BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 389

Short Communications

Gewinnung von [32P]Adenosintriphosphorsiiure

mit hoher speziflscher Radioaktivitiit

In neuerer Zeit sind verschiedene chemische und biochemische Methoden zur Dar- stellung 3*P-markierter Adenosinpolyphosphate beschrieben worden 1-3. Die chemi- schen Methoden ffihren zwar zu hoher spezifischer Aktivititt, abet die Radioaktivitiit verteilt sich w~hrend der Synthese auf mehrere Phosphoratome. Die enzymatische Synthese sollte mit reinen kristallisierten Enzymen durchgeffihrt werden, um Neben- reaktionen zu vermeiden. Es soll hier kurz fiber ein schon frfiher angedeutetes 4, einfaches, enzymatisches Verfahren berichtet werden, mit dem reine E~-3*P]Adenosin- triphosphors~ure von extrem hoher spezifischer Radioaktivit~it hergestellt werden kann, die entweder als solche oder zur radioaktiven Markierung anderer physiolo- gischer Phosphatester benfitzt werden kann und die bei Untersuchungen fiber den Wirkungsmechanismus der Glutaminsynthetase mit bestem Erfolg eingesetzt wurde 5.

Folgende Enzymreaktionen, die durch k~ufliche kristallisierte Enzyme (C. F. Boehringer und S6hne, Mannheim) katalysiert werden, kommen bei der Darstellung zum Ablauf:

(I) Anorganisches Phosphat wird in Gegenwart von 3-Phosphoglycerinaldehyd, DPN und der 3-Phosphoglycerinaldehyd-Dehydrogenase in das energiereiche Phosphors~ureanhydrid, die 1,3-Diphosphoglycerins~ure, fibergeffihrt.

(2) Dutch die katalytische Funktion der Phosphoglyceratkinase e wird das energiereiche Phosphat in Gegenwart yon Mg++ auf ADP fibertragen. Das Gleich- gewicht dieser 2. Reaktion liegt ganz auf der Seite der ATP-Bildung. Nach BOCI~ER ~ ist die Gleichgewichtskonstante ffir die gekoppelte Reaktion bei pH 7.4:

[3-Phosphoglycerinaldehyd] [DPN] [ADP] [3-Phosphoglycerins~ure] [ATP~ [DPNH] = 1.2. IO -e Mole Phosphat/ml. (A)

Da die Affinit~t des Phosphats zur Dehydrogenase in Reaktion (I) sehr gross ist und andererseits die meisten handelsfiblichen Substrate als Verunreinigung anorganisches Phosphat enthalten, kann im Inkubationsansatz tr~tgerfreies anorganisches 8,p. Phosphat eingesetzt werden (I mC//zg P). Das Hauptproblem einer hohen 3,p_ Markierung besteht also nur in der Reindarstellung der Testsubstrate. Da der Trioseester nicht sehr best~ndig ist, haben wir ihn gew6hnlich aus Fructose-I,6- diphosphat mittels kristallisierter Aldolase im Inkubationsansatz erst gebildet, nachdem der Phosphatdiester zuvor dutch Hochspannungselektrophorese gereinigt worden war.

Abktirzungen: ATP, AdenosintriphosphorsAure; ADP, Adenosindiphosphorsaiire; DPN, DPNH, oxydiertes und reduziertes Diphosphopyridinnucleotid; Tris, Tris(oxymethyl)amino- methan.

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Ein Inkubationsansatz enthielt in der Regel bei einem Gesamtvolumen von 3.5 ml in o.i M Trispuffer vom pH 7.4: 5" lO-5 Mole Mg ++, I - IO -6 Mol DPN, I . io -~ Mol ADP, 3" IO-S Mole Phosphoglycerinaldehyd oder einen (3berschuss an Fructose- 1,6-diphosphat, 3 mC tr~gerfreies E3~p~Phosphat, Ioo/~g Phosphoglycerinaldehyd- I)ehydrogenase und IO/zg Phosphoglyceratkinase. Nach 20 Min langem Stehen bei Zimmertemperatur wird die L6sung zur Eiweissdenaturierung 3 M i n i m siedenden Wasserbad erhitzt und der Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wird mit Wasser auf ca. 20 ml verdtinnt und 20 Min mit I g satiregewaschener Holzkohle (Nuchar C 19o yon der Virginia Pulp and Paper Comp., Tyrone, Pennsylvania) gerfihrt. Dann saugt man die Kohle auf der Nutsche ab und w~scht sie mehrfach zur Entfernung des nicht umgesetzten anorganischen [3~P]Phosphats. [y-~2P]ATP kann dann mit 20 ml einer L6sung aus konz. Ammoniak, Athanol und Wasser im Volumenverh~tnis IO: 25 : 65 durch 20 Min langes Digerieren eluiert werden. Die Kohle wird auf der Nutsche abgetrennt und mit frischem Eluierungsmittel gewaschen. Die vereinigten L6sungen werden im Vakuum eingedampft. Wenn notwendig wurde [3*P]ATP durch Hoch- spannungslektrophorese oder Ionenaustauscherchromatographie von nicht um- gesetztem, nicht radioaktivem ADP bzw. DPN abgetrennt. Legt man besonderen Weft auf eine hohe radioaktive Markierung und arbeitet daher mit reinen Substraten und trAgerfreiem [3*P]Phosphat, so liegen natfirlich wegen der geringen Phosphat- konzentration nach Gleichung (A) die Ausbeuten ffir Es2PIATP niedrig. Immerhin konnte bei einer Ausbeute von 3 ° % (bezogen auf RadioaktivitAt) [y-32P]ATP mit einer spezifischen Aktivit~t yon bis zu 4.8 mC//~Mol erhalten werden.

Nach Umsetzung des gereinigten Ez2PlATP-Pr~tparates mit Mg ++, Hexokinase aus Hefe und Glucose war der ADP-Fleck im anschliessenden Papierchromatogramm frei von l~adioaktivitAt, dagegen das enzymatisch gebildete Glucose-6-Phosphat hoch radioaktiv, ein Zeichen daffir, dass nur der endstitndige Phosphatrest im ATP radioaktiv markiert war.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich ftir die Untersttitzung dieser Arbeit, Herrn F. ORTANDERL ftir geschickte Mitarbeit.

Biochemisehe A bteilung des Institutes fi~r Organische Chemie GERHARD PFLEIDERER der Universit~t, Frankfurt a. M. (Deutschland)

1 j. M. LOWENSTEIN, Biochemical Preparations, Vol. 7, John Wiley and Sons Inc., New York- London, I96O, S. 5.

2 R. T. TANAKA, Y. ]~¢[ANO UND N. SHIMAZONO, Biochim. Biophys. Acta, 27 (1958) 642 und 36 (1959) 262.

8 L. C. 1V[OKRASCH, J. CARAVACA UND S. GRISOLIA, Biochim, Biophys. Acta, 37 (196o) 442. 4 TH. WIELAND UND G. PFLEIDERER, Ange~o. Chemie, 69 (1957) 199.

TH. WIELAND, G. PFLEIDERER UND B. SANDMANN, Biochem. Z., 330 (19.58) 198. 6 TH. B0CI-I~R, Biochim. Biopkys. Acta, I (1947) 292.

Eingegangen den 29. Oktober, 1960

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