HPLC-Anlage - Übersicht - chm.tu-dresden.de · Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 1 HPLC-Anlage - Übersicht Pumpe 70 mbar Eluenten Entgaser Gradienten-mischer

Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 1

HPLC-Anlage - Übersicht

Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Eluenten

Einlassfritte 5-10 µm+ entfernt Partikel aus dem

Eluenten (Schutz der

Pumpenventile)

Mikrobieller Befall+ Insbesondere bei wässrigen

Eluenten ist auf zu achten!

Aus: Th. Welsch

Einführung in die HPLC


Eluenten

Die verwendeten

Eluenten

müssen

ineinander

mischbar sein

Aus V.R. Meyer

Praxis der Hochleistungsflüssigchromatographie


Eluenten - Reinheit

Der verwendete Detektor bestimmt die Reinheitsan-forderungen an die Eluenten

+ UV-Detektor:

• geringe Eigenabsorption

• geringer Gehalt UV-aktiver Verunreinigungen Spezifikation ‚HPLC-

grade‘, gradient grade‘

+ Fluoreszenz-Detektor

• geringe Eigenfluoreszenz bei den gewählten Ex/Em

• geringer Gehalt an Substanzen, die bei den gewählten Ex/Em eine Fluoreszenz zeigen

+ .....................

Solvent UV Cutoff (nm)

Acetonitrile 190

Water 190

Cyclohexane 195

Hexane 200

Methanol 210

Ethanol 210

Diethyl Ether 220

Dichloromethane 220

Chloroform 240

Carbon Tetrachloride 265

Tetrahydrofuran 280 (220)

Toluene 285


Eluenten - Reinheit

Spezifikationen

+ Reinheit

+ Viskosität

+ Brechungsindex

+ Siedepunkt

+ Toxizität

+ UV-Durchlässigkeit/UV-Cutoff

+ Löslichkeit


Garantieschein

Gehalt (GC) min. 99,8 %

Abdampfrückstand max. 0,0005 %

Wasser max. 0,02 %

Acidität max. 0,0005 meq/g

Alkalität max. 0,0002 meq/g

gradient grade

bei 235 nm max. 2 mAu

bei 254 nm max. 1 mAu

Fluoreszenz

bei 254 nm max. 1 ppb

bei 365 nm max. 1 ppb

UV Durchlässigkeit

bei 220 nm min. 50 %

bei 235 nm min. 80 %

bei260 nm min. 98 %

Physikalische Daten von Methanol:

UV-Grenze: 260 nm

Brechungsindex: 1,3284

Viskosität 0,60 mPas

Polarität E° (Al2O3): 0,95

Dichte: 0,79 g/ml

Siedepunkt: 65° C

MAK-Wert: 200 ml/m3

Eluenten

aus: Merck HPLC-Training System



Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Entgaser / Degasser

Entfernung gelöster Luft

+ Probleme mit der Pumpe Druckschwankungen aufgrund von Luftblasen in den Ventilen

insbesondere bei Mischung bestimmter Lösungsmittel (Methanol/Wasser)

+ Detektorprobleme

• Amperometrischer Detektor (Sauerstoff)

• Entstehung von Gasblasen in der Detektorzelle

→ Brechungsindexdetektor

→ UV-/Fluoreszenzdetektor


Entgaser / Degasser

Prinzipien / Methoden+ Permeations-Vakuumentgaser

+ Helium-Spülung

+ Ultraschall / Vakuum-Ultraschall



Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Gradientenmischer

Prinzip+ entgaste Eluenten laufen durch Einwegeventile

+ es ist jeweils nur ein Ventil pro Zeiteinheit

geöffnet

+ die Ventile öffnen sich proportional zum Anteil

des jeweiligen Eluenten

+ Beispiel:

