1298 R. Schwyzer und G . Karlaganis 1973

Liebigs Ann. Chem. 1973, 1298-1309

Hormon-Rezeptor-Beziehungen: Synthese und Eigenschaften von [Phenylalaninz, (4,5-dehydro-4,5-ditritio)-norvalin4]- adrenocorticotropin-( 1-24)-tetrakosipeptid

Robert Schwyzer *) **) und Georg Kurlagunis ***)

Institut fur Molekularbiologie und Biophysik der Eidgenossischen Technischen Hochschule, CH-8049 Zurich

Eingegangen am 29. Dezember 1972

Wir beschreiben die Synthese von [Phenylalanin2,(4,5-dehydro-4,5-ditritio)-norvalin4]-adreno- corticotropin-(l-24)-tetrakosipeptid ([Phez,Nva(t2)4]-ACTH1-~4, 1 a), einem radioaktiven (7.42 Ci/mmol), spezifisch mit Tritium markierten ACTH-Analogen. Es wurde aus geschutz- tem [Phez, Agl41-ACTHI-24 (3; Agl = L-Allylglycin; Boc an a- und &-Amino-, But an N- und y-Carboxyl-Funktionen) durch katalytische Tritiierung der Doppelbindung und Abspaltung der Schutzgruppen mit H F hergestellt (Schemata 1 und 2). Das entsprechende unmarkierte, gesattigte Polypeptid, [Phez, Nva41-ACTH1-24 (1 b) wird ebenfalls beschrieben. Dagegen gelang es uns nicht, das ungesattigte freie Peptid, [Phez, Agl41-ACTHI-24 (Ic) zu erhalten, da unter den sauren Bedingungen der Schutzgruppen-Abspaltung (oder gar der Aminosauren- analyse) der Agl-Rest zerstort wird. Beide gesattigte Verbindungen ( l a und 1 b) sind in iso- lierten Lipocyten und Nebennierenrinden-Zellen von Ratten volle Hormon-Agonisten, sind aber etwa lOmal weniger wirksam als das ACTHI- 24 rnit der naturlichen Aminosaurensequenz.

Hormone-Receptor Relationships: Synthesis and Properties of [Phenylalaninez, (4,5-dehydro-4,5-ditritio)norvaline~~adrenocorticotropine(l-24)tetrakosipeptide

We describe the synthesis of a radioactive (7.42 Ci/mmol), specifically tritium-labelled ACTH analogue : [phenylalaninex, (4,5-dehydro-4,5-ditritio)norvaline~]adrenocorticotropine( 1 -24)- tetrakosipeptide ([Phez, Nva(t~)4]-ACTH,-24, 1 a). I t was prepared from protected [Phez, Agl41-ACTHI-24 (3; Agl = L-allylglycine; rert.-butoxycarbonyl on 01 and E amino, tert.-butyl on a and y carboxyl groups) by catalytic tritiation of the double bond and subsequent removal of the protecting groups with H F (Schemes 1 and 2). The corresponding unlabelled compound, [Phez, Nva41-ACTHI-24 (I b) is also described ; however, we were not able to obtain unsaturated [Phez, Agl41-ACTHI-24 (1 c) because the allylglycine residue was destroyed in the acid media required for deprotection (and amino acid analysis). Both l a and I b are full hormonal agonists in isolated rat lipocytes and adrenal cortex cells, but are 10-fold less potent than ACTHI-24 with the natural sequence.

Urn unsere Studien iiber Wechselwirkungen zwischen Hormonen und ihren poten- tiellen, zellularen Rezeptormolekelnl) auszuweiten, haben wir - nach dem ,,Photo-

*) Korrespondenz bitte an diesen Autor richten. **) Herrn Prof. Dr. Theodor Wieland in Verehrung und Freundschaft zum 60. Geburtstag

* * *) G. Karlaganis, Teil der Dissertation Eidgenossische Technische Hochschule Zurich 1973. 1) R. Schwyzer, Proc. 12th European Peptide Symposium, September 1972, Reinhardsbrunn,

D D R - North Holland Publ., Amsterdam, S. 424, 1973 und dort zitierte, fruhere Arbeiten.

gewidmet.

1973 Spezifisch Tritium-markiertes ACTH-Analoges 1299

affinitatsmarker" Diazoacetylcholin2) und dem fluoreszenzmarkierten ACTH- Derivat N&-Dansyllysin21-adrenocorticotropin-( 1 -24)-tetrakosipeptid3) - nun auch ein spezifisch mit Tritium markiertes ACTH-Analoges hergestellt. Diese neue Ver- bindung, das [Phenylalanin2,(4,5 - dehydro - 4,5 - ditritio)-norvalin4] - adrenocortico- tropin-(l-24)-tetrakosipeptid ([PheZ,Nva(t2)4]-ACTH1-24; 1 a) besitzt, anstelle von Tyrosin2 und Methionin4 der naturlichen Sequenz, Phenylalaninz und Norvalin4; seine Radioaktivitat betragt 7.42 Ci/mmol.

Das tritiierte l a und die normale IH-Verbindung 1 b sind bezuglich ihrer Stimulie- rung der Lipolyse in isolierten Fettzellen, als auch der Steroidogenese in isolierten Nebennierenrinden-Zellen von Ratten volle Agonisten (vermogen also einen maxima- len Effekt zu erzielen)l), mussen aber zur Erzielung der halbmaximalen Wirkung in ca. lOmal hoheren Dosen angewandt werden als ACTH-( 1 -24)-tetrakosipeptid mit der naturlichen Sequenz (Synacthen@4)), z. B. 7.5.10-9 M (Lipolyse) und ca. 2 .10-13~ (Steroidogenese) oder ca. 1 .10-11 M (cyclo-3',5'-AMP-Produktion in isolierten Nebennierenrinden-Zellen). Mit 1 a lassen sich die Bindungseigenschaften zellularer Rezeptoren bequem untersuchen. So wurde z. B. eine Verdoppelung der Anzahl spezifisch bindender Stellen (,,Mobilisierung der Rezeptorreserve") in Fettzellen unter dem EinfluR von 10-6 M Actinomycin D oder der entsprechenden Menge des peptid- freien, antibiotisch unwirksamen Phenoxazon-Anteils, Actinocin, gefunden.

