor kann auch ein zusätzlicher Alkohol (z.B. 2-
Propanol) für das Cofaktorrecycling verwendet werden. [168]
Elektrochemische Regeneration des Cofaktors
Ein alternativer Ansatz für das Coenzymrecycling ist die elektrochemische Regeneration von
Coenzymen.[169] Beispielsweise wird der Komplex [Cp*Rh(bpy)(H2O)2+] kathodisch reduziert
und führt durch Aufnahme eines Protons zu [Cp*Rh(bpy)H+], welches als
Hydridtransferreagenz gegenüber NAD(P)+ fungiert. Dieses System wurde erfolgreich in
synthetischen Anwendungen von NADH-abhängigen Monooxygenasen angewendet.[170, 171]
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 38
Verwendung von ganzen Zellen
Biotransformationen mit ganzen Zellen haben gegenüber in vitro-Systemen den Vorteil, dass
allfällige Cofaktorregeneration vom Zellmetabolismus bewerkstelligt wird. Darüberhinaus
entfällt der schwierige Prozess der Proteinaufreinigung und die Anwendungen sind nicht
limitiert bezüglich möglicher Enzyminstabilitäten. Nachteilig sind jedoch zusätzliche
Enzyme, wenn mit ganzen Zellen gearbeitet wird. Die Gefahr von Nebenreaktionen steigt, da
beide, Substrate und Produkte, von anderen Enzymen der Zelle akzeptiert werden können.
Dies wird häufig in nativen Stämmen beobachtet. So kann es im Zuge des Zellmetabolismus
zur Lactonhydrolyse mittels einer Hydrolase kommen. Der Einsatz eines Enzyminhibitors,
wie Tetraethylpyrophosphat, kann hier Abhilfe schaffen.[172]
Ein weitaus eleganterer Weg ist die Benutzung rekombinanter Expressionsstämme. Die
vermehrte Produktion von gewünschten Protein kann durch Verwendung eines starken
Promoters erreicht werden, sodass die Menge an gewünschtem Protein der Menge an
ungewünschtem Proteins überwiegt. Nebenreaktionen können also vernachlässigt werden. Die
Klonierung der CHMO aus Acinetobacter in Saccharomyces cerevisiae[173] und in
Escherichia coli[174] erwies sich als überaus erfolgreich. So kann das Kultivieren von
pathogenen Organismen, welches eine spezielle Laborausrüstung, mikrobiologische
Erfahrung und höhere Sicherheitsstandards erfordert, durch Wahl eines geeigneten
Wirtsorganismus vermieden werden.
6.3 Cyclohexanonmonooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter
sp NCIMB 9871
Das Enzym CHMO wurde in den Bodenbakterien Nocardia, Pseudomonas und Acinetobacter
gefunden. Sie alle können auf Cyclohexanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen.[175] Die
CHMO aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (E.C. 1.14.13.22) wurde 1976 von Trudgill und
Mitarbeiter aufgereinigt und charakterisiert.[150] Es handelt sich um ein 61 kDa schweres
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 39
Flavoprotein, bestehend aus 542 Aminosäuren, welche über 1.6 kbp codiert ist. Die natürliche
Funktion des Enzyms ist der Sauerstoffeinbau während des biologischen Abbaus von
Cyclohexanol zu Adipinsäure (Abb. 33).[137, 176, 177]
OH O
O
O
(CH2)4
CH2OH
COOH
(CH2)4CHO
COOH
(CH2)4
COOH
COOH
NAD+ NADH O2 H2O
Cyclohexanol-dehydrogenase
CHMO
NADPH NADP+
1-Oxa-1-Oxo-Cycloheptan-
lactonase
H2O
NADH NAD+
Hydroxy-hexanoat-
dehydrogenase
NADPH NADP+
6-Oxohexanoat-dehydrogenase
Abb. 33: Metabolismus von Cyclohexanol in Acinetobacter.
Neben seiner natürlichen Funktion oxidiert die CHMO über 100 nicht-natürliche Substrate.
Sie katalysiert Desymmetriesierungsreaktionen prochiraler Ketone und kinetische
Racematspaltungen oft mit guten bis sehr guten Enantioselektivitäten.[109-112] Eine
Röntgenstrukturanalyse steht noch aus, sodass nur indirekte Modelle des aktiven Zentrums,
welche auf Experimenten zum Substratspektrum beruhen, bestehen.[178-180]
Das Gen für die CHMO aus Acinetobacter wurde zum ersten Mal in 1988 kloniert und
sequenziert.[177] Die später gemachte Sequenzanalyse des CHMO-Gens von Iwakai et al.[176]
unterschied sich in verschiedenen Nucleotidpositionen von der ursprünglich von Chen et al.
Monooxygenase katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion 40
berichteten Sequenzanalyse. Kürzlich unternommene massenspektrometrische Experimente
zeigten, dass die Sequenz von Iwakai et al. die korrekte CHMO Sequenz ist (Abb. 34).[181]
Abb. 34: CHMO-Sequenz nach Iwakai et al.[176]
Der natürliche Stamm NCIMB 9871 produziert eine Lactonhydrolase. Es müssen also
geeignete Inhibitoren zur Reaktion hinzugefügt werden, um die Hydrolyse des Lactons zu
verhindern.[172] Furstoss und Mitarbeiter fanden einen anderen Weg, um das Problem zu
umgehen. Sie verwendeten in Fermentierungen Acinetobacter TD 63, ein Stamm ohne
Hydrolase Gen. Nachteilig ist allerdings die Pathogenität des Stammes,[172, 182] zumal
Expressionssysteme in S. cerevisiae („designer yeast“)[173] und E. coli[111, 183]. für
Biotransformationen mit ganzen Zellen zur Verfügung stehen.
Genexpression 41
7 Genexpression
7.1 Klonierung
In der Botanik und der Mikrobiologie bezeichnet der Begriff des Klonierens die
ungeschlechtliche, genetisch identische Vermehrung eines Organismus. Als Beispiel kann
man Pflanzenklone, die aus der Blattvermehrung einer Pflanze zu ganzen neuen Pflanzen
entstanden sind, anführen.
Molekularbiologisch versteht man unter Klonieren den Einbau eines Gens oder eines
DNA-Abschnittes in einen Träger (Klonierungsvektor) und die nachfolgende Vermehrung
und Bildung des Genproduktes in einer geeigneten Wirtszelle. Als Klonierungsvektoren
dienen Plasmide. Dies sind kleine DNA-Doppelstrang-Ringe, bakteriellen Ursprungs. Sie
können die Zellmembran mit Hilfe physikalischer Methoden passieren. Einmal ins Bakterium
eingeschleust, werden sie wie zelleigene DNA weitervermehrt.
Im einzelnen läuft das Klonieren folgendermaßen ab (Abb. 35):
Ein Plasmid X und die zu klonierende DNA besitzen beide eine Schnittstelle für ein
Restriktionsenzym (oftmals EcoRI). Nach erfolgtem Schnitt haben beide DNA-Fragmente
überstehende 5'-OH-Enden (klebrige Enden). Das DNA-Fragment lagert sich nun über die
klebrigen Enden in das linearisierte Plasmid ein. Eine DNA-Ligase verknüpft Plasmid und
DNA-Fragment kovalent. Die rekombinante DNA ist entstanden. Diese kann nun in eine
geeignete Wirtszelle (ein Bakterium) transformiert werden. Besitzt die klonierte Fremd-DNA
des Plasmids eine Protein codierendes Gen, so kann in der Wirtszelle das dazugehörige
Protein exprimiert werden.
Das Markergen, welches in den häufigsten Fällen eine Antibiotikaresistenz codiert, ist der
Indikator für die Anwesenheit dieses Vektors und damit auch der übertragenden Fremd-DNA
in der Wirtszelle. Denn wird neben dem Fremd-Gen als Markergen die Antibiotikaresistenz
übertragen, so sind alle Wirtszellen, die den Vektor integriert haben, in einer
antibiotikahaltigen Nährlösung noch lebensfähig. Zellen, die den Vektor nicht integriert
haben, sterben hingegen ab. Somit lassen sich Zellen, welche Fremd-DNA aufgenommen
haben, in antibiotikahaltiger Nährlösung selektionieren.
Genexpression 42
Abb. 35: Schema des Klonierens. M = Markergen, steht in den häufigsten Fällen für eine Antibiotikaresistenz.[184]
Genexpression 43
7.2 Expressionssystem der Cyclohexanonmonooxygenase
Das in E. coli BL21(DE3) überexprimierende Plasmid (Abb. 36) für die
Cyclohexanonmonooxygenase wurde mittels molekularbiologischer Methoden konstruiert.
Hierzu wird der Vektor pET 22b(+) verwendet. Im Endkonstrukt, mit der Bezeichnung
pMM04, erfolgt die Proteinexpression durch einem starken T7 Promoter, welcher über die
Zugabe von Isopropylthio-β-D-galctopyranosid (IPTG) zum Kulturmedium gesteuert werden
kann.[183]
pET22-CHMO7021 bp
Amp(r)
lacI
CHMO
T7 promoterlacO
f1 ori
ColE1, pBR322 ori
T7 terminator
Xho I (159)
Nde I (1817)
Abb. 36: pET 22b(+) mit klonierter CHMO.
Gerichtete Evolution von Enzymen 44
8 Gerichtete Evolution von Enzymen
Charles Darwin führte die Komplexität der Lebewesen auf einen Algorithmus von Mutation
und natürlicher Selektion zurück.[185] Die Produkte dieses Evolutionsalgorithmus sind auf
allen Ebenen sichtbar, von der erstaunlichen Vielfalt des Lebens bis zu einzelnen
Proteinmolekülen. In den 1980/90er Jahren wurde der Mechanismus der Evolution in das
Laboratorium übertragen. Wissenschaftler und Ingenieure benutzen ihren eigenen
Algorithmus, um Moleküle auf ihre Zwecke hin umzugestalten. Die gerichtete Evolution
erlaubt es uns, Enzymfunktionen zu erforschen, welche in der natürlichen Umgebung nicht
erforderlich sind, ohne dass eine Kenntnis der molekularen Zusammenhänge erforderlich
wäre. Dieses Design steht im Kontrast zu dem herkömmlichen Design, in welchem Proteine
rational durch Einsatz von Computern und ortsgerichteter Mutagenese umstrukturiert werden.
Im Folgenden wird beschrieben, wie die molekulare Evolution im Reagenzglas gesteuert
werden kann, um maßgeschneiderte Biokatalysatoren zu erhalten.
8.1 Wozu gerichtete Evolution ?
Der Einsatz natürlicher Enzyme für industrielle Anwendungen −vom Katalysator in der
chemischen Synthese bis zu Additiven für die Waschmittelindustrie− scheitert häufig daran,
dass die Enzyme den spezifischen Anforderungen nicht genügend angepasst sind, da
natürliche Enzyme auf spezifisch biologische Funktionen eines lebenden Organismus hin
optimiert wurden. In der Biotechnologie werden Enzyme benötigt, die über einen möglichst
langen Zeitraum hinweg stabil und aktiv sind. Außerdem werden häufig zusätzliche
Anforderungen gestellt, wie beispielsweise Stabilität gegenüber organischen Lösemitteln und
ein breites Substratspektrum.
Es ist nun möglich, Enzyme in rekombinanten Mikroorganismen zu produzieren. Eine
geeignete Modifikation auf DNA-Ebene bewirkt eine neue Aminosäuresequenz und damit
auch neue Enzymeigenschaften. Hinderlich ist die Unkenntnis über den Zusammenhang
zwischen Aminosäuresequenz und Enzymeigenschaften, von der Fähigkeit zur heterologen
Expression in Wirtsorganismen bis hin zur katalytischen Aktivität in nichtnatürlichen
Umgebungen. Zahlreiche Experimente an der Proteinsequenz zeigen, dass es der kumulative
Gerichtete Evolution von Enzymen 45
Effekt vieler kleiner Anpassungen ist, der zu neuen Proteineigenschaften führt. Weiterhin
kann der Verlust von nur wenigen Wasserstoff-Bindungen im Enzym einen missgefalteten
und damit inaktiven Zustand zur Folge haben. Die Aufrechterhaltung der Faltung des Proteins
und die gleichzeitige Evolvierung des katalytischen Zentrums ist so komplex, dass jeder
rationale Ansatz eine genaue Kenntnis der Struktur, des Mechanismus und der Dynamik
erfordert, was zur Zeit nahezu unmöglich ist.
8.2 Evolution im Labor
8.2.1 Erweiterung der natürlichen Diversität
Die Hürden, die das rationale Enzymdesign mit sich bringt, werden von der Evolution
umgangen. Die Kraft der Evolution als ein Algorithmus zum molekularen Design kann
wahrscheinlich am Besten durch das Studium ihre Produkte verstanden werden. Bei der
Betrachtung der Entwicklungsgeschichte der heutigen Proteine haben wir gelernt, dass diese
hochadaptierte Moleküle sind. Eine Vielzahl von α/β fässerartigen Enzymen verdeutlicht
dies.[186] Vertreter dieser Enzyme katalysieren sehr verschiedene Reaktionen. Trotz dieser
großen funktionellen Diversität sind sie aller Wahrscheinlichkeit nach aus einem Urmotif
durch Zufallsmutagenese, Rekombination und natürliche Selektion evolviert wurden.
Andererseits zeichnen sich funktionell homologe Enzyme verschiedener
Ursprungsorganismen häufig durch eine geringe strukturelle Homologie aus und können in
Abhängigkeit ihres Fundortes unterschiedlichste Eigenschaften (Stabilität, Löslichkeit,
pH-Tolereanz usw.) zeigen.[187-189]
Die Evolution ist also ein mächtiges Werkzeug, welches nachweislich die Fähigkeit zur
Änderung der Enzymfunktion und zur Feinabstimmung der Enzymeigenschaften besitzt.
Dieser Algorithmus kann für die Neuentwicklung von Enzymen im Labor eingesetzt werden.
Die Herausforderung besteht nun darin, den Zeitraum für die Evolution auf Monate oder
sogar Wochen schrumpfen zu lassen.
Gerichtete Evolution von Enzymen 46
8.2.2 Auswahl einer Evolutionsstrategie
Die Evolution in der Natur beruht auf der Anpassung an die sich ständig ändernde Umwelt.
Sie arbeitet weder in eine bestimmte Richtung noch hat sie ein bestimmtes Ziel. Der
zugrundeliegende Prozess, die Reproduktion und das „Überleben der Mutante“, geschieht
spontan. Im Gegensatz dazu besitzt die gerichtete Evolution ein konkretes Ziel und der
Schlüsselprozess –Mutation, Rekombination und Screening oder Selektion– werden durch
den Experimentator kontrolliert.
Die Kernschritte der gerichteten Evolution eines Enzyms sind in Abb. 37 gezeigt. Von einem
oder mehreren Elternsequenzen ausgehend lässt sich die genetische Vielfalt für die Evolution
über Mutagenese und oder Rekombination erzeugen. Die veränderten Gene werden in ein
Plasmid kloniert und in einem geeigneten Wirtsorganismus wie beispielsweise Bakterien oder
Hefe exprimiert. Die von den Klonen exprimierten verbesserten Enzyme werden über ein
Hochdurchsatzscreeningsystem, oder durch Selektion, identifiziert. Die für die verbesserten
Enzyme codierenden Gene werden isoliert und einer erneuten Runde der gerichteten
Evolution unterzogen. Nach Durchlaufen von mindestens zwei Zyklen hat man einen
evolutionären Druck hinsichtlich der gewünschten Eigenschaft ausgeübt. Wird dagegen nur
ein Zyklus durchlaufen, erhält man lediglich eine Bibliothek von Zufallsvarianten des
untersuchten Enzyms.
Gerichtete Evolution von Enzymen 47
1
MRek
Abb. 37: Schlüsselschritte e
Für die Ausführung ein
ist es wichtig, die komb
typisches Enzym besteh
hundert), wobei 20 mög
Sequenzraum, also die S
unserer Vorstellungskra
korrespondierenden Fu
sorgfältig geplant werd
gewünschten Funktion u
ist es vielversprechende
als nach der gewünschte
Eigen[192] und Kaufma
geeigneten Proteinen be
für die Evolution im Lab
die der Evolution unterz
dass bei einer bergaufw
. Wildtyp- bzw. Mutanten-Gen.
utation/ ombination
3
6. IsolieW
ines typischen Experiments z
es erfolgreichen Projekte
inatorischen Eigenschafte
t aus einer Kette von N
liche Aminosäuren an jed
umme aller theoretisch m
ft (20N). Eine Erforschung
nktionen im Labor mus
en,[191] denn einem groß
nd wahrscheinlich sogar
r, die Evolution eines ode
n Funktion in zufällig erz
nn[193] betrachten die
stehende Landschaft des
or wird für jede Eigensch
ogen werden, verschiede
ärtsgerichteten Bewegung
. Klonieren der Mutantenin ein Plasmid.
4. Transformation der Plasmide inBakterien, welche die Enzym-
varianten produzieren (eine Zelle, eine Sequenz).
5
rie
u
s
n
e
s
en
a
r
e
E
S
a
n
,
. Evaluieren der Kolonien aufdie gewünschte Eigenschaft.
ung der verbesserten Gene und derholung des Prozesses.
r gerichteten Evolution.[190]
für die gerichtete Evolution von Proteinen
dieses Systems in Betracht zu ziehen. Ein
Aminosäuren (N ist gewöhnlich ein paar
r Position der Kette vorliegen können. Der
öglichen Variationen, liegt somit außerhalb
des gigantischen Sequenzraumes und seine
offensichtlich streng limitiert sein und
Teil des Sequenzraumes wird es an der
n einem gefalteten Protein mangeln. Daher
mehreren existiernden Enzymen zu lenken
ugten Peptidbibliotheken zu schauen.
volution als Kletterübung in einer aus
equenzraumes. Das Proteinlandschaftsbild
ft oder jedes Sortiment von Eigenschaften,
sein. Nach Arnold ist es wahrscheinlicher,
d.h. ausgehend von niedriger Performance,
Gerichtete Evolution von Enzymen 48
in der Proteinlandschaft der Erfolg sich eher mit kleinen Schritten (ein oder zwei
Aminosäureaustausche) einstellt. [191, 194] Die Variationsvielfalt (es gibt 19N Sequenzen, die
nur einen Aminosäureaustausch irgendeiner gegebenen Sequenz mit N-Aminosäuren
besitzen) bietet viele Möglichkeiten verbesserte Mutanten zu finden. Eine effektive
Evolutionsstrategie, veranschaulicht in Abb. 38 und in Abb. 39, basiert auf kleinen Schritten
(vorzugsweise ein Aminosäureaustausch in jeder Generation), die entweder sequentiell oder
durch Rekombination[13, 195] akkumuliert werden, um die gewünschte Enzymfunktion zu
erhalten.[191, 194] Solch ein Ansatz ist kompatibel mit einer geringen Mutationsrate über das
gesamte Gen. Ein alternativer Ansatz ist die Anwendung einer höheren Mutationsrate über
eine schmale Region des Gens.[196] Die Mutagenese über das gesamte Gen erlaubt die
Entdeckung unerwarteter Ergebnisse. Mehr noch, die ortsspezifische Mutation, welche es
vermag neue Kombinationen vom Aminosäureaustausche zu erzielen. Dabei handelt es sich
um Kombinationen die unerreichbar durch einzelne Schritte wären, da die Intermediate nicht
bevorzugt sind. Der Ablauf der evolutionären Erforschung des Proteinsequenzraumes ergibt
sich aus dem Potential des Suchwerkzeuges, der Häufigkeit positiver Mutationen (gewöhnlich
klein) und der Wahl der Ausgangspunkte(s). Ein anderer Ansatz zur Erzeugung von Diversität
für die gerichtete Evolution ist das in vitro Shuffling −auch „family shuffling“ [197] genannt−
homologer Gene. Eine Rekombination von zwei oder mehreren Elterngenen führt zu einer
chimären Genbibliothek für die Evolution auf die gewünschten Merkmale. Die
rekombinanten Sequenzen, entstanden durch unterschiedliche Evolvierung von einem
gemeinsamen Vorfahren, besitzen eine ähnliche Struktur und Funktion. Sie stellen sehr große
Sprünge im Sequenzraum dar und ergeben funktionelle Proteine.[197, 198] Eine in vivo
Rekombination kann auch zu interessanten neuen chimären Enzymen führen[199-202], wobei die
Diversität begrenzt ist.
Gerichtete Evolution von Enzymen 49
e
Abb. 38: Sequentielle Anordnung von 1
Abb. 39: Rekombination verbesserter G
Eine natürl. Funkt. ausübendes Wildtyp-Enzym
Eine neue Funkt. ausübendes Wildtyp-Enzym
n
Anzahl der MutationeRelative Performanc
-2 Aminosäureaustausche.[194]
e
Relative PerformancRekombination
1-2 Mutationen
n
Anzahl der Mutationeene.
Mutagenesemethoden 50
9 Mutagenesemethoden Die von Mullis beschriebene Polymerasekettenreaktion (kurz: PCR für engl. Polymerase
Chain Reaction) bildet die Grundlage aller heute bekammten Mutagenesemethoden. Als ein
Meilenstein in der Zufallsmutagenese kann die von Chen und Goedell entwickelte epPCR
(fehlerhafte Polymerasekettenreaktion) betrachtet werden.[203] In dieser wurden die
Bedingungen einer klassischen PCR empirisch (z.B. MgCl2-Konzentration) variiert, um so die
gewünschte Mutationsrate zu erzielen. Die Methode wurde später noch durch Cadwell und
Joyce verbessert.[204] Diesem Prozess der Erzeugung von Punktmutationen folgte 1994 die
von Stemmer entwickelte Methode des DNA-Shufflings[13, 205] und 1998[206] und 1999[207]
Arnolds Staggered Extension Prozess und Random Priming Recombination Methode. Dies
sind alles rekombinante Prozesse, welche eine hohe Diversität der Gene zu Folge haben.
Seitdem wurden diese und andere Methoden, wie Sättigungsmutagenese[208] oder
Kassettenmutagenese[209-213], auf der Suche nach Enzymvarianten mit verbesserter Stabilität
und Aktivität angewendet.
Im Folgenden wird das Prinzip der Polymerasekettenreaktion erläutert und es wird näher auf
einige wichtige Mutagenesemethoden eingegangen.
