Grundlagen der Blutgerinnung Teil 2 Gerinnungstests in der Routine

Grundlagen der Blutgerinnung Teil 2

Gerinnungstests in der Routine

Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 2 2

Hämostaseuntersuchungen

Primäre Hämostase Blutungszeit Thrombozytenaggregationstest Thrombozytenfunktion

Sekundäre Hämostase Bestimmung von Gerinnungs- und

Fibrinolysefaktoren und –inhibitoren Globaltests: Quick, aPTT, Thrombinzeit Bestimmung von Einzelfaktoren und Inhibitoren


Blutentnahme

Kurze Stauung weitlumige Kanüle (0,6 – 1 mm) Erste Entnahme nicht für Gerinnung Zügige Entnahme ohne Hämolyse Geeignetes Antikoagulanz (meist Citrat 1:10) Sofort mischen (ohne Schaumbildung) Proben bei RT lagern, bald ins Labor bringen


Probenvorbereitung

Innerhalb von 2 Stunden nach Entnahme zentrifugieren (bei Routineuntersuchungen) Thrombozytenarmes Plasma:

10 min., 1500 – 2000 g = ca. 3000 U/min Thrombozytenfreies Plasma:

20 min., mind. 2500 g = 4000 U/min Thrombozytenreiches Plasma

5 min., 100 g = 800 U/min


Probenvorbereitung

Aufbewahrung bei RT bis zur Untersuchung (max. 4 Stunden für Globaltests) Höhere Temperaturen, auch Sonneneinstrahlung

führen zu Aktivitätsabfall Lagerung im Kühlschrank führt zu Kälteaktivierung der

Faktoren VII, XI und XII Probe für spätere Untersuchungen schnellstens

einfrieren Einfrieren bei -70°C oder schockgefrieren (-196°C) Kurzfristige Lagerung bei -20°C (2 Wochen) Längerfristige Lagerung bei -70°C (1 Jahr) Praktisch unbegrenzte Haltbarkeit bei -196°C


Messprinzipien

Koagulometrische MessverfahrenMessung der Gerinnungszeit bis zur Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin Mechanisches Prinzip mit Hilfe von Kugeln Optisches Prinzip durch Messung der Zunahme an

Trübung oder Lichtstreuung Chromogene Messverfahren

Messung der (Enzym-)Aktivität von Faktoren oder Inhibitoren mit Hilfe chromogener Substrate

Immunologische Messverfahren Bestimmung der Konzentration mit Hilfe von

spezifischen Antikörpern (Enzymimmunoassays)

Primäre Hämostase

Blutungszeit

Thrombozytenaggregationstest

Thrombozytenfunktion


Blutungszeit

Einziger in-vivo-Test zur Erfassung der Thrombozytenfunktion

Nur bedingt standardisiert Erhebliche Fehlerquellen Zeit- und personalaufwändig Geeignet in definierten klinischen Situationen

Bekannte Thrombopathie (z.B. Morbus Glanzmann) Bei Einnahme von ASS u.ä. Medikamenten


Blutungszeit

Methode nach Duke Stichverletzung am Ohrläppchen, abtupfen

des austretenden Blutes, messen der Zeit bis zum Blutungsstillstand.

Methode nach Ivy Nach Anlegen einer Stauung von 40 mmHg

am Oberarm wird mit einem speziellen Einmalgerät ein Schnitt am Unterarm gesetzt. Das austretende Blut wird abgetupft und die Zeit bis zum Blutungsstillstand gemessen.



Zugabe von aggregationsinduzierenden Substanzen zu plättchenreichem Plasma Kollagen Adrenalin ADP Ristocetin

Erhöhung der Lichtdurchlässigkeit bei Aggregatbildung (Messung in speziellem Photometer, Aggregometer)

Aufzeichnen der Lichtdurchlässigkeit (Aggregation) als Kurve



Normale Aggregation

alle Kurven grenzwertig

Vermindert bis grenzwertige Aggregation


Platelet Function Analyzer (PFA-100)

Messung der Plättchenfunktion bei hohen Scherkräften und ersetzt weitgehend die Blutungszeit Citratblut strömt durch die

kapilläre Öffnung einer mit Kollagen und ADP (oder Kollagen und Epinephrin) beschichteten Membran.

