Der Einfluss von Fcγ-RIII und TNF-RI auf den Respiratory ... · CHAOS Cardiovascular shock, Homeostasis, Apoptosis, Organ dysfunction, Immune suppression DAG Diazylglyzerol DHEA

Aus dem Institut für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und der

Experimentellen Unfallchirurgie

der Unfallchirurgischen Kinik

der medizinischen Hochschule Hannover

Der Einfluss von Fcγ-RIII und TNF-RI auf den Respiratory Burst

von neutrophilen Granulozyten in Abhängigkeit vom

Migrationsverhalten in einem

Ischämie-Reperfusions-Modell der Maus

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Nina Zündel

aus Northeim

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung:

Univ.-Prof. Dr. med. vet. M. Kietzmann, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und

Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

Prof. Dr. rer. biol. hum. Martijn van Griensven, Experimentelle Unfallchirurgie,

Unfallchirurgische Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr.med.vet. M. Kietzmann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr.med.vet. H.-J. Hedrich

Tag der mündlichen Prüfung: den 4. Juni 2004

Meinen Eltern

&

Daggi und Werner

gewidmet

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG.........................................................................................................1

2 LITERATURÜBERSICHT .....................................................................................3

2.1 Rolle des Immunsystems bei der Pathogenese des SIRS und MODS ................................................... 3

2.2 Rolle der neutrophilen Granulozyten bei der Pathogenese des SIRS und MODS............................... 8

2.3 Rolle der Adhäsionsmoleküle bei der Pathogenese des SIRS und MODS.......................................... 11

2.4 Rolle der Zytokine bei der Pathogenese des SIRS und MODS............................................................ 12 2.4.1 Tumor Nekrose Faktor α (TNF-α) ..................................................................................................... 13 2.4.2 Interleukin-6 ...................................................................................................................................... 16 2.4.3 Interleukin-10 .................................................................................................................................... 17

2.5 TNF-α-Rezeptoren................................................................................................................................... 18

2.6 Fcγ-Rezeptoren ........................................................................................................................................ 21 2.6.1 Fcγ-Rezeptorfunktionen auf neutrophilen Granulozyten................................................................... 23

1.7 Möglichkeiten der Prävention und der Therapie des SIRS und MODS............................................. 24

1.8 Grund für die Verwendung der Knockout-Mäuse ............................................................................... 27

3 FRAGESTELLUNG ............................................................................................29

4 MATERIAL UND METHODEN............................................................................30

4.1 Material .................................................................................................................................................... 30 4.1.1 Chemikalien und Medikamente......................................................................................................... 30 4.1.2 Geräte ................................................................................................................................................ 31 4.1.3 Verbrauchsmaterialien....................................................................................................................... 32

4.2 Methoden.................................................................................................................................................. 33 4.2.1 Versuchstiere ..................................................................................................................................... 33

4.2.1.1 Versuchstiergruppen...................................................................................................................... 34 4.2.2 Versuchsprotokoll.............................................................................................................................. 35 4.2.3 Blut und Organentnahme................................................................................................................... 36 4.2.4 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ...................................................................................................... 37 4.2.5 Kapilläre Permeabilität der Lunge..................................................................................................... 37 4.2.6 Proteinbestimmung nach Lowry........................................................................................................ 38 4.2.7 Harnstoffbestimmung ........................................................................................................................ 39

4.3 Myeloperoxidaseaktivität (MPO)........................................................................................................... 41

4.4 Histologische Untersuchung ................................................................................................................... 43 4.4.1 Durchflusszytometrie ( FACS-Analyse)............................................................................................ 45

4.4.1.1 Funktionsprinzip des Durchflusszytometers.................................................................................. 45 4.4.1.2 Durchführung der Messung ........................................................................................................... 46

4.5 Statistik..................................................................................................................................................... 48

5 ERGEBNISSE.....................................................................................................49

5.1 Lungenpermeabilität ............................................................................................................................... 49

5.2 Myeloperoxidaseaktivität........................................................................................................................ 51

5.3 Histologie.................................................................................................................................................. 53 5.3.1 Lungenödem...................................................................................................................................... 53 5.3.2 Granulozyteninfiltration ins Lungengewebe...................................................................................... 56 5.3.3 Leberödem......................................................................................................................................... 58 5.3.4 Granulozyteninfiltration in die Leber ................................................................................................ 61 5.3.5 Hydropische Degeneration in der Leber............................................................................................ 63 5.3.6 Nekrotische Veränderungen in der Milz............................................................................................ 65 5.3.7 Abgrenzbarkeit der weißen von der roten Milzpulpa ........................................................................ 67 5.3.8 Lymphozytendichte in der weißen Milzpulpa ................................................................................... 69 5.3.9 Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli ................................................................................. 71 5.3.10 Granulozyteninfiltration in die Nieren............................................................................................... 73

5.4 Zytokine.................................................................................................................................................... 75 5.4.1 INF-γ-Konzentration ......................................................................................................................... 75 5.4.2 IL-12-Konzentration.......................................................................................................................... 77 5.4.3 TNF-α-Konzentration ........................................................................................................................ 79 5.4.4 IL-6-Konzentration............................................................................................................................ 81 5.4.5 IL-10-Konzentration.......................................................................................................................... 83 5.4.6 MCP-1-Konzentration ....................................................................................................................... 85

5.5 Mortalität ................................................................................................................................................. 87

6 DISKUSSION......................................................................................................89

6.1 Lungenpermeabilität ............................................................................................................................... 91

6.2 Myeloperoxidaseaktivität und Granulozyteninfiltration des Lungengewebes................................... 92

6.3 Lungenödem............................................................................................................................................. 95

6.4 Leberödem ............................................................................................................................................... 96

6.5 Granulozyteninfiltration in die Leber ................................................................................................... 98

6.6 Hydropische Degeneration der Leber.................................................................................................... 99

6.7 Nekrosen, Lymphozytendichte und Abgrenzbarkeit der weißen von der roten Pulpa in der Milz100

6.8 Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli und Granulozyteninfiltration in die Nieren ......... 101

6.9 Zytokine.................................................................................................................................................. 102

7 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................109

8 SUMMARY........................................................................................................111

9 LITERATURVERZEICHNIS ..............................................................................113

10 DANKSAGUNG .............................................................................................139

Abkürzungen

ARDS Adult Respiratory Distress Syndrome

BAL Bronchoalveoläre Lavage

BSA Bovine Serum Albumin

CARS Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome

CD Cluster of Differentiation

CHAOS Cardiovascular shock, Homeostasis, Apoptosis, Organ

dysfunction, Immune suppression

DAG Diazylglyzerol

DHEA Dehydroepiandrosteron

DNA Desoxyribonucleicacid

ELAM Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

F- Mäuse denen sowohl das Gen für den TNF-RI als auch für den

Fcγ-RIII fehlt

Fcγ-R Fcγ-Rezeptor

FMLP Formylmethionine Leucyl-Phenylalanine

GM-CSF Granulocyte-Makrophage-Colony-stimulating factor

HE Hämatoxylin-Eosin

ICAM Intercellular Adhesion Molecule

IFN Interferon

IgG Immunglobulin G

IL Interleukin

I/R Ischämie-Reperfusion

Isch. Ischämie

LPS Lipopolysaccharide

NO Stickstoffmonoxid

MARS Mixed Antagonist Response Syndrome

min Minuten

MODS Multiorgan Dysfunktions Syndrom

MOV Multiorganversagen

MPO Myeloperoxidase

NK-Zellen Natürliche Killerzellen

OD Optische Dichte

p55 Tumornekrosefaktorrezeptor I

p75 Tumornekrosefaktorrezeptor II

PMN Polymorphonuclear Granulocytes

SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome

sTNF löslicher Tumornekrosefaktor

T- Mäuse, denen das Gen für den TNF-Rezeptor I fehlt

TH T-Helferzellen

TNF Tumornekrosefaktor

TNF-R Tumornekrosefaktorrezeptor

WT Wildtyp-Mäuse (C57BL/6-Mäuse)

Ferner gelten die allgemeinen SI-Einheiten und die chemischen Elementsymbole.

Einleitung 1

1 Einleitung

Noch vor 50 Jahren war das Problem des Multiorganversagens (MOV) gänzlich unbekannt.

Aufgrund der noch wenig entwickelten rettungsmedizinischen Maßnahmen verstarben

Patienten, die einen hämorrhagischen Schock erlitten, wegen des großen Blutverlustes, bevor

sich ein derartiges Krankheitsbild entwickeln konnte. Auch schwere bakterielle Infektionen

stellten ein zusätzliches gravierendes Problem dar, weil die antibiotischen

Therapiemöglichkeiten noch sehr begrenzt waren.

Mit der konstanten Verbesserung rettungsmedizinischer Maßnahmen durch großzügige

Volumenersatztherapie war es möglich, polytraumatisierte Schockpatienten zu stabilisieren.

In diesem Zusammenhang trat eine Folge von Komplikationen auf, die bisher unbekannt

waren. Viele der Verletzten starben nun nicht mehr aufgrund des starken Blutverlustes,

sondern an schweren sekundären Beeinträchtigungen der Lungen- und Nierenfunktion.

Besonders häufig konnte diese Beobachtung während der 60 er Jahre gemacht werden, da mit

Hilfe von Hubschraubern eine schnelle Erstversorgung von verletzten Personen gewährleitset

werden konnte. Sie konnten somit zwar vor einem tödlichen Blutverlust bewahrt werden, es

entwickelte sich jedoch sekundär ein Krankheitsbild, was aus einem Komplex von Luftnot,

erhöhter Temperatur und zentraler Zyanose gekennzeichnet ist. Während dieser Zeit wurde

der Begriff der „Schocklunge“ geprägt. Zwar wurden die gleichen Symptome bereits 1932

durch MOON und 1950 durch JENKINS et al. beschrieben, den bis heute noch gültigen

Begriff des „Adult Respiratory Distress Syndrom“ (ARDS) führten ASHBAUGH et al.

jedoch erst 1967 ein. Verschiedene Autoren beschrieben zu jener Zeit eine Beeinträchtigung

der Lungenfunktion nach Bauchhöhlenoperationen (SKILLMAN 1969), Peritonitis (BURKE

1963) oder anderen Infektionen (CLOWES, Jr. 1968). Somit wurde klar, dass die pulmonale

Beeinträchtigung wahrscheinlich die Folge entfernter Prozesse im Körper ist. Das ARDS war

zu dieser Zeit die häufigste Todesursache bei schwerverletzten Patienten (ALBERTS 1999;

ASHBAUGH 1967; BAUE 1975; BURKE 1963; GORIS 2003). Die Überlebensrate an

ARDS erkrankter Patienten konnte durch weitere intensivmedizinische

Behandlungsfortschritte erheblich verbessert werden, so dass neben den zunächst

Einleitung 2

lebenslimitierenden Lungenveränderungen auch die Beeinträchtigungen anderer

Organsysteme in den Vordergrund rückten. TINLEY et al. beschrieben 1973 erstmals dieses

neu entstandene Syndrom, als drei Patienten nach rupturierten Aortenaneurysmen an den

Folgen von „distal organ failure“ verstarben. Von BAUE wurde dieses Syndrom 1975 als

Multiorganversagen (MOV) bezeichnet, „das Syndrom der Siebziger Jahre“. Trotz maximaler

Intensivtherapie konnten viele der Patienten auf Intensivstationen nicht mehr stabilisiert

werden, da sie ein multiples, progressives MOV entwickelten (CARRICO 1986; MANSHIP

1984; SCHUSTER 1989), was mit hoher Letalität einherging. Im Jahre 1991 wurden bei der

Konsensuskonferenz der Society of Critical Care Medicine und des American College of

Chest Physicians die Begriffe „SIRS“ (Systemic Inflammatory Response Syndrom) und

„Sepsis“ neu definiert. In diesem Rahmen wurde auch die Bezeichnung „MOV“ durch

„MODS“ (Multiorgan Dysfunktions Syndrom) ersetzt. Hierdurch soll das Kontinuum der

Organdysfunktion besser zum Ausdruck kommen und nicht nur der Endpunkt in Form des

Organversagens beschrieben werden.

Auch heute noch stellt das MODS die schwerwiegendeste Komplikation bei schwerverletzten

Patienten dar. Etwa 40% der Intensivpatienten entwickeln ein MODS, was mit

Mortalitätsraten von 50-80% einhergeht und somit die führende Todesursache auf

Intensivstationen ist (DEITCH 1992; MANSHIP 1984; MARSHALL 1995; RANGEL-

FRAUSTO 1995; SALVO 1995; TRAN 1990).

Literaturübersicht 3

2 Literaturübersicht

2.1 Rolle des Immunsystems bei der Pathogenese des SIRS und MODS

Das Immunsystem spielt nach neuen Erkenntnissen bei der Entstehung des MODS eine

besonders wichtige Rolle. Durch die Immunmediatoren wird das Immunsystem zu einer

Reaktion angeregt, welche das physiologische Ausmaß deutlich überschreitet. Es können

sowohl zu starke als auch zu geringe Immunantworten auf das auslösende Agens auftreten.

Die Folge ist ein sequentielles Versagen multipler Organsysteme wie der Lunge, der Leber,

des Intestinums und der Niere. Exogene Faktoren scheinen hierbei eine untergeordnete Rolle

zu spielen, sind es doch die endogenen Mediatoren, die auf das Immunsystem einwirken

(DEITCH 1992).

Eine Aufgabe des Immunsystems besteht darin, den Organismus vor der Invasion pathogener

Agentien zu schützen. Es besteht eine Proportionalität zwischen der Intensität der

Immunabwehr und der Stärke einer Infektion. Ziel dieser Immunabwehr ist es, das

schädigende Agens zu eliminieren.

Man unterscheidet funktionell zwischen dem angeborenen (unspezifischen) und dem

erworbenen (spezifischen) Immunsystem. Die angeborene Abwehr umfaßt unspezifische

physikalische, zelluläre und chemische Mechanismen, während das erworbene Abwehrsystem

aus einer zellulären (T-Zell-Antwort) und einer humoralen (Antikörper) Komponente besteht

(siehe Abbildung 1).


angeborene, physikalische zelluläre chemische unspezifische Barrieren Abwehr Barrieren Abwehr Haut Granulozyten pH-Wert Mukosa Makrophagen Lipide NK-Zellen Enzyme Komplement Interleukine Akutphasenproteine erworbene, zelluläre humorale spezifische Abwehr Abwehr Immunität Lymphokine, Interleukine Antikörper Zytotoxische T-Zellen T-Helferzellen B-Zellen

Abbildung 1: Komponenten des Immunsystems (KAYSER 1998)

Bei einer physiologischen Immunantwort regulieren sich die funktionellen Einheiten des

Immunsystems gegenseitig, so dass es zu einer angemessenen Reaktion kommt, die innerhalb

bestimmter Grenzen bleibt, und rechtzeitig beendet wird. Kann das pathogene Agens jedoch

nicht eliminiert werden, wie zum Beispiel Bakterien oder Endotoxine bei einer Sepsis, ist es

möglich, dass eine derartig intensive Aktivierung des Immunsystems resultiert, welche zu

einem septischen Schock führt und schließlich in einem MODS endet (BUDELMANN 1969).


