Gentechnische Methoden - rd.springer.com978-3-8274-2430-3/1.pdf · Lieber Leser, lieber Nutzer, wie funktioniert doch gleich die Methode, die dringend benötigte Ergebnisse liefern

Gentechnische Methoden

Monika Jansohn, Sophie Rothhämel (Hrsg.)

Gentechnische MethodenEine Sammlung von Arbeitsanleitungen für das molekularbiologische Labor

5. Auflage

Mit Beiträgen vonAchim Aigner, Tanja Arndt, Stefan Bade, Tobias Bopp, Ute Dechert, Andreas Frey, Hans-Heiner Gorris, Josef Hermanns, Monika Jansohn, Matthias Klein, Susanne Kneitz, Christoph Krettler, Monika Lichtinger, Gerd Moeckel, Cornel Mülhardt, Arnd Petersen, Christoph Reinhart, Carolina Rió Bártulos, Niels Röckendorf, Sophie Rothhämel, Henning Schmidt, Martin Schröder, Michael Teifel, Hella Tappe, Korden Walter, Sabine Wolf

Weitere Informationen zum Buch finden Sie unter www.spektrum-verlag.de/978-3-8274-2429-7

Wichtiger Hinweis für den BenutzerDer Verlag, die Herausgeber und die Autoren haben alle Sorgfalt walten lassen, um vollständige und akkurate Informationen in diesem Buch zu publizieren. Der Verlag übernimmt weder Garantie noch die juristische Verantwortung oder irgendeine Haftung für die Nutzung dieser Informationen, für deren Wirtschaftlichkeit oder fehlerfreie Funktion für einen bestimmten Zweck. Der Verlag übernimmt keine Gewähr dafür, dass die beschriebenen Verfahren, Programme usw. frei von Schutzrechten Dritter sind. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Buch berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jeder-mann benutzt werden dürften.

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5. Auflage 2012 © Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2012Spektrum Akademischer Verlag ist ein Imprint von Springer

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Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen.

Planung und Lektorat: Dr. Ulrich G. Moltmann, Martina MechlerRegister: Bärbel HäckerSatz: TypoStudio Tobias Schaedla, HeidelbergUmschlaggestaltung: SpieszDesign, Neu-Ulm Titelfotografie: © Paolo Toscani (Fotolia)

ISBN 978-3-8274-2429-7

Lieber Leser, lieber Nutzer,wie funktioniert doch gleich die Methode, die dringend benötigte Ergebnisse liefern kann? Welches Verfahren ist für ein Experiment am besten geeignet? Welche Kontrol-len sind sinnvoll? Warum muss dieser Puffer angesetzt werden, und wie genau war das noch mal mit der Rei-henfolge im Pipettierschema? Diese Fragen begegnen uns täglich im Labor und eine unkomplizierte Antwort wäre wirklich hilfreich.

Das vorliegende Buch bietet eine ausgewählte Samm-lung an Arbeitsmethoden der Molekularbiologie bzw. Bio-technologie, um die täglichen Hürden der Laborarbeit zu meistern. Es richtet sich an Bachelor-, Master- oder Diplomstudenten, die zum ersten Mal eine PCR ansetzen, an Technische Assistenten oder Laboranten, die eine neue Methode im Labor etablieren, sowie an erfahrene Wissen-schaftler, die nur schnell mal nachschlagen wollen. Und natürlich richtet sich dieses Buch in gleichem Maße an Vertreter beiderlei Geschlechts, auch wenn wir im Hin-blick auf die Lesbarkeit auf die ausdrückliche Erwähnung der weiblichen Form verzichten.

Die Autoren dieses Buches geben ihre Erfahrung aus dem aktuellen Laboralltag weiter. Manche Autoren sind seit vielen Jahren in Lehre und Ausbildung tätig, andere in der Industrie oder Forschung beschäftigt. Die hier beschriebenen Methoden und Rezepte werden zum Teil

seit Jahren erfolgreich angewendet, andere hingegen wur-den erst kürzlich etabliert.

Wir empfehlen, die Kapitel immer als Ganzes zu lesen. Alle Abschnitte enthalten eine allgemeine theoretische Einleitung und einen praktischen Teil. Letzterer stellt ver-allgemeinerte Protokolle vor, die durch Hilfestellungen zur Optimierung und Anpassung für kompliziertere Fragestel-lungen ergänzt werden. Besonderen Wert haben wir auf Sicherheitshinweise und mögliche Fehlerquellen gelegt. Alle Angaben und Hinweise zu den Herstellern sind als Vorschläge zu sehen, die im Einzelfall modifiziert werden können.

Gegenüber der letzten Auflage hat sich einiges verän-dert. Wir haben die Kapitel zu RNAi, Bioinformatik und zu Microarrays deutlich ausgebaut. Ein Kapitel zur Fixierung und Aufbereitung von Gewebe wurde neu aufgenommen. Die Autoren haben alle Abschnitte gründlich überarbeitet, wofür wir ihnen an dieser Stelle herzlich danken!

Es ist das Ziel dieses Buches, den interessierten Nutzer anzuleiten und zu unterstützen, um erfolgreich und enga-giert die gewünschten Experimente durchzuführen.

Wir wünschen gutes Gelingen!Monika Jansohn und Sophie RothhämelNew York und Detroit im Juli 2011

Vorwort

Prof. Dr. Achim AignerRudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und ToxikologieAbteilung Klinische Pharmako-logieHärtelstraße 16-18D - 04107 Leipzig

Dr. Tanja ArndtMedizinische Hochschule HannoverCarl-Neuberg-Straße 1D - 30625 Hannover

Dr. Steffen Bade Forschungszentrum BorstelAbteilung PneumologieMukosale Immunologie und DiagnostikParkallee 22D - 23845 Borstel

Tobias Bopp Institut für ImmunologieUniversität MainzHochhaus am AugustusplatzD - 55131 Mainz

Dr. Ing. Ute DechertB•R•A•I•N AGDarmstädter Straße 34D - 64673 Zwingenberg

PD Dr. Andreas FreyForschungszentrum BorstelLaborgruppe MukosaimmunologieParkallee 22D - 23845 Borstel

Dr. Hans-Heiner Gorris Institut für Analytische Chemie, Chemo- und BiosensorikUniversität RegensburgUniversitätsstr. 31D - 93040 Regensburg

Dr. Josef HermannsBiologische Heilmittel Heel GmbHDr. Reckewegstraße 2-4D - 76532 Baden-Baden

Dr. Monika JansohnGrandview Drive 1709Rochester Hills, MI 48306USA

Dr. Matthias KleinInstitut für Immunologieder Universitätsmedizin der JGU MainzObere Zahlbacher Str. 67D - 55131 Mainz

Dr. Susanne KneitzInstitut für Virologie und ImmunbiologieIZKF WürzburgVersbacher Str. 7D - 97078 Würzburg

Christoph KrettlerMühlstr. 43a D - 65760 Eschborn

Dr. Monika Lichtinger3 Concordia StreetThe Quays, Flat 43Leeds LS1 4ESUK

Prof. Dr. Gerd Moeckel Fakultät für Informatik Fachhochschule HeidelbergLudwig-Guttmann-Straße 6D - 69123 Heidelberg

Dr. Cornel MülhardtF. Hoffmann-La Roche AGGrenzacherstraße 124CH - 4070 Basel

PD Dr. Arnd PetersenForschungszentrum BorstelLaborgruppe Biochemische und Molekulare AllergologieParkallee 22D - 23845 Borstel

Dr. Christoph ReinhartHeidestr. 15460385 Frankfurt am Main

Dr. Carolina Rió BártulosFachbereich BiologieAG Kroth, M611Universität KonstanzD - 78457 Konstanz

Dr. Niels RöckendorfForschungszentrum BorstelAbteilung PneumologieMukosale Immunologie und DiagnostikParkallee 22D - 23845 Borstel

Dr. Sophie RothhämelAlbert Einstein College of MedicineDepartment of Developmental and Molecular Biology1300 Morris Park AvenueBronx, NY 10461USA

Prof. Dr. Henning SchmidtInstitut für GenetikTechnische Universität BraunschweigSpielmannstr. 7D - 38106 Braunschweig

Dr. Martin SchröderUniversity of DurhamSchool of Biological and Biomedical SciencesSouth RoadDurham DH1 3LEUK