Die Zeit von Testbeginn bis zum Verschluss der Öffnung wird gemessen = Verschlusszeit (CT = closure time)

beschichtete Membran

Kapillaröffnung

Kapillare

Probenreservoir

Probe


Platelet Function Analyzer (PFA-100) Einflussgrößen

Thrombozytenzahl Thrombozytenfunktion

Blockierung von GP Ib und GP IIb/IIIa Angeborene Defekte Medikamentöse Blockierung der Rezeptoren

Von-Willebrand-Faktor Medikamente

hemmend: ASS, Rheopro u.ä. fördernd: DDAVP, Substitution des von-Willebrand-

Faktors

Sekundäre Hämostase

QuickPTT

ThrombinzeitFibrinogen

EinzelfaktorenAntithrombin III

D-Dimere


Gerinnungskaskade

Verletzung Verletzung Verletzung

Fremdoberfläche

XI XIa

IX IXa + VIIIa + PL + Ca++

VIII

XII XIIa

PK, HMWK

Thrombozyten-PL

X

Xa + Va + PL + Ca++

V

I Fibrin s

II IIa

XIIIa

Fibrin i

XIII

Gewebsthromboplastin

Gewebs-PL, TF

Ca++ + PL + VIIa VII

Intrinsisches Sytem

Extrinsisches Sytem

Gemeinsame Endstrecke


Quick-Test = Thromboplastinzeit (TPZ) Globaltest für das

extrinsische System und die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung. Erfasst werden: Vitamin-K-abhängige

Faktoren II (Prothrombin), VII und X

Faktor V und Fibrinogen (Faktor I)

Inhibitoren (z.B. Heparin in hoher Konzentration)

X

Xa + Va + PL + Ca++

V

I Fibrin s

II IIa

Ca++ + PL + VIIa VII

Gewebsthromboplastin

Gewebs-PL, TF


Quick-Test

Prinzip: Durch Zugabe von Gewebethromboplastin und Calcium wird die Gerinnung über das extrinsische System ausgelöst. Die Zeit von der Zugabe des Reagenzes bis zur Gerinnselbildung wird gemessen (TPZ). Mit Hilfe einer Bezugskurve werden die gemessenen Gerinnungszeiten in Prozent der Norm umgerechnet oder als Prothrombin Ratio oder als INR (International normalisierte Ratio) angegeben.


Quick-Test

Resultat in Sekunden =TPZAbhängig von Art des Thromboplastins (aus Hirn, Lunge, Plazenta,

von Kaninchen, Rind, Mensch, rekombinant) Methode (mechanisch, optisch)

Sehr unterschiedliche Messergebnisse mit verschiedenen Reagenzien

Normbereich nur reagenzienabhängig möglich, keine Vergleichbarkeit unterschiedlicher Thromboplastine


Quick-Test

Umrechnung in Prozent Kalibrierung mit Normal- oder Kalibrierplasma Umrechnung der Sekundenwerte anhand

einer Bezugskurve Bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse Normbereich: 70 – 120 % (allgemein gültig)


Quick-Test

Prothrombin-Ratio (PR) und INR

PR =

Um eine internationale Vergleichbarkeit der Werte in der stabilen Phase einer oralen Antikoagulatientherapie zu gewährleisten, wurde 1983 von der WHO die INR (international normalisierte Ratio) eingeführt.

INR = PRISI

ISI = Internationaler Sensitivitätsindex = Steigung der PR gemessen am WHO-Standard (reagenzabhängig)

Thromboplastinzeit Probe

Thromboplastinzeit Normalplasma


Quick-Test

Gründe für die Anwendung der INR Standardisierung der Intensität der Antikoagulation für

eine bestimmte Indikation unabhängig von Thromboplastin und Gerät (INR 2,0 – 5,0)

Bessere Vergleichbarkeit verschiedener Labors Bessere Überwachung und Therapieführung des

Patienten

Die INR ist nur in der stabilen Phase der oralen Antikoagulation anwendbar!


