Hilic - polare Verbindungen trennen

�Analytik�

HILIC – polare Verbindungen trennen

Heiko Hayen

Die flüssigchromatographische Technik der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) trennt

besonders gut stark polare Analyten, die sich mit Hochleistungsflüssigchromatographie an konventio-

nellen Umkehrphasen nicht trennen lassen. Dies ist nur ein Grund für das wachsende Interesse

an dieser Technik.

� Basis der Analyse nicht-flüchtiger Verbindungen in Gemischen ist oft die Trennung mit Hochleistungsflüs-sigchromatographie (HPLC) mit massenspektrometrischer Detekti-on. Die Wahl des Trennsystems geht von den Eigenschaften der zu ana-lysierenden Verbindungen aus, ins-besondere von deren Polarität (Ab-bildung 1).

Am weitesten verbreitet und Mit-tel der Wahl bei hydrophoben Ana-lyten ist die Umkehrphasen-Chro-matographie (reversed phase, RP) an modifiziertem Kieselgel (in der Re-gel Octadecyl- oder Octylreste). Die-se Phasen retardieren hydrophile und ionische Verbindungen nur un-zureichend.

Der Zusatz von Ionenpaarreagen-zien (z. B. Tetramethylammonium-salze für starke und schwache Säu-ren oder Alkysulfonate für starke und schwache Basen) in der mobilen Phase erhöht die Retention der gela-denen Verbindungen (Ionenpaar-chromatographie). Mischungen von Säuren, Basen und neutralen Ana-lyten lassen sich hiermit jedoch oft nur schwer trennen, und durch die Ionenpaarreagenzien altert das Säu-lenmaterial schnell. Zudem behin-dert die hohe Ionenfracht die mas-senspektrometrische Detektion.

Mit zusätzlichen polaren funktio-nellen Gruppen, z. B. Amiden, auf

der unpolaren Umkehrphase (polar modifizierte C18- oder C8-Phasen), erhält man HPLC-Säulen, die mit rein wässrigen Eluenten betrieben werden können. Diese erreichen auch für polarere Verbindungen eine ausreichende Retention. Geladene Spezies werden jedoch nur wenig re-tardiert oder eluieren in der Durch-flusszeit. Der hohe Wassergehalt ist ein Nachteil bei der Kopplung der LC-Trennung mit der Elektro-spray(ESI)-MS.

Geladene Substanzen lassen sich mit Ionenaustauschchromato-graphie (IC) an Anionen- oder Kat io nen aus tau scher säu len tren-nen, die geladene funktionelle Gruppen auf der Oberfläche tragen und Ionen reversibel austauschen. Die Methode eignet sich jedoch kaum zur Trennung von Gemi-schen, die sowohl Ionen als auch neutrale Analyten enthalten. Der zur Elution erforderliche hohe Salzgehalt bereitet zudem Schwie-rigkeiten bei der Kopplung mit der Massenspektrometrie.

Hydrophile Verbindungen sind über die Normalphasenchromato-graphie (NP) zugänglich. Diese ar-beitet mit einer polaren stationären Phase (in der Regel SiO2, Al2O3 oder MgO) und einer unpolaren mobilen Phase. Im Vergleich zur RP-Chromatographie, die wesent-

lich auf einer Verteilung der Ana-lyten beruht, ist die Retention in der NP-Chromatographie auf Ad-sorption zurückzuführen. Aller-dings hat NP-Chromatographie ei-nige Nachteile: Polare hydrophile

Hydrophob

Hydrophil Geladen

NP

RP

IC

HILIC

Abb. 1. Einsatzbereiche flüssigchromatographischer Trenntechniken in

Abhängigkeit von der Polarität der zu analysierenden Verbindungen.

� QUERGELESEN

�� Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC)

verwendet eine wässrig-organische mobile Phase

und eine Trennsäule, die hydrophile Wechselwir-

kungen mit den Analyten eingeht.

�� Der Trennmechanismus beruht auf der Verteilung

zwischen einer stark wasserhaltigen stationären

Phase und einer weniger polaren mobilen Phase

mit hohem Acetonitrilanteil.

�� Zu den typischen Anwendungsgebieten der HILIC

zählen Proteomik, Metabolomik, Speziations- und

Lebensmittelanalytik.

Nachrichten aus der Chemie | 58 | April 2010 | www.gdch.de/nachrichten

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Substanzen lösen sich schlecht in den NP-Lösungsmitteln, in der Re-gel muss wasserfrei gearbeitet wer-den, teilweise sind die Äquilibrie-rungszeiten der Säule bei Gradien-tenelution lang und die Ionisations-effizienz und damit die Sensitivität der ESI-MS-Detektion gering.