9.1 PCR
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion lassen sich Gen-Sequenzen vervielfältigen, ohne
einen lebenden Organismus, wie z.B. E. coli oder Hefe zu benutzen. Die PCR wird in
biologischen und medizinischen Laboratorien für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben
verwendet, zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten, für das Erstellen und
Überprüfen genetischer Fingerabdrücke, für das Klonieren von Genen und für
Vaterschaftstests.
9.1.1 Geschichte
Die PCR wurde in den frühen 1980er Jahren vom späteren Nobelpreisträger Mullis
entwickelt. Seine Idee war es, ein Verfahren zu entwickeln, das DNA durch wiederholte
Mutagenesemethoden 51
Verdopplung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Polymerase künstlich
vervielfältigt.
DNA-Poymerase kommt in allen Lebewesen vor, sie verdoppelt die DNA vor der Zellteilung
indem sie an einen einzelnen DNA-Strang bindet und einen dazu komplementären Strang
erzeugt. In Mullis ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro (in einer
kontrollierten, künstlichen Umgebung) verwendet. Die doppelsträngige DNA wurde durch
erhitzen auf 96 °C in zwei Einzelstränge aufgeteilt. Bei dieser Temperatur wird die DNA
Polymerase inaktiviert und muss daher nach jedem Erhitzen erneuert werden. Mullis
ursprüngliches Verfahren war sehr ineffizient, da es viel Zeit und große Mengen an DNA-
Polymerase erforderte.
Später wurde der PCR-Prozess verbessert, indem die DNA-Polymerase von thermophilen
(Hitze liebenden) Bakterien verwendet wurde, die bei über 110 °C in Geysiren leben. Die
DNA-Polymerase dieser Lebewesen ist themostabil und bleibt daher beim Erhitzen während
der PCR-Zyklen aktiv. Da nicht mehr ständig neue DNA-Polymerase hinzugefügt werden
musste, konnte der Vervielfältigungs-Vorgang erheblich vereinfacht und automatisiert
werden.
Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus Thermophilus aquaticus
gewonnen und Taq genannt. Taq-Polymerase erfährt gegenwärtig breite Anwendung. Ein
Nachteil der Taq-Polymerase liegt darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNA
produziert, was zu Mutationen (Fehlern) in der DNA-Sequenz führt. Polymerasen wie Pwo
oder Pfu, die aus Archaea gewonnen werden, haben einen Korrekturmechanismus, der die
Anzahl der Mutationen in der kopierten DNA erheblich senkt.
9.1.2 PCR in der Praxis
Zur Durchführung einer PCR werden mehrere grundlegende Komponenten benötigt.
• Die zu vervielfältigende DNA (die Matritze)
• Zwei Primer, um Anfang und Ende des zu vervielfältigenden Abschnitts festzulegen
• DNA-Polymerase, um den festgelegten Abschnitt zu kopieren
• Nucleotide, die Bausteine für den von der DNA-Polymerase zu synthesierenden
DNA-Strang
Mutagenesemethoden 52
Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einen sogenannten Thermocycler statt. Diese
Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die
Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird.
9.1.3 Primer
Das zu vervielfältigende DNA-Fragment wird durch die Primer bestimmt. Primer sind kurze,
künstlich erzeugte DNA-Stränge, die weniger als 50 Nucleotide lang sind und exakt mit dem
Anfang bzw. dem Ende des zu vervielfältigenden DNA-Teils übereinstimmen. Sie lagern sich
an den Start- und Endpunkten der Ausgangs-DNA an und dienen der DNA-Polymerase für
die Synthese des neuen DNA-Strangs. Wie man die Länge und den Schmelzpunkt des Primers
festlegt, hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Der Schmelzpunkt eines Primers ist die
Temperatur, unterhalb der sich der Primer an die Ausgangs-DNA anlagert. Wird dieser
überschritten, löst sich der Primer wieder von der Vorlage. Der Schmelzpunkt steigt mit
zunehmender Primer-Länge. Sollte ein Primer zu kurz sein, kann er sich an verschiedenen
Stellen der DNA anlagern, wodurch man den zu vervielfältigenden Bereich nicht mehr genau
bestimmen kann. Auf der anderen Seite ist die Länge des Primers durch die zum Erreichen
des Schmelzpunkts benötigte Temperatur begrenzt. Ist der Schmelzpunkt zu hoch, d.h. über
80 °C, kann das zu Problemen führen, da DNA-Polymerase bei solch hohen Temperaturen
weniger aktiv ist. Die optimale Länge für den Primer liegt im Allgemeinen zwischen 30 und
40 Nucleotiden bei einem Schmelzpunkt zwischen 60 °C und 75 °C.
9.1.4 Ablauf
Der PCR-Prozess besteht aus einer Serie von 20 bis 40 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus drei
Schritten (Abb. 40). Zunächst wird die doppelsträngige DNA erhitzt, um die Stränge zu
trennen. Dieser Schritt wird Melting (Schmelzen) genannt. Die Wasserstoff-
Brückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Im
ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt um sicherzustellen, dass sich sowohl
die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollständig aufgetrennt haben und nur noch aus
einem Strang bestehen.
Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer sich an die
einzelnen DNA-Stränge anlagern können. Dieser Schritt heißt Annealing (Anlagern). Die
Mutagenesemethoden 53
Temperatur während dieser Phase hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 5 °C
unter ihrem Schmelzpunkt. Wird die Temperatur falsch gewählt, kann das dazu führen, dass
die Primer sich nicht oder an der falschen Stelle an der Ausgangs-DNA anlagern.
Schließlich füllt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge. Sie beginnt am angelagerten
Primer und folgt dann dem DNA-Strang. Dieser Schritt heißt Elongation (Verlängerung). Die
Temperatur hängt nun von der DNA-Polymerase ab. Die Zeit die dieser Schritt benötigt,
hängt von der DNA-Polymerase und der Länge des DNA-Fragments, das vervielfältigt
werden soll, ab.
Abb. 40: Schematische Darstellung des PCR-Zyklus. (1) Schmelzen bei 96 °C. (2) Anlagerung. (3) Verlängerung (P=Polymerase). (4) Der erste Zyklus ist beendet. Es folgen weitere Zyklen.
Mutagenesemethoden 54
Die beiden entstandenen DNA-Stränge bilden die Vorlage für den nächsten Durchlauf, die
Menge an DNA verdoppelt sich also mit jedem Zyklus. Der Ablauf einer korrekten PCR lässt
sich über verschiedene Parameter einstellen. Dazu gehören die Temperaturen, die Zeiten, die
Salzkonzentrationen, der pH-Wert, die Zugabe von Additiven, usw.
9.2 Fehlerhafte PCR
Die meistbenutzte Zufallsmutagenese zur Erzeugung von Enzymvarianten mit definierter
Mutationsfrequenz ist die fehlerhafte PCR (engl.: error prone PCR, epPCR). Error prone
PCR-Protokolle sind modifizierte Standard PCR Methoden. Sie wurden entworfen um die
natürliche Fehlerrate zu erhöhen.[203, 214] Gewöhnlich wird die Taq Polymerase[215] benutzt, da
ihre natürliche Fehlerrate recht hoch ist, wobei AT durch GC ausgetauscht wird. In epPCR
Reaktionen werden höhere MgCl2-Konzentrationen an als in Standard PCR Reaktionen
verwendet, wodurch nichtkomplementäre Basenpaare stabilisiert werden.[216, 217]. Auch die
Zugabe von Mangan kann die Fehlerrate erhöhen.[218] Andere Methoden zur Erhöhung der
Fehlerrate benutzen unterschiedliche Konzentrationen an Nucleotiden in der PCR
Reaktion.[219-221] Empirisch kann man die Fehlerrate so einstellen, dass durchschnittlich
entweder eine, zwei, drei (oder mehr) Aminosäuren im Protein ausgetauscht werden. Die
epPCR ist jedoch nicht wirklich randomisiert, da manche Aminosäuren aufgrund der
Entartung des genetischen Codes benachteiligt sind.
9.3 Randomisierte Oligonucleotid-Mutagenese
Hierbei werden zufällige Mutationen, welche auf synthetischen Oligonucleotiden codiert sind,
in eine spezifische Region inkorporiert. Die Anzahl der Mutationen eines einzelnen Enzyms
innerhalb einer Population kann durch Variation der Länge der Zielsequenz und dem Grad
ihrer Randomisierung während der Synthese der Oligonucleotide erfolgen. Die randomisierte
Oligonucleotid-Mutagenese bietet ein mächtiges Werkzeug für das schnelle Erstellen von
großen Mutantenbibliotheken.[222] Diese Bibliotheken können dazu benutzt werden, um
Sequenzeinschränkungen innerhalb eines Proteins zu erforschen.
Mutagenesemethoden 55
9.4 Ortsgerichtete Mutagenese
Der Austausch, die Insertion oder Deletion von einem oder mehreren definierten Nucleotiden
eines gegebenen Gens wird als ortsgerichtete Mutagenese bezeichnet.[223] Hierbei wird ein
kurzer Oligonucleotid-Primer an ein Einzelstrang DNA-Templat, welcher das zu
mutagenisierende Gen enthält, hybridisiert. Das Oligonucleotid ist gänzlich komplementär zu
der Region des Templats ausgenommen der oder die Positionen, welche die Mutation(en)
tragen.
9.5 Sättigungsmutagenese
Mit Sättigungsmutagenese lässt sich eine Bibliothek von Mutanten, die alle möglichen
Mutationen an einer oder mehreren vorbestimmten Stellen besitzt, herstellen. Diese Methode
wird in gerichteten Evolutionsexperimenten verwendet, um die Anzahl der
Aminosäureaustausche über randomisierte Mutagenese zu erhöhen.[208] In Kombination mit
Hochdurchsatz-Screening Methoden wurde Sättigungsmutagenese erfolgreich zur
Verbesserung von enzymatischen Eigenschaften, wie der Thermostabilität[208, 224, 225], der
Substratspezifität[226] und der Enantioselektivität[227], eingesetzt.
9.6 Kassettenmutagenese
Hierbei handelt es sich um die gezielte Randomisierung eines bestimmten Genabschnitts
(Kassette). Durch Restriktionsenzyme wird der gewählte Genabschnitt aus der Templat-DNA
herausgeschnitten und durch verschiedene Verfahren randomisiert. Der mutierte Genabschnitt
wird wieder in die Templat-DNA eingefügt und durch PCR amplifiziert.[209-213] Eine
verwandte kombinatorische multiple Kassettenmutagenese (CMCM) wurde von REETZ
variiert und in der gerichteten Evolution eines enantioselektiven Enzyms eingesetzt.[228, 229]
9.7 DNA-Shuffling
Das DNA-Shuffling, eine Methode zur in vitro Rekombination von homologen Genen, wurde
von STEMMER eingeführt.[197] Die zu rekombinierenden Gene werden durch DNaseI zufällig
Mutagenesemethoden 56
fragmentiert. Fragmente von gewünschter Größe werden an einem Agarosegel gereinigt.
Beim Durchlauf von mehreren Denaturierungs-, Anlagerungs-, und Erweiterungszyklen
mittels einer Polymerase werden die Fragmente wieder zusammengebaut (siehe Abb. 41).
Eine Rekombination tritt auf, wenn Fragmente von unterschiedlichen Eltern an einer Region
mit hoher Sequenzidentität anlagern. Nach dieser Zusammenlagerung wird eine PCR
Amplifikation dafür benutzt, um ganze chimere Gene zu erzeugen. Über DNA-Shuffling
wurden chimäre Enzyme mit verbesserter Aktivität und Stabilität gefunden.[230-233]
E e
S
S 2
S 1
Abb. 41: DNA-Shuffling.[190]
9.8 Staggered Extension Process (StEP)
Der StEP[206] ist im Vergleich zu dem DNA-Shuffling, welch
und Amplifikationsschritte bedarf, einfacher und weniger arb
Über-Kreuz-Hybridisierung von wachsenden Genfragmenten w
Im Einzelnen handelt es sich um eine Denaturierung, das A
Spezies 4
lterliche Gen
pezies 3
pezies
pezies
D ges
eit
ä
n
NA-Shufflin
C e
Fragmenta
sintensiv. E
hrend der P
hybridisieren
himäre Gen
tions-, Isolations-
r beruht auf einer
rimer Elongation.
der Primer und
Mutagenesemethoden 57
einem Elongationssschritt, dessen kurze Dauer und die Wahl einer suboptimalen Temperatur
die Primerextension begrenzt. Die nur teilweise verlängerten Primer werden über mehrere
Zyklen hinweg zufällig an unterschiedliche Eltersequenzen wieder angelagert. Das Schema ist
in Abb. 42 dargestellt. Die vollständigen rekombinanten Produkte können, in Abhängigkeit
von der in dem StEP erhaltenen Produktausbeute, mit einer zweiten PCR amplifiziert werden.
Für die StEP-Methode wird jedoch eine Sequenzhomologie von mindestens 80 %
vorausgesetzt.[187-189]. Deshalb hat sie eine begrenzte Anwendung.
g
Abb. 42: StEP-Rekombination.
Annealin
n
Elongatio Denaturierung gefolgt von dem zufälligen Anlegender Primer und Elongation
n
Mehrere Zycle
Mutagenesemethoden 58
Es existieren noch eine Vielzahl weiterer Mutagenesemethoden, wie ITCHY[234, 235], Binary
Patterning[236, 237], das von REETZ entwickelte ADO-Shuffling[238] und viele mehr. Eine gute
Übersicht über die verschidenen Mutagenesemethoden bietet das Buch „Directed Evolution
Library Creation“ von Francis H. Arnold und George Georgiou.[239]
9.9 Anwendung der gerichteten Evolution von funktionellen
Enzymen
Die oben beschriebenen Methoden wurden insbesondere von ARNOLD[12] und STEMMER[13]
angewandt, um Enzyme mit höherer thermischer Stabilität und/oder Aktivität in organischen
Lösemitteln zu erzeugen. Im Arbeitskreis REETZ wurden die ersten Beispiele für gerichtete
Evolution von Enzymen beschrieben.[240] Es handelt sich um Lipasen.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 59
10 Hodurchsatzscreening-Systeme auf
Enantioselektivität
Die gerichtete Evolution zur Generierung enantioselektiver Enzyme für die organische
Synthese bringt das Problem mit sich, dass tausende von Biokatalysatoren auf
Enantioselektivität bewertet werden müssen. Die Bestimmung der ee-Werte wird traditionell
durch chirale Gaschromatographie oder chirale HPLC durchgeführt, wobei gewöhnlich nur
wenige Proben pro Tag gemessen werden können. Bis 1995 standen praktisch keine
Hochdurchsatz-Screeningverfahren zur Verfügung.[29] Seitdem wurden verschiedene
Methoden, wie Systeme die auf UV/VIS[29, 241-244], IR-Thermographie[245], MS[246, 247] und
Kapillarelektrophorese[248] beruhen, entwickelt.
10.1 UV/VIS-basierende Assays
Das erste in der gerichteten Evolution von enantioselektiven Enzymen verwendete
Hochdurchsatzscreening basierte auf UV/VIS Spektroskopie.[29] Dieses System ist beschränkt
auf die hydrolytisch kinetische Racematspaltung von chiralen p-Nitrophenolestern durch
Lipasen oder Esterasen. Die p-Nitrophenolester (S)-1/(R)-1 wurden als Modellsubstrate
benutzt, um eine Bibliothek, bestehend aus ca. 1000 Varinaten einer Lipase aus
Pseudomonas aeruginosa, nach vielversprechenden Biokatalysatoren für die hydrolytisch
kinetische Racematspaltung von chiralen Estern zu evaluieren. Die Hydrolyse in gepufferten
Medium liefert das p-Nitrophenolat 3 welches eine starke Absorption bei 405 nm zeigt. Bei
Durchführung der Reaktionen in Mikrotiterplatten kann mit einem photometrischen
Plattenlesegerät die Absorption als Funktion der Zeit gemessen werden. Da die Racemate nur
eine Informationen über den Gesamtumsatz liefern, wurden die (R)- und (S)-Substrate einzeln
prepariert und auf einer 96er-Well Mikrotiterplatte paarweise getrennt betrachtet. Wenn nun
der Verlauf der Absorptionszeitkurve einer Mutante in beträchtlicher Weise von der
Absorptionszeitkurve des Wildtyp abweicht, so zeigt dies einen Hit an.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 60
O NO2
O
R
CH3
ROH
CH3
O
+R
OH
CH3
O
-O NO2+
H2O
Lipase-Varianten
rac-1 (R=n-C8H17) (S)-2 (R)-2
3
(A)
Abzeit(C)
Na
sei
Su
An
ein
Qu
Än
(B)
(C)
b. 43: (A) zeigt die Hydrolysegleichung von rac-2-Methyldecansäure-p-nitrophenylester. (B) gibt den lichen Verlauf der lipasekatalysierten Hydrolyse der Ester (R)-1 und (S)- 1 für die Wildtyp-Lipase und für eine verbesserte Mutante aus der ersten Generation wieder.
chteilig an dem Assay ist, dass ein Chromophor (p-Nitrophenol) im Substrat vorhanden
n muss und eine eventuelle Substratkonkurrenz nicht erfasst wird, da die (S)- und (R)-
bstrate paarweise getrennt untersucht werden müssen.
dere UV/VIS-basierende Ansätze zum Screening enantioselektiver Hydrolasen verwenden
en kolorimetrischen Assay.[242, 249] Diese sind allgemeingültiger als der ursprüngliche
ick-E-Test.[241] Sie beruhen darauf, dass es bei der Hydrolyse eines Esters zu einer
derung des Säuregehaltes kommt. Durch Verwendung eines Puffers (N,N-bis(2-
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 61
hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure) und eines pH-Indikators (p-Nitrophenol) mit
gleichem pKa-Wert wurde eine lineare Korrelation zwischen der Menge der freigesetzten
Säure und dem Grad der Protonierung festgestellt (Kazlauskas-Test).[242] Der Vorteil dieses
Systems beruht darauf, dass kein Ester mit chromophorer Gruppe, wie der p-Nitrophenolester,
erforderlich ist. Es können also auch „normale Substrate“ so wie der Methylester 4 (Abb. 44)
umgesetzt werden.
R1 OCH3
O
+
R2
R1 OH
O
R2
R1 OH
O
R2
CH3OH+
rac-4 (S)-5 (R)-5
R1 O-
O
R2
R1 O-
O
R2
-H+ -H+
Abb. 44: Hydrolytische lipasekatalysierte kinetische Racematspaltung.
Der Kazlauskastest auf enantioselektive Hydrolasen ist zwar billig und praktisch, aber
wirkliche E-Werte in einer kinetischen Racematspaltung chiraler Ester liefert auch dieser Test
nicht, da (R-) und (S-) Substrate getrennt untersucht werden.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 62
10.2 Enzymgekoppelte-Assays
Es wurden verschiedene ee-Assays entwickelt, die von einem Enzymgekoppelten Prozess
Gebrauch machen. Wenn ein Produkt einer enzymatischen Reaktion durch ein anderes Enzym
zu einem nachfolgenden Produkt, welches zu einem spektroskopisches Signal führt,
umgesetzt wird, so ist ein Enzym gekoppeltes Assay möglich. Dies wurde als erstes im
Hochdurchsatz mit Fluoreszensspektroskopie als Detektionsmethode gezeigt.[250] Chirale
Ester, welche einen fluorogenen Rest besitzen, unterliegen der enzymkatalysierten Hydrolyse.
Das zuerst gebildete Produkt (Alkohol) wird enzymatisch unter der Bildung eines über
Fluoreszens detektierbaren Folgeproduktes abgebaut. Weitere Enzym gekoppelte Prozesse die
ohne einen fluorogenen Rest auskommen wurden von anderen Gruppen beschrieben.[251, 252]
10.2.1 Enzym-Immuno-Assay
Ein anderes UV/VIS-basierendes Hochdurchsatz-Screening System auf Enantioselektivität
verwendet einen Enzym-Immuno Assay[253], einer Technologie die routinemäßig in der
Biologie und Medizin angewendet wird. Dieser Assay wurde für die enantioselektive
Ruthenium katalysierte Hydrogenierung von Benzoylameisensäure zu Mandelsäure
entwickelt (siehe Abb. 45). Der Gebrauch eines Antikörpers, der an beide Enantiomere
bindet, ermöglicht es die Konzentration der Reaktionsprodukte zu bestimmen. Durch
Verwendung eines (S)-spezifischen Antikörpers lässt sich dann die Enantioselektivität
bestimmen. Über 1000 ee Bestimmungen pro Tag mit einer Genauigkeit von +/- 9 % sind
somit möglich.
OCOOH
Ph
HOCOOH
Ph
HOCOOH
PhEnantioselektiver
Katalysator
Ausbeute
ee
Abb. 45: Enzym-Immunoassay als Hochdurchsatzscreening für enantioselektive Katalysatoren. Der Antikörper, gekennzeichet mit grauer Farbe, erkennt beide Enantiomere, wobei der Antikörper, gekennzeichnet mit schwarzer Farbe, nur das (S)-Enantiomer erkennt.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 63
10.3 Fluoreszenz-basierende Assays
Fluoreszenzbasierende Assays sind gewöhnlich sehr sensitiv.[250] Wenn die fluoreszierende
Gruppe allerdings mit dem Substrat verknüpft ist und bei der enzymkatalysierten
enantioselektiven Transformation miteingeht, so führt der Prozess der gerichteten Evolution
zur Bildung eines Enzyms, welches spezifisch für das Substrat mit fluoreszierender Gruppe
und nicht für das Substrat allein ist. Mit der Verwendung eines molekularen Sensors, der bei
der Bildung eines bestimmten Produktes fluoresziert[254] lässt sich ein Enzym, ohne die
Verwendung eines Fluorophors, auf das gewünschte Substrat evolvieren.
In 2001 entwickelte SHAIR einen fluoreszensbasierten ee-Assay, welcher mit
Fluoreszenzmarkern in DNA-Mikroarrays arbeitet.[255] Als Modellsubstrate wurden chirale
Aminosäuren benutzt. Diese wurden zuerst an der Aminfunktion geschützt (N-Boc). Danach
wurden die Proben kovalent über Aminfunktionen an die feste Phase gekuppelt. In einem
zweiten Schritt wurden die nicht gekuppelten Aminfunktionen der festen Phase extensiv
acyliert. Im dritten Schritt erfolgte die Entschützung der Aminosäuren. Und schließlich, im
vierten Schritt, wurden in einer kinetischen Racematspaltung zwei pseudoenantiomere
Fluoreszenzmarker an die freien Aminogruppen gekuppelt. Das Gelingen der ee-Bestimmung
beruht auf eine im ausreichendem Maße vorliegende kinetische Racematspaltung während der
Amidbildung.[256] Die ee-Werte sind durch Messung des Verhältnisses der
Fluoreszenzintensitäten zugänglich. Es sind über 8000 ee Bestimmungen pro Tag möglich
und die Genauigkeit dieses Verfahrens liegt bei +/- 10 % des wirklichen Wertes.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 64
Schritt 1 Schritt 2
Schritt 3 Schritt 4
r
Abb. 46: Reaktionsmikroarray zur Hochdurchsatzbestimmung
Fluoreszenzmarke
der Enantioselektivität.[255]
chiraleProbe
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 65
10.4 MS-basierende Assays
Die (R)- und (S)-Enantiomere eines gegebenen chiralen Produktes haben identische
Massenspektren und können so nicht massenspektrometrisch unterschieden werden.