Quick-Test

Halbwertszeit

Faktorin

Stundenwährend der

stabilen Phase

VII 2 - 6 15 - 30 %

Protein C 2 - 7 ca. 50 %

IX ca. 24 15 - 30 %

X ca. 48 15 - 30 %

Protein S ca. 40 60 - 65 %

II ca. 60 30 - 40 %

Verlaufskontrolle der oralen Antikoagulation

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tage

%

F II

F VII

Quick in %


Quick-Test

Verminderung des Quick Leberparenchymerkrankungen Cumarintherapie, Vitamin-K-Mangel Faktorenmangel der erfassten Faktoren Hohe Heparindosierung Bei Neugeborenen normal (bis 30 %) Fibrinogenspaltprodukte Inhibitoren gegen erfasste Faktoren


Quick-Test

Quick 50 – 70 % Weitgehend normale Gerinnung Bei Lebererkrankungen Hinweis auf eingeschränkte

Syntheseleistung Quick 30 – 50 %

Hämorrhagische Diathese ohne Neigung zu Spontanblutungen

Kleine operative Eingriffe durchführbar Quick 15 – 30 %

Therapeutischer Bereich bei oraler Antikoagulation Quick unter 10 %

Ausgeprägte hämorrhagische Diathese mit Neigung zu Spontanblutung (unter 4 % lebensgefährlich)


aPTT = aktivierte partielle Thromboplastinzeit

Globaltest für das intrinsische System. Erfasst werden: Faktoren XII, XI,

IX, VIII (endogen), PK, HMWK

Inhibitoren (z.B. Heparin)

XI XIa

IX IXa + VIIIa + PL + Ca++

VIII

Fremdoberfläche

XII XIIa

PK, HMWK

Thrombozyten-PL

X

Xa + Va + PL + Ca++

V

I Fibrin s

II IIa


aPTT

Prinzip:Durch die Inkubation von Plasma mit Phospholipiden (partielle Thromboplastine = PF 3) und negativ geladenen Oberflächen (Aktivatoren) werden die Faktoren des intrinsischen Systems aktiviert. Durch Zugabe von Ca++ wird der Gerinnungsvorgang gestartet und die Zeit bis zur Gerinnselbildung gemessen.


aPTT

Aktivatoren Partikelförmige Aktivatoren: Kaolin, Celit, Silikate Lösliche Aktivatoren: Ellagsäure

Bei Vollautomaten zunehmend verwendet!

Die Art des Aktivators beeinflusst die Sensitivität(Präkallikrein wird in Gegenwart von Kaolin besonders gut erfasst, aber kaum in Gegenwart von Ellagsäure)

ReferenzbereichMittlerer Bereich: 26 – 40 s (abhängig von Aktivator und Phospholipid)


aPTT

Verlängerung der PTT Mangel an Faktor VIII (Hämophilie A), Faktor IX

(Hämophilie B), Faktor XI oder XII Von Willebrand-Faktor-Mangel (vWF dient dem Faktor VIII

als Schutzprotein vor Proteolyse) Lupusantikoagulans (= Antiphospholipid-Antikörper) Fibinogenspaltprodukte Heparin

Faktor < 1 % aPTT 1 aPTT 2 aPTT 3

VIII 79 106 119

IX 84 110 126

XI 99 118 126

XII 184 277 294

Faktor-XII-Mangel: ausgeprägte Verlängerung, aber keine Blutungsneigung!


aPTT

Verkürzung der aPTT Manchmal bei akuten Thrombosen Fehler bei der Blutentnahme

Gerinnungsaktivierung durch zu langsame Entnahme

Ungenügendes Mischen => Gerinnungsaktivierung und kleine Gerinnsel

Deutliche Gerinnung durch sichtbare Gerinnsel


aPTT - Heparin

Unfraktioniertes Heparin (HMWH) Antithrombin III verbindet sich mit Heparin zu einem

Komplex, der Thrombin und Faktor Xa mit hoher Geschwindigkeit hemmt.

Heparin löst sich aus dem entstandenen Komplex und steht für neue Aufgaben zur Verfügung.

HMWHAntithrombin III

IIa

Xa


aPTT - Heparin

Fraktioniertes Heparin LMWH Fraktioniertes Heparin (= niedermolekulares Heparin)

wird aus unfraktioniertem Heparin isoliert. Es hat nur noch geringe Anti-Thrombin-Aktivität, da die

Bindungsstelle für Thrombin fehlt.

Antithrombin III

IIa

Xa

LMWHÄhnliche Wirkung haben auch Heparinoide, z.B. Danaparoid-Natrium = Orgaran®


aPTT - Heparin

Unfraktioniertes Heparin (Liquemin®) verlängert die aPTT v.a. durch Hemmung von Thrombin (keine Feedback-Aktivierung von Faktor VIII)=> aPTT zur Kontrolle der Heparintherapie mit HMWH geeignet

Fraktioniertes Heparin (Fragmin®, Clexane®, Fraxiparin®) verlängert die aPTT kaum, da nur minimale Hemmung von Thrombin stattfindet (Feedback-Aktivierung von Faktor VIII).=> aPTT zur Kontrolle der Heparintherapie mit LMWH nicht geeignet


aPTT - Heparin

Bei s.c. Heparingabe (HMWH) erreicht die aPTT schnell den Höchstwert und fällt nach 1 Stunde langsam wieder ab (Halbwertszeit 60 min.)