Von einem Systemic Inflammatory Response Syndrom (SIRS) spricht man, wenn laut

Definition zwei oder mehr der folgenden Parameter diagnostiziert werden können:

1. Rektaltemperatur entweder > 38° C oder < 36° C

2. Herzfrequenz > 90 Schläge pro Minute

3. Atemfrequenz > 20 Atemzüge pro Minute oder

arterieller Kohlenstoffdioxidpartialdruck < 4,3 kPa

4. Leukozytenzahl> 12000 pro mm3 oder < 4000 pro mm3

oder 10% der Leukozyten bestehen aus unreifen Formen

Tritt das SIRS im Zusammenhang mit einer generalisierten Infektion auf, so spricht man in

diesem Falle von einer „Sepsis“. Ist zusätzlich der hämodynamische Status beeinträchtigt, so

liegt eine „schwere Sepsis“ vor. Das „MODS“ beschreibt den Zustand eines physiologischen

Ungleichgewichts, bei dem die Organe nicht in der Lage sind, die Homöostase aufrecht zu

halten (BONE 1992).

Die Entwicklung des SIRS kann in drei Stadien unterteilt werden:

• die lokale Immunantwort,

• die initiale systemische Immunantwort und

• die massive systemische Inflammation (BONE 1996a; DAVIES 1997)

Während der ersten Phase reagiert der Körper mit einer physiologischen lokalen

Immunantwort auf einen Infektionsreiz oder ein Trauma. Hierbei werden humorale und

zelluläre Immunmediatioren lokal aktiviert, um bereits aufgetretene Schäden zu beseitigen

und eine Ausbreitung zu verhindern (REGEL 1989). Um einem Überschießen der

proinflammatorischen Immunantwort vorzubeugen, werden regulativ auch

antiinflammatorische Mediatoren freigesetzt (DINARELLO 1993; PLATZER 1995). Ist die

lokale Immunantwort nicht in der Lage den initiierenden Reiz zu kontrollieren, gelangen

während der zweiten Phase Mediatoren und proteolytische Enzyme in die systemische

Zirkulation, um eine erhöhte Einwanderung peripherer immunkompetenter Zellen (z.B.:

Makrophagen, neutrophile Granulozyten, Thrombozyten und Koagulationsfaktoren)


herbeizuführen. Dieser Prozeß endet erst mit dem Abklingen der Infektion oder der

Wiederherstellung der Homöostase (BONE 1996a; FUKUSHIMA 1994). Gelingt diese

Wiederherstellung jedoch nicht, kommt es während einer dritten Phase zu einer destruktiv

wirkenden systemischen Immunantwort und zur klinischen Manifestation des SIRS (BONE

1996b; REGEL 1991).

Aufgrund einer fortschreitenden endothelialen Dysfunktion kommt es zu einer erhöhten

mikrovaskulären Permeabilität mit Transsudation in die Organe (BARIE 1988; IBBOTSON

1989; KREUZFELDER 1988; LUCAS 1991; PAPE 1994; PETRAK 1989; SEEKAMP

1993b; STEPHENS 1988; VAN GRIENSVEN 1999b; WELBOURN 1991b). Des weiteren

bilden sich Mikrothrombi, welche die Mikrozirkulation negativ beeinflussen und so eine

lokale Ischämie hervorrufen können (GANDO 1996; SIGURDSSON 1992). Bei der

Wiederherstellung der Durchblutung kann es schließlich zu einem Reperfusionsschaden

aufgrund von Sauerstoffradikalen und Hitze-Schock-Proteinen kommen, welche im

Ischämiegebiet gebildet werden (CIPOLLE 1993; RINALDO 1990). Die Dysregulation der

vasodilatatorischen und vasokonstriktorischen Mechanismen ruft eine ausgeprägte Dilatation

der Gefäße hervor, so dass es zu einer zusätzlichen Verschlechterung der Blutzufuhr und einer

Steigerung der Transsudation kommt (GOMEZ-JIMENEZ 1995; MIYAUCHI 1990). Die

Folge kann eine Organdysfunktion oder bei Beteiligung mehrerer Organe eine

Multiorgandysfunktion sein. Hierbei sind außerdem klinisch die fünf klassischen Symptome

der Entzündung Rubor, Calor, Dolor, Tumor und Functio laesa festzustellen. Kann der Körper

die überschießende Inflammation nicht mit Hilfe von antiinflammatorischen Mediatoren unter

Kontrolle bringen, endet das MODS letal (REGEL 1991).

Kommt es in diesem Rahmen zu einer antiinflammatorischen Reaktion, die das

physiologische Maß überschreitet, tritt eine „Immunparalyse“ ein (KREMER 1996; MILLS

1989; RANDOW 1995; SYRBE 1994). In diesem Falle spricht man von einem Compensatory

Antiinflammatory Response Syndrom (CARS) (BONE 1996a; BONE 1996c; BONE 1996d;

DAVIES 1997). Während dieser Phase besteht eine besonders große Gefahr für eine Infektion

des Organismus mit Mikroorganismen, woraus leicht eine Sepsis und in dieser Folge ein

septischer Schock entstehen können (MOORE 1999; VOLK 1990)


Es besteht außerdem die Möglichkeit, dass die Inflammation neben der einsetzenden

Aniinflammationsreaktion erhalten bleibt und somit ein Mixed Antagonist Response Syndrom

(MARS) hervorruft (BONE 1996b; BONE 1996d; DAVIES 1997). Auch diese beiden

klinischen Zustände können unter anderem zum MODS führen. Patienten, bei denen ein SIRS

oder MODS festgestellt wurde, erliegen demnach nicht zwangsläufig unkontrollierten

Infektionen, sondern unter Umständen der dysregulierten Entzündungsantwort (VAN

GRIENSVEN 1999a).

All diese möglichen Reaktionen (SIRS, CARS, MARS, MODS) werden unter dem Begriff

CHAOS (cardiovascular shock, homeostasis, apoptosis, organ dysfunction und immune

suppression) zusammengefaßt (BONE 1996b; DAVIES 1997).

Es wurde beobachtet, dass nicht alle Patienten bei gleicher Verletzungsschwere ein MODS

entwickeln. Daraus kann geschlossen werden, dass neben dem initialen Trauma verschiedene

andere Faktoren für die Entstehung dieses Syndroms verantwortlich sind (BERNARD 1990;

REGEL 1989). So besteht ein Zusammenhang zwischen sekundären pulmonalen

Veränderungen und Frakturen, weil hierbei aufgrund von Gefäßverletzungen Ischämien

hervorgerufen werden können. Besonders oft kann diese Beobachtung bei offenen Frakturen

gemacht werden, die in der Regel mit einer partiellen oder kompletten Ischämie einhergehen

(SUDKAMP 1989) und somit ein erhöhtes Risiko für posttraumatische Komplikationen

darstellen (AUFMKOLK 1996). Erst bei einer Reperfusion führt die entstandene Ischämie

anhand von Mediatoren, Proteasen, Sauerstoffradikalen und aktivierten Granulozyten zu

sekundären, distalen Organschäden (WELBOURN 1991b), deren pathologisches Muster in

allen Organen einheitlich ist (BERNARD 1994; BURCHARDI 1987).

Eine Ischämie mit anschließender Reperfusion führt zu einer sekundären Organschädigung,

unabhängig davon, in welche Gebiet die Ischämie vorlag. So konnten pulmonale Schäden

nach Ischämie/Reperfusion der Extremitäten (BELKIN 1989; GOLDMAN 1992; SEEKAMP

1993c; SEEKAMP 1993a; SEEKAMP 1994; SEIBERT 1993; WELBOURN 1991a), der

Leber (DUBAYBO 1988) und nach genereller Ischämie im Zusammenhang mit einem

hypovolämischen Schock festgestellt werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Schäden

erst dann auftreten, wenn das Gebiet reperfundiert wird (SEEKAMP 1993b). Verantwortlich


sind hierfür neutrophile Granulozyten und reaktive Sauerstoffradikale (FLAHERTY 1991;

GOLDMAN 1992; GRECH 1994; KAZUI 1994; SEEKAMP 1993b; SEIBERT 1993;

WELBOURN 1991a; WELBOURN 1991b; WELBOURN 1990; YOKOTA 1989;

ZIMMERMAN 1990), die zum Teil von den neutrophilen Granulozyten gebildet werden und

teilweise Produkte von chemischen Reaktionen im reperfundierten Gebiet sind (KORTHUIS

1989; PARKS 1986). Die freien Radikale sind in der Lage durch Interaktionen mit

Desoxyribonucleinsäure DNA-Strangbrüche hervorzurufen, welche die Zelle irreparabel

schädigen können (BIELSKI 1979; BURGER 1980). Bei Reaktionen zwischen Radikalen und

ungesättigten Fettsäuren durch Lipidperoxidation kommt es zu Zellmembranschäden, die den

Untergang der Zelle verursachen können (AUST 1982; YOUNES 1987).

PAPE et al. konnten (1994) anhand von obduzierten Patienten, die aufgrund schwerer

Verletzungen verstorben waren, das typische Muster eines posttraumatischen

Multiorganversagens zeigen. Patienten, die innerhalb der ersten 24 Stunden nach dem Trauma

verstarben, erlagen grundsätzlich ihren Hirnverletzungen oder unstillbaren Blutungen. Starben

die Patienten nach zwei bis sieben Tagen, war die Beeinträchtigung der Lungenfunktion die

häufigste Ursache; ab dem siebten Tag post Trauma erlagen die meisten Patienten einem

MOV. Diese Beobachtungen konnten von REGEL et al. (1996) bestätigt werden. Sie

beschreiben, dass Patienten, die ein Multiorganversagen entwickeln, zu knapp 75% eine

starke Beeinträchtigung der Lungenfunktion zeigen. Etwa 65% dieser Patienten erlagen dieser

Dysfunktion. Die Lunge ist grundsätzlich das erste Organ, welches nach einer schweren

traumatischen Einwirkung auf den Organismus beeinträchtigt wird. Im Mittel tritt diese

Veränderung nach 3,7 ± 2,8 Tagen auf. Nur bei weniger als 5% der Patienten wurde eine

Beeinträchtigung der Nierenfunktion festgestellt.

2.2 Rolle der neutrophilen Granulozyten bei der Pathogenese des SIRS und

MODS

Neutrophile Granulozyten sind Zellen der myeloiden Reihe, welche sich im Knochenmark

innerhalb von etwa 14 Tagen aus Myeloblasten bis zu den reifen PMN mit einem lobulierten


Zellkern differenzieren. Diese reifen Zellen verlassen das Knochenmark und treten

vorübergehend in die Blutbahn ein. Ihre Halbwertszeit beträgt hier etwa sechs Stunden.

Besteht jedoch der Bedarf einer unspezifischen Immunreaktion im Gewebe, so treten diese

Zellen mittels Diapedese ins Gewebe ein, wo ihre Funktionsfähigkeit nach etwa ein bis zwei

Tagen erlischt (BAINTON 1971). Bereits 1887 erkannte EHRLICH die sezernierende

Eigenschaft der neutrophilen Granulozyten, ca. 10 Jahre später, um 1900, wurde entdeckt,

dass diese Zellen außerdem zur Phagozytose befähigt sind. Ermöglicht werden ihnen diese

Eigenschaften durch den Gehalt von zwei verschiedenen Arten von Granula. Es handelt sich

hierbei einerseits um peroxidase-positive Granula, welche unter anderem Myeloperoxidase,

Elastase, Lysozym und β-Glycerophosphatase enthalten. Die peroxidase-negative Granula

hingegen beinhalten Lactoferrin, Prokollagenase, alkalische Phosphatase und Lysozym

(ACKERMAN 1971; BAINTON 1966; BAINTON 1971; SCOTT 1970). Die Möglichkeit der

Sekretion und der Phagozytose macht die neutrophilen Granulozyten zu einer der wichtigsten

Zellen des unspezifischen Immunsystems (GRISWOLD 1988). Sie werden durch Chemotaxis

auf die mikrobiellen Organismen hingewiesen. Die nun folgende Adhäsion an und Migration

der Zellen durch das Gefäßendothel kann in verschiedene Phasen unterteilt werden. Man

bezeichnet sie als Rolling, Attachment und Diapedese, welche jeweils von unterschiedlichen

Adhäsionsmolekülen abhängig sind (siehe Sektion 2.3). Über einen chemotaktischen

Gradienten verläuft die Migration an den Ort, wo die mikrobiellen Organismen mit Hilfe der

bereits oben erwähnten Granula phagozytiert und lysiert werden. Besonders in der frühen

Phase (bis zum 3. Tag) nach einem Trauma spielen die neutrophilen Granulozyten eine große

Rolle, im weiteren Verlauf (ab Tag 4) treten andere Zellen, wie Lymphozyten und Monozyten

in den Vordergrund (BOTHA 1995b; BOTHA 1995a).

Auch bei der Entstehung eines Gewebeschadens nach Ischämie-Reperfusion sind es gerade

die Produkte dieser Granula, die eine schädigende Funktion einnehmen, so dass den

neutrophilen Granulozyten hierbei eine Schlüsselposition zugesprochen werden kann

(FUJISHIMA 1995; KORTHUIS 1988; VEDDER 1989).

Welche entscheidende Rolle die neutrophilen Granulozyten bei der Entstehung des

Gewebeschadens nach Ischämie/Reperfusion spielen, zeigt außerdem die Tatsache, dass in

unterschiedlichen Tiermodellen eine Neutropenie dem Ischämie-Reperfusionsschaden

signifikant vorbeugte (CARDEN 1990; HERNANDEZ 1987). Neben den neutrophilen


Granulozyten wird bestimmten Mediatoren bei der Entstehung des Ischämie-

Reperfusionsschadens eine große Bedeutung zugeschrieben. So konnten KLAUSNER et al.

(1989) bei einem derartigen Gewebeschaden erhöhte Thromboxanwerte feststellen. Die

Bedeutung dieses Mediators scheint jedoch gering zu sein, da die Inhibition der Bildung

dieser Moleküle durch Indomethacin keine Verringerung der Neutrophilenakkumulation im

pulmonalen Gewebe nachgewiesen werden konnte (PUNCH 1991). Auch bei Pferden, die

aufgrund eines Ileus einen Schock entwickelten, wurden unter anderem erhöhte

Thromboxanwerte im Plasma festgestellt werden. Sie ließen sich durch den Einsatz des

Medikamentes Flunixin-Meglumin signifikant absenken (GERDEMANN 1995). Ein weiterer

Mediator, dessen Plasmakonzentration bei einem Ischämie-Reperfusionsschaden erhöht ist, ist

das Leukotrien B4 (KLAUSNER 1988) Einerseits bewirkt dieses eine chemotaktische

Ausrichtung der neutrophilen Granulozyten (PALMBLAD 1981), andererseits aber auch die

direkte Freisetzung von Wasserstoffperoxidradikalen aus diesen Zellen, was ihre zentrale

Rolle bei der Pathogenese des Gewebeschadens unterstreicht.