Autorenverzeichnis

VIII Autorenverzeichnis

Dr. Michael TeifelZentaris GmbHDrug Discovery - Pharmacology & ToxicologyWeismüllerstraße 50D - 60314 Frankfurt/Main

Dr. Hella TappeBIOTechnikumFlad Flad Communication GmbHThomas-Flad-Weg 1D - 90562 Heroldsberg

Dr. Korden Walter Hügelstr. 3D - 65203 Wiesbaden

PD Dr.-Ing. Sabine WolfEsplora GmbHc/o Institut für BiochemiePetersenstraße 22D - 64287 Darmstadt

A AmpereAbschn. AbschnittA AdenosinAc2O EssigsäureanhydridAK AntikörperAla Alaninamp AmpicillinAMPPD Adamantyl-1,2-dioxethanarylphosphatAMV Avian Myeloblastosis VirusAP alkalische PhosphataseAPS AmmoniumperoxodisulfatApo E Apolipoprotein EArg ArgininAS Aminosäure(n)Asn AsparaginAsp AspartatATP Adenosin-5’-triphosphatb Base(n)BAC bacterial artificial chromosomeBCA Bichinchonin-SäureBCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat,

p-Toluidinsalzβ-Gal β-Galactosidase BHK 21 Hamsternierenfibroblasten, Klon 21bidest. bidestilliertBLAST Basic Alignment Search Tool; Programm

für den Vergleich einer Ausgangssequenz gegen Sequenzdatenbanken

Bluo-Gal 5-Bromoindolyl-β-D-galactopyranosidβ-ME β-MercaptoethanolBMM buffered minimal methanolBMG buffered minimal glycerolBN-PAGE Blue-Native-Polyacrylamid-

GelelektrophoreseBNPS 3-Brom-3-methyl-2-(2-nitrophenly-

mercapto)-3H-indolbp Basenpaar(e)BPB BromphenolblauBrCN BromcyanBSA RinderserumalbuminC CytidincAMP cyclisches AdenosinmonophosphatCAPS CyclohexylaminopropansulfonsäureCAT Chloramphenicol-Acetyltransferase CBS Citrat gepufferte Salzlösung

cDNA complementary DNACDNB 1-Chloro-2,4-dinitrobenzolCHIP Chromatin-ImmunopräzipitationCi CurieCIP calf intestine phosphatase, alkalische

Phosphatase aus KälberdarmCLUSTALW Programm für die Berechnung multipler

Sequenzvergleiche4-CN 4-ChlornaphtholCOS.7-Zellen SV40-transformierte Zellinie von

Affennierenzellen (CV1)CP Carboxypeptidase cpm counts per minuteCTAB CetyltrimethylammoniumbromidCTP CytidintriphosphatCys Cysteind TagDa DaltonDAB 3,3‘- DiaminobenzidinDABSCl 4-Dimethylamino-azobenzol-4-

sulfonylchloriddAMP Desoxyadenosin-5‘-monosphatdATP Desoxyadenosin-5‘-triphosphatDC-Chol 3[N-(N,N-Dimethylaminoethan)-

carbamoyl]-cholesterindCTP Desoxycytidin-5‘-triphosphatDDAB DimethyldioctadecylammoniumbromidDDBJ DNA Databank of JapanddH2O zweifach destilliertes WasserddPCR Differential Display PCR2 DE zweidimensionale Polyacrylamid-

GelelektrophoreseDEAE DiethylaminoethylDEPC Diethylpyrocarbonatdest. destilliertdGTP Desoxyguanosin-5’-triphosphatDICP DiisocarbodiimidDIG DigoxigeninDisk-Elek- diskontinuerliche Elektrophorese trophorese dITP Desoxyinosin-5’-triphosphatDNA desoxyribonucleic acid

(Desoxyribonucleinsäure)DNase DesoxyribonucleaseddNTP 2’,3’-Didesoxyribonucleosid-5’-triphosphat

Abkürzungsverzeichnis

X Abkürzungsverzeichnis

DGGE denaturierende GradientengelelektrophoreseDMF N,N-DimethylformamidDMS DimethylsulfatDMSO DimethylsulfoxidDMRIE 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-

hydroxyethylammoniumbromiddNTP 2’-Desoxyribonucleosid-5’-triphosphatDOC DesoxycholatDOGS Dioctadecylamidoglycylspermidin,

TransfectamDOPE Dioleyl-phosphatidyl-ethanolamin DOSPER 1,3-Dioleyloxy-2-(6-carboxyspermyl)-

propylamidDOTAP N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-

trimethylammoniumethylsulfatDOTMA 1,2-Dioleyloxypropyl-3-trimethyl-

ammoniumbromidds doppelsträngigDTE DithioerythrolDTT DithiothreitoldTTP Desoxythymidin-5’-triphosphatE ExtinktionEBI European Bioinformatics InstituteEDTA EthylendiamintetraacetatEI-PCR enzymatic inverse PCRELISA enzyme-linked immuno sorbent assayEMBL European Molecular Biology LaboratoryER endoplasmatisches RetikulumESI Elektrospray IonisationEST Expressed Sequence TagsEtBr Ethidiumbromidf femtoF FaradFACS fluorescence activated cell sorterFASTA Programm für den Vergleich

einer Ausgangssequenz gegen Sequenzdatenbanken

FCS/FKS fötales Kälberserum FGF-BP Fibroblastenwachstumsfator bindendes

Proteinfl. flüssigFMOC FluorenylmethylchloroformiatFPLC fast protein liquid chromatographyFRET Fluoresence Resonance Energy Transferg Grammg ErdbeschleunigungG GuanosinG-418 Aminoglycosidantibiotikum GeneticinGCG Genetics Computer Group der Universität

Wisconsin, USA

gent GentamycinGFP grünfluoreszierendes Protein Gln GlutaminGlu GlutamatGly GlycinGST Glutathion-S-TransferaseGTP Guanosintriphosphath StundeHAT- hypoxanthin-, aminopterin- und Medium thymidinhaltiges MediumHBS HEPES gepufferte SalzlösungHeLa Zellinie aus einem CervixkarzinomHEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethan-

sulfonatHFM Hogness modified freezing mediumHGMPRC Human Genome Mapping Project Resource

CenterHis HistidinhnRNA heterogene nucleäre RNAHOBt N-HydroxybenzotriazolHPLC high performance liquid chromatographyHRP MeerrettichperoxidaseHSB high salt bufferhsDNA Heringsperma-DNAHUVEC humane Nabelschnurendothelzelleni.a. im AllgemeinenIARC International Agency Research CenterI.D. InnendurchmesserIEF isoelektrische FokussierungIle IsoleucinIPG immobilisierte pH-GradientenIPTG Isopropylthiogalactosidk Kilo-kan Kanamycinkb KilobasenKS Kalbsseruml LiterIκB Inhibitor κ Kap. KapitelKNL kationisiertes Nylon 6,6LB Luria brothLD lethale DosisLeu LeucinLM-Agarose Low Melting AgaroseLPLL Lipopoly-L-Lysin LPS LipopolysaccharidLR-PCR long range PCRLuc LuciferaseLUV große unilamellare VesikelLys Lysin

Abkürzungsverzeichnis XI

m Milli-μ mikroM molarMALDI matrixunterstütze Laser-Desorption/

IonisationMD Minimal DextroseMeOH MethanolMeIm N-MethylimidazolMES 2-MorpholinoethansulfonsäureMet MethioninMeV MegaelektronenvoltMilli-Q-H2O durch eine Millipore-Anlage gereinigtes

Wassermin Minute(n)MLV multilamellare VesikelMM Minimal MethanolMMLV Moloney Murine Leukemia Virusmoi multiplicity of infection, Mengenverhältnis

Phagen/BakterienMOPS 3-MorpholinopropansulfonsäuremRNA Messenger-RNAMS MassenspektrometrieMTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyl-tetra-zoliumbromidNBT Nitrotetrazoliumblauchlorid, 3,3’-

(3,3’-Dimethoxy-4,4’-biphenylen)-bis-[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid]