LMWH hat eine längere Halbwertszeit (100 – 180 min.), Orgaran® sogar 24 Stunden

Plättchenfaktor 4 (aus zerfallenden Thrombozyten) und histidinreiches Glykoprotein binden an Heparin

Die Heparinelimination erfolgt z.T. über die Niere und durch Bindung an Endothel

=> aPTT ist abhängig vom Zeitpunkt der Heparingabe, der Blutentnahme, der Lagerung und dem Zustand des Patienten


Thrombinzeit

Standardtest für die Überwachung der Heparintherapie mit unfraktioniertem Heparin Höhere Sensitivität als aPTT Geringere Präzision bei höheren

Heparinkonzentrationen Überwachung fibrinolytischer Therapien und

Hyperfibrinolyse Suchtest zur Erfassung von Fibrinbildungsstörungen

(z.B. Dysfibrinogenämie)


Thrombinzeit

Prinzip:

Durch Zugabe einer definierten Menge Thrombin bildet sich aus Fibrinogen Fibrin. Die Zeit bis zur Gerinnung wird gemessen.

I Fibrin s

IIa


Thrombinzeit

Die Thrombinzeit ist abhängig von: Hemmung des zugegebenen Thrombin durch

Heparin (HMWH) Hirudin u.ä. (direkte Thrombinhemmung) Fibrinogenspaltprodukte (hemmen die

Fibrinpolymerisation) Fibrinogenkonzentration (erst bei sehr

geringer Konzentration) Dysfibrinogenämie


Thrombinzeit

Normalbereich: 16 – 20 s (bei Thrombinkonz. 1,5 IE/ml)(9 - 13 s bei Thrombinkonz. von 3 IE/ml)

Verlängerung auf 24 – 30 s: Ausreichende Hemmwirkung bei prophylaktischer

Heparingabe Schwere Gerinnungsstörung bei DIC oder Hyperfibrinolyse

Verlängerung auf 40 – 60 s: Relativ sicherer Schutzbereich vor venösen

Thromboembolien (Heparintherapie) Bedrohliches Zeichen bei DIC oder Hyperfibrinolyse Dysfibrinogenämie

Nicht mehr messbar: Heparinkonzentration über 1 IE/ml Extreme Hyperfibrinolyse


Fibrinogen

Bestimmung des gerinnbaren Fibrinogens nach Clauss Prinzip: Durch Zugabe von Thrombin im Überschuss

bildet sich aus Fibrinogen Fibrin. Die Zeit bis zur Gerinnung wird gemessen.

Derived Fibrinogen (abgeleitetes Fibrinogen) Während einer optischen Quick-Bestimmung kann die

Fibrinmenge anhand der Steigung der Extinktion bestimmt werden.

Immunologische Fibrinogenbestimmung Konzentrationsbestimmung mit Hilfe von spezifischen

Antikörpern


Fibrinogen

Normalbereich gerinnbares Fibrinogen: 1,5 – 4,0 g/l (150 – 400 mg/dl)

Fibrinogen > 4,0 g/l (> 400 mg/dl): Als Akutphaseprotein erhöht bei Entzündungen,

postoperativ, u.ä. Häufig im Alter

(dauerhaft erhöhtes Fibrinogen gilt als Risikofaktor für koronare Herzkrankheiten)

bei Diabetes mellitus bei Nikotinabusus


Fibrinogen

Fibrinogen < 1,5 g/l (< 150 mg/dl): Durch den Verbrauch von Gerinnungsfaktoren

und Fibrinogen bei DIC Die bei einer Fibrinolyse(therapie)

entstehenden Fibrinogenspaltprodukte hemmen die Polymerisation => falsch niedrige Werte