Der initiale Schritt dieses Pathomechanismus stellt also die Chemotaxis dar. Dabei handelt es

sich um einen chemischer Reiz, welcher die Wanderungsrichtung phagozytierender Zellen in

Abhängigkeit vom Konzentrationsgradienten der reizauslösenden Substanz bestimmt. Diese

Substanz muß nicht unbedingt ein mikrobieller Organismus oder körperfremdes Antigen sein

(BAUER 1994; BILLING 1993; WARD 1991), auch IL-1, IL-6, TNF-α, Endotoxine,

Sauerstoffradikale, Komplementfaktoren C3a und C5a, Leukotriene (z.B. LTB4), Fragment D

der Fibrinolyse und Plättchenaktivierender Faktor stellen sehr potente Chemotaxine dar

(DEMLING 1985; KINDT 1991; WARREN 1989; WEIGELT 1988). Ein großer Teil dieser

Substanzen wird nach der Ischämie während der Reperfusionsphase direkt im Gewebe von

Endothelzellen und Gewebsmakrophagen gebildet.

Auch Immunkomplexe, Gerinnungsfaktoren, das Kallikrein-Kininsystem, Granulozyt-

Monozyt-Kolonieformender Faktor, Prostaglandine und Fragmente des geschädigten

Gewebes (wie zum Beispiel Kollagenfragmente) können die neutrophilen Granulozyten

aktivieren (CERASOLI, Jr. 1990; JONAS 1991; MALIK 1985; NEUHOF 1991; WARREN

1989; WARREN 1991; WEIGELT 1988). Bei dieser Aktivierung kommt es zu einer

vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen (siehe 2.3), wodurch die neutrophilen


Granulozyten am kapillären Endothel adhärieren. Durch die Freisetzung der bereits oben

erwähnten Sauerstoffradikale und lysosomalen Produkte wird das sogenannte Zell-spreading

ausgelöst. Dabei nehmen die vorher runden Endothelzellen eine sternförmige Gestalt an, so

dass ihre Verformbarkeit deutlich vermindert wird(BAUER 1994; HOOVER 1987). Die

Folge ist eine erhöhte endotheliale Permeabilität, weshalb schädigende Mediatoren

einschließlich Zellen die Endothelbarriere einfacher passieren können. Auch

inflammatorische Mediatoren können eine Erhöhung der Endothelpermeabilität herbeiführen

(MARUO 1992; VAN GRIENSVEN 1999a).

2.3 Rolle der Adhäsionsmoleküle bei der Pathogenese des SIRS und MODS

Der entscheidende Schritt zur Migration der neutrophilen Granulozyten an den Ort der

Inflammation ist die Adhäsion dieser Zellen an das kapilläre Endothel (FURIE 1987; FURIE

1989; HARLAN 1987). Diese Adhäsion wird über bestimmte Adhäsionsmoleküle vermittelt,

welche in drei Gruppen unterteilt werden können: die Selektine, die Integrine und die

Immunglobulin-ähnlichen. Sie werden sowohl von den neutrophilen Granulozyten als auch

von den Endothelzellen auf der Zelloberfläche exprimiert (KUROSE 1994), wodurch es zu

einer hochaffinen spezifischen Ligand-Rezeptor-Bindung kommen kann, so dass eine

selektive Akkumulation der neutrophilen Granulozyten in dem inflammatorischen oder

reperfundierten Gewebe erfolgt.

Der Migrationsprozeß kann in die verschiedenen Stadien Rolling, Attachment (Aggregation)

und Diapedesis (Transmigration) unterteilt werden, welche jeweils von unterschiedlichen

Adhäsionsmolekülen abhängig sind. Besonders das von den neutrophilen Granulozyten

exprimierte L-Selektin spielt bei der initialen Adhäsion zwischen dem Gefäßendothel und den

PMN (Polymorphkernige Granulozyten) eine bedeutende Rolle(RICHTER 1994; SIMON

1995; SPERTINI 1991; WADDELL 1994; WADDELL 1995), somit kann insbesondere die

Gruppe der Selektine für das sogenannte Tethering und Rolling verantwortlich gemacht

werden (BARGATZE 1994; LEY 1991). Zunächst kommt es zu einer rein physikalischen

Adhäsion, da bei erniedrigter Flußgeschwindigkeit Scherkräfte zwischen dem Endothel und


den neutrophilen Granulozyten auftreten. Später wird diese Anheftung mit Hilfe des

neutrophilen L-Selektins und des endothelialen P- und E-Selektins in eine transiente

Adhäsion umgewandelt (ANDERSON 1987; BUTCHER 1991; SPRINGER 1990).

Der nächste Schritt des Migrationsprozesses ist das sogenannte Attachment oder Abstoppen

der neutrophilen Granulozyten auf den Endothelzellen, welches durch die Gruppe der

Integrine ausgelöst wird, die einen stabilen Zell-Zellkontakt herstellen. Integrinmoleküle

bestehen aus mehreren Untereinheiten, von denen die β2 Untereinheit für die Adhäsion der

neutrophilen Granulozyten besonders wichtig ist. Das bekannteste Adhäsionsmolekül der

Immunglobulin-ähnlichen ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1), welches

überwiegend von Endothelzellen exprimiert wird. SMITH et al. (1988, 1989) konnten das

ICAM-1 als endothelialen Liganden für die β2-Integrine identifizieren. Bei Patienten, die an

den Folgen einer Sepsis verstarben, wurde sowohl eine erhöhte Expression von ICAM am

Gefäßendothel der Lunge festgestellt, als auch eine vermehrte Expression von β2-Integrin auf

den neutrophilen Granulozyten. Traumapatienten hingegen, die eine Sepsis überlebten,

zeigten basale ICAM-Expressionswerte am Lungengefäßendothel (TSOKOS 2001).

2.4 Rolle der Zytokine bei der Pathogenese des SIRS und MODS

Nach bisherigen Untersuchungen steht die Expression der Adhäsionsmoleküle und die

Aktivität der neutrophilen Granulozyten in einem engen Zusammenhang mit der Freisetzung

von Zytokinen (GAMBLE 1985; KUIJPERS 1992; NATHAN 1989; POHLMAN 1986).

Bei einer physiologischen Reaktion des Körpers auf ein infektiöses oder traumatisches

Ereignis erfolgt zunächst die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNF-α (siehe

2.4.1), IL-1 und IL-6 (siehe 2.4.2). Im weiteren Verlauf der Abwehrreaktion kommt es

aufgrund negativer Rückkopplungsmechanismen zu einer vermehrten Freisetzung

antiinflammatorischer Zytokine (DINARELLO 1996). Besonders wichtig sind hierbei das IL-

10 (siehe 2.4.3), IL-4 und das IL-13. Neben den erwähnten Zytokinen gibt es eine Vielzahl

anderer Mediatoren, welche ein hochdifferenziertes pro- oder antiinflammatorisches

Wirkungsprofil haben.


Durch das beschriebene Zusammenspiel der pro- und antiinflammatorischen Zytokine ist es

dem Organismus möglich, eine zeitlich und qualitativ begrenzte Entzündungsreaktion

hervorzurufen. So ist bei einer limitierten Immunreaktion nach wenigen Tagen am

Plasmazytokinspiegel der Übergang von der inflammatorischen Primärphase zur

kompensatorischen hypoinflammatorischen Sekundärphase zu erkennen. Gerät dieser

Regelmechanismus aus dem Gleichgewicht, kann es zur Manifestation folgeschwerer

Syndrome kommen. Bei einer überschießenden systemischen proinflammatorischen

Immunreaktion spricht man vom SIRS, welches schließlich in einem MODS enden kann

(siehe 2.1). Überwiegen hingegen die Rückkopplungsmechanismen mit Freisetzung von

antiinflammatorischen Zytokinen, kann eine Hyporeaktivität des Immunsystems resultieren,

welche man als „Immunparalyse“ (CARS, siehe 2.1) bezeichnet. Liegt hingegen eine

persistierende proinflammatorische Aktivität trotz aktiver antiinflammatorischer

Immunantwort vor, bezeichnet man diesen Zustand als MARS (siehe 2.1) (BONE 1996a;

BONE 1996b; BONE 1996c; DAVIES 1997; KREMER 1996; MILLS 1989; RANDOW

1995; SEEKAMP 1998; SYRBE 1994).

2.4.1 Tumor Nekrose Faktor α (TNF-α)

Derzeit werden der TNF-α und TNF-β voneinander unterschieden. Beide Formen haben

nahezu identische Eigenschaften, jedoch konnten REMICK et al. (1987) zeigen, dass der

TNF-α bei der inflammatorischen Reaktion die bedeutendere Rolle spielt. So wird der TNF-α

von Monozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten sezerniert (siehe Abbildung 2), der

TNF-β hingegen nur von den Lymphozyten (BELLOMO 1992; CERASOLI, Jr. 1990;

MULLIGAN 1993; WARD 1991; WARREN 1989). Geringe Mengen von TNF-α sind für

eine adäquate Immunantwort von Nutzen. So verschlechterte die Gabe von Anti-TNF-

Antikörpern vor Induktion einer experimentellen Peritonitis in Mäusen die Überlebensraten

(ECHTENACHER 1990), wohingegen eine vorangehende Injektion geringer TNF-α- oder

Endotoxindosen wahrscheinlich durch Toleranzinduktion die Überlebensraten verbesserte

(ECHTENACHER 1995). TNF-α löst in den Endothelzellen verschiedene Mechanismen aus,


die bei der Entstehung des MODS eine bedeutende Rolle spielen (siehe Abbildung 2). Es

induziert zum Beispiel die Freisetzung von IL-1, IL-6 und IL-8 aus den Endothelzellen

(LOPPNOW 1989; NAWROTH 1986a), zusätzlich wird die Endothelpermeabilität im

Zusammenspiel mit IL-1 gesteigert (BRETT 1989; MARCUS 1996; ROYALL 1989; VAN

GRIENSVEN 1999b). Ferner konnte gezeigt werden, dass TNF-α die Expression zellulärer

Adhäsionsmoleküle der Endothelzellen wie ICAM-1, ELAM-1 (Endothelial Leukocyte

Adhesion Molecule) und E-Selektin anregt (MULLIGAN 1993; WONG 1992), so dass die

Gewebeschäden, besonders von den neutrophilen Granulozyten verursacht, verstärkt werden

(CHEN 1998; VARANI 1994). Zusätzlich muß die gesteigerte prokoagulierende Aktivität des

Gefäßendothels erwähnt werden (NAWROTH 1986b; SAWDEY 1991).

Eine kausale Rolle des TNF-α konnte auch bei der Entstehung eines septischen Schocks

nachgewiesen werden(BEUTLER 1985a; BEUTLER 1985b), da in humanem Serum in

diesen Fällen erhöhte TNF-α-Werte festgestellt werden konnten. Mit Hilfe dieser Werte kann

eine prognostische Aussage über die Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten gemacht

werden (CALANDRA 1991; DAMAS 1989; DEBETS 1989). So korrelieren hohe TNF-α

Werte mit einer schlechten Prognose(CALANDRA 1991; CASEY 1993). Bei Tieren konnte

ebenfalls durch Verabreichung von TNF-α ein dem septischen Schock ähnliches

Krankheitsbild hervorgerufen werden, was ein weiterer Beweis für die kausale Rolle dieses

Zytokins bei einem Schockgeschehen ist (JOHNSON 1989; REDL 1990; TRACEY

1986).Auch im Hinblick auf das SIRS und MODS wurde die Rolle des TNF-α untersucht

(BROUCKAERT 1996), wobei gezeigt werden konnte, dass für Patienten, die nach Trauma

ständig erhöhte TNF-α Plasmaspiegel aufwiesen, eine schlechte Prognose besteht (CASEY

1993; THIJS 1995). Bei an ARDS verstorbenen Patienten konnten sowohl in der

bronchoalveolären Lavage als auch im Plasma stark erhöhte TNF-α-Plasmakonzentrationen

festgestellt werden (MEDURI 1995b; MEDURI 1995a). Eine verläßliche prognostische

Aussage über den Ausgang der Situation konnte in diesem Falle jedoch nicht gemacht werden

(MEDURI 1995a).

Die Sekretion von TNF-α kann ebenfalls durch Ischämie hervorgerufen werden. So erzeugten

eine Ischämie der Leber (COLLETTI 1990; WANNER 1996), des Darmes (DEITCH 1994)


oder der hinteren Extremitäten (MA 1993; WELBOURN 1991c) eine erhöhte TNF-α

Plasmakonzentration.

Interessanterweise sezernieren Monozyten von Traumapatienten, die einen erhöhten TNF-α

Serumwert haben, nach Stimulation mit Endotoxin weniger TNF-α als üblich. Diese Tatsache

geht mit einer verminderten mRNA-Expression des TNF-α einher (ERTEL 1995). Es besteht

somit die Gefahr der Entwicklung eines CARS.

Zytokine, Adhäsionsmoleküle, Koagulationsfaktoren, TNF, NO-Synthese IL-1, IL-6 Antikörper Endothelzellen LPS Monozyten B-Lymophozyten Monozyten / Makrophagen TNF-α T-Lymphozyten IL-2, IFN-γ Fibroblasten

Gehirn Fieber Fettzellen Proliferation Kachexie Abbildung 2: Biologische Wirkungen des TNF-α (VAN GRIENSVEN 2000)

IL= Interleukin; IFN= Interferon; TNF= Tumor Nekrose Faktor; LPS= Lipopolysaccharid; NO=

Stickstoffmonoxid


2.4.2 Interleukin-6

Dem Zytokin IL-6 kann eine bedeutende Stellung sowohl bei der Immunabwehr als auch bei

der Hämatopoese zugeschrieben werden (AKIRA 1993; HIRANO 1994; KISHIMOTO 1992;

VAN SNICK 1990). Das Molekül ist ein Polypeptid mit einer Länge von 212 Aminosäuren.

HIRANO et al. (1986) gelang es, die genetische Sequenz, die das Protein kodiert, zu

entschlüsseln. Die bioaktive Form des IL-6, welche aus 184 Aminosäuren besteht, entsteht

erst nach Abspaltung einer 28 Aminosäuren langen hydrophoben Signalsequenz. Das

Molekulargewicht des IL-6 kann zwischen 21,5 und 28 kD liegen, da an den

Aminosäurepositionen 73 und 172 unterschiedliche Glykosylierungen und

Phosphorylierungen möglich sind.

