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Identifizierung und Charakterisierung
von Genen mit spezieller Funktion
in der Skelettentwicklung
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Melanie Grosch
aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 16.05.2012 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Winterpacht Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Robert Slany
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ............................................................................. 1
1 Summary ............................................................................................. 3
2 Einleitung ............................................................................................ 5
2.1 Skelettentwicklung ............................................................................................... 5
2.1.1 Enchondrale Ossifikation von Röhrenknochen ............................................ 6
2.1.2 Desmale Ossifikation ..................................................................................... 8
2.2 Angeborene und erworbene Skelettdefekte ..................................................... 8
2.3 Ursachen von Skeletterkrankungen .................................................................. 9
2.3.1 ER-Stress ...................................................................................................... 10
2.3.2 Das Zentrosom.............................................................................................. 11
2.3.3 Zilien ............................................................................................................. 12
2.3.4 Selenoproteine .............................................................................................. 14
2.4 Zielsetzung ........................................................................................................... 16
3 Ergebnisse ......................................................................................... 17
3.1 Suche nach der genetischen Ursache der SEMD-JL Typ Hall ................... 17
3.1.1 Patientenbeschreibung und Stammbaum .................................................... 17
3.1.2 Homozygotie-Kartierung ............................................................................. 19
3.1.3 Sanger-Sequenzierung von Kandidatengenen ............................................ 21
3.1.3.1 Gruppe A: Gene mit bekannter Funktion bei der Skelettentwicklung ............ 21
3.1.3.2 Gruppe B: unbekannte Gene ......................................................................... 22
3.1.3.3 Gruppe C: in ATDC5-Zellen differentiell exprimierte Gene.......................... 22
3.1.4 Next Generation Sequencing ....................................................................... 23
3.1.5 Bioinformatische Analysen ......................................................................... 25
3.1.6 Expression der betroffenen NIN- und POLE2-Isoformen ......................... 27
3.1.7 Subzelluläre Lokalisation ............................................................................ 28
3.2 Funktionelle Analysen von Selenoprotein M und dessen Rolle in der
Skelettentwicklung ..............................................................................................30 3.2.1 Gen- und Proteinstruktur ............................................................................. 30
3.2.2 Expressionsanalysen von selm im Huhn..................................................... 31
3.2.3 Expressionsanalysen von Selm in der Maus ............................................... 38
3.2.4 Generierung einer Selm-Knockout-Maus ................................................... 41
3.2.4.1 Nachweis des Knockouts .............................................................................. 41
Inhaltsverzeichnis II
3.2.4.2 X-Gal-Färbung ............................................................................................. 42
3.2.5 Charakterisierung der Selm-Knockout-Maus ..............................................44
3.2.5.1 Genotypenverteilung .................................................................................... 44
3.2.5.2 Morphologische und Histologische Untersuchungen..................................... 44
3.2.6 Regulation der Selm-Expression durch die Unfolded Protein Response...47
3.2.7 Promotoranalyse von Selm ...........................................................................48
3.2.8 Regulation des Selm-Promotors durch XBP1 .............................................50
3.2.9 Suche nach Interaktionspartnern mittels Yeast-two-Hybrid-System .........52
3.2.9.1 Generierung der Köder-Konstrukte............................................................... 53
3.2.9.2 Autotransaktivierungstest der Köder............................................................. 53
3.2.9.3 Nachweis der Fusionsproteine mittels Western Blot ..................................... 54
3.2.9.4 Screening auf Interaktionspartner ................................................................. 55
4 Diskussion ......................................................................................... 59
4.1 Suche nach der genetischen Ursache der SEMD-JL Typ Hall ....................60 4.1.1 Diagnose und Art der Vererbung .................................................................60
4.1.2 Funktion der Proteine NIN und POLE2 ......................................................61
4.1.2.1 POLE2 ......................................................................................................... 61
4.1.2.2 NIN ............................................................................................................. 62
4.2 Funktionelle Analysen von Selenoprotein M und dessen Rolle in der
Skelettentwicklung .............................................................................................. 65 4.2.1 Expressionsstudien ........................................................................................65
4.2.2 Möglicher Zusammenhang von SELM mit der UPR .................................67
4.2.2.1 Die Rolle der UPR bei der Skelettentwicklung ............................................. 69
4.2.2.2 Mit der UPR assoziierte Skeletterkrankungen ............................................... 70
4.2.3 Generierung und phänotypische Analyse von Selm-/--Mäusen ..................71
4.2.3.1 Mögliche Kompensation durch andere Selenoproteine .................................. 71
4.2.3.2 Einfluss des Selenstatus auf die Synthese der Selenoproteine........................ 72
4.2.3.3 Die Rolle von ER-Stress in der Pathogenese verschiedener Krankheiten ....... 75
5 Material und Methoden .................................................................. 79
5.1 Isolierung von Nukleinsäuren ...........................................................................79 5.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien ...............................................79
5.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen .....................................................79
5.1.3 DNA-Isolation aus Gewebe..........................................................................79
5.1.4 DNA-Isolation aus Mausschwänzen ............................................................80
5.1.5 RNA-Isolation aus Geweben ........................................................................80
5.1.6 RNA-Isolation aus Zellkultur .......................................................................80
5.1.7 Photometrische Bestimmung der DNA- und RNA-Konzentration ...........80
Inhaltsverzeichnis III
5.2 DNA- und RNA-Standardmethoden ............................................................... 81
5.2.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen .................................. 81
5.2.2 Agarose-Gelelektorphorese von DNA- und RNA-Fragmenten ................ 81
5.2.3 PAA-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten ........................................ 81
5.2.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ................................. 81
5.2.5 Aufreinigung von DNA/RNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion ...... 81
5.2.6 Fällung von DNA ......................................................................................... 82
5.2.7 Fällung von RNA ......................................................................................... 82
5.2.8 Southern Blot-Analysen ............................................................................... 82
5.3 Klonierung ........................................................................................................... 83 5.3.1 Klonierung von PCR-Produkten ................................................................. 83
5.3.2 Ligation ......................................................................................................... 83
5.3.3 Transformation von Bakterien..................................................................... 83
5.3.4 Selektion positiver Klone ............................................................................ 83
5.4 Gerichtete Mutagenese ...................................................................................... 84
5.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ............................................................... 84
5.5.1 Semiquantitative PCR .................................................................................. 84
5.5.2 Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)....................................................... 84
5.6 Quantitative Real-Time PCR (qPCR) ............................................................. 85
5.6.1 Prinzip der qPCR .......................................................................................... 85
5.6.2 Durchführung ............................................................................................... 86
5.6.3 Analyse der qPCR-Daten ............................................................................. 86
5.7 Sequenzierung von DNA ................................................................................... 87 5.7.1 Aufreinigung von PCR-Produkten für die Sequenzierung ........................ 87
5.7.2 Sequenzierreaktion und Aufreinigung ........................................................ 87
5.7.3 Sequenzanalyse und Auswertung ................................................................ 87
5.8 Protein-Techniken .............................................................................................. 88
5.8.1 Isolierung von Proteinen aus Zellkultur...................................................... 88
5.8.2 Isolierung von Proteinen aus Hefen ............................................................ 88
5.8.3 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford .............................. 88
5.8.4 Western Blot ................................................................................................. 89
5.8.5 Immunzytologie............................................................................................ 90
5.9 Histologische Färbungen ................................................................................... 90 5.9.1 Paraffineinbettung von Gewebe .................................................................. 90
5.9.2 Anfertigen von Gewebeschnitten ................................................................ 90
5.9.3 HE-Färbung .................................................................................................. 90
5.9.4 Azan-Färbung ............................................................................................... 91
5.10 X-Gal-Färbung ................................................................................................... 91
5.11 Skelettfärbung..................................................................................................... 91
Inhaltsverzeichnis IV
5.12 RNA in situ Hybridisierung ...............................................................................92
5.12.1 Generierung DIG-markierter RNA Sonden.................................................92
5.12.2 Prähybridisierung ..........................................................................................92
5.12.3 Hybridisierung ...............................................................................................92
5.12.4 Posthybridisierung ........................................................................................93
5.12.5 Detektion .......................................................................................................93
5.13 Zellkultur ..............................................................................................................93 5.13.1 Primäre Osteoblasten ....................................................................................93
5.13.2 Micromass culture.........................................................................................94
5.13.3 Kultur von adhärent wachsenden Zellen .....................................................94
5.13.4 Passagieren von Kulturen .............................................................................95
5.13.5 Einfrieren und Auftauen von Kulturen ........................................................95
5.13.6 Transfektion eukaryotischer Zellen .............................................................95
5.13.7 Luziferase-Assay ...........................................................................................95
5.14 Mauszucht ............................................................................................................96 5.15 Yeast-two-Hybrid-System ....................................................................................96
5.15.1 Transformation der Hefen ............................................................................96
5.15.2 Mating haploider Hefestämme .....................................................................97
5.15.3 Ermittlung der Matingeffizienz ....................................................................98
5.15.4 Verifizierung potentieller Interaktionspartner .............................................98
5.16 In silico-Analysen ................................................................................................98
5.17 Reagenzien und Materialien ..............................................................................99 5.17.1 Puffer und Lösungen .....................................................................................99
5.17.2 Vektoren ..................................................................................................... 104
5.17.3 Antikörper................................................................................................... 104
5.17.4 Bakterien und Medien................................................................................ 104
5.17.5 Zellkulturmedien und -zusätze .................................................................. 105
5.17.6 Hefen und Medien ...................................................................................... 105
5.17.7 Enzyme, Molekulargewichtstandards, Chemikalien ............................... 106
5.17.8 Kits .............................................................................................................. 109
5.17.9 Materialien .................................................................................................. 109
5.17.10 Geräte .......................................................................................................... 110
5.17.11 Synthetische Oligonukleotide ................................................................... 111
6 Literaturverzeichnis ...................................................................... 133
7 Anhang............................................................................................. 157
7.1 mRNA-Sequenz von selm im Huhn ............................................................... 157
7.2 Abbildungsverzeichnis..................................................................................... 159
7.3 Tabellenverzeichnis.......................................................................................... 161
Inhaltsverzeichnis V
7.4 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 162
7.5 Danksagung ....................................................................................................... 165
7.6 Lebenslauf.......................................................................................................... 166
7.7 Veröffentlichungen ........................................................................................... 167
1 Zusammenfassung
Das Skelett besteht aus über 200 unterschiedlichen und einzigartig geformten Knochen,
für deren Bildung und Homöostase ein komplexes regulatorisches Netzwerk notwendig
ist, dessen einzelne Komponenten bisher nur zum Teil bekannt sind. Genetische Studien
von Skeletterkrankungen und Untersuchungen am Tiermodell können dazu beitragen,
diese hochkomplexen Prozesse besser zu verstehen, neue Gene zu identifizieren und
deren Rolle während der Skelettentwicklung näher zu charakterisieren.
Dementsprechend wurden hierzu in der vorliegenden Arbeit zwei unterschiedliche
Strategien verfolgt.
Zum einen wurde die genetische Ursache der Spondylo-epi-metaphysären Dysplasie
(SEMD) mit Gelenkschwäche (joint laxity) und Leptodaktylie (SEMD-JL Typ Hall) in
einer konsanguinen Familie untersucht. Dabei wurde mittels Homozygotie-Kartierung
eine 8 Mb und 64 annotierte Gene umfassende Kandidatenregion auf Chromosom 14
(14q22.1 bis 14q23.1) identifiziert. Dies ist der erste kartierte Lokus für die SEMD-JL.
Nach Priorisierung und Kategorisierung der Kandidatengene konnte durch Sanger-
Sequenzierung eine Mutation (c.6345A>G) in Ninein (NIN), die zu einem Austausch
einer hoch konservierten Aminosäure (p.N2082D) führt, identifiziert werden. Um diese
Mutation zu bestätigen, wurde mittels Next Generation Sequencing das komplette Exom
der Indexpatientin sequenziert. Dabei wurde neben der NIN-Mutation noch eine zweite
Mutation (c.283C>T) in der Polymerase epsilon Untereinheit 2 (POLE2) innerhalb der
Kopplungsregion gefunden, die ebenfalls zu einem Austausch einer hochkonservierten
Aminosäure (p.P95S) führt. Beide Mutationen segregieren mit der Erkrankung. Obwohl
die funktionellen Analysen keinen direkten Hinweis auf die Ursächlichkeit einer der
beiden Mutationen für die Erkrankung ergaben, sprechen die bioinformatischen
Analysen zusammen mit Daten aus der Literatur jedoch dafür, dass die Mutation im
zentrosomalen Protein NIN die ursächliche Mutation in der vorliegenden Familie mit
SEMD-JL Typ Hall darstellt. Darüber hinaus ist dies ein erster Hinweis auf eine
Verbindung von Ninein mit der Skelettentwicklung.
Zum anderen wurde das Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert. Es konnte
gezeigt werden, dass Selm während der Entwicklung besonders stark in Knochen und
Sehnen exprimiert wird. Dabei wurde in den Knochen eine signifikante Co-Expression
mit Osteocalcin (Bglap) und Typ I Kollagen (Col1a1) und in Sehnen mit Scleraxis (Scx)
und Tenomodulin (Tnmd) nachgewiesen. Dies spricht für eine Expression in
Osteoblasten und Tenozyten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass SELM in
Osteoblasten in die Unfolded Protein Response (UPR) involviert ist und ein Zielgen von
XBP1(s) darstellt. Zusammen mit Daten aus der Literatur und der potentiellen
1 Zusammenfassung 2
Interaktion mit der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) sprechen die Ergebnisse dieser
Arbeit dafür, dass SELM eine Rolle bei der Faltung und Prozessierung sekretorischer
(Matrix-)Proteine während der Skelettentwicklung spielen könnte.
1 Summary
A complex regulatory network is responsible for the formation and homeostasis of more
than 200 different and uniquely shaped bones of the skeleton. However, the underlying
genes and mechanisms have only partly been elucidated yet. Genetic studies of skeletal
diseases and analyses of animal models may contribute to a better understanding of
these highly complex processes and may help to identify and further characterize genes
involved in skeletal development. Thus, two different strategies were used in the present
dissertation.
On the one hand, I analyzed the genetic cause of the spondylo-epi-metaphyseal
dysplasia (SEMD) with joint laxity and leptodactyly (SEMD-JL Hall type) in a
consanguineous family. Homozygosity mapping revealed an 8 Mb candidate region on
chromosome 14 (14q22.1 - q23.1) comprising 64 annotated genes. This is the first
report of a genetic locus for SEMD-JL. After ranking of candidate genes I could
identify a mutation (c.6345A>G) in ninein (NIN) leading to the substitution of a highly
conserved amino acid (p.N2082D) using Sanger sequencing. To verify this mutation,
the whole exome of the index patient was sequenced using Next Generation
Sequencing. In addition to the NIN mutation I found a second mutation (c.283C>T)
within the linkage region, namely in the polymerase epsilon subunit 2 (POLE2) gene,
which also leads to the substitution of a highly conserved amino acid (p.P95S). Both
mutations segregate with the disease phenotype. Although the functional analyses could
not link any of the mutations directly with the disease, bioinformatics analyses together
with data from the literature indicate that the mutation in the centrosomal protein NIN is
the causative mutation in the presented family with SEMD-JL Hall type. In addition,
this may point to a possible role of ninein in skeletal development.
On the other hand, selenoprotein M (SELM) was functionally characterized. I could
show that Selm is prominently expressed in bones and tendons during development. A
significant coexpression of Selm with osteocalcin (Bglap) and type I collagen (Col1a1)
in bones, and with scleraxis (Scx) and tenomodulin (Tnmd) in tendons could be
detected revealing expression in osteoblasts and tenocytes, respectively. Moreover, I
showed that SELM is involved in the Unfolded Protein Response (UPR) in osteoblasts
and a target gene of XBP1(s). Together with data from the literature and a potential
interaction with the protein disulfide isomerase (PDI) these results indicate that SELM
could play a role in the correct folding and processing of secretory (matrix) proteins
during development.
1 Summary 4
2 Einleitung
Die Bildung des Skeletts ist ein komplexer Prozess, der durch eine Vielzahl von
Faktoren reguliert wird. Längst nicht alle daran beteiligten Mechanismen und Gene sind
bisher aufgeklärt worden. Um Defekte bei Bildung, Wachstum und Homöostase des
Skeletts besser diagnostizieren zu können und Strategien zur Prävention und Therapie
von Knorpel- und Knochenerkrankungen zu entwickeln, ist es wichtig, neue Gene, die
an der Knorpel- und Knochenentwicklung beteiligt sind, zu identifizieren.
2.1 Skelettentwicklung
Das Skelett besteht aus über 200 Knochen, die je nach Lage und Funktion viele
unterschiedliche und einzigartige Formen haben (Karsenty und Wagner, 2002). Sie
erfüllen eine wichtige Stützfunktion, schützen lebenswichtige Organe und sind
verantwortlich für das Längenwachstum des Körpers. Darüber hinaus sind sie auch der
Ort der Blutbildung und spielen eine wichtige Rolle in der Kalziumhomöostase (Zelzer
und Olsen, 2003). Knochen bestehen zu 20% aus Wasser, 45% aus anorganischen
Bestandteilen (vor allem Hydroxylapatit) und zu 35% aus organischer Matrix. Die
organischen Anteile bestehen zu 90% aus Kollagen Typ I und zu 10% aus
Proteoglykanen und einigen anderen nicht-kollagenen Proteinen wie z. B. Osteocalcin
(BGLAP), Osteonectin (SP ARC) und Osteopontin (SPP1) (Carter und Beaupré, 2007).
Die Skelettentwicklung ist ein komplexer Prozess, der sich aus mehreren Phasen
zusammensetzt. Während der ersten Phase – der Musterbildung – kondensieren
mesenchymale Zellen und bilden ein Modell des zukünftigen Knochens. Darauf folgt
die Phase der Morphogenese, in der es zur Gestalt- und Formbildung der einzelnen
Skelettelemente kommt. Dabei differenzieren die mesenchymalen Vorläuferzellen zu
Chondrozyten bzw. Osteoblasten und es kommt zur Einwanderung von Blutgefäßen in
die resultierenden Knorpel- bzw. Knochengewebe. Den Abschluss bildet die Phase der
Homöostase, in der die Knochensubstanz durch Osteoblasten und -klasten
kontinuierlich auf- und abgebaut, ihre Form und Größe im Wesentlichen aber nicht
mehr verändert wird (Zelzer und Olsen, 2003). Osteoklasten stammen im Gegensatz zu
den Osteoblasten nicht von mesenchymalen Zellen, sondern von hämatopoetischen
Stammzellen ab (Murakami et al., 2004).
Grundsätzlich kann man zwei Arten der Knochenentwicklung unterscheiden: Das
Axial- und Extremitätenskelett wird zuerst als Knorpelmodell angelegt, das nach einer
Reihe von Proliferations- und Differenzierungsschritten schließlich durch Knochen
ersetzt wird („Ersatzknochenmodell“). Dieser Prozess wird enchondrale Ossifikation
2 Einleitung 6
genannt. Im Gegensatz dazu differenzieren bei der desmalen (intramembranösen)
Ossifikation kondensierte mesenchymale Zellen direkt zu Osteoblasten, welche die
Knochenmatrix aufbauen. Diese Form der Knochenentwicklung spielt vor allem bei der
Bildung kraniofazialer Skelettelemente und der Clavicula eine Rolle (Epstein et al.,
2004).
An der Regulation der Skelettentwicklung ist eine Vielzahl von Signalwegen beteiligt.
Dazu zählt der FGF-, TGFβ-, BMP-, Wnt-, Notch- und Hedgehog-Signalweg
(Kobayashi und Kronenberg, 2005). Abb. 2.1 zeigt einen Überblick über wichtige
Prozesse und Faktoren, die an der Differenzierung von Chondrozyten, Osteoblasten und
Osteoklasten beteiligt sind.
Abb. 2.1: Differenzierung von Chondrozyten, Osteoblasten und Osteoklasten. Chondrozyten und Osteoblasten stammen von gemeinsamen mesenchymalen Vorläuferzellen ab. Während der enchondralen Ossifikation kondensieren mesenchymale Zellen und differenzieren zu Chondrozyten. Anschließend proliferieren die Chondrozyten und differenzieren weiter über säulenbildende zu hypertrophen Chondrozyten. Die terminale Differenzierung wird dabei durch Runx2 induziert. Runx2 ist außerdem genau wie Osx essentiell für die Osteoblastendifferenzierung sowohl während der enchondralen als auch der desmalen Ossifikation. Osteoklasten sind hämatopoetischer Abstammung. Ihre Differenzierung wird ebenfalls durch eine Reihe externer Stimuli reguliert. Wichtige Transkriptionsfaktoren sind in schwarz dargestellt, Signalmoleküle in blau (nach (Kobayashi und Kronenberg, 2005)).
2.1.1 Enchondrale Ossifikation von Röhrenknochen Eine schematische Übersicht über die enchondrale Ossifikation ist in Abb. 2.2
dargestellt. Den ersten Schritt stellt die SOX9-vermittelte Kondensation mesenchymaler
Zellen und deren Differenzierung zu Chondrozyten dar (Lefebvre und Smits, 2005).
Diese beginnen zu proliferieren und sezernieren Bestandteile der extrazellulären Matrix,
2 Einleitung 7
v.a. Kollagen Typ II, IX und XI und Proteoglykane wie Aggrecan (ACAN) (Epstein et
al., 2004). Um die Knorpelanlage herum bildet sich das Perichondrium, das aus
undifferenzierten mesenchymalen Zellen besteht (Karsenty und Wagner, 2002;
Kronenberg, 2003). Anschließend beginnt die Differenzierung zu hypertrophen
Chondrozyten, die durch die Expression von Kollagen Typ X charakterisiert sind
(Lefebvre und Smits, 2005). Terminal differenzierte, hypertrophe Chondrozyten werden
von einer mineralisierten extrazellulären Matrix umgeben, bevor sie in die Apoptose
übergehen. Diese Matrix, die auch VEGF (Vascular endothelial growth factor) enthält,
ist dann verantwortlich für die Einwanderung von Blutgefäßen, durch die wiederum
Osteoblasten sowie Osteo- bzw. Chondroklasten und hämatopoetische Zellen in die
Matrix einwandern (Karsenty und Wagner, 2002). Es kommt zur Resorption der
Knorpelmatrix durch Osteo- bzw. Chondroklasten und zum Aufbau der
Knochensubstanz durch Osteoblasten. So entsteht in der Diaphyse ein primäres
Ossifikationszentrum. In den Epiphysen entstehen postnatal sekundäre
Ossifikationszentren. Die Wachstumsfuge, der Bereich zwischen primärem und
sekundärem Ossifikationszentrum, in dem der Knorpel bis zum Ende der Pubertät
erhalten bleibt, ist für das Längenwachstum der Röhrenknochen verantwortlich. Hier
spielen sich die eben beschriebenen Vorgänge nochmals in räumlich und zeitlich
geordneter Form ab.
Abb. 2.2: Enchondrale Ossifikation von Röhrenknochen. Mesenchymale Zellen kondensieren und differenzieren zu Chondrozyten (A). Diese proliferieren und beginnen zu differenzieren (B). Um die Knorpelanlage herum bildet sich aus undifferenzierten mesenchymalen Zellen das Perichondrium. Chondrozyten im Zentrum der Diaphyse hypertrophieren und mineralisieren die extrazelluläre Matrix bis sie apoptotisch werden (C). In die so entstandenen Lakunen wandern Blutgefäße ein, durch die Osteoblasten, Osteoklasten und Knochenmarkzellen in das Gewebe gelangen. Osteoklasten resorbieren den Knorpel, Osteoblasten ersetzen ihn durch Knochensubstanz. Es bildet sich ein primäres Ossifikationszentrum (D, E). An den Epiphysen entstehen schließlich sekundäre Ossifikationszentren. Das Längenwachstum der Röhrenknochen wird durch die Wachstumsfuge reguliert, die zwischen primären und sekundären Ossifikationszentren liegt (F) (verändert nach (Gilbert und Singer, 2006)).
2 Einleitung 8
2.1.2 Desmale Ossifikation Im Gegensatz zur enchondralen Ossifikation differenzieren die mesenchymalen
Vorläuferzellen bei der desmalen Ossifikation direkt zu Osteoblasten, ohne dass vorher
ein Knorpelmodell des Knochens angelegt wird.
Auch hier steht zu Beginn die Kondensation von mesenchymalen Zellen, deren
Differenzierung zu Osteoblastenvorläufern hauptsächlich durch RUNX2, einem für die
Osteoblastendifferenzierung essentiellen Transkriptionsfaktor (Komori, 2005), reguliert
wird. Anschließend differenzieren diese zuerst zu Prä-Osteoblasten, dann zu reifen
Osteoblasten und exprimieren Osteoblasten-spezifische Gene wie z.B. BGLAP und
SPP1 (Nakashima und de Crombrugghe, 2003). Die Hauptaufgabe von Osteoblasten ist
die Bildung von Knochenmatrix (Osteoid), die später mineralisiert wird, um neuen
Knochen zu bilden. Dafür haben sie ein gut entwickeltes raues endoplasmatisches
Retikulum und einen ausgeprägten Golgi-Apparat (Palumbo, 1986). Zu den von
Osteoblasten sezernierten Osteoidbestandteilen gehören z.B. Typ I Kollagen,
Osteocalcin und Enzyme wie die Alkalische Phosphatase (Nakashima und de
Crombrugghe, 2003). Die knochenaufbauenden Osteoblasten werden schließlich in die
mineralisierte Knochenmatrix als Osteozyten integriert (Franz-Odendaal et al., 2006).
Alternativ können Osteoblasten auch zu ruhenden Oberflächenzellen, den sogenannten
„ bone lining cells“ differenzieren, welche die inaktiven Bereiche der
Knochenoberfläche bedecken. Es handelt sich dabei um flache, dem Knochen
aufsitzende Zellen, die zum Einen die Ernährung der Osteozyten unterstützen, zum
Anderen der Trennung von Knochenkompartimenten und der Osteoklastenaktivierung
dienen (Miller und Jee, 1987; Sims und Gooi, 2008; Rochefort et al., 2010).
2.2 Angeborene und erworbene Skelettdefekte
Knochenentwicklung und -wachstum stellen komplex regulierte Prozesse dar, wobei in
jedem Entwicklungsstadium Fehler auftreten können, die zu Skelettanomalien führen.
Das Spektrum dieser Fehlbildungen reicht von lokalen Deformationen oder Verlusten
einzelner Skelettelemente (Dysostosen) bis hin zu generalisierten Fehlbildungen
(Osteochondrodysplasien), die isoliert oder als Teil von komplexen Syndromen
auftreten können (Zelzer und Olsen, 2003). Die einzelnen Erkrankungen sind dabei
meist sehr selten, insgesamt sind Skeletterkrankungen jedoch weit verbreitet (Ikegawa,
2006). Nach neuester Klassifizierung gibt es 456 verschiedene genetische
Skeletterkrankungen, die aufgrund klinischer, radiologischer und molekularer Befunde
in 40 Gruppen unterteilt werden können (Warman et al., 2011). Eine dieser Gruppen
stellen die Spondylo-epi-(meta)physäre Dysplasien (SE(M)Ds) dar. SE(M)Ds sind
Skelettdysplasien, die durch vertebrale, epiphysäre und evtl. metaphysäre Fehlbildungen
2 Einleitung 9
gekennzeichnet sind. Gemeinsames Hauptmerkmal ist dabei ein disproportionierter
Kleinwuchs (Cormier-Daire, 2008).
Neben den angeborenen Skeletterkrankungen gibt es eine Vielzahl erworbener
Erkrankungen des Skelettsystems. Dazu zählen Verschleißerkrankungen wie
Osteoarthrose, durch Störungen des Kalzium-Phosphat-Stoffwechsels verursachte
Erkrankungen wie Osteoporose als auch Defekte, die durch einen Mangel an
Spurenelementen verursacht werden, wie z.B. die Kashin-Beck-Krankheit (KBD) (Yang
et al., 1988; Bijlsma et al., 2011; Vilela und Nunes, 2011). Bei KBD handelt es sich um
eine destruktive Osteoarthropathie mit Kleinwuchs, die endemisch in Nordchina,
Sibirien, Tibet und Nordkorea auftritt, und u.a. im Zusammenhang mit Selenmangel
diskutiert wird (Moreno-Reyes et al., 1998; Sudre und Mathieu, 2001).
2.3 Ursachen von Skeletterkrankungen
Neben den klassischen Entwicklungs-Signalwegen (FGF-, TGFβ-, BMP-, Wnt-, Notch-
und Hedgehog-Signalweg) (Kobayashi und Kronenberg, 2005) wurden in den letzten
Jahren auch Mutationen in zahlreichen Bestandteilen der extrazellulären Matrix, sowie
in zentrosomalen und ziliären Komponenten identifiziert. So wurden z.B. Mutationen in
den ECM-Genen COMP (cartilage oligomeric matrix protein) und MATN3 (Matrilin 3)
bei Pseudoachondroplasie (PSACH) und multipler epiphysärer Dysplasie (MED), im
zentrosomalen Protein Pericentrin (PCNT) bei primordialem Kleinwuchs Typ Majewski
II (MOPD2) und im Ziliengen IFT80 (intraflagellar transport 80 homolog) bei Jeune-
Syndrom identifiziert (Briggs et al., 1995; Hecht et al., 1995; Briggs und Chapman,
2002; Beales et al., 2007; Rauch et al., 2008).
Wie oben bereits erwähnt, spielen neben den rein genetisch-bedingten
Skeletterkrankungen auch eine Kombination von genetischen und Umwelt- bzw.
Ernährungsfaktoren eine Rolle. So gibt es auch für die mit Selenmangel assoziierte
KBD Hinweise auf eine genetische Komponente. Zwei Assoziationsstudien konnten
Selenoproteine in Zusammenhang mit KBD bringen (Sun et al., 2010; Xiong et al.,
2010). Weitere Hinweise darauf, dass Selenoproteine bei der Pathogenese von KBD
eine Rolle spielen könnten, ergab eine Studie von Downey et al. im Mausmodell.
Mäuse die in Skelettelementen keine Selenoproteine produzieren konnten, zeigten einen
KBD-ähnlichen Phänotyp (Downey et al., 2009).
Im Folgenden sollen ER-Stress, das Zentrosom, Zilien und Selenoproteine näher
dargestellt werden, da es zahlreiche Hinweise darauf gibt, dass diese Komponenten eine
besonders bedeutende Rolle bei der Knorpel- und Knochenentwicklung und in der
Pathogenese von Skeletterkrankungen spielen.
2 Einleitung 10
2.3.1 ER-Stress Die korrekte Faltung von Proteinen ist essentiell für die Funktion des
endoplasmatischen Retikulums. Die Akkumulation ungefalteter oder fehlgefalteter
Proteine im ER führt zu ER-Stress, der wiederum zu einer verminderten Translation,
einer transkriptionellen Aktivierung von Chaperonen und Proteindegradierung führt
(Schroder und Kaufman, 2005). Diese Prozesse und damit assoziierte Signalwege
werden zusammen die „Unfolded Protein Response (UPR)“ genannt. Abb. 2.3 zeigt
eine Übersicht über die wichtigsten Faktoren der UPR.
In Vertebraten dienen drei ER-residente Transmembranproteine [inositol-requiring
protein-1 (IRE1), activating transcription factor-6 (ATF6) und PKR-like ER kinase
(PERK)] als proximale ER-Stress-Sensoren. Im inaktiven Zustand sind deren luminale
Domänen mit dem ER-Chaperon immunoglobulin heavy chain binding protein/glucose-
regulated protein of (BiP/GRP78) assoziiert, einem wichtigen Transducer der UPR.
Zu den frühen ER-Stress-Antworten gehört die schnelle Phosphorylierung von eIF2α
durch PERK und die damit verbundene Inhibierung der Translation (Harding et al.,
2001). Um die Faltung akkumulierter Proteine zu beschleunigen, trägt jeder der drei
proximalen ER-Stress-Sensoren zur Hochregulierung von UPR-Genen wie Chaperonen
und Oxidoreduktasen bei (Ellgaard und Helenius, 2003). Unter ER-Stress wird ATF6
gespalten und als Transkriptionsfaktor in den Kern transloziert. Eines seiner Zielgene ist
das X-box binding protein-1 (Xbp1), aus dessen mRNA ein 26 bp langes Intron durch
unkonventionelles IRE1-abhängiges Spleißen entfernt wird (Rutkowski und Kaufman,
2007). Die gespleißte Form von XBP1 [XBP1(s)] wiederum aktiviert als potenter
Transkriptionsfaktor UPR-Zielgene. Die Phosphorylierung von eIF2α durch PERK ist
nicht nur verantwortlich für die Inhibierung der Translation, sondern auch für die
präferentielle Translation von activating transcription factor 4 (ATF4), einem
Transkriptionsfaktor, der nur unter ER-Stress translatiert wird. Wenn falsch gefaltete
Proteine nicht mehr repariert werden können, werden sie ins Zytosol retrotransloziert
und anschließend in einem Prozess, der „ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD)“
genannt wird, degradiert (Lilley und Ploegh, 2004; Ye et al., 2004; Meusser et al.,
2005). Wenn all diese Mechanismen zur Reduzierung akkumulierter Proteine im ER
fehlschlagen, geht die Zelle schließlich in Apoptose über.
Erst kürzlich konnten Mutationen in Genen, die für Bestandteile der ECM codieren, in
Zusammenhang mit ER-Stress gebracht werden (Hecht et al., 1995; Briggs und
Chapman, 2002; Lisse et al., 2008). ER-Stress scheint auch in einer Reihe weiterer
Erkrankungen Bestandteil der Pathogenese zu sein (Boot-Handford und Briggs, 2010)
(vgl. auch 4.2.3.3).
2 Einleitung 11
Abb. 2.3: Wichtige Faktoren der Unfolded Protein Response. Die drei proximalen UPR-Transducer ATF6, IRE1 und PERK sind im inaktiven Zustand mit BiP assoziiert. Wenn ungefaltete oder fehlgefaltete Proteine im ER akkumulieren, kommt es zur Dissoziation von BiP und damit zur Aktivierung der drei Stress-Sensoren. ATF6 gelangt in den Golgi-Apparat, wo es durch S1P/S2P geschnitten wird. Das zytosolische Fragment wandert als Transkriptionsfaktor in den Kern. Zur gleichen Zeit oligomerisieren IRE1 und PERK und werden autophosphoryliert. Phosphoryliertes IRE1 katalysiert das Spleißen der XBP1 mRNA, da XBP1 nur in seiner gespleißten Form einen potenten Transkriptionsfaktor darstellt. Aktiviertes PERK phosphoryliert eIF2a, das wiederum zu einer generellen Verminderung der Translation führt, während es die Translation ausgewählter mRNAs mit spezifischen Elementen in der 5‘ UTR ermöglicht. Zu den Proteinen, die verstärkt synthetisiert werden gehört ATF4. Die downstream Effektoren dieser drei Signalwege induzieren die Expression von Genen, die für ER-Proteine codieren, die die Faltung akkumulierter Proteine beschleunigen sollen. Terminal fehlgefaltete Proteine werden über einen Prozess, der ERAD genannt wird, degradiert (aus (Wu und Kaufman, 2006)).
2.3.2 Das Zentrosom Das Zentrosom wird auch als Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) bezeichnet.
Es besteht aus zwei aufeinander senkrecht stehenden Zentriolen, die von einer
elektronendichten Matrix, dem perizentriolären Material (PCM), umgeben sind
(Sankaran und Parvin, 2006). Die beiden zylindrischen Zentriolen sind aus 9
radialsymmetrischen Mikrotubuli (MT)-Tripletts aufgebaut und entlang ihrer
proximodistalen Achse polarisiert (Bettencourt-Dias und Glover, 2007). Aufgrund ihrer
Ultrastruktur und ihres Alters lassen sich die Zentriolen eindeutig voneinander
unterscheiden. Das ältere Zentriol (Mutterzentriol) enthält distale und subdistale
Anhänge, die dem jüngeren Zentriol (Tochterzentriol), das im vorhergehenden
Zellzyklus gebildet worden ist, fehlen (Abb. 2.4) (Piel et al., 2000; Bettencourt-Dias
und Glover, 2007; Bornens, 2008; Nigg und Raff, 2009).
2 Einleitung 12
Die zentrosomalen Komponenten, die für die Ausbildung von MT-
Polymerisationskeimen verantwortlich sind, sind im PCM lokalisiert (Moudjou et al.,
1996; Tassin et al., 1998). Das wichtigste beteiligte Protein ist dabei γ-Tubulin, das in
einem ringförmigen Komplex mit weiteren Proteinen vorliegt, dem γ-Tubulin-
Ringkomplex (γ-TuRC). Dieser dient als Ausgangspunkt für die Bildung der polaren
Mikrotubuli aus ihren α- und β-Tubulin-Untereinheiten (Luders und Stearns, 2007).
Nach erfolgter Polymerisation der MTs im PCM, werden die MTs entweder ins
Zytoplasma entlassen oder an den subdistalen Anhängen des Mutterzentriols verankert.
Für die Verankerung am Zentrosom spielen neben dem γ-TuRC noch andere Proteine
eine Rolle (z.B. Ninein, Centriolin, Dynactin), die an den subdistalen Anhängen des
Mutterzentriols lokalisiert sind (Dammermann und Merdes, 2002; Delgehyr et al., 2005;
Luders und Stearns, 2007).
Darüber hinaus dient das Zentrosom als Basalkörper für Zilien. Die distalen Anhänge
des Mutterzentriols dienen dabei der Verankerung an der Plasmamembran (transition
fibres) (Hagiwara et al., 1997; Rohatgi und Snell, 2010). Man geht davon aus, dass die
transition fibres eine Art selektiven Filter oder Pore darstellen, die den Eintritt zellulärer
Proteine in das ziliäre Kompartiment reguliert (Rosenbaum und Witman, 2002). Dabei
werden strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit dem nukleären Porenkomplex
(NPC) diskutiert (Jekely und Arendt, 2006; Christensen et al., 2007).
Abb. 2.4: Aufbau des Zentrosoms. Schematische Darstellung (links) und Elektronenmikroskopische Aufnahme (rechts) des Zentrosoms. Das Zentrosom besteht aus zwei Zentriolen, die jeweils aus 9 Mikrotubuli-Tripletts aufgebaut sind und durch Fasern miteinander verbunden sind. Das Mutterzentriol unterscheidet sich durch seine distalen und subdistalen Anhänge vom Tochterzentriol. Die Zentriolen sind von einer elektronendichten Matrix, dem perizentriolären Material (PCM), umgeben (verändert nach (Doxsey, 2001; Azimzadeh und Marshall, 2010)).
2.3.3 Zilien Zilien sind 5-10 µm lange Zellfortsätze an der Zelloberfläche, welche einen
Durchmesser von 250 nm aufweisen. Grundsätzlich kann zwischen zwei Arten von
2 Einleitung 13
Zilien unterschieden werden: beweglichen (Kinozilien) und unbeweglichen (primäre)
Zilien (Abb. 2.5). Bewegliche Zilien sind durch eine sogenannte 9+2 Mikrotubuli-
Konfiguration gekennzeichnet. Dabei umgeben neun MT-Dubletten zwei einzeln
stehende MTs. Dieses zentrale MT-Paar ist wichtig für die Beweglichkeit der Zilien. Im
Gegensatz dazu fehlt primären Zilien, die auf fast jeder Körperzelle zu finden sind, das
zentrale MT-Paar (9+0 Konfiguration). Sie sind demzufolge unbeweglich. Eine
Ausnahme hierzu bilden die nodalen Zilien, die trotz 9+0 Konfiguration (eingeschränkt)
beweglich sind und für die Ausbildung der Links-Rechts-Achse in der frühen
Embryonalentwicklung verantwortlich sind (Basu und Brueckner, 2008).
Abb. 2.5: Schematischer Aufbau eines Ziliums. Zilien bestehen aus einem Mikrotubuli-basierten Axonem, das von der Zilienmembran umgeben ist. Neun radial angeordnete Mikrotubulipaare (9+0-Konfiguration bei primären Zilien, 9+2-Konfiguration bei beweglichen Zilien), deren Ursprung der Basalkörper (Mutterzentriol) ist, werden dabei über die distalen Anhänge an der Plasmamembran verankert. Zilienproteine gelangen gekoppelt an IFT-Partikel mittels Kinesin-II-Motor zur Zilienspitze (anterograder Transport) und mittels retrogradem Dynein-Motor zur Zilienbasis zurück (retrograder Transport) (verändert nach (Temiyasathit und Jacobs, 2010; Hu und Nelson, 2011)).