Unterschiedliche Massenspektren für die beiden Enantiomere lassen sich jedoch durch
Verwendung eines chiralen Derivatisierungsreagenzes erzeugen.[257] Voraussetzung dafür ist,
dass die kinetische Racematspaltung beim Schritt der Derivatisierung in ausreichendem Maße
abläuft (Prinzip von Horeau[256]). Die relativen Mengen der Diastereomere können durch
Integration der zugehörigen Signale bestimmt werden. Die Genauigkeit einer ee-Bestimmung
liegt bei +/- 10 %.[257] Anwendungen im Hochdurchsatz wurden noch nicht gezeigt, aber
dieses sollte prinzipiell möglich sein.
Ein anderer auf MS basierender Ansatz kommt ohne eine Derivatisierungsreaktion aus und
wurde erfolgreich von REETZ in der gerichteten Evolution von Enzymen eingesetzt.[246, 247]
Dieser verwendet deuteriummarkierte Pseudoenantiomere oder Pseudomesoverbindungen.
Diese Methode kann für kinetische Racematspaltungen oder Desymmetrisierungsreaktionen
prochiraler enantiotope Gruppen tragender Verbindungen, verwendet werden (siehe Abb. 47).
Da die Produkte der Transformationen stets Pseudoenantiomere sind, welche sich in der
Konfiguration als auch in der Masse voneinander unterscheiden, ergibt eine Integration der
MS-Signale den ee- oder den E-Wert. Die Ungenauigkeit der ee-Werte liegt bei +/- 2 %. Die
ursprüngliche Form des Systems wurde automatisiert und so ist man in der Lage bis zu
1000 ee Bestimmungen pro Tag durchzuführen.[246] Ein MS-Instrument, welches eine 8-Kanal
Multiplex Elektronensprayquelle verwendet, erlaubt sogar 8000 ee Bestimmungen pro
Tag.[247]
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 66
R1 R2 R1 R2
FG FG*
R1 R2
FG'
R1 R2
FG'FG'' FG''*+ +(A)
R1
+ +
R2 R1 R2*
FG FG
R1 R2
FG'
R1 R2*
FG'FG''+ + +(B)
FG'' FG''*+ +(C)
FG FG' FG'FG'' FG''*+ + +(D)
FGFG
R R
FG*FG'
R R
FG'FG
R R
+
FG FG* FG' FG* FG FG'
Abb. 47: Asymmetrische Transformation von pseudoenantiomeren (A) und (B), pseudomeso (C) und pseudoprochiralen (D) Verbindungen. FG steht für die funktionelle Gruppe, FG' bzw. FG'' stehen für die durch Umsetzung gebildeten funktionellen Gruppen. Ein Stern (*) symbolisiert die Isotopenmarkierung.
10.5 NMR-basierende Assays
NMR Messungen sind gewöhnlich zeitaufwendig. Die Entwicklung von Durchflusszellen
erlaubte jedoch den Einsatz der Methode in der kombinatorischer Chemie.[258-261] Die
technologischen Fortschritte wurden auf zwei verschiedene NMR basierende Hochdurchsatz
ee-Assays angewandt.[262] Der erste Ansatz benutzt ein chirales Reagenz oder ein NMR-
Shift-Reagenz zur klassischen Derivatisierung. Eine Parallelisierung ermöglicht die
Bestimmung von 1400 ee-Werten pro Tag. Die Genauigkeit liegt bei +/- 5 %. Der zweite
Ansatz ist vom Prinzip her mit dem MS-System verwandt, welches weiter oben beschrieben
wurde. Chirale-, oder Mesosubstrate werden isotopenmarkiert. Die resultierenden
Pseudoenantiomere oder pseudo-meso Verbindungen können dann gescreent werden. Die
Anwendung ist beschränkt auf kinetische Racematspaltungen und Desymmetrisierungen von
prochiralen Verbindungen, welche enantiotope Gruppen tragen (siehe Abb. 47). Der Assay
bedient sich der 1H-NMR Spektroskopie. Eine 13C-Markierung wird verwendet um zwischen
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 67
den (R)- und (S)-Formen der chiralen Verbindung zu unterscheiden. Es kann praktisch jedes
Kohlenstoffatom in der zu interessierenden Verbindung markiert werden, wobei
Methylgruppen, in welchen es nicht zu einer Aufspaltung von 1H-Signalen durch 1H, 1H
Kopplungen kommt, bevorzugt sind. Die entscheidenden Signale sind ein Singulett, welches
aus der CH3-Gruppe des einen Enantiomers resultiert, und ein Dublett, welches aus der 13CH3-Gruppe des anderen Enantiomers resultiert. Es können bis zu 1400 Proben mit einer
Genauigkeit der ee-Bestimmung von +/- 2 %. gemessen werden. Die Verwendung einer
vierfach parallelen Durchflusszelle kann den Probendurchsatz um den Faktor vier
erhöhen.[263]
10.6 Kapillarelektrophorese-basierendes Assay
In der analytischen Chemie wird zur Bestimmung der Enantiomerenreinheit manchmal
Kapillarelektrophorese (CE) eingesetzt. Der Elektrolyt enthält Cyclodextrinderivate als
chirales Selektionsmittel.[264-266] Die ursprüngliche Form der CE erlaubt aber nur ein paar
Dutzend ee-Bestimmungen pro Tag. Mit dem Human-Genomprojekt wuchsen die
analytischen Anforderungen, was in den letzten Jahren die Kapillarelektorphorese
revolutionierte. Die Kapillar-Array-Elektrophorese (CAE) arbeitet mit einer hohen Anzahl an
parallelen Kapillaren und wurde der ee-Bestimmung im Superhochdurchsatz angepasst.[248]
Mittels CAE sind bis zu 20.000 ee Bestimmungen pro Tag möglich. Eine Derivatisierung des
Produktes mit einem fluoreszenzaktiven Reagenz ermöglicht die Verfolgung der Reaktion.
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion ergibt sich eine Präzision von
+/- 3 %.
10.7 Circulardichroismus-basierendes Assay
Eine Alternative zur chiralen GC oder HPLC, ist die Abtrennung der Edukte von den
enantiomeren Produkten mit einer achiralen Säule und die anschließende Bestimmung des
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 68
Enantiomerenüberschusses über Circulardichroismus (CD). Damit die Methode angewandt
werden kann, muss der g-Faktor unabhängig von der Konzentration und linear hinsichtlich
des Enantiomerenüberschusses sein. Diese Bedingungen können nicht eingehalten werden,
wenn die chiralen Verbindungen Dimere oder Aggregate bilden, denn solche enantiomeren
oder diastereomeren Spezies würden ihre eigenen CD-Effekte zeigen. REETZ zeigte 2000 in
einem Evolutionsprojekt zur gerichteten Evolution, dass mit CD unter Benutzung eines
Durchflussinstrumentes und einem Autosampler bis zu 9000 ee Bestimmungen pro Tag
möglich sind.[267]
10.8 IR-Thermographie-basierendes Assay
Auf IR-Thermographie basierende Assays für enantioselektive Katalysatoren wurden von
REETZ entwickelt.[245, 268] Die Identifizierung von enantioselektiven Katalysatoren läuft über
die Verfolgung der Wärmetönung einer katalytischen enantioselektiven Reaktion. Eine
zeitaufgelöste Detektion einer enzymkatalytischen enantioselektiven Racematspaltung wurde
mit der Lipase aus Candida antarctica durchgeführt.[269] Als Substrate wurden separat (S)-
und (R)-1-Phenylethanol und Vinylacetat als Acylierungsmittel benutzt. Es konnte gezeigt
werden, dass die Reaktion hoch (R)-selektiv ist. Dies lässt sich daran erkennen, dass die Wells
der Mikrotiterplatte, welche das (R)-Enantiomer enthalten einen Hot Spot zeigen, was mit den
Literaturdaten, die ein ee-Wert von über 99 % zugunsten des (R)-Enantiomers bei einem
Umsatz von 50 % voraussagen, übereinstimmt. Eine Quantifizierung steht jedoch noch aus.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 69
Ph
OHOAc
Lipase Ph
OAc
Ph
OHOAc
Lipase Ph
OAc
(S) (S)
(R) (R)
Abb. 48: Lipasekatalysierte Umsetzung von (S)- bzw. (R)-1-Phenylethanol.
Abb. 49: Zeitaufgelöste IR-Thermographieaufnahmen der lipasekatalysierten Veresterung von 1-Phenylethanol vor Beginn der Reaktion (a), nach 0.5 min (b) und nach 3.5 min Das Kontrollexperiment ohne Enzym ist jeweils in der letzten Reihe gezeigt.
Aufgabenstellung 70
11 Aufgabenstellung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Enzym Cyclohexanonmonooxygenase (CHMO)
unter Anwendung des Prinzips der gerichteten Evolution in einen effizienten Katalysator für
die Baeyer-Villiger-Oxidation von Substraten umzuwandeln, die mit schlechten
Enantioselektivitäten reagieren. Speziell sollten 4-Hydroxy- und 4-Methoxycyclohexanon als
Substrate dienen. CHMO aus Acinetobacter calcoaceticus rekombinant in E. coli sollte dabei
als Biokatalysator dienen. Bei der enzymatischen Umwandlung von 4-Hydroxycyclohexanon
1 zu [1]# folgt eine spontane Umlagerung zu 2 (Abb. 50). Der Wildtyp-CHMO führt zu einem
ee von nur 9 % zugunsten des (R)-Enantiomers.[270]
O
O
O
OH
O
O
HO
CHMOaus Acinetobacter
calcoaceticus
OH
9 % ee (R), 61 % Ausbeute
E. coli als Expressionssystem
1 [1]# 2
4-Hydroxycyclohexanon 5-Hydroxy-ε-Caprolacton 5-(2-Hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on
Abb. 50: Enzymatische Baeyer-Villiger-Reaktion von 4-Hydroxycylohexanon zum 7-Ring-Lacton und anschließende Umlagerung zum 5-Ring-Lacton.
Zunächst musste ein Assay entwickelt werden, welcher die Anzucht der Bakterienkulturen,
Reaktionsbedingungen, Aufarbeitungsschritte und Analytik umfasst. Um einen möglichst
hohen Durchsatz im Screening der Enzymvarianten zu erzielen, sollten die einzelnen Schritte
automatisiert und in 96er deep-well Platten bzw. Glas-Mikrotiterplatten durchgeführt werden.
Es sollten mehrere Bibliotheken von Enzymvarinaten generiert werden. Zur Analyse der
Reaktionen sollte ein im Labor bereits etabliertes und erweitertes GC-Screening-System
verwendet werden.[271]
Assayentwicklung 71
12 Assayentwicklung
Der gesamte Screeningprozess lässt sich in mehrere Teilschritte untergliedern. Zunächst
mussten die Modellsubstrate, das 4-Hydroxy- und 4-Methoxycyclohexanon, und deren
Oxidationsprodukte, das 5-(2-Hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on und 5-Methoxy-2-oxepanon,
synthetisiert werden. Mit Hilfe der racemischen Oxidationsprodukte wurde eine geeignete
Kapillarsäule für die Enantiomerentrennung ausfindig gemacht. Als nächstes musste ein
Assay entwickelt werden: angefangen von der Anzucht der genetisch modifizierten E. coli-
Kulturen über die Reaktion bis hin zur Aufarbeitung und Validierung der Enzymvarianten auf
Enantioselektiviät mittels GC-Analytik.
12.1 Darstellung der Modellsubstrate
12.1.1 Modellsubstrat: 4-Hydroxycyclohexanon
Die Synthese des Substrates wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen durchgeführt.
Syntheseweg 1
Die Substratsynthese erfolgte nach Radlick und Crawford.[272] Eine Birch-Reduktion von
para-Methoxyphenol mit anschließender Hydrolyse des Enolethers.
OH
OCH3
OH
OCH3
OH
O
-50 °C 50 °C
Li / NH3 H3O+
Abb. 51: Syntheseweg 1 für 4-Hydroxycyclohexanon.
Assayentwicklung 72
Syntheseweg 2
Die Substratsynthese erfolgte nach Shvily u.a.[273] (1.Stufe) und Majewski u.a.[274] (2. Stufe).
Eine Hydrierung von Cyclohexandionmonoethylenketal mit NaBH4 und eine Entschützung
von 4-Hydroxycyclohexanon-ethylenketal mit p-TSOH in Wasser.
OONaBH4
MeOH
0 °C auf RTO
OO
OH OH
O
p-TSOH
H2ORefluxieren
Abb. 52: Syntheseweg 2 für 4-Hydroxycyclohexanon.
Syntheseweg 1 erwies sich als weniger gut geeignet. Zum einen musste unter Schutzgas
gearbeitet werden und zum anderen war die Ausbeute mit 66 % wesentlich geringer als
angegeben (98 % Literaturausbeute).
Syntheseweg 2 dagegen wurde unter Luftgasatmosphäre durchgeführt. Zudem konnte eine
Gesamtausbeute von 74 % erzielt werden.
Assayentwicklung 73
12.1.2 Modellsubstrat: 4-Methoxycyclohexanon
Syntheseweg
Das zweite Modellsubstrat wurde in drei Stufen nach Shvily u.a.[273] (1. Stufe) und Majewski
u.a.[274] (2. und 3. Stufe) dargestellt. Eine Abfolge von Hydrierung mit NaBH4, Williamson-
Ether-Synthese und Entschützung. Die Gesamtausbeute belief sich auf 65 %.
O
O
p-TsOHH2O
24 Std. Refluxieren
OONaBH4
MeOH0 °C auf RT
O
OO
OH
NaH, MeI
THF
OO
O
Abb. 53: Synthese von 4-Methoxycyclohexanon.
12.2 Darstellung der racemischen Produkte
Die racemischen Lactone, 5-(2-Hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on und
5-Methoxy-2-oxepanon, wurden durch Oxidation der Ketone mit m-CPBA erhalten.[275]
Assayentwicklung 74
12.3 Modellreaktionen
Die Modellreaktionen, eine Desymmetrisierung von 4-Hydroxycyclohexanon und von
4-Methoxycyclohexanon, sind in Abb. 54 und Abb. 55 dargestellt. Sie werden von der
CHMO aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (EC 1.14.13.22) katalysiert. Das Gen für die
CHMO wird in E. coli BL21(DE3) Zellen exprimiert. Die Zellkultur wird über Nacht (14 bis
18 Stunden) in LB-Medium/Cb (LB-Medium versetzt mit dem Antibiotika Carbenicillin) als
Vorkultur angezogen. Frisches LB-Medium/Cb wird mit der Vorkultur inokuliert und
anschließend bis zu einem OD600-Wert von 0.2-0.8 kultiviert. In der so erhaltenen
Hauptkultur wird die Enzymproduktion mittels IPTG induziert. Danach kann die CHMO-
Hauptkultur zur Oxidation des Modellsubstrates eingesetzt werden.
OOO
OH
O
HO
CHMOin
E. coli
OH
9 % ee (R)-Enantiomer61 % Ausbeute
O
O
HO
OO OH
H
H
O
O2 (R)-γ-Lacton
(S)-γ-Lacton
Abb. 54: Modellreaktion 1.
Zur Verifizierung der Umlagerungsreaktion wurde das γ-Lacton zum Aldehyd oxidiert (siehe
16.2.5).
Assayentwicklung 75
OCH3
OO
H3CO
O
OO
H3CO
+O2
CHMO in
E. Coli
(R)-Oxepanon (S)-Oxepanon
78 % ee (S)-Enantiomer, 84 % Ausbeute
Abb. 55: Modellreaktion 2.
12.4 Ausarbeitung der Reaktionsbedingungen
Zum Auffinden geeigneter Reaktionsbedingungen wurden die meisten Reaktionen sowohl mit
4-Hydroxycyclohexanon (Substrat) als auch mit Cyclohexanon (Vergleichsubstrat)
durchgeführt, um auszuschließen, dass keine Fehler der Reaktionsdurchführung vorliegen.
Die Umsetzung von Substrat und Vergleichsubstrat mit der CHMO aus Acinetobacter sp.
NCIMB 9871 wurde zunächst in Erlenmeyerkolben durchgeführt und später auf deep-well
Platten übertragen.
Zur Durchführung einer Biotransformation wird eine E. coli BL21 (DE3) Kultur, welche
Träger des CHMO-Gens ist, über Nacht angezogen. Dies wird als Vorkultur bezeichnet. Mit
ihr wurde ein frisches Nährmedium, welches dann als Hauptkultur bezeichnet wird, angeimpft
und bis zum gewünschten OD600-Wert kultiviert. Mit der Zugabe von IPTG wurde die
Enzymproduktion in der Hauptkultur induziert. Das Substrat konnte nun umgesetzt werden.
Die Aufarbeitung erfolgte durch Extraktion mit Essigsäureethylester. Bevor die organische
Phase abgenommen wurde, wurde noch zur besseren Phasentrennung zentrifugiert.
Vor-und Hauptkultur
Die Vorkultur für die Assayentwicklung wurde immer nach dem gleichen Schema angefertigt.
Eine E. coli-Einzelkolonie wurde in einen Erlenmeyer-Kolben mit LB-Medium/Cb überpickt
und über Nacht bei 30 °C im Schüttelinkubator kultiviert. Mit der Vorkultur wurde ein neues
Assayentwicklung 76
LB-Medium/Cb im Verhältnis 1:100 angeimpft und im Schüttelinkubator bis zu dem
gewünschten OD600-Wert kultiviert.
Wahl der Induktionsparameter
Für eine effiziente Enzymproduktion müssen geeignete Parameter für die Induktion gewählt
werden. Die Induktion sollte in der logarithmischen Wachstumsphase der Bakterienkultur
also bei einer OD600 zwischen 0.2 und 1.0 erfolgen. Das Induktionsmittel sollte in
ausreichender, aber nicht zu hoher Konzentration zugegeben werden, da sich ansonsten
Inclusion Bodies bilden können. Die von unserer Kooperationspartnerin M. M. Kayser aus
Kanada vorgegebenen Induktionsparameter dienten in den Untersuchungen zur
Assayaufstellung als Ausgangsparameter:
Parameter zur Induzierung
• OD600 = 1.0
• Induktionszeit ca. 1 Stunde
• Induktionstemperatur 37 C
Assayentwicklung 77
12.4.1 Umsetzung der Substrate im Erlenmeyerkolben
Testreihe 1
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 1.0 mit 19 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Dies entspricht einer IPTG-Konzentration von
0.08 mM. Nach der Induzierung wurde die Hauptkultur in 1 ml Portionen auf 10 ml
Erlenmeyerkolben verteilt und das jeweilige Substrat hinzugegeben. Die Reaktion wurde für
24 Stunden bei RT mit 150 rpm geschüttelt.
Tab. 4: Testreihe 1.
Substrat
Substrat-
Volumen
in µl
Hauptkultur-
Volumen in ml
Induktionszeit/
-Temperatur Umsatz
1 100
3 100 Cyclohexanon
(δ = 0.947 g/ml) 5
1 70 min, 30 °C
100
1 0
3 0 4-Hydroxycyclohexanon
(δ = 1.165 g/ml) 5
1 70 min, 30 °C
0
1 100
3 100 Cyclohexanon
5
1 30 min, 37 °C
100
1 0
3 0 4-Hydroxycyclohexanon
5
1 30 min, 37 °C
0
1 100
3 100 Cyclohexanon
5
1 50 min, 37 °C
100
1 0
3 0 4-Hydroxycyclohexanon
5
1 50 min, 37 °C
0
Assayentwicklung 78
Resultat
Mit den gewählten Induktionsparametern (OD600 und IPTG-Menge) ließ sich Cyclohexanon
vollständig umsetzen. Die Induktionsdauer und -temperatur konnte in weiten Grenzen variiert
werden. Das 4-Hydroxycyclohexanon wurde bei den angegebenen Parametern nicht
umgesetzt. Vermutlich lag eine Substrat- oder Produktinhibierung vor. Wenn dieses zutraf,
dann sollte eine Herabsetzung der Substratkonzentration zu einer Umsetzung des
4-Hydroxycyclohexanons führen.
Testreihe 2
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.48 mit 19 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Dies entspricht einer IPTG-Konzentration von
0.08 mM. Nach der Induzierung wurde die Hauptkultur in den unten angegebenen Mengen
auf 50 ml Erlenmeyerkolben verteilt und das jeweilige Substrat hinzugegeben. Zur Reaktion
wurde für 24 Stunden bei RT mit 150 rpm geschüttelt.
IPTGEndkonz. = 0.08 mM
Induktionszeit und –Temperatur: 35 min, 37 °C
Tab. 5: Testreihe 2.
Substrat
Substrat-
Volumen
in µl
Hauptkultur-
Volumen
in ml
Umsatz
in %
3 10 100
5 10 100 4-Hydroxycyclohexanon
(δ = 1.165 g/ml) 10 10 50
Resultat
Im Unterschied zu Testreihe 1 wurde hier mit geringeren Konzentrationen von
4-Hydroxycyclohexanon gearbeitet. Bei entsprechend niedriger Substratkonzentration
erfolgte der Umsatz von 4-Hydroxycyclohexanon quantitativ.
Assayentwicklung 79
12.4.2 Übertragung der Reaktionsbedingungen auf deep-well Platten
Sowohl für das Wachstum der E. coli Zellen als auch für die B.-V.-Oxidation muss ein
ausreichender Sauerstoffeintrag gewährleistet sein. Bei Benutzung von deep-well Platten ist
dieser limitiert, da die Vertiefungen einer deep-well Platte nur eine kleine Oberfläche
besitzen. Es standen deep-well Platten mit unterschiedlicher Anzahl von Vertiefungen (24, 48
und 96) zur Verfügung. Eine kleine Anzahl von Vertiefungen pro deep-well Platte ist
gleichbedeutend mit einer geringeren Tiefe, aber größeren Oberfläche pro Vertiefung. Das
Oberflächen- zu Volumenverhältnis ist also bei einer 24er deep-well Platte am günstigsten.