Die radioaktive Verbindung 1 a wurde aus dem geschutzten Zwischenprodukt [Phe2,Agl4]-ACTH1-24 (3; Agl = L-Allylglycin; Boc an a- und E-Amino-, But an LX- und y-Carboxylgruppen) durch katalytische ,,Hydrierung" der Allyl-Doppelbindung mit Tritium-Gas (Apparatur in Abb. 1) und nachfolgende Abspaltung der Schutz- gruppen mit H F gewonnen: 92.2 % der gesamten Radioaktivitat sind im entstandenen Norvalin lokalisiert; das Histidin enthalt 5 % und die andern Aminosauren jede weniger als 1 %. Die natiirliche ACTH-(l-24)-Sequenz haben wir aus folgenden Griinden zu 3 und

1 a abgewandelt : 1) Es ist bekannt, daR sowohl Phe2-ACTH1-23-amid (Geiger und Mitarbeiters)),

als auch Nva4, Val25-ACTH1-25-amid (Guttmann und Mitarbeiters)) biologisch aktiv sind.

2) Durch katalytische Tritiierung durfte Tritium hauptsachlich in die Doppelbindung des im N-terminalen Bereich sich befindenden Allylglycin-Restes eintreten, wahrend der Austausch von Wasserstoffatomen an andern Orten relativ beschrankt sein sollte (siehe jedoch den beobachteten Austausch von 5 % beim Histidins). Dieses Prinzip hatten schon Pande und Mitarbeiter 7) durch Einbau und Tritiierung von 4-Dehydro-

2) J. Frank und R . Schwyzer, Experientia (Basel) 26, 1207 (1970); P . G. Waser, A . Hofmann und W. Hopff, ebenda 26, 1342 (1970).

3) R . Schwyzer und P . W. Schiller, Helv. Chim. Acta 54, 897 (1971); Fogarty Int. Center Proc. 4, 105 (1969) (National Institutes of Health, Bethesda); P . W . Schiller, Proc. Nat. Acad. Sci., 69, 975 (1972).

4) R . Schwyrer und H. Kappeler, Helv. Chim. Acta 46, 1550 (1963). 5 ) R . Geiger, K . Sturrn, G. Vogel und W . Siedel, Z . Naturforsch. 19b, 858 (1964). 6 ) S. Guttmann, J. Pless und R. A . Boissonnas, Acta Chim. (Budapest) 44, 141 (1965). 7) C. S . Pande, J . Rudnick, L. Ornstein, I . L. Schwartz und R . Walter, Mol. Pharmacol. 5,

227 (1969).

1300 R. Schwvzer und G . Karlaaanis I973

norleucin in einem Gastrin-Tetrapeptid-Analogen verwendet : es ist deshalb besonders geeignet, weil man erst am SchluR einer langen Synthese mit radioaktiven Verbindun- gen arbeiten muR.

3) Durch Jodierung kann gewohnliches oder radioaktives Jod voraussichtlich relativ spezifisch in eine C-terminale Lage am Tyr23 eingefuhrt werden (Tyr2 fehlt; His6 kann allerdings storen). Im ersten Falle liel3en sich die Tyr23-Jodatome durch weitere Tritiumatome ersetzen, wie das z. B. bei der Synthese von Tyr(t2)23-ACTH1-24 geschehen ist (Bei diesem Verfahren muI3ten allerdings eine ganze Reihe von an- spruchsvollen Synthese- und Reinigungsschritten mit stark radioaktiven Zwischen-

S c h e m a 1. Aufbau d e r Sequenz 1-10 ( A n a l y s i e r t e Verbindungen mit u n t e r s t r i c h e n e r A m i n o s a u r e n s e q u e n z )

Boc P h e O H + Hl- S e r - OMe, C1'

9) DCCl + IIOBt 1

l3 I".' Boc Phe-Ser *OMe

Boc S e r - OH + Hit- Phe-Ser * OMe, C1-

11 l2 I I"""' + Hont

Boc - Ser-Phe-Ser * OMe

I H - A g l - O H ( L )

17

/ '1, '. Boc * S e r P h e - S e r - NHNH, + HZ-Agl .OMe, C1- I 1

Boc S e r P h e - S e r - A g l - OMe I

I

7

, 1

i [Boc - Ser-Phe-Ser-Agl -OH]

I 4

8b

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Boc . Ser-Phe-Ser-Agl *NHNH,

OBu' I 7: Boc Ser-Phe-Ser-Agl-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly 0-

5 I in

Abkurzungen s i e h e E x p e r i m e n t e l l e r T e i l

1973 Spezifisch Tritium-markiertes ACTH-Analoges 1301

L 0 N

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(5

85 Liebigs Ann. Chem. 1973, Heft 8

1302 R . Schwyzer und G. Karlaganis 1973

produkten durchgefuhrt werdens)). Im zweiten Falle erhielte man eine doppelt mar- kierte Verbindung mit vevschiedenen radioaktiven Atomen in den N- und C-terminalen Abschnitten, die besonders zur Kontrolle einer enzymatischen Hydrolyse des ACTH1-24-Analogen wahrend der Wirkung geeignet sein durfte. Wir beschaftigen uns z. Z . mit diesen Moglichkeiten.

Die vorliegende Synthese verlief entsprechend den Schemata 1 und 2 sowie in Analogie zu dem von unserem Arbeitskreis fruher fur ACTHI-24 ausgearbeiteten Verfahrend). Zur Kondensation wurde entweder die Methode von Konig und Geigers) mit Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol oder die Azidmethode nach Honzl und Rudinger 10) verwendet. Alle Verbindungen konnten in hochgereinigter, meist analysenreiner Form erhalten werden. Dazu muljten das geschiitzte [Phe2,Ag14]- ACTH-(1 - 10)-dekapeptid (5) uber Aluminiumoxid filtriert und das geschutzte [Phez,Agl4]-ACTH( 1 -24)-tetrakosipeptid (3) durch Gegenstromverteilung gereinigt werden. Nach der Tritiierung, oder Hydrierung und nach der letzten Schutzgruppen- abspaltung mit HF fielen die gesattigten Tetrakosipeptide 2a (b) und l a (b) in ana- lysenreiner Form an. Die Unversehrtheit der Allylgruppe lieR sich leicht im 1H-NMR- Spektrum anhand des Multipletts bei 6 = 5-6 ppm nachweisen. Als letzte analytische Kontrolle dienten die enzymatische Spaltung von 1 a sowie 1 b mit Trypsin und Chymo- trypsin verbunden mit der Prufung der Abbau-Peptide auf chromatographische Reinheit und ,,Identitat" mit denen von ACTHI-24 (SynacthenB).