Da für die Skelettentwicklung insbesondere die primären Zilien wichtig sind, soll hier
näher auf diese eingegangen werden. Diese Zilien befinden sich auf fast allen nicht-
proliferierenden Zellen bzw. Zellen während der Interphase, so auch auf Chondrozyten
und Osteoblasten (Haycraft und Serra, 2008; Kaushik et al., 2009). Während der Mitose
wird das Zentrosom für die Ausbildung der Mitosespindeln gebraucht und steht zu
diesem Zeitpunkt nicht als Basalkörper für die Verankerung des primären Ziliums zur
Verfügung (Sharma et al., 2008). Da innerhalb des Ziliums keine Ribosomen lokalisiert
sind, werden alle Proteine, die für die Bildung und Aufrechterhaltung des primären
2 Einleitung 14
Ziliums gebraucht werden, aktiv dorthin transportiert. Dieser Transportmechansimus
wird „Intraflagellarer Transport (IFT)“ genannt. IFT ist ein bidirektionales
Transportsystem, das zwischen den MT-Dubletten des Axonems und der
Zilienmembran lokalisiert ist, durch das große Partikel (IFT-Partikel) von der
Zilienbasis zur –spitze und umgekehrt transportiert werden. Der anterograde Transport
wird hierbei durch Kinesin-II-Motorproteine und der retrograde Transport durch
zytoplasmatisches Dynein 2 bewerkstelligt (Pedersen et al., 2008). IFT ist ein
hochkonserviertes System und essentiell für die Bildung und Aufrechterhaltung des
Ziliums.
Man geht davon aus, dass das Zilium von Vertebraten bis zu 1000 unterschiedliche
Proteine für seine Funktion braucht (Gherman et al., 2006). Primäre Zilien spielen eine
wichtige Rolle während der Entwicklung und sind an der Fortleitung von mechanischen
und chemischen Signalen beteiligt (Pazour und Witman, 2003; Marshall und Nonaka,
2006; Singla und Reiter, 2006; Sloboda und Rosenbaum, 2007; Berbari et al., 2009;
Lancaster und Gleeson, 2009). Des Weiteren spielen sie eine wichtige Rolle in
verschiedenen Signaltransduktionswegen, wie dem Hedgehog (Hh)-, kanonischen und
nicht-kanonischen Wnt- und PDGFRα-Signalweg (Bisgrove und Yost, 2006;
Eggenschwiler und Anderson, 2007; Gerdes et al., 2009).
Defekte in der Bildung, Aufrechterhaltung oder Funktion der primären Zilien gelten als
Ursachen unterschiedlichster humaner Erkrankungen, die Ziliopathien genannt werden.
Deren klinische Symptome sind sehr variabel (sogar innerhalb einer Familie) und
können nahezu jedes Organsystem betreffen. So kann es z.B. zu Nierenzysten,
Retinadegeneration, Gehörverlust, Situs inversus, Polydaktylie und anderen
Skelettfehlbildungen kommen (vgl. 4.1.2.2). Oft führen dabei Mutationen in
zentrosomalen oder Zilien-Genen zu einem kompletten Zilien-Verlust oder fehlerhaftem
Zilienaufbau (Badano et al., 2006; Bergmann, 2011).
2.3.4 Selenoproteine Das essentielle Spurenelement Selen ist von großer Bedeutung für verschiedene
Stoffwechselwege, Schilddrüsenhormone, den Schutz der Zelle vor oxidativem Stress
und die intrazelluläre Redox-Homöostase (Fairweather-Tait et al., 2011).
Selen wird in Form der 21. Aminosäure Selenocystein (Sec) co-translational in Proteine
eingebaut. Beim Menschen sind bisher 25 (bei Nagetieren 24) solcher Selenoproteine
bekannt (Reeves und Hoffmann, 2009). Die 21. Aminosäure Sec wird durch das Codon
UGA codiert, das normalerweise als Stop-Codon fungiert. Ob das Nukleotid-Triplett
UGA in der mRNA zum Stopp der Translation oder zum Einbau von Sec in die
wachsende Polypeptidkette genutzt wird, hängt von dem Vorhandensein mehrerer cis-
und trans-aktiver Faktoren ab (Hatfield und Gladyshev, 2002), die in Abb. 2.6 A
2 Einleitung 15
schematisch dargestellt sind. So befindet sich in der Selenoprotein-mRNA ein
sogenanntes „Sec Insertionssequenz (SECIS)-Element“, eine Stammschleifenstruktur in
der 3‘ UTR (Berry et al., 1991; Copeland et al., 2000), die für die Rekrutierung des
SECIS-Bindeprotein 2 (SBP2) zuständig ist. Der Sec-spezifische
Translationselongationsfaktor EFSec wiederum bindet an SBP2 und rekrutiert die Sec-
tRNA. So wird Selenocystein in das aktive Zentrum des Proteins eingebaut.
Interessanterweise hängt die Sec-Biosynthese (Abb. 2.6 B) selbst von einem
Selenoprotein ab, dem Enzym Selenophosphat-Synthetase 2 (SEPHS2), das für die
Bildung des Selendonors Monoselenphosphat verantwortlich ist (Itoh et al., 2009). Die
für den Einbau von Sec verantwortliche tRNA, auch Sec-tRNA[Ser]Sec genannt (Lee et
al., 1989), wird zu Beginn durch die Seryl-tRNA-Synthetase mit Serin beladen, welches
anschließend durch die Phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec-Kinase phosphoryliert wird (Carlson
et al., 2004). Der Selendonor wird schließlich durch die Sec-Synthase auf die
Phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec übertragen, aus der nach Abspaltung des Phosphats die Sec-
tRNA[Ser]Sec entsteht, welche die Sec-Insertion vermittelt (Ganichkin et al., 2008).
Die Funktion der meisten Selenoproteine ist bislang nur unzureichend erforscht. Es
konnte jedoch nachgewiesen werden, dass Selenoproteine essentiell für das Überleben
von Organismen mit Selenoproteomen sind. So sind Mäuse, in denen das Gen für die
Sec-tRNA[Ser]Sec genetisch deletiert wurde, embryonal letal (Bosl et al., 1997). Auch für
die Skelettentwicklung sind Selenoproteine essentiell. So führt der konditionale
Knockout der Sec-tRNA[Ser]Sec in Osteochondroprogenitorzellen zu
Wachstumsstörungen, Veränderung der Wachstumsfugen, verspätete Ossifikation und
Chondronekrosen des artikulären Knorpels (Downey et al., 2009).
Abb. 2.6: Einbau von Selenocystein in Selenoproteine. (A) Synthese von Selenoproteinen. Das SECIS-Element in der 3 ̀UTR (Stammschleife in rot) wird von SBP2 (hellblau) erkannt, das wiederum den Elongationsfaktor EFSec (grün) und die Sec-tRNA (gelb und hellgrün) rekrutiert. So wird das Stop-Codon UGA nicht als Translationsstopp, sondern zum Einbau von Selenocystein in das Protein genutzt (verändert nach (Berry, 2005)). (B) Selenocystein-Biosynthese. (verändert nach (Papp et al., 2007)).
2 Einleitung 16
2.4 Zielsetzung
Die an der Bildung und der Homöostase des Skeletts beteiligten Gene und
Mechanismen sind bisher nur zum Teil aufgeklärt. Um Skeletterkrankungen besser
diagnostizieren zu können und Strategien zur Prävention und Therapie von Knorpel-
und Knochenerkrankungen zu entwickeln, ist es wichtig, neue Gene/Proteine mit
spezieller Funktion in der Skelettentwicklung zu identifizieren und deren Rolle während
der Skelettentwicklung näher zu charakterisieren. Dazu wurden in der vorliegenden
Arbeit zwei unterschiedliche Strategien verfolgt.
Zum einen sollte die genetische Ursache der Spondylo-epi-metaphysären Dysplasie
(SEMD) mit Gelenkschwäche (joint laxity) und Leptodaktylie (SEMD-JL Typ Hall) in
einer konsanguinen Familie mittels Homozygotie-Kartierung und Sequenzierung von
Kandidatengenen identifiziert und mögliche funktionelle Konsequenzen näher
charakterisiert werden.
Zum anderen sollte das Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert werden, das
von Tagariello et al. (2005) im Rahmen eines Screenings nach skelettspezifischen
Transkripten identifiziert worden war. Um dessen Rolle während der
Skelettentwicklung näher zu untersuchen, sollten Expressionsanalysen am Huhn- und
Mausmodell durchgeführt, eine Knockout-Maus generiert und charakterisiert, die
Regulation der Genexpression analysiert und Interaktionspartner mittel Yeast-two-
Hybrid-System gesucht werden.
3 Ergebnisse
Skelettentwicklung und –Homöostase werden durch eine Vielzahl von Genen und
Mechanismen reguliert, die längst nicht alle aufgeklärt sind. Neben der
Charakterisierung neuer Gene und Genprodukte der Knorpel- und Knochenentwicklung
können auch genetische Studien von Erkrankungen, die die Bildung und das Wachstum
des Skelettsystems betreffen, neue Einblicke in die Rolle einzelner Gene bei diesen
komplexen Prozessen geben. Dementsprechend wurden in der vorliegenden Arbeit
zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen wurde die genetische Ursache der
SEMD-JL Typ Hall in einer konsanguinen Familie mittels Homozygotie-Kartierung und
Next Generation Sequencing untersucht (vgl. 3.1). Zum anderen wurde das
Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert, das von Tagariello et al. (2005) im
Rahmen eines EST-Projektes als Kandidatengen für die Skelettentwicklung beschrieben
worden war (vgl. 3.2).
3.1 Suche nach der genetischen Ursache der SEMD-JL Typ Hall
3.1.1 Patientenbeschreibung und Stammbaum
Die türkisch-stämmige Indexpatientin (Abb. 3.1 A, IV.1) wurde 1995 im Alter von 35
Jahren bei Frau Dr. Stephanie Spranger (Facharzt für Humangenetik, Bremen)
vorstellig. Klinische und radiologische Befunde umfassten auffällige epi- und
metaphysäre Veränderungen der Röhrenknochen, Kleinwuchs, Gelenkschwäche mit
häufigen Dislokationen, verzögerte Ossifikation der Handknochen, grazile
Metakarpalia, feine vertikale Streifen an den Metaphysen, Genu valgum und eine
schwere Skoliose (Abb. 3.1 B). Aufgrund dieser Symptome wurde bei der
Indexpatientin eine Spondylo-epi-metaphysäre Dysplasie (SEMD) mit Gelenkschwäche
(joint laxity) und Leptodaktylie (SEMD-JL Typ Hall) diagnostiziert. Dabei handelt es
sich um einen bestimmten Typ einer sehr heterogenen Gruppe von Skeletterkrankungen
(SEMD), denen die Kombination von vertebralen, epiphysären und metaphysären
Dysplasien gemein ist (Cormier-Daire, 2008). Die Familienanamnese ergab, dass außer
der Indexpatientin noch eine Schwester und zwei Cousinen zweiten Grades betroffen
sind. Alle vier Elternteile der Betroffenen sowie zwei Brüder und eine Schwester der
Indexpatientin sind gesund. Es handelt sich also um eine Familie mit 4 betroffenen
Individuen, deren Eltern Cousins und Cousinen ersten Grades sind (Abb. 3.1).
3 Ergebnisse 18
Aufgrund der Seltenheit der Erkrankung (25 Fälle weltweit) und der multiplen
Konsanguinität innerhalb der Familie muss von einer identischen vererbten Mutation
bei den Patienten ausgegangen werden. Da es keinen betroffenen Vorfahren der
Patienten gibt, ist eine autosomal rezessive Vererbung anzunehmen. Dies steht im
Gegensatz zu den bisher publizierten Fällen von SEMD-JL Typ Hall, bei denen von
einer autosomal dominanten Vererbung ausgegangen wird (Megarbane et al., 2003).
Die zu Grunde liegende Mutation bzw. das betroffene Gen sind jedoch bisher noch
unbekannt. Um die ursächliche Mutation zu finden, wurde die Konsanguinität der
Familie genutzt und eine Homozygotie-Kartierung durchgeführt.
Abb. 3.1: Stammbaum und Patientenbilder. (A) Stammbaum der betroffenen Familie. Betroffene sind mit einem schwarz ausgefüllten Symbol gekennzeichnet, die Indexpatientin zusätzlich mit einem Pfeil. Arabische Zahlen markieren die Personen, von denen DNA verfügbar war. (B) Röntgenbilder der Indexpatientin im Alter von 35 Jahren.
3 Ergebnisse 19
3.1.2 Homozygotie-Kartierung
Da es sich – wie bereits oben erwähnt – im vorliegenden Fall um eine sehr seltene
autosomal rezessiv vererbte Erkrankung in einer konsanguinen Familie handelt, kann
angenommen werden, dass das mutationstragende Allel von einem gemeinsamen
Vorfahren abstammt. Dabei wird nicht nur die Mutation weitergegeben, sondern auch
mit dem Krankheitslocus gekoppelte flankierende Marker. Chromosomenabschnitte, die
aufgrund der Konsanguinität homozygot vorliegen, werden auch als autozygot oder
abstammungsidentisch (identical by descent; IBD) bezeichnet. Die gezielte Suche nach
solchen homozygoten Haplotypen stellt den ersten Schritt zur Identifikation des
Krankheitslocus dar.
In der vorliegenden Arbeit wurde in Kooperation mit Dr. Dominik Seelow und Prof.
Peter Nürnberg (Max-Delbrück-Zentrum für Molekulare Medizin, Berlin) eine
Homozygotie-Kartierung mittels 10K-SNP-Arrays durchgeführt. Dabei wurde für die
multipoint Kopplungsanalyse die ALLEGRO-Software (Gudbjartsson et al., 2000;
Gudbjartsson et al., 2005) und für die two-point Kopplungsanalyse der
Kandidatenregionen zusätzlich MLINK (FASTLINK Software, Version 5.1) des
LINKAGE Pakets verwendet. In jedem Programm wurden ein autosomal rezessiver
Vererbungsmodus mit kompletter Penetranz und eine Krankheitsallelfrequenz von
0,001 gewählt. Die genomweite Kopplungsanalyse mit der DNA von vier betroffenen
(IV.1, IV.2, IV.6 und IV.7) und drei nicht-betroffenen (III.1, III.2 und III.4)
Familienmitgliedern ergab zwei homozygote Intervalle mit einem LOD-Score größer
als 3. Ein Bereich lag auf Chromosom 3 mit einem LOD-Score von 3,5 und der zweite
Bereich auf Chromosom 14 mit einem LOD-Score von 4,2 (Abb. 3.2).
Abb. 3.2: Genomweite parametrische multipoint LOD-Score Analyse. Auf der X-Achse sind die Chromosomen von p-ter nach q-ter und der genetische Abstand in cM dargestellt. Die Y-Achse zeigt den LOD-Score, der bei Chromosom 3 und 14 die Signifikanzschwelle von 3 überschreitet.
Zur Eingrenzung des genomischen Bereichs wurde von beiden Regionen mit den SNP-
Markern aus dem Array eine Haplotyp-Karte konstruiert. Weiterführende SNP-
3 Ergebnisse 20
Analysen zeigten aber, dass die Kopplungsregion auf Chromosom 3 heterozygote SNPs
enthielt, woraufhin diese als Kandidatenregion ausgeschlossen und im Folgenden nicht
mehr weiter analysiert wurde.
Abb. 3.3: Eingrenzung der Kopplungsregion auf Chromosom 14 durch Haplotypenanalyse. Dargestellt sind die Haplotypen des Elternpaares III.1 und III.2 sowie der 4 Betroffenen (IV.1, IV.2, IV.6 und IV.7). Zusätzlich sind auch die rekonstruierten Haplotypen des Elternpaares III.3 und III.4, deren DNAs für die Chip-Analyse nicht verwendet wurden, in schwarz dargestellt. Der chromosomale Bereich, der bei den Betroffenen homozygot vorliegt und mit der Erkrankung segregiert, ist in der Abbildung mit einem schwarzen Rahmen markiert. Die verschiedenen Farben stehen für unterschiedliche Haplotypenblöcke.
Abb. 3.3 zeigt die Haplotyp-Karte des kartierten Bereichs auf Chromosom 14. Die
flankierenden heterozygoten SNPs sind an Position 49.378.248 (rs1986410,
SNP_A_1514235) und 57.381.598 (rs950622, SNP_A_1516509) auf Chromosom
3 Ergebnisse 21
14q21.3 bis q22.3 lokalisiert. Die Kopplungsregion auf Chromosom 14 ist 8 Mb groß
und umfasst 64 annotierte Gene (Abb. 3.4; entsprechend GRCh37/hg19).
Abb. 3.4: Physikalische Karte der Kopplungsregion auf Chromosom 14. Schematische Darstellung von Chromosom 14, die Kopplungsregion (14q21.3 – q22.3) ist rot umrahmt. Darunter befindet sich eine Vergrößerung des Ausschnitts mit den darin enthaltenen 64 annotierten RefSeq-Genen (UCSC-Browser, hg19).
3.1.3 Sanger-Sequenzierung von Kandidatengenen Um die verursachende Mutation zu finden, sollten die 64 Kandidatengene sequenziert
werden. Dazu wurden die Gene zunächst nach verschiedenen Kriterien analysiert und
einer von vier Gruppen (A-D, siehe unten) zugeordnet. Anschließend wurden alle
codierenden Exons (inklusive Exon-Intron-Übergänge) der entsprechenden Gene mit
der DNA der Indexpatientin (IV.1) amplifiziert und nach Sanger sequenziert. Da es sich
bei der SEMD-JL Typ Hall um eine sehr seltene autosomal rezessiv vererbte
Erkrankung handelt, wurden bei der Auswertung nur solche Mutationen in Betracht
gezogen, die homozygot vorliegen und in der SNP (single nucleotide polymorphism)-
Datenbank dbSNP (Version 131) nicht annotiert sind.
3.1.3.1 Gruppe A: Gene mit bekannter Funktion bei d er Skelettentwicklung
Der Gruppe A wurden alle Gene zugeordnet, die bereits eine bekannte Rolle bei der
Knorpel-/Knochenentwicklung spielen, eine Homologie zu solchen Proteinen oder eine
bekannte Expression in Knorpel- oder Knochengewebe aufweisen (Tab. 3.1). In diesen
zehn Genen wurde keine Mutation gefunden.
Tab. 3.1: Kandidatengene der Gruppe A (entsprechend NCBI36/hg18).
Rang Gensymbol Genname 1 BMP4 Bone morphogenetic protein 4 2 GNG2 Guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 2 3 LGALS3 Lectin, galactoside-binding soluble 3 4 TXNDC1 Thioredoxin domain containing 1 5 NID2 Nidogen 2 6 STYX Serin/threonin/tyrosine interacting protein 7 CNIH Cornichon homolog, Drosophila 8 OTX2 Orthodenticle homolog 2, Drosophila 9 GNPNAT1 Glucosamine-phosphate N-acetyltransferase 1 10 MAP4K5 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 5
3 Ergebnisse 22
3.1.3.2 Gruppe B: unbekannte Gene Der Gruppe B wurden alle Gene zugeordnet, die bisher noch nicht näher charakterisiert
waren oder bei denen es sich nur um vorhergesagte Gene handelte, da eines dieser Gene
eine noch nicht bekannte Funktion in der Skelettentwicklung spielen könnte. Auch in
diesen acht Genen (C14orf104, C14orf166, C14orf138, C14orf32, C14orf101,
C14orf29, KIAA0831 und KIAA1344; entsprechend NCBI36/hg18) wurde keine
Mutation gefunden.
3.1.3.3 Gruppe C: in ATDC5-Zellen differentiell exp rimierte Gene Der Gruppe C wurden alle Gene zugeordnet, die differentiell in der chondrogenen
Zelllinie ATDC5 exprimiert sind (Tab. 3.2). Es handelt sich hierbei um eine murine
Teratomzelllinie, die unter Zugabe von Insulin zu Chondrozyten differenziert und dabei
alle Stadien der enchondralen Ossifikation bis zu hypertrophen Chondrozyten
durchläuft (Shukunami et al., 1996). Die Differenzierung erfolgte über einen Zeitraum
von 32 Tagen, wobei alle vier Tage RNA aus den Zellen isoliert wurde. Nach
Umschreibung der RNA in cDNA wurde eine semiquantitative RT-PCR mit allen
verbleibenden Kandidatengenen durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Die Gene, die in
allen Chondrozyten-Differenzierungsstadien gleich stark exprimiert waren, wurden
schließlich der Gruppe D zugeordnet.
Tab. 3.2: Kandidatengene der Gruppe C (entsprechend NCBI36/hg18).
Rang Gensymbol Genname 19 MGAT2 mannosyl (alpha-1,6-)-glycoprotein beta-1,2-N-
acetylglucosaminyltransferase 20 FRMD6 FERM domain containing 6 21 DDHD1 DDHD domain containing 1 22 SOCS4 suppressor of cytokine signaling 4 23 KLHDC1 kelch domain containing 1 24 SPG3A spastic paraplegia 3A 25 PELI2 pellino homolog 2 (Drosophila) 26 GMFB glia maturation factor, beta 27 ATP5S ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex,
subunit s (factor B) 28 SOS2 son of sevenless homolog 2 (Drosophila) 29 PPIL5 peptidylprolyl isomerase-like 5 30 PLEKHC1 pleckstrin homology domain-containing family C member 1 31 NIN ninein
Nachdem die Gene der Gruppe A und B erfolglos sequenziert wurden, konnte
schließlich in Exon 31 des Ninein-Gens (NIN) eine Mutation (c.6244A>G) gefunden
werden, die zu einem AS-Austausch von Asparagin zu Aspartat (p.N2082D, NP_06597)
führt. Exon 31 kommt ausschließlich in Isoform 2 (NM_020921) vor, einer von 4
bekannten NIN-Isoformen. Die Resequenzierung aller Familienmitglieder ergab
erwartungsgemäß, dass die Mutation mit dem Krankheitsphänotyp segregiert. Durch die
3 Ergebnisse 23
Daten von 1094 Kontrollpersonen in der “1000-genome” Datenbank
(http://www.1000genomes.org, dbSNP 132) konnte ausgeschlossen werden, dass es sich
bei der gefundenen Mutation um einen häufigeren Polymorphismus handelt. Dies
konnte durch die Sequenzierung von Exon 31 in 200 türkischen und 300 kaukasischen
nicht-betroffenen Kontrollpersonen bestätigt werden.
Um auszuschließen, dass in den verbleibenden 33 Genen innerhalb der
Kandidatenregion nicht noch eine andere Mutation enthalten ist und aufgrund der
technischen Entwicklungen im Sequenzierbereich während der Erstellung der
vorliegenden Dissertation, sollte das gesamte Exom der Indexpatientin mittels Next
Generation Sequencing sequenziert werden.
3.1.4 Next Generation Sequencing
In Kooperation mit Dr. Adrian Stütz, Dr. Tobias Rausch und Dr. Jan O. Korbel (EMBL,
Heidelberg) wurde ein whole-exome sequencing durchgeführt. Dazu wurde das Exom
der Indexpatientin (IV.1) mittels “Human All Exome 38 Mb SureSelect kit”
angereichert und anschließend mittels “Genome Analyzer IIx” sequenziert. Insgesamt
wurden 49,9 Mio 76 bp reads analysiert, 88,3% (43,6 Mio reads) davon konnten dem
menschlichen Genom zugeordnet werden. 33,6 Mio reads waren Teil eines Exons oder
Exon-flankierender Sequenzen (Exon + 200 bp). Dies entspricht einer on-target ratio
von 77%. 23,2 Mio reads (53.2%) konnten direkt den angereicherten Exons zugeordnet
werden. Durch das SNP calling mittels “Genome Analysis Toolkit” und “SAMtools”
wurden 5387 Missense- und Nonsense-SNVs (single nucleotide variants) identifiziert.
Davon waren 277 SNVs neu (ohne rs-Nummer), d.h. sie waren nicht in dbSNP (Version
131) enthalten und damit keine bekannten SNPs mit einer Allelfrequenz > 1%. Ein
Großteil dieser 277 SNVs lag heterozygot vor. Unter der Annahme autosomal
rezessiver Vererbung mit vollständiger Penetranz und eines gemeinsamen anzestralen
Allels, lag der Fokus auf homozygoten, nicht-synonymen Varianten, die in einem Exon
oder den flankierenden Introns liegen. Nur 13 SNVs von 277 bisher unbekannten
Varianten waren homozygot (Tab. 3.3). Davon lagen wiederum zwei innerhalb der
Kopplungsregion auf Chromosom 14 (chr14:49.378.248-57.381.598) und
erwartungsgemäß keine innerhalb der Kopplungsregion auf Chromosom 3
(chr3:176.622.918-179.815.700).
Die erste Mutation (c.283C>T) (Abb. 3.5 A) befindet sich in Exon 4 der DNA
Polymerase epsilon Untereinheit 2 (POLE2) und verursacht einen AS-Austausch
(p.P95S, NP_002683). Exon 4 ist Teil von Isoform 1 (NM_ 002692) und 3
(NM_001197331), kommt aber nicht in Isoform 2 von POLE2 vor. Die zweite Mutation
(c.6244A>G) (Abb. 3.5 B) ist die bereits mittels Sanger-Sequenzierung identifizierte
Mutation in Exon 31 des Ninein-Gens (NIN; vgl. 3.1.3.3).
3 Ergebnisse 24
Tab. 3.3: Homozygote, bisher unbekannte Varianten (dbSNP 131) der Indexpatientin.
Chromosom Position Gen NM-Nummer Mutation AS-Austausch 11 1092872 MUC2 NM_002457 c.4691C>G p.T1564S 11 33373368 HIPK3 NM_001048200 c.2959G>A p.D987N 12 82752543 C12orf26 NM_032230 c.199T>G p.S67A 12 82752559 C12orf26 NM_032230 c.215T>G p.L72R 12 120110185 PRKAB1 NM_006253 c.239C>T p.T80M 14 45501487 FAM179B NM_015091 c.3720T>G p.S1240R 14 50141108 POLE2 NM_002692 c.283G>T p.P95S 14 51190339 NIN NM_020921 c.6244T>G p.N2082D 14 93118229 RIN3 NM_024832 c.835C>T p.R279C 14 105858022 PACS2 NM_001100913 c.2142>T p.P714L 16 16271357 ABCC6 NM_001171 c.2542T>G p.M848V 17 44144993 KIAA1267 NM_015443 c.1574C>C p.R525P 19 7056571 MBD3L3 NM_001164425 c.389G>A p.A130D
Varianten innerhalb der Kopplungsregion sind grau markiert.
Die Resequenzierung aller Familienmitglieder mittels Sanger-Sequenzierung ergab
erwartungsgemäß, dass beide Mutationen mit dem Krankheitsphänotyp segregieren
(Abb. 3.5 C). Die Daten von 1094 Kontrollpersonen in der “1000-genome” Datenbank
(http://www.1000genomes.org, dbSNP 132) schloss ferner aus, dass es sich bei den 2
Mutationen um häufigere Polymorphismen handelt. Dies konnte durch die Sanger-
Sequenzierung beider mutierter Exons in 200 türkischen und 300 kaukasischen nicht-
betroffenen Kontrollpersonen bestätigt werden.
Abb. 3.5: Resequenzierung und Segregation. Elektropherogramme der Mutationen in (A) NIN (c.A6435G; p.N2082D) und (B) POLE2 (c.C283T; p.P95S) in betroffenen und nicht-betroffenen Individuen. (C) Genotypen der untersuchten Familienmitglieder (ID).
3 Ergebnisse 25
3.1.5 Bioinformatische Analysen Weder für NIN noch für POLE2 ist bis heute eine Rolle in der Skelettentwicklung
bekannt. Um potentielle Effekte der beiden Mutationen auf die Struktur und Funktion
der Proteine vorhersagen zu können, sollten die möglichen Auswirkungen der
Aminosäureaustausche mit bioinformatischen Methoden analysiert werden.
Beide Mutationen betreffen Aminosäuren, die unter Vertebraten hoch konserviert sind
(Abb. 3.6).
Abb. 3.6: Konservierung der mutierten Aminosäuren in verschiedenen Vertebraten. Zahlen in Klammern geben die AS-Position innerhalb des Proteins an. Die mutierte AS ist durch einen grünen Kasten hervorgehoben. Der Grad der Konservierung ist farblich codiert (rot: invariable AS, blau: AS, die bei mehr als 50% der Spezies an dieser Stelle auftritt, grün: ähnliche AS). (A) POLE2 H. sapiens (NP_002683), B. taurus (NP_001098853), C. familiaris (XP_851216), M. musculus (NP_035263), O. anatinus (XP_001515002), G. gallus (NP_001006493), X. laevis (NP_001083783), D. rerio (NP_775353), T. nigroviridis (CAG10412) (B) NIN H. sapiens (NP_065972), B. taurus (XP_869477.2), C. familiaris (XP_537442), M. musculus (NP_001074922), O. anatinus (XP_001514688), G. gallus (XP_426482), X. laevis (NP_001086424), D. rerio (XP_001332720), T. nigroviridis (CAG05094).
Zur Vorhersage, ob durch die Aminosäureaustausche Proteinstruktur und –funktion
beeinträchtigt sein könnten, wurden die Programme „Polyphen-2 v2.1.0“ (Adzhubei et
al., 2010) und „Sorting Intolerant from Tolerant“ (SIFT) (Ng und Henikoff, 2001)
verwendet. Durch die p.N2082D Mutation in Ninein, die eine negativ geladene
Aminosäure in das Protein einführt, wurde mit einem sehr hohen Polyphen-2 Score von
0,998 (bei einer Sensitivität von 0,27 und einer Spezifität von 0,99) als schädlich
vorhergesagt. Im Gegensatz dazu wurde diese Mutation von SIFT als tolerierbar mit
einem Score von 0,63 eingestuft. Die p.P95S Mutation in POLE2 wurde von Polyphen-
2 ebenfalls als schädlich eingestuft mit einem Score von 0,990 (Sensitivität: 0,71;
3 Ergebnisse 26
Spezifität: 0,96). Im Gegensatz zu Ninein wurde hier auch von SIFT vorhergesagt, dass
die p.P95S Mutation die Proteinfunktion beeinträchtigt (Score: 0,03).
Abb. 3.7: Bioinformatische Analysen von POLE2 und NIN. Schematische Darstellung der Proteinstruktur von (A) POLE2 (Iso1; NP_002683) und (B) NIN (Iso2; NP_065972 verändert nach (Hong et al., 2000a; Hong et al., 2000b; Cheng et al., 2006; Lin et al., 2006)) (C) Effekt der p.N2082D Mutation auf die Coiled-coil-Region von Ninein. „Helical wheel” Darstellung für ein Coiled-coil Dimer der AS-Reste 2068-2120 in Wildtyp (links) und Mutante (rechts). Die Farben der Aminosäuren im 1-Buchstaben-Code sind farblich entsprechend ihrer biophysikalischen Eigenschaften codiert. Blaue gestrichelte Linien zeigen elektrostatische Anziehungskräfte, die mutierte AS ist mit einem grünem Pfeil markiert. Die rote gestrichelte Linie zeigt eine elektrostatische Abstoßung zwischen D2082 und E2081 der zweiten Untereinheit.
Abb. 3.7 zeigt die Proteinstruktur von POLE2 (A) und NIN (B). Die Analyse der
Proteinstruktur von POLE2 mit dem Programm „SMART“ (http://smart.embl-
heidelberg.de) ergab eine N-terminale (AS 2-74) und eine C-terminale Domäne (AS
287-489). Die gefundene Mutation p.P95S liegt in dem Bereich dazwischen, der keine
3 Ergebnisse 27
besondere Sekundärstruktur besitzt. Diese Vorhersage deckt sich mit einer früheren
Studie, die zeigt, dass die Aminosäuren 76-180 von POLE2 nur geringe
Sequenzkonservierung aufweisen und voraussichtlich ungeordnet sind (Nuutinen et al.,
2008). Daher erscheint es eher unwahrscheinlich, dass die p.P95S-Mutation die Struktur
oder Funktion von POLE2 signifikant verändert.
Die Analyse der Proteinstruktur von Ninein mit dem Programm “Coils2” (Lupas et al.,
1991) ergab, dass das Protein 11 Coiled-coil Segmente (AS 358–570, 628–722, 767–
928, 960–1027, 1070–1099, 1184–1341, 1441–1725, 1750–1816, 1854–1885, 1922–
1962 und 1991–2120) besitzt. Diese wurden mit Hilfe des Programms „DrawCoil“
(http://www.gevorggrigoryan.com/drawcoil) dargestellt. Coiled-coil Domänen spielen
eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen und sind
außerdem verantwortlich für die experimentell bestätigte Homo-Oligomerisierung von
Ninein (Petit et al., 2003). Die p.N2082D Mutation ist in der am weitesten C-terminal
liegenden Coiled-coil Region (AS 1991–2120) lokalisiert. Abb. 3.7 C zeigt, dass
Asn2082 Teil einer Helix ist, die ausschließlich von ungeladenen Aminosäuren besetzt
ist. Die p.N2082D Mutation schafft eine elektrostatische Repulsion mit Glu2081 der
zweiten Untereinheit, für die eine Schwächung oder sogar Zerstörung der Coiled-coil-
Domäne vorausgesagt wird, wodurch die Struktur und der Oligomerisierungsgrad von
Ninein gestört werden würde.
3.1.6 Expression der betroffenen NIN- und POLE2-Isoformen Da beide Mutationen in alternativ gespleißten Exons lokalisiert sind, wurde untersucht,
ob die entsprechende Isoform im Knorpel-/Knochengewebe exprimiert ist. Die
Expressionsanalysen wurden am orthologen murinen Gen durchgeführt.
Abb. 3.8: Expressionsanalyse von Nin und Pole2 mittels RT-PCR. Verschiedene Gewebe neugeborener Mäuse wurden auf Expression von Nin (Isoform 2) und Pole2 untersucht. Actb diente als Kontrolle. COB: Osteoblasten aus Kalvarien (calvarial osteoblasts).
3 Ergebnisse 28
Dazu wurde RNA aus verschiedenen Geweben von neugeborenen Mäusen extrahiert
und mittels RT-PCR analysiert. Knorpel-RNA wurde aus isolierten
Rippenchondrozyten und Knochen-RNA aus Kalvarien gewonnen. Für die
Amplifikation von Nin wurden Isoform 2 (NM_020921)-spezifische Primer benutzt, da
die gefundene Nin-Mutation in Exon 31 liegt, welche nur in der Isoform 2 von Ninein
vorkommt. Isoformspezifische Primer für Pole2 (NM_ 002692) waren nicht notwendig,
da es bei der Maus nur ein Pole2-Transkript gibt. Daher wurden für die RT-PCR Primer
verwendet, die Exon 1-6 von Pole2 amplifizieren. Für beide Gene konnte eine
ubiquitäre Expression in allen untersuchten Geweben einschließlich Knorpel und
Knochen nachgewiesen werden (Abb. 3.8).
3.1.7 Subzelluläre Lokalisation Um zu testen, ob durch die Mutationen die subzelluläre Lokalisation der Proteine
beeinträchtigt wird, sollten POLE2 und NIN jeweils mit und ohne Mutation
überexprimiert und ihre zelluläre Lokalisation immunzytologisch untersucht werden. Da
weder für POLE2 noch für NIN ein funktionierender Antikörper zur Verfügung stand,
wurde ein Protein mit einem HA-tag bzw. ein GFP-Fusionsprotein verwendet. Dazu
wurde der offene Leserahmen des murinen Pole2 in den Expressionsvektor
pcDNA3.1(+)/HA-His A mit einem C-terminalem HA-tag kloniert. Da der offene
Leserahmen von Nin mit 6,5 kb zu groß für die Klonierung war, wurde hier nur der C-
terminale Bereich (Exon 27 bis 31) verwendet. Delgehyr et al. (2005) konnten zeigen,
dass dieser Bereich für die Lokalisation des Proteins am Zentrosom verantwortlich ist
und somit die gleiche subzelluläre Lokalisation wie das gesamte Protein aufweist.
Daher wurde Exon 27 bis 31 von Nin (Isoform 2) in den Vektor pEGFP-C3 kloniert und
somit ein Fusionskonstrukt mit N-terminalem EGFP generiert. Anschließend wurden
durch gerichtete Mutagenese die Mutationen in die beiden Konstrukte eingeführt. Für
den immunzytochemischen Nachweis wurden HEK293-Zellen mit den Konstrukten
(der jeweilige Leervektor diente als Kontrolle) transient transfiziert und die Proteine
nach 24-48 h mittels anti-HA-Antikörper bzw. EGFP nachgewiesen. Als Zentrosom-
Marker wurde Pericentrin verwendet (Doxsey et al., 1994). Weder die hauptsächlich
nukleäre Lokalisation von POLE2 noch die zentrosomale Lokalisation von NIN (Co-
Lokalisation mit PCNT) wurde durch die jeweilige Mutation beeinflusst (Abb. 3.9).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass weder NIN noch POLE2 direkt mit der
Skelettentwicklung in Verbindung gebracht werden konnte. Jedoch ist der
vorhergesagte destabilisierende Effekt der NIN-Mutation auf eine Coiled-coil-Domäne
des Proteins ein Hinweis darauf, dass es sich dabei um die für die SEMD-JL Typ Hall
ursächliche Mutation handeln könnte.
3 Ergebnisse 29
Abb. 3.9: Subzelluläre Lokalisation von NIN und POLE2 (Wildtyp und Mutante). Wildtyp- bzw. Mutations-Konstrukte [(A) EGFP-NIN(Ex27-31), (B) POLE2-HA] wurden transient in HEK293-Zellen eingebracht, mit den angegebenen Antikörpern detektiert und die DNA mit DAPI gefärbt. Jeweils ganz rechts ist die Überlagerung der Einzelfarben (merge) dargestellt. Maßstabsbalken 10 µm.
3 Ergebnisse 30
3.2 Funktionelle Analysen von Selenoprotein M und dessen Rolle in der Skelettentwicklung
Selenoprotein M (SELM) wurde im Rahmen eines EST (expressed sequence tag)-
Projekts beschrieben, dessen Ziel es war, Gene zu identifizieren, die an der
Skelettentwicklung beteiligt sind (Tagariello et al., 2005). Dazu wurden aus einer
humanen fetalen Wachstumsfugen-Knorpel-cDNA-Bibliothek ESTs generiert und mit
den ESTs in anderen Datenbanken verglichen. Bei einem dieser Transkripte, das in den
ESTs der Wachstumsfugen-cDNA-Bibliothek im Vergleich zu anderen cDNA-
Bibliotheken überrepräsentiert war, handelte es sich um SELM.
Da die Funktion von SELM noch weitgehend unbekannt war, und vor allem noch
niemand zuvor die Rolle von SELM in der Skelettentwicklung untersucht hatte, war
eines der Ziele der vorliegenden Arbeit die funktionelle Charakterisierung von SELM.
Die Untersuchungen wurden an den jeweils orthologen Genen aus Maus (Selm) und
Huhn (selm) durchgeführt.
3.2.1 Gen- und Proteinstruktur Das im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisierte Selenoprotein M (SELM) wurde
2002 erstmals von Korotkov und Kollegen beschrieben (Korotkov et al., 2002). Beim
Menschen ist SELM auf Chromosom 22 (22q12.2, NM_080430), bei der Maus auf
Chromosom 11 (11A1, NM_053267) und beim Huhn auf Chromosom 15 lokalisiert. Im
Huhn wurde selm im 5´-Bereich (Exon 1 und 2) bisher nicht vollständig annotiert. Um
trotzdem auch im Huhn mit selm arbeiten zu können, wurden ein Alignment aller
verfügbaren ESTs durchgeführt, die Konsensussequenz ermittelt (siehe Anhang) und für
die weiteren Analysen verwendet. Abb. 3.10 zeigt eine schematische Darstellung der
Gen- und Proteinstruktur des humanen Selenoprotein M. Das Gen besteht aus 5 Exons
(vgl. Abb. 3.10 A) mit einer Transkriptlänge von 739 bp. Die cDNA enthält einen
offenen Leserahmen von 435 bp Länge, der für ein Protein mit 145 Aminosäuren
codiert (Abb. 3.10 B). Für die Lokalisation im ER besitzt SELM am N-Terminus ein
Signalpeptid von 23 AS Länge und ein hoch konserviertes HxDL-ER-Retentionssignal
am C-Terminus (Labunskyy et al., 2007). Das für Selenoproteine charakteristische
TGA-codierte Selenocystein ist in Vertebraten ebenfalls hoch konserviert und liegt
innerhalb des CxxU-Redoxmotivs (Abb. 3.10 B). SELM zeigt keine Homologie zu
anderen Proteinen und besitzt keine bekannten Domänen. In einer kürzlich erschienenen
Studie von Ferguson et al. (2006) konnte jedoch gezeigt werden, dass SELM und
SEP15 (15 kDa Selenoprotein) Strukturhomologe mit einer Thioredoxin-ähnlichen
Domäne (auch Sep15/Selm Redox-Domäne genannt) darstellen und eine eigenständige
Unterfamilie innerhalb der Thioredoxin-Proteinfamilie bilden (Ferguson et al., 2006).