Um hochpolare Verbindungen zu trennen, ist die Hydrophile Inter-aktionschromatographie (Hydrophi-lic interaction liquid chromatogra-phy, HILIC) eine attraktive Alternati-ve zu konventionellen flüssigchro-matographischen Methoden. Für HILIC verwendet man eine wässrig-organische mobile Phase mit verbes-serter Löslichkeit der Analyten und eine Trennsäule, die hydrophile

Wechselwirkungen mit den Ana-lyten eingehen kann. Der hohe Ace-tonitril-Anteil bei HILIC-Trennungen hat den Vorteil, dass die vergleichs-weise niedrige Oberflächenspan-nung der mobilen Phase die Spray-bildung im ESI-Prozess begünstigt, so dass eine gute Ionenausbeute er-zielbar ist.1) Folglich ist für polare Substanzen die ESI-MS-Detektion nach HILIC-Trennung deutlich emp-findlicher als nach RP-Chromato-graphie. Dies ist auch ein Grund für die steigende Beliebtheit der Tech-nik, die sich nicht nur durch den Anstieg der HILIC-Applikationen zeigt, sondern auch durch die Zahl der neuen HILIC-Phasen auf dem Markt.

Trennprinzip

� Die hydrophile Interaktionschro-matographie gibt es schon seit lan-gem, die Bezeichnung HILIC ist je-doch erst seit wenigen Jahren ge-bräuchlich.2) Typische Analyten für die HILIC sind sehr hydrophile Ver-bindungen, beispielsweise polare Metaboliten, Kohlenhydrate oder Peptide.

HILIC lässt sich als Erweiterung der Normalphasenchromatographie mit wässrigen Eluenten betrachten. Vereinfacht beruht der Trennmecha-nismus auf der Verteilung zwischen einer stark wasserhaltigen stationä-ren Phase und einer weniger polaren mobilen Phase (üblicherweise mit einem hohen Anteil an Acetonitril) (Abbildung 2). Daraus resultiert für hydrophile Substanzen eine stärkere Retention als für hydrophobe Stoffe, also eine umgekehrte Elutionsrei-henfolge wie bei der RP-Chromato-graphie.

Zusätzlich zum reinen HILIC-Me-chanismus treten je nach den chemi-schen Eigenschaften der stationären Phase weitere Wechselwirkungen auf und beeinflussen die Selektivität.

Die am längsten verwendete HILIC-Phase ist reines Kieselgel. Die-se birgt aber die Gefahr, dass polare Analyte irreversibel auf der stationä-ren Phase adsorbieren – insbesonde-re bei biologischen Proben. Im HILIC-Modus schirmt die wasserrei-che Schicht zwar die Oberfläche der stationären Phase ab; sie kann aber die Aktivierung von Silanolgruppen nicht vollständig verhindern. Somit entstehen Kationenaustauscherzen-tren für basische Analyte. Um diese Nachteile zu überwinden und besse-re Selektivitäten zu erreichen, wur-den gebundene Trennphasen auf Kieselgelbasis eingeführt.

Die Eigenschaften dieser Phasen und deren Anwendungen haben Hemström und Irgum in einem Arti-kel umfassend zusammengestellt.3)

Stationäre und mobile Phase

� Die in der HILIC verwendeten sta-tionären Phasen lassen sich in drei Gruppen einteilen: neutrale Phasen,

Hydrophile Verteilung

Elektrostat. Interaktion

Poröses Kieselgel

Wass

erreic

heSchic

htOrganische mobile Phase

Abb. 3. HILIC/MS-Trennung der Aminosäuren Phenyl alanin, Tyrosin und Glutaminsäure an einer zwitterionischen

HILIC-Phase (ZIC-HILIC, Sequant) mit einem binären Gradienten aus Acetonitril und wässrigem Ammoniumacetat-

Puffer (pH 5,8) und anschließender ESI-MS-Detektion.

Phenylalanin Tyrosin

0

50

100

Glutaminsäure

Rel

. Int

ensi

tät [

%]

< <

Zeit [min]0 5 10 15 20

OH

O

NH2

HO

O

OH

O

NH2HO

OH

O

NH2

Abb. 2. Schema des HILIC-Trennmechanismus. Die elektrostatische Wechselwirkung hängt

stark von der Oberflächenmodifizierung des Kieselgels ab.