IL-6 wird von einer Vielzahl von Zellen wie T- und B-Lymphozyten,

Monozyten/Makrophagen, Fibroblasten, Hepatozyten, Astrozyten, Endothelzellen,

Mesangiumzellen, Osteoblasten, Sertolizellen sowie in Karzinomen, Sarkomen, Myelomen

und Melanomen exprimiert. Durch Mitogene, Antigene, Lipopolysaccharide, Zytokine (IL-1

und TNF) und Viren wird die Bildung von IL-6 angeregt (AARDEN 1985; NAVARRO 1989;

WAAGE 1990). Auch durch Ischämie, Hämorrhagie und das Ischämie-Reperfusionsmodell

der hinteren Extremitäten kann eine gesteigerte IL-6 Produktion induziert werden (O'NEILL

1994; WANG 1997; YASSIN 1996). Eine Inhibition der IL-6 Produktion wird hingegen von

den Zytokinen IL-4, IL-10 und IL-13 hervorgerufen. Bei einer Vielzahl von pathologischen

Prozessen kann im Serum ein erhöhter IL-6 Spiegel festgestellt werden. Dazu gehören

Traumen, Sepsis, baterielle und virale Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Malignome

(AKIRA 1993; HIRANO 1994; KISHIMOTO 1992; VAN SNICK 1990). Anhand

unmittelbar nach einem traumatischen Ereignis gemessener IL-6-Werte kann eine Aussage

über die Schwere eines Traumas gemacht werden, welche zum Beispiel mit dem Injury

Severity Score (ISS) beschrieben werden kann. Mit Hilfe dieses Scores werden die Patienten

in verschieden Risikogruppen unterteilt, um so eine optimale Versorgung der Gruppe

entsprechend gewährleisten zu können (GEBHARD 2000; PAPE 1999). Das IL-6 wird

deswegen heute an vielen intensivmedizinischen Kliniken als Routineparameter bestimmt

(CALANDRA 1991; HACK 1989; HELFGOTT 1989; WAAGE 1989; ZABEL 1989).

Hierdurch kann eine Aussage über das voraussichtliche Outcome bei septischem Schock oder


SIRS gemacht werden. Ein kontinuierlich hoher Plasmaspiegel des IL-6 ab dem Tag der

Aufnahme in der Klinik weist auf eine schlechte Prognose hin (HACK 1989; PAPE 1999;

THIJS 1995; WAAGE 1989). Für die Bewertung der Überlebenswahrscheinlichkeit der

Patienten mit Hilfe der IL-6 Konzentration in Abhängigkeit vom Untersuchungszeitpunkt

nach dem Trauma, wurden spezielle Score-Systeme entwickelt (LEMESHOW 1993).

TERREGINO et al. (1997) zeigten, dass Patienten, die ein SIRS überlebten, ein niedrigeres

IL-6 Niveau aufweisen. Außerdem konnte beobachtet werden, dass Kinder mit einer Sepsis

und einem hohen IL-6 Plasmaspiegel häufiger ein MODS entwickeln als Kinder ohne

Steigerung des IL-6 Wertes (DOUGHTY 1996). Auch das Auftreten von ARDS in

Traumapatienten korreliert mit erhöhten IL-6 Plasmawerten(CLERICI 1993; MEDURI

1995b; MEDURI 1995a).

In vitro konnte die Endothelpermeabilität mit Hilfe von IL-6 dosis- und zeitabhängig

gesteigert werden, nach Zugabe eines spezifischen Antikörpers konnte diese Reaktion jedoch

wieder rückgängig gemacht werden (MARCUS 1996; MARUO 1992; VAN GRIENSVEN

1999b).

2.4.3 Interleukin-10

Besonders für die Regulation inflammatorischer Prozesse ist das antiinflammatorisch

wirkende Interleukin 10 ein sehr wichtiger Immunmediator. IL-10 wird von einer Vielzahl

unterschiedlicher Zellen exprimiert, wie zum Beispiel aktivierten Th2-Zellen,

Monozyten/Makrophagen, B-Lymphozyten, Keratinozyten, fetalen Thymozyten und

Gliazellen (MOORE 1993; MOSMANN 1994). Besonders TNF-α regt die Sekretion von IL-

10 an (VAN DER 1994). Das IL-10 ist ein Polypeptid mit einer Länge von 178 Aminosäuren.

Die genetische Sequenz des Proteins konnte entschlüsselt werden. Dabei wurde eine

Homologie der Aminosäuzesequenzen zwischen humanem und murinem IL-10 von 73%

festgestellt. Die bioaktive Form des Proteins, welche aus 160 Aminosäuren besteht, bildet

sich erst nach Abspaltung einer hydrophoben Precursorsignalsequenz. Besonders nach


Traumen beziehungsweise operativen Eingriffen können erhöhte IL-10 Werte im Plasma

festgestellt werden.

Das Zytokin ist befähigt, die Produktion bestimmter anderer Mediatoren zu inhibieren. Hierzu

zählen IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender

Faktor (GM-CSF) und IFN-γ, welche von aktivierten Th1-Zellen, NK-Zellen und

Monozyten/Makrophagen gebildet werden.

Durch IL-10 wird besonders stark das IFN-γ gehemmt, wobei sich die Inhibition nicht direkt

auf die Zytokinsekretion durch Th1-Zellen auswirkt, sondern indirekt durch eine

Beeinträchtigung der Antigenpräsentation und Sekretion proinflammatorischer Zytokine

durch die Makrophagen (ENK 1993; FIORENTINO 1991) vermittelt wird. Neben der

Einschränkung dieser Makrophagenfunktion ist das IL-10 in der Lage die zytotoxische

Aktivität der Zellen herabzusetzen. Zusätzlich ist es dem Zytokin möglich, die Proliferation

und Differenzierung von Mastzellen und T- und B-Lymphozyten zu induzieren

(FIORENTINO 1991; MOORE 1993; MOSMANN 1994). Im Falle einer Überproduktion des

IL-10 kann es zur Entwicklung eines CARS kommen (BONE 1996b).

2.5 TNF-α-Rezeptoren

TNF-α bindet an zwei verschiedene membrangebundene Rezeptoren, welche als TNF-RI

(55 kD = p55) und TNF-RII (75 kD = p75) Rezeptor bezeichnet werden (siehe Abbildung 3).

Sie sind auf allen Zelltypen außer Erythrozyten zu finden. Beide Rezeptoren sind ebenfalls in

löslicher Form (sTNFR) im Plasma nachweisbar, wo sie bioaktives TNF-α binden und somit

antagonistisch wirken können (MOLDAWER 1994; PESCHON 1998). Drei Stunden nach

Trauma können erhöhte Werte für die lösliche Form beider Rezeptoren im Plasma festgestellt

werden, welche sich bei ungestörtem Verlauf nach 12 Stunden wieder normalisieren

(HENSLER 2002). Bei Patienten, die kritisch an einer Sepsis erkrankt waren und daran

verstarben, konnte ein erhöhter sTNF-RI-Spiegel festgestellt werden. Überlebende Patienten

hingegen zeigten verminderte Werte (ROGY 1994).


Die biologische Funktion der beiden Rezeptoren ist unterschiedlich und verläuft über zwei

verschiedene Signaltransduktionswege. Viele der Effekte, die durch Endotoxine ausgelöst

werden, werden über den TNF-RI vermittelt, welcher außerdem für die Entwicklung von

Lymphfollikeln in den peripheren Lymphknoten verantwortlich (MATSUMOTO 1996).

Fibroblasten werden über den TNF-RI zur Proliferation und zur Produktion von IL-6 und

GM-CSF angeregt (MACKAY 1994). Die Apoptose der zytotoxischen T-Zellen wird

ebenfalls über diesen Rezeptor vermittelt (SPEISER 1996), bei anderen Zellen scheinen für

die Apoptoseinduktion jedoch beide TNF-Rezeptoren verantwortlich zu sein

(VANDENABEELE 1995). Auch bei einer akuten Graft-versus-host Reaktion spielt der

TNF-RI eine wichtige Rolle (SPEISER 1996) (siehe Abbildung 3).

Der TNF-RII vermittelt die durch TNF- α induzierte T-Lymphozytenproliferation (GRELL

1998; TARTAGLIA 1993). Bei SIRS-Patienten konnte eine verminderte Expression dieses

TNF-Rezeptors festgestellt werden (HUBL 1999).

MODZELEWSKI (1997, 2003) stellte fest, dass bei Sepsispatienten eine erhöhte

Konzentration von TNF-α -einhergehend mit verminderten sTNF-RI-Werten- auf eine

schlechte Prognose hindeuten. Entscheidend sind hierbei jedoch nicht die absoluten

Blutwerte, sondern das Verhältnis von TNF-α zu seinen löslichen Rezeptoren. Es konnte

außerdem gezeigt werden, dass der sTNFRI einen prediktiven Wert für die Entwicklung eines

SIRS/MODS nach schwerwiegenden operativen Eingriffen wie beispielsweise einem

kardiopulmonalen Bypass hat. Vergleicht man post- und preoperative Werte miteinander, so

ist das Verhältnis bei SIRS/MODS-Patienten deutlich höher als bei Patienten mit einem

unkomplizierten Verlauf (EL BARBARY 2002).

Mit Hilfe von Knockout-Mäusen, denen entweder das Gen für den TNF-RI oder den TNF-RII

fehlt, konnten in dieser Hinsicht neue Erkenntnisse gewonnen werden. Bei TNFRp55-/-

Mäusen, welche defekte Peyer`sche Platten besitzen, wurde eine Resistenz gegenüber

niedrigen Endotoxindosen festgestellt. Die Verabreichung hoher Dosen hingegen war für die

Tiere letal (ROTHE 1993). Bei Infektionsversuchen dieser Knockout-Mäuse mit dem Erreger

Listeria monocytogenes wurde eine schlechte Abwehr der Mikroorganismen und ein Erliegen

der Tiere aufgrund der Infektion beobachtet (PFEFFER 1993). Die Suszeptibilität für Listeria

monocytogenes wird polygenetisch determiniert und ist stark stammesabhängig. Während

BALB/c-Tiere bei Infektionsversuchen erkranken, stellen sich C57BL/6-Mäuse als resistent


heraus. Versuche, bei denen der Erreger Streptococcus pneumoniae eingesetzt wurde,

erbrachten ähnliche Ergebnisse (O`BRIAN et al. 1999). ACTON et al. (1996) stellten zwar

eine Resistenz der TNFRp55-/- Mäuse gegenüber E. coli-Endotoxinen fest, eine Peritonitis

konnte jedoch mit Hilfe dieser Erreger ausgelöst werden. Außerdem wurde bei diesen Tieren

nach Verabreichung von TNF-α eine verminderte Expression von VCAM-1 und E-Selektin

auf Endothelzellen beobachtet, was eine verminderte Leukozyteninfiltration in Leber, Lunge

und Niere zur Folge hat (MACKAY 1993; NEUMANN 1996). VAN GRIENSVEN et al.

(2001) zeigten in einem Sepsismodell mit TNFRp55-/- Mäusen, dass eine Behandlung mit

dem Hormon Dehydroepiandrostenon (DHEA) die Mortalität signifikant senkte. Wobei sich

der protektive Effekt bei Mäusen, denen das Gen für den TNF-RI fehlt, deutlicher zeigte als

bei den Wildtypen. Aufgrund der Tatsache, dass in beiden Gruppen eine positive Wirkung des

Hormons zu bemerken war, wird davon ausgegangen, dass es sowohl einen zytokinabhängige

als auch eine zytokinunabhängige Wirkungsweise des DHEA geben muß (VAN

GRIENSVEN 2001). Der TNF-RI hat demnach ebenfalls eine wichtige Funktion im Rahmen

einer Sepsis, die aufgrund eines traumatischen Ereignisses entsteht.

Tieren, denen das Gen für den TNF-RII fehlt, zeigen eine weniger ausgeprägte

Gewebsnekrose nach subkutanen TNF-Injektionen als Vergleichstiere (ERICKSON et al.

1994).


Monozyten/Makrophagen TNF-α p55-Rezeptor p75-Rezeptor Entwicklung von Lymphfollikeln Apoptose Gewebsnekrosen und Peyer`schen Platten Fieber T-Zellproliferation Endotoxinschock Adhäsionsmolekülexpression auf Endothelzellen Fibroblastenproliferation Apoptose von peripheren Zytotoxischen T-Zellen

Lyse von Tumorzellen

Abbildung 3: Wirkungen des TNF-α in Bezug auf die verschiedenen Rezeptoren (VAN GRIENSVEN 2000)

TNF= Tumor Nekrose Faktor; p55= Tumor Nekrose Faktor-Rezeptor I; p75= Tumor Nekrose Faktor-Rezeptor II

2.6 Fcγ-Rezeptoren

Im humanen System sind drei Klassen von Fcγ-Rezeptoren (FcγR) bekannt: Fcγ-RI, Fcγ-RII

und der Fcγ-RIII. Sie bilden eine Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die genetisch,

strukturell und funktionell eng miteinander verwandt sind (RAVETCH 1991). Beim 4th

International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens 1989 in Wien wurden

diese Rezeptoren mit den Bezeichnungen CD64 für den Fcγ-RI, CD32 für den Fcγ-RII und


CD16 für den Fcγ-RIII belegt(KNAPP 1989). Die Rezeptoren besitzen die Eigenschaft, den

Fc-Teil des Immunglobulins G (IgG) zu binden und stellt somit ein wesentliches

Verbindungsglied zwischen der humoralen Antigenerkennung durch Immunglobuline und der

Aktivierung von Effektorzellen dar. Auf diese Weise wird eine Vielzahl immunologischer

Funktionen wie die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität, Phagozytose, Degranulation

und Immunkomplex-Clearance vermittelt. Die Rezeptoren besitzen ebenfalls eine

immunregulatorische Funktion indem sie die Lymphozytenproliferation beeinflussen und die

Antikörperproduktion steuern (VAN DE WINKEL 1991a; WITTE 1992).

Alle Gene des Fcγ-R sind auf dem Chromosom 1 lokalisiert. Bisher sind zwei

unterschiedliche Gene für den Fcγ-RI und drei verschiedene Gene mit insgesamt sechs

Transkripten für den Fcγ-RII bekannt (BROOKS 1989; VAN DE WINKEL 1991b). Die

beiden Gene des Fcγ-RIII werden zellspezifisch exprimiert (RAVETCH 1989). Auf

natürlichen Killerzellen liegt das Gen Fcγ-RIIIA transkribiert als transmembranöse Form des

Fcγ-RIII (Fcγ-RIIIa) vor. Auf der Membran der neutrophilen Granulozyten hingegen findet

man den Fcγ-RIIIB. Es enthält die Informationen für eine glykosylphosphatidylinositol-

verankerte Form des Fcγ-RIII, den Fcγ-RIIIb. Strukturell handelt es sich bei den Fcγ-R mit

Ausnahme des Fcγ-RIIIb auf neutrophilen Granulozyten um integrale Membranproteine. Sie

besitzen einen extrazellulären Anteil mit IgG-ähnlichen Domänen, die die Fcγ-R der Ig-

Superfamilie zuordnen, einen transmembranen und einen intrazellulären Anteil. Alle Fcγ-R

sind mehrfach glykosyliert.