Wir danken dem Schweizerischen Nationalfunds fur die Unterstiitzung dieser Arbeit.

Experimenteller Teil Abkurzungen: Aminosauren sind nach den IUPAC-Regeln11) abgekurzt ; wenn nicht extra

vermerkt, handelt es sich um L-Aminosauren. Weiterhin bedeuten: ACTH = adrenocortico- tropes Hormon, Agl = Allylglycin, Boc = tert.-Butyloxycarbonyl, But = tert.-Butyl, DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid, DMF = Dimethylformamid, DMSO = Dimethylsul- foxid, HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol. - Die Aminosaure-Derivate wurden, wenn nicht anders vermerkt, nach allgemeinen, bekannten Vorschriftenlz) hergestellt. - Die Schmelz- punkte wurden auf einem Apparat nach Tuttuli (Fa. Buchi) gemessen und nicht korrigiert. - Die Elementaranalysen wurden im Mikrolaboratorium der Fa. Ciba-Geigy, unter der Leitung von Herrn Dr, W. Padowetz, die Aminosaureanalysen im Laboratorium von Prof. Dr. H. Zuber durch Fraulein H. Schneider nach Stein und Moore auf Apparaten der Fa. Beckman, Modelle 120B und 121, ausgefuhrt. - Diinnschichtchromatographische Reinheitskontrollen: Als Trager wurden verwendet: S = Kieselgel (Alufolien rnit Kieselgel F 254, Fa. Merck); A = Aluminiumoxid (DS-0 der Fa. Camag, mit Zusatz von 12% Gips; keine Fertigplatten); C = Cellulose (Fertigplatten 0.1 mm, MN 300, der Fa. Macherey-Nagel); CA: Cellulose- acetat (Cellogel-Fertigplatten, Plasticfolien der Fa. Chemetron). Zusammensetzung der FlieD- mittel: BEW 1 = 2-Butanol/Essigsaure/Wasser (67: 10: 23), BEW 2 = 2-Butanol/Essig-

8) D . E. Brundish und R. Wade, Biochem. J. 129, 23 (1972). 9) W. Kiinig und R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (1970). 10) J. Hunzl und J. Rudinger, Collect. Czech. Chem. Commun. 26, 2333 (1961). 11) Vgl. Biochemistry 6, 362 (1967) und Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 348, 262 (1967). 12) J. P. Greenstein und M. Winitz, Chemistry of the Amino Acids, John Wiley, New York,

London 1961; E. Schroder und K. Liibke, The Peptides, Academic Press, New York, London 1965.

1973 Spezifisch Tritium-markiertes ACTH-Analoges 1303

saure/Wasser (72: 7: 21), BPEW 1 = 1-Butanol/Pyridin/Essigsaure/Wasser (50: 12: 12:25), BPEW 2 = 1-Butanol/Pyridin/Essigsaure/Wasser (42: 24: 4: 30), BPEW 3 = 1-Butanol/Pyri- din/Essigsaure/Wasser (30:20: 6:24), CM 1 = Chloroform/Methanol (80:20), CME 1 =

Chloroform/Methanol/Essigsaure (95: 5: 3), EBPEW 1 = Essigester/l-Butanol/Pyridin/Essig- saure/Wasser (42: 24: 21 : 6: lo), EPAW 1 = Essigester/Pyridin/Ameisensaure/Wasser (63 :21 : 10: 6). Die Platten wurden mit Jod, Ninhydrin- und Reindel-Hoppe-Reagens13) angefarbt. - Die Radioaktivitat auf Diinnschichtplatten wurde rnit einem Diinnschicht-Scanner Actigraph I11 der Fa. Nuclear-Chicago lokalisiert. Fur Radioaktivitatsmessungen von Losungen ver- wendete man einen Liquid Scintillation Computer Mark I, Model 6860 der Fa. Nuclear- Chicago und als Scintillationslosung Aquasol der Fa. Nen Chemicals. Der Tritium-Gehalt der Luft wurde rnit einem Tritium-Monitor FHT 112A der Fa. Frieseke & Hoepfner iiber- wacht. - Optische Drehungen bestimmte man rnit einem Perkin-Elmer Polarimeter, Modell 141. - UV-Spektren wurden auf einem Beckman-Spektrophotometer, Modell ACTA V, im Laboratorium von Dr. H. J . Weder von Frau H. Marzoll aufgenommen. - 1H-NMR- Spektren wurden rnit einem Spektrometer Varian XL 100 rnit Tetramethylsilan als internem Standard von den Herren R. Baumann und A. Musson (im Laboratorium von Prof. Dr. K. Wiithrich) gemessen. - Die Peptidderivate 4 und 6 stellte uns Herr Dr. W . Rittel, Fa. Ciba-Geigy, dankenswerter Weise zur Verfiigung. - Die lipolytische Aktivitat wurde von Fraulein U. Lung unter Mithilfe von Fraulein M. F. Nuwratil gemessen. - Die steroidogene Aktivitat bestimmten dankenswerter Weise die Herren Prof. Dr. G . Sayers und D . S. Seelig, Case Western Reserve University, Cleveland/Ohio.

Dekapeptid-Synthese (Schema 1)

L-Allylglycin (17). - Es wurde aus DL-Allylglycin (puriss., Fa. Fluka) nach der Vorschrift von Black und Wrightl4) [via N-Acetyl-DL-allylglycin, Schmp. 114- 115°C (Lit. 14): Schmp. 114°C); Ausb. 92%. RF(S) = 0.38 (BEW I)] und enzymatischer Hydrolyse (Schweinenieren- Acylase; Fa. Sigma) gewonnen. Ausbeute 69%; RF(S) = 0.10 (BEW 1); = -36.5" (c = 4.248 in H20). - NMR (in D20): 6 = 2.5-2.8 (t; CH), 3.7-4.0 (t; CH), 5.1 -6.2 ppm (m; CH=CHz).