3 Ergebnisse 31
Abb. 3.10: Gen- und Proteinstruktur des humanen Selenoprotein M. (A) Schema der Selm-Genstruktur (NM_080430). Dargestellt sind die fünf Exons (graue Kästen), das Sec-enthaltende Exon (Stern) und das SECIS-Element (Stammschleife) in der 3‘ UTR. Die Größe der Introns (oben) und der Exons (unten) in bp ist angegeben. (B) Schematische Darstellung der SELM-Proteinstruktur sowie des Redoxmotivs und des ER-Retentionssignals bei verschiedenen Vertebratenspezies (H. sapiens NP_536355, B. taurus NP_001156643, C. familiaris NP_001108486, M. musculus NP_444497, O. anatinus EST EH003982, G. gallus rekonstruiert, X. tropicalis NP_001165078, D. rerio NP_840071, T. nigroviridis CR637442).
3.2.2 Expressionsanalysen von selm im Huhn Da SELM mit der Skelettentwicklung in Verbindung gebracht worden war (Tagariello et
al., 2005), sollte zuerst das Expressionsprofil von selm in diesem Gewebe genauer
untersucht werden. Hierzu wurden die Experimente aufgrund der leichteren
Handhabung und Verfügbarkeit (vor allem der frühen Entwicklungsstadien) am Huhn
durchgeführt. Die Expressionsanalysen wurden an Hühnerembryonen, die zwischen 3
Tagen (Hamburger-Hamilton-Stadium (HH) 19) und 14 Tagen (HH40) alt waren,
mittels RNA-in situ-Hybridisierung (ISH) und quantitativer Real-Time (qPCR)
durchgeführt.
Für die Analyse der selm-Expression wurden 5 µm dicke Paraffin-Serienschnitte von
Hühnerflügeln verschiedener Embryonalstadien angefertigt. Die ISH wurde mittels
DIG-markierter RNA-Sonden gegen selm (Sequenz siehe Anhang) durchgeführt.
Bereits in HH29 konnte ein selm-Signal an der Stelle, an der sich später Knorpel und
Knochen bilden, detektiert werden (Abb. 3.11 A). Auch in späteren Stadien zeigt sich
ein besonders starkes Signal in den Röhrenknochen, das am deutlichsten in HH40-
Flügeln erkennbar ist.
3 Ergebnisse 32
Abb. 3.11: Selm-Expression in Röhrenknochen. ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten von Flügeln der angegebenen Entwicklungsstadien (A) bzw. HH40 (B). (A) Die Schnitte wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen selm hybridisiert. (B, C) Serienschnitte wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen selm und bglap hybridisiert. Zusätzlich wurden eine Azanfärbung (Azan) und eine Alkalische Phosphatase-Färbung (AP) durchgeführt. Maßstabsbalken 1mm (B) bzw. 50 µm (C).
3 Ergebnisse 33
Um dies genauer zu untersuchen, wurden Serienschnitte von HH40 Flügeln angefertigt
und eine ISH mit Sonden gegen selm und Osteocalcin (bglap, NM_205387) – einem
Osteoblastenmarker (Ducy und Karsenty, 1995; Schinke und Karsenty, 1999) –
durchgeführt. Zur besseren Übersicht wurden außerdem eine Azanfärbung und eine
Alkalische Phosphatase (AP)-Färbung angefertigt. Durch die Azanfärbung werden
fibrilläre Proteine (v.a. Kollagene) blau und Zellkerne und Zytoplasma rot angefärbt.
Abb. 3.11 B und C zeigen, dass das stärkste selm-Signal mit den Signalen der AP-
Färbung und der bglap-Sonde in den Röhrenknochen übereinstimmt. Dies deutet darauf
hin, dass selm vor allem in Osteoblasten exprimiert wird. Neben diesen starken Signalen
sind aber auch schwächere Signale in den Muskeln und der Haut erkennbar.
Um diese Befunde zu bestätigen, wurde eine qPCR an RNA aus verschiedenen
Geweben von HH40-Hühnern durchgeführt. Auch hier zeigte sich eine Expression von
selm in verschiedenen Geweben, am stärksten jedoch in Knochengewebe (Abb. 3.12
A). Des Weiteren wurde die selm- und bglap-Expression in RNA aus Flügeln
verschiedener Embryonalstadien mittels Real-Time PCR analysiert (Abb. 3.12 B). Hier
zeigte sich ein paralleler Anstieg der Expression beider Gene im Lauf der Entwicklung.
Dies deckt sich gut mit den Signalen von selm und bglap in der ISH, die ebenfalls am
deutlichsten in HH40-Flügeln zu sehen sind.
Abb. 3.12: Expression von selm in unterschiedlichen Geweben und Flügeln verschiedener Embryonalstadien. (A) Real-time PCR zur Analyse der selm-Expression (normalisiert auf tbp) in verschiedenen Geweben von Hühnern des Embryonalstadiums HH40. Die Messung wurde in Triplikaten durchgeführt (Mittelwert ± Standardabweichung). (B) Real-time PCR zur Analyse der selm- und bglap-Expression (normalisiert auf tbp) in Flügeln verschiedener Embryonalstadien. Die Messung wurde an zwei unabhängigen cDNAs pro Stadium jeweils in Triplikaten durchgeführt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment (Mittelwert ± Standardabweichung).
3 Ergebnisse 34
Selm konnte jedoch nicht nur in enchondral ossifizierenden Knochen nachgewiesen
werden, sondern auch in kraniofazialen Skelettelementen, die durch desmale
Ossifikation entstehen (Abb. 3.13). Auch hier war sowohl eine Expression von selm als
auch von bglap detektierbar.
Abb. 3.13: Selm-Expression in Schädelknochen. ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten. Serien-Schnitte von HH37 Köpfen wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen selm und bglap hybridisiert. Der Pfeil markiert einen Schädelknochen. Maßstabsbalken 0,5 mm
Da SELM ursprünglich in einer humanen fetalen Wachstumsfugen-cDNA-Bibliothek
als Kandidatengen für die Skelettentwicklung identifiziert worden war (Tagariello et al.,
2005), sollte als nächstes festgestellt werden, ob selm im Skelett tatsächlich nur von
Osteoblasten oder auch von Chondrozyten exprimiert wird. Dazu wurden primäre
mesenchymale Zellen (micromass culture, mmc) aus Extremitätenknospen isoliert und
sieben Tage lang zur Differenzierung kultiviert, wobei jeden Tag RNA isoliert wurde.
Anschließend wurde die selm-Expression mittels semiquantitativer RT-PCR überprüft.
Mit einer gapdh-Kontrolle konnte gezeigt werden, dass gleiche Mengen an cDNA für
die PCR eingesetzt worden waren und col2a1 und col10a1 dienten als Nachweis für die
Differenzierung der mmc bis hin zu hypertrophen Chondrozyten. Abb. 3.14 A zeigt,
dass die Differenzierung der mmc gut funktioniert hat, aber selm nur sehr schwach bis
gar nicht in Chondrozyten exprimiert ist. Demgegenüber ist selm in allen mittels
semiquantitativer RT-PCR untersuchten Differenzierungsstadien primärer Kalvarien-
Osteoblasten stark exprimiert (Abb. 3.14 B). Hier wurde als Beladungskontrolle
ebenfalls gapdh mitgeführt, als Marker für Osteoblasten dienten col1a2 und col12a1
(Jikko et al., 1999; Izu et al., 2011). Zur Bestätigung wurde die Selm-Expression auch
noch in der Prä-Osteoblasten-Zelllinie MC3T3, die 30 Tage lang zu Osteoblasten
differenziert wurde, nachgewiesen (Abb. 3.14 C). Auch hier wurde zur Kontrolle der
gleichmäßigen Beladung Gapdh mitgeführt und Bglap und Col1a1 dienten der
Bestätigung des Osteoblasten-Phänotyps. Die Experimente an unterschiedlichen Zellen
bestätigen somit die Ergebnisse der ISH, dass selm stark in Osteoblasten exprimiert ist,
aber nicht in Chondrozyten.
3 Ergebnisse 35
Abb. 3.14: Expression von selm in Osteoblasten und nicht in Chondrozyten. Die selm-Expression wurde mittels semiquantitativer RT-PCR in micromass cultures (A), primären Kalvarien-Osteoblasten (B) und der Prä-Osteoblasten-Zelllinie MC3T3 untersucht. Gapdh diente als Beladungskontrolle, der jeweilige Zelltyp wurde mit Markergenen bestätigt.
Neben dem Signal in Osteoblasten zeigte sich in der ISH auch ein starkes selm-Signal in
Strukturen entlang des Knochens, die mit der Azanfärbung ebenfalls blau angefärbt
wurden (Abb. 3.15).
Abb. 3.15: Selm-Expression in Sehnen. ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten. Serienschnitte von Flügeln HH40 wurden mit einer DIG-markierten RNA-Sonde gegen selm hybridisiert und mit Azan gefärbt. Maßstabsbalken 1 mm.
3 Ergebnisse 36
Da bei der Azanfärbung vor allem fibrilläre Kollagene blau angefärbt werden und –
neben dem Knochen und der Haut – Sehnen große Mengen Kollagen, v.a. Typ I
Kollagen (Benjamin und Ralphs, 2000; Kjaer, 2004), enthalten, wurde vermutet, dass es
sich bei den angefärbten Strukturen um Sehnen handelt. Um diese Hypothese zu
bestätigen, wurden erneut Serienschnitte von Flügeln verschiedener Embryonalstadien
angefertigt und eine Azanfärbung sowie eine ISH mit Sonden gegen selm, scx
(NM_204253) und tnmd (NM_206985) durchgeführt (Abb. 3.16).
Abb. 3.16: Expression von selm, scx und tnmd in Flügeln verschiedener Embryonalstadien. ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten. Serienschnitte wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen selm, scx und tnmd hybridisiert. Zusätzlich wurde eine Azanfärbung durchgeführt. Maßstabsbalken 2 mm.
3 Ergebnisse 37
Bei scx und tnmd handelt es sich um zwei Sehnenmarker, wobei scx bereits in früheren
Entwicklungsstadien exprimiert wird, tnmd erst in späteren (Shukunami et al., 2006).
Wie erwartet, war die scx-Expression in frühen Embryonalstadien deutlicher zu
erkennen als die tnmd-Expression, in älteren Stadien war es eher umgekehrt. Das Signal
von selm stimmte sehr gut mit dem Expressionsmuster von beiden Sehnenmarkern
überein. Dies spricht dafür, dass es sich bei den angefärbten Strukturen tatsächlich um
Sehnen handelt und selm somit auch in Tenozyten exprimiert und mit der
Sehnenentwicklung assoziiert ist.
Besonders lange und kräftige Sehnen sind in den Beinen der Hühnerembryonen zu
sehen. Abb. 3.17 zeigt eine ISH an Beinen HH38 mit Sonden gegen selm, scx und tnmd.
Auch hier zeigt sich eine Co-Expression der drei Gene.
Abb. 3.17: Expression von selm in Sehnen. ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten von Beinen HH38. Serienschnitte wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen selm und tnmd hybridisiert bzw. mit Azan gefärbt (wie angegeben). Maßstabsbalken 2 mm (A) bzw. 50 µm (B).
Auch das Expressionsprofil von scx und tnmd wurde (wie zuvor das von selm und
bglap, vgl. Abb. 3.12) mittels Real-Time PCR an Flügeln verschiedener
Embryonalstadien überprüft. Die Ergebnisse in Abb. 3.18 zeigen einen Anstieg der
Expression von scx bis zum Stadium HH34 und danach eine abfallende scx-Expression.
Die tnmd-Expression steigt zeitverzögert ab HH28 an, erreicht bei HH38 ihren höchsten
3 Ergebnisse 38
Wert und bleibt bis HH40 annähernd auf dem gleichen Niveau. Diese Daten korrelieren
sehr gut mit den beobachteten Signalstärken der ISH (vgl. Abb. 3.16) sowie den laut
Publikationen (Schweitzer et al., 2001; Shukunami et al., 2006) zu erwartenden
Expressionsstärken.
Abb. 3.18: Expressionsprofil von scx und tnmd. Real-time PCR zur Analyse der selm- und tnmd-Expression (normalisiert auf tbp) in Flügeln verschiedener Embryonalstadien. Die Messung wurde an zwei unabhängigen cDNAs pro Stadium jeweils in Triplikaten durchgeführt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment (Mittelwert ± Standardabweichung).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass selm während der Embryonalentwicklung im
Huhn zwar ubiquitär exprimiert wird, allerdings besonders stark in Knochen und
Sehnen. Die Expression in Knochen ist sowohl in enchondral als auch desmal
ossifizierenden Skelettelementen nachweisbar. Dabei stimmt das Expressionsprofil sehr
gut mit dem der Alkalischen Phosphatase und Osteocalcin überein, so dass von einer
Expression in Osteoblasten ausgegangen werden kann. Außerdem wurde eine Co-
Expression von selm mit scx und tnmd in Tenozyten identifiziert.
3.2.3 Expressionsanalysen von Selm in der Maus Um die Expressionsdaten in einem zweiten Modellorganismus zu bestätigen, wurden
ISH und qPCR an Mausgeweben durchgeführt. Die ISH wurde mit DIG-markierten
RNA-Sonden, die gegen Selm (NM_053267), Osteocalcin (Bglap, NM_001032298) und
Typ I Kollagen (Col1a1, NM_007742) gerichtet waren, an 5 µm dicken Paraffin-
Serienschnitten durchgeführt. Parallel dazu wurden auch Schnitte mit Azan gefärbt.
Bei Schnitten vom Embryonalstadium Tag 16,5 (E16,5) war ein starkes Selm-Signal in
den Knochen des kraniofazialen, axialen und Extremitäten-Skeletts detektierbar (Abb.
3.19). So war eine Expression z.B. in den Wirbelkörpern, der Maxilla und Mandibula zu
erkennen (Abb. 3.19 A) sowie ebenfalls in den Knochenbälkchen und dem Periost der
Röhrenknochen (Abb. 3.19 B). Dieses Expressionsmuster stimmt größtenteils mit dem
von Bglap, einem Marker für Osteoblasten (Ducy und Karsenty, 1995; Schinke und
Karsenty, 1999), überein (Abb. 3.19 A). Zusätzlich war in diesem Entwicklungsstadium
eine Selm-Expression im Riechepithel zu sehen (Abb. 3.19 A).
3 Ergebnisse 39
Abb. 3.19: Selm-Expression in Mausembryonen (E16,5). ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten von ganzen Embryonen (A) und Hinterextremitäten (B). Maßstabsbalken 2 mm, rechte Spalte 50 µm. (A) Serienschnitte wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen Selm und Bglap hybridisiert. Wirbel sind mit einem Pfeil markiert. Md, Mandibula; Mx, Maxilla; OE, olfaktorisches Epithel. (B) Serienschnitte wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen Selm hybridisiert bzw. mit Azan gefärbt. Pe, Periost; Kb, Knochenbälkchen; Ti, Tibia.
Anschließend wurde die Expression von Selm an Schnitten von Kopf und Extremitäten
4 Tage alter Mäuse (P4) untersucht (Abb. 3.20). Hier war eine starke Selm-Expression
im Cerebellum und dem Riechepithel zu sehen, eine etwas schwächere im
Hippocampus (Abb. 3.20A). Diese Ergebnisse stimmen mit der Studie von Zhang et al.
(2008) überein, die eine starke Selm-Expression im Cerebellum, Riechkolben,
Ammonshorn und Hippocampus gefunden hatten. Darüber hinaus konnte im Rahmen
der vorliegenden Arbeit eine Expression von Selm in Zähnen und Knochen
nachgewiesen werden, die dem Expressionsmuster von Bglap sehr ähnlich war (Abb.
3.20 A). An Schnitten von P4 Hinterextremitäten konnte eine Expression von Selm im
Periost und den Knochenbälkchen beobachtet werden (Abb. 3.20 B). Ein Vergleich
dieses Expressionsmusters mit dem von Typ I Kollagen (Col1a1) bzw. Bglap, Marker
für frühe bzw. späte Osteoblasten (Jikko et al., 1999; Cohen, 2006; Kulterer et al.,
2007), ergab eine komplette Co-Expression von Selm und Col1a1, wohingegen die Co-
Expression von Selm und Bglap auf das Periost beschränkt war (Abb. 3.20 B).
3 Ergebnisse 40
Abb. 3.20: Expression von Selm in P4-Mäusen. ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten von Köpfen (A; Maßstabsbalken 1 mm) und Hinterextremitäten (B, C; Maßstabsbalken 0,5 mm (B), 50 µm (C)). Serienschnitte wurden mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen Selm, Blglap und Col1a1 hybridisiert und mit Azan gefärbt. Cb, Cerebellum; Fe, Femur; Fi, Fibula; Hi, Hippocampus; Bz, Backenzahn; Mx, Maxilla; Nm, Nasenmuschel; OE, olfaktorisches Epithel; Os, os sphenoidale; Kb, Knochenbälkchen, Ti, Tibia; Pe, Periost; Vn, vomeronasales Organ.
3 Ergebnisse 41
3.2.4 Generierung einer Selm-Knockout-Maus Die gefundene starke Selm-Expression in Osteoblasten deutet darauf hin, dass SELM
eine Rolle während der Skelettentwicklung spielen könnte. Um Hinweise auf die
Funktion von SELM zu bekommen, wurde in Kooperation mit Michael Bösl
(Transgenic Service, Max-Planck-Institut für Neurobiologie, München) eine Knockout-
Maus generiert, nach der bereits 1986 etablierten Methode von Thomas et al.. Dazu
wurden embryonale Stamm- (ES-) Zellen mit C57BL/6-Hintergrund, die bereits ein
genetisch deletiertes Selm-Allel trugen, vom „knockout mouse project (KOMP)
repository“ käuflich erworben. Es handelte sich um drei unterschiedliche ES-Zellklone
(11537A-A8, 11537A-B11 und 11537A-H3), in deren Genom durch homologe
Rekombination jeweils der offene Leserahmen des Selm-Gens durch eine ZEN-Ub1-
Kassette ersetzt worden war (Abb. 3.21 A). Diese Kassette vermittelt eine Neomycin-
Resistenz und enthält ein lacZ-Reporter-Gen, das unter der Kontrolle des Selm-
Promotors steht. Alle drei ES-Zelllinien wurden in C57BL/6 Blastozysten injiziert und
anschließend in pseudoschwangere Mäuse reimplantiert. Die erhaltenen chimären
Mäuse wurden mittels Genotypisierungs-PCR (Abb. 3.21 B) identifiziert und mit
C57BL/6-Mäusen verpaart. Bei Verwendung der ES-Zelllinie 11537A-H3 entstanden
keine chimären Mäuse, so dass diese Linie nicht weiter verwendet wurde. Durch
Verpaarungen heterozygoter Tiere konnten somit zwei kongene Stämme (nachfolgend
als AA8 und AB11 bezeichnet) mit C57BL/6-Hintergrund generiert werden, die beide
lebensfähig und fertil sind. Nachfolgend werden die Knockout-Mäuse (offizielle
Bezeichnung: Selmtm(KOMP)Vlcg) als Selm-/--Mäuse bezeichnet.
Abb. 3.21: Schematische Darstellung des Selm-Knockout-Allels und Genotypisierung. (A) In den erworbenen ES-Zellen der Firma KOMP war der offene Leserahmen von Selm mittels homologer Rekombination durch eine ZEN-Ub1-Kassette ersetzt worden, die das lacZ-Reportergen enthält und die Neomycin-Resistenz vermittelt. Die Lage der Genotypisierungs-Primer ist durch Pfeile markiert, die Lage der Sonde für den Southern Blot mit einem schwarzen Balken. lacZ: β-Galaktosidase-codierende Sequenz des lacZ Gens von E. coli, hUbCpro: humaner Ubiquitin C Promotor, neor: codierende Sequenz der Neomycin-Phosphotransferase. (B) Die Genotypen der Mäuse wurden durch eine Multiplex-PCR mit unterschiedlichen Primern für Wildtyp (+/+) und Knockout (-/-) bestimmt. +/-: Heterozygote.
3.2.4.1 Nachweis des Knockouts Um zu zeigen, dass das Knockout-Konstrukt nur einmal in das Genom integriert ist,
wurden Southern Blot-Analysen durchgeführt. Dazu wurde genomische DNA von
3 Ergebnisse 42
Wildtyp- und Selm-/-- (AA8 und AB11) Tieren mit XbaI restringiert,
gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran transferiert. Der
Nachweis des Knockout-Konstrukts erfolgte mittels Hybridisierung mit einem
radioaktiv markierten, 493 bp großen Fragment aus dem lacZ-Gen (vgl. Abb. 3.21).
Abb. 3.22 A zeigt sowohl bei AA8 als auch bei AB11 eine einzelne Bande, die
zwischen 4 und 5 kb läuft (erwartete Größe: 4,4 kb). Dies spricht für eine singuläre
Integration der Knockout-Kassette in das Genom. Auf RNA-Ebene wurde der Knockout
mittels Real-Time PCR an verschiedenen Geweben und mittels RNA-in situ-
Hybridisierung überprüft. Abb. 3.22 B zeigt exemplarisch das Ergebnis der Real-Time
PCR mit Selm-Primern an cDNA aus Kalvarien-Osteoblasten. Nur im Wildtyp, nicht
aber im Knockout, ist Selm detektierbar. Für die ISH wurden Paraffinschnitte von
Mausextremitäten P4 angefertigt und mit einer DIG-markierten RNA-Sonde gegen Selm
hybridisiert. Bei Wildtyp-Mäusen konnte das Selm-typische Signal in den Osteoblasten
detektiert werden, in Selm-/--Mäusen hingegen nicht (Abb. 3.22 C). Da keine
funktionsfähigen Antikörper zur Verfügung standen, konnte der Knockout nicht auf
Protein-Ebene nachgewiesen werden.
Abb. 3.22: Nachweis des Selm-Knockouts. (A) Southern Blot mit XbaI-verdauter genomischer DNA aus der Niere von Wildtyp- (+/+) und Selm-/-- (-/-) Mäusen der beiden Stämme AA8 und AB11. Als Sonde diente ein 493 bp langes Fragment des LacZ-Gens der Knockout-Kassette. Ganz links: Molekulargewichtstandard mit Größen in bp. (B) Selm-Expression (normalisiert auf Actb) in Wildtyp- (+/+) und Selm-/-- (-/-) Osteoblasten aus P4 Kalvarien (Mittelwert + Standardabweichung., n = 4). (C) ISH an 5 µm-dicken Paraffinschnitten von P4 Hinterextremitäten. Schnitte von Wildtyp- (+/+) und Selm-/-- (-/-) Mäusen wurden mit einer DIG-markierten RNA-Sonde gegen Selm hybridisiert. Maßstabsbalken 0,5 mm.
3.2.4.2 X-Gal-Färbung Da das Knockout-Konstrukt ein LacZ-Gen unter der Kontrolle des Selm-Promotors
enthält, kann eine X-Gal-Färbung für den indirekten Nachweis der Selm-Expression
genutzt werden. Da kein Phänotyp in den Knockout-Tieren gesehen und dort eine
stärkere Färbung als in heterozygoten Mäusen erwartet wurde, wurden E16,5 und P4
3 Ergebnisse 43
Selm-/--Mäuse verwendet, um das Expressionsmuster von Selm zu verifizieren. Im
Vergleich zu mit Alizarinrot und Alzianblau gefärbten Embryonen (Abb. 3.23 A e, f),
deren Knochen rot und Knorpel blau angefärbt sind, ist eindeutig ein Signal in nahezu
allen knöchernen Strukturen des Skeletts zu erkennen (Abb. 3.23 A a, b). Im Wildtyp
(Abb. 3.23 A c, d) fehlt erwartungsgemäß das Signal, da hier keine Knockout-Kassette
im Genom vorhanden ist. In den P4 Selm-/--Mäusen sind ebenfalls nahezu alle
Skelettelemente, die durch enchondrale (z.B. Röhrenknochen) und desmale (z.B.
Schädelplatten) Ossifikation entstehen, angefärbt (Abb. 3.23 B).
Diese Ergebnisse bestätigen die starke Selm-Expression in sowohl enchondral als auch
desmal ossifizierenden Knochen, die bereits mit der ISH gezeigt werden konnte (vgl.
Abb. 3.19).
Abb. 3.23: X-Gal-Färbung. (A) X-Gal-Färbung von E16,5 Selm-/-- (a, b) und Wildtyp- (c, d) Mäusen (a, b). Wildtyp-Embryonen wurden mit Alizarinrot und Alzianblau gefärbt, um Knochen und Knorpel sichtbar zu machen (e, f). Die Schädelplatten sind durch Pfeile markiert. Maßstabsbalken 2 mm. (B) X-Gal-Färbung von P4 Wildtyp- (+/+) und Selm-/--Mäusen (-/-) (a). Detailaufnahmen des Kopfes (b), einer Hinterextremität (c) und der Rippen (d) der Selm-/--Mäuse sind dargestellt. Maßstabsbalken 5 mm.
3 Ergebnisse 44
3.2.5 Charakterisierung der Selm-Knockout-Maus Die phänotypische Charakterisierung der Selm-Knockout-Mäuse verschiedener
Altersstufen sollte helfen, die Funktion von SELM zu identifizieren. Dazu wurden die
Experimente an Mäusen unterschiedlicher Altersstufen jeweils an Tieren beider ES-
Zelllinien, AA8 und AB11 (vgl. 3.2.4), durchgeführt. Da keine Unterschiede zwischen
den Stämmen beobachtet werden konnten, werden im Folgenden nur die Ergebnisse
eines Stammes (bezeichnet als Selm-/-) dargestellt.
3.2.5.1 Genotypenverteilung Die Selm-/--Mäuse sind lebensfähig und fertil. Die Genotypen der Nachkommen
heterozygoter Tiere sind außerdem nach Mendel verteilt (24,1% Wildtyp, 51,9%
Heterozygote, 24,0% Knockout; n = 412)
3.2.5.2 Morphologische und Histologische Untersuchu ngen Äußerlich war kein Unterschied zwischen Wildtyp- und Selm-/--Mäusen zu erkennen.
Auch Lage und Größe bzw. Gewicht der inneren Organe zeigten keinerlei Unterschiede.
Um mögliche histologische Organveränderungen feststellen zu können, wurden
Paraffinschnitte der großen inneren Organe und der Hoden angefertigt und mit
Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Diese Routinefärbemethode der Histologie färbt
alle basophilen Strukturen der Zellen (v.a. DNA) blau und alle azidophilen Bestandteile
rot an. In Abb. 3.24 sind jeweils exemplarisch Übersichtsfärbungen von Herz, Lunge,
Leber, Niere, Milz und Hoden von 10 Wochen alten Wildtyp- und Selm-/--Mäusen
dargestellt. In keinem der genannten Gewebe konnten im Vergleich zwischen Wildtyp-
und Selm-/--Mäusen Auffälligkeiten in Morphologie und Histologie gefunden werden.
Außerdem wurden mittels Alzianblau-/Alizarinrot-Färbung die Selm-defizienten Mäuse
zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung auf phänotypische Veränderungen des
Knorpel-Knochensystems untersucht. Dazu wurden Selm-/--Mäuse im
Embryonalstadium E15,5, sowie im Alter von 4 Tagen (P4) und 10 Wochen mit
gleichaltrigen Wildtyp-Geschwistern verglichen (Abb. 3.25). Dabei konnten weder
Malformationen des Skelettsystems noch Größenunterschiede detektiert werden. Die
Skelette wurden auf vorhandene Deformationen oder Mineralisierungsdefekte der
Extremitäten, Rippen, Wirbelsäule und der kranialen Skelettelemente untersucht.
Zusätzlich wurden die Knochen von 10 Wochen alten Tieren vermessen, es konnte
jedoch kein Unterschied festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). In Abb. 3.25 C sind
exemplarisch Schädel, Arm und Beckenknochen dargestellt. Hierbei konnten, wie auch
bei den Knochen von P4 (Abb. 3.25 B) und E15,5 (Abb. 3.25 A) ebenfalls keine
signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp- und Selm-/--Mäusen detektiert werden.
3 Ergebnisse 45
Abb. 3.24: Histologie der großen inneren Organe und der Hoden. 5 µm-dicke Paraffinschnitte von den großen inneren Organen 10 Wochen alter Wildtyp- (+/+) und Selm-/-- (-/-) Mäuse wurden mit HE gefärbt. Maßstabsbalken: 1 mm (Übersicht) bzw. 0,1 mm (Vergrößerung).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass morphologische und histologische
Untersuchungen keinen Hinweis auf einen sichtbaren Phänotyp der Selm-/--Maus ergab.
Untersuchungen auf Proteinebene waren im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht
möglich, da weder kommerzielle Antikörper, noch ein selbst generierter Antikörper ein
spezifisches SELM-Signal zeigten.
3 Ergebnisse 46
Abb. 3.25: Skelettfärbung mit Alzianblau und Alizarinrot. Vergleichende Skelettfärbung von Wildtyp- (+/+) und Selm-/-- (-/-) Mäusen im Alter von (A) E15,5, (B) P4 und (C) 10 Wochen. Maßstabsbalken 2 mm.
3 Ergebnisse 47
3.2.6 Regulation der Selm-Expression durch die Unfolded Protein Response
Man geht davon aus, dass einige Selenoproteine an der ER-Stressantwort (unfolded
protein response, UPR) beteiligt sind (Labunskyy et al., 2007) und dass die ER-Stress-
Antwort wichtig für die Osteoblasten-Differenzierung ist (Murakami et al., 2009; Saito
et al., 2011). Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob
die Selm-Expression in Osteoblasten durch ER-Stress aktiviert wird. Dazu wurden
primäre Osteoblasten von Kalvarien 4 Tage alter Mäuse isoliert und in 6-well-Platten
kultiviert. Wenn die Zellen konfluent waren, wurden sie für 24 h mit Thapsigargin (TG)
oder Tunicamycin (TM) behandelt, um ER-Stress auszulösen. Da sowohl TG als auch
TM in DMSO gelöst waren, wurden DMSO-behandelte Zellen als Kontrolle verwendet.
Nach 24 h wurde die RNA der Zellen isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die
anschließende Real-Time PCR ergab eine 6-fache Hochregulation der Selm mRNA
nach ER-Stress-Induktion mit TG, wohingegen TM keinen Einfluss auf die Selm-
Expression hatte (Abb. 3.26 A).
Abb. 3.26: Induktion der Selm-Expression durch ER-Stress. (A, B) Real-Time PCR zur Analyse der Selm- (A) und Bip- (B) Expression (normalisiert auf Actb) in primären Osteoblasten aus P4 Kalvarien. Die RNA wurde 24 h nach Zugabe von 100 nM Thapsigargin (+ TG), 3 µg/ml Tunicamycin (+ TM), oder DMSO isoliert. Dargestellt ist die fold induction gegenüber DMSO-behandelten Zellen (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6; *** p < 0.001; Student's t-test). (C) Die Induktion von ER-Stress wurde durch eine Xbp1-spezifische PCR verifiziert (-: DMSO-behandelte Zellen). (D) Western Blot von Proteinen aus Zelllysaten DMSO- (-), TM- und TG-behandelter Osteoblasten mit einem Antikörper gegen ATF4. Ein anti-ACTB-Antikörper diente als Ladekontrolle.
Um nachzuweisen, dass tatsächlich ER-Stress ausgelöst worden war, wurde auch die
Expression von Bip, einem ER-Stress Marker (Kaufman, 2002), analysiert. Abb. 3.26 B
zeigt eine doppelt so hohe Bip-Expression nach Behandlung der Osteoblasten mit TG
im Vergleich zu TM-induzierten Zellen. Dies deutet darauf hin, dass TG zu stärkerem
ER-Stress in Osteoblasten führt als TM. Dieser Befund konnte mittels RT-PCR bestätigt
3 Ergebnisse 48
werden, in der einer der Haupt-Transducer von ER-Stress, Xbp1, amplifiziert wurde.
Xbp1-Transkripte werden nur unter ER-Stress durch unkonventionelles Spleißen
prozessiert, wodurch ein 26 bp langes Intron herausgeschnitten wird (vgl. 2.3.1). Für die
RT-PCR wurden Primer verwendet, die sowohl die gespleißte Form [XBP1(s)] als auch
die ungespleißte Form [Xbp1(u)] amplifizieren. In Abb. 3.26 C ist bei TG-induzierten
Zellen eine starke Bande für Xbp1(s) und eine schwache Bande für Xbp1(u) zu sehen,
wohingegen die Bande für Xbp1(s) in TM-behandelten Zellen nur schwach zu erkennen
ist. Zusätzlich konnte die Induktion von ER-Stress auf Proteinebene verifiziert werden.
Hierfür wurde aus den induzierten Zellen ein Lysat hergestellt, mittels SDS-PAGE
aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-ATF4-Antikörper hybridisiert. Anschließend
wurde der Blot als Ladekontrolle mit einem Antikörper gegen ACTB hybridisiert. Bei
etwa gleichen Proteinmengen konnte eine deutlich stärkere Bande auf Höhe von ATF4
– ebenfalls ein Marker für ER-Stress (Samali et al., 2010) – in TG- im Vergleich zu
TM-induzierten Zellen detektiert werden (Abb. 3.26 D).
Da die Induktion von UPR-Genen durch ER-Stress zum Großteil auf Ebene der
Transkription reguliert wird, sollte als nächstes der Promotor von Selm untersucht
werden.
3.2.7 Promotoranalyse von Selm Promotoren sind wichtige Elemente zur Regulation der Genexpression. Sie enthalten
neben Elementen für die Basispromotoraktivität zahlreiche Bindestellen für
Transkriptionsfaktoren. Durch die Kombination verschiedener, zum Teil gewebe- oder
entwicklungsspezifischer Transkriptionsfaktoren entsteht ein komplexes Regulations-
netzwerk (Blackwood und Kadonaga, 1998; Butler und Kadonaga, 2002; Rodelsperger
et al., 2011).
Für die Vorhersage des Selm-Promotors wurde das Programm „Gene2Promoter“ der
Genomatix-Software (www.genomatix.de) verwendet. Dabei wurde der Promotor aus
acht Spezies analysiert (Rattus norvegicus, Bos taurus, Canis lupus familiaris, Homo
sapiens, Pan troglodytes, Mus musculus, Macaca mulatta, Equus caballus). Abb. 3.27
zeigt die Lage und Länge des vorhergesagten murinen Selm-Promotors, der den
Ausgangspunkt für nachfolgende Klonierungen darstellte.
3 Ergebnisse 49
Abb. 3.27: Schematische Darstellung des murinen Selm-Promotors. Die Exons von Selm (NM_053267) mit dem Translationsstart (Start) sind in grün, der von Genomatix vorhergesagte Promotor in orange dargestellt.
Zur Überprüfung, ob es sich bei dem vorhergesagten Bereich tatsächlich um den
Promotor von Selm handelte, sollte ein Luziferase-Reportergen-Assay durchgeführt
werden. Hierzu wurde das 832 bp lange Fragment zunächst mittels PCR aus
genomischer DNA amplifiziert. Die Klonierung in das Luziferase-Reporterplasmid
pGL3 erfolgte ungerichtet nach Restriktionsverdau mit SmaI. Fehlerfreie Klone in
beiden Orientierungen (forward und reverse) wurden durch Sanger-Sequenzierung
identifiziert. Zusätzlich zur Klonierung des kompletten vorhergesagten
Promotorbereichs wurde ein Deletionsklon mittels Restriktionsverdau mit NheI und
AvrII hergestellt (s. Abb. 3.28). Die Promotoraktivität wurde mit Hilfe eines dualen
Luziferase-Assays in HEK293-Zellen analysiert. Neben dem Firefly-Luziferase-
Plasmid, das den Selm-Promotor enthielt, wurden die Zellen mit dem Referenzplasmid
pRL-TK, das ein Gen für die Renilla-Luziferase enthält, co-transfiziert. Dies diente als
endogene Kontrolle zum Ausgleich der Transfektionseffizienz und der Zellzahl. 48 h
nach der transienten Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Luziferase-Aktivität
der Zellextrakte in einem Luminometer gemessen. Die Luziferase-Aktivität ist hierbei
ein Maß für die Aktivität des Promotorfragments, unter dessen Kontrolle das
Luziferase-Gen exprimiert wird. Die Ergebnisse eines Luziferase-Assays, der in
Triplikaten durchgeführt wurde, sind in Abb. 3.28 dargestellt. Der vorhergesagte
Promotor (Selm_fw) zeigte eine 33-fach erhöhte Luziferase-Aktivität gegenüber der
basalen Luziferase-Aktivität des leeren pGL3-Vektors (pGL3). Die mit dem Leervektor
vergleichbare Aktivität des Promotors in gegensätzlicher Orientierung (Selm_rev)
spricht dafür, dass es sich bei dem von Genomatix vorhergesagten Fragment tatsächlich
um den Promotor von Selm handelt. Das Deletionskonstrukt (Del) wies eine ähnliche
Luziferase-Aktivität auf wie der vorhergesagte Promotor. Dies spricht dafür, dass die
für die Expression wesentlichen Promotorbereiche im 3‘-Bereich des vorhergesagten
Promotors liegen. Da das Deletionskonstrukt aber eine minimal geringere Luziferase-
Aktivität aufwies, wurde für weitere Versuche der komplette Promotor herangezogen.
3 Ergebnisse 50
Abb. 3.28: Aktivität des Selm-Promotors. Die Aktivität der unterschiedlichen Promotor-Konstrukte wurde 48 h nach transienter Transfektion in HEK293-Zellen mittels dualem Luziferase-Assay bestimmt. Links dargestellt sind die verschiedenen Promotorkonstrukte und rechts die dazugehörigen Ergebnisse der Luziferase-Messung. Als relative Luziferase-Aktivität wird der Quotient aus Firefly-Luziferase- und Renilla-Luziferase-Aktivität bezeichnet. Die Daten zeigen den auf pGL3 normierten Mittelwert aus 3 Messwerten und die dazugehörige Standardabweichung.
3.2.8 Regulation des Selm-Promotors durch XBP1 Die Induktion von UPR-Genen wie z.B. Chaperonen und Oxidoreduktasen durch ER-
Stress wird zum Großteil auf Transkriptionsebene reguliert. Um die Faltung
akkumulierter Proteine zu verstärken, tragen die drei proximalen ER-Stress-Sensoren
IRE1, ATF6, und PERK gleichermaßen zur Hochregulierung von UPR-Zielgenen bei
(Ellgaard und Helenius, 2003). Tatsächlich besitzen diverse UPR-Zielgene spezielle
Promotor-Elemente, die bei ER-Stress aktiviert werden und „ER-Stress-Element
(ERSE) I und II“ und „UPR-Element (UPRE)“ genannt werden (Groenendyk et al.,
2010). Da XBP1(s) sowohl an ERSE als auch an UPRE binden kann (Yamamoto et al.,
2004; Yamamoto et al., 2008), wurde der Selm-Promotor auf das Vorhandensein dieser
Bindungsstellen untersucht. Das Ergebnis dieser Analysen war die Identifikation eines
UPRE-ähnlichen GACGTGG-Motivs, das im Selm-Promotor unterschiedlichster
Vertebraten konserviert ist (Abb. 3.29) und eine putative XBP1-Bindestelle darstellt
(Acosta-Alvear et al., 2007).
Abb. 3.29: Konservierung der putativen XBP1-Bindestelle. Dargestellt ist die Konservierung der putativen XBP1-Bindestelle in der Promotorregion von Selm verschiedener Vertebraten. Die Zahlen geben die Position relativ zum Translationsstart an (H. sapiens NM_080430, M. musculus NM_053267, T. guttata XR_054047, X. tropicalis NM_001171607, D. rerio NM_178286).
3 Ergebnisse 51
Als nächstes wurde untersucht, ob dieses Motiv für die Induktion der Selm-
Transkription bei der ER-Stressantwort verantwortlich ist. Für den Assay wurde ein
Reporterkonstrukt verwendet, das das Firefly-Luziferase-Gen unter der Kontrolle des
murinen Selm-Promotors (−761 bis +71; +1: Beginn der Translation) enthält. 24 h nach
TG-Zugabe zeigte der Wildtyp-Selm-Promotor eine 3-fach verstärkte Luziferase-
Aktivität (Abb. 3.30 A) im Vergleich zu mit DMSO behandelten Zellen. Mittels Real-
Time PCR TG-behandelter NIH3T3-Zellen konnte ebenfalls eine 3,5-fach erhöhte
Selm-Expression nachgewiesen werden (Abb. 3.30 B, links). Die ER-Stress-Induktion
wurde mittels PCR mit Xbp1-spezifischen Primern verifiziert (Abb. 3.30 B, rechts).