Wobei eine 96er deep-well Platte, deren Vertiefung größer und Oberfläche kleiner ist,
wesentlich stärker geschüttelt werden kann, was sich wiederum positiv auf den
Sauerstoffeintrag auswirkt.
Testreihe 3
Die Umsetzungen wurden in einer 24er deep-well Platte durchgeführt.
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.38 mit 19 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf die
einzelnen Wells einer 24er deep-well Platte. Nach der Zugabe des Substrates wurde für
24 Stunden bei RT mit 320 rpm geschüttelt.
IPTGEndkonz. = 0.08 mM
Induktionszeit und -Temperatur: 36 min, 37 °C
Tab. 6: Testreihe 3.
Substrat Substrat-
Volumen in µl
Hauptkultur-
Volumen in ml Umsatz in %
0.5 1 0 4-Hydroxycyclohexanon
(δ = 1.165 g/ml) 1 1 0
0.5 1 100
1 1 100 Cyclohexanon
(δ = 0.947 g/ml) 1.5 1 100
Assayentwicklung 80
Resultat
Cyclohexanon wurde vollständig umgesetzt, jedoch fand keine Umsetzung des
4-Hydroxycyclohexanons statt. Das Problem ist wahrscheinlich auf den schlechten
Sauerstoffeintrag zurückzuführen; eine 24er deep-well Platte lässt sich nur mit geringer rpm-
Zahl schütteln, da die Reaktionslösung leicht überschwappen kann (die Wells haben eine
große Oberfläche und nur eine geringe Tiefe).
Testreihe 4a
Die Umsetzungen wurden in einer 48er deep-well Platten durchgeführt. Zur besseren
Durchmischung der Reaktionsgemische und damit auch zu einem höheren Sauerstoffeintrag
wurden Rührkerne eingesetzt.
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.5 mit 19 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf die
einzelnen Wells einer 48er deep-well Platte. Nach der Zugabe des Substrates wurde für 24
Stunden bei RT gerührt.
IPTGEndkonz. = 0.08 mM
Induktionszeit und -Temperatur: 60 min, 37 °C
Tab. 7: Testreihe 4a.
Substrat Substrat-
Volumen in µl
Hauptkultur-
Volumen in ml Umsatz in %
1 1 50 4-Hydroxycyclohexanon
(δ = 1.165 g/ml) 1 3 100
1 1 100 Cyclohexanon
(δ = 0.947 g/ml) 1 3 100
Resultat
Der Einsatz von Rührkernen führt zur besseren Durchmischung und damit auch zu einem
höheren Sauerstoffeintrag. 4-Hydroxycyclohexanon ließ sich somit bei geeignetem Substrat-
zu Kulturvolumenverhältnis vollständig umsetzen.
Assayentwicklung 81
Testreihe 4b
Wie zuvor (Testreihe 4a) wurden für eine bessere Durchmischung Rührkerne eingesetzt.
Unter Berücksichtigung einer Publikation von Mihovilovic et al.[270] wurde zur Induktion eine
weitaus geringere Menge an IPTG (Endkonzentration 0.025 mM) verwendet.
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.35 mit 6 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf die
einzelnen Wells einer 48er deep-well Platte. Nach der Zugabe des Substrates wurde für 24
Stunden bei RT gerührt.
IPTGEndkonz.. = 0.025 mM
Induktionszeit und -Temperatur: 45 min, 37 °C
Tab. 8: Testreihe 4b.
Substrat Substrat-
Volumen in µl
Hauptkultur-
Volumen in ml Umsatz in %
1 1 50 4-Hydroxycyclohexanon
(δ = 1.165 g/ml) 1 3 100
1 1 100 Cyclohexanon
(δ = 0.947 g/ml) 1 3 100
Resultat
Es wurden die gleichen Umsätze wie unter der Testreihe 4a erzielt. Die IPTG-Konzentration
konnte somit für die folgenden Reaktionen auf 0.025 mM reduziert werden.
Assayentwicklung 82
Testreihe 5
Die Umsetzungen wurden in einer 96er deep-well Platte mit Rührkernen durchgeführt. Die
IPTG-Konzentration betrug 0.025 mM.
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.8 mit 6 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf die
einzelnen Wells einer 96er deep-well Platte. Nach der Zugabe des Substrates wurde für 24
Stunden bei RT gerührt.
IPTGEndkonz. = 0.025 mM
Induktionszeit und -Temperatur: 30 min, 37 °C
Tab. 9: Testreihe 5.
Substrat Substrat-
Volumen in µl
Hauptkultur-
Volumen in ml Umsatz in %
0.5 0.2 76
1 0.2 20
0.5 0.5 100
0.5 1 100
4-Hydroxycyclohexanon
(δ = 1.165 g/ml)
1 1 100
0.5 0.2 100
1 0.2 100
0.5 0.5 100
0.5 1 100
Cyclohexanon
(δ = 0.947 g/ml)
1 1 70
Resultat
Der Einsatz von Rührkernen sorgt auch bei einer 96er deep-well Platte für einen
ausreichenden Sauerstoffeintrag.
Assayentwicklung 83
Testreihe 6
Die Umsetzungen wurden in einer 96er deep-well Platte durchgeführt. Die Durchmischung
erfolgte sowohl durch Rühren oder Schütteln.
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.9 mit 6 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf die
einzelnen Wells einer 96er deep-well Platte. Nach der Zugabe des Substrates wurde für 24
Stunden bei RT geschüttelt bzw. gerührt.
IPTGEndkonz. = 0.025 mM
Induktionszeit und -Temperatur: 5 min, 37 °C
Tab. 10: Testreihe 6.
Substrat Substrat-
Volumen in µl
Hauptkultur-
Volumen in µl Umsatz
1 100 47 %
1 200 58 %
1 500 100 %
0.5 100 -
0.5 200 100 %
4-Hydroxycyclohexanon
(δ = 1.165 g/ml)
Rühren
0.5 500 100 %
1 100 30 %
1 200 64 %
1 500 100 %
0.5 100 58 %
0.5 200 100 %
4-Hydroxycyclohexanon
Schütteln
0.5 500 -
Resultat
Da die Wells (Vertiefungen) einer 96er deep-well Platte tief genug sind und nur maximal
500 µl Kulturmedium verwendet wurde, konnte mit 900 rpm geschüttelt werden. Die Umsätze
entsprechen weitgehend den Umsätzen die man bei dem Einsatz von Rührkernen erzielt.
Assayentwicklung 84
12.5 Bestimmung des Extraktionsfaktors
Zur Bestimmung des Extraktionsfaktors wurden die Reaktionskulturen ein zweites Mal auf
die gleiche Art und Weise extrahiert und der Umsatz bestimmt.
Vor-und Hauptkultur
Vor-und Hauptkultur wurden wie bisher in einem Erlenmeyerkolben angesetzt.
12.5.1 Versuchsreihe 1
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.8 mit 6 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf 1.5 ml
Eppendorfgefäße. Nach der Zugabe der Substratlösung (100 g/l) wurde bei RT mit 700 rpm
geschüttelt.
Tabelle 8:
IPTGEndkonz. = 0.025 mM
Induktionszeit und –
Temperatur: 40 min, 37 °C
Reaktionszeit: 15 Stunden
Substrat: 4-Hydroxycyclohexanon
Tabelle 9:
IPTGEndkonz. = 0.025 mM
Induktionszeit und –Temperatur: 40 min, 37 °C
Reaktionszeit: 22 Stunden
Substrat: 4-Hydroxycyclohexanon
Assayentwicklung 85
Tab. 11: Bestimmung des Extraktionsfaktors.
Extraktion
Volumen
Substratlösung
in µl
Hauptkultur-
Volumen
in µl
Umsatz
in %
100 42
200 79
300 99
400 100
erste 5
500 100
100 42
200 79
300 99
400 100
zweite 5
500 100
Tab. 12: Bestimmung des Extraktionsfaktors.
Extraktion
Volumen
Substratlösung
in µl
Hauptkultur-
Volumen
in ml
Umsatz
in %
200 85
300 99
400 100 erste 5
500 100
200 85
300 99
400 100 zweite 5
500 100
Resultat
Die Umsatzzahlen nach der zweiten Aufarbeitung entsprechen denen der ersten Aufarbeitung.
Der Extraktionsfaktor ist somit gleich eins.
Assayentwicklung 86
12.5.2 Versuchsreihe 2
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.35 mit 6 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Dies entspricht einer IPTG-Konzentration von
0.025 mM. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf die einzelnen Wells einer 96er
deep-well Platte. Nach der Zugabe der Substratlösung (100 g/l)) wurde bei RT mit 900 rpm
geschüttelt.
IPTGEndkonz. = 0.025 mM
Induktionszeit und –Temperatur: 40 min, 37 °C
Substrat: 4-Hydroxycyclohexanon
Tab. 13: Bestimmung des Extraktionsfaktors.
Extraktion
Volumen
Substratlösung
in µl
Hauptkultur-
Volumen
in µl
Reaktions
-zeit
in Std.
Umsatz
in %
ee
in %
100 25 8.16
200 37 8.23 erste 5
300
12
43 9.35
100 26 9.04
200 38 8.70 zweite 5
300
12
44 8.78
100 36 8.23
200 46 9.35 erste 5
300
24
58 9.53
Resultat
Die Umsatzzahlen nach der zweiten Aufarbeitung entsprechen praktisch denen der ersten
Aufarbeitung. Der Extraktionsfaktor ist gleich eins. Zudem ist deutlich zu sehen, dass die
Reaktion nach 12 Stunden noch nicht abgeschlossen ist.
Assayentwicklung 87
12.5.3 Versuchsreihe 3
Das Substrat wurde direkt nach der Induzierung hinzugegeben.
Induzierung und Reaktion
Eine 100 ml E. coli BL21(DE3) Hauptkultur wurde bei einem OD600-Wert von 0.3 mit 6 µl
IPTG-Lösung (100 mg/ml) induziert. Es folgte die Aufteilung des Kulturmediums auf die
einzelnen Wells einer 96er deep-well Platte. Nach der Zugabe der Substratlösung (100 g/l))
wurde für 24 Stunden bei RT mit 900 rpm geschüttelt.
IPTGEndkonz. = 0.025 mM
Substrat: 4-Hydroxycyclohexanon
Tab. 14: Bestimmung des Extraktionsfaktors.
Extraktion
Volumen
Substratlösung
in µl
Hauptkultur-
Volumen
in µl
Reaktions-
Zeit
in Std.
Umsatz
in %
ee
in %
100 29 9.02
200 54 8.47 erste Extraktion 5
300
12
58 8.34
100 31 8.52
200 55 8.85 zweite Extraktion 5
300
12
58 8.10
100 34 9.84
200 79 8.77 erste Extraktion 5
300
24
85 10.0
Resultat
Die Umsatzzahlen nach der zweiten Aufarbeitung entsprechen praktisch denen der ersten
Aufarbeitung. Der Extraktionsfaktor ist gleich eins. Zudem ist deutlich zu sehen, dass die
Reaktion nach 12 Stunden noch nicht abgeschlossen ist. Die direkte Zugabe des Substrates
ohne Induktionszeit wirkt sich positiv auf die Umsätze aus und spart einen Arbeitsschritt ein.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 88
13 Semiautomatisierter Screening-Prozess
Für einen hohen Durchsatz im Screening der Enzymvarianten ist es erforderlich, die einzelnen
Teilschritte, von dem Picken der Kolonien bis zur analytischen Auswertung der
Enzymvarianten, so weit wie möglich zu automatisieren.
Zunächst beginnt der Prozess mit der Mutagenese an den Ausgangsgenen und der
Amplifizierung der DNA über die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die DNA wird dann in
den pET 22b (+) –Vektor kloniert und die so gewonnene Plasmid-DNA in kompetente Zellen
des E. coli Stammes Top 10 transformiert. Dass aus einer Minipräparation erhaltene Plasmid,
wird schließlich in kompetente Zellen des E. coli Stammes BL21 (DE3) transformiert. Die
transformierten Bakterienzellen werden auf 1 x LB-Agarplatten mit Carbenicillin als
Antibiotikum ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
13.1 Anzucht der Kolonien
Die gewachsenen Klone wurden mit dem Colony Picker Q-Pix (Abb. 56) der Firma Genetix
automatisch in 96er deep-well Mikrotiterplatten, gefüllt mit 1 x LB-Medium/CB, überführt.
Das Befüllen der 96er deep-well Platten mit Kulturmedium erfolgte mit einem
8-Kanal-Dispenser MultidropDW der Firma Labsystems.
Abb. 56: Colony Picker QPix der Firma Genetix.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 89
Mit dem Colony-Picker ließen sich mehrere tausend Kolonien innerhalb weniger Stunden
verarbeiten. Als Agarplatten werden quadratische QTray´s verwendet. Nach dem Picken der
Kolonien wurden die 96er deep-well Platten mit einer sauerstoffdurchlässigen Klebefolie der
Firma Advanced Biotechnologies abgedeckt und die Bakterien über Nacht im
Schüttelinkubator mit 700 rpm bei 30 °C kultiviert.
13.2 Anlegen der Gefrier- und Hauptkulturen
Aus den Vorkulturen wurden mit Hilfe des Pipettierroboters Genesis (Abb. 57) der Firma
Labsystems Gefrierkulturen und Hauptkulturen angelegt. Der Pipettierroboter ist unter
Benutzung von programmierten Pipettierskripten in der Lage, die verwendeten
Mikrotiterplatten automatisch zu befüllen. Die Hauptkultur wurde für drei Stunden bei 37 °C
mit 600 rpm bis zu dem gewünschten OD600-Wert im Schüttelinkubator Multitron der Firma
Infors AG kultiviert. Die Induzierung der Hauptkulturen mit IPTG zur Enzymproduktion und
die Zugabe des Substrates erfolgte ebenfalls über entsprechende Pipettierskripte mit dem
Pipettierrobotor Genesis.
Abb. 57: Pipettierroboter Genesis der Firma Labsystems.
Der Pipettierroboter besteht aus einem Karusell (rechts), zur Aufbewahrung der
Mikrotiterplatten und einem Roboterarm für deren Transport von dem Karusell zu der
Arbeitsfläche. Auf dieser wurden Mikrotiterplatten mit einem 96-fach Pipettiermodul
bearbeitet. Über das Pipettiermodul wurde aus der Vorkultur die Hauptkultur angeimpft und
eine Glycerin-Gefrierkultur angelegt. Durch die Liquid Station wurde das Glycerinmedium
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 90
für die Gefrierkulturen vorgelegt und es erfolgte die Zugabe von Induktionsmittel und
Substrat.
13.3 Reaktion
Für die Reaktion wurden die Bakterien bei Raumtemperatur für 24 Stunden mit 900 rpm im
Schüttelinkubator Multitron der Firma Infors AG geschüttelt. Die deep-well Platten wurden
erneut mit sauerstoffdurchlässiger Klebefolie abgedichtet.
13.4 Aufarbeitung
Die Extraktion der Proben erfolgte ebenfalls mit dem Pipettierroboter Genesis der Firma
Tecan. Dabei übernahm die Liquid-Station die Zugabe des Extraktionsmittels und über das
96-fach Temo-Pipettiermodul erfolgte das Durchmischen von organischer und wässriger
Phase. Danach wurden die deep-well Platten von Hand mit Verschlussmatten der Firma HJ
Bioanalytik verschlossen und in einer Zentrifuge zur Phasentrennung für 15 min bei 3000 rpm
zentrifugiert. Schließlich wurde die organische Phase mit Hilfe des Pipettierroboters
abgenommen und in eine Glasmikrotiterplatte überführt.
13.5 Analyse der enzymatischen Umsetzungen – Screening
Die Glasmikrotiterplatten, welche die zu untersuchenden Proben enthalten, wurden mit einer
Aluminiumfolie abgedeckt, mit einer dünnen Gummimatte versehen und durch ein System
von Aluboden und verschraubbarer Abdeckplatte aus Aluminium zusammengehalten, um eine
Verdampfung des Lösemittels über Nacht zu verhindern. Anschließend wurden die Proben
mit einem automatisierten GC-Screening-System gemessen.
Ein auf GC-basierendes Screeningsystem hat den Vorteil, dass die Umsätze und
Enantiomerenverhältnisse genau bestimmt werden können. Die Proben müssen allerdings
sequentiell gemessen werden. Um dennoch einen mittel-hohen Durchsatz an Proben zu
gewährleisten, können mehrere Gaschromatographen parallel betrieben werden. Die
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 91
Probenmessung sollte im Automatikbetrieb erfolgen. Zudem ist eine Koordination von
Probenaufgabe und Datenaufnahme und -auswertung erforderlich.
Erfüllt werden diese Anforderungen mit dem HTS-Pal-System (High-Throughput-Screening
Prep-And-Load System) der schweizer Firma CTC. Das System besitzt einen Probengeber,
welcher mit einer Mikrotiterspritze ausgestattet ist. Der Probengeber ist in der Lage, neben
dem Injektionsport, Mikrotiterplatten, die sich in einem Schubladensystem befinden und eine
Waschstation, welche der Reinigung der Injektionsspritze dient, anzusteuern. KÜHLING setzte
das HTS-Pal-System erfolgreich in ein von ihm entwickeltes GC-Screening-System ein.[271]
Dieses System soll im folgenden kurz vorgestellt werden.
13.5.1 Mitteldurchsatz-Screening System nach KÜHLING
Das von Kühling[271] verwendete System besteht aus zwei Gaschromatographen, einem
Probengeber und einem Personal Computer (siehe Abb. 59). Über einen standardisierten
Datenbus (HP-IB) kann mit der Chemstation®-Software der Druck, die Temperatur, der Fluß,
etc. kontrolliert als auch Daten, z.B. des Detektors ausgetauscht werden. Das System umfasst
ferner zwei Waschstationen und zwei Schubladensysteme, welches bis zu acht
Mikrotitterplatten aufnehmen können. Der Probengeber ist in der Weise angeordnet, dass er
beide Injektionsports erreicht. Das Programm Chemstation ermöglicht die Anwendung
zusätzlicher Programme (Makros), die vor und nach jeder analytischen Messung ablaufen.
Solch ein Makro steuert den Probengeber , wobei jede Position auf einer Mikrotiterplatte über
die Sequenztabelle gekennzeichnet ist. Für verschiedene Mikrotiterplatten lassen sich
unterschiedliche Sequenzen definieren. Der Sequenzname gibt die Position der
Mikrotiterplatte im Schubladensystem vor, was den Probengeber dazu befähigt die richtige
Probe anzusteuern. Ein anderes Makro stellt sicher, dass nach jedem Durchlauf nur die
relevanten Signale erfasst werden. Die analytischen Daten werden über DDE (Dynamic Data
Exchange) in Microsoft-Excel übertragen. Dort werden sie in einer entsprechend formatierten
Tabelle für Mikrotiterplatten dargestellt. Schließlich sind die beiden Gaschromatographen mit
Wasserstoffwächtern ausgestattet. Diese kontrollierten die H2-Konzentration in den beiden
Öfen. Bei einer Konzentration höher als 1 % (ein explosionsfähiges Gemisch liegt ab 4 %
vor) reagieren die Wasserstoffwächter mit einer automatischen Umstellung der
Trägergaszufuhr von Wasserstoff auf Stickstoff.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 92
Abb. 58: Schematischer Aufbau des GC-Screening-Systems nach Kühling.
13.5.2 Neues Hochdurchsatz-GC-Screening-System
Das Screening-System von Kühling wurde in einigen Punkten abgewandelt. So wurde jeder
Gaschromatograph mit einem Probengeber ausgestattet (Abb. 59). Dies wurde erforderlich, da
es mit der Software des alten Systems, die den Probengeber in die Lage versetzte beide
Gaschromatographen anzusteuern, zu Systemabstürzen kam. Mit dem neuen System und
schließlich einer neuen Software (GC Chemstation; Rev. A. 09.03 [1417], Agilent
Technologies 1990-2002) konnten die Proben parallel bearbeitet werden. Der Einsatz eines
dritten GCs ermöglicht einen Gesamtdurchsatz von 800 Proben pro Tag.