Die Rezeptoren binden das IgG mit unterschiedlicher Affinität. Nur der Fcγ-RI ist in der Lage

monomeres IgG mit hoher Affinität zu binden(ANDERSON 1980). Fcγ-RII und Fcγ-RIII

hingegen interagieren aufgrund ihrer niedrigen Affinität zu monomeren IgG vorwiegend mit

IgG-Immunkomplexen. Sie werden deshalb als niedrig-affine Fcγ-R bezeichnet (HUIZINGA

1989; VAN DE WINKEL 1989). Fcγ-R sind besonders im peripheren Blut auf einer Vielzahl

von Zellen lokalisiert. Fcγ-RI auf Monozyten und aktivierten neutrophilen Granulozyten nach

IFN-γ-Produktion bei Streptokokkeninfektionen (GUYRE 1990) oder bei Patienten mit

schwerer kongenitaler Neutropenie, welche mit rekombinantem humanen Granulozyten

Kolonie-stimulierendem Faktor behandelt wurden (ELSNER 1992). Fcγ-RII sind vorwiegend

auf Monozyten, B-Zellen, Thrombozyten und Granulozyten zu finden. Die Fcγ-RIII befinden

sich hauptsächlich auf natürlichen Killerzellen, neutrophilen Granulozyten und


Teilpopulationen von Monozyten und T-Zellen (UCIECHOWSKI 1992; VAN DE WINKEL

1991a).

2.6.1 Fcγ-Rezeptorfunktionen auf neutrophilen Granulozyten

Auf den neutrophilen Granulozyten befinden sich demnach die niedrig-affinen Fcγ-R: Fcγ-RII

und Fcγ-RIIIb. Zwar binden sie beide IgG-Immunkomplexe, unterscheiden sich jedoch in

ihrer Membranverankerung. Während der Fcγ-RII ein Transmenbranprotein ist (BROOKS

1989), ist der Fcγ-RIII auf den Granulozyten über eine Glykosylphosphatidylinositolstruktur

mit der äußeren Zellmembran verbunden (RAVETCH 1989). Diese Form der

Membranverankerung erhöht die Lateralbeweglichkeit der Rezeptoren, da sie nicht über einen

intrazytoplasmatischen Anteil an interne Proteine des Zytoskelettes gebunden sind (BROOKS

1989). Die Expression der Rezeptoren auf der Zelloberfläche wird durch hydrolytische

Enzyme wie Phospholipase C, welche den Glykolipidanker spaltet, reguliert. Auf ruhenden

neutrophilen Granulozyten werden zwischen 10.000 und 40.000 Moleküle des Fcγ-RII und

zwischen 80.000 und 300.000 Moleküle des Fcγ-RIIIb exprimiert. Eine Stimulation der

neutrophilen Granulozyten mit dem Tripeptid FMLP (N-Formylmethionin Leucyl-

Phenylalanin) oder dem Phorbolester Phorbolmyristatazetat setzt Fcγ-RIII von der

Zelloberfläche frei (HUIZINGA 1988). Die lösliche Form des Fcγ-RIII kann auch im Plasma

von gesunden Spendern nachgewiesen werden (HUIZINGA 1990).

Beide Fcγ-R induzieren Degranulation und Phagozytose (HUIZINGA 1989; HUIZINGA

1990) der neutrophilen Granulozyten, wodurch ihre wichtige Rolle bei der Entstehung des

SIRS und MODS unterstrichen wird. Die wichtigsten bei der Degranulation freigesetzten

Produkte sind Wasserstoffperoxid, Superoxidanion und das Stickstoffoxid. Der Vorgang, bei

dem diese Substanzen produziert werden, heißt respiratory burst und wird hauptsächlich vom

Fcγ-RIII vermittelt. Findet der respiratory burst jedoch in gesteigerter Form im Gewebe statt,

so wird die Organfunktion dadurch nachhaltig gestört. Ein Beispiel hierfür ist die

Beeinträchtigung der Lungenfunktion nach einem Ischämie-Reperfusionsschaden.

Der Fcγ-RIIIb auf den neutrophilen Granulozyten zeigt einen Polymorphismus, welcher als

Neutrophilen-Antigensystem (NA) bezeichnet wird (ORY 1989). Es konnten funktionelle


Unterschiede zwischen NA1+ und NA2+ neutrophilen Granulozyten festgestellt werden. NA1

homozygote Zellen phagozytieren IgG-opsonierte Erythrozyten besser als NA2 homozygote

(SALMON 1990). Die über Fcγ-R induzierten zellulären Funktionen werden durch

intrazelluläre Botenstoffe vermittelt. Die Signaltransduktion der FMLP-Rezeptoren auf den

neutrophilen Granulozyten ist am genauesten untersucht worden. Auch diese Rezeptorart

bewirkt eine Degranulation und Sauerstoffradikalproduktion, womit sie ein ähnliches

funktionelles Spektrum aufweist wie die Fcγ-R. Der FMLP-Rezeptor wirkt über einen

intrazellulären Kalziumanstieg, welcher über folgende Kaskade vermittelt wird: Der Ligand-

Rezeptor-Komplex aktiviert G-Proteine, die Phospholipasen C stimulieren. Diese spalten

Phosphatidylinositolbiphosphat in Inositoltriphosphat und Diazylglyzerol (DAG).

Inositoltriphosphat setzt daraufhin Kalzium aus intrazellulären Speichern im

endoplasmatischen Retikulum frei (DILLON 1988). DAG und Kalzium initiieren dann über

die Proteinkinase C die Sauerstoffradikalproduktion (HEYWORTH 1990). Die bei diesem

Vorgang involvierten G-Proteine können durch Pertussistoxin in ihrer Funktion gehemmt

werden. Auch für den Fcγ-RII ist eine Pertussistoxin-Sensitivität in Bezug auf die

Sauerstoffradikalproduktion beschrieben worden, so dass auf eine Beteiligung der G-Proteine

an der Signaltransduktion der Fcγ-RII geschlossen werden kann (FEISTER 1988). Beim Fcγ-

RIII wurde ein intrazellulärer Kalziumanstieg nach Kreuzvernetzung des Rezeptors

nachgewiesen (KIMBERLY 1990). Es existieren somit Hinweise für Parallelen in der

Signaltransduktion von FMLP und Fcγ-Rezeptoren.

1.7 Möglichkeiten der Prävention und der Therapie des SIRS und MODS

Eine ausreichend wirksame Therapie des SIRS und MODS konnte bis heute leider nicht

entwickelt werden. Zur Verbesserung der Prognose und zur Verringerung der Mortalität beim

Auftreten dieser Syndrome gibt es jedoch unterschiedliche Präventions- und Therapieansätze.

Eine Möglichkeit besteht darin, bereits der Entwicklung des SIRS und MODS vorzubeugen,

indem Adhäsionsmoleküle selektiv inhibiert werden, um so das Rolling der neutrophilen


Granulozyten und die Akkumulation dieser Zellen im Gewebe zu verhindern. Den daraus

resultierenden Organschäden könnte damit eventuell vorgebeugt werden.

Im experimentellen Modell erschien eine Therapie mit monoklonalen Antikörpern gegen

Integrin-Adhäsionsmoleküle der neutrophilen Granulozyten (Anti-CD18, Anti-CD11b)

durchaus erfolgversprechend (ARFORS 1987; GASIC 1991; TALBOTT 1994; WINN 1993).

Eine selektive Inhibition des L-Selektins, welches für das Rolling der Granulozyten an den

Gefäßendothelzellen verantwortlich ist, konnte bereits mit Hilfe monoklonalen Antikörper

EL-246 (anti-Schaf-L-Selektin) (VAN GRIENSVEN 1999b), DREG-200 (humanisiertes anti-

human-L-Selektin) (MA 1993) und CY-1747 (synthetisches sialyl Lewisx Analog) (RUBIO-

AVILLA 1997) erreicht werden. Anhand dieser Methode konnten zwar gute Erfolge erzielt

werden, jedoch muß beachtet werden, dass es bei mehrfacher Applikation einer solchen

Substanz zu einer idiopathischen Anti-Antikörperreaktion kommen kann, wodurch die

Wirksamkeit der monoklonalen Antikörper verloren geht. Zusätzlich besteht bei der

Behandlung des Patientens über mehrere Tage die Gefahr einer allergischen Reaktion auf das

Fremdeiweiß.

Aufgrund dieser Nebenwirkungen ist es vorteilhaft, Substanzen einzusetzen, die zwar das L-

Selektin inhibieren, jedoch nur eine geringe allergene Wirkung besitzen und keine Anti-

Antikörperreaktion hervorrufen. Möglich ist hier der Einsatz niedermolekularer Substanzen

auf der Basis der Oligosaccharide, wie zum Beispiel das Fucoidin. SEEKAMP et al. (2001)

konnten zwar eine gewisse protektive Wirkung des Fucoidins auf die Adhärenz der

neutrophilen Granulozyten feststellen, da der Wirkstoff jedoch ein Antagonist für alle drei

Selektine (P, E und L) ist, besteht die Gefahr der unspezifischen Bindung mit durchaus sehr

unterschiedlichen Ergebnissen. Außerdem hat das Fucoidin Heparin-ähnliche Eigenschaften,

weshalb es nach der Applikation zu Blutungen kommen kann. Von einem Einsatz bei

klinischen Studien wird aus diesen Gründen abgeraten.

Spezifische Therapieversuche mit monoklonalen Antikörpen gegen IL-1, TNF-α oder den

Thrombozyten-aggregierenden Faktor erbrachten kein zufriedenstellendes Ergebnis, es war

sogar möglich, durch die Beeeinträchtigung der Immunantwort einen negativen Effekt

hervorzurufen (DINARELLO 1993).


Ein anderer Therapieansatz ist die topische und parenterale Applikation von Antibiotika.

Hiermit soll eine selektive digestive Dekontamination des oberen Verdauungstraktes von

gramnegativen und anderen potentiell pathogenen Erregern erreicht werden. Zwar konnte die

nosokomiale Infektion damit verringert werden, die Inzidenz des MODS und die Mortalität

blieben jedoch unverändert(CERRA 1992; GASTINNE 1992). Der Versuch einer Anti-

Endotoxin-Therapie mit Antiseren, hyperimmunem polyklonalem Immunglobulin,

monoklonalen IgM-Antikörpern, welche entweder gegen den Kern des Lipopolysaccharids

oder gegen die Lipid-A-Region des Endotoxinmoleküls gerichtet waren, blieben ohne

nennenswerten Erfolg (MANTHOUS 1993; ZANETTI 1993). Bei Pferden, die in Folge einer

Kolikerkrankung eine Endotoxämie entwickelten, wurde die Wirkung eines polyklonalen,

anti-endotoxin-spezifischen Immunglobulinpräparates (Stegantox 60®) untersucht. Es konnte

kein signifikanter Unterschied der Prostaglandin E2-Konzentration im Plasma der

Kontrollgruppe und der mit dem Präparat behandelten Gruppe festgestellt werden. Die

Thromboxan B2-Plasmakonzentrationen hingegen waren, auf den gesamten

Untersuchungszeitraum bezogen, geringer als der Wert der Kontrollgruppe (SPILLE 1997).

Auch die Therapie mit verschiedenen Antioxidantien wie Eisenchelatbildner, Katalase,

Superoxiddismutase, Allopurinol und N-Acetylcystein, welche die Entstehung freier Radikale

vermindern sollen, erbrachten keine deutlichen Erfolge (SCHILLER 1993). Positive

Ergebnisse wurden mit der Anwendung von Glucan als Immunmodulator und Antithrombin

III erzielt (BABINEAU 1994; YU 1993).

Über die kontinuierliche Hämofiltration als Therapiemöglichkeit bei SIRS und MODS-

Patienten herrschen sehr unterschiedliche Meinungen. HIRASAWA et al. (1996) und

KODAMA et al. (1995) sehen darin eine effektive Möglichkeit im Plasma enthaltene

Endotoxine und Immunmediatoren, besonders TNF-α, IL-1 und IL-6, zu verringern und den

Sauerstoffpartialdruck zu verbessern. SCHETZ et al. (1995) hingegen konnten keine

Verringerung der Immunmediatoren nach dieser Methode feststellen und befürchten sogar

eine zusätzliche Aktivierung von Leukozyten.

Da bis heute keine gezielte Therapie entwickelt werden konnte, bleibt die symptomatische

Prävention und Therapie des MODS in Form adäquater Notfalltherapie das Mittel der ersten

Wahl Dazu gehören die Sicherung des Gasaustausches, ausreichende Volumen- und


Erythrozytenkonzentratsubstitution und die Verabreichung vasopressiver Substanzen zur

Aufrechterhaltung der Gewebeperfusion. Die Morbidität und die Mortalität können auf diese

Art und Weise jedoch nicht verringert werden (VINCENT 1996).

Es ist wichtig, anhand von Zytokinen (IL-6) im Plasma den immunologischen Status der

Patienten zu bestimmen. Je nachdem in welchem Status (hyper- oder hypoinflammatorisch)

sich der Patient befindet, kann eine Behandlung in Form von antiinflammatorischen oder

immunfördernden Maßnahmen eingeleitet werden, denn entscheidend für das Überleben

dieser Patienten ist ein zeitlich adäquates Management der Therapie. Der Status muß deshalb

für jeden Patienten mehrfach individuell bestimmt werden (VAN GRIENSVEN 2003).

1.8 Grund für die Verwendung der Knockout-Mäuse

Wie bereits erwähnt, induzieren sowohl der Fcγ-RII als auch der Fcγ-RIII auf den

neutrophilen Granulozyten die Phagozytose von Partikeln und die Degranulation

schädigender Agentien zur Abtötung des phagozytierten Objektes. Die wichtigsten dabei

freigesetzten Produkte sind Wasserstoffperoxid, Superoxidanion und das Stickstoffoxid. Der

Vorgang, bei dem diese Substanzen produziert werden, heißt respiratory burst und wird

hauptsächlich vom Fcγ-RIII vermittelt. Findet der respiratory burst jedoch in gesteigerter

Form im Gewebe statt, so wird die Organfunktion dadurch nachhaltig gestört. Ein Beispiel

hierfür ist die Beeinträchtigung der Lungenfunktion nach einem Ischämie-

Reperfusionsschaden.

Auch an der Aktivierung der neutrophilen Granulozyten über das Komplementsystem ist der

Fcγ-R beteiligt. Bakterien werden durch die Anlagerung des Komplementfaktors C3b

opsoniert, wodurch sie für phagozytierende Strukturen leichter erkennbar werden. C3b allein

kann jedoch über seinen speziellen Rezeptor die Phagozytose nicht anregen. Hierzu ist eine

zusätzliche Bindung von Immunglobulin G an den Fcγ-R des neutrophilen Granulozyten

notwendig.