eine Mischung von A:B (80:20) wird erreicht,

wenn sich Ventil A 0,8s öffnet

und anschließend Ventil B für 0,2s

A B C

A B C



Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Pumpen-Typen

KolbenpumpeMit Abstand der Typ mit der weitesten

Verbreitung

+ Förderkolben wird von einer

exzentrischen Scheibe angetrieben

+ Kolbenmaterial: Saphir (inert) wird von

einer Dichtung umschlossen

+ Ein- und Austritt des Eluenten wird

durch 2 Einwegeventile geregelt

Fluss ist nur in eine Richtung

möglich

+ Mit dieser Technik sind Drucke bis

400 bar möglich


Pumpe

Doppelkolbenpumpen –Prinzip der seriellen Schaltung

+ Es werden 2 Kolben zur pulsa-

tionsfreien Förderung eingesetzt

+ Eluentenein- und –ausstrom

werden beim ersten Kolben durch

Ventile geregelt

+ Restschwankungen der Pulsation

lassen sich über eine elektro-

nische Drehzahlregelung des

Schrittmotors regeln.

Auslass-

Einlass-

ventilaus: Merck HPLC-Training System


Pumpe

Doppelkolben-

pumpe

(Praktikum)

Einlass-

ventil

Pumpen

-kopf


Pumpe

Ventile

+ Rubinkugel dichtet in einer

eingeschliffenen Saphirscheibe

+ Saphirkolben zieht sich zurück

• Einlassventil öffnet sich, im

Auslassventil fällt die Rubinkugel

durch den Systemdruck in die

Saphirscheibe und dichtet

Saphirkolben

Kolbendichtung

Einlassventil

Feder

Rubinkugel

Saphirscheibe

(geschliffen) Saphirkolben Saphirscheibe + Rubin

aus: Agilent -Trainingsmaterialien



Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer

Atmos-

phären-

druck

Hochdruckbereich (bis 400 bar)

Niederdruckbereich


Schäuche, Fittings, Kapillaren

Niederdruckbereich+ Verwendung von Schläuchen und Kapillaren

mit einem Aussendurchmesser von 1/8“

(3,175mm) und einem Innendurchmesser über

0,2 mm (Ausnahme Kapillare von der Säule zum Detektor

und vom Detektor in den Abfall)

+ Dichtung erfolgt über

• die geflanschte (‚aufgespreizte‘) Kapillare

• Einen Dichtkegel (Ferrule), der beim

Aufschrauben auf die Kapillare gedrückt wird

Geflanschte Kapillare

mit Schraube

‚flangeless fitting‘

Kapillare mit Dichtkegel



Hochdruckbereich+ Verwendung von Schläuchen und Kapil-

laren mit einem Aussendurchmesser von

1/16“ (1,588mm) und einem Innendurch-

messer von

• 0,5 mm zwischen Pumpe und Injektions-

ventil

• 0,25 mm zwischen Probenaufgabe und

Detektorausgang

+ Dichtung erfolgt über

• einen Dichtkegel (Ferrule), der beim Auf-

schrauben auf die Kapillare gedrückt wird

• Materialien→ Edelstahl

→ PEEK, PTFE: inerte, druckstabile Kunststoffe

‚fingertight fitting‘

Aus: Th. Welsch




Hochdruck-

bereich

Aus: Th. Welsch


Aus: G. Aced et al.

Liquidchromatographie


Druck- und Längeneinheiten

Druckeinheiten

1 bar 1 MPa 1 psi 1 mWS 1 mmHg

1 bar 0,1 14,5 10,2 750

1 MPa 10 145 102 7500

1 psi 0,0689 0,00689 0,7 51,7

1 mWS 0,0981 0,00981 1,42 73,6

1 mmHg 0,0013 0,00013 0,019 0,013

Umrechner: http://www.juwo.at/de/pressunits.htm#Definitions

Längeneinheiten (Zoll mm)

Zoll (inch, “) 1“ ½“ 3/8“ ¼“ 3/16“ 1/8“ 1/16“ 1/32“

mm 25,4 12,7 9,525 6,35 4,76 3,175 1,59 0,794

Umrechner: http://www.segelservice.com/service/entf_rech.htm



Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Spül-(Purge-)ventil

+ dient dem schnellen Spülen der Anlage bis einschließlich Pumpe,

ohne die Säule zu belasten (beliebig hohe Flussrate)