NC NitrocelluloseNCBI National Center for Biotechnology

InformationNCS/NKS Neugeborenen-KälberserumNfκB nuclear factor κB, TranskriptionsfaktorNIH National Institute of HealthNL neutrales Nylon 6,6NLM National Library of MedicineNMP N-MethylpyrrolidonNTB nick translation bufferOBt Ester mit N-HydroxybenzotriazolOMIM Online Mendelian Inheritance in ManONPG ortho-Nitrophenyl-β-D-GalactopyranosidOPA OrthophthaldialdehydORF open reading framep Pico-p.a. pro analysiPAA PolyacrylamidPAC Phage Artificial ChromosomePAGE Polyacrylamid-GelelektrophoresePAP Peroxidase-anti-PeroxidasePASA PCR-allelspezifische Amplifikation

PBS phosphate buffered saline = phosphatgepufferte Salzlösung

PBST PBS mit TweenPCR polymerase chain reaction, Polymerase-

KettenreaktionPDB ProteindatenbankPE PolyethylenPEG PolyethylenglykolPFAM Protein familiesPFGE Puls Feld GelektrophoresePfp PentafluorphenylPFTE Polyfluortetraethylen (Teflon)pfu plaquebildende EinheitPhe PhenylalaninPIC PhenylisocyanatPITC PhenylisothiocyanatPMSF PhenylmethylsulfonylfluoridPonceau S 3-Hydroxy-4-[2-sulfo-4-(sulfo-phenylazo)

phenylazo]-2,7-naphthalindisulfonsäurePP PolypropylenPRINTS Protein Fingerprints DatabasePro ProlinPRODOM Protein Domain DatabasePROSITE Protein Sites Database, Proteinfamilien-

und ProteindomänendatenbankPTH PhenylthiohydantoinPVDF PolyvinylidenfluoridRACE rapid amplification of cDNA endsRC-PCR recombinant circle PCRRf-Werte Relative mobility-Werterlu relative LichteinheitenRNA ribonucleic acid (Ribonucleinsäure)RNase RibonucleaseRPC reversed phase chromatographyR-PCR recombination PCRRP-HPLC reversed phase HPLCrpm Umdrehungen pro MinuterRNA ribosomale RNARSB residual salt bufferRSB/K RSB mit KClRT RaumtemperaturRT-PCR Reverse Transkriptase PCRs SekundeSANBI South African National Bioinformatics

InstituteSDS NatriumdodecylsulfatSer SerinSMART Simple Modular Architecture ResearchSNP singel nucleotide polymorphismsnRNA kleine nucleäre RNA

XII Abkürzungsverzeichnis

SOE-PCR splicing by overlap extension PCRSRS Sequence retrieval systemss einzelsträngigSSC sodium salt citrate, NatriumcitratSSCP single-strand conformation polymorphismSTACK Sequence Tag Alignment and Consensus

Knowledge Database; eine expressed sequence tags-(EST)-Datenbank

SUV kleine unilamellare VesikelSV40 Simian Virus 40T ThymidinTAE Tris-Acetat-EDTA-PufferTB terrific brothTBE Trisbase mit Borsäure und EDTATBP TATA BindungsproteinTBS Tris-gepufferte SalzlösungTBST TBS mit TweenTCA TrichloressigsäureTE Tris-EDTATEMED N,N,N’,N’-TetramethylethylendiaminTESS transcription element search softwaretet TetracyclinTFA TrifluoressigsäureThr ThreoninTIBS TriisobutylsilanTIGR The Institute of Genome ResearchTLE Tris-EDTA mit LiClTLC Thinlayerchromatography;

Dünnschichtchromatographie

Tm DNA-SchmelztemperaturTris Tris(hydroxymethyl)aminomethantRNA Transfer-RNATrp TryptophanTyr TyrosinU unit (Einheit für Enzymmenge)ÜN über NachtÜNK ÜbernachtkulturURL uniform resource locatorsUSE unique site elimination, Eliminierung eines

SelektionsmarkersUTP UridintriphosphatUV UltraviolettV VoltVal ValinVA RNA virusassoziierte RNAVDR VanadylribonucleosidkomplexW WattXaa beliebige AminosäureXC XylencyanolX-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-

galactopyranosidYAC yeast artificial chromosomes = künstliche

HefechromosomenYNB yeast nitrogen baseYPD yeast peptone dextroseYPDS yeast extract peptone dextrose sorbitolYT yeast tryptoneZV Zellvolumen

Vorwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V Autorenverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .IX

1 Allgemeine Methoden . . . . . . . . . . . . . . . 1(Carolina Río Bártulos, Hella Tappe, Sophie Rothhämel*)

1.1 Absorptionsmessungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.1 Absorptionsmessung im UV-Bereich . . . . . . . . 21.1.2 Absorptionsmessung im sichtbaren Bereich . . 31.1.3 Trübungsmessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.1.4 Fluoreszenzmessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.2 Radioaktivitätsmessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.3 Autoradiographie und Fluorographie . . . . . . . . 51.4 Zentrifugationstechniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.5 Steriles Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.5.1 Sterilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.5.2 Steriles Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.5.3 Silikonisieren von Glasgeräten . . . . . . . . . . . . . . 91.6 Phenolextraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.7 Fällungsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101.7.1 Präzipitation von Nucleinsäuren . . . . . . . . . . .111.8 Säulenchromatographische Trennverfahren

für kleine Mengen Nucleinsäuren . . . . . . . . . .121.8.1 Ionenaustauschchromatographie an

DEAE (Diethylaminoethyl)-Cellulose . . . . . .121.8.2 Gelpermeationschromatographie an

Sephadex G-50 oder G-100 . . . . . . . . . . . . . . .131.9 Markierung von Nucleinsäuren . . . . . . . . . . . . .141.9.1 Endmarkierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . .141.9.1.1 5’-Phosphorylierungen von DNA . . . . . . . . . .141.9.1.2 3’-Endmarkierung von DNA . . . . . . . . . . . . . .151.9.2 Radioaktive Markierung von DNA

durch Nick-Translation . . . . . . . . . . . . . . . . . . .161.9.3 Markierung von DNA-Fragmenten durch

random priming . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .181.10 Dephosphorylierung von DNA . . . . . . . . . . . . .191.11 Arbeiten mit Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . .19

1.11.1 Kultivierung von E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . .211.11.2 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .211.11.2.1 Genetische Marker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .221.11.2.2 Restriktions-Modifikationssysteme

von E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .221.11.2.3 Der Gebrauch des genetischen Codes . . . . . .231.11.2.4 Keimzahlbestimmungen . . . . . . . . . . . . . . . . . .241.12 Proteinisolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .241.12.1 Chromatographische Verfahren . . . . . . . . . . . .251.12.1.1 Ionenaustauschchromatographie . . . . . . . . . . .271.12.1.2 Gelpermeationschromatographie . . . . . . . . . .301.12.1.3 Hydrophobe Chromatographie . . . . . . . . . . . .321.12.1.4 Affinitätschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . .331.12.2 Fällung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35

2 Gelelektrophoresen . . . . . . . . . . . . . . . . .37(Ute Dechert)

2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) . . . .372.1.1 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese . . .402.1.2 Gelelektrophorese in Tris-Tricin-

Puffersystemen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .442.1.3 Kontinuierliche SDS-Gelelektrophorese . . . . .462.1.4 Gradienten-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . .472.1.5 Diskontinuierliche Gelelektrophorese

unter nativen Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . .492.1.6 Isoelektrische Fokussierung (IEF) . . . . . . . . . .512.1.7 Zweidimensionale Polyacrylamid-

Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .552.1.8 Automatisierte Elektrophorese . . . . . . . . . . . . .592.2 Nachweismethoden für Proteine . . . . . . . . . . .592.2.1 Coomassie Blau-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . .602.2.2 Silberfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .622.2.2.1 Merril-Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .632.2.2.2 Ansorge-Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .632.2.3 Fluoreszenzfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .652.2.4 Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .662.2.5 Detektion von Proteinen in Gelen durch

SDS-Präzipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .672.3 Gelelektrophorese von Nucleinsäuren . . . . . . .682.3.1 Agarose-Gelsysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .692.3.1.1 Puls-Feld-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . .702.3.1.2 Native Agarose-Gelelektrophorese für DNA . .742.3.1.3 Denaturierende alkalische Agarose-

Gelelektrophorese für DNA . . . . . . . . . . . . . . .76

Inhalt

* Hier angegeben sind die Autoren der aktuellen Auflage. Sie haben als Vorlage für die grundlegende Überarbeitung das entsprechende Kapitel der 4. Auflage dieses Buches ergänzt (Spektrum Akademischer Verlag, 2007), in der die früheren Autoren genannt sind.