TNF-α ist ein bedeutendes Zytokin bei der Inflammationsreaktion eines Organismus. Die

inflammatorische Wirkung wird hauptsächlich über den TNF-RI vermittelt (siehe 2.5). Um


den Einfluß des TNF-α bei der Entwicklung eines SIRS/MODS nach einem Ischämie-

Reperfusionsschaden abschätzen zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl an

Einfach- (Tnfrsf1atm1lmx) als auch an Doppel-Knockout-Mäusen (Fcgr3tmiSjv Tnfrsf1atm1lmx) ein

Ischämie-Reperfusionsversuch durchgeführt.

Fragestellung 29

3 Fragestellung

Es ist bekannt, dass eine Ischämie, die von einer Reperfusion gefolgt wird, eine Schädigung

verschiedener Organsysteme bewirkt. Zuerst ist hiervon die Lunge betroffen, im weiteren

zeitlichen Verlauf treten jedoch auch pathologische Veränderungen an der Leber auf.

Besonders neutrophile Granulozyten sind für die Entstehung dieses Schadens verantwortlich,

da sie ins Parenchym migrieren und dort unter anderem Sauerstoffradikale freisetzen, welche

das Gewebe beeinträchtigen. Chemotaktische Zytokine spielen somit eine wichtige Rolle bei

der Pathogenese des Ischämie-Reperfusions-Schadens. Im Rahmen dieser Arbeit soll geklärt

werden, welchen Einfluß der TNF-RI und der Fcγ-RIII auf die Entwicklung der

Organbeeinträchtigung haben.

1. Welche Rolle spielen die Rezeptoren TNF-RI und Fcγ-RIII bei der Infiltration der

neutrophilen Granulozyten ins Lungen- und Lebergewebe?

2. Ist dabei ein zeitabhängiger Effekt zu beobachten?

3. Kann ein Unterschied in der Mortalität zwischen genetisch unveränderten Tieren und

Tieren ohne TNF-RI bzw. ohne TNF-RI und Fcγ-RIII festgestellt werden?

4. Ist ein synergistischer oder addditiver Effekt der TNF-RI und Fcγ-RIII zu bemerken?

5. Welche Rolle spielen die Zytokine IL-12, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, IL-10 und IL-6 bei der

Entstehung des I/R-Schadens?

6. Ist eine zeitabhängige Ausschüttung der Zytokine zu beobachten?

7. Welchen Effekt haben der TNF-RI und Fcγ-RIII auf die Zytokinsekretion und –wirkung?

8. Welche Rolle spielen der TNF-RI und Fcγ-RIII beim respiratory burst nach Ischämie-

Reperfusion?

Material und Methoden 30

4 Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Chemikalien und Medikamente

Carprofen (Rimadyl®, Pfizer GmbH, Karlsruhe)

Desinfektionsmittel Softasept® (Braun, Melsungen)

Diethylether (Rüsch Hospital, Böblingen)

Formalin (Merck, Darmstadt)

Heparinlösung (Liquemin® N 25000) (Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen)

Ketamin-Lösung (Ketanest®) (Parke-Davis GmbH, Karlsruhe)

Natriumchloridlösung 0,9% (Braun, Melsungen)

Ringer-Lactat-Lösung (Braun, Melsungen)

Stickstoff (Linde, Hannover)

Waschlotion Bactolin® basic (Bode Chemie, Hamburg)

Xylazin-Lösung (Rompun® 2%) (Bayer, Leverkusen)

Zytokin-Assay (Zytokin-CBA) (BD Biosciences, Heidelberg)

Allgemeine Laborchemikalien (u.a. verschiedene Salze für Pufferlösungen) wurden in

handelsüblicher p.A.-Qualität (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) bezogen.


4.1.2 Geräte

Durchflusszytometer FACSCalibur ( BD Biosciences, Heidelberg)

Feinwaage A 120 S (Sartorius, Göttingen)

Kühlzentrifuge (Heraeus, Hanau)

Mikroskop (Zeiss, Jena)

pH-Meter 537 (Wissenschaftlich-Technische Werkstätten, Weilheim)

Photometer Biophotometer (Eppendorf, Hamburg)

Photometer Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech, Cambridge, England)

Rüttler Typ VF 2 (Janke & Kunkel, IKA Labortechnik, Staufen i. Br.)

Schermaschine (Aesculap Typ H 585)

Tischzentrifuge (Heraeus, Hanau)

Ultraschallhomogenisator Sonoplus GM 2070 (Bandelin-Electronic, Berlin)

Waage (Mettler-Waagen GmbH, Gießen)

Zentrifuge 3200 (Eppendorf, Hamburg)


4.1.3 Verbrauchsmaterialien

Combitips 50 ml (Eppendorf, Hamburg)

Einmalhandschuhe, unsteril (Kimberly Clark, Roswell, USA)

FACS-Röhrchen, 5 ml (Sarstedt, Nümbrecht)

Faden Prolene®, 1,5 metric (Ethicon, Norderstedt)

Faden Mersilene®, Polyester, geflochten, steril, 4 metric (Braun, Melsungen)

Kanülen (27 G und 24 G) (Braun, Melsungen)

Kompressen, 10 x 20 cm (Lohmann, Neuwied)

Kryoröhrchen mit Schraubdeckel (Nunc, Wiesbaden)

Pipettenspitzen (Sarstedt, Nümbrecht)

Reaktionsgefäße, 1,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht)

Skalpellklingen No.11 (Feather, Industries Limited, Tokyo, Japan)

Spritzen (1 ml und 2 ml) (Braun, Melsungen)

Wattestäbchen (NOBA Verbandsmittel Danz GmbH, Wetter)

Zentrifugenröhrchen, 15 ml (Greiner GmbH, Nürtingen)


4.2 Methoden

4.2.1 Versuchstiere

Versuchstierstämme:

• C57BL/6-Mäuse, Zentrales Tierlaboratorium der MHH (werden im folgenden Teil der

Arbeit als Wildtypen (WT)bezeichnet)

• B6;129P2-Fcgr3tmiSjv TNFrsf1atm1Imx, Zentrales Tierlaboratorium der MHH (Knockout-

Mäuse für den TNF-Rezeptor I und den Fc-γ-Rezeptor III, sie werden im folgenden Teil

der Arbeit als

F--Mäuse bezeichnet)

• B6;129S-TNFrsf1atm1Imx , Zentrales Tierlaboratorium der MHH (Knockout-Mäuse für den

TNF-Rezeptor I, werden im folgenden Teil der Arbeit als T--Mäuse bezeichnet)

Die durchgeführten Versuche wurden von der Bezirksregierung Hannover unter dem

Aktenzeichen 03/663 genehmigt.

Es wurden Untersuchungen an insgesamt 120 männlichen Mäusen vorgenommen. Bei 57

Tieren handelte es sich um Mäuse des Wildtypstammes. 33 der verwendeten Versuchstiere

fehlten die Gene für den TNF-Rezeptor I und den Fc-γ-Rezeptor III. Weiteren 30 Tieren

fehlte nur das Gen für den TNF-Rezeptor I.

Alle Mäuse wurden im Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover

gezüchtet, ihr mittleres Körpergewicht betrug 23,8 ± 2,1 g bei einem durchschnittlichen Alter

von 6-8 Wochen.

Während der Versuchsdurchführung wurden die Mäuse bei einer Gruppengröße von 5 bis 10

Tieren in Typ-III-Käfigen (810 cm2 Grundfläche) gehalten. Futter in pelletierter Form und

Wasser stand ihnen ad libitum zur Verfügung. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2 °C, es war

ein Zyklus mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gegeben.


4.2.1.1 Versuchstiergruppen

Die Mäuse wurden gemäß Angaben in der Tabelle 1 in 16 verschiedene Gruppen eingeteilt.

Gr.nr. n Gruppe Stamm Ischämie Reperfusion Tötung

1 6 Null-Wert WT nein nein nach 0 h

2 10 Lap. 8 h WT nein nein nach 8 h

3 10 Lap. 48 h WT nein nein nach 48 h

4 10 Isch. 4 h WT ja nein nach 4h

5 10 I/R 8 h WT ja ja nach 8 h

6 11 I/R 48 h WT ja ja nach 48 h

7 6 Lap. 8 h F- nein nein nach 8 h

8 8 Lap. 48 h F- nein nein nach 48 h

9 6 Isch. 4 h F- ja nein nach 4 h

10 7 I/R 8 h F- ja ja nach 8 h

11 6 I/R 48 h F- ja ja nach 48 h

12 5 Lap. 8 h T- nein nein nach 8 h

13 7 Lap 48 h T- nein nein nach 48 h

14 6 Isch. 4 h T- ja nein nach 4 h

15 6 I/R 8 h T- ja ja nach 8 h

16 6 I/R 48 h T- ja ja nach 48 h

Tabelle 1: Einteilung der Versuchstiere. Die Versuche wurden an drei verschiedenen Tierstämmen durchgeführt, welche wiederum in unterschiedliche Gruppen eingeteilt wurden. Teilweise erfolgte eine Ischämie der hinteren Gliedmaßen durch Ligatur der Aorta im Bereich kaudal der Niere. Beim Herbeiführen der Reperfusion wurde diese Ligatur wieder durchtrennt. Die Tötung der Tiere zur Probengewinnung erfolgte nach den angegebenen Zeitintervallen, vom Operationsbeginn an gerechnet. Gr.nr. = Gruppennummer, I/R = Ischämie / Reperfusion, Isch. = Ischämie, Lap. = Laparotomie, n = Anzahl der Tiere, F- = Knockout-Mäuse für den TNF-Rezeptor I und den Fc-γ-Rezeptor III, T- = Knockout-Mäuse für den TNF-Rezeptor I, WT = Wildtyp, x h = x Stunden nach Operationsbeginn


4.2.2 Versuchsprotokoll

Zur Durchführung der Versuche wurden die Tiere mit Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht)

und Xylazin (16 mg/kg Körpergewicht) narkotisiert und bei erhaltener Spontanatmung

operiert. Die Verabreichung der Medikamente erfolgte in einer Mischspritze durch subcutane

Injektion.

Nach Eintritt der Narkose wurde das Abdomen der Mäuse geschoren, gereinigt (Bactolin®

basic Waschlotion) und desinfiziert (Softasept®). Alle Tiere erhielten subcutan Heparin

(Liquemin®, 12,5 IE/Tier), um eine Thrombosierung der distalen Gefäße während der

Ischämiephase zu verhindern. Zusätzlich wurde allen Tieren subcutan Carprofen (Rimadyl®)

als Analgetikum appliziert. Die initiale Dosis betrug 5 mg/kg, an den folgenden Tagen wurde

den Mäusen alle 24 Stunden 2,5 mg/kg des Medikamentes verabreicht. Die Versuchstiere

wurden auf einer Korkplatte ausgebunden und ein ca. 2 cm langer Schnitt in der Medianlinie

des Abdomens (Linea alba) vorgenommen. Das Darmpaket wurde aus der Bauchhöhle

vorgelagert und in eine mit Ringer-Lactatlösung befeuchtete Kompresse gehüllt, um einer

Austrocknung vorzubeugen. Zur Erzeugung der Ischämie der unteren Extremitäten erfolgte

eine infrarenale Ligatur der Aorta abdominalis und der Vena cava caudalis mit einem

Polyesterfaden (Mersilene®) (siehe Abbildung 4). Während der nachfolgenden vierstündigen

Ischämiephase blieben die Mäuse narkotisiert. Die Laparotomiewunde wurde mit

Diagonalheften verschlossen (Prolene® Faden). Zur Verringerung des Wärmeverlustes

während der Ischämiephase wurden die Tiere auf dem Bauch liegend unter einer

Wärmelampe platziert.

Nach vier Stunden wurde die Bauchhöhle erneut eröffnet, um die Ligatur mit Hilfe einer

Skalpellklinge zu entfernen. Nach dem Verschließen der Wunde wurden die Tiere während

des gesamten Beobachtungszeitraumes (je nach Gruppe 4 oder 48 h) unter der Wärmelampe

gehalten. Futter und Wasser stand ihnen während dieser Zeit ad libitum zur Verfügung.

Die Kontrolltiere wurden narkotisiert (siehe oben) und sofort für die Organentnahme durch

Blutentzug aus dem Herzen getötet (Exsanguation, siehe 4.2.3).


Abbildung 4: Infrarenale Ligatur der Aorta abdominalis und Vena cava caudalis.

4.2.3 Blut und Organentnahme

Zur Probengewinnung wurden die narkotisierten Tiere (siehe Kapitel 4.2.2) durch

Exsanguation getötet. Nachdem sowohl die Bauch- als auch die Brusthöhle eröffnet wurden,

erfolgte die Punktion des Herzens mit einer Spritze, deren Konus mit Heparin gefüllt war, um

eine Gerinnung des gewonnenen Blutes zu verhindern. Das Blut wurde daraufhin für 2

Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert und das so gewonnene Serum in einem Eppendorfgefäß

bis zu den weiteren Untersuchungen bei –80° C aufbewahrt.

Weiterhin wurde das Herz-Lungen-Paket entnommen und eine bronchoalveoläre Lavage

(BAL) durchgeführt (siehe Kapitel 4.2.4). Danach wurde ein Lungenflügel für eine

Myeloperoxidasebestimmung kryokonserviert, der andere wurde hingegen mit 5%-iger

phosphatgepufferter Formalinlösung perfundiert und schließlich in einem Glasbehältnis mit

Formalin aufbewahrt. Des weiteren wurden die Milz, eine Niere und ein Teil der Leber für

histologische Untersuchungen entnommen und ebenfalls in Formalin fixiert.


4.2.4 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)

Für die bronchoalveoläre Lavage wurde eine stumpfe Kanüle in die Trachea eingeführt (siehe

Abbildung 5) und fixiert. Danach erfolgte die Spülung beider Lungenflügel mit ca. 1 ml

steriler isotonischer Kochsalzlösung. Die bei der BAL erhaltene Spülflüssigkeit wurde bis zu

den weiteren Untersuchungen in einem Eppendorfgefäß bei –80°C gelagert.

Abbildung 5: Die Kanüle wurde für die BAL in die Trachea eingeführt.