• Volumen in den Schläuchen und insbesondere im Entgaser kann

mehrere mL betragen

+ sinnvoll bei

• Inbetriebnahme

• Wechseln eines Eluenten

Purge-

ventil



Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Mischkammer

+ Eluenten werden

meist hochdruck-

seitig gemischt

+ Mischkammertypen• statisch

• dynamisch

statische Mischkammer dynamische Mischkammer (z.B. Knauer)



Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Probenaufgabe

2-Position-6-Port-

Schaltventil+ Load-Position

• HPLC-Spritze einführen

• gesamtes Volumen injizieren

(Überschuss gelangt in den

Abfall)

• Spritze noch nicht herausziehen

+ Drehen in Inject-Position

• Spritze herausziehen

• Probenschleife wird nun vom

Eluenten durchströmt

• ein integrierter Kontakt

übermittelt den Analysenstart

einem Integrator oder einer

HPLC-Software

Load – Inject

Stellung

HPLC-Spritze

- stumpfe Spitze

- Einspitzvolumen ca. 5x Volumen

der Probenschleife



Probenaufgabe

2-Position-6-Port-SchaltventilInjektionsport

für HPLC Spritze

Probenaufgabeschleife

zur Trennsäule/Detektor

von der Pumpe/Mischer


Probenaufgabe

Funktionsweise+ in der LOAD-Position die Ports 2/3,

4/5 und 6/1 miteinander verbunden

+ nach dem Umschalten in die INJECT-

Position sind die Ports 1/2, 3/4 und

5/6 verbunden

+ dies wird durch eine Dichtung (rotor

seal) erreicht, die sich mit dem

Schalthebel dreht und jeweils zwei

Kanäle verbindet

Probenschleife

Rotor Seal

Kerben verbinden

jeweils 2 Kanäle



Probenaufgabe

Überfüllen der Probeschleife in

der Load-Stellung (5x Schleifen-

volumen)

+ HPLC-Spritze noch nicht

herausziehen

Durch Drehen des Ventils wird

die Probeschleife in den Eluen-

tenstrom gebracht (Inject-

Stellung)

+ jetzt Spritze herausziehen

Pumpe

Pumpe

Säule

Säule

Ladestellung (Load)

Injektionsstellung (Inject)

Probeschleife



Probenaufgabe

Autosampler+ Ähnliches Prinzip, nur

dass die Probenappli-

kation durch einen

Roboter erfolgt

2. Probenapplikation

Pumpe

Säule

3. Injektion

Pumpe

Säule

1. Normalbetrieb

Pumpe

SäuleSchaltventil




Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Säulenofen

Säulenofen + soll Säulentemperatur konstant

halten, um reproduzierbare

Retentionszeiten zu erhalten

+ Funktionen

• Heizen (Raumtemperatur* (RT)

bis 80 – 100 °C)

• Kühlen (bis 20°C unter Raum-

temperatur nur bei Öfen mit

Peltierelement)

• Detektion von Leckagen

* man beachte, dass im Sommer die RT

beträchtlich variieren kann

mind. 40 °C für reproduzierbare Bedingungen


Packungsmaterial

Kieselgel+ Partikelgestalt/-geometrie

(sph./irr.)

+ Teilchengröße (3–10 µm)(vergl. Säulenchromatographie)

+ Porendurchmesser

(60-400 Å = 6-40 nm)