L-Allylglycin-methylester (16). - Zu 70 ml Methanol tropfte man bei -10°C 7.5 ml (103 mmol) Thionylchlorid. Nach Zugabe von 3.2 g (27.8 mmol) H-Agl-OH wurde das Reaktionsgemisch 1 h bei -10°C und 24 h bei Raumtemperatur geriihrt. Die Losung wurde eingeengt und nach Zugabe von Methanol erneut eingedampft. Den oligen Ruckstand ver- setzte man rnit 1 Liter Ather, wobei sehr hygroskopische Kristalle ausfielen. Ausbeute 4.3 g (93%); Schmp. 73-74°C; RF (S) = 0.36 (BEW 1).

Boc-Phe-Ser-OMe (13). - 15.55 g (100 mmol) H-Ser-OMe.HC1 wurden in 150 ml D M F gelost und rnit 11.52 g (100 mmol) N-Athylmorpholin (purum, Fa. Fluka) freigesetzt. Man fugte eine Losung von 26.53 g (100 mmol) Boc-Phe-OH in 150 ml DMF zu. Bei 0°C ver- setzte man rnit 27.02 g (200 mmol) festem 1-Hydroxybenzotriazol (purum, Fa. Fluka) und 22.7 g (1 10 mmol) DCCI (puriss., Fa. Fluka). Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 0°C und 90 min bei Raumtemperatur geriihrt. wobei Dicyclohexylharnstoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, das DMF abgedampft und der Riickstand in Essigester aufgenommen. Man wusch die Essigesterlosung zweimal rnit Natriumhydrogencarbonat-, einmal mit Citronen- saure- und einmal rnit Natriumhydrogencarbonat-Losung, einmal rnit Wasser sowie einmal rnit Natriumchlorid-Losung und trocknete uber Natriumsulfat. Der Essigester wurde abge- dampft und der Ruckstand aus Aceton/Petrolather umkristallisiert. Ausbeute: 32.6 g (89 %); Schmp. 88-89°C; RF(S) = 0.58 (CME 1).

13) E. von Arx und R. Neher, J. Chromatogr. 12, 329 (1963). 14) S. Black und N. G . Wright, J. Biol. Chem. 213, 39 (1955).

85*

1304 R. Schwyzer und G. Karlaganis 1973

H-Phe-Ser-OMe.HCI (11). - 32 g (87 mmol) Boc-Phe-Ser-OMe (13) wurden in 126 ml iiber Aluminiumoxid getrocknetem Essigester gelost. Man fiigte 163 ml 4.42 M (720 mmol) Salzsaure in Essigester zu. Die Endkonzentration an Salzsaure war somit 2.5 M. Nachdem man die Losung 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen hatte, wurden 1200 ml Ather zuge- fiigt und der entstehende Niederschlag abgetrennt. Umkristallisation aus Methanol/Ather lieferte 22.0 g (84%) 11; Schmp. 182-183°C; RF(S) = 0.34 (BEW l), 0.26 (CM 1).

CI3H19CIN204 (302.8) Ber. C 51.57 H 6.33 N 9.25 Gef. C 51.36 H 6.27 N 9.20

Boc-Ser-Phe-Ser-OMe (10). - 21.8 g (71.9 mmol) H-Phe-Ser-OMe .HCl (11) wurden in 100 ml DMF rnit 8.29 g (71.9 mmol) N-Athylmorpholin freigesetzt. Man fiigte eine Losung von 16.06 g (71.9 mmol) Boc-Ser-OH .H20 (12) in 100 ml DMF zu. Das Gemisch wurde bei 0°C mit 19.43 g (143.8 mmol) festem I-Hydroxybenzotriazol sowie einer Losung von 16.33 g (79.1 mmol) DCCI in 80 ml DMF versetzt und geriihrt. Die Reaktionszeit betrug 60 min bei 0°C und 90min bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde sofort wie bei der Herstellung von 13 aufgearbeitet. Nach dem Umkristallisieren des Rohproduktes aus Essig- ester/Petrolather erhielt man 27.7 g (85%) 10; Schmp. 148--149°C; RF(S) = 0.76 (BEW I ) , 0.65 (CM 1).

C21H31N308 (453.5) Ber. C 55.62 H 6.89 N 9.27 Gef. C 55.77 H 6.89 N 9.39

Boc-Ser-Phe-Ser-NHNHZ (9). - 11.3 g (25 mmol) Boc-Ser-Phe-Ser-OMe (10) wurden in 150 ml Methanol gelost und rnit 5 ml Hydrazin-hydrat versetzt. Man riihrte das Gemisch 6 h bei Raumtemperatur. Der entstandene Niederschlag wurde abgesaugt, rnit Methanol ge- waschen, getrocknet und aus DMF umkristallisiert. Ausbeute 10.02 g (89%) 9; Schmp. 184--185°C; RF(S) = 0.60 (BEW 2), 0.73 (BPEW 1).

Boc-Ser-Phe-Ser-Agl-OMe ($a). - Man leitete getrocknetes HC1-Gas in peroxidfreien Essigester ein. Die Konzentration an Salzsaure wurde durch direkte Titration rnit N-Athyl- diisopropylamin (Hunig-Base, purum, Fa. Fluka) bestimmt. Eine Losung von 13.6 g (30mmol) Boc-Ser-Phe-Ser-NHNHZ (9) in 300ml DMF wurde bei -20°C rnit 25ml (69.3 mmol) 2.78 M Salzsaure in Essigester und bei - 15°C rnit 4.28 ml (36 mmol) tert.-Butyl- nitrit (purum, Fa. Fluka, destilliert) versetzt. Das Gemisch riihrte man 15 min bei -15°C. Getrennt davon wurden 4.97 g (30 mmol) H-Agl-OMe’HCl (16) in 200 ml DMF gelost, daraus bei -20°C rnit 5.14 ml (30 mmol) Hiinig-Base die Base freigesetzt und dieses Gemisch der ersten Losung zugetropft. Man neutralisierte rnit 11.9 ml (69.3 mmol) Hiinig-Base. Nach lstdg. Reaktionszeit bei -15°C und 20 h bei 0°C wurde eingedampft. Man nahm das Roh- produkt in Essigester auf und reinigte durch Ausschiittein rnit einer Mischung aus 5proz. Kaliumhydrogensulfat und 5 proz. Kaliumsullat-Losung (1 : 2), gesattigter Natriumhydrogen- carbonat-Losung, Wasser und gesattigter Natriumchlorid-Losuug (je dreimal). Die Essigester- losungen wurden iiber Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Umkristallisation des Ruckstandes aus Methanol/Ather lieferte als diinrschichtchromatographisch einheitliches Produkt 12.84 g (78%) $a; Schmp. 150--151°C; RF(S) = 0.61 (CM I), 0.71 (BEW 1) .