Dysfibrinogenämie Ausgeprägte Störung der Leberfunktion


Einzelfaktoren

Wann ist die Bestimmung erforderlich? Unerklärbare Verlängerungen der

Gerinnungszeit im Globaltest Verlaufskontrolle bei bekanntem

Faktorenmangel Abklärung einer Hyperkoagulabilität


Einzelfaktoren

Prinzip:Verdünntes Patientenplasma wird mit Mangelplasma im Überschuss versetzt. (Mangelplasma enthält alle Gerinnungsfaktoren außer dem Faktor, der bestimmt werden soll.) Dadurch ist die Gerinnungszeit der Probe nur noch abhängig vom zu bestimmenden Faktor im Patientenplasma. (Der Faktor mit der geringsten Konzentration limitiert den Test!)Mit einem modifizierten Globaltest (Quick bei Faktor X, VII, V, II; aPTT bei Faktor XII, XI, IX, VIII) wird die Gerinnungszeit bestimmt und anhand einer Bezugskurve in Prozent Gerinnungsaktivität umgerechnet.


Einzelfaktoren

Normalbereiche: Faktor II 70 – 120 % Faktor V 60 – 120 % Faktor VII 70 – 120 % Faktor X 60 – 120 % Faktor VIII 50 – 150 % (Akutphaseprotein!) Faktor IX 70 – 120 % Faktor XI 70 – 120 % Faktor XII 70 – 120 %


Antithrombin III

Antithrombin ist der wichtigste Inhibitor, da es Thrombin, Faktor Xa und die meisten anderen Gerinnungsenzyme inaktiviert.

AT III ist ein langsamer Inhibitor, die Reaktionsgeschwindigkeit wird jedoch durch Heparin stark gesteigert.

Bei sehr geringen AT III-Konzentrationen (< 30 %) ist die Heparinwirkung eingeschränkt.

Bereits subnormale AT III-Konzentrationen begünstigen eine Thromboseneigung.


Antithrombin III Prinzip:

Chromogene Bestimmung der Thrombin- bzw. Faktor Xa-AktivitätDurch Zugabe von Heparin im Überschuss sowie Thrombin oder Faktor Xa zum Plasma wird AT III vollständig im Komplex gebunden. Das restliche Enzym (Thrombin oder Faktor Xa) spaltet von einem chromogenen Substrat einen Farbstoff ab.Die gemessene Extinktion ist umgekehrt proportional zur AT III-Konzentration.

HeparinAT III

Xa

Xa

Xa

Xa

Xa

Ext.Photometer

Heparin

1.

2.

3.


Antithrombin III

Normalbereich: 80 – 120 % AT III 40 – 70 %

Angeborener Mangel mit erhöhtem Risiko für venöse Thromboembolien

Eingeschränkte Leberfunktion Verbrauch von Gerinnungsfaktoren und Inhibitoren bei

DIC AT III < 40 %

Fortgeschrittene Leberzirrhose DIC


D-Dimere

D-Dimere entstehen beim Abbau von Fibrin durch Plasmin

Gleichzeitig wird Fibrinogen durch Plasmin gespalten. Die entstehenden Spaltprodukte hemmen die Fibrinpolymerisation

D-Dimer

D-Dimer

D – Fragmente – Y


D-Dimere

Wann sollte eine D-Dimer-Bestimmung durchgeführt werden? Verdacht auf tiefe venöse Thrombose

D-Dimere im Normalbereich schließen mit 96- 98 %iger Wahrscheinlichkeit einen Gefäßverschluss aus!

Voraussetzung: normale fibrinolytische Aktivität! Krankheitsbilder mit gesteigerter

Gerinnungsaktivität (DIC) Krankheitsbilder mit gesteigerter Fibrinolyse


D-Dimere Prinzip:

die D-Dimer-Bestimmung ist eine immunologische Bestimmung.Mit Hilfe monoklonaler Antikörper auf Latexpartikeln werden D-Dimere in einer Antigen-Antikörper-Reaktion gebunden. (Latexagglutination)Dadurch kommt es zu einer Änderung der Lichtdurchlässigkeit bzw. Lichtstreuung, die gemessen wird.

Auch ELISA-Tests sind möglich, dabei kommt es zu einer Farbzunahme.


D-Dimere

Normalbereich: < 0,5 µg/ml (500 µg/l) Erhöhte Konzentration:

Thromboembolische Erkrankungen Intra- und postoperativ Hämolytisch-urämisches Syndrom Sepsis DIC (Verbrauchskoagulopathie) Transplantatabstoßung Tumoren, Leukämien Stress (nur leichte Erhöhung)

Grundlagen der Blutgerinnung Teil 3

Diagnostik und Therapie

21. Januar 2005

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Grundlagen der Blutgerinnung Teil 2 Gerinnungstests in der Routine