+ Porosität

+ Spezifische Oberfläche

Irregular

Silicagel

Sphärisch

Irreguläraus: Agilent -Trainingsmaterialien


Packungsmaterial

Partikelgröße

+ Partikelgrößen sind gaussverteilt je nach Herstellung

+ Der Porendurchmesser beträgt nur etwa 1/1000 des Teilchendurchmessers



Packungsmaterial

Spezifische Oberfläche

+ Kieselgele können mit verschiedenen Chlorsilanen

modifiziert werden

+ Cl Si R

CH3

CH3

Si OH

Si OH

Si OH

Si O

Si O

Si OH

Si R

CH3

CH3

Si R

CH3

CH3



Packungsmaterial

Modifizierte Kieselgele+ auch in den Poren sind die Silanolgruppen umgesetzt

+ Oberfläche ca. 170 m2/g

Si CH3H3C

O

O

Si

O

Si

O

OH

Pores

Brush-like

Carbon Chain



Packungsmaterial

RP-Phasen

aus: http://quimica.udea.edu.co/~carlopez/cromatohplc/column.html

http://quimica.udea.edu.co/~carlopez/cromatohplc/column.html


Säule

Spezifikationen

CS-Chromatographie ServiceMultospher 120 RP-18 HP 5µ

Art.-Nr. xxxx HPLC-Säule 250x3 mmMultospher 120 RP-18 HP-5Ch. 70801Säulen-Nr. 0103-01 Flow --------Muster-ChromatographieTel., Fax, mail

Herstellername des Kieselgels

Porengröße (Angström)

Modifizierung des Kieselgels

Korngröße in µm

Säulendimension (Länge x ID)

Flussrichtung


Säule

+ Zum Schutz der Hauptsäule wird eine

kleine Vorsäule eingesetzt (oft als

Kartusche)

+ Equilibrierung der Säule mit der

mobilen Phase mit etwa 5-10

Säulenvolumen

• bei einer 3x250mm Säule, 0.5 ml/min:

4-8 min)

+ Säulen sollten nur in der angegebenen

Richtung betrieben

(Verlust an Auflösung)

+ Säulenmaterialien sind empfindlich

gegen Druckstöße



Säule

+ Kieselgelphasen nur in einem pH-

Bereich von 2.0 bis 7.0 betrieben

werden

+ Enden sind stets zu verschließen, um

ein Austrocknen der Säule zu

vermeiden

+ Lagerung der Säule muss in einem

geeigneten Lösungsmittel erfolgen

(Vermeidung von Hydrolyse,

mikrobieller Befall)




Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Detektoren

UV-Detektor+ Es gilt das Lambert-

Beer'sche Gesetz

+ E = · c · dE: Absorption

: molarer Absorptionskoeffi-

zient bei

c: Konzentration

d: Schichtdicke

+ Verwendete Lösungs-

mittel (und Puffersalze)

müssen für das UV-

Licht der gewählten

Wellenlänge durch-

lässig sein

UV Lamp

Grating

Flow cell

Reference diode

Sample

diode

Cut-off filter

Holmium oxide

filter

Slit

Mirror 2

Mirror 1



Detektoren

Sensitivität (Empfindlichkeit)

PAH's extracted from soil; Sup.LC-PAH 150x4.6mm;

Solv.: H2O/CH3OH= 10:90

Fluorescence

UV-signal

WL

241/

394

WL

270/

388

WL

248/

411

WL

302/

420

WL

247/

504

Pyren

e

Chryse

ne

Benzo

(e)p

yren

e

Peryle

ne

Benzo

(k)fl

uora

nthen

e

Benzo

(a)p

yren

e

Benzo

(ghi

)per

ylene

Inden

o(12

3-cd)p

yren

e



Detektoren

Selektivität



Detektoren

Selektivität

UV-spectrum

Chlortoluron

?Atrazine

?

Wavelength (nm)

44

68

58

96 132 138158

172

215

200MS-spectrum

104

Mass/Charge60 80 100 120 140 160 180 200 220




Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


AD-Wandler

+ Kontinuierliches Span-

nungssignal des De-

tektors wird in digitale

Daten umgewandelt:

+ Aufnahmerate wird

vorgewählt (z.B. 2 Hz)