XIV Inhalt

2.3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese für RNA nach Denaturierung mit Glyoxal und DMSO . . . . .78

2.3.2 Polyacrylamid-Gelsysteme . . . . . . . . . . . . . . . .802.3.2.1 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese

für DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .802.3.2.2 Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese für DNA . . . . . . . . . . . . . . .822.4 Anfärbung von Nucleinsäuren in Gelen . . . . . .842.4.1 Anfärbung von Nucleinsäuren in Gelen

mit Ethidiumbromid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .852.5 Elution von Nucleinsäuren aus Gelen . . . . . . .872.5.1 Elution von DNA aus LM-Agarosegelen . . . .882.5.2 Elution von DNA aus LM-Agarosegelen

durch GELase® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .892.5.3 Elution von DNA aus Agarosegelen durch

reversible Bindung an Silica/Glasfaser-Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90

2.5.4 Elektroelution von hochmolekularer DNA aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91

2.5.5 Diffusionselution von DNA aus Polyacrylamidgelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92

3 Isolierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . .95(Carolina Río Bártulos, Hella Tappe, Sophie Rothhämel*)

Klassische Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .95 Silikagel basierende Verfahren . . . . . . . . . . . . .95 Anionenaustauschchromatographie . . . . . . . .95 Filtrationsverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 Hinweise zum Arbeiten mit DNA . . . . . . . . . .963.1 Isolierung chromosomaler DNA . . . . . . . . . . . .96 Allgemeine Hinweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .973.1.1 Silikageltechnologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97 Allgemeine Hinweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .973.1.1.1 Vollblut und Körperflüssigkeiten . . . . . . . . . . .983.1.1.2 Gewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .993.1.1.3 Lyse weiterer Ausgangsmaterialien . . . . . . . .100 Lysate jeder Art . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1043.1.2 Probenkonzentrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . .1043.1.3 Anionenaustausch-Technologie . . . . . . . . . . .1043.1.3.1 Lyse von Blut, buffy coat oder

Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .105

3.1.3.2 Lyse von Geweben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1063.1.3.3 Lyse von Hefe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1063.1.3.4 Lyse von Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1063.1.3.5 Isolierung genomischer DNA aus Blut,

Kulturzellen, Tiergeweben, Hefen und Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .107

3.2 Isolierung von Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . .1073.2.1 Wichtige allgemeine Parameter . . . . . . . . . . .1073.2.1.1 Plasmid-Kopienzahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1083.2.1.2 Wirtsstamm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1083.2.1.3 Wachstum der Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . .1083.2.1.4 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1083.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA . . . . . . .109 Reinheitsgrad der DNA und Technologien

für die Plasmidminipräparation . . . . . . . . . . .110 Probendurchsatz und Automatisierung . . . .1103.2.2.1 Klassische Minipräparation von

Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1113.2.2.2 Minipräparation von Plasmid-

DNA mit Silikatechnologie und Zentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .111

3.2.2.3 Minipräparation von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz-Format mittels Filtrationstechnologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .114

3.2.2.4 Weitere Alternativen im Bereich Minipräparation von Plasmid-DNA . . . . . . .115

3.2.2.5 Besonderheiten bei Minipräparationen von Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .116

3.2.2.6 Analyse von Plasmid-DNA nach der Minipräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .116

3.2.3 Großpräparation von Plasmid-DNA . . . . . . .1173.2.3.1 Anzucht der Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . .1183.2.3.2 Alkalische Lyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1183.2.3.3 Weitere Reinigung der Plasmid-DNA . . . . . .1193.2.3.4 Reinigung von Plasmid-DNA über

CsCl-Dichtegradientenzentrifugation . . . . . .1193.2.3.5 Entfernung von genomischer DNA-

Kontamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1213.2.3.6 Analyse der Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . .1213.2.4 DNA-Präparation und Analyse von

Plasmiden mit großem Insert (PAC, BAC) . .1223.2.4.1 DNA-Isolierung von E. coli-Zellen mit

PAC- oder BAC-Plasmiden . . . . . . . . . . . . . .1223.2.4.2 Restriktionskartierung und Größen-

bestimmung klonierter DNA-Fragmente . . .1253.2.4.3 Aufreinigung von PAC- und BAC-

Insert-DNA durch präparative Puls-Feld-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .126

3.3 Isolierung von Phagen-DNA . . . . . . . . . . . . . .1283.3.1 Großpräparation von λ-DNA . . . . . . . . . . . . .128


Inhalt XV

3.3.1.1 Anzucht der Phagen mittels Plattenlysat . . .1293.3.1.2 Anzucht der Phagen mittels Flüssiglysat

(Mini- und Midi-Lysate) . . . . . . . . . . . . . . . . .1293.3.1.3 Protokoll zur Isolierung der λ-DNA . . . . . . .1303.3.2 Präparation von M13-Phagen-DNA . . . . . . .1313.3.2.1 Präparation von M13-Phagen-DNA

durch Silikamembran-Technologie und Zentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .131

3.4 Analyse von Ausbeute, Reinheit und Länge der isolierten Nucleinsäure . . . . . . . . .132

4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135(Henning Schmidt, Sophie Rothhämel*)

4.1 Grundprinzip und Einsatzgebiete der PCR . . .1354.1.1 Wesentliche Komponenten der PCR . . . . . . .137 Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .137 Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .137 DNA-Polymerasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1384.1.2 Durchführung der PCR (Basisprotokoll) . . .1384.1.3 PCR-Geräte (Thermocycler) und

Nachweissysteme für PCR-Produkte . . . . . . .1414.1.4 Anwendungsgebiete der PCR . . . . . . . . . . . . .1424.2 Verschiedene PCR-Techniken . . . . . . . . . . . . . .1434.2.1 Amplifikation von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . .1434.2.1.1 Hot start-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1434.2.1.2 Multiplex-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1444.2.1.3 High fidelity-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1454.2.1.4 Long range-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1464.2.1.5 Inverse PCR zur Amplifikation

unbekannter Sequenzabschnitte . . . . . . . . . .1484.2.2 Amplifikation von RNA (RT-PCR) . . . . . . . .1494.2.2.1 Grundprinzip der Reverse Transkriptase-

Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1494.2.2.2 Enzymatische Aktivitäten der Reversen

Transkriptase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1514.2.2.3 Stabile RNA-Sekundärstrukturen . . . . . . . . .1524.2.2.4 Priming der cDNA-Synthese . . . . . . . . . . . . .1534.2.2.4.1 Primer-Typen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1544.2.2.5 Verschiedene Reverse Transkriptasen . . . . . .1554.2.2.6 Methoden der RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . .1554.2.3 Quantitative PCR und RT-PCR . . . . . . . . . . .160

4.2.3.1 Kompetitive RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1604.2.3.2 Real time-PCR und -RT-PCR . . . . . . . . . . . . .1614.2.3.3 Quantifizierung von Zielnucleinsäuren . . . .1624.2.3.4 Real time-PCR und RT-PCR mit

sequenzspezifischen Fluoreszenzsonden . . .1634.2.3.5 Real time-Multiplex-PCR mit

sequenzspezifischen Fluoreszenzsonden . . .1654.2.3.6 Real time-PCR und -RT-PCR mit DNA-

bindenden Fluoreszenzfarbstoffen . . . . . . . .1674.2.3.7 Real time-one step-RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . .1684.2.4 in situ-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .170

5 Klonierung von cDNA (cDNA-Phagenbank) . . . . . . . . . . . . . . .173(Cornel Mülhardt)

5.1 Klonierung von cDNA mit λ-Vektoren . . . . . .1735.1.1 cDNA-Synthese und Vorbereitung zur

Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1765.1.1.1 cDNA-Erststrangsynthese . . . . . . . . . . . . . . . .1765.1.1.2 cDNA-Zweitstrangsynthese . . . . . . . . . . . . . .1775.1.1.3 Auffüllreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1785.1.1.4 Eco RI-Linkerligation und

-phosphorylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1785.1.1.5 Hydrolyse der cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1795.1.1.6 Größenfraktionierung der cDNA . . . . . . . . .1805.1.1.7 Ligation der cDNA mit λ-Vektor-DNA . . . .1825.1.2 Titerbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1825.1.3 Amplifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1835.1.4 TCA-Präzipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1845.2 Klonierung von cDNA mit λ-gt11 . . . . . . . . . .1855.2.1 in vitro-Verpackung von λ-gt11-DNA . . . . .1885.2.1.1 Herstellung von Verpackungsextrakt . . . . . .1885.2.1.2 in vitro-Verpackung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1895.2.1.3 Lagerung von λ-Phagenbanken und

-Lysaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1905.2.2 Titerbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1905.2.2.1 Überprüfung der Qualität der cDNA-

Phagenbank durch PCR-Screening . . . . . . . .1925.2.3 Amplifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1925.2.4 Screening der λ-gt11-cDNA-Bank mit

Antikörpern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1945.2.4.1 Pseudoscreening: Entfernung der Anti-

E. coli- und Anti-Phagen-lmmunglobuline aus Antikörperseren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .196

5.2.4.2 Screening mit Antikörpern und Nachscreening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .197

5.2.5 Möglichkeiten eines Authentizitäts-nachweises positiver λ-gt11-Klone . . . . . . . .200


XVI Inhalt

5.2.5.1 Isolierung des β-Galactosidase-Fusionsproteins durch SDS-Gelelektro-phorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .201

5.2.5.2 Gewinnung von Antikörpern zum Rescreening und für Western-Blots . . . . . . .203

5.2.6 Isolierung und Reinigung des β-Galactosidase-Fusionsproteins . . . . . . . . . .204

5.2.6.1 Etablierung von lysogenen E. coli Y1 089-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .204

5.2.6.2 Rohlysatherstellung aus lysogenen E. coli Y1 089-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .206

5.2.6.3 Reinigung von β-Galactosidase-Fusionsproteinen aus dem Rohlysat . . . . . . .206

5.3 Klonierung von cDNA in Plasmide . . . . . . . . .2085.3.1 Präparation von Plasmid-DNA mit

3'-überstehendem Thymidin . . . . . . . . . . . . .2085.3.2 Ligation von amplifizierter cDNA mit

Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2095.3.3 Herstellung von transformations-

kompetenten E. coli-Zellen . . . . . . . . . . . . . . .2095.3.4 Transformation von kompetenten

E. coli-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .211

6 Klonierung von genomischer DNA (genomische Genbank) . . . . . .213(Cornel Mülhardt*)

6.1 Klonierung mit dem Bakteriophagen λ-EMBL3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .213

6.1.1 Partialhydrolyse der chromosomalen DNA .2146.1.2 Größenfraktionierung von DNA

durch Saccharose Dichtegradienten-zentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .215

6.1.3 Vektorhydrolyse und Ligationsreaktion . . . .2166.1.4 in vitro-Verpackung der Ligations-

produkte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2176.1.5 Titerbestimmung und Ausplattieren

der Phagenbank . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2176.2 Klonierung mit Cosmiden . . . . . . . . . . . . . . . .2186.2.1 Vektorhydrolyse, Phosphatasebehandlung

und Ligationsreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2206.2.2 in vitro-Verpackung der Ligations-

produkte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .221

6.2.3 Etablierung der Genbank . . . . . . . . . . . . . . . .2216.3 Herstellung von DNA-Bibliotheken in künst-

lichen, bakteriellen Chromosomen (BAC) . . .2226.3.1 BAC-Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2236.3.2 Präparation von HMW-DNA und

Größenselektion der DNA-Fragmente zur Klonierung in einen BAC-Vektor . . . . . .224

6.3.2.1 Präparation des BAC-Vektors . . . . . . . . . . . .2256.3.2.2 Plasmidaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2256.3.2.3 Vorbereitung des Vektors zur Ligation . . . . .2256.3.2.4 Isolierung von Megabasen-DNA aus

Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2266.3.2.5 Einbetten der Pflanzenzellkerne in

Agaroseblöcke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2276.3.2.6 DNA-Isolierung in der Agarose . . . . . . . . . . .2276.3.2.7 Partieller DNA-Verdau, grobes Einstellen

des Selektionsfensters . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2286.3.2.8 Partieller DNA-Verdau, Feineinstellung

des Selektionsfensters . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2286.3.2.9 Vorbereitung partiell verdauter DNA

zur Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2286.3.2.10 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2296.3.2.11 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .230

7 Isolierung und Markierung von RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .233(Martin Schröder)

7.1 Arbeiten mit RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2347.1.1 Arbeitsbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2347.1.2 Vorbereiten von Geräten . . . . . . . . . . . . . . . . .2347.1.3 RNase-Inhibitoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2357.1.3.1 Diethylpyrocarbonat (DEPC) . . . . . . . . . . . . .2357.1.3.2 Vanadylribonucleosid-Komplexe . . . . . . . . . .2367.1.3.3 RNasin/RNAguard . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2367.1.4 Ansetzen von Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . .2377.1.5 Probenmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2377.1.5.1 RNAlater® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2377.1.6 Fällung von RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2387.2 Methoden zur Isolierung von RNA . . . . . . . . .2387.2.1 Isolierung von RNA aus Prokaryoten . . . . . .2397.2.1.1 Grampositive Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . .2397.2.1.2 Gramnegative Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . .2407.2.2 Isolierung von RNA aus Saccharomyces

cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2417.2.3 Isolierung von RNA aus Pflanzenzellen . . . .2417.2.4 Isolierung von RNA aus tierischen Zellen . .2437.2.4.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus

Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .243


Inhalt XVII

7.2.4.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben . .2447.2.4.3 Isolierung von Gesamt-RNA aus

glycoprotein- und oligosaccharidreichen Geweben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .245

7.2.4.4 Isolierung cytoplasmatischer und nucleärer RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .246

7.3 Reinigung und Fraktionierung von RNA . . . .2487.3.1 Hydrolyse von DNA mit DNase I . . . . . . . . .2497.3.2 Isolierung von poly(A)+-mRNA durch

Affinitätschromatographie an Oligo(dT)-Cellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250

7.3.3 Isolierung von poly(A)+-mRNA mit Oligo(dT)-Cellulose ohne Säulen-chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251

7.4 Synthese und Markierung von RNA durch in vitro-Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .252

7.4.1 in vitro-Transkription markierter RNA . . . .2557.4.1.1 in vitro-Transkription radioaktiv

markierter RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2557.4.1.2 in vitro-Transkription Digoxigenin

markierter RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2567.4.2 in vitro-Transkription unmarkierter RNA . .2577.5 Qualitätskontrolle und Lagerung der

RNA-Präparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2587.5.1 Qualitätskontrolle einer RNA-Präparation . . .2587.5.2 Lagerung von RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .260

8 RNA-interference . . . . . . . . . . . . . . . . . . .261(Tobias Bopp, Matthias Klein)

8.1 Design von siRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2628.1.1 siRNA-Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2628.2 Methoden zur Herstellung von siRNA . . . . . .2638.2.1 PCR-Expressionskassetten . . . . . . . . . . . . . . .2648.2.2 siRNA-Expressionsvektoren . . . . . . . . . . . . . .2658.2.3 Abbau langer dsRNA durch Enzyme

der RNase III-Familie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2658.2.4 in vitro-Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2668.2.5 Chemische Synthese von siRNA . . . . . . . . . .2678.3 Transfektionsmethoden für siRNA . . . . . . . . .2688.3.1 Lipid/aminbasierte Transfektions-

methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2688.3.2 Elektroporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2688.4 Analyse des knock downs . . . . . . . . . . . . . . . .2688.4.1 Nachweis auf mRNA-Ebene . . . . . . . . . . . . . .2698.4.2 Nachweis auf Proteinebene . . . . . . . . . . . . . . .2698.4.3 Trouble Shooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2698.5 Ratschläge für ein erfolgreiches siRNA-