Abb. 59: Aufbau des GC-Screening-Systems im Labor. Zu sehen sind die drei Gaschromatographen mit je einem Probengeber.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 93
Die Analysendurchläufe werden als TXT-, GIF- und WMF-Files über die Chemstation
gespeichert. Die Auswertung der Daten erfolgt über ein Makro, welches die Peakflächen der
relevanten Signale aus den TXT-Dateien einliest und aus ihnen den Umsatz und den
Enantiomerenüberschuss berechnet. Die ausgewerteten Daten der Proben einer deep-well
Platte werden in einer Excel-Tabelle dargestellt (Abb. 60). Ein WMF- oder GIF- DATA-File
zeigt das Chromatogramm einer Messung (Abb.6).
vial PP retTime1 retTime2 retTime3 area1 area2 area3 ee Umsatz
1 A1 1,883 193,83533 0 02 A2 3,97 4,302 0 46,13587 56,74554 10,31% 100,00%3 A3 3,969 4,301 0 40,18934 48,942 9,82% 100,00%4 A4 3,967 4,3 0 38,85726 50,16728 12,70% 100,00%5 A5 3,969 4,302 0 37,37188 46,08666 10,44% 100,00%6 A6 3,969 4,301 0 42,0028 51,7565 10,40% 100,00%7 A7 1,882 3,978 4,313 77,54332 13,89032 16,70912 9,21% 23,15%8 A8 3,972 4,305 0 37,99294 46,11659 9,66% 100,00%9 A9 1,884 111,29697 0 010 A10 1,884 108,90109 0 011 A11 3,977 4,31 0 31,30235 38,04386 9,72% 100,00%12 A12 1,882 3,973 4,306 6,26194 39,07787 45,80179 7,92% 91,19%13 B1 3,977 4,307 0 36,98167 60,04954 23,77% 100,00%14 B2 3,978 4,31 0 40,38678 49,57404 10,21% 100,00%15 B3 3,968 4,299 0 37,49183 49,12681 13,43% 100,00%16 B4 3,963 4,296 0 41,3732 49,96413 9,41% 100,00%17 B5 3,972 4,304 0 38,77441 47,71441 10,34% 100,00%18 B6 3,968 4,299 0 43,81905 54,45482 10,82% 100,00%19 B7 1,881 3,978 4,313 66,56966 16,47419 20,00516 9,68% 29,49%20 B8 3,973 4,306 0 38,07217 46,61518 10,09% 100,00%21 B9 3,968 4,301 0 38,90234 40,29548 1,76% 100,00%22 B10 1,878 112,16309 0 023 B11 3,974 4,308 0 34,05958 36,63339 3,64% 100,00%24 B12 3,965 4,296 0 56,81964 68,80012 9,54% 100,00%25 C1 3,966 4,298 0 46,18979 57,86331 11,22% 100,00%26 C2 3,966 4,299 0 41,49463 51,37588 10,64% 100,00%27 C3 1,878 118,22449 0 028 C4 1,877 3,973 4,31 98,11345 8,66235 10,70846 10,56% 13,10%29 C5 3,951 4,282 0 41,7913 51,52863 10,43% 100,00%30 C6 1,876 156,10524 0 031 C7 3,955 4,288 0 40,42964 46,7724 7,27% 100,00%32 C8 1,868 123,76998 0 033 C9 3,953 4,285 0 38,8961 47,02884 9,46% 100,00%34 C10 1,867 113,46581 0 0
Abb. 60: Ausschnitt aus einer typischen Excel-Tabelle. Spalte eins und zwei geben die Nummer bzw. Position des jeweiligen Wells an. Spalten drei bis fünf geben die Retentionszeiten und Spalten sechs bis sieben die Integrationsflächen des Substrates und der Produktenantiomere an. In den letzten beiden Spalten ist der Enantiomerenüberschuss und der Umsatz aufgeführt.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 94
O
OH
4-Hydroxy-cyclohexanon
R)- und (S)-Lacton
Abb. 61: Gif-Bild einer GC-Analyse. Die Signale bei einer Re4.302 min sind die beiden Enantiomeren. Bei 1.478 min liegt da
13.5.3 Kapillartrennsäule zur Auftrenn
Lactonenantiomeren
Die Auftrennung der Enantiomeren erfolgte an einer chiralen K
Firma BGB Analytik AG. [276] Ihr Einsatzbereich erstreckt sic
und Terpene. Die Parameter der Kapillartrennsäule sind:
BGB-178
20 % 2,3-Diethyl-6-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin gel
85 % methylpolysiloxan)
• Innendurchmesser: 0.25 mm
• Filmdicke: 0.25 µm
• Länge: 15 m
(
O
O
OH
tentionszeit von 3.975 min unds Substrat.
ung der 5-Ring-
apillartrennsäule BGB-178 der
h auf Lactone, Alkohole, Ester
öst in BGB-15 (15 % Phenyl-,
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 95
Die eigentliche Länge der BGB-178 beträgt 30 m. Es wurde eine Halbierung der Länge der
Kapillartrennsäule vorgenommen, um die Retentionszeiten zu verkürzen (von 8 min auf unter
5 min) und damit einen höheren Durchsatz an Proben zu erzielen.
13.5.3.1 Faktorbestimmung
Das Produkt einer Baeyer-Villiger-Reaktion besitzt logischerweise einen höheren
Sauerstoffanteil als das Edukt. Dies hat zur Folge, dass bei Verwendung eines FID-Detektors
das Produkt im geringeren Ausmaß detektiert wird als das Edukt. Um den genauen Umsatz zu
erhalten, musste eine Faktorbestimmung durchfgeführt werden (erfolgt durch die analytische
Abteilung für Gaschromatographie des Max-Planck-Instituts). Zur Bestimmung des Faktors
wurden Reinsubstanzen von Edukt und Produkt verwendet, wobei das Edukt als Standard
gesetzt wurde (Faktor: 1). Für das 5-Ring-Lactonprodukt wurde ein Faktor von 1.31 ermittelt.
13.5.3.2 Chromatographie-Bedingungen
Die analytischen Messungen erfolgten isotherm, um ein zeitaufwendiges Abkühlen des
GC-Ofens, was bei Benutzung eines Temperaturprogramms der Fall wäre, zu vermeiden. So
ließ sich die Zeit zwischen zwei Injektionen kurz halten. Die einzelnen Parameter sind unten
aufgeführt.
• Ofentemperatur 5 min auf 150 °C
• Trägergas Wasserstoff
• Trägergasdruck 0.4 bar
• Injektortemperatur 220 C
• Detektortemperatur 350°C
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 96
13.5.4 Kapillartrennsäule zur Auftrennung der Enantiomeren von
5-Methoxy-2-oxepanon
Die Auftrennung der Enantiomeren erfolgte an einer chiralen Kapillartrennsäule BGB-176SE
der Firma BGB Analytik AG.[277] Ihr Einsatzbereich erstreckt sich auf Lactone, Alkohole,
Ester und Terpene. Die Parameter der Kapillartrennsäule sind:
BGB-176SE
20 % (2,3 Dimethyl-6-tert-butyl-dimethylsilyl-β-cyclodextrin) gelöst in einer SE52 (5 %
Phenyl-, 95 % methylpolysiloxan).
• Innendurchmesser: 0.25 mm
• Filmdicke: 0.25 µm
• Länge: 30 m
Chromatographie-Bedingungen
• Ofentemperatur 8 min auf 150 °C
30 °C/min auf 210 C
2 min isotherm auf 210°C
• Trägergas Wasserstoff
• Trägergasdruck 0.7 bar
• Injektortemperatur 220 C
• Detektortemperatur 320°C
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 97
14 Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO auf die
beiden Modellsubstrate
14.1 Ergebnisse zum Modellsubstrat 4-Hydroxycyclohexanon Im Folgenden sind die Ergebnisse der durch epPCR generierten Mutantenbanken der ersten
und zweiten Generation, der Sättigungsmutagenesen und der Einzelmutationen auf das
Wesentliche zusammengefasst.
14.1.1 Enzymvarianten der ersten Generation
Ausgehend vom Wildtyp der CHMO aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 wurde eine erste
Generation von Enzymvarianten mit fehlerhafter PCR generiert. Es wurden sieben
Bibliotheken (1300-1800 Mutanten je Bibliothek) mit unterschiedlichen PCR-Bedingungen
erstellt (siehe Molekularbiologische Arbeiten), wobei 60 bis 90 % aller Mutanten einer
Bibliothek aktiv waren (Tab. 15).
Innerhalb der ersten Generation mit ca. 10000 Mutanten wurden sowohl verbesserte
(R)-selektive als auch verbesserte (S)-selektive Mutanten gefunden. Es wurden insgesamt 10
Mutanten sequenziert (Tab. 16). Bei diesen lagen zwischen einer und drei ausgetauschte
Aminosäuren vor. Die beste (R)-selektive Mutante (I-H7-F4, 54 % ee) übertrifft den Wildtyp
um das sechsfache bezüglich der Enantioselektivität. Die beste (S)-selektive Mutante I-J6-F9
zeigt einen Enantiomerenüberschuss von sogar 83 %.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 98
Tab. 15: Ergebnisse aus der ersten Generation.
Bibliothek
Anzahl
der
Mutanten
Beste (R)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
Beste (S)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
Wt - - 100 9 - - -
C 1344 I-C2-B7 100 34 I-C3-A10 72 8
D 1440 I-D1-B6 100 21 I-D9-G3 100 0.2
E 1440 I-E1-F1
I-E12-B5
100
80
55
49 I-E15-C11 75 8
F 1440 I-F1-F5
I-F13-B2
100
89
40
45 I-F4-B9 100 46
H 1440 I-H7-F4 100 54 I-H3-C9 100 18
J 1344 I-J2-E12 100 17 I-J6-F9 85 83
K 1728 I-K7-D11 86 43 I-K2-F5
I-K6-G2
100
100
79
78
Aufgeführt sind die jeweils beste (R)- und (S)-Mutante einer Bibliothek. Liegt noch eine ähnlich gute Mutante vor, so ist auch diese mitaufgeführt. Die Bibliotheken A, B und G liegen nicht vor, da die Anzahl der Klone zu gering war. Wt = Wildtyp-Enzym.
Tab. 16: Sequenzierungen aus der ersten Generation.
Mutante Aminosäure-Austausch Selektivität ee in %
I-C2-B7 F432Y, K500R (R) 34
I-F1-F5 L143F (R) 40
I-E1-F1 L426P (R) 55
I-E12-B5 F432I (R) 49
I-H7-F4 L426P, A541V (R) 54
I-H3-C9 L220Q, P428S, T433A (S) 18
I-F4-B9 D41N, F505Y (S) 46
I-K6-G2 K78E, F432S (S) 78
I-K2-F5 F432S (S) 79
I-J6-F9 F282G, F432S (S) 83
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 99
14.1.2 Enzymvarianten der zweiten Generation
Ausgehend von den verbesserten Enzymvarianten I-F1-F5, I-F4-B9 und I-K2-F5 aus der
ersten Generation wurden mehrere Bibliotheken von Enzymvarianten mit fehlerhafter PCR
generiert. Tab. 17 zeigt aus welchen Templaten (Ausgangsmutanten) die einzelnen
Bibliotheken (zwischen 750 und 2000 Mutanten) der zweiten Generation erstellt wurden. Die
Ergebnisse sind in Tab. 18 zusammengefasst.
Tab. 17: Ausgangstemplate der zweiten Generation.
Templat aus
erster Generation Umsatz
ee
in %
Mutationsbezeichnung
der zweiten Generation
I-F1-F5 100 40 (R) II-A
I-F4-B9 100 46 (S) II-B
I-K6-G2 100 78 (S) II-C
I-F1-F5 100 40 (R) II-D
I-F4-B9 100 46 (S) II-E
Mix* II-G
I-F1-F5 100 40 (R) II-H
I-F1-F5 100 40 (R) II-I
* Für die Bibliothek II-G wurde ein Templatmix aus verschiedenen Mutanten der ersten Generation verwendet (siehe Molekularbiologische Arbeiten).
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 100
Tab. 18: Ergebnisse aus der zweiten Generation.
Bibliothek
Anzahl
der
Mutanten
Aktiv-
Mutanten
Beste (R)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
Beste (S)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
II-A 1056 40 %
II-A1-G1
II-A11-A5
II-A10-B6
100
75
46
41
52
54
II-A1-B2 97 52
II-B 768 30 % II-B1-C3 100 44 II-B1-G8 100 54
II-C 960 5 % − − − II-C12-A7 91 80
II-D 1920 80 % II-D19-E6 98 90 II-D8-
A12 85 5
II-G 1152 < 1 % II-G2-H7 98 47 − − −
Aufgeführt sind die jeweils beste (R)- und (S)-Mutante einer Bibliothek. Liegen noch ähnlich gute Mutante vor, so sind diese mitaufgeführt.
Die Bibliotheken der zweiten Generation besitzen eine relativ geringe Anzahl an aktiven
Mutanten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass weitere Mutationen die Wahrscheinlichkeit
eines missgefalteten Zustands des Enzyms erhöhen.
In der Bibliothek II-A, deren Ausgangsmutante I-F1-F5 40 % ee zugunsten des (R)-
Enantiomers zeigt, liegen Mutanten mit verbesserter (R)-Selektivität (Tab. 18) vor. Eine
Umkehrung der Enantioselektivität wurde in der gleichen Bibliothek (II-A1-B2) gefunden.
Die Bibliotheken II-B und II-C, deren Ausgangsmutanten I-F4-B9 und I-K6-G2 sind, zeigen
keine Verbesserung der (S)-Selektivität. In der Bibliothek II-B wurde allerdings eine Mutante
mit umgekehrter Selektivität gefunden. Es handelt sich hierbei um die Mutante II-B1-C3
(44 % ee zugunsten des (R)-Enantiomers).
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 101
In der Bibliothek II-D führte die zweite Runde, ausgehend von der Mutanten I-F1-F5
(ee =40 %), mit fehlerhafter PCR zu einer merklich verbesserten Mutanten (II-D19-E6). Diese
katalysiert die B.-V.-Oxidation mit einer Enantioselektivität von 90 % zugunsten des (R)-
Enantiomers. Eine Sequenzierung der Mutante ergab, dass zusätzlich zur elterlichen Mutation
(L143F) drei neue Aminosäureaustausche vorliegen (E292G, L435Q, T464A). Welchen
Einfluß die einzelnen Mutationen haben, wird später in Kapitel 14.1.4 untersucht.
In der Bibliothek II-E wurde eine im Vergleich zur Ausgangsmutanten (I-J6-F9,
48 % (S)-selektiv) verbesserte Mutante II-E6-G7 (81 % ee) gefunden. Die Enantioselektivität
liegt allerdings noch unterhalb der besten (S)-Mutanten (I-K6-G2) aus der ersten Generation.
Die Bibliothek II-G, welche auf einem Templatmix basiert ist nahezu inaktiv. Eine Erklärung
hierfür wurde nicht gefunden.
Von der II-Generation wurden einige Mutanten sequenziert. Sie tragen zwei oder drei
zusätzliche Mutationen im Vergleich zu ihren elterlichen Mutanten (Tab. 19).
Tab. 19: Sequenzierungen der zweiten Generation.
Mutante Aminosäureaustausch Konfig. ee in % Umsatz
in %
II-A8-H8* D41N, Q393L, F505Y (R) 49 70
II-A10-B6 T60A, V82E, L143F (R) 54 46
II-D19-E65 L143F, E292G, L435Q, T464A (R) 90 98
fett gedruckt: Aminosäureaustausche der Eltern-Mutanten
*gehört zur Bibliothek II-B
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 102
14.1.3 Sättigungsmutagenesen
Ausgehend von den verbesserten Varianten der ersten und zweiten Generation wurden durch
fehlerhafte PCR Sättigungsmutagenesen an den in Tab. 20 aufgeführten Positionen
vorgenommen.
Wahl der Positionen
Die Positionen der Sättigungsmutagenesen ergeben sich aus den verbesserten Mutanten der
ersten (Tab. 16) und zweiten (II-D19-E6) Generation. Hierbei handelt es sich um solche
Aminosäuren, deren Austausch einen signifikanten Effekt auf die Enantioselektivität bewirkt,
sowie die flankierenden Aminosäuren. Position 432 ist besonders interessant, da diese
Position in fünf verschiedenen CHMO-Varianten ausgetauscht wurde (Tab. 16). Pro
Bibliothek wurden etwa 400 Bakterienkolonien betrachtet. Bei einem Aminosäureaustausch je
Mutante werden alle theoretisch möglichen 20 Mutanten mit einer Wahrscheinlichkeit von
99 % erfasst (Abb. 62). In Bibliothek I-SAT1 wurden die Positionen 426 (Mutante I-E1-F1,
verantwortlich für hohe (R)-Selektivität) und 432 (Mutante I-K15-C1 verantwortlich für hohe
(S)-Selektivität) gleichzeitig gesättigt. Im Gegensatz zu den Einzelsättigungen I-SAT2 und
I-SAT3, geht aus der Bibliothek I-SAT1 sowohl eine bessere (R)- als auch (S)- selektive
Mutante hervor (Tab. 21). Das Zusammenspiel beider Aminosäureaustausche ist also
entscheidend.
P = 1-(1-f)n n = ln(1-P) / ln(1-f)
Abb. 62: Formel zur Abdeckung einer Sättigungsbank.[278] P = Wahrscheinlichkeit der Abdeckung; f = Häufigkeit der einzelnen Mutanten; 1/f = Anzahl der Varianten auf DNA-Ebene; n = Anzahl der Kolonien.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 103
Tab. 20: Positionen der Sättigungsmutagenesen.
Bibliothek Position Bibliothek Position
I-SAT1 426+432 I-SAT9 493
I-SAT2 432 I-SAT10 500
I-SAT3 426 I-SAT11 505
I-SAT4 427 I-SAT12 429
I-SAT5 428 I-SAT13 430
I-SAT6 143 I-SAT14 431
I-SAT7 292 I-SAT18 436
I-SAT8 464 - -
Tab. 21: Ergebnisse aus den Sättigungsmutagenesen.
Bibliothek Aktiv-
Mutanten
Beste
(R)-Mutante
Umsatz
in %
ee
in
%
Beste
(S)-Mutante
Umsatz
in %
ee
in
%
I-SAT1 90 % I-SAT-8-G12 99 66 I-SAT1-8-F11 79 80
I-SAT2 90 % I-SAT2-1-F10 100 54 I-SAT2-1-D5 100 75
I-SAT3 90 % I-SAT3-6-E2 100 53 I-SAT3-3-H4 85 16
I-SAT4 30 % I-SAT4-F12 86 26 − − −
I-SAT5 40 % I-SAT5-4-F6 82 28 I-SAT5-2-E9 88 16
I-SAT6 90 % I-SAT6-B5 69 70 I-SAT6-4-H6 62 28
I-SAT7 80 % I-SAT7-C5 92 22 I-SAT7-A12 91 31
I-SAT8 90 % I-SAT8-E10 100 68 I-SAT8-4-A6 100 4
I-SAT9 90 % I-SAT9-1-E1 81 84 I-SAT9-2-H5 100 15
I-SAT10 95 % I-SAT10-1-G12 100 27 I-SAT10-3-E6 66 53
I-SAT11 90 % I-SAT11-1-C12 93 68 I-SAT11-2-C12 82 46
I-SAT12 90 % I-SAT12-1-E6 100 23 I-SAT12-4-A9 96 3
I-SAT13 70 % I-SAT13-1-F7 93 58 I-SAT13-2-H3 100 1
I-SAT14 60 % I-SAT14-3-F7 94 48 - -
I-SAT18 80 % I-SAT18-4-F4 100 37 I-SAT18-2-G7 68 30
Aufgeführt sind die jeweils beste (R)- und (S)-Mutante einer Bibliothek.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 104
Die Sättigungsmutagenesen ergaben keine besseren Mutanten als die bisher schon gefundenen
I-J6-F9 (83 % S-Selektivität) und II-D19-E6. (90 % R-Selektivität) Die Bibliothek I-SAT2
mit der Sättigungsposition 432 wies eine hohe Variabilität des Enantiomerenüberschusses auf.
Um eine Korrelation zwischen ee und Aminosäureaustausch festzustellen, wurden einige
Mutanten aus der Bibliothek I-SAT2 sequenziert. Die Ergebnisse sind in Tab. 22
zusammengefasst. Anhand der Sequenzierungen ist zu sehen, dass nicht nur eine Sättigung
der Position 432 stattgefunden hat, sondern zum Teil auch andere Aminosäuren ausgetauscht
wurden. Die gewählten PCR-Bedingungen führten folglich zufällige Mutationen ein.
Tab. 22: Sequenzierungen aus einer Sättigungsbank I-SAT2.
Platten-Nr.
+ Position
Aminosäure-
Austausch
Aminosäure-
Austausch
Aminosäure-
Austausch Selektivität
ee
in %
1-D5 F432S S 75
2-C7 F432S G498V S 40
2-D6 F432S N217S V443L S 31
1-A5 F432G S 20
1-C8 F432G S 17
4-D10 F432V A476V M481T R 5
1-D10 F432Y R 17
2-B6 F432L R 48
2-B5 F432G P320L R 66
4-D11 F432P R 72
Die Elternmutante Mutante F432S zeigt die höchste (S)-Selektivität in dieser Bibliothek. Ein
Austausch von Phenylalanin zu Prolin an der Position 432 führt zur höchsten (R)-selektiven
Mutanten der Bibliothek I-SAT2. Dies lässt sich vermutlich auf eine geringere Flexibilität des
Proteinrückrates – verursacht durch den ringförmigen Aufbau des Prolins – zurückführen.
Auffällig ist die Mutante 2-B5 mit zwei Aminosäureaustauschen (F432G und P320L). Sie
besitzt, wie 1-C8, an der Position 432 ein Glycin statt einem Phenylalanin, was eine (S)-
Selektivität von 17 % zur Folge hat. Jedoch besitzt die Mutante 2-B5 noch einen weiteren
Aminosäureaustausch an der Position 320. Ein Prolin ist gegen ein Leucin ausgetauscht.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 105
Dieser zusätzliche Aminosäureaustausch bewirkt die recht hohe (R)-Selektivität (66 %) dieser
Mutanten. Eingehendere Untersuchungen, wie beispielsweise eine Sättigungsmutagenese des
Wildtyps an der Position 320, erscheinen vielversprechend.
Gezielte Sättigung der Position 432
Da die Mutanten der Sättigungsbank I-SAT2 vereinzelt noch zusätzliche Mutationen neben
der Position 432 aufwiesen, wurde die Sättigung der Position 432 mittels ortsgerichteter
Mutagenese wiederholt. Die Ergebnisse zu den Umsetzungen der Mutanten mit
4-Hydroxycyclohexanon sind in Tab. 23 aufgeführt. Je nach vorliegender Aminosäure wurden
Enantiomerenüberschüsse von 82 % für das (S)-Lacton und 72 % für das (R)-Lacton erzielt.
Tab. 23: Enantioselektivität der CHMO mit verschiedenen Aminosäuren an der Position 432 in der Reaktion mit 4-Hydroxycyclohexanon.
Aminosäure an der
Position 432 Konfig. ee in %
T (S) 82
S (S) 80
Q (S) 69
R (S) 46
K (S) 36
A (S) 27
G (S) 20
F (R) 9
V (R) 12
Y (R) 17
L (R) 48
W (R) 50
I (R) 51
N (R) 68
P (R) 7
C, D, E, H, M n.b.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 106
Die Ergebnisse aus der gezielten Sättigungsmutagenese der Position 432 lassen sich
folgendermaßen zusammenfassen:
• Befinden sich an der Position 432 kleine und eine Hydroxygruppe tragende
Aminosäuren, wie Threonin und Serin, so führt dies zu hohen (S)-Selektivitäten.
• Moderate (S)-Selektivitäten werden erhalten, wenn sich Arginin oder Lysin, welche
beide eine positive Ladung tragen, an der Position 432 befinden.
• Kleine apolare Aminosäuren, wie Alanin und Glycin führen zum Verlust von
Enantioselektivität.
• Der Wildtyp besitzt an der Position 432 ein Phenylalanin, welches sich vom Tyrosin
nur durch eine OH-Gruppe unterscheidet. Die Tyrosin-Mutante zeigt eine dem
Wildtyp ähnliche Enantioselektivität.
• Mittlere bis große apolare Gruppen wie Leucin, Isoleucin und Tryptophan ergeben
moderate (R)-Selektivitäten.
• Die Einführung von Prolin, einer zyklischen Aminosäure mit apolaren Charakter, an
der Position 432 führt zur höchsten (R)- selektiven Mutante.
• Die Mutanten 432Q und 432N setzen 4-Hydroxycyclohexanon mit komplementären
Enantioselektivitäten um, wobei sie sich nur in ihrer Länge um eine CH2-Gruppe
unterscheiden.
