Grundlagen der Durchflusszytometrie

Gliederung

-Was ist ein Durchflusszytometer?-Teile eines Durchflusszytometers

- Flüssigkeitssystem - Optik- Elektronik- Computer

-Instrumentsettings-Beispielsmessung

Diese Partikel haben etwas gemeinsam

Algae

ChromosomesBlood cells

Protozoa

Einige ihrer Eigenschaften können mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden.

.

Was ist ein Durchflusszytometer?

Grundlegend ist ein Durchflusszytometer ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop.

(Erste Prototypen sahen auch so aus)

Das automatisierte Mikroskop

Waste

Detector& Counter

Sample

Diese einfache Darstellung zeigt das Grundprinzip eines Durchflusszytometers: Zellen werden in einer Durchflussküvette an einer Mikroskopoptik vorbei geführt.

Das Durchflusszytometer

Welche Parameter können gemessen werden?

die relative Zellgrösse (Forward Scatter - FSC)

die Granularität oder innere Komplexität

(Side Scatter - SSC)

die Fluoreszenzintensität (FL1, FL2, up to FL X)

Teile eines Durchflusszytometers

• Flüssigkeitssystem– Liefert einen konstanten Hüllflüssigkeitsstrom– Transportiert die Probe in die Küvette– Fokussiert die Zellen im LASER-Strahl

• Optik– Fokussiert das Anregungslicht– Sammelt das emittierte Licht

• Elektronik– Wandelt Lichtsignale in elektrische Signale um– Sendet die Signale zum Auswerterechner

• Computer– Stellt Daten graphisch dar– Kontrolliert die „Instrument Settings“

Charakteristiken von FSC und SSC

Coherent lightsource (488 nm)

Forward scatter Cell size (488 nm)

Side scatter Granularity (488 nm)

Forward scatter (FSC)

gemessen entlang der Achse des einfallenden Lichtes

proportional zur Zellgrösse / Zelloberfläche (nur bei runden Zellen)

Side scatter (SSC)

gemessen im 90° Winkel zum einfallenden Licht

proportional zur Zellkomplexität und Granularität

Beispiel: Blut

Forward scatter

Sid

e sc

atte

rGranulozyten

Debris Lymphozyten

Monozyten

Fluoreszenz

=488 nm

Excitation light

=530 nm

Emission light

Die Fluorochrome absorbieren die Energie des Anregungslichtes.

Die absorbierte Energie wird abgegeben als:

Schwingungsenergie und Wärme

Emission eines Photons mit grösserer Wellenlänge ( = geringere Energie)

Fluoreszenzintensität

FITC

FIT

C

101 104103102

Relative fluorescence intensity

Nu

mb

er o

f E

ven

ts

FITC

FIT

CFITC

FITC

FITC

FITC

FIT

C

FITC

Hydrodynamische Fokussierung

SheathSample

Optische Filter

460 500 540460 500 540 460 500 540

SP 500SP 500LP 500LP 500 BP500/80BP500/80

Longpass Shortpass Bandpass

Octagon Detection System

SSC

PE PE-Cy7

FITC

PerCP-Cy5.5

695/40

655 LP

Elektronik

Wandelt optische Signale (Photonen) in elektronische Signale (Spannungspulse) um

Digitalisiert die Signale

Analysiert die -Höhe [Height (H)], -Weite [Width (W)]

und die -Fläche [Area (A)] des Spannungspulses

Übermittelt die Daten an den Auswerterechner

Entstehung eines Spannungspulses

Voltage

LaserLaser

LaserLaser

LaserLaser

t

t

t

Voltage

Voltage

1.

2.

3.

Auswertung eines Spannungspulses

Time (µs)

Volt

age

Pulse Area (A)

Puls

e H

eig

ht

(H)

Pulse Width (W)

400

Schwellenwert (Threshold)

Der Schwellenwert gibt die minimale Signalintensität an, die an dem jeweiligen Kanal erreicht werden muss. Alle Signale mit geringerer Intensität werden nicht dargestellt.

Zusammenfassung

Während die Zellen den LASER-Strahl passieren, werden Spannungspulse am Photomultiplier generiert

Das Signal wird verstärkt Die Elektronik digitalisiert das Signal mit einer Frequenz

von 10MHz Nur Signale, die den gewünschten Schwellenwert

überschreiten, werden analysiert und aufgezeichnet Die Daten werden letztlich zum Analyserechner

übermittelt, der mit dem Zytometer verbunden ist

Instrumentsettings

Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von

der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem

jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab

Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der

Regel durch die Anwendung bedingt

Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von

der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem

jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab

Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der

Regel durch die Anwendung bedingt

Datenspeicherung

Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank

gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden

Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der

Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv

waren.

Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der

Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet.

Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte

Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen

wurde.

Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank

gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden

Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der

Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv

waren.

Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der

Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet.

Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte

Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen

wurde.

Darstellung der Daten 1

1) Histogramm - ein Parameter, der die Fluoreszensintensität als Häufigkeitsverteilung dargestellt

Event 1

Event 2

Event 3

FSC SSC FL1 FL2

30 60 638 840

100 160 245 85

300 650 160 720

Listmode file

400 800 10000

840

85

245 638FL1-H

FL2-H

0

200

400

600

800

1000

200 600

Darstellung der Daten 2

2) Dotplot (Punktwolkendarstellung) - zwei Parameter werden auf der x- und y-Achse dargestellt

Enough theory of flow!

Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag:

Enough theory of flow!

Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag:

Aufgabe: Bestimmung des prozentualen Anteils an CD4+, CD3+ und CD8+ Zellen im Vollblut

Material•Milzzellen aus der Maus

Methode• Drei-Farben-Immunfluoreszenz

Preparation• Färben von frisch isolierten Milzzellen

Färbung• Ungefärbte Kontrolle• Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die passenden Instrumentsettings zu bestimmen

Material•Milzzellen aus der Maus

Methode• Drei-Farben-Immunfluoreszenz

Preparation• Färben von frisch isolierten Milzzellen

Färbung• Ungefärbte Kontrolle• Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die passenden Instrumentsettings zu bestimmen

Einstellung der FSC- und SSC-Spannung

• FSC und SSC sind optimal

eingestellt, wenn die zu

untersuchende Population (z.B.

Lymphozyten) von allen anderen

Populationen zu unterscheiden ist

• Der Schwellenwert des FSC

wird so eingestellt, dass Debris

überwiegend von der

Datenauswertung

ausgeschlossen wird

• FSC und SSC sind optimal

eingestellt, wenn die zu

untersuchende Population (z.B.

Lymphozyten) von allen anderen

Populationen zu unterscheiden ist

• Der Schwellenwert des FSC

wird so eingestellt, dass Debris

überwiegend von der

Datenauswertung

ausgeschlossen wird

Parameter (I)

• FSC und SSC

Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert)

Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll,

Fixierungsmethode)

Werden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende

Population für weitere Untersuchungen zu definieren

• FSC und SSC

Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert)

Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll,

Fixierungsmethode)

Werden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende

Population für weitere Untersuchungen zu definieren

Parameter (II)

• Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX)

Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper,

Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.)

Meistens dient die Fluoreszenz als Marker für die

statistische Analyse

• Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX)

Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper,

Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.)

Meistens dient die Fluoreszenz als Marker für die

statistische Analyse

„Gating“:Bestimmen der gewünschten Population

„Gating“

• Selektive Analyse definierter Zellpopulationen

• Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt

werden

• Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen

• Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen

• Selektive Analyse definierter Zellpopulationen

• Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt

werden

• Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen

• Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen

Einstellung der Fluoreszenzsettings

A) Einstellen der PMT-SpannungProbe: ungefärbte Kontrolle

• Die gemessene Fluoreszenz wird als unspezifische Autofluoreszenz betrachtet. •Die Lymphozytenpopulation wurde vorher im FSC und SSC „gegated“.

B) “Quadrantengating”

Traditionell werden Quadranten benutzt um die 4 möglichen Populationen in einem 2-Farben-Experiment zu definieren. Bei Vielfarbenexperimenten ist diese Art des „Gatings“ nicht die optimale Lösung.

„Quadrantengating“

FL1-H

FL2-H

FITC+

PE

FITC

PE

negative

Q2

Q4Q3

Q1

Fluoreszenzüberstrahlung

650nm 700nm500nm 550nm 600nm

Rel

ativ

e In

ten

sitä

t

Wellenlänge (nm)

FL1530/30

FL2585/42

FITC-Kompensation

Detektor - … % Signal

650nm 700nm500nm

550nm 600nm

Rel

ativ

e In

ten

sitä

t

Wellenlänge (nm)

FL1

530/30

FL2585/42

Lowering the FITC-population is achieved by...

... Subtracting a percentage of FITC-intensity from the affected PE-channel ...

650nm 700nm500nm 550nm 600nm

FL1530/30

FL2

585/42R

ela

tive I

nte

nsit

y

… because 25% of the FITC-signal are actually detected in the PE channel ...

Wavelength (nm)

FITC-Kompensation

Zusammenfassung

• FSC und SSC werden so eingestellt, dass die Population gut von anderen Populationen zu unterscheiden ist

• Die gewünschte Population wird „gegatet“• Die PMT Spannungen der Fluoreszenzkanäle werden mit

der ungefärbten Kontrolle eingestellt• Einzelfärbungen werden eingemessen um

Fluoreszezüberstrahlungen zu kompensieren