Nach Einführung einer Mutation (Austausch von 4 bp) in die XBP1-Bindestelle
(GGATCGG statt GACGTGG) mittels gerichteter Mutagenese betrug die Luziferase-
Aktivität des Selm-Promotors in TG-behandelten Zellen nur noch 50% im Vergleich
zum Wildtyp (Abb. 3.30 A). Dadurch konnte die Beteiligung der XBP1-Bindestelle an
der Regulation der Selm-Expression bestätigt werden.
Abb. 3.30: Aktivierung des Selm-Promotors durch XBP1. (A) Luziferase-Assay mit dem Wildtyp-Selm-Promotor (Selm) oder einem Konstrukt mit mutierter XBP1-Bindestelle (mut). NIH3T3-Zellen wurden mit den Konstrukten transient transfiziert und für 24 h mit 100 nM TG (+TG) oder DMSO (-TG) behandelt. Dargestellt ist die relative Luziferase-Aktivität normalisiert auf die Wildtyp-Promotor-Aktivität DMSO-behandelter Zellen. Das Experiment wurde zweimal jeweils in Triplikaten durchgeführt (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6; ** p < 0.01; *** p < 0.001; Student's t-test). (B) Links: Real-time PCR zur Analyse der Selm-mRNA (normalisiert auf Actb) in NIH3T3-Zellen, die mit 100 nM TG (+ TG) oder DMSO (- TG) für 24 h behandelt worden waren. (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 5). Rechts: Die Induktion von ER-Stress wurde mit einer Xbp1-spezifischen PCR verifiziert. Actb diente als Kontrolle. (C) Luziferase-Assay an NIH3T3-Zellen, die mit den Selm-Promotor-Konstrukten und einem Leervektor (leer) bzw. einem Xbp1(s)- oder Xbp1(u)-Expressionsvektor co-transfiziert worden waren. Die Luziferase-Aktivität relativ zum Leervektor ist dargestellt (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6).
3 Ergebnisse 52
Die Co-Transfektion von Xbp1(s) mit den Reporterkonstrukten führte zu einer 2-fachen
Steigerung der Transkription des Wildtyp-Selm-Promotors, wohingegen Xbp1(u) keinen
signifikanten Einfluss auf die Luziferase-Aktivität hatte, da hier die
Transaktivierungsdomäne fehlt (Abb. 3.30 C). Dieses Ergebnis bestätigt nochmals den
stimulierenden Effekt von Xbp1(s) auf die Selm-Expression. Unerwarteterweise hatte
die Co-Transfektion von Xbp1(s) mit dem mutierten Promotorkonstrukt eine 3,5-fach
verringerte Luziferase-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp zur Folge (Abb. 3.30 C),
während die Promotoraktivität nach Co-Transfektion mit Xbp1(u) erwartungsgemäß
unverändert war. Da sich beide Spleißvarianten nur durch das Vorhandensein [Xbp1(s)]
bzw. Fehlen [Xbp1(u)] der Transaktivierungsdomäne unterscheiden, könnte die
reduzierte Promotoraktivität nach Überexpression von Xbp1(s) auf eine kompetitive
Bindung von Transkriptionsfaktoren zurückzuführen sein.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die UPR-Induktion durch TG, aber nicht
TM, zu einer 6-fachen Hochregulierung von Selm in primären Osteoblasten aus murinen
Kalvarien führte. TG verstärkte auch die Selm-Expression in NIH3T3-Zellen, die
wiederum durch die Mutation einer konservierten XBP1-Bindestelle reduziert war.
Darüber hinaus resultierte die Überexpression von Xbp1(s) in einer erhöhten Selm-
Expression, wohingegen die Co-Transfektion von Xbp1(s) und dem mutierten Selm-
Promotorkonstrukt zu einer reduzierten Selm-Expression führte. Insgesamt deuten diese
Ergebnisse stark darauf hin, dass die UPR, speziell XBP1, an der Regulation der Selm-
Expression beteiligt ist.
3.2.9 Suche nach Interaktionspartnern mittels Yeast-two-Hybrid-System
Da Interaktionspartner eines Proteins Hinweise auf dessen Funktion geben können,
sollten in der vorliegenden Arbeit Interaktionspartner von SELM mittels Yeast-Two-
Hybrid-System identifiziert werden. Dieses System stellt eine gute in vivo-Methode zur
Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionspartnern dar. Das zu untersuchende
Protein (Köder) wird hierbei an eine GAL4-DNA-Bindungsdomäne (DB) fusioniert und
zusammen mit einem Fusionsprotein aus Beute-Protein und GAL4-
Transaktivierungsdomäne (AD) in Hefezellen eingebracht. Interagieren diese beiden
Proteine miteinander, so gelangen DB und AD in unmittelbare Nähe und es kommt zur
Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors, der die Transkription von
Reportergenen aktiviert (Van Criekinge und Beyaert, 1999). Die Expression der
Reportergene wurde in Wachstumsassays (aur1-c, ade2, his3) bzw. über eine Blau-
Weiß-Selektion nachgewiesen (mel1). Durch die Kombination verschiedener
Wachstumsassays kann unterschiedlich stringent auf eine mögliche Köder-Beute-
Interaktion selektiert werden.
3 Ergebnisse 53
3.2.9.1 Generierung der Köder-Konstrukte Für die Suche nach möglichen Interaktionspartnern mittel Yeast-two-Hybrid dienten
zwei unterschiedliche Selm-Konstrukte als Köder. Der komplette ORF bzw. der ORF
ohne Signalpeptid wurde in frame mit der GAL4 DB in den Vektor pGBKT7 kloniert.
Da Hefen keine Selenoproteine besitzen und daher auch kein Selenocystein in Proteine
einbauen können, wurde das Sec-codierende TGA mittels gerichteter Mutagenese durch
das Codon TGT, das für ein Cystein codiert, ersetzt. Abb. 3.31 zeigt eine schematische
Darstellung der beiden Konstrukte. Der Erhalt fehlerfreier Klone wurde durch
Sequenzierung bestätigt.
Abb. 3.31: Schematische Darstellung der Y2H-Konstrukte. Es ist jeweils der Ausschnitt aus dem Vektor gezeigt, der für das Fusionsprotein aus GAL4-DB, MYC-tag und SELM codiert. pGBKT7-SELM-SP beinhaltet dabei den kompletten ORF von Selm, pGBKT7-SELM den ORF ohne Signalpeptid.
3.2.9.2 Autotransaktivierungstest der Köder Da für ein Screening nur solche Konstrukte geeignet sind, die die Reportergene nicht
von sich aus aktivieren können, muss der Köder vorher auf Transaktivierung getestet
werden. Hierzu wurde der S. cerevisiae Stamm Y2H-Gold mit den Köder-Konstrukten
pGBKT7-SELM (ohne Signalpeptid) und pGBKT7-SELM-SP (mit Signalpeptid)
transformiert. In beiden Fällen wird das Fusionskonstrukt durch den ADH-Promoter
(PADH1) reguliert und konstitutiv exprimiert. Zur Selektion der transformierten Hefen
diente das im pGBKT7-Vektor enthaltene trp1-Gen, das die Tryptophan (Trp)-
Auxotrophie der Hefe kompensiert, und somit das Wachstum auf Trp-Mangel-Medium
(SD/-Trp) ermöglicht. Beide Köder-Konstrukte wurden erfolgreich in Y2H-Gold
eingebracht. Die Autoreaktivität der Köder-Proteine wurde mit Hilfe der im Y2H-Gold
Stamm enthaltenen Reportergene mel1 und aur1-C getestet. Beide Köder-Konstrukte
konnten auf SD/-Trp/X-α-Gal-Platten wachsen, nicht jedoch auf Platten, die zusätzlich
AbA enthielten. Die erhaltenen Kolonien zeigten keine Blaufärbung, d.h. das mel1-
kodierte Enzym α-Galaktosidase wurde nicht aktiviert (Abb. 3.32 und Tab. 3.4). Beide
Köder-Konstrukte sind folglich nicht autotransaktivierend und konnten daher beide für
das folgende Yeast-Two-Hybrid Experiment verwendet werden.
3 Ergebnisse 54
Abb. 3.32: Autotransaktivierungstest der Köder-Konstrukte. Die SELM-Köder-Konstrukte ohne (pGBKT7-SELM) bzw. mit Signalpeptid (pGBKT7-SELM-SP) wurden in Y2H-Gold-Hefen eingebracht und auf SD/-Trp bzw. SD/-Trp/X- α-Gal-Platten selektioniert. Das Reportergen mel1, das für die α-Galaktosidase codiert, wurde bei keinem der Konstrukte aktiviert.
Tab. 3.4: Zusammenfassung der Ergebnisse des Autotransaktivierungstests.
pGBKT7-SELM pGBKT7-SELM-SP Selektivplatte Wachstum Farbe Wachstum Farbe SD/-Trp + weiß + weiß SD/-Trp/X-α-Gal + weiß + weiß SD/-Trp/ X-α-Gal/AbA - - - - +: Wachstum, -: kein Wachstum
3.2.9.3 Nachweis der Fusionsproteine mittels Wester n Blot Eine zusätzliche Voraussetzung für die Durchführung eines Yeast-Two-Hybrid-
Screenings ist, dass die Köder-Fusionsproteine in der Hefe synthetisiert werden und
keinen toxischen Effekt auf die Zellen haben. Der Beute-Vektor pGBKT7 enthält einen
c-MYC-tag, der einen Nachweis der Fusionsproteine mittels anti-MYC Antikörper
ermöglicht.
Um die Bildung der Köder-Proteine SELM-GAL4-DB und SELM-SP-GAL4-DB
nachzuweisen, wurden daher Western Blot Analysen durchgeführt. Als Positivkontrolle
wurde ein mit dem pGBKT7-53 Kontrollplasmid der Firma Clontech (Heidelberg)
transfizierter Y2H-Gold Hefestamm, als Negativkontrolle ein nicht transformierter
Y2H-Gold Hefestamm mitgeführt. Y2H-Gold Hefen wurden mit den entsprechenden
Konstrukten transformiert, lysiert und die im Zelllysat enthaltene Proteinmenge mit
Hilfe des Bradfordassays bestimmt (Bradford, 1976). 35-50 µg Protein wurden auf
einem 12 % SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine
Nitrocellulosemembran geblottet und mit einem Maus-anti-MYC-Antikörper detektiert.
In Abb. 3.33 ist in Spur 1, bei der Positivkontrolle, eine Bande bei 48 kDa zu erkennen,
3 Ergebnisse 55
die dem Fusionsprotein aus Domänen des p53, der GAL4-DB und dem cMyc-Tag
entspricht. In den untransfizierten Y2H-Gold Hefen, die als Negativkontrolle dienten,
konnte keine Bande detektiert werden (Spur 4). In Spur 2 ist eine Bande von 36 kDa zu
sehen, was dem erwarteten Molekulargewicht des Fusionsproteins SELM-SP mit der
GAL4 BD und c-MYC-Tag entspricht. Die Synthese des Fusionsproteins SELM-
GAL4-DB dagegen konnte auch nach mehrfachem Wiederholen des Experiments nicht
nachgewiesen werden (Spur 3). In Folge dessen wurde die Suche nach SELM-
Interaktionspartnern im Weiteren nur mit dem pGBKT7-SELM-SP Konstrukt
durchgeführt.
Abb. 3.33: Nachweis von Fusions-proteinen mittels Western Blot. Hefe-Zelllysate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und die Proteine mit einem anti-MYC-Antikörper detektiert. Spur 1: Positivkontrolle; Spur 2: SELM-SP-GAL4-DB; Spur 3: SELM-GAL4-DB; Spur 4: untransformierte Y2H-Gold-Hefen.
3.2.9.4 Screening auf Interaktionspartner Als Beute für das Yeast-Two-Hybrid-System diente der kommerziell erhältliche, mit
einer Mausembryonen (E17,5) -cDNA-Bank transformierte S. cerevisiae Stamm Y187.
Da die haploiden Hefe-Stämme Y187 und Y2H-Gold unterschiedlichen Paarungstypen
angehören, können diese durch Mating vereinigt werden. So entstehen diploide Hefen,
die sowohl den Köder als auch die Beute enthalten. Das Mating erfolgte für 24 h bei
30°C, wobei die Bildung der Zygoten optisch kontrolliert wurde. Je 200 µl der
Suspension wurde auf 50 SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA-Platten ausgestrichen, um die
Hefekolonien zu selektionieren. Zusätzlich wurden verschiedene Verdünnungsstufen
der Suspension auf SD/-Trp-, SD/-Leu- und SD /-Trp/-Leu-Platten ausgestrichen, um
die Mating-Effizienz zu bestimmen. Als Negativkontrolle dienten Hefen, die mit den
zwei Vektoren ohne Insert transformiert worden waren, als Positivkontrolle zwei
Proteine, von denen bekannt ist, dass sie miteinander interagieren (p53 und SV40 large
T antigen).
Die Anzahl der gescreenten Klone betrug 1,1 x 105, die Mating-Effizienz lag bei 4,2%.
50 Klone wurden von SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA-Platten auf SD/-His/-Leu/-Trp/X-α-
Gal/AbA-Platten umgestrichen. Neun Klone waren in der Lage die drei Reportergene
mel1, aur1-C und his3 zu aktivieren (Abb. 3.34 A). In einem weiteren Selektionsschritt
erfolgte der Test auf Aktivität des Reporters ade2, jedoch konnte keiner der Klone auf
3 Ergebnisse 56
SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA-Platten wachsen. Bei dieser Selektion auf vier
Reportergene handelt es sich allerdings um eine hochstringente Selektion, die nur bei
einer starken Interaktion, wie bei der Positivkontrolle (Abb. 3.34 B), überwunden
werden kann. Die dreifache Selektion vermindert das Risiko einer falsch-positiven
Interaktion aber bereits um ein Vielfaches. Bei den neun gefundenen Kandidaten könnte
es sich folglich um schwache Interaktionspartner von SELM handeln.
Abb. 3.34: Potentielle Interaktionspartner von SELM. A) Wachstum der neun Hefeklone mit potentiellen SELM-Interaktionspartnern auf 3-fach-Selektionsplatten. B) Wachstum der Positivkontrolle auf 4-fach-Selektionsplatten.
Das Ergebnis der Sequenzanalysen der neun Kandidatenklone ist in Tab. 3.5
dargestellt. Als physiologische Interaktionspartner von SELM kommen nur Proteine in
Frage, die die gleiche subzelluläre Lokalisation wie SELM aufweisen. Da Klon 5
(Mirg) überhaupt nicht für ein Protein codiert (es handelt sich hierbei um eine nicht-
codierende RNA) und von den restlichen acht Kandidaten nur die Prolyl-4-Hydroxylase
beta (P4HB) im ER lokalisiert ist, konnten von den neun potentiellen
Interaktionspartnern bereits acht ausgeschlossen werden.
Zur Verifizierung der Interaktion zwischen SELM und dem Kandidaten P4HB wurde
ein Rescreen durchgeführt. Dabei wurde getestet, ob das Anschalten der Reportergene
mel1, aur1 C, his3 und ade1 wiederholt werden kann. Dazu wurde das Beute-Plasmid
pGADT7-P4HB aus den Y187-Hefen isoliert und in E. coli amplifiziert. Anschließend
erfolgte die Co-Transformation von Y2H-Gold-Hefen mit dem Beute- und Köder-
Plasmid pGBKT7-SELM bzw. mit dem Beute-Plasmid und dem Leervektor pGBKT7.
Letzteres diente der Überprüfung eines autotransaktivierenden Effekts der Beute-
Plasmide. Zusätzlich konnte durch Transformation der Y2H-Gold Hefen mit dem
pGBKT7-Leervektor bzw. dem pGADT7-Leervektor allein eine köder- bzw.
beutevektorbedingte Aktivierung der Reportergene untersucht werden. Das
3 Ergebnisse 57
Vorhandensein beider Plasmide in den Y2H-Gold-Hefen wurde durch das Wachsen
weißer Klone auf Trp- und Leu-Mangelmedium bestätigt (Daten nicht gezeigt). Es
waren allerdings sowohl die Köder-Beute co-transformierten als auch die Leervektor-
Beute co-transformierten Hefen in der Lage, das mel1-Reportergen anzuschalten und
eine Blaufärbung hervorzurufen (Daten nicht gezeigt). Auf stringenteren Selektivplatten
konnte bei keinem der Konstrukte Wachstum detektiert werden (Daten nicht gezeigt).
Da die Interaktion von SELM mit P4HB mit einem Rescreen nicht bestätigt werden
konnte, wurde diese nicht weiter analysiert.
Tab. 3.5: Potentielle Interaktionspartner von SELM
Klon-Nr.
Gen Lokalisation im ER
Funktion
1 Lysm nein Abbau bakterieller Zellwand 2 Wdr53 nein Nicht bekannt 3 H3c1/H3c2 nein Histoncluster 4 Hk1 nein Glycolyse-Enzym: Glc � G6P 5 Mirg nein Nicht-codierende RNA; imprinted, maternal
exprimiert 6 P4hb ja Proteindisulfidisomerase (PDI), Hydroxylierung
von Prolylresten in Präprokollagenen 7 Osgin nein oxidative stress response protein that regulates
cell death, regulates apoptosis 8 Sfrs6 nein Spleißfaktor 9 Ssna1 nein Mikrotubuli-assoziert, Plasmamembran-Transport
in Mausembryogenese
4 Diskussion
Ein komplexes regulatorisches Netzwerk ist für die Bildung und Homöostase des
Skeletts verantwortlich, wobei die beteiligten Gene und Mechanismen noch nicht
vollständig aufgeklärt sind. Untersuchungen am Tiermodell und genetische Studien von
Skeletterkrankungen können dazu beitragen, den hochkomplexen Prozess der
Knorpel-/Knochenentwicklung besser zu verstehen.
Aktuell gibt es 456 verschiedene genetisch-bedingte Skeletterkrankungen, die aufgrund
klinischer, radiologischer und molekularer Befunde in 40 Gruppen unterteilt werden
können (Warman et al., 2011). Dabei sind die einzelnen Defekte meist sehr selten,
wobei die Skeletterkrankungen zusammengenommen jedoch recht häufig sind. Die
molekularen Ursachen sowie die Pathomechanismen sind jedoch nur unzureichend
verstanden. Daher ist es wichtig, neue Kandidatengene für diese Erkrankungen zu
identifizieren und deren Rolle während der Skelettentwicklung näher zu
charakterisieren. Dementsprechend wurden dazu in der vorliegenden Arbeit zwei
unterschiedliche Ansätze verfolgt.
Zum einen wurde in einem klassischen positionellen Klonierungsansatz die genetische
Ursache der SEMD-JL Typ Hall in einer konsanguinen Familie mittels Homozygotie-
Kartierung, Sequenzierung von Kandidaten sowie Next Generation Sequencing
untersucht.
Zum anderen wurde das Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert, das von
Tagariello et al. (2005) im Rahmen eines EST-Projektes als differentiell exprimiertes
Gen mit möglicher Funktion in der Skelettentwicklung beschrieben worden war. Um
die Rolle von SELM während der Knorpel-/Knochenentwicklung näher zu untersuchen
und so möglicherweise Hinweise auf korrespondierende Kandidatenerkrankungen für
dieses Gen zu finden, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Expressionsanalysen
am Huhn- und Mausmodell durchgeführt, eine Knockout-Maus generiert und
charakterisiert, die Regulation der Genexpression analysiert und Interaktionspartner
mittel Yeast-two-Hybrid-System gesucht.
4 Diskussion 60
4.1 Suche nach der genetischen Ursache der SEMD-JL
Typ Hall
4.1.1 Diagnose und Art der Vererbung In der vorliegenden Arbeit wurde eine konsanguine Familie türkischer Abstammung mit
4 Betroffenen untersucht. Die Indexpatientin wies epi- und metaphysäre Veränderungen
der Röhrenknochen, Kleinwuchs, Gelenkschwäche mit -dislokationen, eine verzögerte
Ossifikation der Handknochen, grazile Metakarpalia, feine vertikale Streifen in den
Metaphysen und eine schwere Skoliose auf. Aufgrund der klinischen und
radiologischen Befunde wurde eine SEMD-JL Typ Hall (OMIM 603546) diagnostiziert.
Laut Auskunft der Indexpatientin wiesen die übrigen Betroffenen die genannten
Symptome ebenfalls auf. Da die Indexpatientin jedoch erst im Alter von 35 Jahren
vorstellig wurde und keine Röntgenaufnahmen aus früheren Jahren verfügbar sind, ist
eine exakte Diagnose schwierig. Ein Krankheitsbild, das der SEMD-JL Typ Hall sehr
ähnlich ist und eine Differentialdiagnose erfordert, ist die autosomal rezessiv vererbte
spondylo-nasale Dysplasie mit striären Veränderungen der Metaphysen
(SPONASTRIME Dysplasie, OMIM 271510) (Fanconi et al., 1983). Die klinischen und
radiologischen Befunde beider Erkrankungen weisen einige Übereinstimmungen auf.
Dazu gehört z.B. der Kleinwuchs, eine Hypoplasie des Mittelgesichts und longitudinale
metaphysäre Streifen an den Knien (Kim et al., 2009). Patienten mit SEMD-JL Typ
Hall zeigen darüber hinaus noch auffallende epiphysäre Veränderungen, spezifische
Veränderungen der Handknochen, Gelenkschwäche mit Dislokationen und milde, aber
deutliche Veränderungen der Wirbelsäule (Hall et al., 1998). Eine weitere SEMD-JL,
die von der SEMD-JL Typ Hall unterschieden werden muss, ist die SEMD-JL Typ
Beighton (OMIM 271640) mit autosomal rezessivem Vererbungsmodus (Beighton und
Kozlowski, 1980; Beighton et al., 1984). Letztere weist auch eine Hypermobilität der
Gelenke auf, wobei eher die Hüften und Ellbogen als die Knie betroffen sind. Zwar
weisen beide Erkrankungen auch Gemeinsamkeiten auf, jedoch sind Patienten mit
SEMD-JL Typ Beighton aufgrund der fehlenden metaphysären Streifen und kurzen,
dicken Metakarpalia eindeutig von Patienten mit SEMD-JL Typ Hall zu unterscheiden
(Kim et al., 2009). Es gibt also einige Hinweise darauf, dass es sich bei dem hier
vorgestellten Fall tatsächlich um eine SEMD-JL Typ Hall handelt.
Bei den bisher bekannten Fällen von SEMD-JL Typ Hall handelt es sich meist um
sporadische Fälle (Hall et al., 1998; Smith et al., 1999; Hall et al., 2002; Megarbane et
al., 2003; Nishimura et al., 2003; Holder-Espinasse et al., 2004; Park et al., 2007; Kim
et al., 2009) oder Vater bzw. Mutter zu Sohn bzw. Tochter Transmission (Hall et al.,
2002; Rossi et al., 2005; Park et al., 2007; Kim et al., 2009), weshalb allgemein von
einer autosomal dominanten Vererbung ausgegangen wird. Interessanterweise legt der
4 Diskussion 61
vorliegende Stammbaum im Gegensatz hierzu eine autosomal rezessive Vererbung
nahe. Es könnte sich daher im vorliegenden Fall um eine neue Unterform der SEMD-JL
Typ Hall handeln.
4.1.2 Funktion der Proteine NIN und POLE2 Mittels Homozygotie-Kartierung konnte eine 8 Mb und 64 Gene umfassende
Kopplungsregion mit einem LOD-Score von 4,2 auf Chromosom 14 (14q21.3 – q22.3)
kartiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte damit zum ersten Mal ein SEMD-JL
Locus identifiziert werden. Das anschließende Kandidatengen-Screening ergab eine
Missense-Mutation (c.6345A>G) in Ninein (NIN). Um diese Mutation zu bestätigen,
wurde mittels Next Generation Sequencing das komplette Exom der Indexpatientin
sequenziert. Dabei wurde neben der NIN-Mutation noch eine zweite Mutation
(c.283C>T) in der Polymerase epsilon Untereinheit 2 (POLE2) innerhalb der
Kopplungsregion gefunden. Beide Gene werden in Mausgeweben ubiquitär exprimiert,
auch in Knorpel und Knochen. Jedoch gibt es zu keinem der Gene Informationen
darüber, ob und, wenn ja, welche Rolle sie bei der Skelettentwicklung und/oder –
Homöostase spielen. Intensive bioinformatische Analysen der zwei Mutationen wurden
durchgeführt, führten jedoch zu keinem eindeutigen Ergebnis. Beide betroffenen
Aminosäuren sind in Vertebraten hoch konserviert und wurden von mindestens einem
von den zwei in der vorliegenden Arbeit verwendeten, bioinformatischen
Vorhersageprogrammen (SIFT, Polyphen-2) als krankheitsverursachend eingestuft.
Eine detaillierte Strukturanalyse der beiden Proteine ergab, dass die Mutation in NIN
einen negativen Effekt auf die Stabilität der Coiled-coil-Region hat, während die
Mutation in POLE2 keine Domäne betrifft. Coiled-coil-Regionen sind typischerweise
an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt (McFarlane et al., 2009; Taru und Jin, 2011).
Die Mutation könnte somit dazu führen, dass Interaktionspartner von NIN nicht mehr
oder schlechter binden können (Simon und van der Meer, 2007; Shuttleworth, 2012). Im
Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte mit immunzytochemischen Verfahren ein
direkter Effekt der Mutationen auf die subzelluläre Lokalisation der Proteine
ausgeschlossen werden. Im Moment sind keine weiteren experimentellen Daten
verfügbar, die den biologischen Effekt und so die Ursächlichkeit der beiden Mutationen
unterstützen.
Im Folgenden sollen die vorhandenen Daten aus der Literatur näher betrachtet werden,
um möglicherweise Rückschlüsse auf die Ursächlichkeit der beiden Mutationen ziehen
zu können.
4.1.2.1 POLE2 Über POLE2 ist bisher nur sehr wenig bekannt. POLE2 ist die Untereinheit B der DNA
Polymerase ε (POL ε). Die humane POL ε besteht aus vier Untereinheiten (A-D) und ist
4 Diskussion 62
an der DNA-Replikation im Nukleus beteiligt (Wang, 1991; Burgers et al., 2001).
Außerdem könnte Pol ε eine Rolle bei der Zellzykluskontrolle und DNA-Reparatur
spielen (Sugino, 1995; Wada et al., 2002). Bisher sind keine Krankheiten bekannt, die
durch Mutationen in einem DNA-Polymerase-Gen verursacht werden. Zusammen mit
den experimentellen Befunden sprechen die Daten eher dafür, dass die gefundene
c.283C>T Mutation nicht die für die Erkrankung ursächliche Mutation darstellt.
4.1.2.2 NIN Ninein (NIN) ist ein zentrosomales Protein, das am proximalen Ende beider Zentriolen
und an den subdistalen Anhängen des Mutterzentriols zu finden ist (Ou et al., 2002). Es
ist bereits bekannt, dass NIN eine wichtige Rolle bei der Verankerung von Mikrotubuli
(MT)-Minusenden am Mutterzentriol spielt und dort mit dem γ-Tubulin-Ringkomplex
interagiert (Stillwell et al., 2004; Delgehyr et al., 2005). Ninein ist daher für die
Funktion des Zentrosoms als Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) von großer
Bedeutung. Darüber hinaus könnte NIN auch an der Ziliogenese beteiligt sein (Vladar
und Stearns, 2007). Für viele zentrosomale Proteine konnte bereits eine wichtige Rolle
für die Bildung, Aufrechterhaltung oder Funktion des primären Ziliums nachgewiesen
werden (Nigg und Raff, 2009). Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass Ninein mit
der Skelettentwicklung und Skelettdysplasien in Verbindung steht, da ziliäre Defekte
bereits als Ursache verschiedener Chondrodysplasien identifiziert wurden. In Tab. 4.1
ist eine Reihe von Ziliopathien mit skelettärer Beteiligung und ihren betroffenen Genen
dargestellt.
Tab. 4.1: Humane Ziliopathien mit skelettärer Beteiligung.
Name OMIM# Betroffenes Gen Referenz Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) 209900 BBS1-16 (Ansley et al., 2003;
Tobin et al., 2008) Oral-Facial-Digital-Syndrom 1 (OFD1)
311200 OFD1 (Ferrante et al., 2006; Bimonte et al., 2011)
Ellis-van-Crefeld-Syndrom (EvC) 225500 EVC, EVC2 (Ruiz-Perez et al., 2007)
Asphyxating thoracic dystrophy 2 (ATD2); Jeune-Syndrom
611623 IFT80 (Beales et al., 2007)
Meckel-Syndrom Typ 1 (MKS1) 249000 MKS1 (Kyttala et al., 2006) Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)
17390 PKD1 (Turco et al., 1993)
Jeubert-Syndrom Typ 7 (JBTS7) 611560 RPGRIP1L (Arts et al., 2007; Brancati et al., 2008)
Verändert nach (Haycraft und Serra, 2008).
Dabei ist die genaue ziliäre Lokalisation und die Funktion der betroffenen Genprodukte
unterschiedlich (Abb. 4.1). Einige der Proteine – OFD1, BBS1-16, EVC und MKS1 –
sind am Basalkörper lokalisiert. IFT80 dagegen ist als Teil des IFT-B-Komplexes, der
für den anterograden Transport im Zilium verantwortlich ist, im Axonem des Ziliums zu
4 Diskussion 63
finden und PC1 (Polycystin 1), das Genprodukt von PKD1, schließlich in der
Zilienmembran. Dort vermittelt es eine mechanosensorische Funktion des Ziliums,
indem es als Sensor für die strömungsabhängige Ca2+-Signaltransduktion dient (Singla
und Reiter, 2006). Loss-of-function-Mutationen in OFD1, BBS, IFT80 und MKS1
führen zu fehlenden oder kürzeren Zilien (Nachury et al., 2007; Gerdes et al., 2009;
Bimonte et al., 2011), wohingegen EVC und EVC2 nicht notwendig für die Bildung
oder Aufrechterhaltung von Zilien sind. So führen Mutationen in EVC oder EVC2 nicht
zu veränderten Zilien, sondern zu einer Störung des Hedgehog-Signalwegs und damit
zum Funktionsverlust der Zilien.
Abb. 4.1: Übersicht über die Lokalisation einiger ziliärer Proteine. (verändert nach (Gerdes et al., 2009)).
Interessanterweise wurden bereits homozygote Loss-of-function-Mutationen in
Proteinen beschrieben, die genau wie NIN Bestandteil des ziliären Basalkörpers sind.
So führen beispielsweise Mutationen in Pericentrin (PCNT2) zu primordialem
Kleinwuchs Typ Majewski II (MOPD2, OMIM 210720) (Rauch et al., 2008) und EVC
bzw. EVC2 ist in ungefähr zwei Dritteln der Patienten mit Ellis-van-Creveld-Syndrom
(EVC, OMIM 225500) mutiert (Tompson et al., 2007; Valencia et al., 2009).
Darüber hinaus gibt es weitere Belege dafür, dass primäre Zilien eine wichtige Rolle in
der Skelettentwicklung spielen. Während der Entwicklung befinden sich primäre Zilien
auf nahezu allen Chondrozyten sowie auf Osteoblasten und Osteozyten (Haycraft und
Serra, 2008; Kaushik et al., 2009). Dort sind die primären Zilien wichtig für die
4 Diskussion 64
Hedgehog-Signalübertragung (Ruiz-Perez et al., 2007; Wong und Reiter, 2008), spielen
eine spezifische Rolle im Aufbau und Aufrechterhaltung der Säulenstruktur der
proliferierenden Chondrozyten (Haycraft et al., 2007; Song et al., 2007; Haycraft und
Serra, 2008), und dienen wahrscheinlich über Interaktionen mit der ECM als Sensoren
für die mechanische Belastung des artikulären Knorpel (McGlashan et al., 2006;
McGlashan et al., 2008; Whitfield, 2008; Knight et al., 2009). Da kein
Patientenmaterial für weitere Analysen zur Verfügung stand, konnte der Einfluss der
Mutation auf die Bildung und Funktion der Zilien leider nicht experimentell untersucht
werden. Zusammengenommen scheint aber aufgrund der verfügbaren Daten in der
Literatur und des destabilisierenden Effektes der Mutation auf eine der Coiled-coil-
Domänen des Proteins, NIN der bessere Kandidat für die SEMD-JL Typ Hall zu sein.
Jedoch muss auch ein synergistischer Effekt der beiden Mutationen in Betracht gezogen
werden. So könnten die gefundenen Mutationen in Kombination für den beobachteten
Phänotyp verantwortlich sein. Aufgrund der engen Nachbarschaft beider Gene würde
diese mit großer Wahrscheinlichkeit in der Familie auch gemeinsam segregieren.
4 Diskussion 65
4.2 Funktionelle Analysen von Selenoprotein M und dessen Rolle in der Skelettentwicklung
Parallel zu dem Patienten-orientierten Ansatz wurde eine eher grundlegende Strategie
zur Identifizierung neuer Komponenten des Knorpel-/Knochensystems angewendet.
Hierbei sollte SELM weitergehend untersucht werden, ein Gen, das im Rahmen eines
EST-Projektes als neues Kandidatengen für die Knorpel-/Knochenentwicklung
beschrieben worden war (Tagariello et al., 2005). Ziel der vorliegenden Arbeit war
daher eine funktionelle Charakterisierung von SELM in Bezug auf seine Bedeutung für
das Skelettsystem. Die Untersuchungen hierzu wurden am Ortholog von Maus (Selm)
und Huhn (selm) durchgeführt.
4.2.1 Expressionsstudien In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal die Selm-Expression während der
Entwicklung untersucht. Die RNA-in situ-Hybridisierung an Schnitten unterschiedlicher
Entwicklungsstadien von Maus und Huhn zeigte eine sehr starke Selm-Expression im
Gehirn, in Sehnen und Knochen. Die qPCR an verschiedenen Geweben von Hühnern
des Stadiums HH40 zeigte eine besonders starke Expression von selm im Knochen und
ansonsten eine moderate ubiquitäre Expression. Die Expression in Knochen erstreckte
sich dabei nicht nur auf desmal ossifizierende Skelettelemente, sondern auch auf solche,
die durch enchondrale Ossifikation entstehen. Die Expression von Selm konnte in den
knöchernen Strukturen in allen untersuchten Entwicklungsstadien von Maus und Huhn
detektiert werden. Die partielle Co-Expression mit Bglap – einem Marker für späte
Osteoblasten (Cohen, 2006) – und fast vollständige Co-Expression mit Col1a1 – einem
Marker für frühe Osteoblasten (Jikko et al., 1999) – deutet darauf hin, dass es sich
hierbei um eine spezifische Expression in Osteoblasten handelt. Dies konnte mit
Expressionsanalysen an primären Osteoblasten und der Prä-Osteoblasten-Zelllinie
MC3T3 bestätigt werden. Hier war Selm zusammen mit Osteoblastenmarkern in allen
untersuchten Differenzierungsstadien sehr stark exprimiert, wohingegen die selm-
Expression in primären mesenchymalen Zellen, die zu Chondrozyten differenziert
wurden (micromass cultures), nur sehr schwach oder gar nicht detektierbar war. Im
Verlauf der Extremitätenentwicklung zeigt sowohl das Expressionsprofil von selm als
auch das von bglap einen nahezu kontinuierlichen Anstieg über die mit qPCR
analysierten Entwicklungsstadien, die an cDNA aus Hühnerflügeln untersucht wurden.
Neben der Expression im Knochen konnte eine Selm-Expression bei der Maus auch im
olfaktorischen Epithel und im Gehirn, speziell im Kleinhirn, nachgewiesen werden.
Dieses Ergebnis bestätigt frühere Untersuchungen von Korotkov et al. (2002), der
mittels Northern Blot-Analysen an adulten murinen Geweben zeigen konnte, dass Selm
4 Diskussion 66
am stärksten im Gehirn exprimiert wird. Jedoch wurde bei diesen Analysen die
Expression in Knochen nicht untersucht.
Auch konnte die selm-Expression in Sehnen und Ligamenten detektiert werden. Diese
verbinden die verschiedenen Elemente des muskuloskelettären Systems und bestehen
aus dicht gepacktem, Kollagen-reichen Bindegewebe. Zwischen den Kollagenfasern
liegen elongierte Fibroblasten (Tenozyten), die entlang der Sehnenachse angeordnet
sind (Benjamin und Ralphs, 1997; Kannus, 2000). In der Anfangsphase der
muskuloskelettalen Entwicklung beginnen Sehnenvorläuferzellen zu proliferieren und
bilden eine Sehnenanlage. Diese teilt sich anschließend in die unterschiedlichen Sehnen
auf, die mit den sich entwickelnden Muskeln und Skelettelementen interagieren und
diese miteinander verbinden (Kardon, 1998). Um die selm-Expression in Sehnen näher
zu untersuchen, wurde sie mit der Expression von den Sehnenmarkern scx und tnmd
(Blitz et al., 2009) verglichen. Bei SCX handelt es sich um einen für die
Sehnenentwicklung essentiellen Transkriptionsfaktor der basischen Helix-Loop-Helix-
(bHLH)-Familie, der in Vorläufern und Zellen aller Sehnen und Ligamente exprimiert
wird und deren Differenzierung reguliert (Cserjesi et al., 1995; Schweitzer et al., 2001;
Murchison et al., 2007). TNMD hingegen ist ein Typ II Transmembranprotein und wird
vor allem in dichtem Bindegewebe exprimiert (Brandau et al., 2001; Shukunami et al.,
2006). Dabei ist der Beginn der Tnmd-Expression mit der Differenzierung von
Tenozyten assoziiert. TNMD gilt als Marker für reife Tenozyten und stellt damit einen
späten Sehnenmarker dar (Shukunami et al., 2006).
Bei der ISH im Huhn konnte eine Co-Expression von selm mit scx und tnmd gezeigt
werden, wobei selm- und scx-Signale auch an Stellen, an denen kein tnmd zu sehen ist,
nachweisbar waren. Dies spricht für eine selm-Expression in Sehnenvorläuferzellen und
reifen Tenozyten. Dafür sprechen auch die entsprechenden Expressionsprofile, die
mittels qPCR aufgenommen wurden. Hier sieht man einen Anstieg der selm-Expression
bis HH34, einen kurzen Abfall bei HH35 – entsprechend der Expression von scx – und
ab da einen erneuten Anstieg. Ungefähr zum gleichen Zeitpunkt ist auch ein starker
Anstieg der tnmd-Expression zu verzeichnen.
Die starke Expression in Osteoblasten bzw. Tenozyten – den Haupt-
Matrixproduzierenden Zellen des Knochens bzw. der Sehnen – könnte darauf
hinweisen, dass das ER-residente Protein SELM eine Rolle bei der Prozessierung von
ECM-Proteinen spielt. SELM wird bereits als Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase bzw. als
Protein-Disulfid-Isomerase diskutiert, die an der Ausbildung, Reduktion oder
Isomerisierung von Disulfidbrücken im ER beteiligt sein könnte (Fomenko und
Gladyshev, 2003; Ferguson et al., 2006; Labunskyy et al., 2007). Ein Charakteristikum
der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI)-Familie ist das Thioredoxin-Redoxmotiv CxxC.
SELM enthält dementsprechend eine Thioredoxin-ähnliche Domäne, die das Redox-
4 Diskussion 67
Motiv CxxU (U = Sec) beinhaltet. Durch ein N-terminales Signalpeptid und ein
spezifisches Retentionssignal am C-Terminus, sind sowohl SELM als auch die PDIs im
ER lokalisiert (Haugejorden et al., 1991; Korotkov et al., 2002). Es ist denkbar, dass
SELM im gut ausgeprägten ER der Osteoblasten ähnlich wie die PDIs als Disulfid-
Isomerase eine Rolle während der Knochenentwicklung spielen könnte. Die mittels
Yeast-Two-Hybrid-System gefundene Interaktion von SELM mit der PDI P4HB scheint
dies zu bekräftigen, auch wenn diese nicht bestätigt werden konnte. Zu den Matrix-
Proteinen, die Disulfidbrücken besitzen und somit potentielle Substrate für SELM
wären, gehören viele Kollagene. Typ I Kollagen ist das häufigste fibrilläre Kollagen in
der Extrazellulären Matrix des Knochens und bestimmt dessen Festigkeit (Hanagata et
al., 2011). Dieses Kollagen ist auch der Hauptbestandteil von Sehnen, in denen daneben
verstärkt aber auch Typ III, IV, V und VI Kollagen vorkommen (Benjamin und Ralphs,
2000; Kjaer, 2004). PDIs spielen bei der Prozessierung fibrillärer Kollagene eine
wichtige Rolle. Nach dem co-translationalen Transport der Prokollagene in das ER
werden die Prolin- und einzelne Lysin-Reste hydroxyliert. Anschließend werden intra-
und intermolekulare Disulfidbrücken in den C-Propeptiden ausgebildet (katalysiert
durch Protein-Disulfid-Isomerasen), die die Bildung der Tripelhelix einleiten. Darauf
folgt die Sekretion der der Prokollagen-Tripelhelix, die Abspaltung der Propeptide und
schließlich die Zusammenlagerung zu Kollagenfibrillen (Ayad et al., 1998).