Ein Deutungsansatz der Ergebnisse aus der gezielten Sättigungsmutagenese der Position 432
kann aufgrund der fehlenden Röntgenstruktur nicht detailliert gegeben werden. Lediglich
Spekulationen sind zurzeit möglich.
Die enzymatische Baeyer-Villiger Reaktion findet im Gegensatz zur klassischen Baeyer-
Villiger-Reaktion in einer Proteinumgebung statt (Abb. 63).
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 107
Fl OO O
OH
O
H
OHO
O
OHO
OFl
O
OH
HO
(R)-2 (S)-2
Abb. 63: Schema für die CHMO katalysierte Baeyer-Villiger-Reaktion von 4-Hydroxycyclohexanon (Fl = Flavin).
Es scheint nun, dass die Aminosäure an der Position 432 einen entscheidenden Einfluß auf die
Wanderungstendenz der σ-Bindungen im 4-Hydroxycylohexanon hat. Die Ergebnisse aus
Tab. 23 zeigen, dass eine Aminosäure, welche als Wasserstoffbindungsdonor fungieren kann,
die (S)-Selektivität erhöht. Scheinbar stabilisiert eine H-Bindung die Hydroxygruppe des
4-Hydroxycyclohexanons und zwar in einer Position, welche die Umlagerung derjenigen
enantiotopen σ-Bindung begünstigt, welche zum (S)-Enantiomer führt.
Die H-Bindung kann durch eine Hydroxygruppe, wie sie in den Amionsäuren Serin oder
Threonin zu finden ist, bereitgestellt werden.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 108
14.1.4 Darstellung der Einzelmutanten durch ortsgerichtete
Mutagenese
Die hochenantioselektive (R)-Enzymvariante II-D19-E6 mit einem ee von 90 % zugunsten
des (R)-Enantiomers besitzt insgesamt vier Mutationen. Um die Relevanz jeder einzelnen
Mutation festzustellen, wurden sämtliche Kombinationsmöglichkeiten der vier Mutationen in
II-D19-E6 konstruiert und zur Umsetzung von 4-Hydroxycyclohexanon eingesetzt. In Tab. 24
sind die einzelnen Mutationskombinationen mit zugehörigen Enantioselektivitäten und
Umsätzen aufgeführt.
Tab. 24: Mutantenkombinationen von II-D19-E6. Einzel- und Doppelmutanten.
Einzelmutanten Doppelmutanten
I-F1-F5 1B 1D 1E 2A 2C 2D 2F 2G 2J
L143F X X X X
E292G X X X X
L435Q X X X X
T464A X X X X
ee in % (R) 4o 14 14 14 45 50 45 30 14 26
Ein X gibt an ob eine Mutation vorhanden ist.
Alle Mutanten zeigen einen Umsatz ≥ 95 %. Die Einzelmutanten (1A, 1B, 1D und 1E) zeigen,
dass nur die Mutation L143F einen wesentlichen Einfluss auf die Enantioselektivität hat, was
sich in einem ee von 40 % zugunsten des (R)-Enantiomers für die Mutante 1A äußert. Alle
anderen Mutationen besitzen nur einen geringfügig höheren ee als der Wildtyp (9 %
zugunsten des (R)-Enantiomers). Die Dopppelmutanten (2A, 2C, 2D und 2F) zeigen alle
einen höheren ee als die Wildtyp-CHMO. Ein ee von über 40 % wird nur bei Vorliegen der
Mutation L143F erreicht. Die Mutation L435Q hat zusammen mit einer anderen zweiten
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 109
Mutation einen synergistischen Effekt. Somit besitzt die Mutante 2C (L143F, L435Q) den
höchsten ee aller Doppelmutanten.
Tab. 25: Mutantenkombinationen von II-D19-E6. Dreifachmutanten + II-D19-E6.
Dreifachmutanten Vierfachmutante
3B 3C 3F 3I II-D19-E6
L143F X X X X
E292G X X X X
L435Q X X X X
T464A X X X X
ee in % (R) 84 86 84 30 90
Ein X gibt an ob eine Mutation vorhanden ist.
Der Einfluß der Mutation L143F bei den Dreifachmutanten (3B, 3C und 3F) ist enorm (Tab.
25). Sie alle zeigen einen ee höher als 80 %. Die Dreifachmutante 3I, der die Mutation L143F
fehlt, zeigt nur einen ee von 24 %.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Mutation L143F wesentlich für das Erreichen
hoher (R)-Selektivitäten ist. Keine der Mutantenkombinationen (Einfach-, Zweifach und
Dreifachmutanten) erreicht einen ee von 90 %. Es sind alle vier Mutationen in II-D19-E6 von
Relevanz. Sie wirken also nicht einfach additiv, sondern synergistisch.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 110
14.2 Screening auf 4-Methoxycyclohexanon
Denkbar war ein Durchsuchen der gesamten ursprünglichen Bibliotheken von 10000
Mutanten. Es erschien jedoch zunächst logischer, erst einige „Hits“ zu testen. Enzymvarianten
mit unterschiedlichen hohen (R)- und (S)-Selektivitäten aus dem Screening mit dem
Modellsubstrat 4-Hydroxycyclohexanon wurden deshalb auf die Umsetzung von
4-Methoxycyclohexanon zu 5-Methoxy-2-oxepanon hin untersucht.
4-Methoxycyclohexanon, welches im Gegensatz zu dem 4-Hydroxycyclohexanon als
Wasserstoffakzeptor und nicht als Wasserstoffdonor fungieren kann, wird von der Wildtyp-
CHMO zum entsprechenden Lacton mit 78 % (S)-Selektivität umgesetzt.[270]
OCH3
OO
H3CO
O
OO
H3CO
+O2
CHMO-Mutante
Alle Enzymvarianten sind im Hinblick auf die Umsetzung der CHMO mit dem
4-Methoxycyclohexanon (S)-selektiv (Tab. 26). Die Mutante II-D19-E6, die sich als hoch
(R)-selektiv bei der Umsetzung des 4-Hydroxycyclohexanons (ee = 90 %) gezeigt hatte,
führte nur zu einem geringen Grade an Enantioselektivität in der Reaktion mit dem
Methoxysubstrat (ee = 25 % zugunsten des (R)-Enantiomers). Im Gegensatz dazu zeigt die
hoch (S)-selektive Mutante I-K2-F5 aus der Reaktion mit dem 4-Hydroxysubstrat eine nahezu
vollständige Enantioselektivität in der Umsetzung des Methoxysubstrates (ee = 99 %
zugunsten des (S)-Enantiomers). Dies lässt vermuten, dass die Mutante einen
Aminosäureaustausch aufweist, welcher im Übergangszustand eine Wasserstoffbrücken-
Bindung zu dem Methoxyrest ausbilden kann. Tatsächlich ist bei I-K2-F5 die Aminosäure
Phenylalanin an der Position 432 durch ein Serin (Wasserstoffdonor) ausgetauscht.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 111
Tab. 26: Vergleich der Modellsubstrate anhand unterschiedlicher Enzymvarianten.
Mutante ee (aus Reaktion mit 4-Hydroxy-
cyclohexanon) in %
Umsatz
in %
ee (aus Reaktion mit 4-Methoxy-
cyclohexanon) in %
Umsatz
in %
I-E1-F1 55 (R) 100 77 100
I-E12-B5 51 (R) 74 94 100
I-F1-F5 41 (R) 100 19 100
I-F4-B9 48 (S) 100 78 > 50 %
I-K6-G2 76 (S) 100 99 100
I-F13-B2 46 (R) 82 20 100
I-H2-D3 42 (R) 95 97 100
I-H7-F4 54 (R) 100 75 100
I-K2-F5 79 (S) 100 99 100
II-A5-B3 32 (R) 85 23 > 50 %
II-A5-G6 5 (R) 97 80 100
II-A6-C2 31 (R) 96 - 0 %
II-A8-E7 50 (S) 75 80 > 50 %
II-A8-H8 40 (R) 92 13 100
II-A9-F6 43 (S) 70 78. > 50 %
II-A10-H6 35 (R) 97 20 100
II-A10-B6 41 (R) 84 11 100
II-B5-B3 44 (R) 62 16 << 50 %
II-B6-H2 43 (R) 80 18 > 50 %
II-B7-E9 14 (R) 95 79 100
II-B8-E10 44 (R) 94 94 100
II-D9-A11 87 (R) 50 18 < 50 %
II-D15-E1 90 (R) 98 25 100
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 112
Darüberhinaus wurde Mutante I-K2-F5 bei der Baeyer-Villiger-Reaktion von 4-Methyl-,
4-Ethyl-, 4-Chlor-, 4-Brom- und 4-Iodcyclohexanon getestet.[270] Es wurden
Enantioselektivitäten von 95-98 % nachgewiesen. Auch die Oxidation des Thioethers Methyl-
p-Methylbenzyl erfolgt mit hoher Enantioselektivität (99 % ee (S)-Enantiomer ; Wildtyp:
14 % ee (S)-Enantiomer).[279] Ferner wurde diese Mutante im Arbeitskreis von MIHOVILIVIC
(Technische Universität Wien) an genug anderen Ketonen getestet (siehe Anhang). Es stellte
sich insgesamt heraus, dass Mutante I-K2-F5 ein sehr breites Substratspektrum zeigt.
Zusammenfassung und Ausblick 113
15 Zusammenfassung und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurde die gerichtete Evolution zur Verbesserung der
Enantioselektivität der CHMO in der Baeyer-Villiger-Oxidation von 4-Hydroxycyclohexanon
eingesetzt (Abb. 64). Der CHMO-Wildtyp katalysiert die Umsetzung mit einer
Enantioselektivität von 9 % ee zugunsten von (R)-5-(2-hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on. In
der ersten Generation wurden etwa 10.000 Mutanten durch epPCR generiert und auf die
Umsetzung mit 4-Hydroxycyclohexanon getestet. Die höchste (R)-selektive Mutante I-E1-F1
zeigt einen ee von 55% und die beste (S)-selektive Mutante weist sogar einen ee von 83 %
auf. In der zweiten Generation konnte die (R)-Selektivität noch auf 90 % gesteigert werden
(Mutante II-D19-E6). Die Untersuchung der Einzelmutanten von II-D19-E6 zeigt deutlich die
Relevanz der Position 146.
OOO
OH
O
HO
CHMOin
E. coli
OH
O
O
HO
OO OH
H
H
O
O2 (R)-γ-Lacton
(S)-γ-Lacton
Abb. 64: CHMO-katalysierte Baeyer-Villiger Oxidation von 4-Hydroxycyclohexanon.
Einige verbesserte Mutanten (Hits) aus dem Screening mit 4-Hydroxycyclohexanon wurden
auf die Enantioselektivität in der Baeyer-Villiger-Oxidation von 4-Methoxycyclohexanon hin
getestet. Der Wildtyp-CHMO setzt das 4-Methoxycyclohexanon mit einem ee von 78 %
zugunsten des (S)-Enantiomers um. Aus dem Screening mit den Hits gingen mehrere
verbesserte (S)-selektive Mutanten hervor, wobei die beste Mutante (I-K2-F5; F432S) einen
ee von 98.6 % zeigt. Genau diese Mutante zeigt auch schon bei der Umsetzung von
Zusammenfassung und Ausblick 114
4-Hydroxycylohexanon einen ee-Wert von 80 % zugunsten des (S)-Enantiomers. Eine (R)-
selektive Mutante für dieses Substrat wurde nicht gefunden.
OCH3
OO
H3CO
O
OO
H3CO
+O2
CHMO in
E. Coli
(R)-Lacton (S)-Lacton
Abb. 65: CHMO-katalysierte Baeyer-Villiger-Oxidation von 4-Methoxycyclohexanon.
Die Mutante I-K2-F5 wurde in anderen Arbeitskreisen getestet, wobei eine breite
Substratakzeptanz nachgewiesen wurde.
Die Sättigungsbank der Position 432 zeigt, dass über die Art der vorliegenden Aminosäure die
Richtung der Selektivität gesteuert werden kann. So führt beispielsweise die Einührung eines
Serins oder Threonins an der Position 432 zu hohen (S)-Selektivitäten und die Einführung
eines Asparagins oder Prolins zu hohen (R)-Selektivitäten.
Höchst interessant für die Fortsetzung der gerichteten Evolution ist die Mutante
I-SAT2-4-D11 (F432G, P320L; 72 % (R)-selektiv). Sie besitzt im Vergleich zu I-SAT2-1-C8
(F432G, 17 % (S)-selektiv) eine zusätzliche Mutation an der Position 320, was zu einer hohen
(R)-Selektivität führt. Eine Sättigung dieser Position könnte eine noch bessere Mutante
hervorbringen, welche dann auf dem weiteren Weg der gerichteten Evolution einem Shuffling
mit anderen hoch (R)-selektiven Mutanten unterzogen werden kann.
Mit den aus dieser Arbeit gesammelten Daten können Struktur-Wirkungszusammenhänge
modelliert werden. Eine Kristallstruktur der CHMO steht allerdings noch aus. Es kann aber
ein Homologiemodell mit der erst kürzlich erhaltenen Kristallstruktur der
Phenylacetonmonooxygenase[159] aufgestellt werden. Damit ist ein Verständnis der
Selektivität des Enzyms in greifbare Nähe gerückt und der Weg für ein rationales Design, mit
den durch gerichtete Evolution gewonnen Erkenntnissen, bereitet.
Experimenteller Teil 115
16 Experimenteller Teil
16.1 Allgemeine experimentelle Bedingungen
16.1.1 Verwendete Lösemittel und Chemikalien
Alle verwendeten Lösemittel wurden, je nach Anforderung, entweder direkt eingesetzt oder
mit den unten aufgeführten Reagenzien getrocknet und anschließend unter Argon destilliert.
Dichlormethan: Calciumhydrid
Ethanol: Natrium
Tetrahydrofuran: Natrium
Reaktionen mit luft- und/oder feuchtigkeitsempfindlichen Verbindungen wurden unter
Anwendung von Standard-Schlenk-Techniken mit Argon als Schutzgas durchgeführt. Die
verwendeten Glasgeräte wurden im Ölpumpenvakuum (<10-2 mbar) von Luft- oder
Feuchtigkeitsspuren befreit und mit Argon begast.
Alle käuflichen Ausgangschemikalien wurden direkt eingesetzt.
Agar (Gibo BRL), β-Cyclodextrin-Hydrat (99%, Acros Organics), Carbenicillin (Gerbu),
3-Chlorperoxybenzoesäure (77 %, Aldrich) 1,4-Cyclohexandion (98 %, Acros Organics),
Dichlormethan (>98 %, Fluka), 1,4-Dioxaspiro[4.5]decan-8-on (97 %, Fluka), Glucose
(Merck), Hefeextrakt (Gibco BRL), 4-Hydroxyanisol (99 %,), Pepton (Gibco BRL)
Pyridiniumchlorochromat (PCC, 98 %, Acros Organics), Natriumborhydrid (98 %, Acros
Organics), Cyclohexanon (99.8 %,), ε-Caprolacton (99 %, Acros Organics), Natriumhydrid
(99 %, Aldrich), p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (99 %, Merck), MeI (99 %, Acros
Organics).
Experimenteller Teil 116
16.1.2 Verbrauchsmaterialien
Deep-well Mikrotiterplatten (Advanced Biotechnologies), Glasmikrotiterplatten (Zinser
Analytics), semipermeable Klebefolien (Advanced Biotechnologies), Polyethylen (PE)-
Mikrotiterplatten (HJ Bioanalytik oder Nunc), Petrischalen 95 mm (Waldeck),
Reaktionsgefäße (0.5 ml, 1.5 ml, 2.0 ml: Eppendorf; 15 ml, 50 ml: Greiner), Q Trays 245 mm
(Genetix), Verschlussmatten (HJ Bioanalytik), Einmal-Küvetten PMMA (ISO Brand).
Die im folgenden beschriebenen Versuche mit lebenden Kulturen wurden in Laboratorien der
Sicherheitsstufe S1 oder S2 (MPI für Kohlenforschung, Mülheim an der Ruhr) unter den
geltenden Vorschriften durchgeführt. Alle Arbeiten erfolgten nach gängiger Steriltechnik. Die
mit Bakterien kontaminierten Abfälle wurden durch Autoklavieren (15 min, 134 °C, 1 bar
Überdruck) vernichtet. Glasgeräte und Medien wurden vor Gebrauch autoklaviert (20 min,
121 °C, 1 bar Überdruck) oder per Heißluft in einem UT20P Sterilisationsofen der Firma
Kendro sterilisiert.
16.1.3 Verwendetes Enzym und Expressionssystem
Cyclohexanonmonooxygenase: aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (E.C. 1.14.13.22)
kloniert in pET 22b (+)-Vektor
exprimiert in E. Coli BL21 (DE3)
Das für das Enzym codierende Gen wurde im Rahmen einer Kooperation von Frau Pofessor
Dr. M. Kayser aus Kanada erhalten.
Experimenteller Teil 117
16.1.4 Vewendete Medien
Nährmedium
Die Bakterienkulturen wurden in Luria Broth (LB)-Vollmedium angezogen. Dazu wurden die
unten aufgeführtren Komponenten eingewogen und mit destilliertem Wasser auf 1 Liter
aufgefüllt. Nach Autoklavieren bei 120 °C für 20 min kann das Medium bei Raumtemperatur
gelagert werden.
Tab. 27: Zusammensetzung LB-Vollmedium.
LB
10 g Bacto-Trypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
1 L dest. H2O
Glycerinmedium
Zur Stammhaltung der Kulturen bei -80 °C wurde eine Übernachtkultur in 1 x LB mit
Glycerin-Medium zu gleichen Anteilen vermengt. Über einen Genesis Pipettierrobotor der
Firma Tecan wurde der Prozess als T_GKK_CHMO.gem-Skript automatisiert. Das
Glycerinmedium enthält die unter Tab. 28 aufgeführten Bestandteile. Es wurde bei 120 °C
und 1 bar Überdruck für 20 min sterilisiert.
Tab. 28: Zusammensetzung Glycerinmedium.
Glycerin-Medium
16 g Bacto-Trypton
10 g Hefeextrakt
10 g NaCl
800 ml Glycerin
200 ml dest. H2O
Experimenteller Teil 118
16.1.5 Agarplatten
Zur Herstellung von Agarplatten wurde 1 x LB-Medium, welchem 15-20 g Agar vor dem
Autoklavieren zugesetzt wurde, verwendet. Das noch warme Agarmedium wurde im
Verhältnis 1 : 1000 mit Carbenicillin-Lösung (10 mg / ml in H2O) versetzt und in Agarplatten
gegossen. Die Platten konnten im Dunkeln mehrere Wochen gelagert werden. Bei Einsatz
eines Kolonie-Pickers wurden quadratische Agarplatten Q-Tray der Firma Genetix mit
24.5 cm Kantenlänge verwendet. Um einen einheitlichen Agar zu erhalten, wurden die Platten
mit 200 g geschmolzenen Agar befüllt und abgeflammt.
16.1.6 Stammhaltung
Stammhaltung auf festen Nährböden
Die Stämme wurden auf LB-Agarplatten mit Selektionsantibiotika bei 30 °C bzw. 37 °C über
Nacht inkubiert und bei 4 °C gelagert.
Stammhaltung in Form von Gefrierkulturen
Zur Stammhaltung in Form von Gefrierkulturen (Lagerung bei -80 °C) wurde eine
Übernachtkultur in 1 x LB / Cb (auf 100 ml 1 x LB kommen 1 mL Carbenicilin-Lsg.
(100 mg/ml)) mit Glycerin-Medium zu gleichen Anteilen vermengt. Die Glycerinkultur
wurde bei -80 °C gelagert.
Über einen Genesis Pipettierrobotor der Firma Tecan wurde der Prozess als
T_GKK_CHMO.gem-Skript automatisiert.
Gefrierkulturen wurden generell in sterilen PE-Mikrotiterplatten der Firma Nunc angesetzt
und mit sterilen PE-Verschlussmatten reversibel verschlossen. Eine gute Durchmischung der
Übernachtkultur mit dem Glycerin-Medium ist dabei entscheidend, um ein Platzen der Zellen
zu verhindern, sowie ein schnelles Schockgefrieren der Gefrierkultur, da Escherichia coli-
Bakterien in Gegenwart von Glycerin bei Raumtemperatur nur eine begrenzte Lebensdauer
zeigen.
Experimenteller Teil 119
16.1.7 Anzucht der Bakterienkulturen in LB-Medium
Im Erlenmeyer-Kolben
Zurerst wurde eine Vorkultur angelegt. Hierzu wurde eine E. coli-Einzelkolonie in einen
Erlenmeyer-Kolben mit LB-Medium/Cb überpickt und bei 30 °C im Schüttelinkubator über
Nacht kultiviert. Mit der Vorkultur wurde eine neues LB-Medium/Cb im Verhältnis 1:100
angeimpft und bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zum gewünschten OD600 von 0.4 – 0.8
(2 - 3 Stunden) inkubiert.
In deep-well Platten
Zur Anzucht in deep-well Platten wurden E. coli-Einzelkolonien in die Vertiefungen, welche
mit 800 µl LB-Medium/Cb gefüllt waren, überpickt und über Nacht bei 30 °C im
Schüttelinkubator kultiviert. Mit 20 µl der Vorkultur wurden 380 µl LB-Medium/Cb
angeimpft. Es wurde für 3 Stunden mit 800 rpm bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zu einem
OD600 von 0.4 – 0.8 (2 – 3 Std.) kultiviert.
16.1.8 Screening-Assay
Das GC-Screening auf Enantioselektivität wurde semiautomatisch durchgeführt. Die aus
unterschiedlichen Mutageneseexperimenten hervorgegangenen Bibliotheken wurden auf
Q-Tray-Agarplatten der Firma Genetix mit LB-Agar mit Carbenicillin als Antibiotikum
ausplattiert. Nach Inkubation der Kolonien über Nacht bei 37 °C wurden die Kolonien mittels
eines Koloniepickers in mit je 0.8 ml LB-Medium/Cb befüllte 96’er deep-well
Mikrotiterplatte überpickt und über Nacht bei 30 °C im Schüttelinkubator kultiviert. Aus der
Vorkultur wurde unter Einsatz eines Genesis Pipettierroboters der Firma Tecan die Gefrier-
als auch Hauptkultur erstellt. Dazu wurde das Skript T_GKK_CHMOR.gem verwendet. Für
die Gefrierkultur wurden 25 µl Übernachtkultur mit 100 µl Glycerin-Medium durchmischt.