C26H3809N4 (550.6) Ber. C 56.72 H 6.96 N 10.17 Gef. C 56.64 H 6.85 N 10.46

Boc-Ser-Phe-Ser-Agl-OH (8b) - Herstellung des Azids: 453 mg (1 mmol) Boc-Ser-Phe- Ser-NHNHZ (9) wurden in 2 rnl einer Losung von 1 N Salzsdure, die 10% Natriumchlorid enthielt, suspendiert und rnit einer Losung von 84 mg (1.2 mmol) Natriumnitrit in 0.3 ml Wasser versetzt. Der entstehende Niederschlag wurde von der Losung getrennt, rnit 1 N

Natriumhydrogencarbonat- sowie Natriurnchlorid-Losung digeriert und in 6 ml DMF gelost. - Kupplung mit Allylglycin: 230 mg (2 mmol) H-AgI-OH (17) loste man in 0.926 ml (2 mmol) 2.16 N Benzyltrimethylammoniumhydroxid-Losung (Triton B, 4OprOZ in Methanol; pract., Fa. Fluka) und dampfte die Losung mit etwas DMF/Benzol (5 : 1) wieder ein. Der

1973 Spezifisch Tritium-markiertes ACTH-Analoges 1305

Ruckstand wurde erneut in 5 ml DMF gelost und zur voranstehend beschriebenen Azidlosung gegeben. Es bildete sich eine Suspension, welche 30 min bei -10°C und 60 h bei 2°C geriihrt wurde. - Aufarbeitung: Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft und der Ruckstand rnit 20 ml 0.2 N Ammoniak versetzt. Unlosliches wurde abgetrennt und das Filtrat mit 1 N Essig- same neutralisiert. Man schuttelte die waBrige Losung rnit Essigester aus. Aus den vereinigten, ungetrockneten organischen Phasen fie1 beim Stehenlassen bei 0°C ein reines Produkt aus. Ausbeute 147 mg S b (28%); Schmp. 189-190°C; RF(S) = 0.62 (BEW l), 0.57 (BEW 2). - NMR (DMSO): 8 = 4.9-6.0ppm (m; CH=CH2, Agl).

C25H3409Nd (534.6) Ber. C 56.17 H 6.41 N 10.48 Gef. C 56.05 H 6.69 N 10.38

Boc-Ser-Phe-Ser-Agl-NHNHz .2H20 (7). - 11.01 g (20 mmol) Boc-Ser-Phe-Ser-Agl-OMe (Sa) wurden in 140 ml Methanol gelost, rnit 3.4 ml (70 mmol) Hydrazin-hydrat versetzt und 24 h bei Raumtemperatur geriihrt. Man nutschte den entstandenen Niederschlag ab und trocknete ihn. Das Rohprodukt wurde in einem Gemisch von 50 ml Methanol und 500 ml Ather wahrend 1 h geriihrt. Abfiltrieren und Trocknen lieferten 8.69 g (74%) 7; Schmp. 211-212°C; RF(S) = 0.24 (CM l), 0.68 (BEW 2).

CzsH&bN6 (586.6) Ber. C 51.19 H 7.22 N 14.33 Gef. C 51.36 H 6.98 N 14.03

Boc-Ser-Phe-Ser- Agl-Glu (OBiit) -His- Phe-Arg-Trp- Gly-0 H (5). - Man verwendete die gleichen Reagenzien wie bei der Herstellung von 8a. Eine Losung von 3.81 g (6.5 mmol) Boc-Ser-Phe-Ser-Agl-NHNHz .2H20 (7) in 100 ml wasserfreiem DMF wurde bei -20°C mit 6.47 ml (17.5 mmol) 2.71 N Salzsaure in wasserfreiem Essigester und bei -15°C rnit 0.93 ml (7.8 mmol) tert.-Butylnitrit versetzt. Das Gemisch riihrte man 10 min bei -10°C. Getrennt davon wurden 5.77 g (6.5 mmol) H-Glu(0But)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (6) in einem Gemisch von 200 ml DMF und 4.1 1 ml (24 mmol) N-Athyldiisopropylamin gelost und der ersten Losung bei - 15°C so zugetropft, dab nie ein BaseniiberschuR entstand. Man riihrte 24 h bei 0°C. - Aufarbeitung: Das Reaktionsgemisch wurde mit 6 ml konz. Essigsaure ange- sauert und rnit 5 Liter Essigester versetzt. Abkiihlen der Fallung auf 0°C und Abnutschen lieferten 8.63 g (94%) rohes 5. - Chromatographie: 1 g Rohprodukt 5 wurde in 100 ml DMF/Wasser (90: 10) gelost und iiber eine Saule von 20 g Aluminiumoxid (neutral, Aktiv.- Stufe IV; Fa. Macherey-Nagel) filtriert. Man eluierte zuerst rnit 1000 ml90proz. DMF, danach rnit 500 ml 70proz. DMF und gewann auf diese Weise 0.79 g reines Peptid 5. Schmp. 208 bis 209°C; RF(S) = 0.24 (BEW 2), RF(A) = 049 (EPAW 1). Aminosaure-Analyse (24stdg. Hydrolyse bei 110°C mit 6 N Salzsaure) ergab: (berechnete Werte in Klammern) Arg 0.99 (l), Glu 1.13 (l), Gly 1.04 (l), His (Bezugswert) 1.00 (l), Phe 1.92 (2), Ser 1.73 (2). Agl wurde bei der Hydrolyse zerstort. - NMR (DMSO): 8 = 4.9-6.1 ppm (m; CH=CHp, Agl).