• Pro Sekunde wer-

den 2 Datenpunkte

aufgenommen

in 10 min 1200

Datenpunkte

• Die Datentabellen

können in Origin

bzw. Excel

verarbeitet werden

0

20

40

60

80

0 2 4 6 8 10 12 min

mV

Analog

Digitalisiert

Unterschiedliche DatenaufnahmerateAus: Th. Welsch




Pumpe

70 mbar

Eluenten

Entgaser

Gradienten-

mischer

A

A

B

C

BC

A

B

C

A B C

A B C

Abfall

Spül-(Purge-)

ventil

Aufgabe-

ventil

Abfall

Auswerte-

software

A/D-Wandler

Detektor

Säulenofen,

Säule

Misch-

kammer


Integrator / Chromatographiesoftware

Integration+ Unterschiedliche

Integrationsmög-

lichkeiten in

einem

Chromatogramm

Aus: Th. Welsch


A Bereich der Totzeit, negativer Peak

B Aufsetzer-(Schulter)peak auf Tailing

C vollständig getrennter Peak

D unvollständig getrennte Peaks (richtig: Vertikale zur Basislinie)

E kleiner Peak ( Peakerkennung)

F Aufsetzer-(Schulter)peak auf driftender Basislinie



Peakerkennung+ Sensitivität

gibt an die Minimalkriterien zur Erkennung eines Peaks an:

• S/N Signal-Rausch-

Verhältnis

(Rauschen = noise)

• Mindestfläche

1,10

1,20

1,30

1,40

1,50

1,60

8,0 9,0 10,0 11,0 12,0

min

mV

0

20

40

60

80

0 2 4 6 8 10 12

mV

noise



Peakerkennung+ Peakspitze

Messwerte werden miteinander verglichen: sobald

ein Messwert S(n+1) kleiner als Sn ist, wird Sn als

Peakspitze angenommen

+ Peakbasis

• der Anstieg des Signales (V/t) wird bei

aufeinanderfolgenden Messwerten verglichen

• wird ein Wert überschritten, wird der Peak

erkannt und hier die Peakbasis gelegt


Praxis


System Check

Vorbereitung der Anlage+ HPLC-Anlage ist mit Eluenten gespült

+ Säule ist mit dem Eluentengemisch equilibriert

+ Detektor zeigt ein stabiles Signal

+ keine Lecks sichtbar

Probenvorbereitung+ Probe ist zur Injektion vorbereitet

• klare Lösung

• ggf. filtriert

• Kompatibel mit dem Eluenten



Probenvorbereitung

Filtration+ Entfernung von Partikeln aus der

Probelösung

+ Einmalfilter mit Membranen

unterschiedlicher Lösungsmittel-

stabilität

• Porengrößen 0,2 und 0,4 µm

• Je nach Probenmenge

unterschiedliche Gehäusegröße

• Gehäuse meist aus PP

• Luerlockanschluss


Probenvorbereitung

Filtration – Membranfiltermaterialien+ Celluloseacetat

• Hydrophile Membran, für wässrige bzw. polare Flüssigkeiten,

pH 4-8

+ PTFE / Polytetrafluorethylen / Teflon

• Hydrophobe Membran, für nicht-wässrige Proben, beständig

gegen Säuren und Basen

+ Polyamid / Nylon

• Hydrophile Membran, für wässrige und organisch/wässrige

Flüssigkeiten im Bereich von pH 3-10

+ Polyvinylidenfluorid (PVDF)

• Hydrophil, für wässrige Flüssigkeiten und Mischungen mit

max. 60% organischen LM-Anteil


Injektionslösung

Kompatibilität zum Eluenten+ Probe sollte im Eluenten gelöst werden (bzw. Anfangszusammen-

setzung des Gradienten) oder in einem weniger starken Eluenten

+ der pH der Probe sollte insbesondere bei protonierbaren Analyten dem des Eluenten entsprechen

Probe in stärkerem Eluenten gelöst

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 min

mAU

Probe in mobiler Phase gelöst

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 min

mAU


RP-Phase

Elutionskraft - Umkehrphasen

Wasser

Methanol

Acetonitril

Isopropanol

Tetrahydrofuran

Elutionskraft

Starke Retention

an der Umkehrphase

Schwache Retention


OH

H

RP-Phase

Prinzip

Si

O

O

O

Si

O

O

O

Si

O

O

O

Si

OH

OH

O OH

Si

OH

OH

O OH

CH3

N

OH

H

OH

H

OH

H

COOH OH

H

CH3

N

OH

H

COOH

CH3

N

CH3

N

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

CH3

N

COOH

OH

H


Elutionskraft

+ Modifikation

durch unter-

schiedlich star-

ke Eluenten

oder deren

Mischungen

100% MeCN

80% MeCN

60% MeCN

50% MeCN

40% MeCN

45% MeCNmin.