Das Animpfen der Hauptkultur (180 µl LB-Medium/Cb) erfolgte mit 20 µl der Vorkultur. Die
Hauptkultur wurde dann für 3 Std. mit 800 rpm bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zu einem
OD600 von 0.4 – 0.8 (2 – 3 Std.) kultiviert. Die Induzierung des Enzyms mit in Wasser
Experimenteller Teil 120
gelösten Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) und die Zugabe des in Wasser gelösten
Substrats erfolgte mit der Liquid-Station des Genesis Pipettierroboters. Es wurden 25 µl
IPTG-Lsg. (2.5 x 10-4 mmol/L) und 25µl Substrat-Lsg. (70 mmol/l) nacheinander
hinzupipettiert. Anschließend wurden die deep-well Mikrotiterplatten bei RT mit 900 rpm für
24 Stunden geschüttelt. Nach der Reaktion wurde mit der Liquid-Station des Genesis
Pipettierroboters 400 µl Ethylacetat pro well (Vertiefung) hinzupipettiert. Wässrige und
organische Phasen wurden unter Einsatz des 96-fach Pipettiermoduls TEMO vermischt. Die
Extraktion des Substrates aus der wässerigen Phase erfolgte durch mehrmaliges Aufnehmen
der organischen Phase und Abgeben derselbigen, mit hoher Geschwindigkeit durch die
Teflon-Nadeln des Pipettierkopfes, in die wässrige Phase. Zur Verbesserung der
Phasentrennung wurden die deep well-Mikrotiterplatten mit einer Zentrifuge mit 4000 rpm
zentrifugiert. Mit dem TEMO-Pipettiermodul wurden 150 µl der organischen Phase in eine
96’er Glas-Mikrotiterplatte abpipettiert. Als Verschlusssystem kam eine von der
feinmechanischen Werkstatt des Instituts gefertigte Kombination zum Einsatz: Die
Glasplatten wurden zunächst mit handelsüblicher Alufolie (30 µm) abgedeckt, mit einer
dünnen Gummimatte (ca. 1.5 mm) versehen und durch ein System von Aluboden und
verschraubbarer Abdeckplatte aus Aluminium zusammengehalten. Die so vorbereiteten
Proben wurden mittels GC analysiert.
Verwendete Geräte:
Dispenser Multidrop von Labsystems für deep well-Mikrotiterplatten
Colonypicker QPix der Firma Genetix.
Software: Q Soft V2000.1.1.
Tecan Genesis RSP 150/8 Pipettierroboter mit integriertem Roboterarm RoMa sowie Karusell
Liconis Hotel zur Probenaufbewahrung und integriertem TeMo-96-fach Pipettierkopf.
Software: Gemini 3.1 und Facts 4.7.
GC-Geräte: 2 x Hewlett Packard HP 6890; 1 x Agilent Technologies 6890.
Software: GC Chemstation; Rev. A. 09.03 [1417], Agilent Technologies 1990-2002.
Experimenteller Teil 121
16.1.9 Analytische Methoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR)
Die 1H-NMR- und Breitband-13C-NMR-Spektren wurden mit Bruker DMX 300 und
Bruker AV 400 gemessen. Als interne Standards dienten für 1H-NMR-Spektren die
Restwasserstoffsignale des verwendeten Lösemittels (Chloroform: 7.24 ppm); für 13C-
Spektren die Signale des deuterierten Lösemittels (Chloroform: 77.0 ppm). Für die
Feinstruktur der Signale gilt: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett,
m = Multiplett. Die Zuordnung der 1H- und der 13C-Signale erfolgte anhand von
Literaturdaten.
Gaschromatographie (GC)
Gaschromatogramme wurden in der Abteilung für Gaschromatographie auf den Geräten 5890
und 6890 der Firma Hewlett-Packard mit Kapillartrennsäulen gemessen. Die Injektion
erfolgte im split-Modus, die Detektion mittels Flammenionisationsdetektor.
Dünnschichtchromatographie (DC)
Zur Dünnschichtchromatographie (DC) wurden kieselgelbeschichtete Kunststofffolien mit
Fluoreszenzindikator (DC-Fertigfolien Polygram SIL-G/UV254, Schichtdicke 0.25mm) der
Firma Macherey & Nagel Düren, verwendet. Die Analyten wurden entweder durch
Fluoreszenzlöschung bei 254 nm, durch Eigenfluoreszens bei 366 nm oder durch Anfärben
mit Cer(IV)/Molybdatophosphorsäure-Lösung detektiert.
Säulenchromatographie
Säulenchromatographische Trennungen wurden an Kieselgel 60 (Korngröße 0.063-0.200 mm;
70-230 mesh ASTM) der Firma Merck durchgeführt. Die verwendeten Laufmittel sind bei
den entsprechenden Präparaten angegeben.
Experimenteller Teil 122
16.2 Darstellung literaturbekannter Verbindungen
16.2.1 Synthese von 4-Hydroxycyclohexanon
Variaynte 1[272]
In einem getrockneten und unter Schutzgas (Argon) befindlichen Dreihalskolben werden bei
-78 °C 100 ml flüssiger Ammoniak eingeleitet. Bei -50 °C werden 2.50 g (360 mmol) Li
hinzugegeben. Schließlich werden 4.00 g (32.2 mmol) p-Methoxyphenol, gelöst in 25 ml
trockenem Ether, über einen Zeitraum von 5 min hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wird
45 min bei -50 °C gerührt. Absolutiertes Ethanol (1.9 ml, 32 mmol) wird hinzugegeben und es
wird für eine weitere Stunde gerührt. Es wird solange absolutiertes Ethanol in 4 ml Portionen
hinzugegeben bis die blaue Farbe verschwindet. Es werden insgesamt ca. 25 ml Ethanol
verwendet. Nach dem Verdampfen des Ammoniaks werden 200 ml gesättigte
Ammoniumchloridlösung zu dem Rest hinzugefügt. Die resultierende braune Lösung wird in
einem Eisbad abgekühlt. Es wird tropfenweise konzentrierte Salzsäure hinzugefügt bis der pH
der Lösung ca. 1 beträgt. Die saure Lösung wird für drei Stunden auf 50 °C erhitzt um den
Enolether zu hydrolysieren. Die gekühlte wässrige Lösung wird mit CHCl3 (8 x.50 ml)
extrahiert, mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und reextrahiert. Es wird über
Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhält ein
braunes Öl. Nach Destillation des Rohprodukts (70 °C, 10 –2 mbar) werden 2.4 g (21,4 mmol,
66 %) eines farblosen Öls von 4-Hydroxycyclohexanon erhalten.
OH
OCH3
OH
OCH3
5
6 1 2
34
OH
O
-50 °C 50 °C
Li / NH3 H3O+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 4.19 (m, 1 H, H-4), 1.66 (s, 1 H, OH), 2.59 (m, 2 H ), 2.31
(m, 2 H), 2.03 (m, 4 H); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 210.9 (C-1), 66.3 (C-4), 37.2 (C-2, C-6), 33.8 (C-3, C-5).
Experimenteller Teil 123
Variante 2
1. Stufe 1[273]: 1,4-Dioxaspiro[4.5]decan-8-ol
OO NaBH4
MeOH
0 °C auf RTO
10
9 8 7
65 OO
2 3
OH
In einem 500 ml Rundkolben werden 10 g (64 mmol) 1,4-Dioxaspiro[4.5]decan-8-on gelöst in
200 ml Methanol vorgelegt und auf 0 °C gekühlt. Unter Rühren wird innerhalb von 30 min
7.28 g (192 mmol) Natriumboranat hinzugegeben. Es wird für 3 Stunden bei RT gerührt. Das
Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt. Es werden 75 ml gesättigte
Kochsalzlösung hinzugefügt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organischen Phasen
werden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt. Es werden 9.91 g (62.7 mmol, 98 % ) eines gelben Öls
erhalten.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 1.58 (m, 4 H, H-7, H-9), 1.83 (m, 4 H, H-6, H-10), 3.78 (m,
1 H, H-8), 3.89 (s, 4 H, H-2, H-3); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ= 108.3 (C-5), 68.2 (C-8), 64.3, 64.2(C-2, C3) , 32.1, 31.6
(C-6, C-7, C-9, C-10).
Experimenteller Teil 124
Variante 2
2. Stufe[274]: Darstellung von 4-Hydroxycyclohexanon
OO
OH OH
O
p-TSOH
H2ORefluxieren
In einen 250 ml Rundkolben werden zu 9.91 g (62.7 mmol) 1,4-Dioxaspiro[4.5]decan-8-ol
400 ml destilliertes Wasser und 1.08 g (6,27 mmol, 10 mol %) p-Toluolsulfonsäure gegeben.
Es wird für 24 Stunden refluxiert. Die Lösung wird auf RT abgekühlt und mit
Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Es wird mehrfach mit Essigsäureethylester extrahiert.
Die organischen Extrakte werden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das
Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Es bleibt ein gelblich schimmerndes Öl zurück
(6.53 g), das säulenchromatographisch mit einem Ethylacetat/Hexan-Gemisch (3:1) gereinigt
wird. Nach entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird das Produkt als farbloses Öl in
einer Ausbeute von 5.40 g (47.4 mmol, 76 %) erhalten.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 4.19 (m, 1 H, H-4), 1.66 (s, 1 H, OH), 2.59 (m, 2 H ),
2.31 (m, 2 H), 2.03 (m, 4 H); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 210.9 (C-1), 66.3 (C-4), 37.2 (C-2, C-6), 33.8 (C-3, C-5).
Experimenteller Teil 125
16.2.2 Synthese von 4-Methoxycyclohexanon
1.Stufe: Darstellung von 1,4-Dioxaspiro[4.5]decan-8-ol[273]
2.Stufe: Darstellung von 4-Methoxycyclohexanon-ethylenketal[274]
OO10
9 8
65
7
OO
2 3
OOH5
NaH, MeI
THF
In einem 250 ml Dreihalskolben unter Schutzgas (Argon) mit Rückflusskühler und
Tropftrichter werden 1.29 g (53.7 mmol) NaH, suspendiert in 65 ml THF vorgelegt. Bei 0 °C
werden 2.82 g (17.9 mmol) 4-Hydroxycyclohexanon-ethylenketal, gelöst in 38 ml THF,
zugegeben. Die Mischung wird bis zum Ende der Wasserstoffentwicklung gerührt. Es werden
5.59 ml (12.7 g, 89.5 mmol) Methyliodid hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wird für 12
Stunden refluxiert. Es werden 70 ml H2O zur Reaktionsmischung gegeben. Anschließend
wird mit Ether (5 70 ml) extrahiert. Die organische Phase wird mit NaHCO3 (2 35 ml)
und gesättigter Kochsalzlösung (2 15 ml) gewaschen. Es wird über MgSO4 getrocknet. Das
Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Es werden 2.88 g (16.7 mmol, 93 %) Rohprodukt
(gelbes Öl) erhalten.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 3.93 (s, 4 H, H-2,H-3), 3.32 (s, 1 H, H-5) , 3.28 (m, 1 H, H-
8), 1.63 (m, 8 H, H-6, H-7, H-9, H-10). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ= 76.88 (C-8), 64.66 (C-2, C-3), 56.25 (C-5), 31.67, 28,53
(C-6, C-7, C-9, C-10).
Experimenteller Teil 126
Stufe 3: Darstellung von 4-Methoxycyclohexanon[274]
OO6
5 4 3
21
OO7
Op-TsOHH2O
24 Std. Refluxieren
In einem Rundkolben mit 50 ml destilliertem Wasser gibt man 1.19 g (6.92 mmol) von
4-Hydroxycyclohexanon-ethylenketal und 132 mg (0.762 mmol, 11 mol %) p-TsOH und
refluxiert für eine Stunde. Die erkaltete Lösung wird mit Essigsäureethylester extrahiert (4
20 ml). Die organische Phase wird mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung
gewaschen (2 10 ml) und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum
entfernt. Es werden 632 mg (4.94 mmol, 71 %) 4-Methoxycylohexanon als farbloses Öl
erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.59 (mc, 1 H, H-4), 3.38 (s, 3 H, H-7), 2.58, 2.25, 2.07,
1.92 (4 m, 8 H, H-2, H-3, H-5, H-6); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ= 74.25 (C-4), 56.08 (C-7), 37.06 (C-2, C-6) 30.10 (C-3,
C-5).
Experimenteller Teil 127
16.2.3 Synthese von 5-(2-Hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on
2
3 4
O1
O
56
OH
O
OH
m-CPBA
NaHCO3
CH2Cl2
In einem 100 ml Kolben werden 595 mg (5.21 mmol) 4-Hydroxycylohexanon, gelöst in 5 ml
Dichlormethan, zusammen mit 1.80 g (0.104 mmol, 2 Äquiv.) Natriumbicarbonat vorgelegt.
Zu 876 mg (10.4 mmol, 1.4 Äquiv.) m-CPBA in 45 ml Dichlormethan gibt man einige
Spatelspitzen Magnesiumsulfat, lässt für 5 Minuten rühren und filtriert das Magnesiumsulfat
ab. Das Filtrat wird tropfenweise bei 0 °C unter Rühren dem Substrat zugetropft. Es wird für
10 Minuten bei 0 °C gerührt und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur. Zur
Reaktionsmischung werden 50 ml Dichlormethan gegeben und abfiltriert. Es wird mit
Natriumsulfit- und Natriumbicarbonatlösung gewaschen, je 50 ml. Die wässrigen Phasen
werden mit Dichlormethan gegengeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt und
über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Es werden 280 mg
(2.15 mmol, 41 %) 5-(2-Hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on nach einer chromatographischen
Reinigung (Ethylacetat:Hexan = 3:1) erhalten. Das Produkt liegt als farbloses Öl vor.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.71 (mc, 1 H, H-5), 3.81 (t, J = 6 Hz, 2 H, H-7,), 2.53 (m,
2 H, H-3,), 2,35 (dddd, J = 13.2 Hz, 6 Hz, 6 Hz, 6 Hz, 1 H, H-4), 1.92 (m, 3 H, H-4, H-6); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ= 177 (C-1), 79 (C-4), 60 (C-6)), 39 (C-2), 29, 28 (2 x C,
C-3, C-5).
Experimenteller Teil 128
16.2.4 Synthese von 5-Methoxy-2-oxepanon
O
O
2
3 45
6
O1
O
O7
m-CPBA
NaHCO3
CH2Cl2
In einem 100 ml Kolben werden 382 mg (2.98 mmol) 4-Hydroxycylohexanon gelöst in 5 ml
Dichlormethan zusammen mit 501 mg (5.96 mmol, 2 Äquiv.) Natriumbicarbonat vorgelegt.
Zu 891 mg (5.17 mmol, 1.3 Äquiv.) m-CPBA in 45 ml Dichlormethan gibt man einige
Spatelspitzen Magnesiumsulfat, lässt für 5 Minuten rühren und filtriert das Magnesiumsulfat
ab. Das Filtrat wird tropfenweise bei 0 °C unter Rühren dem Substrat zugetropft. Es wird für
10 Minuten bei 0 °C gerührt und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur. Zur
Reaktionsmischung werden 50 ml Dichlormethan gegeben und abfiltriert. Es wird mit je
50 ml Natriumsulfit- und Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die wässrigen Phasen werden
mit Dichlormethan gegengeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt und über
MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Es werden 359 g (2.49
mmol, 84 %) 5-Methoxy-2-oxepanone als Rohprodukt (farbloses Öl) erhalten.
1H-NMR (300 MHz,): δ= 4.45, 3.55 (2 x m, 2 H, H-6), 3.55 (mc, 1 H, H-4) 3.34 (s, 3 H,
CH3), 2.95, 2.40 (2 x m, 2 H, H-2), 2.00, 1.85 (2 x m, 4 H, H-3, H-5);
DEPT (75 MHz, CDCl3): δ= 77 (CH), 64 (C-6), 56 (CH3), 34 (C-2), 28, 27 (2 x C, C-3, C-5).
Experimenteller Teil 129
16.2.5 (5-Oxo-tetrahydro-furan-2-yl)-acetaldehyd[280]
In einem zuvor ausgeheizten und unter Argon befindlichen 50 ml Schlenkkolben werden
108 mg (0.501 mmol) Pyridiniumchlorochromat (PCC) und 5 mL CH2Cl2 vorgelegt. Unter
Rühren werden 40 mg (0.308 mmol) 5-(2-Hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on hinzugegeben.
Es wird für vier weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Reaktionsmischung
werden 25 mL Ether gegeben. Es wird abdekantiert und der schwarze Rückstand wird
mehrmals mit Ether gewaschen. Die vereinigten organischen Extrakte werden über Celite
(8 g) abfiltriert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird durch 1H-NMR bestimmt.
O
O
OH
2
3 4O
1
O
56
O
PCC
CH2Cl2
2
3
1O
OH
4
56
O
A B 1H-NMR (300 MHz,): δ= 1.9-3.0 (mehrere m); 4.94 (m, H-4 von A); 6.13 (dd, J = 15.8 Hz,
J = 7.6 Hz, H-5 von B); 6.84 (td, J = 6.1 Hz, J = 15.5 Hz, H-4 von B); 9.5 (d, J = 7.7 Hz,
H-6 von B); 9.78 (s, H-6 von A).
Molekularbiologische Arbeiten 130
17 Molekularbiologische Arbeiten Die molekularbiologischen Arbeiten wurden von B. Brunner durchgeführt.
17.1.1 Laborausrüstung
PCR:
Tgradient Thermocycler, Biometria GmbH i. L
Inkubator:
Thermomixer comfort, Eppendorf AG
Multitron, Infors AG
Incubator Memmert GmbH&Co.Kg
LabforsII, Infors Ag
Zentrifuge:
Zentrifuge 5810 R, Eppendorf AG
Biofuge pico, Kendro Laboratory Products GmbH
Elektrophorese:
BioDocAnalyze, Biometra GmbH i. L
Minigel-Twin, Biometra GmbH i. L
Power supply Power Pac 300, Bio-Rad Laboratories
Geldryer, Biometra GmbH i. L
Ultraschall:
Bandelin SonoplusHD200, Bandelin Electronic
Koloniepicker:
Qpix Genetixs, Genetix Limited
Software: Q Soft V2000.1.1.
Sterilbank:
HERAsafe, Kendro Laboratory Products GmbH
Molekularbiologische Arbeiten 131
Sterilisation:
Varioklav H&P, Labortechnik AG
UT20P Sterilisationsofen, Kendro Laboratory Products GmbH
17.1.2 Stämme
E. coli XL10 Gold von Stratagene
E. coli BL21 Star (DE3) von Invitrogen
E. coli Top 10 von Invitrogen
E. coli SCS110: Stratagene
17.1.3 Plasmide
pET-22b (+): 5.4 kb von Merck KGaA-Novagen
pMM04: 7.02 kb[183]
pET100/D-Topo von Invitrogen
17.1.4 Kommerzielle Kits
Tab. 29: Komerzielle Kits.
Anwendung Kit-Name Firma
Plasmid Minipreparation QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen GmbH
Plasmid Maxipreparation QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen GmbH
PCR Aufreinigung QIAquick PCR Purification Kit Qiagen GmbH
Gelextraktion QIAEX II Agarose Gel Extraction Spin
Columns
Qiagen GmbH
Freeze ′N Squeeze DNA Gel Extraction
Spin Columns
Bio-Rad Laboratories
Protein-Assay Bio Rad Protein Assay Bio-Rad Laboratories
Molekularbiologische Arbeiten 132
17.1.5 Puffer- und Reagenzlösungen
Restriktionsendonukleasen, modifizierende Enzyme und die dazugehörigen Puffer wurden
von Roche Diagnostics GmbH, New England Biolabs Inc., Promega, QIAGEN GmbH,
Qbiogene, Invitrogen, Merck KGaA-Novagen bezogen.
Chemikalien für Medien und Puffer sind von der höchsten verfügbaren Qualität. Sie wurden
von verschiedenen Firmen bezogen: Riedel-de Haen, Sigma Aldrich CO, Bio-Rad
Laboratories, Invitrogen, Merck KGaA, Acros, Fisher Scientific, Fluka, AppliChem GmbH.
17.1.6 Medien
LB (Luria-Bertani)
10 g/l Bactotrypton
5 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
Glycerin
16 g/l Bactotrypton
10 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
800 ml/l Glycerin
200 ml/l dest. H2O
SOC
20 g/l Trypton
0.58 g/l NaCl
5 g/l Hefeextrakt
2 g/l MgCl2
0.18 g/l KCl
2.46 g/l MgSO4
3.46 g/l Glucose
Molekularbiologische Arbeiten 133
LB/CB: LB-Medium mit 100 µg/ml CB
IPTG-Lösung (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid): 10 mM
Agar-Platten: 15 g/l Agar-Agar wurden zum Medium hinzugefügt.
17.1.7 Reagenzien für die Agarosegel-Elektrophorese
Tab. 30: Reagentien für die Agarosegel-Elektrophorese.
Bezeichnung Reagenzlösung Konzentrierte Stamm-Lsg.
Tris-Borsäure-EDTA Puffer
(TBE)
8.9 mM Tris, pH 8.3
8.9 mM Borsäure
0.2 mM EDTA
10 ×
89 mM Tris, pH 8.3
89 mM Borsäure
2 mM EDTA
Tris-Essigsäure EDTA Puffer
(TAE)
0.8 mM Tris, pH 8.0
0.4 mM Essigsäure
0.02 mM EDTA
50 × 40 mM Tris, pH 8.0
20 mM Essigsäure
1 mM EDTA
Ladepuffer Bio-Rad Laboratories
Agarose Bio-Rad Laboratories
Ethidiumbromid 0.5 µg/mL 10 mg/mL in Wasser
Molekularbiologische Arbeiten 134
17.1.8 Reagentien für die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
(PAGE)
Tab. 31: PAGE-Reagenzien.
Trenn-Gel (10 %, 10 ml): Sammel-Gel (4 %, 2.5 mL):
3.75 ml H2O 1.525 ml H2O
2.50 ml 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 0.625 ml 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)
3.60 ml Bisacrylamid (30%) 0.325 ml Acrylamide/Bis (30%)
100 µl 10 % (w/v) SDS 25 µl 10% (w/v) SDS
50 µl 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat 12.5 µl 10% (w/v) Ammoniumpersulfat
10 µl TEMED 2.5 µl TEMED
Proben-Puffer (6x) 10 mL Lauf-Puffer (5x):
7 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) + 0.4 % SDS 15.1 g/l Tris Base
3 ml Glycerol 72 g/l Glycin
1 g SDS 5 g/l SDS
0.93 g DTT
1.2 mg Bromphenolblau
Färbelösung Entfärbelösung
0.1 % (w/v) Coomassie Blau R-250
45 % (v/v) Ethanol
45 % (v/v) H2O
10 % (v/v) Essigsäure
10 % Essigsäurelösung
Molekularbiologische Arbeiten 135
Tab. 32: Molekulare Gewichtsstandards: Bio-Rad Laboratories.