Tetrakosipeptid-Synthese (Schema 2)

Boc-Ser-Phe-Ser-Agl-Glu(OBut) -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(Boc) -Pro- Val-Gly-Lys(Boc) -Lys (Boc)-Arg-Arg-Pro- Val-Lys(Boc)-Val-Tyr-Pro-OBut .3HCI (3). - 703 mg (0.50 mmol) ge- schiitztes DekapeptidderivatSwurdenin lOmlDMF suspendiertundbeiO"Cmit0.55ml l N'Salz- slure gelost. AnschlieBend wurde eine Losung von 1090 mg (0.50mmol) reinemTetradekapeptid- derivat 4 in 6 ml DMF hergestellt und bei Raumtemperatur zur Losung von 5 gegeben. Nach Zugabe von 74 mg (0.55 mmol) 1-Hydroxybenzotriazol in 2 ml DMF und Temperaturerho- hung auf 45°C wurden 155 mg (0.75 mmol) DCCI in 2 ml DMF zugegeben. Nach 18stdg. Riihren bei 45°C wurde langsam auf 0°C abgekiihlt, wobei Dicyclohexylharnstoff ausfiel, der abgenutscht werden konnte. Zur DMF-Losung fiigte man 500 ml Ather. Das Rohprodukt wurde abgenutscht, rnit frischem Ather gewaschen und getrocknet (1.61 g = 89 % 3). Das Roh- produkt wurde durch multiplikative Verteilung gereinigt (Steady-State-Distribution-Machine,

1306 R. Schwyzer und G. Karlaganis 1973

Model 20 der Fa. Quickfit and Quartz; Phasenkapazitat 10 ml; 123 Zellen). Als System ver- wendete man Methanol/Puffer/Chloroform/Tetrachlorkohlenstoff [8: 4: 5:2; Puffer = 14.3 ml Eisessig, 9.62 g Ammoniumacetat (puriss., Fa. Fluka) und 480 ml Wasser14). Die Unter- phase wurde stationar gehalten und die Oberphase iiber 630 Schritte verschoben (Schiittelzeit 3 min, Wartezeit 5 min). Ober- und Unterphase wurden getrenntin Fraktionensammlern auf- gefangen und diinnschichtchromatographisch gepriift. Die Elemente 72- 110 enthielten reines Produkt und wurden vereinigt. Man dampfte die Losung nach Zugabe von wenigen Tropfen Octanol (puriss., Fa. Fluka) ein, sublimierte das Ammoniumacetat bei 40°C im Hochvakuum ab, nahm den Riickstand in 30 ml tert.-Butylalkohol/Wasser (1 : 1) auf und lyophilisierte. Es konnten 926 mg diinnschichtchromatographisch reines 3 gewonnen werden. Schmp. 184 bis 186°C; RF(A) = 0.71 (EPAW l), 0.33 (EBPEW 1). - NMR (DMSO): 6 = 4.9-6.1 ppm (m; CH=CH*, Agl). - Es war nicht moglich eine befriedigende Aminosaure-Analyse zu erhalten (Storung durch Agl und Lys?).

Versuche zur Herstellung von H-Ser-Phe-Ser-Agl-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- Val-Gly- Lys-Lys-Arg-Arg-Pro- Val-Lys- Val-Tyr-Pro-OH. 6 CF3COOH und .6HCl (1 c)

a) Spaltung mit 9Oproz. Triyuoressigsaure: 0.8 mg reines, geschiitztes Tetrakosipeptidderivat 3 wurden in 0.2 ml90proz. Trifluoressigsaure (purum, Fa. Fluka) gelost und 30 rnin bei Raum- temperatur stehengelassen. Das Peptid wurde rnit kaltem Ather ausgefallt, abzentrigufiert und rnit frischem Ather gewaschen.

b) Spaltung mit 70proz. Trifluoressigsaure: 0.4 mg 3 wurden in 0.2 ml 70prOZ. Trifluoressig- saure gelost und 20 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Aufarbeitung wie bei a).

b) Spaltung mit konz. Salzsaure: 0.5 mg 3 wurden in 5 Tropfen konz. Salzsaure gelost und 15 rnin bei 0" stehengelassen. Man dampfte die Salzsaure bei 0°C im Hochvakuum ab und lyophilisierte den Riickstand aus tert.-Butylalkohol.

c) Spaltung mit konz. SulzsaurelEssigsaure ( 1 : l ) : 0.5 mg 3 wurden in 3 Tropfen Eisessig gelost und rnit 3 Tropfen konz. Salzsaure versetzt. Man lie13 3 rnin bei Raumtemperatur stehen, dampfte die Losung bei 0°C im Hochvakuum ab und lyophilisierte den Ruckstand aus tert.-Butylalkohol. -Reinheitspriifung : Die diinnschichtchromatographische Reinheitspriifung (Aloxplatten, System BPEW 2 und BPEW 3) zeigte, dal3 die Produkte aller 4 Reaktionen Gemische waren (Zerstorung der Doppelbindung unter den Bedingungen der Schutzgruppen- abspaltung ?).

Boc-Ser-Phe-Ser-Nva-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(Boc)-Pro- Val-Gly-Lys(Boc) Lys(Boc)-Arg-Arg-Pro- Val-Lys(Boc)- Val-Tyr-Pro-OBut.3HCl (2b). - 54 mg reines ge- schiitztes Tetrakosipeptidderivat (3) wurden in 10 ml Methanol gelost und rnit 0.1 ml konz. Essigsaure und 50 mg Palladium/Kohle (10% puriss., Fa. Fluka) versetzt. Man hydrierte insgesamt 78 h unter Schiitteln bei Raumtemperatur, wobei nach 24 und nach 48 h je 50 mg frischer Katalysator zugefiigt wurden. AnschlieOend filtrierte man den Katalysator ab, dampfte ein, lyophilisierte aus tert.-Butylalkohol/Wasser (1 : 1) und erhielt 38 mg (70%) 2b. Schmp. 183--185°C; RF(A) = 0.65 (EPAW I), 0.56 (EBPEW 1). - Aminosaure-Analyse (Be- dingungen siehe 5): Arg 2.77 (3), Glu 1.14 (l), Gly 2.10 (2), His 0.98 (I), Lys 3.89 (4), Nva 1.19 (l), Phe 1.83 (2), Pro 3.00 (3), Ser 1.85 (2), Tyr 0.91 (l), Val (Bezugswert) 3.00 (3). - NMR (DMSO): zwischen 6 = 4.9 und 6.1 ppm kein Signal.