4.2.2 Möglicher Zusammenhang von SELM mit der UPR Bei der Prozessierung von ECM-Proteinen ist die korrekte Faltung eine Voraussetzung
für die Sekretion, wohingegen fehlgefaltete Proteine im ER zurückgehalten werden. Die
Akkumulation von fehlgefalteten oder unterglykosylierten Proteinen resultiert in ER-
Stress (Wu und Kaufman, 2006; Groenendyk et al., 2010). Um die Proteinlast im ER
bei ER-Stress zu verringern und Apoptose zu verhindern, hat die Zelle mehrere
Mechanismen entwickelt, die zusammengenommen als Unfolded Protein Response
(UPR) bezeichnet werden. Wenn die falsch gefalteten Proteine durch die UPR nicht
repariert werden können, werden sie ins Zytosol retrotransloziert und anschließend in
einem Prozess, der „ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD)“ genannt wird,
degradiert (Lilley und Ploegh, 2004; Ye et al., 2004; Meusser et al., 2005). Derzeit sind
verschiedene ER-Stress induzierende Reagenzien verfügbar, die die Analyse der UPR in
vitro ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen Thapsigargin (TG), ein
Inhibitor der ER Ca2+-ATPase, der die Ca2+-Speicher entleert, und zum anderen
Tunicamycin (TM), ein Glykosylierungs-Inhibitor, verwendet (Lee, 2001). Nach
Behandlung von primären Osteoblasten mit TG, aber nicht TM, konnte eine verstärkte
Selm-Expression beobachtet werden. Demzufolge wird Selm durch ER-Stress
differentiell reguliert. Durch TG verursachter, akuter ER-Stress induzierte die Selm-
Expression, wohingegen durch TM verursachter, adaptiver ER-Stress keinen Einfluss
4 Diskussion 68
auf die Expression von Selm hatte. Tatsächlich konnte bereits nachgewiesen werden,
dass die Stressantwort von Osteoblasten variabel ist; während milder ER-Stress die
Expression von Osteoblasten-spezifischen Genen erhöht, fördert schwerer ER-Stress die
Apoptose (Hamamura und Yokota, 2007; Hamamura et al., 2008). Dies könnte darauf
hindeuten, dass SELM eine Rolle bei ER-Stress spielt, der durch pathologische
Veränderungen verursacht wird (siehe auch 4.2.3.3).
An der Aktivierung von UPR-Zielgenen sind mehrere Transkriptionsfaktoren beteiligt,
wobei XBP1 ein Haupt-Transducer von ER-Stress ist. Xbp1-Transkripte werden durch
unkonventionelles Spleißen prozessiert, wodurch ein 26 bp langes Intron
herausgeschnitten wird. Nur die gespleißte Form [XBP1(s)] bildet einen aktiven
Transkriptionsfaktor, der die Expression von UPR-Genen verstärkt (Rutkowski und
Kaufman, 2007). Die Überexpression von gespleißtem Xbp1(s) und die anschließende
Erstellung eines Expressionsprofils wurde bereits früher genutzt, um verschiedene
potentielle XBP1-Zielgene zu identifizieren (Lee et al., 2003; Shaffer et al., 2004;
Sriburi et al., 2007). Die meisten davon sind proteinfaltende ER Chaperone, ERAD-
Komponenten oder Bestandteil der ER-Golgi-Transportmaschinerie (Acosta-Alvear et
al., 2007; Yamamoto et al., 2008), ebenso Proteine, die an der Disulfidbrückenbildung
beteiligt sind (Lee et al., 2003). Da SELM eine potentielle Thiol-Disulfid-
Oxidoreduktase darstellt, wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft, ob Selm durch
XBP1(s) reguliert wird. Es konnte hierbei gezeigt werden, dass Selm durch
Überexpression von Xbp1(s) hochreguliert wird. Dies bestätigt die jüngsten Ergebnisse
von Sriburi et al., die eine erhöhte Expression verschiedener ER-Gene nach Xbp1(s)
Überexpression und Erstellung eines Expressionsprofils zeigten, darunter Selm (Sriburi
et al., 2007). Um zu testen, ob XBP1 direkt an der Regulation der Selm-Expression
beteiligt ist, wurde der Selm-Promotor analysiert und eine hochkonservierte putative
XBP1-Bindestelle identifiziert. Dabei war sowohl die Sequenz (GACGTGG) als auch
die Position relativ zum Translationsstart in allen untersuchten Vertebraten konserviert.
Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Acosta-Alvear et al. überein, die
herausgefunden hatten, dass die Mehrheit der XBP1-Bindestellen innerhalb von 500 bp
um den Transkriptionsstart lokalisiert ist, mit der größten Anreicherung innerhalb von
200 bp (Acosta-Alvear et al., 2007). Durch Mutation des Selm-Promotors konnte
bestätigt werden, dass Selm direkt durch XBP1 reguliert wird. Selm war auch eines von
545 XBP1-Zielgenen, die von Acosta-Alvear et al. mittels ChIP-on-Chip identifiziert
wurden (Acosta-Alvear et al., 2007). Folglich kann davon ausgegangen werden, dass
SELM tatsächlich ein Zielgen von XBP1 ist, das in die UPR involviert ist. Dies ist auch
sehr gut mit der Expression in Osteoblasten vereinbar, da bereits bekannt ist, dass viele
UPR-Komponenten eine wichtige Rolle bei der Skelettentwicklung, speziell für die
Funktion der Osteoblasten, spielen.
4 Diskussion 69
4.2.2.1 Die Rolle der UPR bei der Skelettentwicklun g Kollagen-sezernierende Osteoblasten gehören neben den Antikörper-produzierenden
Plasmazellen und Zellen der endo-/exokrinen Organe zu den sogenannten
„professionellen sekretorischen Zellen“, die große Mengen extrazellulärer Proteine
synthetisieren. Um deren Prozessierung sicherzustellen, kommt es zur Aktivierung der
UPR und der damit verbundenen Erhöhung der Faltungskapazität des ER (Wu und
Kaufman, 2006). Darüber hinaus konnte für zwei der drei proximalen ER-Stress-
Sensoren – PERK und IRE1α – eine direkte Beteiligung an der
Osteoblastendifferenzierung nachgewiesen werden (vgl. Abb. 4.2 (Saito et al., 2011;
Tohmonda et al., 2011)).
Abb. 4.2: Die Beteiligung der UPR an der
Osteoblastendifferenzierung. Schematische Darstellung der IRE1α- und PERK-vermittelten UPR, die zur verstärkten Expression von ECM-Proteinen des Knochens führt und damit eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Osteoblasten spielt (verändert nach (Saito et al., 2011; Tohmonda et al., 2011)).
PERK ist einer der drei Haupt-Transducer der ER-Stress-Antwort, dessen Aktivierung
zur Phosphorylierung von eIF2α und damit im Allgemeinen zu einer Hemmung der
Translation führt. Die Phosphorylierung von eIF2α führt aber gleichzeitig zur
verstärkten Translation des Transkriptionsfaktors ATF4. Atf4-/--Mäuse zeigen eine
verzögerte Knochenentwicklung und postnatal eine niedrigere Knochenmasse, womit
gezeigt werden konnte, dass ATF4 ein essentieller Transkriptionsfaktor während der
Knochenentwicklung ist (Yang und Karsenty, 2004; Yang et al., 2004). Perk-/--Mäuse
weisen mit einer schweren Skelettdysplasie und postnatalen Wachstumsverzögerungen
einen Phänotyp auf, der dem der Atf4-defizienten Mäuse sehr ähnlich ist (Delepine et
al., 2000; Zhang et al., 2002). Saito et al. (2011) konnten zeigen, dass es während der
Knochenentwicklung zu ER-Stress kommt, der zu einer Aktivierung des PERK-eIF2α-
ATF4-Signalwegs und damit zur verstärkten Expression knochenspezifischer Gene wie
BGLAP und IBSP führt.
Auch der IRE1α-XBP1-Signalweg der UPR ist für die Osteoblastendifferenzierung
essentiell (Tohmonda et al., 2011). So konnte Osterix (SP7), ein für die
4 Diskussion 70
Knochenentwicklung unverzichtbarer Transkriptionsfaktor (Nakashima et al., 2002), als
Zielgen von XBP1 identifiziert werden. Dies spricht dafür, dass auch SELM als ein in
Osteoblasten exprimiertes Zielgen von XBP1 in die Knochenentwicklung involviert ist.
4.2.2.2 Mit der UPR assoziierte Skeletterkrankungen Die UPR ist jedoch nicht nur unter physiologischen Bedingungen wichtig für die
Skelettentwicklung, sondern spielt auch eine wichtige Rolle in der Pathogenese von
Skeletterkrankungen (Boot-Handford und Briggs, 2010). Bisher ging man davon aus,
dass die den Phänotyp bestimmende fehlerhafte Matrix-Struktur auf Mutationen in
ECM-Genen zurückzuführen ist, die zu einer Reduktion und/oder falschen
Zusammensetzung von Matrixkomponenten führen. Doch jetzt wird zunehmend klar,
dass die UPR als Antwort auf die Ansammlung fehlgefalteter ECM-Proteine im ER
signifikant zur Pathogenese beiträgt (Boot-Handford und Briggs, 2010). So kann
chronischer ER-Stress zur Apoptose führen (Szegezdi et al., 2006), zu einer generellen
Verringerung der Protein-Synthese aufgrund der eIF2α-Phosphorylierung, zu
veränderten Signalwegen (Eizirik et al., 2008; Zhang und Kaufman, 2008), oder zu
veränderten Expressionsprofilen der betroffenen Zellen (Kawai et al., 2004; Hollien und
Weissman, 2006; Tsang et al., 2007; Rutkowski et al., 2008).
Ein Beispiel für eine UPR-assoziierte Skeletterkrankung ist die Osteogenesis Imperfecta
(OI). Diese Erkrankung wird normalerweise durch Mutationen in COL1A1 und
COL1A2 verursacht, die v.a. in den pro-α-Ketten lokalisiert sind und zur Synthese
fehlgefalteter Proteine führen. Mutationen in den C-Propeptiden sind assoziiert mit der
Induktion der UPR, die durch eine erhöhte Expression von BIP und anderen UPR-
Markern nachgewiesen wurde (Chessler et al., 1993; Lisse et al., 2008). Diese
Verbindung zwischen UPR und fehlerhafter Kollagen-Synthese ist besonders
interessant, da in der vorliegenden Arbeit klare Hinweise darauf gefunden wurden, dass
SELM als potentielle Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase an der Prozessierung von
Matrixproteinen wie Typ I Kollagen in Osteoblasten beteiligt sein könnte (vgl. 4.2.1).
Mutationen in Typ I Kollagen verursachen nicht nur OI, sondern wurden auch in
Patienten mit Ehlers-Danlos-Syndrom gefunden. Das Ehlers-Danlos-Syndrom stellt eine
Gruppe hereditärer Bindegewebserkrankungen dar, deren Gemeinsamkeit eine
Überdehnbarkeit der Haut und eine Hypermobilität der Gelenke ist (Beighton, 1993).
Zusätzlich zu den genannten Symptomen wiesen die Patienten mit Typ I Kollagen-
Mutationen auch Sehnenrupturen auf (Mao und Bristow, 2001). Dies ist besonders
bemerkenswert, da für Selm in der vorliegenden Arbeit nicht nur eine starke Selm-
Expression im Knochen, sondern auch in Sehnen gefunden wurde.
4 Diskussion 71
4.2.3 Generierung und phänotypische Analyse von Selm-/--Mäusen
Um die Funktion von SELM in vivo charakterisieren zu können, wurde eine Knockout-
Maus mit genetisch deletiertem Selm generiert. Die Genotypenverteilung der
Nachkommen heterozygoter Tiere entsprach den Mendelschen Regeln. Die Selm-/--
Mäuse waren lebensfähig und fertil. Äußerlich waren sie nicht von ihren Wildtyp-
Geschwistern zu unterscheiden. Auch die morphologischen und histologischen
Untersuchungen ergaben keinen offensichtlichen Phänotyp. Da vor allem die Rolle von
SELM während der Skelettentwicklung untersucht werden sollte, wurde besonders viel
Wert auf die Analyse des Skeletts gelegt. Aber auch hier zeigten sich in den Selm-/--
Mäusen der untersuchten Altersstufen keine mit Standardmethoden nachzuweisenden
morphologischen oder histologischen Auffälligkeiten. Auch eine erste Kleintier-CT-
Untersuchung der Tibia zeigte keine Veränderungen der Knochenstruktur. Zwar wurden
diese Analysen nur an je einem Wildtyp und einer Knockout-Maus gemacht, da es aber
keinen Hinweis auf eine Veränderung gab und diese Untersuchung extrem kostspielig
ist, wurden keine weiteren CTs durchgeführt. Es kann allerdings nicht vollständig
ausgeschlossen werden, dass subtile Veränderungen bisher nicht entdeckt wurden, da
im Rahmen der Arbeit aus zeitlichen Gründen sowie aus Gründen des Tierschutzes eine
methodisch tiefergehende Analyse (z.B. biochemische Analysen, Mangelernährung)
sowie die Untersuchung weiterer Entwicklungsstadien und Organsysteme nicht möglich
war. Geht man aber davon aus, dass die Befunde in der Tat einen fehlenden Phänotyp
der Knockout-Mäuse widerspiegeln, bleiben drei Erklärungsmöglichkeiten hierfür: 1.
Die Funktion von SELM wird in den Selm-/--Mäusen durch andere (Seleno-)Proteine
kompensiert; 2. Ein Phänotyp zeigt sich nur unter zusätzlichem Selenmangel; 3. SELM
zeigt erst unter ER-Stress seine volle Funktion, wodurch in den Knockout-Mäusen nur
unter pathologischen Bedingungen mit erhöhtem ER-Stress ein Phänotyp zu erkennen
wäre. Diese drei Erklärungsmöglichkeiten sollen im Folgenden näher diskutiert werden.
4.2.3.1 Mögliche Kompensation durch andere Selenopr oteine SELM ist eines von 25 humanen (24 murinen) Selenoproteinen, die bisher identifiziert
wurden (Reeves und Hoffmann, 2009). Die einzelnen Mitglieder dieser Familie zeigen
unterschiedliche Expressionsmuster, einige sind ubiquitär, andere gewebespezifisch
exprimiert. Auch die subzelluläre Lokalisation variiert. Allen Selenoproteinen ist ein
Selenocystein-Rest, der sich im aktiven Zentrum befindet, gemein. Eine Ausnahme
hierzu bildet SEPP1, das bis zu zehn Sec-Reste enthalten kann und als Selentransport-
Protein dient. Sec besitzt im Gegensatz zu Cys einen niedrigeren pKa-Wert (5,2 statt
8,3) und damit eine höhere Reaktivität (Huber und Criddle, 1967; Shchedrina et al.,
2010).
4 Diskussion 72
Selenoproteine im allgemeinen sind während der Embryogenese essentiell, da eine
gezielte Deletion des Sec-tRNA-Gens, Trsp, das für die Synthese aller Selenoproteine
notwendig ist, embryonal letal ist (Bosl et al., 1997). Darüber hinaus führt der
konditionale Knockout unter der Kontrolle des Col2a1-Promotors in
Osteochondroprogenitorzellen zu Wachstumsstörungen, Veränderung der
Wachstumsfugen, verspätete Ossifikation und Chondronekrosen des artikulären
Knorpels (Downey et al., 2009). Dies zeigt, dass Selenoproteine essentiell für die
Knochenentwicklung sind. Welche Selenoproteine im Einzelnen zu diesem Phänotyp
beitragen, ist jedoch ungeklärt. Außerdem sind längst nicht alle Selenoproteine
funktionell charakterisiert, vor allem die Rolle während der Skelettentwicklung ist meist
noch nicht erforscht. Es gibt bisher nur eine Studie von Bassett et al. (2010), die zeigt,
dass DIO2 essentiell für die optimale Knochenstärke und –mineralisierung ist. Tab. 4.2
zeigt eine Übersicht über die 25 humanen Selenoproteine mit ihrer subzellulären
Lokalisation und Funktion (soweit bekannt). Zu den besser charakterisierten
Selenoproteinen gehören die Gruppe der Dejodinasen, Glutathion-Peroxidasen und
Thioredoxin-Reduktasen, wohingegen die Funktion von SELO und SELV noch
vollkommen unbekannt ist (Reeves und Hoffmann, 2009).
Für eine potentielle kompensatorische Rolle kommen vor allem solche Selenoproteine
in Frage, die die gleiche subzelluläre Lokalisation wie SELM aufweisen, also im ER
lokalisiert sind. Dies sind DIO2, SELK, SEP15, SEPN1, SELS und SELT, wobei nur
SEP15 – genau wie SELM – im ER-Lumen lokalisiert ist, die anderen hingegen in der
ER-Membran. SELM und SEP15 sind Strukturhomologe mit Thioredoxin-ähnlichen
Domänen und bilden eine eigenständige Familie innerhalb der Thioredoxin-
Proteinfamilie. Auch wird beiden Proteinen eine Funktion als Thiol-Disulfid-
Oxidoreduktase zugesprochen (Ferguson et al., 2006). Darüber hinaus wurde von
Labunskyy et al. (2009) nachgewiesen, dass SEP15 an der UPR beteiligt ist. Da dies in
der vorliegenden Arbeit auch für SELM gezeigt wurde, spricht einiges dafür, dass die
SELM-Defizienz durch SEP15 kompensiert werden könnte. Die Generierung von
Doppel-Knockout-Mäusen beider Gene wäre daher sehr interessant, um diese
Hypothese zu überprüfen.
4.2.3.2 Einfluss des Selenstatus auf die Synthese d er Selenoproteine Nicht nur das vollständige Fehlen von Selenoproteinen hat schwerwiegende Folgen
(Bosl et al., 1997), sondern auch Selenmangel. So führt Selenmangel beim Menschen
zur Keshan-Krankheit, bei der es durch selenverarmte Böden in Teilen Chinas zu einer
endemischen Kardiomyopathie kommt (Li et al., 1985). Auch das Skelett kann von
Selenmangel betroffen sein, wie bei der Kashin-Beck-Krankheit (KBD), einer
Osteoarthropathie, die endemisch in einigen Teilen Asiens auftritt (Moreno-Reyes et al.,
1998; Mathieu et al., 2001). Auch im Tiermodell ist eine adäquate Selenaufnahme von
4 Diskussion 73
Bedeutung, so konnte z.B. gezeigt werden, dass Ratten, die mehrere Generationen unter
Selenmangel gehalten wurden, eine Osteopenie und Wachstumsverzögerung
entwickelten (Moreno-Reyes et al., 2001). Auch hier ist nicht bekannt, welche
Selenoproteine im Einzelnen zum Phänotyp beitragen.
Die Bildung der Selenoproteine wird vorwiegend posttranskriptionell über die
Verfügbarkeit von Selen reguliert. Dabei reagieren manche Selenoproteine sensitiver
auf Selenmangel als andere. So werden z.B. GPX1, SEPW1 und SELH bei Selenmangel
kaum noch synthetisiert, wohingegen Dejodinasen (DIO1-3) und Thioredoxin-
Reduktasen (TXNRD1-3) weitestgehend unbeeinflusst bleiben (Allan et al., 1999;
Brigelius-Flohe, 1999; Sunde et al., 2009). Diese ungleiche Verteilung wird auch
„Hierarchie der Selenoproteine“ genannt. Die Stellung von SELM innerhalb dieser
Hierarchie wurde von Sunde et al. (Sunde et al., 2009) in der Niere und der Leber
untersucht. In diesen Geweben wird SELM unter Selenmangel moderat (auf 60-70%
des normalen Zustands) herunter reguliert. Der genaue Mechanismus, der zu dieser
Hierarchie führt, ist noch unverstanden, es gibt allerdings einige bekannte Faktoren, die
dazu beitragen. Zum einen werden die mRNAs durch nonsense mediated mRNA decay
(NMD) degradiert wenn das Sec-codierende Stop-Codon aufgrund eines Selenmangels
nicht für den Sec-Einbau genutzt werden kann. Allerdings variiert die Sensitivität der
Selenoprotein-mRNAs gegenüber NMD unter Selenmangel stark, wobei die Gründe
hierfür unbekannt sind (Moriarty et al., 1998; Maquat, 2001; Sunde et al., 2008). Die
Lage und der Kontext des UGA-Codons und des SECIS-Elements scheinen jedoch
dabei eine Rolle zu spielen (Wen et al., 1998; Muller et al., 2003). Zum anderen gibt es
zwei Isoformen der Sec-tRNA[Ser]Sec, eine methylierte und eine unmethylierte. Da die
Methylierung der Sec-tRNA[Ser]Sec selbst selenabhängig ist, ist unter Selenmangel die
unmethylierte Form vorherrschend. Steht dem Organismus wenig Selen zur Verfügung,
ist diese Form für die Biosynthese essentieller Selenoproteine wie TXNRD1 oder GPX4
(housekeeping selenoproteins) zuständig, während die mRNAs nicht-essentieller
Selenoproteingene bevorzugt abgebaut werden (Hatfield et al., 2006; Carlson et al.,
2007).
Ein zweites hierarchisches Prinzip ist bei der Selen-Versorgung der einzelnen Organe
zu beobachten. Es konnte gezeigt werden, dass Ratten, die über mehrere Generationen
auf Selenmangel-Diät gehalten wurden, im Gegensatz zu den meisten anderen Organen
ein kaum reduziertes Selen-Level in Hoden, Gehirn und endokrinen Organen aufwiesen
(Behne und Hofer-Bosse, 1984; Behne et al., 1988). Diese Hierarchie ist allerdings
bisher nur in ausgewählten Organen untersucht worden. Für das Knochengewebe liegen
zurzeit noch keine Daten vor.
4 Diskussion 74
Tab. 4.2: Subzelluläre Lokalisation und Funktion der Selenoproteine.
Genname Symbol subzelluäre Lokalisation Funktion/Besonderheit
Dejodinase, Iodothyronin, Typ I
DIO1 Plasmamembran Aktiviert Thyroidhormone (T4 � T3)
Dejodinase, Iodothyronin, Typ II
DIO2 ER-Membran Aktiviert Thyroidhormone (T4 � T3); Essentiell in Osteoblasten für optimale Knochen-Festigkeit und -Mineralisierung
Dejodinase, Iodothyronin, Typ III
DIO3 Plasmamembran Inaktiviert Thyroidhormone (T4 � rT3, T3 � T2); Knockout z.T. embryonal/perinatal letal, infertil
Glutathion Peroxidase 1 (zytosolisch)
GPX1 Zytoplasma, Mitochondrium
Antioxidans; Knockout anfälliger für oxidativen Stress
Glutathion Peroxidase 2 (gastrointestinal)
GPX2 Zytoplasma Antioxidans; Gpx1/Gpx2 Doppel-Ko erhöhtes Darmkrebsrisiko
Glutathion Peroxidase 3 (Plasma)
GPX3 extrazellulär Antioxidans
Glutathion Peroxidase 4 (Phospholipid Hydroperoxidase)
GPX4 Zytoplasma, Mitochondrium
Antioxidans; beteiligt an oxidativer Stressantwort; Knockout embryonal letal
Glutathion Peroxidase 6 (olfaktorisch)
GPX6 unbekannt Antioxidans; Murines Gpx6 enthält kein Sec
Thioredoxinreduktase 1 TXNRD1 Zytoplasma, Nukleus
Schutz vor oxidativem Stress; Knockout embryonal letal
Thioredoxinreduktase 2 TXNRD2 Mitochondrium Schutz vor oxidativem Stress; Knockout embryonal letal
Thioredoxinreduktase 3 TXNRD3 Mitochondrium Schutz vor oxidativem Stress; Testis-spezifische Expression
Selenophosphat Synthetase 2
SEPHS2 Zytoplasma Essentiell für die Synthese aller Selenoproteine
Chromosom 11 open reading frame 31
C11orf31, SELH
Nukleus Wichtig für die Entwicklung und beteilig an der oxidativen Stressantwort in Drosophila.
Ethanolaminephos-photransferase 1
EPT1, SELI
unbekannt mögliche Beteiligung an der Phospholipid-Biosysnthese
Selenoprotein K SELK ER-Membran Ca2+-Homöostase im ER, Immunsystem; Knockout erhöhte Anfälligkeit für virale Infekte
Selenoprotein M SELM ER-Lumen Putative Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase 15 kDa Selenoprotein SEP15 ER-Lumen Putative Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase;
Ko milder oxidativer Stress in der Leber, Katarakte
Selenoprotein N SEPN1 ER-Membran Frühe Muskelentwicklung; Mutationen im Menschen führen zu Myopathien; Ko Verlust von Satellitenzellen
Selenoprotein O SELO unbekannt Unbekannt Selenoprotein P SEPP1 Extrazellulär Selen-Transport-Protein;
Knockout neurologischen Probleme und männliche Infertilität
Selenoprotein S SELS ER-Membran Involviert in ER-Stress Selenoprotein T SELT ER-Membran Calcium-Mobilisierung Selenoprotein V SELV unbekannt Testis-spezifische Expression Selenoprotein W SEPW1 Zytoplasma Vermutlich Antioxidans, evtl. beteiligt am
Muskelwachstum Selenoprotein X SEPX1,
SELR Zytoplasma, Nukleus
Methionin-R-Sulfoxid Reduktase B1; Knockout erhöhter oxidativer Stress
ER-ständige Selenoproteine sind grau hinterlegt (Verändert nach (Reeves und Hoffmann, 2009; Bassett et al., 2010; Shchedrina et al., 2010; Kasaikina et al., 2011; Rederstorff et al., 2011; Verma et al., 2011)).
Die Position innerhalb der Hierarchie der Selenoproteine scheint die physiologische
Wichtigkeit während der Entwicklung widerzuspiegeln (Schomburg und Schweizer,
4 Diskussion 75
2009). So sind z.B. Dio3- oder Gpx4-Knockout-Mäuse embryonal letal (Yant et al.,
2003; Hernandez et al., 2006). Beide Selenoproteine stehen weit oben in der Hierarchie.
Es gibt allerdings auch Selenoproteine, deren wichtige Rolle erst unter bestimmten
Bedingungen sichtbar wird. So sind Mäuse mit genetischer Deletion von Sepp1
lebensfähig, sterben aber unter Selenmangel (Hill et al., 2003; Schweizer et al., 2004).
Da die Expression von SELM ebenfalls abhängig vom Selenstatus ist, wäre es also
denkbar, dass auch die Selm-/--Mäuse erst einen offensichtlichen Phänotyp unter
Selenmangel zeigen. Einerseits könnte der Selenmangel dazu führen, dass
Selenoproteine, die die Funktion von SELM kompensieren, nicht mehr synthetisiert
werden. Andererseits ist auch denkbar, dass in Selm-/--Mäusen unter Selenmangel die
Funktion anderer, selensensitiverer Selenoproteine nicht mehr durch SELM
kompensiert werden kann.
4.2.3.3 Die Rolle von ER-Stress in der Pathogenese verschiedener Krankheiten
Die ER-Stressantwort spielt eine wichtige Rolle für die Entwicklung und Homöostase
des Organismus und nimmt auch eine Schlüsselrolle in der Pathogenese vieler
Erkrankungen ein (Boot-Handford und Briggs, 2010). UPR-assoziierte Krankheiten
können verschiedene Ursachen haben. Zum einen kann es zur Akkumulation
ungefalteter oder fehlgefalteter Proteine im ER kommen. So führt die Cys96Tyr
(C96Y)-Mutation im Ins2 (Proinsulin 2)-Gen zur UPR-Aktivierung und schließlich zur
Apoptose von β-Zellen im Pankreas (Izumi et al., 2003). Damit ist ER-Stress ein
entscheidender Faktor bei der Entstehung von Typ I Diabetes. Dieser Befund wird noch
weiter dadurch verstärkt, dass die gleiche Mutation in Chop-/--Mäusen (CHOP ist ein
UPR-Faktor, der für das Auslösen der Apoptose wichtig ist; vgl. Abb. 4.3) zu einer
abgeschwächten Pathogenese mit späterem Beginn des Diabetes führt (Oyadomari et
al., 2002). Es kann aber auch durch eine verminderte Faltungskapazität des ER zur
Akkumulation von Proteinen kommen. So zeigen Patienten mit Wolcott-Rallison-
Syndrom, die inaktivierende Mutationen im PERK-Gen tragen, Osteoporose,
Mineralisierungsdefekte des Skeletts und einen durch progressiven β-Zell-Verlust
verursachten Diabetes bereits im Kindesalter (Delepine et al., 2000). Ähnliche Defekte
zeigen auch Perk-/--Mäuse (Harding et al., 2001; Zhang et al., 2002). Zum anderen kann
auch ein unangemessenes Anschalten der UPR, z.B. durch Viren, eine Krankheit erst
ermöglichen (Lin et al., 2008). So können einige Viren (z.B. Herpes Simplex oder
Hepatitis C Virus (Pavio et al., 2003; Mulvey et al., 2007)) die zelluläre
Abwehrmechanismen umgehen und die UPR nutzen, um virale Glykoproteine in großen
Mengen von der Wirtszelle produzieren zu lassen (Dimcheff et al., 2003). Darüber
hinaus ist ER-Stress aber auch eine Komponente im Verlauf inflammatorischer
Erkrankungen wie der Rheumatoiden Arthritis (Todd et al., 2008) und auch ein Teil der
Pathogenese von Osteoarthritis (Ruiz-Romero et al., 2008; Hamamura et al., 2009).
4 Diskussion 76
Auch in der Pathogenese von Trinukleotiderkrankungen wie Alzheimer und Parkinson
scheint ER-Stress involviert zu sein. Zwar findet hier die Akkumulation der
Proteinaggregate im Nukleus oder Zytoplasma statt und beeinflusst so die ER-Funktion
nicht direkt, jedoch gibt es Hinweise darauf, dass der proteasomale Abbau gestört ist
und es so zu einer UPR-Aktivierung und schließlich zur Apoptose kommt (Bence et al.,
2001).
Abb. 4.3: Die adaptive und apoptotische ER-Stressantwort. (A) Die Aktivierung von PERK, ATF6α und IRE1α im ER führt (B) akut zur Inhibition der Translation durch die Phosphorylierung von eIF2α und die Degradation ER-assoziierter mRNAs durch IRE1α. (C) Die Aktivierung aller drei Signalwege führt außerdem über ATF4, ATF6α und XBP1 zur verstärkten Transkription von Genen, die die Faltungskapazität des ERs erhöhen und so dem ER-Stress entgegenwirken. (D) Die gleichen drei Stress-Sensoren sind auch für die Initiation des Apoptose-Signalwegs verantwortlich. Die downstream Zielgene von CHOP (DoC) und c-jun (DoJ), die letztendlich Apoptose auslösen sind noch nicht eindeutig identifiziert, ebenso Signalwege, die durch gestrichelte Linien dargestellt sind (verändert nach (Rutkowski und Kaufman, 2007)).
Bei dieser Zusammenstellung wird klar, dass die UPR in vielfältige pathologische
Prozesse, die zu erhöhtem ER-Stress führen, involviert ist. Da in der vorliegenden
Arbeit gezeigt werden konnte, dass Selm nach Induktion von ER-Stress hochreguliert
wird, könnte es sein, dass SELM erst unter pathologischem ER-Stress seine volle
Funktion entfaltet. Dies könnte auch erklären, warum in den Selm-/--Mäusen unter
physiologischen Bedingungen kein Phänotyp zu erkennen ist. Zudem fällt bei
Untersuchungen an Knockout-Mäusen von verschiedenen UPR-Komponenten auf, dass
die Phänotypen sehr variabel sind. Einige Knockout-Mäuse, wie z.B. Ire1α-/- (Urano et
al., 2000) und Xbp1-/- (Reimold et al., 2000), sind embryonal letal, während andere
lebensfähig sind, aber z.T. schwere Entwicklungsdefekte aufweisen. So zeigen Perk-/--
Mäuse einen OI-ähnlichen Phänotyp, u.a. eine schwere Skelettdysplasie und postnatale
Wachstumsverzögerungen (Zhang et al., 2002; Saito et al., 2011), da der Transport und
die Sekretion von Typ I Kollagen gestört ist (Wei et al., 2008). Auch Atf4-/--Mäuse
zeigen eine verzögerte Knochenentwicklung (Yang und Karsenty, 2004; Yang et al.,
2004). Im Gegensatz dazu gibt es aber auch Mäuse, denen ein UPR-assoziiertes Gen
fehlt, die aber trotzdem keinen offensichtlichen Phänotyp zeigen. Ein Beispiel dafür ist
4 Diskussion 77
die Atf6-/--Maus, die nicht von ihren Wildtyp-Geschwistern zu unterscheiden ist bis ER-
Stress induziert wird (Rutkowski et al., 2008). Da in der vorliegenden Arbeit gezeigt
werden konnte, dass SELM in die ER-Stressantwort involviert ist, aber keinen
offensichtlichen Defekt aufweist, wäre so ein Mechanismus auch für die Selm-/--Maus
vorstellbar. Daher wäre es sehr interessant zu untersuchen, ob die Selm-Knockout-Maus
einen Phänotyp zeigt, wenn man sie mit ER-Stress-Induktoren behandelt.
5 Material und Methoden
5.1 Isolierung von Nukleinsäuren
5.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Präparationen geringer DNA-Mengen (Mini-Präps) wurden nach dem Prinzip der
alkalischen Lyse nach Birnboim und Doly (1979) durchgeführt.
Dazu wurden 3 ml LB-Medium mit Antibiotikum (50 µg/ml Kanamycin oder
Ampicillin) versetzt, mit dem entsprechenden Glycerinstock angeimpft und ÜN bei
37°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation (1 min,
16.000 g, RT) der Übernachtkultur. Anschließend wurde das Pellet in 300 µl Puffer P1
resuspendiert, mit 300 µl Lysis-Puffer P2 versetzt und nach mehrmaligem Invertieren
5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Um Proteine und chromosomale DNA zu
entfernen, wurde 300 µl gekühlter Neutralisations-Puffer P3 zugegeben, mehrmals
invertiert und abzentrifugiert (10 min, 16.000 g, RT). Der Überstand wurde zur Fällung
der Plasmid-DNA mit 560 µl 100% Isopropanol versetzt und bei 16.000 g für 10 min
zentrifugiert. Nach einmaligem Waschen mit 200µl 70%igem Ethanol wurde erneut
zentrifugiert (20 min, 16.000 g, RT), das Pellet getrocknet und in 20 µl A. bidest gelöst.
Zur Langzeitlagerung der Bakterien (Glycerinstock) wurden Teile der Übernachtkultur
mit gleichen Volumina 50% Glycerin versetzt und bei –80°C weggefroren.
Die Isolierung größerer Mengen qualitativ hochreiner Plasmid-DNA erfolgte
entsprechend mit Hilfe des „Nucleobond® Xtra Midi“ Kits laut Herstellerangaben
(Macherey-Nagel, Düren).
5.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen Die Plasmid-Isolierung aus Hefen wurde mit Hilfe des „Zymoprep Yeast Plasmid
Miniprep Kits“ nach Herstellerangaben durchgeführt.
5.1.3 DNA-Isolation aus Gewebe Genomische DNA aus Gewebe wurde mit Hilfe des „QIAamp DNA Blood Mini Kit“
(Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert.
5 Material und Methoden 80
5.1.4 DNA-Isolation aus Mausschwänzen Die Isolation von genomischer DNA für die Genotypisierung erfolgte mit dem nexttec
„Isolation of Genomic DNA from Tissue and Cells“ Kit (Bio&Sell, Nürnberg) nach
Angaben des Herstellers.
5.1.5 RNA-Isolation aus Geweben
Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben wurden die bei –80°C gelagerten Proben
in flüssigem Stickstoff gemörsert, anschließend in je 1ml Trizol (Invitrogen, Karlsruhe)
pro 100 mg Gewebe aufgenommen und in einem Glashomogenisator für 2 min
homogenisiert. Die Probe wurde für 15 min (12.000 g, 4°C) zentrifugiert und der
Überstand nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit 0,2 ml Chloroform pro
ml Trizol versetzt und 15 s durch kräftiges Schütteln gemischt. Die Phasentrennung
erfolgte nach 3 min Inkubation (RT) durch Zentrifugation (15 min, 12.000 g, 4°C). Die
in der wässrigen Phase enthaltene RNA wurde durch Zugabe von 0,5ml Isopropanol
(pro ml Ausgangsmenge Trizol) für 10 min bei RT gefällt und durch Zentrifugation
(10 min, 12.000 g, 4°C) pelletiert. Nach einmaligem Waschen mit 1 ml 75% Ethanol
und erneuter Zentrifugation (5 min, 7.500 g, 4°C), wurde die RNA getrocknet und in
20 µl A. bidest gelöst (5 min, 55°C).
5.1.6 RNA-Isolation aus Zellkultur
Zur Isolierung von RNA aus Zellkulturen wurden die Zellen zweimal mit PBS
gewaschen und anschließend in 1 ml TRIzol pro 10 cm2 (Invitrogen, Karlsruhe) lysiert.
Die Zellen wurden mit einer 20gauge Nadel homogenisiert und 5 min bei RT inkubiert.
Anschließend wurde die Suspension mit 0,2 ml Chloroform pro ml Trizol versetzt und
entsprechend 5.1.5 weiterverarbeitet.
5.1.7 Photometrische Bestimmung der DNA- und RNA-Konzentration
Um die DNA- bzw. RNA-Konzentration einer Probe zu bestimmen, wurde diese bei
einer Wellenlänge von 260nm mit Hilfe des NanoQuant infinite F200 (Tecan,
Männedorf, Schweiz) gemessen. Als Maß für die Reinheit der isolierten Nukleinsäuren
dient das Verhältnis von OD260/OD280, das zwischen 1,8 und 2,0 liegen sollte.
Außerdem wurde die Qualität mittels Gelelektrophorese (vgl. 5.2.2) überprüft.
5 Material und Methoden 81
5.2 DNA- und RNA-Standardmethoden
5.2.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonuklease n
Die Verwendung von Restriktionsenzymen zur Spaltung von DNA erfolgte nach
Angaben des Herstellers und unter Verwendung der mitgelieferten Restriktionspuffer.
Die verwendete Enzymmenge wurde je nach Aktivität des entsprechenden Enzyms und
Menge der zu restringierenden DNA variiert.
5.2.2 Agarose-Gelelektorphorese von DNA- und RNA-Fragmenten
DNA- und RNA-Fragmente wurden durch horizontale Gelelektrophorese aufgetrennt.
Je nach erwarteter Größe wurden 1-1,5%-ige Agarosegele verwendet, dabei diente 1 x
TAE als Laufpuffer. Zur Größenbestimmung wurden die Molekulargewichtsstandards
100 bp-Leiter und 1 kb-Leiter der Firma Invitrogen (Karlsruhe) benutzt. Die
elektrophoretische Auftrennung der mit 1/6 Vol Ladepuffer versetzten Proben erfolgte
bei 80-120 V.
Nach Färben der Gele im 0,02% Ethidiumbromidbad erfolgte die Dokumentation mit
Hilfe eines Transilluminators (UV Star, Biometra, Göttingen) unter UV-Licht bei
312 nm mit der „BioDocAnalyze“-Auswertungssoftware (Biometra, Göttingen).
5.2.3 PAA-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten Für die Auftrennung kleiner (< 200 bp) DNA-Fragmente wurde ein 10%-iges natives
PAA-Gel verwendet, dabei diente 0,5 x TBE als Laufpuffer. Der Gellauf erfolgte für ca.
4 h bei 200 V und 4°C.
5.2.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegele n
Nach elektrophoretischer Auftrennung von DNA-Fragmenten (vgl. 5.2.2) wurden die
mit Ethidiumbromid gefärbten Banden auf einem Transilluminator aus dem Agarosegel
ausgeschnitten. Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit
Hilfe des „NucleoSpin Extract II“ (Macherey-Nagel, Düren) nach Herstellerangaben.
5.2.5 Aufreinigung von DNA/RNA durch Phenol-Chlorof orm-Extraktion
Um DNA/RNA aufzureinigen, z.Β. nach einem Restriktionsverdau, wurde eine Phenol-
Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Probe wurde dazu mit A. bidest auf 200 µl
aufgefüllt, mit 100 µl Phenol und 100 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) vermischt
und für 10 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Um Phenolreste zu
5 Material und Methoden 82
entfernen, wurde der Überstand mit 200 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) gemischt
und erneut zentrifugiert (10 min, 16.000 g, RT). Anschließend wurde die DNA aus dem
Überstand mit Ethanol gefällt (vgl. 5.2.6).