�Blickpunkt� Analytik 462


geladene Phasen und zwitterionische Phasen. Neutrale stationäre Phasen (z. B. Diol- oder Cya-nopropylphasen) zeigen nur schwache oder gar keine ionischen Wechselwirkungen und oftmals eine geringere Selektivität. Stationäre Phasen mit geladenen Funktionalitäten tragen über elektrostatische Wechselwirkungen (Abbil-dung 2) zur Retention bei und sorgen so für eine modifizierte Selektivität. Zwitterionische statio-näre Phasen enthalten sowohl kationische als auch anionische funktionelle Gruppen. So be-wirkt beispielsweise eine Betain-Struktur (posi-tiv geladene quarternäre Ammoniumgruppe, negativ geladener Sulfonsäurerest) eine in Sum-me nach außen ungeladene, aber hochpolare Oberfläche. Im Gegensatz zu einer Phase mit ausschließlich positiv oder negativ geladener Oberfläche wie in der Ionenaustauschchromato-graphie, treten nur schwach-ionische Wechsel-wirkungen auf, so dass geringere Pufferkonzen-trationen erforderlich sind (< 100 mM).

Die mobilen Phasen sind in der Regel binäre Gemische aus Wasser und Puffer (< 40%) und organischen Lösungsmitteln. Mindestens 3 % Wasser sind erforderlich, um die stationäre Pha-se ausreichend zu benetzen. Analyten können durch den Anstieg der Polarität, also durch Er-höhung des Wassergehalts der mobilen Phase oder auch durch höhere Pufferkonzentration eluiert werden.4,5) Im Gegensatz zur RP-Chro-matographie hat bei HILIC Wasser die höchste Elutionskraft. Die elutrope Reihe einiger Lö-sungsmittel unter HILIC-Bedingungen ist: Tetra-hydrofuran < Aceton < Acetonitril < Isopro-panol < Ethanol < Methanol < Wasser.

In der Regel ist die Trenneffizienz mit Aceto-nitril und einem wässrigen Puffer (meist basie-rend auf Essigsäure/Ammoniumacetat oder Ameisensäure/Ammoniumformiat) am besten.6) Die Gradientenbedingungen im HILIC-Modus sind umgekehrt zu denen des RP-Modus: Gra-dienten beginnen mit einem hohen organischen Anteil, typischerweise 95 %, und fahren dann mit einem stetig wachsenden Anteil der wäss-rigen Komponente fort. Daher wird die Technik auch als „umgekehrte Umkehrphasenchromato-graphie“ bezeichnet.

Anwendungen

� Ein Beispiel für die Umkehr der Elutionsrei-henfolge der HILIC im Vergleich zur RP-Chro-matographie ist die Trennung der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Glutaminsäure (Ab-bildung 3). Die Substanzen wurden an einer zwitter io ni schen HILIC-Phase (ZIC-HILIC, Se-quant) mit einem binären Gradienten aus Ace-tonitril und wässrigem Ammoniumacetat-Puffer


kungen auf schonenden chromato-graphischen Bedingungen beruht – etwa im Gegensatz zum Ionenaus-tausch mit starken elektrostatischen Wechselwirkungen, die bis zur Dis-soziation von Metallspezies führen.

Beispiele für die Speziationsana-lytik mit HILIC sind Phytosideropho-re, die der Aufnahme von Eisen in Getreidepflanzen (Weizen, Mais, Reis) dienen und über HILIC-MS identifiziert werden konnten.11,12) Auch Gadolinium-Kontrastmittel aus der Kernresonanz-Tomographie (MRT) lassen sich mit der Kopplung von HILIC und ESI-Massenspektro-metrie analysieren.13) Dabei ist die Detektion auch mit der Element-massenspektrometrie (ICP-MS) möglich.14)

Des Weiteren gibt es Anwen-dungsmöglichkeiten der HILIC über-all dort, wo polare Analyten eine Rolle spielen, so in der Lebensmit-telanalytik, beispielsweise Acryl -amid, wasserlösliche Vitamine oder Pflanzenschutzmittelrückstände.

Ausblick

� Neue stationäre Phasen mit neu-en Selektivitäten erweitern heute das Gebiet der Trennung polarer und io-nischer Analyten. Dieser Trend ist bei der HILIC am deutlichsten: Jeder größere Säulenanbieter erweitert sein Repertoire an HILIC-Materialien: von Kieselgel (klassisch bis ver-netzt) bis hin zu polaren oder zwit-terionischen Phasen. Dies gibt dem Anwender Flexibilität bei der Me-thodenentwicklung. Auf dem Gebiet der Flüssigchromatographie ist die HILIC zur Zeit einer der dynamischs-ten Bereiche. Sie ist eine attraktive Alternative für Trennungen von po-laren bis ionischen Substanzen und erobert vor allem immer mehr sol-che Anwendungsgebiete, die Mas-senspektrometrie als Detektions-methode erfordern.