Experiment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .269

8.6 miRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2718.6.1 Prozessierung von miRNAs . . . . . . . . . . . . . .2718.6.2 Isolierung von miRNAs aus einer Probe . . .2738.6.2.1 Anreicherung von miRNAs . . . . . . . . . . . . . .2748.6.2.2 Detektion der miRNAs, Quantifizierung

und Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .274

9 Gewebepräparation . . . . . . . . . . . . . . .275(Tanja Arndt, Sophie Rothhämel)

9.1 Konservierungsmethoden für Gewebe . . . . .2759.2 Fixieren, Einbetten und Schneiden von

Gewebe in Paraffinwachs . . . . . . . . . . . . . . . .2769.3.1 Kryogeleinbetten von Gewebe . . . . . . . . . . . .2779.3.2 Schneiden der in Kryogel eingebetteten

Gewebe am Kryostaten . . . . . . . . . . . . . . . . . .278

10 Detektion von Protein und Nucleinsäure auf Membran . . . . . . .279

10.1 Western Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .279(Steffen Bade, Niels Röckendorf, Andreas Frey, Arnd Petersen)

10.1.1 Vorbereiten der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . .27910.1.2 Gelelektrophoretische Trennung des

Proteingemisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28110.1.3 Gel-Blot: Elektrophoretischer Transfer

in Wet- und Semi-Dry-Verfahren . . . . . . . . .28210.1.4 Dot-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28910.1.5 Färbung der transferierten Proteine . . . . . . .29010.1.6 Nachweisreaktion: Bindung der Erst-

und Zweitantikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29110.1.7 Visualisierung: Fluoreszenz, Farb- oder

Chemilumineszenz-Reaktion . . . . . . . . . . . . .29810.1.8 Trouble Shooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30410.2 Nucleinsäure Blotting (Southern/Northern) . .309

(Sophie Rothhämel*)10.2.1 Transfertechniken (Blotting) . . . . . . . . . . . . .31010.2.1.1 Dot-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31010.2.1.2 Southern-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31110.2.1.3 Northern-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31210.2.1.4 Kolonietransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31310.2.1.5 Plaque-Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .315


XVIII Inhalt

10.2.2 Hybridisierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31610.2.2.1 Richtlinien zur Berechnung der Schmelz-

temperatur bei der Hybridisierung . . . . . . . .31710.2.2.2 Richtlinien zur Hybridisierung und

Markierung von Nucleinsäuren . . . . . . . . . . .31810.2.2.3 Hybridisierung von Genbanken sowie

Southern-Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31910.2.2.4 Hybridisierung von Genbanken sowie

Southern-Blots mit Oligonucleotidproben . .32210.2.2.5 Hybridisierung von Northern-Blots . . . . . . .32310.2.3 Wiederverwendung der Filter

(Sondenentfernung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32410.2.4 Selektion und Vereinzelung positiver

Klone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32510.2.4.1 Vorgehen bei Koloniehybridisierungen . . . .32510.2.4.2 Vorgehen bei der Plaque-Hybridisierung . . .326

11 Detektion von mRNA und Protein in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .327(Tanja Arndt, Sophie Rothhämel*)

11.1.1 in situ-Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32711.1.2 Immunhistochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32811.1.3 Auswahl der verwendeten Gewebetypen . . .32811.2.1 Auswahl der RNA-Sonden . . . . . . . . . . . . . . .32811.2.2 in vitro-Transkription der RNA-Sonden . . .32811.2.3 Vorbereitung von Paraffinschnitten

für die Hybridisierung mit einer DIG-markierten RNA-Sonde . . . . . . . . . . . . . . . . . .330

11.2.4 Vorbereitung von gefrorenen und mit Kryogel eingebetteten Schnitten für die Hybridisierung mit einer DIG-markierten RNA-Sonde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .332

11.2.5 Hybridisierung von Gewebeschnitten mit DIG-markierten Sonden . . . . . . . . . . . . .333

11.2.6 Detektion der DIG-markierten Sonde mittels Antikörper und Farbreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .334

11.3.1 Alternativprotokoll: Radioaktive Markierung der RNA-Sonde . . . . . . . . . . . . .336

11.3.2 Waschen der Objektträger . . . . . . . . . . . . . . .33711.3.3 Dippen der Objektträger . . . . . . . . . . . . . . . . .33811.3.4 Entwicklung der Objektträger . . . . . . . . . . . .339

11.4.1 Auswahl der verwendeten Antikörper . . . . .34011.4.2 Vorbereitung von Paraffinschnitten für

die Immunhistochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . .34011.4.3 Vorbereitung von in Kryogel eingebetteten

gefrorenen Schnitten für die Immunhisto-chemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .342

11.4.4 Blockieren unspezifischer Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen und Anti-körperinkubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .342

11.4.5 Generierung des ABC-Komplexes und enzymatische Umsetzung des Farbsubstrates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .343

11.5.1 Nuclear-fast-Red-Gegenfärbung für NBT/BCIP gefärbte ISH . . . . . . . . . . . . . . . . .345

11.5.2 Hematoxylin- und Eosin-Gegenfärbung der DAB-gefärbten Schnitte . . . . . . . . . . . . . .345

11.5.3 Entwässern und Eindecken der gefärbten Schnitte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .346

11.5.4 Durchführung von Doppel-ISH . . . . . . . . . .34711.5.5 Durchführung von Doppel-IHCs . . . . . . . . .34711.5.6 Kombination von in situ-Hybridisierung

und Immunhistochemie . . . . . . . . . . . . . . . . .34711.5.7 Automatisierung der in situ-

Hybridisierung und der Immunhisto-chemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .347

11.6 Trouble Shooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34811.6.1 Trouble Shooting der ISH . . . . . . . . . . . . . . . .34811.6.2 Trouble Shooting der IHC . . . . . . . . . . . . . . .349

12 Transfektion von Säugerzellen . . .351(Michael Teifel)

12.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35112.1.1 Chemische Transfektionsmethoden . . . . . . .35112.1.2 Physikalische Transfektionsmethoden . . . . .35312.1.3 Biologische Transfektionsmethoden . . . . . . .35612.1.4 Methoden zur Steigerung von Gen-

expression und Transfektionseffizienz . . . . .36012.1.5 Stabile Expression und Genamplifikation . . .36112.2 Zellkulturmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36212.2.1 Beschichtung von Kulturgefäßen . . . . . . . . . .36212.2.2 Kultivierung von Säugerzellen am Beispiel

der Fibroblastenzelllinie BHK 21 . . . . . . . . . .36212.2.3 Subkultivierung von BHK 21 . . . . . . . . . . . . .36312.2.4 Zellzählung durch den Trypanblau-

Ausschlusstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36312.2.5 Einfrieren und Auftauen von Säugerzellen . . .36412.2.6 Herstellung von Zellextrakten durch

wiederholtes Einfrieren und Auftauen . . . . .364


Inhalt XIX

12.2.7 MTT-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36512.2.8 Bestimmung der Geneticintoleranzdosis . . .36612.3 Transfektionsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . .36612.3.1 Versuchsplanung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36612.3.2 Calciumphosphat-Transfektion . . . . . . . . . . .36712.3.3 DEAE-Dextran-Transfektion . . . . . . . . . . . . .36812.3.4 Transfektion mit aktivierten Dendrimeren . .36912.3.5 Lipofektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37012.3.5.1 Herstellung der Liposomen . . . . . . . . . . . . . .37012.3.5.2 Lipofektion mit DDAB- oder DOTAP-

Liposomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37212.3.5.3 Lipofektion mit kommerziell erhältlichen

Lipofektionsreagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . .37212.3.6 Elektroporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37312.3.7 Transfektion mit komplexen

Transfektionsreagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . .37312.3.8 Transfektion bestimmter Zelltypen

mit speziell optimierten Transfektions-reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .374

12.4 Nachweis der Expression und Bestimmung der Transfektionseffizienz . . . . . . . . . . . . . . . .374

12.4.1 Nachweis von β-Galactosidase mittels X-Gal-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .374

12.4.2 Nachweis von β-Galactosidase in Zellextrakten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .375

12.4.3 Messung von Luciferaseaktivität in Zelllysaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .376

12.4.4 Bestimmung der Transfektionseffizienz . . . .37612.4.5 Selektion auf stabile Expression und

Isolierung resistenter Klone . . . . . . . . . . . . . .37712.5 Trouble Shooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .378