5.2.6 Fällung von DNA
Plasmid-DNA wurde nach Zugabe von 1/10 Vol 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und
2,5 Vol 100% Ethanol für 30 min bei –80°C gefällt und anschließend abzentrifugiert
(30 min, 16.000 g, 4°C). Das Präzipitat wurde mit 5 Vol 70% Ethanol gewaschen,
10 min zentrifugiert und anschließend luftgetrocknet. Die Präzipitate wurden in
A. bidest gelöst.
5.2.7 Fällung von RNA
Zur quantitativen Fällung wurde die RNA mit 2 µl Glykogen (10 mg/ml; Invitrogen,
Karlsruhe), 1/10 Vol 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Vol 100% Ethanol versetzt
und 30 min bei –80°C gefällt. Nach 20-minütiger Zentrifugation (16.000 g, 4°C) wurde
das Präzipitat mit 70% Ethanol gewaschen, 10 min zentrifugiert (16.000 g, 4°C),
luftgetrocknet und in 20 µl A. bidest aufgenommen.
5.2.8 Southern Blot-Analysen DNA-Fragmente aus Agarosegelen (vgl. 5.2.2) wurden mittels der von Southern (1975)
beschriebenen Methode auf eine für je 5 min in A. bidest, 5 x SSC und 10 x SSC
äquilibrierte Nylonmembran transferiert. Das Agarosegel wurde hierzu vorher für
10 min in 0,3 M HCl depuriniert und anschließend für je 30 min in Denaturierungs- und
Neutralisierungslösung inkubiert. Der Transfer mit 10 x SSC als Transferpuffer erfolgte
ÜN. Die DNA wurde daraufhin im Ofen für 30 min bei 80°C auf der Nylonmembran
fixiert. Der spezifische Nachweis der DNA erfolgte über Hybridisierung mit einer
radioaktiv markierten Sonde. Die Sondenmarkierung mit P32 erfolgt dabei mittels
„Ready To Go DNA Labelling Beads (-dCTP)“ (Amersham, Freiburg) nach
Herstellerangaben. Die Membran wurde zunächst mit „Expresshyb“ (Clontech,
Heidelberg) für 30 min bei 65°C prähybridisiert. Anschließend erfolgte die
Hybridisierung mit der für 5 min bei 100°C denaturierten Sonde in 5 ml „Expresshyb“
ÜN bei 65°C. Danach wurde die Membran jeweils 2 x für 20 min in Waschpuffer I bei
50°C und in Waschpuffer II bei RT gewaschen. Nach Abtropfen der Lösung wurde die
Membran eingeschweißt und ein Röntgenfilm (Hyperfilm MP; Amersham, Freiburg)
aufgelegt. Die Exposition erfolgte für 3 Wochen bei -80°C. Anschließend wurde der
Film entwickelt, fixiert und getrocknet.
5 Material und Methoden 83
5.3 Klonierung
5.3.1 Klonierung von PCR-Produkten
Zur „blunt-end-Klonierung“ von PCR-Produkten wurde der „TOPO TA Cloning Kit“
(Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Die Klonierung erfolgte nach Angaben des
Herstellers.
Für die „sticky-end-Klonierung“ von PCR-Produkten wurde das entsprechende DNA-
Fragment mit Linker-Primern mittels PCR (vgl. 5.5) amplifiziert. Im Anschluss daran
wurden das PCR-Produkt sowie der Vektor mit den entsprechenden
Restriktionsenzymen geschnitten (vgl. 5.2.1) und mittels Gelelektrophorese (vgl.5.2.2),
anschließender Gelextraktion (vgl. 5.2.4) und Phenol-Chloroform-Extraktion (vgl.
5.2.5) aufgereinigt.
5.3.2 Ligation
Die Ligation erfolgte mit Hilfe der T4 DNA-Ligase (Fermentas, St. Leon-Rot) nach
Angaben des Herstellers. Der geschnittene Vektor wurde dazu mit dem zu klonierenden
PCR-Produkt im molaren Verhältnis von 1:3 gemischt und in 1 x Ligationspuffer mit
5 U T4 DNA-Ligase für eine Stunde bei 22°C ligiert.
5.3.3 Transformation von Bakterien
Zur Transformation wurde der chemisch kompetente „OneShot TOP10“ E. coli-Stamm
(Invitrogen, Karlsruhe) mit 2-5 µl des Ligationsansatzes gemischt, 30 min auf Eis
inkubiert und zur Aufnahme des Vektors einem Hitzeschock (45 s, 42°C) ausgesetzt.
Die Zellen wurden nach Zugabe von 200 µl SOC-Medium bei 37°C eine Stunde
horizontal geschüttelt. Jeweils 50 µl und 200 µl des Transformationsansatzes wurden
auf antibiotikahaltigen LB-Platten (50 µg/ml Kanamycin bzw. Ampicillin) ausplattiert
und die Platten anschließend ÜN bei 37°C inkubiert.
5.3.4 Selektion positiver Klone
Die Identifizierung positiver Klone erfolgte über eine Kolonie-PCR mit Vektorprimern.
Die PCR-Reaktion wurde hierbei wie in 5.5 beschrieben durchgeführt. Als Matrize
dienten direkt von der LB-Platte gepickte Klone oder ca. 3 µl der entsprechenden
Glycerinkultur. Positive Klone wurden mittels DNA-Sequenzierung überprüft (vgl.
5.7.2).
5 Material und Methoden 84
5.4 Gerichtete Mutagenese
Für die Mutagenese von Plasmiden wurde der „QuikChange Site-Directed Mutagenesis
Kit“ von Stratagene (La Jolls, USA) verwendet. Mittels PCR (vgl. 5.5) wurde das
komplette Plasmid mit Primern, die die gewünschte Mutation enthielten, amplifiziert.
Die Primer binden an die beiden Stränge der klonierten DNA im Plasmid. Die
eingesetzte Pfu-Polymerase amplifiziert ausgehend von den Primern die Plasmid-DNA
bis sie das 5` Ende des Mutagenese-Primers erreicht. So entstehen Plasmide mit
Einzelstrangbrüchen. Anschließend wurde der PCR-Ansatz durch Zugabe von 0,5 µl
DpnI, einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym, für eine Stunde bei 37°C
verdaut, um das parentale, methylierte Plasmid aus dem Ansatz zu entfernen. Zur
Überprüfung des DpnI-Verdaus wurde vor der Transformation von TOP10 Zellen mit
4 µl des Ansatzes (vgl. 5.3.1) eine Gelelektrophorese (vgl. 5.2) mit je 5 µl des Ansatzes
vor sowie nach Verdau durchgeführt.
5.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die PCR (Saiki et al., 1988) wurde standardmäßig in einem 50 µl-Ansatz durchgeführt.
Ein Ansatz enthielt 200 µM dNTPs, jeweils 0,2 µM forward und reverse Primer, 1 x
PCR-Puffer, 1 U Taq-Polymerase und optional 1 M Betaine. Zur Amplifikation wurden
500 ng Plasmid-DNA, 40 ng cDNA oder 20 ng gDNA eingesetzt. Die Amplifikations-
bedingungen wurden abhängig von den verwendeten Primern und DNA-Matrizen
variiert. Als Ausgangspunkt diente folgendes Standardprogramm: Initiale
Denaturierung: 5 min 95°C; 35 Zyklen á 1 min 95°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C;
terminale Extension: 10 min 72°C. Die PCR wurde mit Hilfe eines „MBS Satellite
0.2G“ Thermocyclers (Thermo Fisher Scientific, Milford) oder „Mastercycler pro
vapo.protect“ (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt. Zur Überprüfung der Amplifikation
wurde 5 µl des PCR-Ansatzes gelelektrophoretisch aufgetrennt (vgl. 5.2.2).
5.5.1 Semiquantitative PCR Die semiquantitative PCR erfolgte wie die Standard-PCR (5.5), jedoch nur mit 25 bis 30
Zyklen.
5.5.2 Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) Die cDNA-Synthese erfolgte mit Hilfe der „SuperScript II Reverse Transcriptase“ oder
„SuperScript III Reverse Transcriptase“ (Invitrogen, Karlsruhe) unter Verwendung von
Oligo(dT)12-18- oder Random Hexamer Primern nach Herstellerangaben. Für die
Erststrangsynthese wurde 2-5 µg RNA eingesetzt. Der 20 µl-Ansatz wurde für die
5 Material und Methoden 85
anschließende PCR (vgl. 5.5) auf eine RNA-Ausgangskonzentration von 40 ng/µl mit
A. bidest verdünnt.
5.6 Quantitative Real-Time PCR (qPCR)
5.6.1 Prinzip der qPCR Die Real-Time PCR stellt eine hochsensitive und über die Verwendung von TaqMan-
Sonden hochspezifische Technik zur simultanen Amplifikation und Quantifizierung von
Nukleinsäuren mit Detektion des PCR-Produkts in Echtzeit (real-time) dar. Im
Gegensatz zur konventionellen PCR, bei der es sich um eine Endpunkt-Messung
handelt, wird bei der Real-Time PCR durch Vergleich der exponentiellen Phasen im
PCR-Verlauf eine Quantifizierung der cDNA-Ausgansmenge erreicht.
qPCR mit Taqman-Sonden
Das Nachweisprinzip der Real-Time PCR beruht auf der Verwendung sogenannter
doppelt-markierter Sonden unter Ausnutzung der 5’-3’-Exonuklease-Aktivität der Taq-
Polymerase (Holland et al., 1991). Doppeltmarkierte Sonden (beispielsweise TaqMan-
Sonden) sind sequenzspezifische Oligonukleotide mit einem fluoreszierenden Reporter-
Farbstoff am 5’-Ende und einem Quencher-Farbstoff am 3’-Ende (Livak et al., 1995),
die zwischen den konventionellen PCR-Primern an die Zielsequenz hybridisieren. Wird
die intakte Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge angeregt, wird die Fluoreszenz des
Reporters durch die räumliche Nähe zum Quencher in einem Fluoreszenz-Resonanz-
Energie-Transfer (FRET) unterdrückt (Livak et al., 1995). Während der kombinierten
Annealing- und Elongationsphase der PCR hybridisieren Primer und Sonde
sequenzspezifisch an den komplementären Matrizenstrang. Die Taq-Polymerase
synthetisiert – ausgehend von den beiden konventionellen PCR-Primern – einen neuen
DNA-Strang und hydrolysiert dabei durch ihre 5’-3’-Exonuklease-Aktivität die Sonde,
die aufgrund eines Phosphatrests am 3’-Ende nicht selbst als Primer für die Polymerase
fungieren kann. Durch die Hydrolyse werden Fluorophore und Quencher räumlich
voneinander getrennt und der FRET aufgehoben. Dadurch emittiert der Reporter
während jedes Zyklus eine detektierbare Fluoreszenz, die proportional zur Menge des
akkumulierenden PCR-Produkts ist, da so für jedes einzelne synthetisierte Molekül ein
spezifisches Signal erzeugt wird. Pipettier-Ungenauigkeiten und
Fluoreszenzfluktuationen werden mit dem Fluoreszenzfarbstoff ROX als passive
Referenz ausgeglichen.
5 Material und Methoden 86
qPCR mit SYBR Green
Das Prinzip der Quantifizierung bei der Real-Time-PCR mit SYBR Green beruht auf
dessen unspezifischen Bindung an die kleine Furche doppelsträngiger DNA. Die
Intensität des bei 521 nm emittierten Fluoreszenzsignals des interkalierenden
Farbstoffes ist dabei proportional zur neugebildeten DNA-Menge.
5.6.2 Durchführung Die qPCR wurde in 384 Well-Platten in 20 µl-Ansätzen durchgeführt. Ein Ansatz
enthielt je 0,625 µM forward und reverse Primer, 0,25 µM Sonde, 1 x qPCR MasterMix
und 20 ng cDNA. Bei Verwendung von Assays-on-Demand wurde pro 20 µl-PCR-
Ansatz 1 µl 20 x Probe-Assay, 10 µl 2 x qPCR MasterMix und 20 ng cDNA eingesetzt.
Bei Verwendung von SYBR Green enthielt der Ansatz 1 x ABsolute blue qPCR master
mix (Thermo Fisher Scientific, Milford), jeweils 0,4 µM Primer und 20 ng cDNA. Jeder
Ansatz wurde in Triplikaten und jede Messung mindestens zweimal durchgeführt. Die
Amplifikation [2 min, 50°C; 10 min, 95°C bzw. 15 min für SYBR Green; 45 Zyklen á
15 s, 95°C (Denaturierung), 60 s, 60°C (Annealing/Elongation)] und gleichzeitige
Messung der Proben wurde am TaqMan („ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection
System“, Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt. Für die Auswertung wurde
die „ABI PRISM 7900 HT SDS V2.1.1“-Software (Applied Biosystems, Weiterstadt)
verwendet.
5.6.3 Analyse der qPCR-Daten
Vor der Quantifizierung des Genexpressionslevels mussten die Rohdaten analysiert
werden, indem Basislinie und Schwelle gesetzt wurden. Die Basislinie wurde über die
Zyklen berechnet, in denen noch kein Fluoreszenzanstieg aufgrund von
Amplifikationsprodukten detektierbar war. Die Schwelle wurde bei semilogarithmischer
Darstellung der Amplifikationskurve in die lineare Phase gelegt. Der PCR-Zyklus, an
dem die Amplifikationskurve die Schwelle schneidet, wurde als CT-Wert angegeben.
Der CT-Wert definierte damit den Zyklus, bei dem die Fluoreszenzintensität den
Schwellenwert erreicht hatte. Zur Analyse der Real-Time PCR Daten wurde die
Expression des zu untersuchenden Gens (Zielgen) relativ zu einem ubiquitär
exprimierten Gen (Referenz) bestimmt (Pfaffl, 2001).
Um Primer und ggf. Sonden für die qPCR auf Funktionalität zu testen und anschließend
die geeignete Kalkulationsmethode zu bestimmen, wurden mittels Verdünnungsreihe
(80 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng) einer geeigneten cDNA Standardkurven erstellt und daraus
die Effizienzen der PCR-Reaktionen bestimmt (zur mathematischen Berechnung siehe
„User Bulletins No.2“, Applied Biosystems, 1997; Raeymaekers, 2000). Wichen die
Steigungen der Standardkurven von Zielgen und Referenz um weniger als 0,1
5 Material und Methoden 87
voneinander ab, wurde die relative Genexpression mittels ∆∆CT-Methode berechnet.
Andernfalls wurde die Standardkurvenmethode angewendet (vgl. „User Bulletins
No.2“, Applied Biosystems, 1997). Bei Verwendung von SYBR Green wurde zusätzlich
eine Dissoziationskurve erstellt, um zu überprüfen, ob es zur Bildung unspezifischer
PCR-Produkte (z.B. Primer-Dimere) kommt, die das SYBR Green-Signal verfälschen
würden.
5.7 Sequenzierung von DNA
5.7.1 Aufreinigung von PCR-Produkten für die Sequenzierung
Die Aufreinigung von PCR-Produkten für die anschließende Sequenzierung erfolgte mit
Hilfe des Pipettierrobotors „Biomek NX“ (Beckmann Coulter, Krefeld) über „magnetic
beads“ (Agencourt Ampure; Beckmann Coulter).
5.7.2 Sequenzierreaktion und Aufreinigung Zur DNA-Sequenzierung wurde die auf Sanger et al. (1977) beruhende Kettenabbruch-
methode verwendet, die von Lee et al. (1992) für die Markierung von DNA mit
fluoreszierenden Didesoxynukleotiden modifiziert wurde.
Die Sequenzierungsreaktion wurde in einem 10µl-Ansatz durchgeführt, der 0,5 µM
Primer, 0,25 µl „Big Dye Terminator Version 3.1“ (Applied Biosystems, Weiterstadt),
1 x Sequenzierpuffer und 100 ng aufgereinigtes PCR-Produkt enthielt. Für die
Sequenzierung von Plasmiden wurde 1 µM Primer, 1 µl Big Dye, 1 x Sequenzierpuffer
und 500 ng Plasmid eingesetzt. Die DNA wurde in einer linearen PCR-Reaktion
amplifiziert (Denaturierungsschritt: 1 min 96°C; 25 Zyklen: 20 s 96°C, 5 s 50°C, 4 min
60°C).
Die Sequenzieransätze wurden mit Hilfe des Pipettierrobotors „Biomek® NX“
(Beckmann Coulter) über magnetic beads (Agencourt® CleanSeq®; Beckmann Coulter,
Beverly, Massachusetts) aufgereinigt und anschließend die DNA-Sequenz mit Hilfe des
Sequenziergeräts „ABI PRISM 3730 DNA Analyzer“ (Applied Biosystems,
Weiterstadt) bestimmt.
5.7.3 Sequenzanalyse und Auswertung Die Analyse der Rohdaten erfolgte mit der „Sequencing Analysis 5.1“ Software
(Applied Biosystems, Weiterstadt) und die anschließende Auswertung der DNA-
Sequenzen mit Hilfe der Programme „Chromas 2“ (Technelysium Pty Ltd, Australien)
5 Material und Methoden 88
und „SeqMan II“ (DNA Star, Madison). Alternativ wurde für das Alignment „AlignX“
(Invitrogen, Karlsruhe) verwendet.
5.8 Protein-Techniken
5.8.1 Isolierung von Proteinen aus Zellkultur
Zur Herstellung von Zelllysaten wurden die Zellen zweimal mit kaltem PBS gewaschen
und nach Ablösen von der Zellkulturplatte mit Hilfe eines Zellschabers in 250 µl
Lysepuffer pro 10 cm2 aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen für 30 min bei
4°C unter Schütteln inkubiert und für 15 min bei 12.000 g und 4°C zentrifugiert. Der
Überstand wurde aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C weggefroren.
5.8.2 Isolierung von Proteinen aus Hefen Zur Gewinnung von Zelllysaten aus Hefen wurden diese in 5 ml Selektiv-
Flüssigmedium bis zu einer OD600 von ca. 0,5–1,0 kultiviert und durch Zentrifugation
(5.000 rpm, 10 min, RT) pelletiert. Für den Hefeaufschluss wurde das Pellet in 150 µl
Lysepuffer resuspendiert und die Suspension mit 1 Volumen Glasperlen versetzt. Nach
10-maligem Wechsel von 30 s vortexen und 30 s Inkubation auf Eis, wurde der Ansatz
für 15 min bei 4°C und 1.400 rpm geschüttelt. Die Zellen wurden (ca. 10 x)
abwechselnd in Trockeneis bzw. flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 42 °C im
Wasserbad angetaut. Nach dem Aufschluss wurde der Ansatz erneut für 15 min bei 4°C
und 1.400 rpm geschüttelt und für 15 min mit 13.000 rpm bei 4°C zentrifugiert. Nach
Abnahme des Überstandes erfolgte die Bestimmung der Proteinkonzentration nach
Bradford (5.8.3).
5.8.3 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Brad ford
Die Proteinkonzentration einer Probe wurde nach der Methode von Bradford (Bradford,
1976) bestimmt. Zur Erstellung der Kalibrierkurve wurden BSA-Verdünnungen
(Endkonzentration 1 bis 25 µg/ml) hergestellt, mit 1/5 Vol Bradfordreagenz gemischt
und für 10min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorptionsmessung erfolgte bei
595 nm im Photometer (Biometra, Göttingen). Die Proben, deren Proteingehalt
bestimmt werden sollte, wurden 1:200 - 1:1.000 in A. bidest verdünnt und ebenfalls
nach Zugabe von 1/5 Vol Bradfordreagenz und 5-minütiger Inkubation photometrisch
gemessen. Die Proteinkonzentration konnte mit Hilfe der Kalibrierkurve ermittelt
werden.
5 Material und Methoden 89
5.8.4 Western Blot
Durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese können Proteine aufgrund ihrer
relativen Molekülmasse aufgetrennt werden (Laemmli, 1970). Natriumdodecylsulfat
(SDS) lagert sich an hydrophobe Bereiche der Proteine an, wodurch eine Entfaltung der
Proteine bewirkt wird. Gleichzeitig wird durch die Einführung negativer Ladungen die
Eigenladung der Proteine vernachlässigbar, sodass die Moleküle ausschließlich nach
ihrer Molekülmasse aufgetrennt werden können.
Zur SDS-PAGE wurden je 25 µg Protein mit Laemmli-Ladepuffer versetzt und für
5 min bei 96°C aufgekocht. Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte auf 1,5 mm
dicken PAA (Polyacrylamid)-Gelen, wobei das Sammelgel 5% und das Trenngel 12%
Acrylamid enthielt. Die Gelelektrophorese erfolgte erst bei 80V bis die Proben in das
Trenngel eingelaufen waren (ca. 30 min) und anschließend bei 150 V für 60 min. Als
Laufpuffer wurde Tris-Glycin-Puffer verwendet, als Standard diente „Page Ruler Plus
prestained protein ladder“ (Fermentas, St. Leon-Rot).
Der Proteintransfer vom PAA-Gel auf eine Nitrocellulosemembran (0,2 µm
Porengröße) erfolgte unter Verwendung der „Fastblot“ Apparatur von Biometra
(Göttingen) mit kontinuierlichem Puffersystem entsprechend den Angaben des
Herstellers. Der Transfer erfolgte für 30 min bei 125 mA (für 1 Gel) bzw. 250 mA (für
2 Gele). Zur Überprüfung des Transfers wurde die Membran 2 min in Ponceau-Lösung,
wodurch Proteine unspezifisch angefärbt werden, inkubiert und anschließend in TBST
gewaschen. Um freie Bindungsstellen auf der Membran zu blockieren, wurde die
Membran ÜN mit 5% Milchpulver in TBS bei 4°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurde der Primärantikörper in 5% Milchpulver in TBST verdünnt
und eine Stunde bei Raumtemperatur mit der Membran inkubiert. Nach dreimaligem
Waschen (1 x 15 min, 2 x 5 min) mit TBST wurde der HRP-gekoppelte sekundäre
Antikörper, ebenfalls in 5% Milchpulver in TBST verdünnt, eine Stunde bei
Raumtemperatur mit der Membran inkubiert. Nach weiteren Waschschritten von 1 x
15 min und 2 x 5 min mit TBST erfolgte die Detektion durch enhanced
chemiluminescence. Dazu wurden die „SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity
Substrate“ (Thermo Fisher Scientific, Milford) im Verhältnis 1:1 gemischt und die
Membran für 5 min damit inkubiert. Nach Abtropfen der Lösung wurde die Membran
eingeschweißt und ein Röntgenfilm (Hyperfilm ECL, Amersham, Freiburg) aufgelegt.
Die Exposition erfolgte für 1-30 min. Anschließend wurde der Film entwickelt, fixiert
und getrocknet.
5 Material und Methoden 90
5.8.5 Immunzytologie Der immunzytologische Nachweis von Proteinen In Zellkultur erfolgte an auf
Objektträgern bzw. Deckgläschen angewachsenen Zellen. Diese wurden zunächst kurz
in 1 x PBS gewaschen und anschließend für 10 min bei RT in 3,7% Formaldehyd
fixiert. Nach zweimaligem Waschen für 5 min in PBS folgte die Permeabilisierung in
0,01% Tween-20/PBS für 10 min und zwei weitere Waschschritte in PBS für je 5min.
Darauf folgte die Inkubation mit Blockierlösung und mit dem Primärantikörper (1:300
in Blockierlösung) für je 1 h bei RT in einer feuchten Kammer. Nach drei 5-minütigen
Waschschritten in PBS erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper (1:300
in Blockierlösung) für 2 h bei RT ebenfalls in einer feuchten Kammer. Nach
nochmaligem Waschen in PBS (2 x 5 min) wurden die DNA für 2 min mit DAPI
(1:1000 in PBS) gefärbt. Nach dem letzten kurzen Waschen in A.bidest wurden die OTs
getrocknet, mit Aqua-Polymount eingedeckelt und ÜN bei 4°C zum Aushärten gelagert.
Die Auswertung erfolgte an einem „Axio Imager Z2“-Mikroskop (Zeiss, Jena) mit Hilfe
der „Axio Vision“-Software Version 4.8 (Zeiss, Jena).
5.9 Histologische Färbungen
5.9.1 Paraffineinbettung von Gewebe
Extremitäten, ganze Embryonen und Köpfe wurden in 4% PFA bei 4°C ÜN fixiert.
Einzelne Organe wurden in 10% Formalin bei RT ÜN fixiert und anschließend in A.
bidest für 24 h bei RT gewässert. Anschließend wurde das Gewebe durch eine
aufsteigende Ethanolreihe (50%, 70% und 90% für je 30 min und 100% für 3x30 min)
und drei abschließende Inkubationsschritte in Roticlear (2 x 30 min, 1 x ÜN) dehydriert.
Die Paraffinierung erfolgte für 3x 60 min bei 60°C, wobei der letzte Schritt wahlweise
ÜN erfolgte. Nach vollständiger Infiltration der Gewebe mit Paraffin wurden diese in
Paraffinblöcke eingebettet und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
5.9.2 Anfertigen von Gewebeschnitten
Die in Paraffinblöcke eingebetteten Gewebe (5.9.1) wurden vor dem Schneiden ca. 5
min bei -20°C gekühlt. Die 5 µm dicken Gewebeschnitte wurden mit dem
Rotationsmikrotom (HM340E, Microm, Walldorf) hergestellt, im 45°C warmen
Wasserbad auf Objektträger aufgezogen und ÜN bei 37°C getrocknet. Die Schnitte
wurden bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
5.9.3 HE-Färbung
Paraffinschnitte (5.9.2) wurden mit Roticlear 2 x 10 min entparaffiniert und
anschließend mit einer absteigenden Ethanolreihe (2 x 5 min 100 % EtOH, je 2 min
5 Material und Methoden 91
95%, 90%, 80%, 70%, 50% und 30%) und zwei Inkubationsschritten für je 5 min in
PBS rehydriert. Für die HE-Färbung wurden die Schnitte in einer Küvette für 3 min in
Hämatoxylin gefärbt und anschließend für 10 min unter fließendem Wasser gebläut.
Danach wurden die Schnitte kurz in A. bidest gespült und mit Eosin für 3-5 min
gegengefärbt. Nach kurzem Spülen in A. bidest wurden die Schnitte in einer
aufsteigenden Ethanolreihe (70%, 90%, 100%) und zuletzt in Roticlear für je 2 min
dehydriert und mit „Organo (Limonene) Mounting Medium“ (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen) eingedeckelt.
5.9.4 Azan-Färbung Rehydrierte Paraffinschnitte (vgl. 5.9.3) wurden kurz in A. bidest gewaschen und
anschließend für 30 min in einer 5%-igen Kaliumdichromatlösung inkubiert. Danach
wurden die Schnitte wiederum kurz in A. bidest gewaschen und mit Azocarmin G bei
56°C im Wasserbad für 30 min gefärbt. Nach erneutem Waschen in A. bidest folgte eine
Inkubation für 1 h in 3% Wolframphosphorsäure, ein weiterer Waschschritt in A. bidest
und die Färbung für 30 min mit Anilinblau-Orange G. Abschließend wurden die
Schnitte nach einem letzten Waschschritt in A. bidest für je 2 min in 96% Ethanol,
Isopropanol und Roticlear dehydriert und mit Clarion eingedeckelt.
5.10 X-Gal-Färbung
Ganze Embryonen (E15,5) oder gehäutete und entweidete P4-Mäuse wurden in 4%
PFA für eine Stunde bei 4°C fixiert. Nach dreimaligem Waschen für 15 min in Prä-
Waschlösung bei 4°C wurden die Proben zweimal für 15 min bei RT in
Detergenslösung inkubiert. Anschließend folgte unter optischer Kontrolle die
Inkubation in Färbelösung bei RT. Nach 3 Waschschritten in Post-Waschlösung
(15 min RT) wurden die Proben nochmals in 4% PFA fixiert (ÜN bei RT) und bei RT
geklärt. Hierzu wurden die Proben zuerst für 5 Tage in 5% KOH und anschließend in
einer absteigenden KOH-Reihe jeweils ÜN inkubiert (80:20, 60:40, 40:60, 20:80; 1%
KOH:glycerol). Die Lagerung der Proben erfolgte in 100% Glycerol bei RT.
5.11 Skelettfärbung
Alle Inkubations- und Waschschritte wurden bei RT durchgeführt. Die Mäuse wurden
durch CO2-Vergiftung getötet, gehäutet, entweidet und für 1-2 Tage in 96% Ethanol
fixiert. Danach erfolgte ÜN die Inkubation der Mäuse in Aceton. Daraufhin wurden die
Proben kurz mit 96% EtOH gewaschen und für 24 h in Alzianblau-Färbelösung
inkubiert. Die Mäuse wurden in EtOH gewaschen und für weitere 24h in EtOH fixiert.
Zur Klärung des Gewebes wurden die Mäuse anschließend in 2% KOH (Adulte) bzw.
5 Material und Methoden 92
1% KOH (Embryonen) für 30 min bzw. 6 h inkubiert. Es folgte die Färbung in
Alizarinrot-Lösung für 4 bis 6 h. Danach wurden die Mäuse einem Klärungsprozess
unterzogen und für je einen Tag in KOH/Glycerin-Gemischen (2% KOH für adulte
Mäuse, 1% KOH für Embryonen) mit abnehmender Konzentration (80:20, 60:40,
40:60, 20:80) inkubiert. Die Lagerung der gefärbten Skelette erfolgte in 100% Glycerin.
5.12 RNA in situ Hybridisierung
5.12.1 Generierung DIG-markierter RNA Sonden Für die in vitro Transkription wurde 500 ng linearisiertes Plasmid (5.2.1) mit je 2 µl
DIG-markierten NTPs (Roche, Mannheim), 40 U T3- oder T7-Polymerase (Fermentas,
St. Leon-Rot), 4 µl 5x Transkriptionspuffer (Fermentas, St. Leon-Rot) und 1 µl RNase
OUT (Invitrogen, Karlsruhe) in einem 20 µl Ansatz in DEPC-H2O vermischt und
anschließend für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur Fällung der RNA-Sonden wurden
1 µl tRNA (1mg/ml; Roche), 7 µl 7,5 M Ammoniumacetat und 75 µl kalter 100%
Ethanol zum Ansatz pipettiert und ÜN bei -20°C inkubiert. Die Probe wurde bei
16.000 g für 15 min bei 4°C abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet
wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, nach wiederholter Zentrifugation getrocknet und
anschließend in 100 µl DEPC-H2O gelöst. Die Qualität der Sonden wurden mit einem
1% Agarosegel (5.2.2) überprüft. Die hergestellten Sonden wurden bis zur Verwendung
bei -20°C aufbewahrt.
5.12.2 Prähybridisierung Rehydrierte Paraffinschnitte (vgl. 5.9.3) wurden für 30 min in 4 % PFA fixiert. Zum
Inaktivieren der endogenen Alkalischen Phosphatase wurden die Schnitte anschließend
mit Proteinase K (10 µg/ml in Proteinase K-Puffer) für 10 min verdaut. Darauf folgte
ein 5-minütiger Waschschritt in PBS und eine nochmalige Fixierung in 4% PFA. Es
folgten vier weitere Waschschritte (2 x 5 min in PBS und 2 x 5 min in 2 x SSC), bevor
die Schnitte inTris/Glycin Puffer überführt wurden (15 min oder länger). Die
Prähybridisierung mit Hybridisierungslösung erfolgte in „Atlas TM Glass Hybridization
Chambers“ (Clontech, Mountain View, USA) für 1-3 h bei 55 °C.
5.12.3 Hybridisierung Nach der Prähybridisierung (5.12.2) erfolgte die Hybridsierung. Dazu wurden 5 µl der
DIG-markierten RNA-Sonde (5.12.1) in 150 µl Hybridisierungslösung für 5 min bei
80°C denaturiert, in die Hybridisierungskammern auf die Schnitte gegeben und bei
55°C ÜN inkubiert.
5 Material und Methoden 93
5.12.4 Posthybridisierung Die OTs mit den hybridisierten Schnitten (5.12.3) wurden aus den Kammern genommen
und 2 x 20 min in 2 x SSC bei RT und 1 x 20 min bei 50 °C gewaschen. Es folgten zwei
weitere Waschschritte in 1 x SSC (20 min bei 55 °C und 20 min bei 60 °C). Die
Schnitte wurden mit 1 x SSC (RT) auf 37 °C abgekühlt (10 min) und dann für 15 min in
NTE bei 37 °C gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte mit 10 µg/ml RNase A in
NTE bei 37 °C inkubiert und nochmals für 15 min in NTE bei 37 °C gewaschen.
Danach wurden die Schnitte kurz mit 2 x SSC (RT) gespült und für 1 h in 2 x SSC bei
50 °C inkubiert. Nach kurzem Spülen in 55 °C warmen 1 x SSC wurden die Schnitte 2 x
1 h (55 °C und 60 °C) und für 30 min bei RT in 1 x SSC gewaschen. Die Schnitte
wurden anschließend für mindestens 1 h in 10% Blocking Reagenz (Roche, Mannheim)
in MABT bei RT blockiert.
5.12.5 Detektion Nach der Posthybridisierung (5.12.4) wurden die OTs kurz in MABT gewaschen. Je
300 µl eines Alkalische Phosphatase gekoppelte Anti-DIG Antikörpers (Roche,
Mannheim; 1:5.000 in 1% Blocking Reagenz) wurden zwischen Objektträger und
Deckgläschen gegeben, wobei kleine Plastilinkügelchen als Platzhalter dienten. Die
Inkubation erfolgte ÜN bei 4 °C in einer feuchten Kammer. Die Deckgläschen wurden
danach mit einer Pinzette entfernt und die OTs 4 x 10 min und 1 x 20 min in TBST und
anschließend 2 x 10 min in NTM gewaschen. Die Substratlösung (BM-Purple/2 mM
Levamisole/0,1 % Tween 20) wurde für 2 min bei 16.000 g abzentrifugiert und das
Pellet verworfen. 500 µl der Substratlösung wurde auf einen Objektträger gegeben
wobei das Deckgläschen wieder auf Plastilinkügelchen lag. Die Färbung erfolgte bei RT
im Dunkeln in einer feuchten Kammer für 1-10 Tage. Zum Abstoppen der
Färbereaktion wurden die Schnitte 5 min in PBS gewaschen. Nach Trocknen der
Objektträger wurden die Schnitte mit wenigen Tropfen „CC Mount“ (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen) bedeckt und für 10 min bei 70°C getrocknet. Anschließend wurden die
Schnitte mit „Clarion Mounting Medium“ (Biomeda Corp., Foster City, USA)
eingedeckelt.
5.13 Zellkultur
5.13.1 Primäre Osteoblasten
Primäre Osteoblasten wurden aus den Kalvarien von 10-15 Hühner-Embryonen (d15)
oder ca. 10 Mäusen (P4) isoliert.
5 Material und Methoden 94
Hühner-Embryonen bzw. Mäuse wurden durch Dekapitation getötet. Die Köpfe wurden
vor und nach Freilegung der Schädelplatten mit 70% EtOH gewaschen. Die Kalvarien
wurden nach der Präparation mechanisch von Bindegewebe befreit und in kleine Stücke
geschnitten. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden diese in Digestion solution bei
37°C im Schüttelwasserbad seriell verdaut (Hühner: 12 min Fraktion 1, 15 min Fraktion
2, 20 min Fraktion 3, 30 min Fraktion 4, 45 min Fraktion 5; Mäuse: 4 x 20 min).
Fraktion 1 wurde verworfen, die restlichen Fraktionen wurden vereinigt und der Verdau
mit FCS (Endkonzentration 10%) abgestoppt. Nach Filtration durch ein Zellsieb wurde
die Einzelzellsuspension zentrifugiert (5 min, 1.000 rpm, RT), die Zellen in α-MEM mit
10% FCS und 100 U/ml Pen/Strep resuspendiert und in eine 10 cm-Schale ausgesät.
Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen auf 6-well-Platten gesplittet. Für die
Differenzierung der Osteoblasten wurde dem Medium 50 mg/ml Ascorbinsäure und
50 mg/ml Glycerol-2-Phosphat zugesetzt.
5.13.2 Micromass culture Für die micromass culture (mmc) wurden mesenchymale Zellen aus Hühner-
Extremitätenknospen (HH22-24) nach Lehmann et al. (2003) isoliert. Dazu wurden die
Extremitätenknospen durch einen 15-minütigen Verdau mit Dispaselösung (3 mg/ml in
1x PBS) bei 37°C und folgenden Waschschritten mit warmem (37°C) HBSS vom
Exktoderm befreit. Anschließend wurde durch einen 30-minütigen Verdau in
Kollagenase-Lösung und anschließender Filtration durch ein Zellsieb (45 µm) eine
Einzelzellsuspension gewonnen, die mit Medium (DMEM:F-12 (1:1), 10% FCS, 0,2%
CS, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin) auf eine Konzentration von 2x107Zellen pro ml
eingestellt wurde. Ausgesät wurden 10 µl pro Well dieser Suspension tropfenförmig in
eine 24-Well-Platte. Nach 2 Stunden, die der Adhäsion der Zellen diente, wurde 1 ml
Medium zu den Zellen gegeben. Die Kulturen wurden für 7 Tage kultiviert, wobei das
Medium jeden Tag erneuert wurde.
5.13.3 Kultur von adhärent wachsenden Zellen
Adhärent wachsende Zelllinien wurden bei 37°C, 5% CO2 und 95% relativer
Luftfeuchtigkeit kultiviert. Verwendet wurden folgende adhärent wachsende Zelllinien:
ATDC5 (Atsumi et al., 1990), DF1 (Himly et al., 1998), HEK293 (Graham et al.,
1977), MC3T3 (Kodama et al., 1981) und NIH3T3 (Todaro und Green, 1963). ATDC5-
Zellen wurden in DMEM:F-12 (1:1) mit 10% FCS und Antibiotika (100 U/ml
Penicillin/Streptomycin), sowie humanem Holo-Transferrin (10µg/ml) und Natrium-
Selenit (3 x 10-8 M) kultiviert. Zur Differenzierung wurde dem Medium bei 100%
Konfluenz der Zellen Insulin in einer Endkonzentration von 40 µg/ml zugesetzt (Atsumi
5 Material und Methoden 95
et al., 1990). Für eine schnellere Differenzierung (Altaf et al., 2006) wurde zusätzlich
Ascorbinsäure in einer Endkonzentration von 37,5 µg/ml zugesetzt. Das Medium wurde
während der Differenzierung in den ersten vier Tagen täglich gewechselt, anschließend
alle 1-2 Tage (Mushtaq et al., 2002). DF1-Zellen wurden in DMEM kultiviert, dem
100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 10% FCS und 2% CS zugesetzt worden war. Als
Medium für HEK293- und NIH3T3-Zellen diente DMEM, das mit 10% FCS, 2 mM L-
Glutamin und Antibiotika (100 U/ml Penicillin/Streptomycin) komplettiert worden war.
MC3T3-Zellen wurden in α-MEM mit 10% FCS und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin
kultiviert.
5.13.4 Passagieren von Kulturen
Zur kontinuierlichen Kultivierung wurden die Zellen bei 100% Konfluenz einmal mit
1 x PBS gewaschen und zum Ablösen der Zellen mit 1 ml Trypsin/EDTA für 5 min bei
37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von serumhaltigem Medium
gestoppt. Nach Abzentrifugieren (5 min, 1.000 rpm, RT) wurden die Zellen 1:3 bis 1:10
in frisches Kulturmedium gesplittet.
5.13.5 Einfrieren und Auftauen von Kulturen
Zum Einfrieren wurde dem Kulturmedium 10% DMSO zugesetzt. Die Zellen wurden,
wie in 5.13.4 beschrieben, von der Zellkulturflasche gelöst und pelletiert. Jeweils etwa
107 Zellen wurden in 1ml des Einfriermediums aufgenommen. Anschließend wurden sie
mit Hilfe des „Nalgene Cryo 1°C Freezing Container“ langsam auf -80°C abgekühlt (ca.
1°/min) und bei -80°C gelagert.
Das Auftauen der Zellen erfolgte möglichst schnell durch Inkubation im Wasserbad bei
37°C und Überführen der Zellsuspension in vorgewärmtes Kulturmedium.
5.13.6 Transfektion eukaryotischer Zellen
Die transiente Transfektion von adhärenten Zellen erfolgte unter Verwendung von
„Lipofectamin 2000“ (Invitrogen, Karlsruhe) nach Herstellerangaben.