4.2.5 Kapilläre Permeabilität der Lunge

Mit Hilfe der in der BAL-Flüssigkeit gemessenen Protein- und Harnstoffkonzentration läßt

sich eine Aussage über die Schädigung der Endothelzellen und damit der kapillären

Permeabilität der Lunge in vivo machen (VAN GRIENSVEN 1999). Da jedoch

unterschiedliche Mengen an Lavageflüssigkeit zurückgewonnen wurden, muss der absolute

Proteingehalt über die gleichzeitig gemessene Harnstoffkonzentration im Serum und in der

BAL korrigiert werden, damit eine volumenunabhängige Aussage der Proteinkonzentration in

der BAL gemacht werden kann. Hierzu wird folgende Formel verwendet:

SerumBAL

SerumBAL

]Protein[]Harnstoff[]Harnstoff[]Protein[

altProteingehrelativer×

×=


4.2.6 Proteinbestimmung nach Lowry

Der Proteingehalt wurde sowohl im Mäuseserum als auch in der BAL nach Lowry bestimmt

(FOLIN u. CIOCALTEU, 1927). Grundprinzip dieser Eiweißbestimmung ist eine

Farbänderung der Reagenzien, die mit Hilfe eines Photometers bei 595 nm bestimmt werden

kann. Proteine reduzieren Cu(II)-Ionen zu Cu(I)-Ionen, die wiederum mit Phosphomolybdat-

Phosphowolframat einen blaugrünen Komplex bilden und somit photometrisch bestimmt

werden können. Die gemessene Extinktion ist proportional zur Proteinkonzentration.

Lösungen:

Lösung A: 2% Na₂CO₃ 0,02% Na+-K+-Tatrat

0,4% NaOH

Lösung B: 0,5% CuSO₄

Lösung I: 49 Teile Lösung A + 1 Teil Lösung B

Lösung II: Folin-Ciocalteu-Phenolreagenz

(Phosphomolybdat-Phosphowolframat 1:1 mit H2O verdünnt)

BSA-Stammlösung: 1 mg BSA/ml in Lösung I

Durchführung:

Zur Erstellung der Eichkurve wurde mit Hilfe des BSA eine Standardreihe mit verschiedenen

Proteingehalten angelegt. Für die Messung der BAL wurde ein Bereich zwischen 5 µg/ml und

500 µg/ml gewählt, die Standardreihe für die Serummessung lag zwischen 200 µg/ml und

2000 µg/ml. Aus den gemessenen Extinktionen der bekannten Konzentrationen der Proben

wurden die Standardkurven und die dazugehörigen beschreibenden Funktionen mittels

linearer Regression erstellt.


Die Probenmessungen wurden analog zur Standardmessung wie folgt durchgeführt: 200 µl

BAL-Flüssigkeit wurden mit 2300 µl Lösung I versetzt und danach 15 Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 200 µl Lösung II hinzugegeben, eine

Inkubation für 30 Minuten, ebenfalls bei Raumtemperatur, schloss sich an. Direkt im

Anschluss erfolgte die Auswertung bei 595 nm.

Die Proteinbestimmung im Serum folgte dem gleichen Prinzip; jedoch wurden die Proben

1:50 mit Lösung I vorverdünnt. Es wurden 50 µl verdünntes Serum eingesetzt, die mit

2450 µl Lösung I versetzt wurden. Die folgenden Schritte waren identisch mit der

Proteinbestimmung in der BAL-Flüssigkeit.

Mit Hilfe der erstellten Standardkurven und deren zugehörigen Funktionen konnten die

Proteinkonzentrationen für die Serum- und BAL-Proben errechnet werden:

baOD +×= ]Protein[

abOD −

=]Protein[

OD = optische Dichte [Protein] = Protein-Konzentration a , b = Konstanten

4.2.7 Harnstoffbestimmung

Der quantitativen Bestimmung des Harnstoffgehaltes in der BAL und im Serum liegt als

Prinzip ebenfalls eine Farbreaktion zugrunde: Urease katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff

zu Ammoniak und Kohlendioxid. Das entstehende Ammoniak reagiert mit Hypochlorit und

Phenol zu Indolphenol, welches photometrisch erfasst wird. Die gemessene

Extinktionsänderung ist proportional zum Harnstoffgehalt.


Lösungen:

Urease-Lösung : 10 U in PBS/Glycerin

(1,25 ml Urease und 8,75 ml PBS)

Urea-Standardlösung: 30 mg ad 10 ml H₂O

Phenol/Natriumprussidlösung: 25 mg Na-Prussid

5 ml Phenol (pH 6-8)

ad 500 ml H₂O

Hypochloritlösung: 2,5 g NaOH

2,5 ml Na- Hypochlorit

ad 500 ml H₂O

Durchführung:

Zur Erstellung der Eichkurve wurde eine Standardreihe mit Harnstoffkonzentrationen

zwischen 150 µg/ml und 3000 µg/ml verwendet. Sie galt sowohl für die BAL- als auch für die

Serumbestimmungen. Aus den bei 595 nm gemessenen Extinktionen der bekannten

Standardkonzentrationen wurde eine Standardkurve mit einer dazugehörigen Funktion erstellt.

200 µl BAL-Flüssigkeit wurden mit 100 µl Ureaselösung versetzt, gut gemischt und 15

Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von jeweils 5 ml Phenol/Natriumprussid und

Hypochloritlösung wurden die Ansätze erneut gut durchmischt und für 45 Minuten bei 37°C

inkubiert. Im Anschluß erfolgte die photometrische Auswertung bei 595 nm. Die

Durchführung der Serummessung erfolgte nach dem oben beschriebenen Prinzip. Jedoch

mussten die Proben 1:5 mit PBS-Lösung vorverdünnt werden. Im Unterschied zur BAL-

Messung wurden nur 50 µl eingesetzt, die außer mit 100µl Ureaselösung noch mit 150 µl PBS

versetzt wurden, bevor der erste Inkubationsschritt begann. Alle nun folgenden Schritte waren

identisch.


Mit Hilfe der erstellten Standardkurve und ihrer zugehörigen Funktion konnten nun die

Harnstoffkonzentrationen in den Serum- und BAL-Proben errechnet werden:

baOD +×= ]Harnstoff[

abOD −

=]Harnstoff[

OD = optische Dichte [Harnstoff] = Harnstoff-Konzentration a, b = Konstanten

4.3 Myeloperoxidaseaktivität (MPO)

Nach ALLAN et al. (1985) besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der MPO-Aktivität

eines Gewebes und der darin enthaltenen Anzahl von neutrophilen Granulozyten. Um indirekt

den Gehalt an neutrophilen Granulozyten bestimmen zu können, wurde daher die MPO-

Aktivität nach folgendem Prinzip ermittelt:

Lösungen:

0,02 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,4: 0,696 g K₂HPO₄

2,18 g KH₂PO₄ ad 1 l aqua dest.

HTAB-Puffer pH 6,0: 7,84 g K₂HPO₄

0,68 g KH₂PO₄ 5,0 g HTAB

ad 1 l aqua dest.

TMB: 700 µl 3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidin-Substrat


Durchführung:

Die kryokonservierten Gewebeproben wurde in einer Reibschale in flüssigem Stickstoff fein

zermahlen und in Eppendorfgefäße verbracht. Um die eingefüllte Menge zu ermitteln, wurden

die Gefäße vor und nach dem Befüllen gewogen. Anschließend wurden 700 µl Kalium-

Phosphatpuffer (4°C) hinzugefügt und die Proben gut durchmischt. Es folgte eine

Zentrifugation für 15 Minuten bei 13 000 rpm. Der Überstand wurde verworfen und die

verbleibenden Pellets für 2 Stunden bei 60°C inkubiert. Daraufhin erfolgte eine Resuspension

der Pellets in 1 ml HTAB-Puffer (Raumtemperatur) und eine Ultraschallhomogenisation für

10 Sekunden. Nachdem die Proben in flüssigem Stickstoff dreimal eingefroren und wieder

aufgetaut wurden, wurde eine erneute Ultraschallhomogenisation für 10 Sekunden

durchgeführt. Es folgte eine abschließende Zentrifugation für 15 Minuten bei 13 000 rpm.

70 µl des Überstandes wurden mit 700 µl TMB versetzt, gut durchmischt und bei 655 nm

photometrisch gemessen.

Die Eichkurve für das Photometer wurde mit Hilfe von Meerrettichperoxidase erstellt, indem

Konzentrationsstufen von 1, 3, 10, 30 und 100 mU Peroxidase pro ml Testflüssigkeit

hergestellt wurden. Die jeweiligen Extinktionsänderungen pro Minute (∆E) konnten daraufhin

bei einer Wellenlänge von 655 nm gemessen werden.

Der Gehalt an Peroxidase pro g Lungengewebe wurde anhand der im Versuch ermittelten

Extinktionsänderung pro Minute und der vorliegenden Eichkurve nach folgender Formel

berechnet:

∆E x 100 = mU Peroxidaseaktivität

mU = milliUnits


4.4 Histologische Untersuchung

Für die histologische Untersuchung wurden den Versuchstieren post mortem jeweils ein

Lungenflügel (siehe Kapitel 4.2.3.), die Milz, die linke Niere und ein Teil der Leber

entnommen und für mindestens 7 Tage in phosphatgepuffertem 5%igen Formalin aufbewahrt.

Die entnommenen Gewebeproben wurden für die lichtmikroskopische Untersuchung in

Paraffin eingebettet und daraus 3 µm dicke Präparate angefertigt. Die Anfärbung dieser

Schnitte erfolgte mit Hämatoxylin und Eosin. Die mikroskopische Beurteilung der Präparate

wurde mit 63-, 100- und 400-facher Vergrößerung durchgeführt.

Bewertung der Organproben:

In den Präparaten der Lunge wurden das interstitielle Ödem und die Infiltration mit

neutrophilen Granulozyten beurteilt. Dabei wurden Präparate ohne besonderen Befund mit 0,

geringgradige Verdickungen der Septen bzw. geringgradige Infiltrationen mit neutrophilen

Granulozyten mit 1 und mittel- bis hochgradige Verdickungen bzw. Infiltrationen mit 2

bewertet. Die Beurteilung der Leberschnitte erfolgte nach dem gleichen Scoresystem, wobei

neben dem interstitiellen Ödem und der Granulozyteninfiltration zusätzlich die hydropische

Degeneration der Leberzellen betrachtet wurde. Bei der histologischen Beurteilung der

Milzpräparate wurde die Schwere der Nekrosen nach oben beschriebenem System mit Zahlen

von 0 bis 2 bewertet. Ließ sich des weiteren die rote von der weißen Pulpa abgrenzen, so

wurde das Organ mit 1 bewertet, war dies jedoch nicht der Fall, so erfolgte die Bewertung mit

einer 2. Zusätzlich wurde die Fülle der weißen Pulpa betrachtet: wenig gefüllte Follikel

wurden mit 1, stark gefüllte mit 2 beurteilt. Die Präparate der Niere wurden ebenfalls auf

Infiltrationen mit neutrophilen Granulozyten nach oben beschriebenem Prinzip (0-2)

untersucht, außerdem erfolgte die Beurteilung der Fülle der Glomeruli (Anzahl der Zellkerne)

mit 1 für weniger stark gefüllte und 2 für stark gefüllte Glomeruli (siehe Tabelle 2).


Lunge

Interstitielles Ödem Granulozyteninfiltration

- + + + - + + +

Score 0 1 2 0 1 2

Leber

Interstitielles Ödem Granulozyteninfil-

tration

Hydropische

Degeneration

- + + + - + + + - + + +

Score 0 1 2 0 1 2 0 1 2

Milz

Nekrose Abgrenzung der

roten / weißen Pulpa

Fülle der weißen

Pulpa

- + + + ja nein + + +

Score 0 1 2 1 2 1 2

Niere

Glomeruli-Fülle Granulozyteninfiltration

wenig gefüllt normal gefüllt - + + +

Score 1 2 0 1 2

Tabelle 2: Scoresystem zur Beurteilung der nach HE gefärbten histologischen Präparate (3µm dick) von Lunge, Leber, Milz und Niere der Versuchstiere.

- = ohne besonderen Befund + = geringgradige Veränderungen + + = mittel- bis hochgradige Veränderungen


4.4.1 Durchflusszytometrie ( FACS-Analyse)

Die Durchflusszytometrie bietet durch die Kombination der Detektion von

Lichtstreuungseigenschaften und Fluoreszenzemission eine effektive Möglichkeit der

qualitativen und quantitativen Messung einzelner Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurden

keine Zellen, sondern Beads (engl.: Perle, Tropfen) gemessen. Die FACS-Analyse

(Fluorescent Activated Cell Scanner) hat gegenüber einem herkömmlichen ELISA (Enzyme

Linked Immuno Sorbent Essay) mehrere Vorteile: Es wird nur 1/6 des ursprünglichen

Probenvolumens für die gleiche Anzahl Ergebnisse benötigt, welche außerdem in nur einem

Durchlauf gemessen werden können. Zusätzlich ist die Genauigkeit der Ergebnisse durch die

Einzelbeadmessung größer als bei einem ELISA.

4.4.1.1 Funktionsprinzip des Durchflusszytometers

Ein Durchflusszytometer ist ein Messsystem, das optische Signale, Streulicht und Fluoreszenz

einzelner fokussierter Partikel analysiert. Die zu untersuchende Flüssigkeit wird durch eine

bestimmte Analysestrecke geleitet und von den Beads einzeln durchlaufen. Hierbei werden

die Partikel von einem Argonionenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt und mit

Hilfe eines optischen Detektionssystems sowohl die Fluoreszenz als auch die

Streulichtemissionen der einzelnen Partikel ermittelt. Anhand des Vorwärtsstreulichtes

(Forwardscatter = FSC) kann eine Aussage über die Partikelgröße gemacht werden, während

das Seitwärtsstreulicht (Sidescatter = SSC) ein Maß für die Granularität des Partikels darstellt.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Auswahl von Zytokinen (IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-

α, IFN-γ und MCP-1) im Serum der Versuchstiere gemessen. Das Prinzip der Analyse besteht

darin, dass die verschiedenen im Serum enthaltenen Zytokine mit Hilfe von spezifischen

Antikörpern, denen am Fc-Teil ein Bead angehängt ist, für den Laserstrahl sichtbar gemacht

werden. Je nach Zytokinzugehörigkeit besitzen diese Beads verschiedene

Fluoreszenzintensitäten, um eine Unterscheidung möglich zu machen. Ein weiterer gegen das

Zytokin gerichteter Detektionsantikörper ist an seinem Fc-Teil mit einem PE-Farbstoff


gekoppelt. Die Menge dieses Farbstoffes wird vom FACS-Gerät ermittelt, sie ist proportional

zur vorhandenen Menge des Zytokins.

Die Darstellung der Messwerte erfolgte über einen angeschlossenen Computer mit dem

Programm Cell Quest Pro (BD Biosciences). Die mit Hilfe von rekombinanten Zytokinen

erstellten Standardkurven wurden als Regressionskurven mit dazugehörigen beschreibenden

Funktionen dargestellt. Mit Hilfe dieser Funktionen wurden die Serumkonzentrationen der

Zytokine in den Proben berechnet und anhand eines Punktdiagrammes (dot plot) und in

tabellarischer Form dargestellt.