13 Transformationsmethoden für filamentöse Pilze . . . . . . . . . . . . . .385(Hella Tappe*)

13.1 Selektionsmarker für filamentöse Pilze . . . . .38613.1.1 Dominante Selektionsmarker . . . . . . . . . . . . .38613.1.2 Gegenselektionssysteme . . . . . . . . . . . . . . . . .38713.1.3 Essenzielle Gene als Selektionsmarker

(Auswahl) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38913.2 Gewinnung einer Sporenlösung

filamentöser Pilze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .390

13.3 Transformation von Aspergillus oryzae-Protoplasten durch Behandlung mit Polyethylenglykol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .391

13.3.1 Herstellung von Aspergillus niger-, A. foetidus- und A. oryzae-Protoplasten . . . .391

13.3.2 Transformation von Aspergillus oryzae-Protoplasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .393

13.4 Biolistische Transformation von Trichoderma reesei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .394

13.5 Transformation von Aspergillus foetidus durch Agrobacterium tumefaciens . . . . . . . . .397

13.5.1 Herstellung von elektrokompetenten Agrobacterium tumefaciens-Zellen . . . . . . . .397

13.5.2 Transformation von elektrokompetenten Agrobacterium tumefaciens-Zellen . . . . . . . .398

13.5.3 Transformation von Aspergillus foetidus durch Agrobacterium tumefaciens . . . . . . . .399

13.6 Transformation von Neurospora crassa-Sporen durch Elektroporation . . . . . . . . . . . . .400

13.7 Präparation von genomischer DNA aus Aspergillus niger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .403

14 Genexpression in E. coli und Insektenzellen: Produktion und Reinigung rekombinanter Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .407(Achim Aigner)

14.1 Vorüberlegungen zur Auswahl von Wirtszelle und Expressionsvektor . . . . . . . . . .407

14.2 Expression eines eukaryotischen GST-Fusionsproteins in E. coli . . . . . . . . . . . . .410

14.2.1 Konstruktion des Expressionsvektors . . . . . .41114.2.2 Expression des GST-Fusionsproteins . . . . . .41214.2.3 Reinigung des GST-Fusionsproteins . . . . . . .41314.2.4 Spaltung eines GST-Fusionsproteins . . . . . . .41514.3 Baculovirussystem: Expression eines

eukaryotischen Proteins in Insekten-zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .416

14.3.1 Konstruktion des Expressionsvektors . . . . . .41814.3.2 Herstellung der rekombinanten

Bacmid-DNA zur Transfektion von Insektenzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .419

14.3.3 Handhabung, Kultivierung und Infektion von Insektenzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .421

14.3.4 Transfektion von Sf9-Insektenzellen mit rekombinanter DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .422

14.3.5 Bestimmung günstiger Expressions-parameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .423


XX Inhalt

14.3.6 Bestimmung des viralen Titers über Plaque-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .424

14.3.7 Reinigung eines sekretierten Expressions-produkts mit His-tag unter nativen Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .426

14.3.8 Reinigung eines nicht sekretierten Expressionsprodukts mit His-tag unter denaturierenden Bedingungen . . . . . . . . . . . .427

15 Das Pichia pastoris-Expressionssystem . . . . . . . . . . . . . . . . .431(Christoph Reinhart, Christoph Krettler*)

15.1 Die Charakteristika des Pichia pastoris-Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .432

15.1.1 Vergleich mit anderen Expressions-systemen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .432

15.1.2 Pichia pastoris-Expressionsvektoren . . . . . . .43215.1.3 Integration der rekombinanten Vektoren

ins Pichia pastoris-Genom . . . . . . . . . . . . . . .43315.1.4 Pichia pastoris-Wirtsstämme . . . . . . . . . . . . .43515.2 Proteinexpression mit dem Pichia pastoris-

System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43715.2.1 Transformation von Pichia pastoris . . . . . . . .43715.2.1.1 Optimierte Elektroporation von

Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43815.2.1.2 LiCl-Transformation von Pichia

pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43915.2.2 Analyse des Mut-Phänotyps

rekombinanter Pichia pastoris-Klone . . . . . .44115.2.3 Selektion von Pichia pastoris-Klonen

mit mehrfach integrierten Expressions-kassetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .442

15.2.4 Proteinproduktion im 20 ml-Maßstab zur Durchmusterung mehrerer Pichia pastoris-Klone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .443

15.2.5 Proteinproduktion im 1 l-Maßstab . . . . . . .44715.2.6 Pichia pastoris im Fermenter . . . . . . . . . . . . .44715.2.7 Zellaufschluss und Präparation von

Rohmembranen in größerem Maßstab . . . . .45015.2.8 Lagerung von Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . .45215.2.9 Trouble Shooting für den gesamten

praktischen Teil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .452

16 Verminderung der Genexpression über Ribozym-Targeting . . . . . . . . . . .455(Achim Aigner*)

16.1 Vorüberlegungen zur Ableitung von Ribozymen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .456

16.2 Herstellung von Ribozymen gegen den HER-2-Rezeptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .457

16.2.1 Identifizierung geeigneter Zielsequenzen und Ableitung der Ribozymsequenzen . . . . .457

16.2.2 Auswahl des Expressionsvektors und Klonierung der Ribozyme . . . . . . . . . . . . . . . .460

16.2.3 Herstellung stabiler ribozymtransfizierter Zelllinien mit konstitutiver Ribozym-expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .462

16.2.4 Analyse und Vergleich der Ribozym-aktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .463

17 Analyse der Genregulation . . . . . . .467(Korden Walter, Monika Lichtinger*)

17.1 Bestimmung von DNase I hypersensitiven Stellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .469

17.2 in silico-Identifizierung von regulatorischen DNA-Elementen und DNA-Bindungsstellen für Transkriptions-faktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .474

17.3 Präparation von Proteinextrakten aus Säugerzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .475

17.3.1 Präparation von Zellkernextrakten . . . . . . . .47617.3.2 Präparation von cytoplasmatischen

Extrakten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47717.3.3 Kurzprotokoll zur Präparation von

Zellkernextrakten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47717.4 EMSA (Electrophoretic mobility shift

assay) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47817.4.1 Selektion und radioaktive Markierung

der DNA-Fragmente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47917.4.2 EMSA-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48017.4.3 Nachweis der DNA-Bindeproteine durch

native Polyacrylamid-Gelelektrophorese . . .48117.4.4 Bestimmung der Spezifität . . . . . . . . . . . . . . .48117.5 in vitro-DNase I-Footprinting . . . . . . . . . . . . .48217.5.1 DNase I-Footprinting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48317.5.2 DNA-Sequenzierung nach Maxam-Gilbert . .48417.6 Funktionelle Analyse von DNase I

hypersensitiven Stellen und Transkriptions-faktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .486

17.7 Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) . . . . . .487


Inhalt XXI

17.8 Bestimmung der Position von Nucleosomen mittels MNase . . . . . . . . . . . . . .492

17.9 DNA-Methylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .495

18 Peptid-Arrays auf Cellulosemembranen . . . . . . . . . . . . . .501Niels Röckendorf, Steffen Bade, Hans-Heiner Gorris, Andreas Frey

18.1 Synthese der filtergebundenen Peptidbibliothek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .501

18.1.1 Aminoderivatisierung des planaren Trägers und Definition der spots . . . . . . . . . .502

18.1.2 Synthese der Peptidkette . . . . . . . . . . . . . . . . .50318.1.3 N-terminale Modifikation der

fertigen Peptide und Entschützen der Aminosäureseitenketten . . . . . . . . . . . . . . . . .505

18.1.4 Praktische Vorbereitungen und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .506

18.1.5 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51418.1.5.1 Routine-Arbeitsschritte . . . . . . . . . . . . . . . . . .51718.1.5.2 Aminoderivatisierung des Celluloseträgers . .51818.1.5.3 Definition der spots und Verlängerung

der Membrananker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52018.1.5.4 Synthesezyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52118.1.5.5 End-capping und Abspaltung der

Aminosäureseitenketten-Schutzgruppen . . .52318.1.5.6 Lagerung der Peptidbibliotheken . . . . . . . . .52318.2 Screening der Peptidbibliotheken . . . . . . . . .52318.2.1 Durchführung des screenings . . . . . . . . . . . . .52418.3 Regeneration (stripping) der

Peptidbibliothek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52618.3.1 Vorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52718.3.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .528