H-Ser-Phe-Ser-Nva-Glu-His-Phe-Arg-Trp- Gly-Lys-Pro- Val-Gly-Lys-Lys-Arg- Arg-Pro- Val- Lys-Val-Tyr-Pro-OH.6CH3COOH (lb). - 23 mg (6.4 pmol) 2 b wurden rnit 0.25 ml Anisol (purum, Fa. Fluka) in ein GefaO aus ,,Daiflon" gefiillt; dieses war ein Teil der Apparatu fur Reaktionen rnit Fluorwasserstoff (Fa. Toho Kasei). Mit Hilfe von fliissigem Stickstoff wurden 8 ml FluDsaure (purum, Fa. Fluka) hinzudestilliert. Das Reaktionsgemisch wurde 30 rnin bei

1973 Spezifisch Tritium-markiertes ACTH-Analoges 1307

0°C geruhrtls). Nach beendeter Reaktion destillierte man die FluDsaure ab loste das Roh- produkt in 5 ml Wasser und entfernte das Anisol durch zweimaliges Ausschiitteln rnit wenig Essigester. - Austausch der Fluorid- gegen Acetationen: Die waDrige Losung wurde direkt auf eine Saule (7 X 1 cni) rnit Anionenaustauscher I1 (schwach basisch, Fa. Merck) gegeben. Man eluierte rnit 1 proz. Essigsaure. Proben des Eluates wurden rnit Folin-Ciocalteus-Reagenz (Fa. Merck) a d ihren Tyrosin-Gehalt gepruft. Nach der Lyophilisation des Eluates erhielt man 14 mg (63%) l b . RF(A) = 0.25 (BPEW 2), 0.44 (BPEW 3); [a]g = -57.3" (c = 0.506 in 1 proz. Essigsaure). Elektrophorese auf Trager CA, 30 min bei 700 V; Anfarben mit Coomassie Brilliant Blau R-250 (Fa. Serva); Laufstrecken: -9.9 cm (pH 1.9), -3.9 cm @H 6.5), -0.5 cm (PH 8.1). - Aminosaure-Analyse (Bedingungen siehe 5): Arg 2.84, (3), Glu 1.22 (I), Gly 2.09 (2), His 0.99 (I), Lys (Bezugswert) 4.00 (4), Nva 1.19 (l), Phe 1.92 (2), Pro 3.13 (3), Ser 1.80 (2), Tyr 0.67 (l), Val 3.13 (3). - UV (0.1 N Natronlauge): hmax (E) = 280 (7420), 288 nm (6550); Molverhaltnis TyrjTrp = 1.20 (D294,4 = 0.311; D280 = 0.428)16).

Boc-Ser-Phe-Ser-Nva(4,5-t2) -Glu(OBu') -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(Boc) -Pro- Val-Gly- Lys(BocJ-Lys(Boc)-Arg-Arg-Pro- Val-Lys(Boc)- Val-Tyr-Pro-OBut.3HCl (2a). - Reinigung von DMF: DMF wurde iiber Bariumoxid getrocknet, im Hochvakuum destilliert und im Dunkeln bei -20°C aufbewahrt. Test auf Dimethylamin: 1 ml des zu priifenden D M F wurde rnit 1 ml 1 proz. 2,4-Dinitrofluorbenzol-Losung @uriss. p. A., Fa. Fluka) in 95pro.z. khan01 gemischt, 30 min stehengelassen und die Absorption A bei 381 nm gemessen. Kaufliches DMF: A = 0.87, destilliertes DMF: A = 0.30. - Tritiierung: Der Bau der Tritiierapparatur (Abb. 1) erfolgte einerseits nach einem Schema von M. Wenzel und Mitarbeitern"), andererseits nach Angaben von Herrn Dr. K. Schmid (Fa. Ciba-Geigy) und in Zusammenarbeit rnit Herrn J. Schildknecht von unserer Biophysik-Gruppe. Hergestellt wurde sie von Herrn W. Widmer [Glasblaser der Kernphysik ETH Zurich (Direktor: Prof. Dr. P. Marmier)]. Bei der Wahl gunstiger Tritiier-Bedingungen war Herr Dr. Wiirsch, (Fa. Hoffmann-LaRoche) behilflich. - Eine Ampulle, enthaltend 10 Curie Tritiumgas (98 % Tritium, 2 % Wasserstoff; Fa. Radio- chemical Centre), wurde an die Tritiierapparatur angeschmolzen. In das 6.5 ml fassende ReaktionsgefaiD fullte man unter FeuchtigkeitsausschluR 30 mg (8.33 pmol) reines, geschutztes Tetrakosipeptidderivat 3, 1 .O ml gereinigtes, trockenes DMF und 30 mg Palladium/Kohle. Das Reaktionsgemisch wurde eingefroren und die Apparatur auf 10-2 Torr evakuiert. Man offnete die Ampulle, transferierte das Tritium-Gas rnit Hilfe einer Toepler-Pumpe ins Reak- tionsgefaB und riihrte das Gemisch 26 h bei Raumtemperatur; der Druck des Tritium-Gases wahrend der Reaktion betrug 570 Torr. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsge- misch wieder eingefroren und das iiberschussige Tritium in die Ampulle zuriicktransferiert. - Aufarbeitung: Sowohl Tritiierung als auch Aufarbeitung erfolgten unter starkem Luftabzug (Plexiglas-Box/Kapelle). Der Tritium-Gehalt der Luft wurde rnit einem Tritium-Monitor uberwacht. Das ReaktionsgefaD wurde rnit gefrorenem Inhalt abgenommen und an einem Destillationsbogen befestigt. Man evakuierte den Destillationsbogen und entfernte so das DMF durch Sublimation. Nach dem Abtrennen des Losungsmittels (1 ml DMF) betrug die Radioaktivitat 3.8 Curie. Der Ruckstand wurde in einem Gemisch Methanol/Wasser (1 : 1) aufgeschlammt und der Katalysator abgenutscht. Um die lose gebundenen Tritium-Atome durch Austausch zu entfernen, dampfte man die Losung im Rotationsverdampfer ein und loste den Ruckstand erneut in Methanol/Wasser. Dieser Vorgang wurde funfmal wiederholt, wonach die Aktivitat der Losung nicht weiter abnahm. Man erhielt ein dunnschichtchromato- graphisch reines Produkt; RF(A) = 0.57 (EPAW l), 0.78 (EBPEW 1).