Heiko Hayen ist promovierter Lebensmittel-

chemiker und wissenschaftlicher Angestellter

am Leibniz-Institut für Analytische Wissen-

schaften – ISAS in Dortmund. Er beschäftigt

sich mit der LC-MS-Methodenentwicklung zur

Analyse von Metaboliten und Lipiden.

Literatur 1) H. P. Nguyen, K. A. Schug: „The advan-

tages of ESI-MS detection in conjunction with HILIC mode separations: Fundamen-tals and applications“, J. Sep. Sci. 2008, 31, 1465–1480.

2) A. J. Alpert: „Hydrophilic-interaction chro-matography for the separation of pep-tides, nucleic acids and other polar com-pounds“, J. Chromatogr. 1990, 499, 177–196.

3) P. Hemström, K. Irgum: „Hydrophilic in-teraction chromatography“, J. Sep. Sci. 2006, 29, 1784–1821.

4) Z. Hao, B. Xiao, N. Weng: „Impact of co-lumn temperature and mobile phase components on selectivity of hydrophilic interaction chromatography“, J. Sep. Sci. 2008, 31, 1449–1464.

5) B. Dejaegher, D. Mangelings, Y. V. Heyden: „Method development for HILIC assays“, J. Sep. Sci. 2008, 31, 1438–1448.

6) „A Practical Guide to HILIC“, A Tutorial and Application Book, SeQuant AB, Umeå, Schweden, 2006

7) T. Yoshida: „Peptide separation by hydro-philic-interaction chromatography: a re-view“, J. Biochem. Biophys. Methods 2004, 60, 265–280.

8) P. J. Boersema, S. Mohammed, A. J. R. Heck: „Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) in proteomics“, Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391, 151–159.

9) Y. Hsieh: „Potential of HILIC-MS in quanti-tative bioanalysis of drugs and drug me-tabolites“ J. Sep. Sci. 2008, 31, 1481–1491.

10) S. Cubbon, C. Antonio, J. Wilson, J. Tho-mas-Oates: „Metabolomic applications in HILIC-LC-MS“, Mass Spec. Rev. 2009, DOI 10.1002/mas.

11) Y. Xuan, H. Hayen, E. Scheuermann, N. von Wirén, G. Weber: „Separation and identification of phytosiderophores and their metal complexes in plants by zwit-terionic hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to electros-pray-ionization mass spectrometry”, J. Chromatogr. A 2006, 1136, 73–81.

12) G. Weber, N. von Wirén, H. Hayen: „Hy-drophilic interaction chromatography of small metal species in plants using sul-fobetaine and phosphorylcholine type zwitterionic stationary phases”, J. Sep. Sci. 2008, 31, 1615–1622.

13) J. Künnemeyer, L. Terborg, S. Nowak, A. Scheffer, L. Telgmann, F. Tokmak, A. Gün-sel, G. Wiesmüller, S. Reichelt, U. Karst: „Speciation analysis of gadolinium-based MRI contrast agents in blood plasma by hydrophilic interaction chromatogra-phy/electrospray mass spectrometry (HILIC/ESI-MS)“, Anal. Chem. 2008, 80, 8163–8170.

14) J. Künnemeyer, L. Terborg, B. Meermann, C. Brauckmann, I. Möller, A. Scheffer, U. Karst: „Speciation analysis of gadolinium chelates in hospital effluents and waste-water treatment plant sewage by a novel HILIC/ICP-MS method“, Environ. Sci. Tech-nol. 2009, 43, 2884–2890.

(pH 5,8) getrennt und anschließend mit ESI-MS detektiert. Die aromati-schen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin unterscheiden sich nur durch die Hydroxylierung am Phe-nylring. Tyrosin ist daher polarer als Phe nyl ala nin und zeigt im HILIC-Modus folglich stärkere Retention. Die saure Glutaminsäure trägt eine negative Gesamtladung und wird noch stärker retardiert.

Neben der Trennung von Amino-säuren dient HILIC zur Trennung von komplexen Peptidgemischen, wie sie in der Proteomik nach trypti-schem Verdau von Proteinen anfal-len.7,8) Darüber hinaus ist die HILIC-Technik in der Analytik von Phar-mazeutika und deren oft sehr pola-ren Metaboliten9) sowie in der Meta-bolomik10) verbreitet.