19 Genexpressionsanalyse mit Microarrays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .531(Susanne Kneitz*)

19.1 Genexpressions-Arrays mit on-chip synthetisierten Oligonucleotiden . . . . . . . . . .534

19.1.1 Präparation von Gesamt-RNA aus Geweben und Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .536

19.1.2 Analyse der Genexpressionsdaten . . . . . . . . .54019.2 Gespottete Microarrays mit synthetischen

Oligonucleotiden (50- bis 70-meren) oder PCR-Produkten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .541

19.2.1 Microarray-Analyse mit synthetischen Oligonucleotiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .542

19.2.1.1 Oligonucleotid-Design . . . . . . . . . . . . . . . . . .54219.2.1.2 Resuspendieren, Drucken und Lagerung

der Oligonucleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54219.2.2 Array-Herstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54319.2.2.1 DNA-Immobilisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . .54419.2.2.2 Prähybridisierung und Waschen der

Microarrays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54419.2.2.3 Überprüfung der spot-Morphologie . . . . . . .54519.2.3 Markierung und Hybridisierung

der Zielmoleküle (targets) für die Expressionsanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .546

19.2.4 Hybridisierung der Microarrays . . . . . . . . . .54919.2.5 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55119.3 Isolation und Anreicherung von micro-

RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55119.3.1 Isolation von Gesamt-RNA aus

Paraffinmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55219.3.2 Auftrennung von Gesamt-RNA und

kurzen RNA-Stücken (< 200 nt) . . . . . . . . . .55319.3.3 Anreicherung von kurzen Sequenzen

(10 bis 40 nt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .554

20 Webbasierte Sequenzanalyse und Datenbankabfragen . . . . . . . . . .557Josef Hermanns, Gerd Moeckel

20.1 Allgemeine Datenbankabfragen . . . . . . . . . . .55820.1.1 Molekularbiologische Datenbanken . . . . . . .55920.1.1.1 DNA-Sequenzdatenbanken . . . . . . . . . . . . . .55920.1.1.2 Proteinsequenz-Datenbanken . . . . . . . . . . . .56120.1.1.3 Charakteristische Sequenzbereiche/

Sequenzmotive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56220.1.1.4 3D-Strukturdatenbanken . . . . . . . . . . . . . . . .56320.1.1.5 Literaturdatenbanken . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56320.2 Textbasierte Suche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56520.2.1 NCBI und Entrez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56520.2.2 EBI und SRS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56620.2.3 Anwendungsbeispiel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56820.3 Sequenzinformationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57020.3.1 Internetportale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57120.3.2 Sequenzanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57220.3.2.1 DNA-Sequenzbausteine . . . . . . . . . . . . . . . . .57220.3.2.2 Sequenzformate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .572


XXII Inhalt

20.3.3 Anwendungsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57320.3.3.1 Datenbankrecherchen mit BLAST . . . . . . . .57320.3.3.2 Domänen-Strukturanalysen . . . . . . . . . . . . . .57520.3.3.3 Restriktionsanalyse als Basis der

Klonierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57620.3.3.4 Auswahl von PCR-Primern . . . . . . . . . . . . . .57620.3.3.5 Vergleich zweier Sequenzen (align, dotplot) . .57720.3.3.6 Vergleich mehrerer Sequenzen

untereinander mit CLUSTALW . . . . . . . . . . .57820.3.3.7 Bestimmung der offenen Leseraster in

einer Sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57920.3.3.8 Analyse repetitiver Sequenzen . . . . . . . . . . . .58020.3.4 Genomanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58020.3.4.1 Orthologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58020.3.4.2 Genomanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .581 Genindex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .581 Genmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .582 Gendatenblatt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .582 Genome-Browser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .583 Proteininteraktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58420.4 Anhang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .585

Anhang 1 Sequenzierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .589(Carolina Río Bártulos, Hella Tappe*)

A1.1 Vorüberlegungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .591A1.2 Vorbereitung der DNA zur

Sequenzierreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .592A1.2.1 Sperminpräzipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .592A1.3 Sequenzierreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .593A1.3.1 Basisprotokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .593A1.3.2 Alternativprotokoll: Sequenzierung in

96 Well-Platten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .595A1.3.3 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit

dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .596

A1.3.4 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit thermostabilen DNA-Polymerasen . . . . . . . .597

A1.3.5 Alternativprotokoll: Zyklussequenzierung (thermal cycle sequencing) . . . . . . . . . . . . . . . .598

A1.3.6 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit 5'-markierten Primern . . . . . . . . . . . . . . . . . . .599

A1.3.7 Hinweise zur Sequenzierung mit Fluoro-phor derivatisierten Didesoxynucleotidtri-phosphaten (dye terminator sequencing) . . .602

A1.3.8 Hinweise zur direkten Sequenzierung von PCR-Produkten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .603

A1.4 Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .604A1.4.1 Herstellung des Sequenziergels . . . . . . . . . . .605A1.4.2 Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .606A1.4.3 Gelbehandlung und Exposition eines

Gels mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .608

A1.4.4 Allgemeine Hinweise zur Gelelektro-phorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .609

A1.4.5 Lesen der Sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .610A1.4.6 Trouble Shooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .610A1.5 Verwendung von automatischen

DNA-Sequenziergeräten . . . . . . . . . . . . . . . . . .611A1.6 Next-Generation-Sequencing (NGS) . . . . . . . .613

Anhang 2 Proteinidentifizierung und Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . .617(Sabine Wolf)

A2.1 Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .617A2.1.1 Massenspektrometrie kompatible

Färbemethoden für Proteingele . . . . . . . . . . .620A2.1.1.1 Kolloidale Coomassie-Färbung . . . . . . . . . . .620A2.1.1.2 Silberfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .620A2.1.1.3 Fluoreszenzfärbung mit Sypro-Ruby . . . . . . .621A2.1.2 Fragmentierungsmethoden der

Massenspektrometrie-Analyse . . . . . . . . . . . .622A2.1.2.1 Hydrolyse mit Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . .622A2.2 Chemische Sequenzierung nach Edman . . . .624A2.2.1 Elektro-Blotting auf PVDF-Membranen . . .625A2.2.2 Alkylierung von Cysteinresten . . . . . . . . . . . .627A2.2.2.1 Alkylierung mit Acrylamid . . . . . . . . . . . . . .627A2.2.3 Entsalzungsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . .628A2.2.3.1 Entsalzung mit ProSorb®-Filtereinheit . . . . .629A2.2.3.2 Ionenpaar-Extraktion mit gleichzeitiger

Fällung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .629A2.3 Fragmentierung von Proteinen . . . . . . . . . . . .630A2.3.1 Chemische Spaltungen . . . . . . . . . . . . . . . . . .631A2.3.1.1 Spaltung mit Bromcyan . . . . . . . . . . . . . . . . . .632A2.3.1.2 Partielle Säurehydrolyse mit

Ameisensäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .634A2.3.2 Enzymatische Hydrolysen mit

Endoproteinasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .634 Mikromethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .635A2.3.2.1 Spaltung in Lösung: Trypsin . . . . . . . . . . . . . .635


Inhalt XXIII

A2.3.2.2 Spaltung in Lösung: Endoproteinase Lys-C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .636

A2.3.2.3 Enzymatische Fragmentierung im Gel . . . . .637A2.3.2.4 Enzymatische Fragmentierung von der

PVDF-Membran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .637A2.4 Isolierung von Peptiden . . . . . . . . . . . . . . . . . .638A2.4.1 Peptidtrennung mittels HPLC . . . . . . . . . . . .639A2.5 Bestimmung der carboxyterminalen

Sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .640A2.5.1 Endgruppenbestimmung mittels

Carboxypeptidasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .641

A2.6 Aminosäure-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .642A2.6.1 Hydrolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .642A2.6.2 Derivatisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .643A2.7 Kombinierte Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . .644A2.7.1 N-terminale Leitersequenzierung:

Kopplung von Massenspektrometrie und Edman-Chemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .645

A2.7.2 C-terminale Leitersequenzierung . . . . . . . . .645A2.8 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .646

Register . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .647

Documents

Gentechnische Methoden - rd.springer.com978-3-8274-2430-3/1.pdf · Lieber Leser, lieber Nutzer, wie funktioniert doch gleich die Methode, die dringend benötigte Ergebnisse liefern