5.13.7 Luziferase-Assay Zur Untersuchung von Promotorsequenzen wurde das „Dual-Luziferase Reporter Assay
System“ verwendet. Dabei wurden die Zellen mit einem Reporter-Plasmid (pGL3), das
den zu untersuchenden Promotor und das Firefly-Luziferase-Gen enthält, und einem
Referenz-Plasmid (pRL-TK), das das Renilla-Luziferase-Gen enthält, co-transfiziert. Da
die Firefly-Luziferase und die Renilla-Luziferase unterschiedliche Substrate für die
lumineszente Reaktion benötigen, kann in einem Ansatz die Expression des Reporters
5 Material und Methoden 96
und der Referenz hintereinander gemessen werden. 48 h nach Transfektion der Zellen
(vgl. 5.13.6) wurde das Medium vollständig entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen
und durch Zugabe von 100 µl „Passive Lysis Buffer“ unter leichtem Schütteln für
15 min bei RT lysiert. Die Zellextrakte wurden zur Entfernung größerer Zelltrümmer
kurz zentrifugiert (30 s, 16 000 g, 4°C) und die Überstände für die Messung im
Luminometer „Luminoskan Ascent“ eingesetzt. Das Ansetzen der Substrate (LARII und
Stop&Glo) für die Messung erfolgte nach Herstellerangaben. Die Auswertung der
Messdaten erfolgte mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogramms Excel (Microsoft).
5.14 Mauszucht
Die Mäuse wurden im Tierstall des Franz-Penzoldt-Zentrums der Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg unter geeigneten Bedingungen (12 h Tag/Nacht-
Rhythmus, 23°C) gehalten. Die Fütterung und Wasserversorgung der Tiere erfolgte ad
libitum. Zur Zucht wurde in der Regel ein heterozygotes Männchen (zwischen 5 und 30
Wochen) mit zwei heterozytogen Weibchen (zwischen 8 und 30 Wochen)
zusammengesetzt. Die neugeborenen Tiere wurden genotypisiert, im Alter von 3 bis 5
Wochen geschlechtsspezifisch getrennt und mit Ohrmarkierungen versehen. Die
Paarung vor der Entnahme von Embryonen erfolgte unter gleichen Bedingungen.
5.15 Yeast-two-Hybrid-System
Diese Methode zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen wurde 1989 von
Fields und Song in der Bäckerhefe (S. cerevisiae) entwickelt (Fields und Song, 1989).
Das zu untersuchende Protein (Köder) wird hierbei an eine GAL4-DNA-
Bindungsdomäne (DB) fusioniert und zusammen mit einem Fusionsprotein aus Beute-
Protein und GAL4-Transaktivierungsdomäne (AD) in eine Hefezelle eingebracht.
Interagieren diese beiden Proteine miteinander, so gelangen DB und AD in unmittelbare
Nähe und bilden einen funktionellen GAL4-Transkriptionsfaktor, der die Transkription
der Reportergene aktiviert (Van Criekinge und Beyaert, 1999).
In der vorliegenden Arbeit wurden die S. cerevisiae-Stämme Y187 mit den
Reportergenen lacZ und mel1 und Y2H-Gold mit den Reportergenen aur1-c, ade2, his3
und mel1 verwendet, die unter der Kontrolle heterologer GAL4-abhängiger Promotor-
Elemente stehen.
5.15.1 Transformation der Hefen Die Herstellung kompetenter Hefen erfolgte nach der Lithiumacetat-Methode (Gietz
und Schiestl, 1991). Eine 3 ml-Übernachtkultur des Hefestammes Y2H-Gold (Clontech,
5 Material und Methoden 97
Heidelberg) wurde in 50 ml YPAD Medium auf eine OD600 von 0,25–0,5 verdünnt. Die
Kultur wurde danach 3-4 h bei 30°C unter Schütteln inkubiert und anschließend
zentrifugiert (4000 g, 5 min, RT). Das Pellet wurde in 25 ml A. bidest resuspendiert und
nach erneuter Zentrifugation (4000 g, 5 min, RT) in 1 ml 100 mM Lithiumacetat
aufgenommen. Nach Zentrifugation (16.000 g, 10 s, RT) wurden die Zellen in 100 mM
Lithiumacetat auf ein Endvolumen von 500 µl resuspendiert und je 50 µl Zellsuspension
pro Transformationsansatz aliquotiert. Nachdem die Ansätze erneut zentrifugiert und
der Überstand verworfen wurde, folgte die Zugabe der Transformationslösungen in der
vorgeschriebenen Reihenfolge:
50 % (w/v) PEG 3350 240 µl
1 M Lithiumacetat 36 µl
Denaturierte Carrier-DNA 50 µg
Plasmid-DNA 500 ng-1 µg
A. bidest ad 360 µl
Die Ansätze wurden bis zur vollständigen Lösung der Zellen ca. 5 min gevortext und
30 min bei 30°C inkubiert. Zur Aufnahme des Plasmids wurden die Zellen einem 20-
minütigen Hitzeschock bei 42°C ausgesetzt, zentrifugiert (16.000 g, 10 s, RT) und in
500 µl A. bidest resuspendiert. Je 100 µl der unverdünnten Transformationssuspension
sowie 100 µl einer 1:10-Verdünnung wurden auf entsprechende Selektionsplatten
ausgestrichen und 3-5 Tage bei 30 °C inkubiert.
5.15.2 Mating haploider Hefestämme Die Generierung von Hefen, die sowohl Köder- als auch Beute-Plasmid tragen, erfolgte
mittels Mating nach dem „Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System“ von Clontech.
Hefen können als zwei unterschiedliche haploide Paarungstypen vorliegen (Mat-α und
Mat-a). Unter entsprechenden Bedingungen kommt es zur Verschmelzung der
Paarungstypen zu einer diploiden Zygote, die ihrerseits wieder diploide Tochterzellen
produziert. Sind die Paarungstypen Träger unterschiedlicher Plasmide, enthält die
diploide Zygote auch beide Plasmide der Ausgangszellen. Eine konzentrierte
Übernachtkultur des Mat-a Köder-Stammes (Y2H-Gold [pGBKT7+Köder]) wurde bis
zu einer OD600 von 0,8 ca. 14 h bei 30°C unter Schütteln in SD/-Trp inkubiert,
zentrifugiert (5.000 rpm, 10 min, RT) und auf eine Zellzahl von >1 x 108 Zellen/ml
(Neubauer Zählkammer) mit 4-5 ml SD/-Trp eingestellt. Ein 1 ml Aliquot des Mat-α
Beute-Stammes (Y187[pGBKT7+Beute]) wurden auf Eis aufgetaut und mit dem Köder-
Stamm sowie 47 ml 2 x YPAD im einem 2 l-Kolben gemischt. Es folgte eine
Inkubation bei 30 °C für 20-24 h bei langsamem Schütteln (50 rpm). Die Bildung der
Hefezygoten wurde optisch kontrolliert. Es folgte das Pelletieren der Zellen bei
5.000 rpm für 10 min (RT), die Resuspension in 100 ml 0,5 x YPAD, erneute
5 Material und Methoden 98
Zentrifugation (5.000 rpm, 10 min, RT) und die Aufnahme in 10 ml 0,5 x YPAD. Je
200 µl der Suspension wurde auf 50 SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA-Platten (150 mm)
ausplattiert. Die Inkubation erfolgte bei 30°C für 3-5 Tage. Die Selektion erfolgt zum
Einen über die Trp-/Leu-Auxortophie der Hefen, die bei Vorhandensein beider
Plasmide in den Diploiden kompensiert wird, und zum anderen über das Reportergen
aur1-c, das eine AbA-Resistenz vermittelt. D.h. es wachsen nur dann Hefekolonien,
wenn beide Plasmide enthalten sind und eine Interaktion von Köder und Beute
stattfindet. Um die falsch-Positiven-Rate zu senken, wurde zusätzlich das Anschalten
der Reportergens mel1 untersucht, das zu einer Umsetzung von X-α-Gal und damit
einer Blaufärbung der gebildeten Hefekolonien führt.
5.15.3 Ermittlung der Matingeffizienz Zur Ermittlung der Matingeffizienz wurden je 100 µl einer 1/10, 1/100, 1/1.000 und
1/10.000 Verdünnung der diploiden Hefezellen auf SD/-Trp-, SD/-Leu- und
SD/-Trp/-Leu -Selektionsplatten ausgestrichen. Die Platten wurden für 3-5 Tage bei
30°C inkubiert, bis Kolonien sichtbar waren. Zur Berechnung der in dem jeweiligen
Medium lebensfähigen Klone (cfu) pro ml wurde folgende Formel verwendet:
Cfu/ml = gezählte Kolonien / (Ausplattiertes Volumen (ml) x Verdünnungsfaktor)
Daraus wurde die Matingeffizienz errechnet:
Matingeffizienz = [cfu/ml der diploiden Hefeklone] / [cfu/ml des limitierenden
Partners] x 100%
Wobei der limitierende Partner derjenige mit der geringsten cfu/ml ist. Die Anzahl
gescreenter Klone entspricht demzufolge der cfu/ml diploider Zellen multipliziert mit
dem Zellsuspensionsvolumen.
5.15.4 Verifizierung potentieller Interaktionspartn er Potentielle Interaktionspartner wurden zur Verifizierung einem Rescreen unterzogen.
Das Beute-Plasmid wurde entsprechend 5.1.2 mit Hilfe des „Zymoprep Yeast Plasmid
Miniprep“ (Zymo Research, Kalifornien) isoliert und in E. coli eingebracht (vgl. 5.3.3).
Nach Anlegen von Langzeitkulturen mittels eines Glycerinstocks und der Plasmid-
DNA-Isolierung durch Midipräparation (5.1.1) wurden Y2H-Gold-Hefen mit dem
Beute-Plasmid sowie dem Köder-Plasmid co-transformiert (5.15.1).
5.16 In silico-Analysen
Für Homologievergleiche mit Nukleotiddatenbanken wurden die Programme
„BLASTN“ vom NCBI-Server (National Center for Biotechnology Information,
5 Material und Methoden 99
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und „UCSC Genome Browser“
(http://www.genome.ucsc.edu) verwendet. Für Gen- und Exonvorhersagen diente
GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html). In silico-Analysen zu den
Genprodukten erfolgten unter Verwendung der auf dem EXPASY Molecular Biology
Server zur Verfügung gestellten Programme (http://kr.expasy.org). Eine Vorhersage des
Molekulargewichts ermöglicht das Compute pI/MW tool
(http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html).
5.17 Reagenzien und Materialien
5.17.1 Puffer und Lösungen
Alizarinrot-Lösung 0,005% Alizarinrot
2% KOH
Alzianblau-Lösung 15 mg Alzianblue 8 GX
80 ml 95% Ethanol
20 ml Essigsäure
Anilinblau-Orange G Stocklösumg 0,5 g Anilinblau
2 g Orange G
8 ml Eisessig
ad 100 ml H2O
Anodenpuffer I 300 mM Tris
(für Western Blot) 20% v/v Methanol; pH 10,4
Anodenpuffer II 25 mM Tris
(für Western Blot) 20% v/v Methanol; pH 10,4
Azocarmin G 0,1% Azocarmin G
1% Essigsäure
Blockierlösung 0,5 M NaCl
0,1% Ovalbumin
0,5% Fischgelatine
0,01% Tween-20
1 x PBS
5 Material und Methoden 100
Denaturierungslösung 0,4 M NaOH
0,6 M NaCl
Detergenslösung 1 x PBS
2 mM MgCl2
0,02% NP40
0,01% Natriumdeoxycholat
Digestion solution α-MEM
(für Hühner-Osteoblasten) 1,5 U/ml Collagenase P
0,05% Trypsin
Digestion solution α-MEM
(für Maus-Osteoblasten) 0,2% Dispase
0,1% Collagenase P
DNA/RNA-Ladepuffer (6x) 0,25% Bromphenolblau
0,25% Xylencyanol FF
30% Glycerin
Färbelösung 1 x PBS; pH 7,4
(für X-Gal-Färbung) 20 mM Tris/HCl; pH 7,5
2 mM MgCl2
0,02% NP40
0,01% Natriumdeoxycholat
5 mM K3Fe(CN)6
5 mM K4Fe(CN)6
0,75 mg/ml X-Gal (in DMSO)
Hybridisierungslösung 50% Formamid
(für ISH) 0,75 M NaCl
1 x PE
0,1% BSA
1% SDS
0,05% Heparin
0,1 mg/ml tRNA
Kahle’s Fixativ 130 ml 100% EtOH
17,5 ml Eisessig
4,35 ml 37% Formaldehyd
5 Material und Methoden 101
Kathodenpuffer 25 mM Tris
(für Western Blot) 40 mM 6-Aminohexansäure
20% v/v Methanol; pH 9,4
Kollagenase-Lösung 1 x PBS
5% CS
0,1% Collagenase Ia
0,1% Trypsin
Laemmli-Lade-Puffer (3x) 187 mM Tris
6% w/v SDS
15% v/v β-Mercaptoethanol
0,03% w/v Bromphenolblau
6% v/v Glycerin
Lysepuffer 150 mM NaCl
(für Zellen) 50 mM Tris/HCl, pH 8,0
1% TritonX-100
Lysepuffer 150 mM NaCl
(für primäre Osteoblasten) 50 mM Tris/HCl, pH 8,0
5 mM EDTA
1% NP40
Lysepuffer 150 mM NaCl
(für Hefen) 50 mM Tris/HCl
0,1% SDS
1% NP40
0,5% Natriumdeoxycholat
0,02% Natriumazid
100 µg/ml PMSF
MAB (1x) 0,1 M Maleinsäure
0,15 M NaCl, pH 7,5
Neutralisierungslösung 1M Tris/HCl ; pH 7,5
1,5 M NaCl
5 Material und Methoden 102
NTE 0,5 M NaCl
10 mM Tris/HCl, pH 7,0
5 mM EDTA, pH 8,0
NTM (1x) 0,1 M NaCl
0,1 M Tris/HCl, pH 9,5
0,05 M MgCl2
PAA-Gel (12%) 375 mM Tris/HCl, pH8,8
12% Acrylamid
0,1% SDS
0,1% APS
0,04% TEMED
PAA-Gel (5%) 125 mM Tris/HCl, pH 6,8
5% Acrylamid
0,1% SDS
0,1% APS
0,1% TEMED
PAA-Gel nativ (10%) 0,5 x TBE
10% Acrylamid
0,07% APS
0,04% TEMED
PBS (10x) 1,37 M NaCl
27 mM KCl
100 mM Na2HPO4
20 mM KH2PO4
PCR-Puffer (10x) 500 mM KCl
100 mM Tris
15 mM MgCl
PE (10x) 100 mM PIPES pH 6,8
10 mM EDTA pH 8,0
Post-Waschlösung 1 x PBS
5 mM EDTA
5 Material und Methoden 103
Prä-Waschlösung 1 x PBS
2 mM MgCl2
Proteinase K-Puffer 20 mM Tris/HCl, pH 7,2
1 mM EDTA
Puffer P1 50 mM Tris HCl, pH 8,0
10 mM EDTA
100 µg/ml Rnase A
Puffer P2 200 mM NaOH
1% SDS
Puffer P3 3 M KaAc, pH 5,0
SSC pH 7,0 (20x) 3M NaCl
300 mM Natriumcitrat
TAE (1x) 40 mM Tris
40 mM Essigsäure
1 mM EDTA; pH 8,3
TBE (1x) 90 mM Tris
90 mM Borsäure
1,25 mM EDTA; pH 8,3
TBS (10x) 1,37 M NaCl
27 mM KCl
250 mM Tris; pH7,4
Tris-Glycin Elektrophorese-Puffer 25 mM Tris
(für Westernblot Gellauf) 250 mM Glycin
0,1% w/v SDS; pH 8,3
Waschpuffer I 2 x SSC
0,05% SDS
Waschpuffer II 0,1 x SSC
0,1% SDS
5 Material und Methoden 104
5.17.2 Vektoren
pcDNA 3.1 (+) /myc-His A Invitrogen, Karlsruhe
pcDNA 3.1 (+) /Flag A Invitrogen, Karlsruhe
pcDNA 3.1 (+) /HA-His A Invitrogen, Karlsruhe
pCR® 4-TOPO® Invitrogen, Karlsruhe
pEGFP-C3 Clontech, Heidelberg
pGBKT7 Clontech, Heidelberg
pGL3 Promega, Mannheim
pRL-TK Promega, Mannheim
5.17.3 Antikörper
Primäre Antikörper
Kaninchen-anti-Aktin (I-19; sc-1616) Santa Cruz, Heidelberg
Maus-anti-myc-HRP Milteniy Biotec, Bergisch-Gladbach
Kaninchen-anti-ATF4 (sc-200) Santa Cruz, Heidelberg
Kaninchen-anti-HA (H6908) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Kaninchen-anti-PCNT AG Rauch, Erlangen
Anti-Digoxigenin-AP, Fabfragments Roche, Mannheim
Sekundäre Antikörper
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Molecular Probes, USA
Schwein-anti-Kaninchen HRP DAKO, Hamburg
Kaninchen-Anti-Maus-HRP DAKO, Hamburg
Ziege-anti-Kaninchen Cy3 Dianova, Hamburg
5.17.4 Bakterien und Medien
Bakterienstämme:
TOP10 E. coli Invitrogen, Karlsruhe
Medien:
LB-Medium 10 g NaCl
10 g Tryptone
5 g Hefeextrakt
ad 1 l H2O, pH 7,5
5 Material und Methoden 105
SOC-Medium 4 g Trypton
1 g Hefeextrakt
0,1 g NaCl
2 ml 250 mM KCl
3,6 ml 20% Glucose
1 ml 2 M MgCl2
ad 200 ml A.bidest
Zusätze:
Ampicillin Roth, Karlsruhe
Kanamycin Roth, Karlsruhe
Agar-Agar (7,5 g pro 500 ml) Roth, Karlsruhe
5.17.5 Zellkulturmedien und -zusätze
Medien: Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco BRL, Karlsruhe
DMEM:F-12 (1:1) Gibco BRL, Karlsruhe
Alpha-MEM PAA, Pasching, Österreich
Optimem Gibco BRL, Karlsruhe
Zusätze:
FCS (hitzeinaktiviert) Gibco BRL, Karlsruhe
CS Gibco BRL, Karlsruhe
Glycerol-2-Phosphat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Holo-Transferrin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
L-Ascorbinsäure-2-Phosphat Magnesium Sigma-Aldrich, Taufkirchen
L-Glutamin Gibco BRL, Karlsruhe
Natrium-Selenit Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Penicillin/Streptomycin Gibco BRL, Karlsruhe
Trypsin/EDTA Gibco BRL, Karlsruhe
5.17.6 Hefen und Medien Hefestämme:
Y187 Clontech, Heidelberg
Y2H-Gold Clontech, Heidelberg
5 Material und Methoden 106
Medien:
SD (1x) 20 g Glucose
6,7 g Yeast Nitrogen Base
10 ml Aminosäuremix
50 µg/ml Kanamycin
ad 1 l H2O; pH 5,8
YPAD (1x) 20 g Pepton
20 g Glucose
10 g Hefeextrakt
0,04 g Adenin
50 µg/ml Kanamycin
Ad 1 l H2O; pH 5,8
Aminosäuremix:
In 500 ml A. bidest gelöst; pH 10
AS oder Base AS-Mix -Trp
AS-Mix -Leu
AS-Mix -Leu/-Trp
AS-Mix -Ade/-His/-Leu/-Trp
Adeninhemisulfat 2,0 g 2,0 g 2,0 g --- p-Aminobenzoesäure 0,2 g 0,2 g 0,2 g 0,2 g Arginin/HCl 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Histidin/HCl 2,0 g 2,0 g 2,0 g --- Isoleucin 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Leucin 4,0 g --- --- --- Lysin/HCl 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Methionin 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Myo-Inositol 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Phenyalanin 3,0 g 3,0 g 3,0 g 3,0 g Serin 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Threonin 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Tryptophan --- 3,0 g --- --- Tyrosin 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g Uracil 1,2 g 1,2 g 1,2 g 1,2 g Valin 9,0 g 9,0 g 9,0 g 9,0 g
5.17.7 Enzyme, Molekulargewichtstandards, Chemikali en
Enzyme:
Collagenase Ia Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Collagenase P Roche, Mannheim
Dispase Invitrogen, Karlsruhe
DNase I Roche, Mannheim
Pfu-Turbo Polymerase Roche, Mannheim
Restriktionsendonukleasen und Puffer NEB, Frankfurt am Main
5 Material und Methoden 107
RNase A Qiagen, Hilden
RNase Erase ICN Biomedicals, Ohio
RNaseOUT Ribonuclease Inhibitor Invitrogen, Karlsruhe
Superscript II Reverse Transcriptase Invitrogen, Karlsruhe
Superscript III Reverse Transcriptase Invitrogen, Karlsruhe
T3 RNA-Polymerase Fermentas, St. Leon-Rot
T7 RNA-Polymerase Fermentas, St. Leon-Rot
T4 DNA Ligase Fermentas, St. Leon-Rot
Taq DNA-Polymerase AG Winterpacht, Erlangen
Trypsin Invitrogen, Karlsruhe
Standards:
1kb DNA-Leiter Invitrogen, Karlsruhe
100bp DNA-Leiter Invitrogen, Karlsruhe
PageRuler Plus prestained protein ladder Fermentas, St. Leon-Rot
Chemikalien:
Aceton Roth, Karlsruhe
Acrylamid (Rotiphorese Gel 30) Roth, Karlsruhe
Albumin from chicken egg white Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Alcian Blue 8GX Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, Taufkirchen
6-Aminohexansäure Roth, Karlsruhe
Ammoniumacetat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
APS Roth, Karlsruhe
Aqua-Polymount Polysciences, Eppelheim
Aureobasidin Clontech, Heidelberg
Azocarmin G Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Betaine (5M) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Borsäure Roth, Karlsruhe
Blocking Reagent Roche, Mannheim
BM Purple Roche, Mannheim
Bradfordreagenz Biorad, München
Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen
CC-Mount Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Chloroform Merck, Darmstadt
Clarion Biomeda Corp., Foster City, USA
DAPI Santa Cruz, Heidelberg
5 Material und Methoden 108
Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DIG-RNA Labeling Mix Roth, Karlsruhe
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt
DTT Invitrogen, Karlsruhe
EDTA Roth, Karlsruhe
Entwicklerkonzentrat Tetenal, Norderstedt
Eosin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Essigsäure Roth, Karlsruhe
Ethanol Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe
Fixiererkonzentrat Tetenal, Norderstedt
Formaldehyd Merck, Darmstadt
Formamid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Gelatine Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Glutaraldehyd (50%) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Glycerin Roth, Karlsruhe
Hämatoxylin Sigma- Aldrich, Taufkirchen
HBSS Gibco BRL, Karlsruhe
Glycin Roth, Karlsruhe
Hämatoxylin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
HCl Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Hefeextrakt Roth, Karlsruhe
Isopropanol Roth, Karlsruhe
Isoamylalkohol Roth, Karlsruhe
Kaliumhexacyanoferrat(III) Roth, Karlsruhe
Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat Roth, Karlsruhe
KCl Sigma-Aldrich, Taufkirchen
KH2PO4 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
KOH-Plätzchen Merck, Darmstadt
Levamisole Sigma-Aldrich, Taufkirchen
β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
Methanol Roth, Karlsruhe
MgCl2 Merck, Darmstadt
MgSO4 Merck, Darmstadt
Na2HPO4 · 2 H2O Merck, Darmstadt
Natriumacetat Roth, Karlsruhe
NaCl Roth, Karlsruhe
Natriumdesoxycholat Roth, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck, Darmstadt
NP40 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
5 Material und Methoden 109
Orange G Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Organo/Limonene Mount Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Paraffin Roth, Karlsruhe/Merck, Darmstadt
PBS-Tabletten für Zellkultur Gibco BRL, Karlsruhe
Phenol Roth, Karlsruhe
Ponceau S solution Sigma-Aldrich, Taufkirchen
PMSF Roche, Mannheim
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche, Mannheim
Roticlear Roth, Karlsruhe
SDS Merck, Darmstadt
Seakem LE Agarose Biozym, Hess. Oldendorf
TEMED Roth, Karlsruhe
Trichloressigsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tris Roth, Karlsruhe
Triton X-100 ICN Biomedicals, Aurora (USA)
TRIzol Invitrogen, Karlsruhe
tRNA Roth, Karlsruhe
Trypton/Pepton Roth, Karlsruhe
Tween-20 Roth, Karlsruhe
Wasserstoffperoxid Merck, Darmstadt
Wolframphosphorsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen
X-α-Gal Glycosynth, Warrington, England
X-Gal Roth, Karlsruhe
5.17.8 Kits
NexttecTM Genomic DNA Isolation Kit for Bio & Sell, Nürnberg
Tissue and Cells
Nucleobond Xtra Midi Machinery-Nagel, Düren
NucleoSpin Extract II Machinery-Nagel, Düren
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen, Hilden
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit Stratagene, La Jolls (USA)
TOPO TA Cloning Kit Invitrogen, Karlsruhe
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep Kit Zymo Research, Freiburg
5.17.9 Materialien
100 mM dNTP Set Invitrogen, Karlsruhe
Atlas Glass Hybridization Chamber Clontech, Heidelberg
BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystems, Weiterstadt
5 Material und Methoden 110
Einbettformen für Paraffin Leica, Wetzlar
Eppendorf Tubes Eppendorf, Hamburg
Falcons (15 ml und 50 ml) Eppendorf, Hamburg
Faltenfilter Schleicher&Schüll, Dassel
Glashomogenisatoren Fisher Science, Waltham (USA)
Glasküvetten Roth, Karlsruhe
Hyperfilm ECL Amersham, Freiburg
Hyperfilm MP Amersham, Freiburg
Lipofectamin 2000 Invitrogen, Karlsruhe
Magermilchpulver Lasana, Herford
Nitrocellulosemembran Schleicher & Schüll, Dassel
Nylonmembran Pall Life Sciences, Ann Arbor, USA
Objektträger Roth, Karlsruhe
PapPen Immunostaining Pen Kisker, Steinfurt
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
qPCR Mastermix (2x) Eurogentec, Seraing (Belgien)
SuperSignal West Femto Maximum Thermo Fisher Scientific, Milford
Sensitivity Substrate
Whatman Papier Schleicher&Schüll, Dassel
Zellkulturschalen TPP, Trasadingen
Zellkulturflaschen TPP, Trasadingen
Zellschaber TPP, Trasadingen
5.17.10 Geräte
Autoklav HiclaveTM HV-85 (HMC, Engelsberg)
Bakterienschüttler Innova 4000 (New Brunswick Scientific,
Nürtingen)
Brutschränke Heraeus, Hanau
Cycler
MBS Satellite 0.2G Thermocycler Thermo Fisher Scientific
Mastercycler pro vapo.protect Eppendorf, Hamburg
DNA-Sequenziergerät
ABI PRISM 3730 DNA Analyzer Applied Biosystems, Weiterstadt
Eismaschine Ziegra, Isernhagen
Fluoreszenzmikoskop
Axio Imager Z2 Zeiss, Jena
Geldokumentationsanlage
BioDocAnalyze Biometra, Göttingen
5 Material und Methoden 111
Gelelektrophoresekammer PEQLAB, Erlangen
Gelkammer für Westernblot BioRad, München
Hybridisierungsofen Memmert, Schwabach
Infinite® 200 NanoQuant TECAN, Männedorf, Schweiz
Kryostat HM 560 (Microm, Walldorf)
Nalgene® Cryo 1°C Freezing Container Nalge Nunc International, Hereford (UK)
Pipettierroboter ,,Biomek® NX” Beckman Coulter, Krefeld
Photometer Biometra, Göttingen
Rotationsmikrotom HM 340E Microm, Walldorf
TaqMan
ABI Prism 7900HT SDS Applied Biosystems, Weiterstadt
Thermomixer Eppendorf, Hamburg
Transferapparatur für Westernblot
Whatman Biometra Fastblot Biometra, Göttingen
Wasserbäder
SW-20C (Julabo, Seelbach) GFL, Burgwedel
SB80 Microm, Walldorf
Werkbank LaminAir (Heraeus, Hanau)
Zentrifugen
Centrifuge 5415D Eppendorf, Hamburg
Centrifuge 5415R Eppendorf, Hamburg
Centrifuge 5810D Eppendorf, Hamburg
5.17.11 Synthetische Oligonukleotide
Vektor-Primer:
pcDNA3.1 fw: taatacgactcactataggg
rev: cctcgactgtgccttcta
pCR4 TOPO fw: attaaccctcactaaaggga
rev: taatacgactcactataggg
pEGFP-C3 fw: tcaagatccgccacaaca
rev: gggaggtgtgggaggttt
pGBKT7 fw: tcatcggaagagagtagt
rev: agagtcactttaaaatttgtat
pGL3 fw: ctttatgtttttggcgtcttcca
rev: ctagcaaaataggctgtccc
5 Material und Methoden 112
Primer für Expressionskonstrukte:
Nin fw: ggaattcccaccaaacaccaaaaacaactc
rev: cgggatccctatgacctcagaggaggcatag
Pole2 fw: ataagcttaacatggcgccggagcg
rev: ggctcgagaaagccctgaagtttgctg
Selm fw: tatccatggcaaccaccaactaccgacc
rev: cgtgtcgacctacaggtcgtcgtgttc
Selm-SP fw: tatccatggcaagcatcctactgtcgccg
rev: cgtgtcgacctacaggtcgtcgtgttc
Expressionsplasmide für XBP1(u) und XBP1(s) wurden von Prof. Kazutoshi Mori zur
Verfügung gestellt.
Mutagenese-Primer:
Nin (N > D) fw: gatttgtatgtcgaaaatgcccagttgttga
rev: tcaacaactgggcattttcgacatacaaatc
Pole2 (P > S) fw: ggagcttttgatatttcacgttttatatata
rev: tatatataaaacgtgaaatatcaaaagctcc
Sec > C fw: gacctgtggaggatgtcagttgaatcgccta
rev: taggcgattcaactgacatcctccacaggtc
XBP1-Bindestelle fw: cagcttgcgggccaggatcggcgcagcggccgag
rev: ctcggccgctgcgccgatcctggcccgcaagctg
Primer für ISH-Sonden:
Gen Spezies NM-Nummer Primersequenzen bglap Huhn NM_205387 fw: gctcacattcagcctctgc
rev: ggagaagtggagcataatgg Bglap Maus NM_001032298 fw: catgaggaccctctctctgc
rev: tgccagagtttggctttagg scx Huhn NM_204253 fw: agctgtccaagatcgagacg
rev: gtgaagacgggagtgtgtcc selm Huhn (Sequenz s. Anhang) fw: gcggtgggtgacggctgagccgg
rev: ttacaggtctgggtggtccttcttg Selm Maus NM_053267 fw: ttcttgcagcccttgtggctcc
rev: acttgcggtagaagccgagc tnmd Huhn NM_206985 fw: accttcaggagtgggaacg
rev: tccgtgtagtcgttgacagg
Das Plasmid für die Col1a1-Sonde wurde von Dr. Michael Stock (Med III, Erlangen)
zur Verfügung gestellt.