Protein Quelle MW [kD]Low Range
Marker
Broad Range
Marker
Myosin Skelettmuskulatur (Kanninchen) 200 x
β-Galactosidase E. coli 116.25 x
Phosphorylase b Muskulatur (Kanninchen) 97.4 x x
Serum Albumin Rind 66.2 x x
Ovalbumin Eiweiß (Hühnerei) 45 x x
Carboanhydrase Rind 31 x x
Trypsin-Inhibitor Sojabohne 21.5 x x
Lysozym Eiweiß (Hühnerei) 14.4 x x
17.1.9 Lösungen für die DNA Aufreinigung
Tab. 33: Lösungen für die DNA-Aufreinigung.
Lösungen Zusammensetzung
NaOAc 3 M Natriumacetat, pH 5.2, steril filtriert
EtOH abs. Ethanol abs.
EtOH 70 %ig 70 % Ethanol abs. + 30 % Wasser
Molekularbiologische Arbeiten 136
17.2 Reagenzien für die Polymerasekettenreaktion (PCR)
• HotStarTaq DNA Polymerase 5 U/µl: Qiagen GmbH.
• HotStarTaq Puffer 10 x (Endkonzentration von 1.5 mM MgCl2): Qiagen GmbH
• KOD HotStar DNA Polymerase 1U/µL: Novagen
• KOD Puffer 10 x: Novagen
• MgSO4 25 mM: Novagen
• MgCl2 25 mM: Quiagen GmbH
• dNTP mix: 2 mM der Natriumsalze von dATP, dCTP, dGTP, dTTP; dNTP-Lösung:
100 mM, pH 8.3: Roche Diagnostics GmbH
• Primer: 10 pmol/µl Thermo Electron Corporation Molecular Biology
Stammlösung: 100 pmol/µl
Tab. 34: Verwendete Primer.
Nummer Name Sequenz 5´ - 3´ PCR /Seq
16 T7 Prom TAATACGACTCACTATAGGG PCR /Seq
17 T7 Terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG PCR /Seq
25 500 Forward gcgcgtttcctcatcactgc Seq-CHMO
26 1350 rev ccaagcaccatgaacatgtttg Seq-CHMO
27 CHMO FW TTGTGAGCGGATAACAATTCC Seq-CHMO
28 CHMO Rev CAGCAGCCAACTCAGCTTCC Seq-CHMO
36 CHMO SAT 426F catggtgNNBggaccgaatggc PCR
37 CHMO SAT 432F ggcccgNNBaccaacctgccg PCR
38 CHMO SAT 426R CGGTCCVNNCACCATGAACATG PCR
39 CHMO SAT 432R GGTTGGTVNN CGGGCCATTCG PCR
40 CHMO SAT 427 gttcatggtgcttNNBccgaatggcccgtttac PCR
41 CHMO SAT 428 gttcatggtgcttggaNNBaatggcccgtttac PCR
42 CHMO SAT 429 tggtgcttggaccgNNBggcccgtttaccaacc PCR
43 CHMO SAT 430 gtgcttggaccgaatNNBccgtttaccaacctg PCR
44 CHMO SAT 431 cttggaccgaatggcNNBtttaccaacctgccg PCR
45 CHMO SAT 433 accgaatggcccgtttNNBaacctgccgccatc PCR
46 CHMO SAT 434 atggcccgtttaccNNBctgccgccatcaattg PCR
47 CHMO SAT 435 cccgtttaccaacNNBccgccatcaattgaatc PCR
Molekularbiologische Arbeiten 137
48 CHMO SAT 436 cgtttaccaacctgNNBccatcaattgaatcac PCR
49 CHMO SAT 437 ttaccaacctgccgNNBtcaattgaatcacagg PCR
50 CHMO SAT 438 ccaacctgccgccaNNBaattgaatcacaggtgg PCR
51 CHMO SAT 439 cctgccgccatcaNNBgaatcacaggtggaatg PCR
52 CHMO SAT 440 ccgccatcaattNNBtcacaggtggaatggatc PCR
53 CHMO SAT 441 gccatcaattgaaNNBcaggtggaatggatcag PCR
54 CHMO SAT 143 atcactgctttaggcNNBttgtctgcgcctaac PCR
55 CHMO SAT 292 attgccaccaatatgNNBgccaatatcgaagcg PCR
56 CHMO SAT 464 gaatccattgaagcgNNBaaagaagcggaagaac PCR
57 CHMO SAT 495 ggatttttggtgcgNNBatcccgggcaag PCR
58 CHMO SAT 500 gaatatcccgggcaagNNBaacacggtttacttc PCR
59 CHMO SAT 505 gcaagaaaaacacggtttacNNBtatctcggtgg PCR
62 CHMO-f-T433I accgaatggcccgtttATCaacctgccgccatc PCR
63 CHMO-r-T433I GATGGCGGCAGGTTGATAAACGGGCCATTCGGT PCR
64 CHMO-f-L435Q cgtttaccaacCAGccgccatcaattgaatc PCR
65 CHMO-r-L435Q GATTCAATTGATGGCGGCTGGTTGGTAAACG PCR
66 CHMO-f-T433I+ L435Q cgaatggcccgtttATCaacCAGccgccatcaattg PCR
67 CHMO-r-T433I+ L435Q CAATTGATGGCGGCTGGTTGATAAACGGGCCATTCG PCR
68 CHMOf-f-T464A gaatccattgaagcgGCAaaagaagcggaagaac PCR
69 CHMOf-r-T464A GTTCTTCCGCTTCTTTTGCCGCTTCAATGGATTC PCR
70 CHMO-SAT432-f-L435Q CGAATGGcccgNNBaccaacCAGccgccatcaattg PCR
71 CHMO-SAT432-r-L435Q CAATTGATGGCGGCTGGTTGGTVNNCGGGCCATTCG PCR
72 CHMO F432E_F ccgaatggcccgGAAaccaacctgccg PCR
73 CHMO F432E_R CGGCAGGTTGGTTTCCGGGCCATTCGG PCR
74 CHMO F432D_F ccgaatggcccgGACaccaacctgccg PCR
75 CHMO F432D_R CGGCAGGTTGGTGTCCGGGCCATTCGG PCR
76 CHMO F432V_F ccgaatggcccgGTTaccaacctgccg PCR
77 CHMO F432V_R CGGCAGGTTGGTAACCGGGCCATTCGG PCR
78 CHMO F432A_F ccgaatggcccgGCTaccaacctgccg PCR
79 CHMO F432A_R CGGCAGGTTGGTAGCCGGGCCATTCGG PCR
80 CHMO F432R_F ccgaatggcccgCGTaccaacctgccg PCR
81 CHMO F432R_R CGGCAGGTTGGTACGCGGGCCATTCGG PCR
82 CHMO F432K_F ccgaatggcccgAAAaccaacctgccg PCR
83 CHMO F432K_R CGGCAGGTTGGTTTTCGGGCCATTCGG PCR
84 CHMO F432N_F ccgaatggcccgAACaccaacctgccg PCR
85 CHMO F432N_R CGGCAGGTTGGTGTTCGGGCCATTCGG PCR
86 CHMO F432M_F ccgaatggcccgATGaccaacctgccg PCR
87 CHMO F432M_R CGGCAGGTTGGTCATCGGGCCATTCGG PCR
88 CHMO F432T_F ccgaatggcccgACCaccaacctgccg PCR
89 CHMO F432T_R CGGCAGGTTGGTGGTCGGGCCATTCGG PCR
Molekularbiologische Arbeiten 138
90 CHMO F432W_F ccgaatggcccgTGGaccaacctgccg PCR
91 CHMO F432W_R CGGCAGGTTGGTCCACGGGCCATTCGG PCR
92 CHMO F432C_F ccgaatggcccgTGCaccaacctgccg PCR
93 CHMO F432C_R CGGCAGGTTGGTGCACGGGCCATTCGG PCR
94 CHMO F432Q_F ccgaatggcccgCAGaccaacctgccg PCR
95 CHMO F432Q_R CGGCAGGTTGGTCTGCGGGCCATTCGG PCR
96 CHMO F432H_F ccgaatggcccgCACaccaacctgccg PCR
97 CHMO F432H_R CGGCAGGTTGGTGTGCGGGCCATTCGG PCR
98 CHMO E292G_F caatatggGagccaatatcgaagc PCR
99 CHMO E292G_R GCTTCGATATTGGCTCCCATATTG PCR
99 523f von medigenomix GCTGGCCAGATGACGTAAGTTTTG Seq
99 1050 forw gaagatgtgaaagccaatccg Seq
99 650rneu gaggtgtttagccagaggtgcca Seq
Molekularbiologische Arbeiten 139
17.3 Kultivierung von E. coli Stämmen
Für eine Plattenkultivierung werden die E. coli Zellen über Nacht auf Agarplatten angezogen.
Eine Kultivierung der E. coli Zellen in flüssiger Form erfolgt mit 50 – 250 ml LB/CB-
Medium in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben. Das Medium wird mit einer Einzelkolonie oder
mit einem Tropfen aus der Gefrierkulturen inokuliert und für 6 - 22 Stunden in einem
Schüttler bei 37°C mit 150 - 180 rpm kultiviert.
17.4 DNA-Preparation
17.4.1 Mini-Plasmidpreparation
Zur Aufreinigung von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab stehen verschiedene Protokolle zur
Verfügung[281]. Das QIAprep Spin Miniprep Kit wird zur Erlangung von hochqualitativer
DNA verwendet.
17.4.2 Maxi Plasmidpreparation
Zur Aufreinigung von Plasmid-DNA im großen Maßstab wird das Qiagen Plasmid Maxi Kit
verwendet. Ausbeuten von bis zu 500 µg sind mit dieser Methode möglich. Das Kit basiert
auf einer alkalischen Lyse der Bakterienzellen in NaOH/SDS in Gegenwart von RNaseA und
einem Anionenaustauscherharz.
17.5 DNA-Aufreinigung
17.5.1 DNA-Fällung
Eine Ethanol-Fällung wird zur Aufkonzentrierung von DNA verwendet:
• 0.1 Volumina 3 M Natriumacetatlösung (Endkonzentration 0.3 M)
• Zugabe von 2 Volumina abs. Ethanols
• Abkühlen auf -70 °C für 60 min
Molekularbiologische Arbeiten 140
• Zentrifugieren bei 12000 rpm für 30 min (4 °C)
• Waschen des Pellets mit 750 µl 70 %iger Ethanol-Lsg.
• Zentrifugieren für weitere 15 –45 min
• Lufttrocknen des Pellets und lösen in Wasser bei Raumtemperatur
17.5.2 PCR-Aufreinigung
Zur Aufreinigung von DNA aus der PCR Reaktionsmischung und zur Aufreinigung von
anderen enzymatischen Reaktionen wird das QIAquick PCR Purification Kit von Qiagen
verwendet.
17.5.3 DNA-Aufreinigung aus dem Agarosegel
In preparativen Gelen variiert die Agarose Konzentration zwischen 0.7 % und 1 %. Die DNA-
Banden werden mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten.
17.5.4 Gelextraktion
Nach dem QIAEX II Agarose Gel Extraktionsprotokoll von Quiagen wird das Gelfragment
gelöst, die DNA bei hohen Salzkonzentrationen an Kiselgelpartikel gebunden und mit Wasser
eluiert.
17.5.5 Freeze ′N Squeeze Technik
• Das Gelfragment wird in ein Freeze′N Squeeze DNA Gel Extraktionsgefäß gegeben.
• Es wird bei -20 °C für 20 min gefroren
• Es wird für 6 min mit 10000 rpm zentrifugiert
Das Zentrifugat enthält die DNA und kann entweder direkt benutzt werden oder man
konzentriert die DNA noch durch Ethanol-Fällung.
Molekularbiologische Arbeiten 141
17.6 DNA-Modifikationen
17.6.1 Restriktionsverdauung
Um die DNA zu verdauen werden Restriktionsendonucleasen vom Typ II benutzt. Die DNA-
Verdauung wird für eine bis vier Stunden bei 37 °C in dem vom Hersteller gelieferten
Restriktionspuffer vollzogen. Analytische Reaktionen wurden bei 37 °C für eins bis vier
Stunden inkubiert.
Die aus einer Mini- oder Maxipreparation erhaltene Plasmid-DNA wird von den Enzymen
NdeI und XhoI verdaut.
Das Reaktionsvolumen (10 µl) für die Restriktionsanalyse besteht aus folgenden
Komponenten:
• 1 µl DNA
• 2 U von jedem Enzym
• 1 µl 10 x Puffer
• Wasser
Die Enzymmenge, welche für die Verdauung von 1 µg DNA eingesetzt werden muss
errechnet sich nach folgender Formel:
sdesPlasmidasseMolekularmDNAderaufnsstellenRestriktio DNAasse der λMolekularmPlasmiddemaufnsstellenRestriktioDNAµg
U
×
×=
λ
Bevor die Proben auf das Agarosegel geladen werden, werden 0.2 Volumina eines
Ladepuffers hinzugegeben.
Molekularbiologische Arbeiten 142
17.6.2 Ligation
T4 DNA-Ligase (Qbiogene) katalysiert die Verknüpfung von zwei DNA-Strängen zwischen
dem 5'-Phosphat und den 3'-Hydroxygruppen von benachbarten Nucleotiden. Das
Temperaturoptimum der Enzymaktivität der T4 DNA-Ligase liegt bei 25 C. Für die Ligation
wird die Temperatur zwischen diesem Optimum und der Temperatur für das Annealing
ausbalanciert.
Die Ligation von sticky end DNA-Fragmenten wird bei 16 °C über Nacht durchgeführt. Die
Ligationsansätze enthalten 0.1 Volumina Ligase Puffer (10 x) und 5 U T4 DNA-Ligase. Das
Vektor zu Insert-Verhältnis beträgt 1:1, 1:2 oder 1:3.
17.6.3 Chemisch kompetente Zellen
• Austreichen von Zellen aus einer Glycerin-Gefrierkultur auf eine Agarplatte mit LB
und geeignetem Antibiotikum. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
• Anwachsen einer Einzelkolonie von der Agarplatte (voriger Schritt) in 2 ml LB (mit
geeignetem Antibiotikum) über Nacht bei 37 °C.
• Inokulieren von 10 ml LB- oder SOC-Medium mit der vorherigen Übernachtkultur
im Verhältnis von 1:30 und bis zu einer OD ≤ 600 bei 37 °C inkubieren.
• Auf Eis kühlen und mit 4000 rpm bei 4 °C zentrifugieren.
• Dekantieren des Überstandes und behutsame Resuspendierung der Zellen in 3.5 ml
kaltem TB-Puffer.
• Auf Eis für 10 Minuten inkubieren.
• Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 800 µl kaltem
Puffer.
• Hinzufügen von 56 µl DMSO (7 %) und für 10 Minuten auf Eis inkubieren.
Molekularbiologische Arbeiten 143
17.6.4 Transformationsprotokoll
• Kompetente Zellen werden auf Eis aufgetaut.
• Es werden 1-5 µL DNA zu 200 µL selbsthergestellten chemisch kompetenten Zellen
gegeben oder 1-2 µL DNA zu 50 µL chemisch kompetenter Zellen von Invitrogen
gegeben.
• Es wird für 30 min auf Eis inkubiert.
• Hitzeschock bei 42 °C für 30 sec. Anschließend werden die Zellen auf Eis für zwei
Minuten abgeschreckt.
• Hinzufügen von 250-800 µL SOC Medium.
• Schütteln bei 37 C für 1 Stunde.
• Ausplattieren auf Agarplatte.
17.7 DNA-Seqenzierung
Die notwendige Menge an DNA wird aus der Miniplasmidminipreparation aus den jeweiligen
E. coli-Klonen gewonnen und durch PCR amplifiziert (Tab. 35).
Tab. 35: PCR-Protokoll zur Sequenzierung der PCR-Reaktion.
Sequenzierungs-PCR
Templat 1 µl
Primer 1 (Nr. 16) 2 µl
Primer 2 (Nr. 17) 2 µl
10 x Puffer 10 µl
Hot Star-Polymerase 1 µl
dNTPs (2 mM) 10 µl
H2O 74 µl
Molekularbiologische Arbeiten 144
Tab. 36: PCR-Programm zur Sequenzierung.
Sequenzierungs-PCR
Temp. [°C] Zeit [sec.] Zyklen
96 900 1
96 60
54.5 60
72 120
40
72 1200 1
• QIAquick PCR Purification Kit für PCR Aufreinigung.
• Analytisches Agarosegel.
• Bestimmung der Konzentration
benötigte Mengen: 10-50 ng/µL (10 ng pro 100 bp für die Sequenzierung).
• Die Sequenzierungen werden von der Medigenomix GmbH durchgeführt.
Die Sequenzen werden mit der Software Vector NTI Advance, Version 9, InforMax
Inc. ausgewertet.
Molekularbiologische Arbeiten 145
17.8 Agarosegel-Elektrophorese
Die Agarosegel-Elektrophorese wird für die analytische und preparative Abtrennung von
DNA-Fragmenten verwendet.
Die Konzentration des Agarosegels variiert zwischen 0.7 und 2 % (w/v) in Abhängigkeit von
der Größe der zu analysierenden Fragmente. Ein 0.8 %iges Agarosegel ist für die meisten
Anwendungen ausreichend. Für analytische Gele ist die erforderliche Menge von Agarose
gelöst in einem 1 x TBE-Puffer. Für preparative Gele benutzt man einen 1 x TAE-Puffer. Das
Auflösen geschieht mittels Erwärmen in einer Mikrowelle. Nach Erkalten der Lösung auf
60 °C werden 1-3 µL Ethidiumbromid hinzugefügt und das Gel wird in eine
Elektrophoresezelle (Bio-Rad Laboratories) gegossen. Der DNA-Lösung wird ein Ladepuffer
in der Größenordnung von 1/3 bis 1/5 des Volumens der DNA hinzugefügt. Die DNA haltige
Lösung wird auf das Gel geladen. Standards für den Größenvergleich sind in Abb. 66
beschrieben. Die angelegte Spannung für die Elektrophorese variiert von 40 V für preparative
Gele bis 90 Volt für Kontrollgele. Nach Beendigung eines Gels werden die DNA Banden
unter UV-Licht visualisiert.
Abb. 66: EZ Load molecular rulers; Bio Rad Laboratories
Molekularbiologische Arbeiten 146
17.8.1 SDS-PAGE
Für die Abtrennung der Proteine werden Polyacrylamidgele benutzt. SDS wird zur
Denaturierung der Proteine hinzugefügt. Die Minigel-Twin Apparatur von Biometra GmbH
wird zur Gelherstellung benutzt. Die Proteinproben werden im Verhältnis 6:1 mit einem
Probenpuffer verdünnt und auf 95 °C für 5 bis 10 Minuten erhitzt. Zur Bestimmung der
Molekularmassen wird ein molekularer Gewichtsstandard (Tab. 32) verwendet. Die Gele
laufen in einem 1 x Ladefpuffer bei konstanter Spannung von 180 V. Für das Färben und
Entfärben werden die Lösungen aus Tab. 31 verwendet. Zuerst wird die Färbelösung
hinzugefügt und für 2–3 Minuten in einer Mikrowelle erhitzt. Die Entfärbelösung wird in der
gleichen Art und Weise angewendet um den Hintergrund zu entfernen. Für die Generierung
geeigneter Gele ist eine zusätzliche Inkubation bei Raumtemperatur erforderlich. Zudem ist
eine frisch hergestellte Entfärbelösung zu empfehlen.d
17.8.2 Protein-Assay
Für die Bestimmung der Gesamtproteinmenge wird der Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad
Laboratories) verwendet. Es basiert auf der Methode von Brandford. Das
Absorptionsmaximum der Säurelösung vom Farbstoff Coomassie Brilliant Blau G-250 wird
von 465 nm auf 595 nm verschoben, wenn eine Bindung zum Protein stattfindet. Der
Farbstoff bindet primär zu basischen und aromatischen Aminosäureresten. Als Standard wird
Rinderserum Albumin (BSA) benutzt.
• Verdünnen von einem Teil Farbstoff mit vier Teilen Wasser und Filtration der
Lösung.
• Pipettieren von 10 µl in Well einer Mikrotiterplatte (0.05 mg/ml – 0.5mg/ml Protein)
• Hinzufügen von 200 µl verd. Farbstoff und gut durchmischen.
• Messung der Absorption bei 595 nm.
17.8.3 Sterilisation
Alle Materialien werden mit dem UT20P Sterilisationsofen (Kendro Laboratory Products
GmbH) sterilisiert. Die Lösungen und Medien für molekularbiologische und mikrobiologische
Experimente werden bei 121 C für 20 Minuten autoklaviert. Der biologische Abfall wird für
15 Minuten bei 134 C autoklaviert. Hitzeempfindlichen Substanzen werden steril filtriert.
Literatur 147
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Anhang 156
19 Anhang
Tabelle 1: Untersuchte Substrate in der Baeyer-Villiger-Oxidation mit dem Wildtyp der CHMO und mit der Mutanten I-K2-F5.
CHMO I-K2-F5 (S)
Substrat [α]20D ee [%] [α]20
D conv. [%] ee [%]
O
- 89.3 - +++ 94
OCl
- >99 - +++ 99
O
- 5 - +++ 91
O
- 99 - +++ >99
O
+ 95 -a +++ >99
O
+ >99 - a +++ >99
O
OH
- 96 - +++ >99
Anhang 157
O
OH
+ >99 - ++ >99
CHMO I-K2-F5 (S)
O
- 99 +++ >99
O
O
n.c n.c.
O
- 17 - +++ >97
O
- 88 - +++ 78
O
- 62 - +++ 96
OO
+ 53 - +++ 83
O
-/- 44/>99 -/- +++/+++ 65/>99
O
-/- 95/>99 -/- +++/+++ >99/80
Persönliche Mitteilung von Professor Dr. Marko D. Mihovilovic (Technische Universität Wien).
+++ >90% Umsatz ++ 90>x>50% Umsatz + < 50% Umsatz n.c. no conversion n.d. not determined (a) bestätigt durch [α]20
D