Insbesondere in der Speziations-analytik hat die HILIC in jüngster Zeit wichtige Beiträge geliefert. Hier gelten oft besondere Anforderungen an das Trennsystem. So kommt es et-wa bei der massenspektrometri-schen Untersuchung von Metall-komplexen darauf an, die – vielfach labilen – Komplexe während der Trennung nicht zu verändern, also Speziestransformationen zu verhin-dern. Die HILIC-Trennung bietet hier den Vorteil, dass sie durch die relativ schwachen Verteilungswechselwir-

�Blickpunkt� Analytik 464



Kurz notiert

Einheitlicher Standard für Labore

� Seit Anfang des Jahres gibt es die Europäische Gesellschaft für Nach-haltige Labortechnologien (Egna-ton), ein ein Netzwerk von Labora-torien, Laborplanern, Forschungs-instituten, Hochschulen, Indus-trieunternehmen und Herstellern. Ziel der Gesellschaft ist ein einheitli-ches Zertifizierungssystem, um so Laboratorien effizienter zu gestal-ten. Jessica von Ahn, Frankfurt www.egnaton.com

Terahertz-Spektroskopie für die industrielle Anwendung

� Ein Terahertz-System für die Qua-litätssicherung in der Kunststoffver-arbeitung haben Thomas Hochrein und Karsten Kretschmer vom Süd-deutschen Kunststoff-Zentrum (SKZ) in Würzburg sowie Norman Krumbholz vom Instutut für Hoch-frequenzetechnik der TU Braun-schweig entwickelt. Das System lässt sich auf andere Anwendungen über-tragen, etwa in der Lebensmittelher-stellung oder in der Pharmaindustrie. www.skz.de; [email protected]

Spektroelektrochemie in Dresden

� Das Leibniz-Institut für Festkör-per- und Werkstoffforschung (IFW) in Dresden hat Ende 2009 sein Zen-trum für Spektroelektrochemie ein-geweiht. Die Forscher analysieren hier Materialien für die Elektroche-mie wie organische Strukturen in Bauelementen, leitfähige Polymere, Lithiumspeicher- und Kohlenstoff-nanostrukturen. Das Zentrum ver-fügt unter anderem über In-situ-Ra-man- und Infrarotspektroskopie, Massenspektrometrie, Elektronen-spinresonanzspektroskopie und Leit-fähigkeitsmessungen sowie über prä-parative Methoden, beispielsweise zur Fullerensynthese. Das IFW wünscht sich internationale Koope-rationspartner aus Forschung und Industrie. Kathrin Dörr, Frankfurt www.ifw-dresden.de

Merck kauft Millipore

� Der Darmstädter Chemie- und Pharmakonzern Merck hat angekün-digt, das US-Unternehmen Millipore für 5,3 Mrd. Euro inklusive Netto-verschuldung zu übernehmen. Milli-pore bietet Produkte und Dienstleis-tungen für die biowissenschaftliche Forschung und biopharmazeutische Produktion, darunter Laborausrüs-tung, Reagenzien, Filtersysteme und Testgeräte. Mit etwa 5900 Mitarbei-tern in circa 30 Ländern erwirtschaf-tete das Unternehmen im letzten Jahr einen Umsatz von 1,7 Mrd. US-Dollar. Millipore hatte in den letzten Jahren den Life-Science-Bereich durch Akquisitionen und Koope-rationen erweitert, unter anderem durch die Übernahme des eng-lischen Serviceanbieters für die bio-pharmazeutische Industrie Bioana-lab.

Der Unternehmensbereich Che-mie von Merck stellt bisher ebenfalls Produkte und Dienstleistungen für die biopharmazeutische Forschung bereit, etwa Chemikalien oder sta-tionäre und mobile Phasen für die Chromatographie. Durch die Über-nahme von Millipore baut Merck das Life-Science-Geschäft nun so aus, dass der Unternehmensbereich Che-mie 35 % der Konzernumsätze er-zielt, derzeit sind es 25 %. Im Jahr 2009 setzte Merck 7,8 Mrd. Euro um.

Den Unternehmenssitz von Mil-lipore in Billerica, Massachusetts, USA, will Merck erhalten und zu seinem Chemiehauptsitz in den USA machen. Das Top-Management von Millipore will Merck mitüber-nehmen. Insgesamt soll der Zusam-menschluss Kosten in Höhe von 100 Mio. US-Dollar jährlich senken.

Vor dem Abschluss der Transakti-on im zweiten Halbjahr dieses Jahres müssen noch die US-Kartellbehör-den sowie die Millipore-Aktionäre zustimmen. Den Aktionären bietet Merck 107 US-Dollar pro Aktie und hat damit wohl Thermo Fisher Scientific überboten.

Analytik �Blickpunkt� 465

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