Elution

Isokratische ElutionZusammensetzung der mobilen Phase bleibt konstant

+ Vorteile

• Keine Equilibrierungszeit

• Keine Störungen durch Verunreinigun-gen in Lösungsmitteln

• Bei allen Detektoren anwendbar

+ Nachteile

• schlechte Auflösung der früh elu-

ierenden Substanzen

• zunehmende Breite und abnehmen-

de Höhe der spät eluierenden Peaks

• Lange Analysenzeiten bei einem

großen k’-Bereich

• Säulenverunreinigung durch stark

retardierte Probenbestanteile

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 min

0

10

20

30mAU % MeCN


Elution

GradientenelutionZusammensetzung der mobilen Phase ändert sich

+ Vorteile• verbesserte Auflösung

• Höhere Empflindlichkeit

(aufgrund schmalerer,

höherer Peaks)

• Trennung komplexer Proben

möglich

• Vermeidung von ‘verschlepp-

ten Substanzpeaks’ durch

stark retardierte Matrix-

bestandteile

isokratisch

Gradient


Elution

+ Nachteile• nicht anwendbar bei RI- und (den meisten) elektrochemischen Detektoren

• nach Abschluss des Gradienten ist eine Equilibrierung der Säule

erforderlich

• Verunreinigungen in Eluenten führen zu einer

→ Ansteigen oder Abfallen

der Basislinie

→ ‘Geisterpeaks’ im Blind-

chromatogramm

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 min

0

20

40

60

80mAU % MeCN

Peaks aus Eluentenverunreinigungen aus einem

‚Blindlaufaus: Agilent -Trainingsmaterialien


Elution

Steilheit des

Gradienten+ Verbesserung

der Auflösung

+ Verkürzung der

Analysendauer

0 10 20 30 40min.

100% B

100% B

0% B

0% B

tG = 40

tG = 20

100% B

0% B

tG = 10

0 10 20 30 40min.

100% B

100% B

0% B

0% B

tG = 40

tG = 20

0 10 20 30 40min.

100% B

100% B

0% B

0% B

tG = 40

tG = 20

100% B

0% B

tG = 10

100% B

0% B

tG = 10



RP-HPLC

Temperatureinfluss

Erhöhte Temperatur führt

+ zu verringerten

Retentionszeiten

+ einem verminderten System-

druck (Abnahme der Viskosi-

tät)

+ Zu einer höheren Belastung

der Analyte und Säulen-

materialien

40C

100 5 min

65 C



RP-HPLC

pH-Einfluss+ Schwache Säuren/Basen liegen

in Abhängigkeit vom pH ionisiert

(-COO-, -NH3+) oder nicht

ionisiert (-COOH, -NH2) vor

+ Die ionisierten Formen eluieren

in der RP-HPLC deutlich früher

COOHCOOH

Benzoesäure (pKS=4,18) Sorbinsäure (pKs=4,76)

Aus: Th. Welsch



Ionenpaareffekt

Trennung von Basen+ Alkylsulfonate

+ Trifluoressigsäure (TFA)

+ Heptafluorbuttersäure (HFTBA)

+ Hexanesulfonsäure

Trennung von Säuren+ Quaternäre Alkyltriethylamine

+ Triethylamin (TEA)

+ Tetramethylammoniumphosphat (TMA)

+ Tetrabutylammoniumphosphat (TBA)

+ Triethylammoniumacetat (TEAA)

+ Nonylamine

SO3

SO3 N

R

R

R

H+

Na+

Bonded Phase Ion-Pair Reagent

Sample

N+

N+

O C R

O

H2PO4


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HPLC-Anlage - Übersicht - chm.tu-dresden.de · Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 1 HPLC-Anlage - Übersicht Pumpe 70 mbar Eluenten Entgaser Gradienten-mischer