5 Material und Methoden 113
Genotypisierungs-Primer:
Knockout fw: tttgggtgcagcctgcggaa
rev: ttctccgtgggaacaaacggcg
Wildtyp fw: tcagccaaatgacccgggacg
rev: ctgccccgtctgtcaaaacacc
Primer für RT-PCR:
Actb fw: gacttcgagcaggagatgg
rev: acgcagctcagtaacagtcc
Bglap fw: catgaggaccctctctctgc
rev: tgccagagtttggctttagg
Col1a1 fw: cctggtaaagatggtgcc
rev: caccaggttcacctttcgcacc
col1a2 fw: gcaacattggattccctggacc
rev: gttcacccttttctcccttgcc
col2a1 fw: ccaacaccgccagcatcc
rev: gccaatatccacgccaaactcct
col10a1 fw: gccaatatccacgccaaactcct
rev: cagaggaatagagaccat
col12a1 fw: gcagaaccaaacctctcact
rev: ttcttggtgttcctctctcc
gapdh fw: gtggagtccactggtgtcttc
rev: atcagcagcagccttcactac
Gapdh fw: gtggagtccactggcgtcttc
rev: ctccgacgcctgcttcaccac
Nin fw: ttgcggccgcagggaaaccaggaacaccttgta
rev: ggtagctatccagaacatactg
Pole2 fw: aaatcgcgaacatggcgccg
rev: aggtgtgagcctatcaccggagg
selm fw: gcggtgggtgacggctgagccgg
rev: ttacaggtctgggtggtccttcttg
Selm fw: ttcttgcagcccttgtggctcc
rev: acttgcggtagaagccgagc
5 Material und Methoden 114
Primer für Real-Time PCR:
Actb fw: agccatgtacgtagccatcc
rev: ctctcagctgtggtggtgaa
bglap fw: tcgcggcgctgctcacattca
rev: gcgcggtgggagatgaaggcttta
Selm fw: tttgtcaccgaggacattca
rev: tgtaccagcgcattgatctc
scx fw: aactcccagcccaaacagat
rev: cttcctgtcgcggtctttac
selm fw: gctcgtgctgcttagcttcag
rev: atctcctcccgggtcatgtc
tbp fw: acaccggcatctgagagctct
rev: gcaaccaagcttcaccgtgg
tnmd fw: cttcggcgtgctgctcattgct
rev: ttctcgccgtggctgaagaaggt
Primer für das Kandidatengen-Screening
BMP4 fw3/3: gcaaattcttggaggtaagca
rev3/3: ctccatttctagccctaaatg
fw1/4.1: ccaggtaccaccttttgactt
rev1/4.1: caggccttctactgccatggg
fw1/4.2: tccaggtacagcatggagatg
rev1/4.2: catcagactcggacccaccag
fw1/4.3: ctacgcttggccctccggcgt
rev1/4.3 ccagtaggtttcccctgcata
CNIH fw1: caatgtcagtgcaacgcagac
rev1: gcgaaaagaggctgtgttg
fw2: ttggtatttgggatcttggtg
rev2: ctggccattttcaaattacttc
fw3: gccacctgctttccagattag
rev3: aataaatgccaactgatcttcc
fw4: cttccctttatggaccacctc
rev4: aaaaccataatgcctgcaaac
fw5: aaagcatactctctcatgctctg
rev5: acatgacagatgaggaaaccc
5 Material und Methoden 115
GNG22 fw2: ctaaagaagggatggggaagt
rev2: ctacatgggaaagaggatcta
fw3: ctagtcccagacttgctggcaa
rev3 ggatgtggatcggcttgcatt
GNPNAT1 fw2: cagtaaaatatctcgcatatg
rev2: cattggtattgagtgtccatc
fw3: gtagtgattatagaagaatag
rev3: gaacaactcagccacattaaac
fw4: cattagtcatggaagtggcaac
rev4: gtctaatggaaactcaaagtc
fw5: taatcagatttgccccagctt
rev5: aatgaagccaaaaagaacttcaa
fw6: ctgtttctaaggaaacttaag
rev6: ctaaatttcacagcatgtcccac
LGALS3 fw: gtggcgccacactactgactt
rev: ctcattggacaaatgagtccag
fw1: cctttgccatattcctctcctt
rev1: ccttgagaagtggctctaagca
fw2: tctagggagccttatctctttgg
rev2: cactgtaagacagggcaagaaga
fw3: tccagtttgaacccattctg
rev3: gggagaagataaactggttaggc
fw4: ctatagtgcagatgaaatatg
rev4: aaccttgaggccccaatgcag
NID2 fw1: ctgccgaactttctcagagcc
rev1: aggagtggggtctgtttcct
fw2: gttgcgcttgtttccctgaat
rev2: ccttcaaatttcctcagcagtc
fw3: atgatgctttgcttgcattct
rev3: tccttggttttgacttgatgc
fw4: gattataagtgtgagccacca
rev4: tctttggtgtgaggatccaag
fw5: taggatctcccctccagattc
rev5: tttcacctacccacttaagag
fw6: tcccttgggttgaatgttatg
rev6: gagcacctgcaagttgatagc
fw7: tggaggcaggactgtttcata
rev7: cactgcgtaaaggcctaaaga
fw8: cttaggcacgatctccaacag
rev8: tagcagccattctgctcactt
5 Material und Methoden 116
fw9: caagggaacacactccaagaa
rev9: gggcaaggatctgctctattc
fw10: aggactcctctatctccgtgac
rev10: tcttctacagacataaggctggg
fw11: aaccatttgtcccattgaagc
rev11: ttccaaagcgatgattacagg
fw12: ggtctgagaacctgcattcc
rev12: tgggagagctccatctatgtg
fw13: tttctgctcatgctcaaaggt
rev13: aatccacagcttggaaaatcc
fw14: ctggtgaagtggatgggttg
rev14: gtggtctgggcaggaattatg
fw15: catggggtcttgagctacatt
rev15: acaaaaaccagacaccaaacg
fw16: cgtagggcgaagaacttttg
rev16: agagagagccctggtcctatg
fw17: ccaaagccacatggctactaa
rev17: tcccctaatggagaaaaatcg
fw18: acttggagacacttgggcttt
rev18: gccatgaaagaacagaccttg
fw19: tgaggagatggagatcactgg
rev19: ggtcaggcaagcagtacaaac
fw20: ggagactagtaataggacagg
rev20: tgtcctctggaacagttggc
fw21: gcagctagagatgagcaatgg
rev21: tgtaaccaagttgcaacagca
fw22: gacttgctgttgcaacttggt
rev22: tcacatgtgctttaattcttgg
OTX2 fw3: gttagtgctggaacgtggaag
rev3: cctcagaaggcaaacctagag
fw4: ctcaacaccaagaagagtaggg
rev4: gcagaaggagaatagtttcct
fw5_1: gcccatgtaggatagatttata
rev5_1: gttgagccagcatatccttg
fw5_2: ctatctggagcccagcttccat
rev5_2: gatcagatgagtctgagcatc
STYX fw1: gattggctgaggcgacg
rev1: gtacaggtgcggctaagac
fw2: cttgtgtgtcacatcttagcc
rev2: gaaatcagcaggtctcaaatcc
5 Material und Methoden 117
fw3: ttgtgctgcttttgatttgg
rev3: cagtatttgtggatgctccc
fw4: acttaagcagagatgtgggttc
rev4: cagaaacaactgatggtacaaaac
fw5: ggttttaatgccttcaagcaa
rev5: ggttgtggtgagccaagatt
fw6: ttgttttcaataggtttcattttg
rev6: tgcaataacaaaggctgcac
fw7: atgcagggatctccagaagg
rev7: ggaataagaacttcaaacttccaaac
fw8: accattacaactcattacccctc
rev8: tcagattatggcaattttaagtattc
fw9: tttctcttcaaacaatatggcac
rev9: tgaatccttctggaattagctc
fw10: agtcacatgtttatggtgcct
rev10: atgttgctcaacaagttgcag
TXN fw1: gggatcagacccctgtcat
rev1: cattcacgggtaagagacgag
fw2: cattcttgatttccggattgtt
rev2: ggaggtggacaagtcaggtta
fw3: cctattaccttgtgctctccc
rev3: cactaagcaaaacaagccctc
fw4: aaattgggggctaaaatgtca
rev4: ttaacagctcaagaaacaaactgag
fw5: gcaataaaatctgtcatattggg
rev5: ctaagctggaagagcaacctg
fw6: gtgggggttgtgtatcaccat
rev6: gacaatctagactgaaccctgc
ORF104 fw1: gagagtgcgcgcggagatagc
rev1: ccgcgcccggccggtaatagc
fw2: ctaagacagctcataggaataac
rev2: cttctcttaacatcactctgccc
fw3_1: ctggaggatgaattttgacagg
rev3_1: cagattgcatttttgactcag
fw3_2: cagttaaagcactacaaatag
rev3_2: cacaaaacttatctccataagg
MAP4K52 fw2: cgtccctcgtgcagacggagc
rev2: gctttctccccaagaggcaac
fw3: aaagccttggaggaagtagacc
rev3: gatagaacatataaagacttc
5 Material und Methoden 118
fw4: gacttctgactttatagaaag
rev4: acttgtaatcacttatgtttc
fw5: cacttcacagtccattctgaacc
rev5: acttcaggctcaggcaagttta
fw6: ttgccattttttttaagtagac
rev6: ctgtatatgtcggcatcagctt
fw7_8: ggagtcacatttacagttttgc
rev7_8: cacaccagatgttactcttaca
fw9: tgcctaagggcgaaagtaaa
rev9: tgatactgtcaaagagcacgc
fw10: tcctagtaaacacctctcagcttc
rev10: gaggtaactaccttcggactagc
fw11: ggtgggtttgctttgtgaat
rev11: tagatccttgccataggtctgc
fw12: gtggttgtatattactgttctg
rev12: ctgctgtaagagatcactaac
fw13: gtgtaattatggattctctg
rev13: ctaagttaaaagatagactcag
fw14: caggtcaaagtcatttctccc
rev14: ggaattccatcgaaaccaga
fw15: cagagtctacagcatagagaa
rev15: gctgagaatcaaattctgcgta
fw16: gactgataatgagtcattgacc
rev16: ccttaatgatcaatacatgatgc
fw17: ctctgcatcgtgatctgtcttt
rev17: tatgcgtgagccaccaaccacg
fw18: ttgggcagtaactcacctcttac
rev18: gaaatctatttatagcccatcc
fw19_20: ccaataaaggatcacccaagtg
rev19_20: taggcctttgtaggctaatctg
fw21: gtaggggtttaatgatgtgaaa
rev21: aagaatagctcctatacactcc
fw22_23: gataggtggctaattcttgatg
rev22_23: tagcaaatatccacaagtccca
fw24_25: gtttagtctgcccagatcaccta
rev24_25: gaagggcctgacagtctgtatta
fw26: taatacagactgtcaggcccttc
rev26: caaagatacagcctcagggacta
fw27: caacctagtatatgcaagttgtt
rev27: atgttctgaccctagatagtag
5 Material und Methoden 119
fw28: gataggagtctttctgttgact
rev28: caaactacctctggcaaatagag
fw29: ctgagttagccatgcttaggaca
rev29: gctacctcggtgctcaactatt
fw30: gctaaatagttgagcaccgaggta
rev30: gtgctggtctagacaaccctaagt
fw31: agaaatcgtggtctagacagtgg
rev31: ctggtggccactgagaattt
fw32: gggttcatttctaataatatgc
rev32: gaataacaatcctcacactgac
fw33: cctagcccagattttttagttgg
rev33: cagtggcaagagatagactagctg
ORF138 fw1: gccaaacgtgtgatttagggtag
rev1: ctataaaataacgtcgactgagg
fw2_3: atccggattacaggctttcc
rev2_3: gcttcaccaggtcggtatgataa
fw4: ctcccattcagcctcctcaata
rev4: gaagatcctttcctcagcttca
fw5: gtcacccacaggtcagttcata
rev5: gttactgcctgagtccagtgaat
fw6: cttgaattgcatgtagccactgt
rev6: gatttcagcctcgcctcaatac
ORF166 fw1: cctattgtacaaccaggaagctg
rev1: gaaggtagttacgtgatgcttgg
fw2: gtatctggacccaggatttgaac
rev2: ccctgaaatccagctttcct
fw3: ggtctctttcaactctcccattct
rev3: tttgaaaggctaaggtgcagac
fw4: atgcagataatccgaagtctg
rev4: ctgtctgcatggatccttctaa
fw5: cccactgaactcattgtaaggtc
rev5: gacatttttctatgtgcacag
fw6: gttgcaagcaccattcaaca
rev6: actgtgcatgagctatttgtgg
fw7_8: gacaccagaatagctaggtgcttt
rev7_8: acccaattttctgggcttcctcc
ORF32 fw2: cctggtgttagattctcacacac
rev2: accatgcctggttaaagcatctc
fw3_1: cgcaaagtagcatctcaaggtt
rev3_1: gatctgtgggtgcaccatatgg
5 Material und Methoden 120
fw3_2: atccgagtgctccatcttcagt
rev3_2: ctggggagaaacaatgtcagttg
fw4: gtatgccagagtaaatgatgtgac
rev4: gccaatgaagttgcagattctaac
ORF101 fw1: ggaatagccatggagaaggtagg
rev1: accagaccgaatgccaagag
fw2: accccaatgcaagcatttggat
rev2: tcggattaccaccatgctgaca
fw3: gtgacgcaccatgtgatagac
rev3: gccataagaaatctacatctc
fw4: gagtagtgctgggtgactatc
rev4: catgctagattatcccgactg
fw5: gcaattatttgatgaacttgg
rev5: aggccagatgccactgcaatc
fw6: cttgaagttccgagatgaatc
rev6: caagtacccatagtgactcac
fw7: cttgacacgcagtttacctgt
rev7: acaactacttctcagacatac
fw8: cagcccttgtgattgttcag
rev8: agcagagttaagggatcaaacc
fw9: ctgcgtagtcccaagttgtagtt
rev9: aagaggccttagctgtattgactc
fw10: acaacaggcacacacaactagg
rev10: ccaagctgtctcactttgagtct
fw11: gctgctgcttatcaggtgatag
rev11: acagtgatcatgaaaactgtaccc
fw12: gggaggtaaattggaagaaggt
rev12: tctcaccagtgacagggaaatag
fw13: gatagttgccatacctctttcac
rev13: tctgtaagtaggagaacgagaag
fw14: atgtagatgatggctgggcatg
rev14: gacaagtagcctttccacatcc
fw15: acatcccttatcagtggagaagc
rev15: ggttgtggagattaggactagac
fw16: gcagcatatttgcctcctgctact
rev16: ccccattaaacagtactgctggac
ORF29 fw1: aagcttaggacatctgtgtgtg
rev1: gattgaggctgaggatagca
fw1_2: gaattcccagtgttagtctct
rev1_2 cagaccatttcagtctaacca
5 Material und Methoden 121
fw2: tgcaggctagtcctagctgataa
rev2: ggacagtgtgtctggagttaagg
fw3: gcagttgtggttctcgtcataa
rev3: atatgtgaaggcatgcctacag
fw4: tcctccaacctgaaagagaaagg
rev4: acgaaggtactttgggacctaga
fw5_6: ctcagagtttctgacagtgcaac
rev5_6: agcaaagagtccctgtcttctg
fw7: cttagtatagggcctgtggaacc
rev7: gcactgccagaaaccatctaa
fw8: gatgcacgtagctcatgtacaag
rev8: tgggttcccttttgtggtaactg
fw9: actctctgtgttaccctggttca
rev9: tacccaaatcttagtgcccatc
fw10: gagtaaatgggagagagggaaac
rev10: cagtagagacgacatggaggttc
fw11_12: tagctgtagagacaggcaactgg
rev11_12: gaagtcaatggcctcagctcatc
KIAA0831 fw1: ttaactcgtagtcttggcctgag
rev1: tcctctcgctggtatctggt
fw2: cccgttgagaagacgtgtattt
rev2: actgtataccacacaccggatct
fw3: ggatggcagttactgatgatgac
rev3: gccacgctacaagtggattaag
fw4: gcagtgatcccaggtagataatc
rev4: ccaccatccccttcctttctg
fw5: ctcgatagttgttgagtgactc
rev5: caatgaccctagaataagaccc
fw6: tctgtgctcataggcagcttt
rev6: gacacagaaagcaatgtgtgg
fw7: acgttatcaggttcacacaggtc
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fw8_9: gggcacagagtatgtgttatacct
rev8_9: ggtttgaggagtttgggattagg
fw10: atgtcaacacggagtgctgca
rev10: agcatgttggtcaccatcacag
KIAA1344 fw3: gacaattagcttaacacactctac
rev3: ccggattcaaacccagtcagac
fw4: ggaggaagaatgccaaatgt
rev4: gggcccaatagaatggttta
5 Material und Methoden 122
fw5: ccacatactggttccatgagact
rev5: acaagagcctcacaaacaacct
fw6: ggagactggtaggaatccttgtt
rev6: atcctcactcctccagttagacc
fw7: atttggccagactagggtgttag
rev7: tgtccaagggctcactacaaat
fw8: tcccaactagtatccctgtgaag
rev8: cttatccacactgccttcgttac
fw9: caactcgtgtggtttgttcag
rev9: gaacagtctatcttctattctacc
fw10: gagatcgtttctgttagtgttgg
rev10: ctagtctccatcttaatctccatc
fw11: gatggagattaagatggagac
rev11: gaccacatatattagctttcttta
fw12: cacacctggcccaagtaaaac
rev12: ctagtccagaacggctgaaagaa
fw13: caggaagcatctcagagtcagtt
rev13: gcacaatcccagaatcagaagt
fw14: gcagtacaagtgcggaaaatc
rev14: gctcctaagcactcttgaaac
fw15: tactgaagatcctaagcaaatgc
rev15: gctatctcccgaaaagtgttg
fw16: caacacttttcgggagatagc
rev16: cgcaagattctaacctagatac
fw17: ggaagccatgttgcattatatca
rev17: cccaaactatgataactccaaag
fw18: cactgtgacctcctagcctagat
rev18: tccagtaaatcctcagctcaca
fw19: gaggtgggattgaataagacga
rev19: ctcaatgggcatcaattcct
fw20: cgtcaagcctaaattgacaagc
rev20: actgtccacatggatgatgctac
fw2:1: atcggcattgagattatggacc
rev21: atggcactagtctgcaaacttg
MGAT22 fw2_1: agttccgaccgtgacaggccaa
rev2_1: gaacacctgcagaaccggacag
fw2_2: ccagggaattgacaacgtcct
rev2_2: gtacagaaagtgtctgtgcact
fw2_3: gtggaaactgaagcagcaagag
rev2_3: caattgtatgtcctgtttggaca
5 Material und Methoden 123
FRMD6 fw2: gaacaccgtgatgcttctcct
rev2: gacaacccaattctgccacatg
fw3: ctggtactgtgatcatcattac
rev3: ggaagagcaaacacatagaatc
fw4: ctagtatgtgcattcagactac
rev4: atactcagcatatatagaaaatgg
fw5: atagaaggatggtgccctgttt
rev5: gggactgaggatataccagcgta
fw6: agaaacagaagggttcctgtcac
rev6: ccaagctccactgtattatcagg
fw7: accaaccagtttacatggccta
rev7: caagactgacgtgcgataacaa
fw8: ctaggtatgtggaaaggcttgag
rev8: gtcaacaatcaggctgagtcac
fw9: ggcatacaccagaagggaaa
rev9: catgtgctacggaccaaacata
fw10: ttactgacagacccttgtggcta
rev10: cctttgccttctggaaatactg
fw11: gttcttggcctgatgagtcac
rev11: ctactgcctaaagttgctctcca
fw12: gtttcctattggagtctcattagc
rev12: cttagtgcagtccagtctctggt
fw13: ccctactttgactcattaacctc
rev13: cagaggcttcccaaccatataa
fw14: ccacagattggaaaccactttc
rev14: gagctatgtttagggtgaagaag
DDHD1 fw1_1: gattagaaacttcgggtggagag
rev1_1: caggtcttcttgtcctccttgt
fw1_2: ggcagctccttgtcgctgca
rev1_2: catctgctcgtttacccttcag
fw2: ttgtattgggtcatgaaaatctg
rev2: gtgttaatatcatgacacttacc
fw3: aagttgccattccctgtagcag
rev3: ccttgatgaacacatgtcaactc
fw4: gtttctggctttggtgttgtg
rev4: atagttggcactggaggaacat
fw5: agtgtggtagtcactggaatgta
rev5: tcccactatatccctccacct
fw6: agatccattagagccaaagctg
5 Material und Methoden 124
rev6: ccaacctgagaccatctgttt
fw7: taccttacttcattcctgcaagat
rev7: agaggtccagtaattccataaaga
fw8: gccatcatctgcgtctttatac
rev8: ctgtgccatataacctgaggact
fw9: cagagcccatctggataactctta
rev9: actgtgcccagctgatagattc
fw10: cggaggtttacttaacatgcag
rev10: ctgctgggagtttcctaataca
fw11: attatgggtggtgctctttagc
rev11: gcttgatggttaagaccttgtg
fw12: aatagaatcctgtactactgaggc
rev12: ctttaaccctgaaatctccgtatc
SOCS4 fw3_1: aagtgcccagaagaaacttcc
rev3_1: atctgatcgaggtgggaaagg
fw3_2: agtagtcggcactcttcagg
rev3_2: cttcggctgcgtatttatcc
fw3_3: cacacgcagattgattatgtcc
rev3_3: gacaccactgcctttgtagaaa
KLHDC1 fw1: tccaagagagaaggaatctgc
rev1: cgggtctgaggctttaataga
fw2: tctcatcctgagaagctgtgtaac
rev2: agagacagcactggtcttgagag
fw3: caagaccagtgctgtctctgaag
rev3: tgagtcacatcctgctcttatcc
fw4: cttggatcacattccctctgat
rev4: tcctacccagtccagtaagacaa
fw5: cttcttacaagccctgtatgtgc
rev5: ccaagttgtgctaaagcctctac
fw6: gtgactatggtaacacttaactc
rev6: ctcaagagaactacttggtatgtg
fw7: gactttcacatactgagcatagg
rev7: ctgcactgaaagattctcctca
fw8: tgaggagaatctttcagtgcag
rev8: gtccttgcttagacatacgatctg
fw9: cactgtgtagccaggtggaat
rev9: gagagccaagggtacaaaagc
fw10: gtggagcacatgtagcaaagtc
rev10: gatatccttctcaatggcttatgg
fw11: gagtcatctctttaatggtgtg
5 Material und Methoden 125
rev11: gagtaacatttcaggcccttca
fw12: tgtgtgtgtgtcaacagctaga
rev12: gagcactcaattacaggtgtaag
fw13: gatctgtgaaagtccaatactac
rev13: tatagtcacttaacagagtgactg
SPG3A fw1: gtgcctcgtagataaatgcaca
rev1: ctccacagaagcagaaagtgg
fw2: agtatgctcctgtgtcggatgt
rev2: cactgaggttggaatggttacac
fw3: ctcgaattggagagggataaga
rev3: cgcctactctgatcacaagaaa
fw4: tttcttgtgatcagagtaggcg
rev4: cacgagaactcgtatgctaattg
fw5: tgtcttgcttggaagaatgagt
rev5: ttaaccagtctcaggcagtaat
fw6: catggctctgctttacctatcc
rev6: ctggaaccagaatgcctaattc
fw7: tagtgacatagctccattcagg
rev7: gcactgtcagtcttgaagtgat
fw8: ttgtgggaccaaacagacatag
rev8: gccctattctcctgacaatttc
fw9: actgtgagaagagcaggtttcag
rev9: ctcgtacctttgctcccatatt
fw10: taaagggagtggcattgagttg
rev10: caacacaagtgaggctgcaata
fw11: ccagcatttaatggcaggcta
rev11: cctcattgcatgtgtgtacagtg
fw12: catatatgcaggctcctgatta
rev12: cctgttgatctgtatttccaac
fw13: aatctgcaggagtatctgttct
rev13: agagtccaccatttcagagctt
fw14: gttactgccaatcagaagttatg
rev14: attttactccgttctgatggaag
PELI2 fw1: gttctcgggatgggattgtag
rev1: atcggaacaatttgcaaagcgca
fw2: ggagtgtttagtgggcaattct
rev2: gcctcaaatggtctgagagact
fw3: gagtggtggctcataactacagg
rev3: tgcactgaggtctgagaatgtag
fw4: gcctgtagtcaacaatgactgc
5 Material und Methoden 126
rev4: cactagaggcaacatacaaagcc
fw5: ccctctgcctctatgcaatgta
rev5: aatgctcttcaggtggtaaggag
fw6_1: gtgggataaattgcttccctgt
rev6_1: caacgggatctgagaccagtatt
fw6_2: catactccaactcagaagcacat
rev6_2: aggtaaaatctagagttagtggc
GMFB fw1: tcaggcgatcgcattctgtcta
rev1: gaattcaatcggaattcgagtcc
fw2: tccagttctgatgacattgcac
rev2: cacctctgttctgtgacattag
fw3: ttaggtactgggaattatgggta
rev3: acactggacttcactaatgcttt
fw4: aaggaggctttgattggattgag
rev4: gctactgagctgcaagtttctg
fw5: cagaaacttgcagctcagtagc
rev5: catagacacagaccctcctcaa
fw6: gccaacctgtagacttgttcttg
rev6: cagtggctttctaacactgccta
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ATP5S fw1: ctttgtcacagcgaagactgac
rev1: gattcttagaggcacacgaagtc
fw2: ccaattgaggtttcaacagtgg
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fw3_1: cttcctcgtcagtcacttgaaa
rev3_1: aggagaggaaggtgtctgtaacc
fw3_2: aacaggccctctggacaaatac
rev3_2: ctggaggaaagaaatgcccaca
fw4: aatggtcctgtccatcagcacaa
rev4: gttgatgcttactgagggcttac
fw5: gtctgtgttacttcctggcatg
rev5: gtaacattaatgagccacgtctg
SOS2 fw1: aacccagacaaaggaggaggag
rev1: atgcaacaggcaattgtgagcc
fw2: tgatagggaagagagggttcaa
rev2: tttgtctacggcatgagatagg
fw3: ggaatcagaatgtattgtgtcac
rev3: tatggaagtgcacatatacacac
fw4: tatcccgtggtacccatacatt
5 Material und Methoden 127
rev4: gttactctgtaaagccaggatt
fw4_2: gaggcttttagtggagtccaac
rev4_2: agagatccccatcctgccatat
fw5: cgtatagatttcaagtactttgag
rev5: atttatgattttaagctggtctgg
fw6: gcctcgagtagcctatattgctc
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rev7: cccagatctagtatgtgccaaa
fw8: gggtatatggaagccagaacat
rev8: gactggtactgtgtgtctccaaa
fw9: ctattactagaaagttggggga
rev9: tcacacttctttgaaaaccaggc
fw10_1: gctgtgcgtaaaagctactgtt
rev10_1: ttggtaatctcagtggttgctc
fw10_2: cagttgtaaacctaatcatggcc
rev10_2: caatccattttttccccaagcct
fw11: gaaaagccacaatctgaggagc
rev11: tggcaaagtagtctacggtcca
fw12: gccaaaggacagttttttgtag
rev12: cataacatatcacatgccagag
fw13: tacaccgtttggagacctactct
rev13: gtggtgaatgtggtgaaatacc
fw14: tgaagatttgcagtcatgtctg
rev14: cataagacttttacttgcaggg
fw15_16: cttgttcatatatgtgttcatc
rev15_16: gacagatgatagatgaaatttc
fw17: gcacaaggcatgacgtagaat
rev17: tgagtgcgtcctatgtgctaga
fw18: gttgctgaatagtataggatgtc
rev18: accctgttgtgcgatccaatag
fw19: agtagtgctactgctgagccatt
rev19: cacctaggaacagccattcaa
fw20: ggactgcacgcttaagaactgta
rev20: tagactggtagtgggacccaaa
fw21: cactaccagtctaaagggagcaa
rev21: cccggctaggtgttctatacagt
fw22: tatggttggtgctagagacacag
rev22: ggcccagcctcttatttagaa
fw23_1: cccagattagtttattttgagcc
5 Material und Methoden 128
rev23_1: gcaagattattctgactagaactg
fw23_2: caccaagagatcctcttcctgat
rev23_2: caagacaaggcaatgctactga
PPIL5 fw1: catacagacacggtgctaagaca
rev1: gggattgccatccactactaaa
fw2: ggcaaagtaactggcacattct
rev2: gaggtacacctttagtcccagat
fw3_1: gccatagaatttgttatgggaag
rev3_1: aaattcttaagttcctggagctg
fw3_2: gccttaggaaattagacttgagtc
rev3_2: gcatagcactgtaagcaatgttag
fw3_3: agtaagattcccaggatgggaa
rev3_3: aggaatgattacagtaagggcc
fw4: gctattaagtggttgtgctggaag
rev4: cctcctctccagcaagtatacag
PLEKHC1 fw2: gagtttctgccgaaagcccc
rev2: gacgcaaaggggaacaggtc
fw3: gttgccctatatattctgcctcag
rev3: ctaggttcttcctgttccacctt
fw4: gacatcaatgtctgacacaactc
rev4: ctcttcctgacctacatgatcc
fw5_6: gctttcctttcagaataaaacttt
rev5_6: attccttattccaccgacttcc
fw7: ggcatatataggcatgtctgac
rev7: gctttcctaagtgtctactcac
fw8: ggtatgtgtccaaagaccctactt
rev8: ccactttgctcaaagttcctgaa
fw9: gcacctacaaacagtttcagca
rev9: gggctgtgccactgtattactat
fw10: tcccatgtgacctgctagttagt
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5 Material und Methoden 129
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5 Material und Methoden 130
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Primer für Expressionsanalyse Kandidatengene (cDNA Maus):
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5 Material und Methoden 131
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5 Material und Methoden 132
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Primer für die Resequenzierung der Patienten:
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NIN fw: caactgtccttatgtcagacctt
rev: catatgtccacattcttggtggc
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7 Anhang
7.1 mRNA-Sequenz von selm im Huhn 1 Start 50 ChEST934j5 (1) -------------------------------------------------- ChEST366h23 (1) ------GCGGCTCGAGGTTGCTCGCGACGTGGCGGGATGCGGCGGGCGGC ChEST382n9 (1) CATGCGCGGAGCGGGGGTTGCTCGCGACGTGGCGGGATGCGGCGGGCGGC ChEST397n20 (1) -----------------------GCGACGTGGCGGGATGCGGCGGGCGGC ChEST212c20 (1) -----------CTTTCGTTGCTCGCGACGTGGCGGGATGCGGCGGGCGGC ChEST80h20 (1) ----------------------TTTGACGTGGCGGGATGCGGCGGGCGGC Consensus (1) GTTGCTCGCGACGTGGCGGGATGCGGCGGGCGGC 51 100 ChEST934j5 (1) -------------------------------------------------- ChEST366h23 (45) GCTGGCCGCGCTGCTGCTGCTGCTGGCGGCGGCGGCGGGGATCGAGCGGC ChEST382n9 (51) GCTGGCCGCGCTGCTGCTGCTG---GCGGCGGCGGCGGGGATCGAGCGGC ChEST397n20 (28) GCTGGCCGCGCTGCTGCTGCTGCTGGCGGCGGCGGCGGGGATCGAGCGGC ChEST212c20 (40) GCTG-CCGCGCTGCTGCTGCTG---GCGGCGGCGGCGGGGATCGAGCGGC ChEST80h20 (29) GCTGGCCGCGCTGCTGCTGCTGCTGGCGGCGGCGGCGGGGATCGAGCGGC Consensus (51) GCTGGCCGCGCTGCTGCTGCTGCTGGCGGCGGCGGCGGGGATCGAGCGGC 101 Sec 150 ChEST934j5 (1) -------------------------------------------------- ChEST366h23 (95) GGCCGCCCCGGGGCTTGGCGAGGGGCAAAGTGGAGACGTGCGGTGGGTGA ChEST382n9 (98) GGCCGCCCCGGGGCTTGGCGAGGGGCAAAGTGGAGACGTGCGGTGGGTGA ChEST397n20 (78) GGC-GCCCCGGGGCTTGGCGAGGGGCAAAGTGGAGACGTGCGGTGGGTGA ChEST212c20 (86) GGCCGCCCCGGGGCTTGGCGAGGGGCAAAGTGGAGACGTGCGGTGGGTGA ChEST80h20 (79) GGCCGCCCCGGGGCTTGGCGAGGGGCAAAGTGGAGACGTGCGGTGGGTGA Consensus (101) GGCCGCCCCGGGGCTTGGCGAGGGGCAAAGTGGAGACGTGCGGTGGGTGA 151 200 ChEST934j5 (1) ------------------------------TTCGTCAGCCAGGACATCCC ChEST366h23 (145) CGGCTGAGCCGGCTGCCGGAGGTGAAGGCCTTCGTCAGCCAGGACATCCC ChEST382n9 (148) CGGCTGAGCCGGCTGCCGGAGGTGAAGGCCTTCGTCAGCCAGGACATCCC ChEST397n20 (127) CGGCTGAGCCGGCTGCCGGAGGTGAAGGCCTTCGTCAGCCAGGACATCCC ChEST212c20 (136) CGGCTGAGCCGGCTGCCGGAGGTGAAGGCCTTCGTCAGCCAGGACATCCC ChEST80h20 (129) CGGCTGAGCCGGCTGCCGGAGGTGAAGGCCTTCGTCAGCCAGGACATCCC Consensus (151) CGGCTGAGCCGGCTGCCGGAGGTGAAGGCCTTCGTCAGCCAGGACATCCC 201 250 ChEST934j5 (21) GCTGTACCATAACCTGGAGATGAAGCACCTGCCCGGCGCCGACCCTGAGC ChEST366h23 (195) GCTGTACCATAACCTGGAGATGAAGCACCTGCCCGGCGCCGACCCTGAGC ChEST382n9 (198) GCTGTACCATAACCTGGAGATGAAGCACCTGCCCGGCGCCGACCCTGAGC ChEST397n20 (177) GCTGTACCATAACCTGGAGATGAAGCACCTGCCCGGCGCCGACCCTGAGC ChEST212c20 (186) GCTGTACCATAACCTGGAGATGAAGCACCTGCCCGGCGCCGACCCTGAGC ChEST80h20 (179) GCTGTACCATAACCTGGAGATGAAGCACCTGCCCGGCGCCGACCCTGAGC Consensus (201) GCTGTACCATAACCTGGAGATGAAGCACCTGCCCGGCGCCGACCCTGAGC 251 300 ChEST934j5 (71) TCGTGCTGCTTAGCTTCAGATACGAGGAGCTGGAGAGAATCCCCCTGAGC ChEST366h23 (245) TCGTGCTGCTTAGCTTCAGATACGAGGAGCTGGAGAGAATCCCCCTGAGC ChEST382n9 (248) TCGTGCTGCTTAGCTTCAGATACGAGGAGCTGGAGAGAATCCCCCTGAGC ChEST397n20 (227) TCGTGCTGCTTAGCTTCAGATACGAGGAGCTGGAGAGAATCCCCCTGAGC ChEST212c20 (236) TCGTGCTGCTTAGCTTCAGATACGAGGAGCTGGAGAGAATCCCCCTGAGC ChEST80h20 (229) TCGTGCTGCTTAGCTTCAGATACGAGGAGCTGGAGAGAATCCCCCTGAGC Consensus (251) TCGTGCTGCTTAGCTTCAGATACGAGGAGCTGGAGAGAATCCCCCTGAGC
7 Anhang 158
301 350 ChEST934j5 (121) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA ChEST366h23 (295) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA ChEST382n9 (298) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA ChEST397n20 (277) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA ChEST212c20 (286) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA ChEST80h20 (279) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA ORF (265) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA Consensus (301) GACATGACCCGGGAGGAGATCAACCAGCTGGTGCAGGAGCTGGGCTTCTA 351 400 ChEST934j5 (171) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTG-CC ChEST366h23 (345) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTG-CC ChEST382n9 (348) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTGGCC ChEST397n20 (327) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTG-CC ChEST212c20 (336) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTG-CC ChEST80h20 (329) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTG-CC ORF (315) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTG-CC Consensus (351) CCGCAAGGAGACTCCCGAAGCTCCTGTGCCCGAGGAGTTCCAGTTTG CC 401 450 ChEST934j5 (220) CCTGCCAA-GCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG ChEST366h23 (394) CCTGCCAA-GCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG ChEST382n9 (398) CCTGCCAA-GCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG ChEST397n20 (376) CCTGCCAA-GCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG ChEST212c20 (385) CCTGCCAAAGCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG ChEST80h20 (378) CCTGCCAA-GCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG ORF (364) CCTGCCAA-GCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG Consensus (401) CCTGCCAA GCCACTGCCCACCCTAACACCCCGCAGGGCTCCTGCAGCTG 451 Stop 500 ChEST934j5 (269) ACGGCAAGACCCTGTCTGAACAGGACAAGAAGGACCACCCAGACCTGTAA ChEST366h23 (443) ACGGCAAGACCCTGTCTGAACAGGACAAGAAGGACCACCCAGACCTGTAA ChEST382n9 (447) ACGGCAAGACCCTGTCTGAACAGGACAAGAAGGACCACCCAGACCTGTAA ChEST397n20 (425) ACAGCAAGACCCTGTCTGAACAGGACAAGAAGGACCACCCAGACCTGTAA ChEST212c20 (435) ACGGCAAGACCCTGTCTGAACAGGACAAGAAGGACCACCCAGACCTGTAA ChEST80h20 (427) ACGGCAAGACCCTGTCTGAACAGGACAAGAAGGACCACCCAGACCTGTAA Consensus (451) ACGGCAAGACCCTGTCTGAACAGGACAAGAAGGACCACCCAGACCTGTAA 501 550
7 Anhang 159
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1: Differenzierung von Chondrozyten, Osteoblasten und Osteoklasten. 6
Abb. 2.2: Enchondrale Ossifikation von Röhrenknochen. .................................... 7
Abb. 2.3: Wichtige Faktoren der Unfolded Protein Response. ............................ 11
Abb. 2.4: Aufbau des Zentrosoms.. ......................................................................... 12
Abb. 2.5: Schematischer Aufbau eines Ziliums. ................................................... 13
Abb. 2.6: Einbau von Selenocystein in Selenoproteine.. ...................................... 15
Abb. 3.1: Stammbaum und Patientenbilder. ......................................................... 18
Abb. 3.2: Genomweite parametrische multipoint LOD-Score Analyse. ............ 19
Abb. 3.3: Eingrenzung der Kopplungsregion auf Chromosom 14 durch
Haplotypenanalyse. ...................................................................................20
Abb. 3.4: Physikalische Karte der Kopplungsregion auf Chromosom 14.. ...... 21
Abb. 3.5: Resequenzierung und Segregation. ........................................................ 24
Abb. 3.6: Konservierung der mutierten Aminosäuren in verschiedenen Vertebraten.................................................................................................25
Abb. 3.7: Bioinformatische Analysen von POLE2 und NIN............................... 26
Abb. 3.8: Expressionsanalyse von Nin und Pole2 mittels RT-PCR. .................. 27
Abb. 3.9: Subzelluläre Lokalisation von NIN und POLE2 (Wildtyp und
Mutante). .....................................................................................................29
Abb. 3.10: Gen- und Proteinstruktur des humanen Selenoprotein M.. .............. 31
Abb. 3.11: Selm-Expression in Röhrenknochen. ..................................................... 32
Abb. 3.12: Expression von selm in unterschiedlichen Geweben und Flügeln
verschiedener Embryonalstadien. ...........................................................33
Abb. 3.13: Selm-Expression in Schädelknochen. .................................................... 34
Abb. 3.14: Expression von selm in Osteoblasten und nicht in Chondrozyten.... 35
Abb. 3.15: Selm-Expression in Sehnen. .................................................................... 35
Abb. 3.16: Expression von selm, scx und tnmd in Flügeln verschiedener
Embryonalstadien. ....................................................................................36
Abb. 3.17: Expression von selm in Sehnen. .............................................................. 37
Abb. 3.18: Expressionsprofil von scx und tnmd. ..................................................... 38
Abb. 3.19: Selm-Expression in Mausembryonen (E16,5). ..................................... 39
Abb. 3.20: Expression von Selm in P4-Mäusen. ...................................................... 40
Abb. 3.21: Schematische Darstellung des Selm-Knockout-Allels und
Genotypisierung. ........................................................................................41
Abb. 3.22: Nachweis des Selm-Knockouts. .............................................................. 42
Abb. 3.23: X-Gal-Färbung.......................................................................................... 43
Abb. 3.24: Histologie der großen inneren Organe und der Hoden. ..................... 45
Abb. 3.25: Skelettfärbung mit Alzianblau und Alizarinrot. . ................................ 46
7 Anhang 160
Abb. 3.26: Induktion der Selm-Expression durch ER-Stress. ...............................47
Abb. 3.27: Schematische Darstellung des murinen Selm-Promotors. ..................49
Abb. 3.28: Aktivität des Selm-Promotors. ................................................................50
Abb. 3.29: Konservierung der putativen XBP1-Bindestelle. .................................50
Abb. 3.30: Aktivierung des Selm-Promotors durch XBP1. ....................................51
Abb. 3.31: Schematische Darstellung der Y2H-Konstrukte. .................................53
Abb. 3.32: Autotransaktivierungstest der Köder-Konstrukte.. ............................54
Abb. 3.33: Nachweis von Fusionsproteinen mittels Western Blot.. ......................55
Abb. 3.34: Potentielle Interaktionspartner von SELM. .........................................56
Abb. 4.1: Übersicht über die Lokalisation einiger ziliärer Proteine.. ................63
Abb. 4.2: Die Beteiligung der UPR an der Osteoblastendifferenzierung. .........69
Abb. 4.3: Die adaptive und apoptotische ER-Stressantwort. .............................76
7 Anhang 161
7.3 Tabellenverzeichnis
Tab. 3.1: Kandidatengene der Gruppe A (entsprechend NCBI36/hg18). ............. 21
Tab. 3.2: Kandidatengene der Gruppe C (entsprechend NCBI36/hg18). ............. 22
Tab. 3.3: Homozygote, bisher unbekannte Varianten (dbSNP 131) der Indexpatientin. ................................................................................................24
Tab. 3.4: Zusammenfassung der Ergebnisse des Autotransaktivierungstests. .... 54
Tab. 3.5: Potentielle Interaktionspartner von SELM............................................... 57
Tab. 4.1: Humane Ziliopathien mit skelettärer Beteiligung. ................................... 62
Tab. 4.2: Subzelluläre Lokalisation und Funktion der Selenoproteine. ................ 74
7 Anhang 162
7.4 Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
α alpha
β beta
µ mikro (10-6)
3’-UTR 3’-untranslatierte Region
5’-UTR 5’-untranslatierte Region
A Adenin
AbA Aureobasidin
Abb. Abbildung
A. bidest Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser)
Ade Adenin
AS Aminosäure
Asn Asparagin
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
bzw. beziehungsweise
C Cytosin
c zenti (10-2)
ca. circa
cDNA komplementäre DNA
cM centi-Morgan
CS Hühnerserum
CT Computertomographie
C-terminal carboxy-terminal
Cys Cystein
D Aspartat
d Tag
DAPI 4',6-Diamidin-2'-phenylindol-dihydrochlorid
ddNTP 2’,3’-Didesoxynucleosid-5’-triphospha
DEPC Diethylpyrocarbonat
d.h. das heißt
DIG Digoxigenin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP 2’-Desoxynucleosid-5’-triphosphat
DTT Dithiothreitol
E Tag der Embryonalentwicklung
7 Anhang 163
ECM extrazelluläre Matrix
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ES embryonale Stammzellen
EST expressed sequence tag
et al. et alii (und andere)
EtOH Ethanol
FCS Fötales Kälberserum
fw forward
G Guanin
g Erdbeschleunigung
g Gramm
gDNA genomische DNA
ggf. gegebenenfalls
Glu Glutamat
h Stunde
H2O Wasser
HE Hämatoxylin/ Eosin
His Histidin
HRP horse radish peroxidase
ISH RNA-in situ-Hybridisierung
k kilo (103)
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
l Liter
LB Luria Broth
Leu Leucin
M molar
m milli (10-3)
mA milli-Ampere
min Minute
Mio Millionen
mmc micromass culture
mRNA messenger Ribonukleinsäure
MT Mikrotubuli
N Asparagin
n nano (10-9)
N-terminal amino-terminal
NP-40 Nonidet P40 Substitute
OD optische Dichte
ORF open reading frame
7 Anhang 164
P Prolin
P Postnataltag
PAA Polyacrylamid
PBS phosphate buffered saline-Puffer
PCR polymerase chain reaction
PFA Paraformaldehyd
pH negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionen-Konzentration
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
qPCR quantitative Real-Time PCR
rev reverse
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
rpm rounds per minute
RT-PCR Reverse Transkriptase polymerase chain reaction
S Serin
s Sekunde
s. siehe
SDS Natriumdodecylsulfat
Sec Selenocystein
SSC standard saline citrate-Puffer
T Thymin
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TG Thapsigargin
TM Tunicamycin
tRNA Transfer-Ribonukleinsäure
Trp Tryptophan
U units (Enzymeinheiten)
u.a. unter anderem
UV ultraviolett
ÜN über Nacht
UPR Unfolded Protein Response
V Volt
v.a. vor allem
vgl. vergleiche
Vol. Volumen
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
7 Anhang 165
7.5 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Winterpacht für die Bereitstellung des Themas der
vorliegenden Doktorarbeit, für die Erstellung des Erstgutachtens sowie für die
kompetente Betreuung, engagierte Unterstützung und fortwährende
Diskussionsbereitschaft, die wesentlich zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben.
Herrn Prof. Dr. Slany danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Patricia Klinger und Herbert Rohrmüller möchte ich herzlich für die Benutzung des
Photometers und die unzähligen Blots danken.
Ein riesengroßes Dankeschön geht auch an alle Mitarbeiter des Humangenetischen
Instituts, vor allem der AG Winterpacht. Mein ganz besonderer Dank gilt dabei:
- Andreas Tagariello für die tolle Betreuung („Alles wird gut.“) und
stundenlangen Diskussionen (nur um festzustellen, dass wir wieder das Gleiche
gemeint haben). Mit niemandem konnte ich so gut (konstruktiv) streiten, wie mit
dir!
- Claudia Nelkenbrecher, die für mich eine gute Freundin geworden ist. Ohne dich
wäre die Arbeit (vor allem zum Schluss) nur halb so schön gewesen!
- Jenny Fuchs, die unermüdlich auf der Suche nach dem Phänotyp war. Die späten
Stunden im Labor wären ohne dich doch sehr einsam gewesen!
Einen ganz besonderen Dank für ihre Unterstützung möchte ich meiner Familie,
besonders meinen Eltern, aussprechen, ohne die diese Arbeit gar nicht möglich gewesen
wäre. Vielen, vielen Dank!
Zu guter Letzt möchte ich meinem Mann danken, der immer für mich da war, auch
wenn der Frust groß war. Flo, ich liebe dich!
7 Anhang 166
7.6 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Melanie Grosch
Geburtstag: 17.03.1983
Geburtsort: Erlangen
Familienstand: verheiratet
Schule
1989-1993 Grundschule
1993-2002 Ohm-Gymnasium Erlangen
Abschluss: Abitur
Studium
10/2002 – 05/2007 Studium der Molekularen Medizin (Diplom) an der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg;
Diplomarbeit: „Funktionelle Charakterisierung des distalen
Chondrozytenmarkers UCMA“
Seit 10/2007 Promotion zum Dr. rer. nat. am Humangenetischen Institut des
Universitätsklinikums Erlangen, AG Prof. Dr. Winterpacht;
Thema: „Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit
spezieller Funktion in der Skelettentwicklung“
7 Anhang 167
7.7 Veröffentlichungen
Teile der vorliegenden Doktorarbeit wurden in folgenden Zeitschriften
veröffentlicht bzw. bei folgenden Tagungen vorgestellt (Ausnahmen sind mit einem *
markiert):
Publikationen
Grosch M., Fuchs J., Bösl M., Winterpacht A., Tagariello A. (eingereicht).
„Selenoprotein M: Expressed during bone development and involved in the Unfolded
Protein Response.“
Grosch M., Grüner B., Spranger S., Meinecke P., Stütz A. M., et al. (in Vorbereitung).
„Homozygosity mapping and whole-exome sequencing reveal mutations in the genes
NIN and POLE2 in a family with spondyloepimetaphyseal dysplasia with joint laxity
(SEMD-JL).”
*Neacsu C. D., Grosch M., Tejada M., Winterpacht A., Paulsson M., et al. (2011).
„Ucmaa (Grp-2) is required for zebrafish skeletal development. Evidence for a
functional role of its glutamate gamma-carboxylation." Matrix Biol 30(7-8): 369-78.
*Tagariello A., Luther J., Streiter M. , Didt-Koziel L., Wuelling M., et al. (2008).
„Ucma – A novel secreted factor represents a highly specific marker for distal
chondrocytes." Matrix Biol 27(1): 3-11.
Poster
*Tagariello A., Grosch M., Neacsu C., Nelkenbrecher C., Wagener R. et al. (2009)
„Further functional characterization of UCMA.” Vortrag: Second Joint Meeting of the
French and German Connective Tissue Societies, Reims, Frankreich, 03.06. -
05.06.2009.
Grosch M., Winterpacht A., Tagariello A. (2009) „Selenoprotein M is expressed in
developing bone and tendon.” Poster: Second Joint Meeting of the French and German
Connective Tissue Societies, Reims, Frankreich, 03.06. - 05.06.2009.
*Tagariello A., Grosch M., Neacsu C., Nelkenbrecher C., Wagener R. et al. (2009)
„Further functional characterization of UCMA.” Vortrag: Gordon Research Conference
Cartilage Biology & Pathology, Les Diablerets, Schweiz, 07.06. - 12.06.2009.
7 Anhang 168
Grosch M., Winterpacht A., Tagariello A. (2009) „Selenoprotein M is expressed in
developing bone and tendon.” Poster: Gordon Research Conference Cartilage Biology
& Pathology, Les Diablerets, Schweiz, 07.06. - 12.06.2009.
Grosch M., Winterpacht A., Tagariello A. (2009) „Selenoprotein M is expressed in
developing bone and tendon.” Poster: 40. Jahrestagung der Gesellschaft für Genetik,
Köln, 16.-19.09.2009.
Grosch M., Winterpacht A., Tagariello A. (2010) „Selenoprotein M is expressed in
developing bone and tendon.” Poster: 21. Jahrestagung der Gesellschaft für
Humangenetik (GfH), Hamburg, 02.03. - 04.03.2010, Med Genetik, 22, S. 181
Grosch M., Fuchs J., Winterpacht A., Tagariello A. (2011) „Characterization of murine Selenoprotein M.“ Poster: Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Bindegewebsfoschung (DGBF), Köln, 31.03.-02.04.2011.