15) S. Sakakibara, Y. Shimonishi, Y. Kishida, M. Okada und H. Sugihara, Bull. Chem. SOC.

16) G . H. Beaven und E. R. Holiday, Advan. Protein Chem. 7, 319 (1952). 17) M. Wenzel, H. Wollenberg und P. E. Schulze, Atompraxis 7, 89 (1961).

Jap. 40, 2164 (1967).

1308 R . Schwyrer und G . Karlaganis 1973

Abbildung 1. Tritiierapparatur (Detail-Aufnahme) 1 = ReaktionsgefaB. 2 = Ansatz fur Ampullenoffner und Tritiumampulle. 3 = Pirani- Vakuum-MeRzelle (Typ TPR 010, Fa. Balzers). 4 = Toepler-Pumpe. 5 = Verbindung zur Vakuumpumpe. 6 = Beliiftungshahn und Zuleitung zur Stickstoffflasche (fur Uberdruck).

H-Ser-Phe-Ser-Nva(4,5-tz) -Glu-His-Phe- Arg-Trp-Gly-Lys- Pro- Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg- Pro- Val-Lys- Val-Tyr-Pro-OH. 6 CH3COOH (1 a). - Die Schutzgruppenabspaltung erfolgte wie bei der Herstellung von 1 b. 29 mg (8.0 pmol) geschutztes, tritiiertes Tetrakosipeptid- derivat 2a wurden rnit 0.5 ml Anisol und 8 ml FluBsaure versetzt und 30 min bei 0°C geruhrt. Darauf destillierte man die FluBsaure ab, gab je 5 ml Wasser und Essigester zu, ruhrte das Gemisch 30 min, trennte den Essigester ab und wiederholte den Vorgang rnit 2.5 ml frischem Essigester. Die waBrige Losung wurde auf eine Anionenaustauschersaule (siehe bei 1 a) gegeben und das Peptid in der Acetat-Form rnit 120 ml 1 proz. Essigsaure eluiert. Die Aktivitat des Eluates betrug am SchluB nur noch 0.4 pCi/ml. Nach dem Eindampfen und Trocknen der Losungerhieltman22.6 mg(80X)la; RF(A) = 0.19(BPEW 2),0.42 (BPEW 3). Elektrophorese auf Trager CA, 30 min bei 700 V; Lokalisation rnit Dunnschicht-Scanner; Laufstrecken: -10.2 cm (PH 1.9), -3.9 cm (pH 6.5), -0.6 cm (pH 8.1). - UV (0.1 N Natronlauge): A,,, (c) = 280 (6520), 288 nm (5730); Molverhaltnis Tyr/Trp = 1.17 (D294.4 = 0.298, D280 = 0.413). - Aminosaureanalyse (Bedingungen siehe 5 ) : Das Eluat des Aminosaure- Analysators wurde rnit einem Fraktionensammler (4 ml-Fraktionen) aufgefangen, in jeder Fraktion die Gesamtmenge an Radioaktivitat gemessen und den einzelnen Aminosauren zugeordnet (Summe der Radioaktivitat aller Aminosauren = 100 %). Das Ergebnis enthalt Tabelle 1 .

1973 Spezifisch Tritium-markiertes ACTH-Analoges 1309

Tabelle 1. Aminosaure-Analyse von 1 a

Aminosaure Ber. Gef. % Radioaktivitat

Arg

Gly His

LY s Nva (Bezugswert) Phe Pro Ser

TrP TYr Val

Glu 3

1

2

1 4

1 2 3

2 1 1 3

3.09 0.3

1.01 0.1 1.91 0.1

0.81 5.0

4.09 0.4 1 .oo 92.2

1.79 0.9 3.02 0.1 1.60 0.2

- 0.5 0.93 0.1

2.99 0.1

Bestimmung der spezifischen Aktivitat: Der Ruckstand (22.6 mg la) wurde in 50 ml bidestil- liertem Wasser gelost, so daB eine 1.29.10-4~ Losung entstand (Molekiilmasse von l a =

3502). Darin waren total 47.97 mCi enthalten. Die spezifische Aktivitat betrug somit 2.12 mCi/ mg oder 7.42 Ci/mmol. Die Genauigkeit der Radioaktivitatsmessung (Fliissigkeitsscintilla- tionszahlung) betrug f 1.6%. - Aufbewahrt wird die Substanz in bidestilliertem Wasser unter Zusatz von 2 % Athanol (als Radkialfanger) ; Konzentration an 1 a: 1.27 .lo-" M.

Man schmolz die Losung in I-ml-Ampullen ein und lagerte diese unter LichtausschluB in fliissigem Stickstoff (- 196°C).

Enzymatischer Abbau von l a und lb: Als Substrate verwendete man Synacthen (Fa. Ciba- Geigy) freies tritiiertes Tetrakosipeptidderivat l a und freies hydriertes Tetrakosipeptid- derivat 1 b, als Enzyme a-Chymotrypsin (reinst, Fa. Serva) und Trypsin (p. A., Fa. Serva). - 0.5 mg Substrat wurden in 0.5 ml 0.1 M Ammoniumhydrogencarbonatpuffer @H 8.1) gelost und nach Zugabe von 10 ~ 1 0 . 1 proz. Enzymlosung wahrend 120 min bei 37°C inkubiert. An- schlieRend wurden je 20 PI der Losungen auf einer Dunnschicht-Platte (Trager C) im Sys- tem BPEW 2 chromatographiert, mit Ninhydrin angefarbt und die radioaktiven Flecken mit dem Dunnschicht-Scanner lokalisiert. Die RF-Werte der Abbau-Produkte aller drei Substrate waren identisch, und zwar sowohl beim Abbau mit a-Chymotrypsin als auch beim Abbau mit Trypsin.

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