4.4.1.2 Durchführung der Messung

Reagenzien:

Mouse Inflammation Capture Beads: Jedes Gefäß enthält Antikörper, die gegen ein

bestimmtes Zytokin gerichtet sind. Um eine Unterscheidung möglich zu machen, sind die

enthaltenen Antikörper an einen Bead gekoppelt, welcher mit einer für das Zytokin

spezifischen Intensität fluoresziert. Die Zytokine sind in abnehmender Fluoreszenzstärke

geordnet:

IL-6 (stärkste Fluoreszenz)

IL-10

MCP-1

IFN-γ

TNF-α

IL-12p70 (schwächste Fluoreszenz)


Cytometer Setup Beads: Beads enthaltende Flüssigkeit zur Kalibrierung des Zytometers

Mouse Inflammation PE Detection Reagent: mit PE-Farbstoff kombinerte Antikörper, die

gegen die verschiedenen Zytokine gerichtet sind

PE Positive Control Detector: mit PE-Farbstoff konjugierte Antikörper zur anfänglichen

Einstellung des Zytometers

FITC Positive Control Detector: mit FITC-Farbstoff konjugierte Antikörper zur anfänglichen

Einstellung des Zytometers

Mouse Inflammation Standards: murine Zytokine enthaltende Flüssigkeit zur Erstellung einer

Standardreihe. Mit Hilfe dieser Standardreihe können Fluoreszenzintensitäten bei bestimmten

Zytokinkonzentrationen am Zytometer eingestellt werden.

Verdünnungsflüssigkeit: gepufferte Proteinlösung

Waschpuffer: PBS-Lösung

Durchführung:

Erstellung der Standardreihe: Der Mouse Inflammation Standard wurde mit 0,2 ml

Verdünnungsflüssigkeit versetzt und nach dem Mischen für mindestens 15 Minuten stehen

gelassen. Aus dieser Lösung erfolgte die Erstellung einer Standardreihe mit folgenden

Verdünnungsstufen: Standard mit höchster Konzentration, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64,

1:128 und 1:256. Die Konzentrationen der Standardreihe reichten von 5000 pg/ml (Standard

mit höchster Konzentration) bis zu 20 pg/ml (1:256). Als Negativkontrolle diente die Assay-

Flüssigkeit.

Erstellung der Mixed Capture Beads: Da die verschiedenen Antikörper in unterschiedlichen

Fläschchen aufbewahrt wurden, mussten sie vor der Messung gemischt werden. Es wurde aus

allen Behältnissen jeweils die gleiche Menge Antikörperflüssigkeit entnommen (10µl pro

Serumprobe, Standardlösung und Negativkontrolle) und in ein Röhrchen gegeben.


Serumproben: 50µl der Mixed Capture Beads und 50µl Serum wurden in die verschiedenen

Probenröhrchen gegeben. Danach erfolgte eine Zugabe von 50µl Mouse Inflammation PE

Detection Reagent, worauf sich eine Inkubation über zwei Stunden bei Raumtemperatur an

einer abgedunkelten Stelle anschloß. Nach diesem Inkubationsschritt wurde jeweils 1ml

Waschpuffer in die Röhrchen gegeben und sie bei 200 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Der

Überstand wurde vorsichtig abgesaugt und verworfen. Erneut wurden 300µl Waschpuffer

hinzugefügt und das Bead-Pellet resuspendiert. Die Proben konnten mit Hilfe des

Durchflusszytometers ausgewertet werden.

4.5 Statistik

Für die einzelnen Gruppen wurden Mittelwerte und der Standardfehler (SEM) berechnet. Alle

statistischen Berechnungen erfolgten mit dem Programm SigmaStat 2.03 (SPSS Inc., San

Rafael, USA).

Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppenmittelwerten wurden mit dem ungepaarten

Student`s t-test ermittelt. Bei ungleicher Varianz oder nicht normal verteilter Population

wurde ein Mann-Whitney Rank Sum Test durchgeführt. Die Überlebenskurven wurden mit

dem sogenannten Fisher exakter Test geprüft (p < 0,05 = signifikanter Unterschied).

Ergebnisse 49

5 Ergebnisse

5.1 Lungenpermeabilität

Abbildung 6: Lungenpermeabilität der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

Lap. 8 h Lap. 48 h

rela

tiver

Pro

tein

geha

lt

A

B

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

rela

tiver

Pro

tein

geha

lt

Ergebnisse 50

Abbildung 6 zeigt die kapilläre Lungenpermeabilität der verschiedenen Versuchsgruppen. Es

fällt auf, dass fast alle Gruppen der T--und F--Knockout-Tiere geringere Werte aufweisen als

die entsprechenden Gruppen der WT-Tiere. Ausnahmen bilden hierbei die Gruppe T--

Ischämie 4 h und F--Laparotomie 48 h. Die Lungenpermeabilität in der Gruppe T--

Laparotomie 8 h (0,01 ± 0,01) ist gegenüber der Gruppe T--Ischämie 4 h (0,09 ± 0,04)

signifikant niedriger (p<0,05). Auch der Wert der Gruppe T--Laparotomie 48 h ist signifikant

niedriger als der der Gruppe Ischämie 4 h (0,09 ± 0,04) (p<0,05).

Ergebnisse 51

5.2 Myeloperoxidaseaktivität

Abbildung 7: Myeloperoxidaseaktivität im Lungengewebe der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, mU= milliUnits

0

20

40

60

80

100

120

Lap. 8 h Lap. 48 h

mU

/ g L

unge

ngew

ebe

A

B0

20

40

60

80

100

120

Isch. 4 h I / R 4 h I / R 48 h

mU

/g L

unge

ngew

ebe

Ergebnisse 52

In Abbildung 7 ist die Myeloperoxidaseaktivität im Lungengewebe der verschiedenen

Versuchsgruppen dargestellt. Signifikante Unterschiede konnten besonders innerhalb der F--

Gruppen festgestellt werden. Die MPO-Aktivität der Gruppe F--Ischämie 4 h (87,99 ± 7,74

mU/g Lungengewebe) war signifikant höher als die der Gruppe F--Ischämie-Reperfusion 48 h

(56,45 ± 5,79 mU/g Lungengewebe) (p<0,05). Auch zwischen der MPO-Aktivität der Gruppe

F--Ischämie 4 h (89,02 ± 7,03 mU/g Lungengewebe) und der Gruppe F--Ischämie-Reperfusion

48 h (56,45 ± 5,79 mU/g Lungengewebe) war ein signifikanter Unterschied zu beobachten

(p<0,05). Die MPO-Aktivität der Gruppe F--Laparotomie 48 h (67,93 ± 5,12 mU/g

Lungengewebe) ist signifikant niedriger als die der Gruppe F--Ischämie 4 h (89,02 ± 7,74

mU/g Lungengewebe) (p<0,05).

Weiterhin konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den Knockout-Gruppen T--

Laparotomie 8 h (49,68 ± 15,33) und F--Laparotomie 8 h (87,99 ± 7,74) festgestellt werden

(p<0,05).

Ergebnisse 53

5.3 Histologie

5.3.1 Lungenödem

Abbildung 8: Ödem in der Lunge der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F- ,Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= geringgradige Verdickung der Septen, 2= mittel- bis hochgradige Verdickung der Septen

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 54

Abbildung 8 zeigt das Lungenödem der verschiedenen Versuchsgruppen. Bis auf in der

Gruppe Laparotomie 8 h wurden für die Knockout-Tiere geringere Lungenödeme gegenüber

den Wildtyp-Tieren festgestellt (siehe Abbildung 9 und 10). Sowohl die Werte in der F--

Gruppe Ischämie-Reperfusion 8 h (0,46 ± 0,05) als auch die Werte in der Gruppe T--

Ischämie-Reperfusion 8 h (0,32 ± 0,01) waren gegenüber den Werten für die Wildtyp-Tiere

der entsprechenden Gruppe (0,99 ± 0,15) signifikant niedriger (p<0,05). Das Lungenödem der

Gruppe WT-Ischämie-Reperfusion 48 h (0,87 ± 0,10) waren im Vergleich zur Gruppe T--

Ischämie-Reperfusion 48 h (0,42 ± 0,05) signifikant höher (p<0,05).

Auch die Vergleiche der Gruppe WT-Laparotomie 8 h (0,47 ± 0,11) mit den Gruppen WT-

Ischämie-Reperfusion 8 h (0,99 ± 0,15) und WT-Ischämie-Reperfusion 48 h (0,87 ± 0,10)

ergaben jeweils ein signifikant stärkeres Lungenödem bei den I/R-Gruppen (p<0,05).

Abbildung 9: Histologisches Präparat der Lunge ohne besonderen Befund (Gruppe WT Lap. 8 h), HE-Färbung,

100x

Ergebnisse 55

Abbildung 10: Histologisches Präparat der Lunge, hochgradiges Ödem der Septen und Granulozyteninfiltration

(Gruppe WT Ischämie-Reperfusion 48 h) HE-Färbung, 100x

Abbildung 11: Histologisches Präparat der Lunge, hochgradiges Ödem der Septen und Granulozyteninfiltration,

(Gruppe WT Ischämie-Reperfusion 48 h) HE-Färbung, 400x

Ergebnisse 56

5.3.2 Granulozyteninfiltration ins Lungengewebe

Abbildung 12: Granulozyteninfiltration in die Lunge der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= geringgradige Granulozyteninfiltration, 2= mittel- bis hochgradige Granulozyteninfiltration

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 57

Abbildung 12 zeigt die Granulozyteninfiltration in die Lunge der verschiedenen

Versuchsgruppen (siehe Abbildung 11 und 13). In der Ischämie 4 h Gruppe und in den

Ischämie-Reperfusions-Gruppen sind die Werte der Knockout-Tiere geringer als bei den

Wildtyp-Tieren. Dabei ist sowohl die Granulozyteninfiltration der F--Tiere der Gruppe

Ischämie-Reperfusion 8 h (0,25 ± 0,09) als auch die Granulozyteninfiltration der T--Tiere der

gleichen Gruppe (0,15 ± 0,07) signifikant niedriger im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren

dieser Gruppe (0,96 ± 0,15) (p<0,05).

Unter den Wildtyp-Tieren konnte ein signifikanter Unterschied bei der

Granulozyteninfiltration der Gruppen Laparotomie 8 h (0,43 ± 0,11) und Laparotomie 48 h

(0,44 ± 0,12) gegenüber der Gruppe Ischämie-Reperfusion 8 h (0,96 ± 0,15) beobachtet

werden (p<0,05).

Abbildung 13: Histologisches Präparat der Lunge, hochgradige Granulozyteninfiltration (Gruppe WT Ischämie-

Reperfusion 48 h), HE-Färbung, 400x

Ergebnisse 58

5.3.3 Leberödem

Abbildung 14: Leberödem der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= geringgradiges Ödem, 2= mittel- bis hochgradiges Ödem

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 59

In der Abbildung 14 ist das Leberödem der verschiedenen Versuchsgruppen dargestellt (siehe

Abbildung 15 und 16) Vergleicht man die Wildtyp-Tiere mit den T--Tieren, so ist eine

Abnahme der Schwere des Leberödems in allen Gruppen zu bemerken. Die F--Tiere hingegen

zeigen in allen Gruppen ein stärkeres Leberödem gegenüber den WT-Tieren. Besonders

deutlich ist der Anstieg in der Gruppe WT Laparotomie 48 h (0,60 ± 0,22) gegenüber der

Gruppe F--Laparotomie 48 h (2,00 ± 0,00). Dieser Unterschied ist statistisch signifikant

(p<0,05).

Das Ödem ist in der Gruppe T--Ischämie 4 h (1,00 ± 0,26) gegenüber der Gruppe F--Ischämie

4 h (2,00 ± 0,00) ebenfalls signifikant geringer (p<0,05).

Innerhalb der WT-Gruppen ist der Wert in der Gruppe Laparotomie 48 h (0,60 ± 0,22)

gegenüber dem Wert der Gruppe Ischämie 4 h (1,30 ± 0.21) signifikant niedriger (p<0,05).

Abbildung 15: Histologisches Präparat der Leber, ohne besonderen Befund (gruppe WT Lap. 8 h), HE-Färbung,

200x

Ergebnisse 60

Abbildung 16: Histologisches Präparat der Leber, hochgradiges Ödem(Gruppe WT Ischämie-Reperfusion 8 h),

HE-Färbung, 200x

Abbildung 17: Histologisches Präparat der Leber, hochgradige hydropische Degeneration (Gruppe WT

Ischämie-Reperfusion 48 h), HE-Färbung, 200x

Ergebnisse 61

5.3.4 Granulozyteninfiltration in die Leber

Abbildung 18: Granulozyteninfiltration in die Leber der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= geringgradige Granulozyteninfiltration, 2= mittel- bis hochgradige Granulozyteninfiltration

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 62

In Abbildung 18 ist die Granulozyteninfiltration der verschiedenen Versuchsgruppen

dargestellt. In allen Gruppen der T--Mäuse kann eine geringere Granulozyteninfiltration in das

Lebergewebe gegenüber der WT-Mäuse beobachtet werden. Hingegen ist bei den F--Mäusen,

außer in der Gruppe Ischämie-Reperfusion 48 h, gegenüber der WT-Tiere eine verstärkte

Zellinfiltration zu bemerken. Die Granulozyteninfiltration der Gruppe Ischämie-Reperfusion 8

h (1,29 ± 0,29) gegenüber der Gruppe Ischämie-Reperfusion 48 h (0,17 ± 0,17) der F--Mäuse

ist signifikant (p<0,05). Weiterhin besteht ein signifikanter Unterschied in der Stärke der

Zellinfiltration zwischen den Gruppen F--Ischämie 4 h (1,33 ± 0,22) und F--Ischämie-

Reperfusion 48 h (0,17 ± 0,17) (p<0,05). Auch gegenüber der Gruppe F--Laparptomie 48 h

(1,00 ± 0,19) ist die Anzahl der Granulozyten im Lebergewebe bei der Gruppe F--Ischämie-

Reperfusion 48 h signifikant geringer (0,17 ± 0,17) (p<0,05).

Vergleicht man die Laparotomie 8 h-Gruppe der T--Tiere (0,10 ± 0,10) mit den F--Tieren

(1,17 ± 0,31), so fällt eine signifikant höhere Zellzahl in der Leber der F--Tieren auf (p<0,05).

Auch 48 h nach der Laparotomie bleibt dieser signifikante Unterschied bestehen (T-: 0,14 ±

0,14; F-: 1,00 ± 0,19) (p<0,05).

Ergebnisse 63

5.3.5 Hydropische Degeneration in der Leber

Abbildung 19: Hydropische Degeneration in der Leber der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind in Tabelle 3 dargestellt, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= geringgradige hydropische Degeneration, 2= mittel- bis hochgradige hydropische Degeneration

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 64

Abbildung 19 zeigt die Hydropische Degeneration der verschiedenen Versuchsgruppen (siehe

Abb 17). Aufgrund der großen Anzahl statistisch signifikanter Unterschiede (p<0,05) werden

diese in Tabellenform dargestellt (siehe Tabelle 3) und nicht in die Diagramme eingezeichnet.

WT T- F-

Lap 8h

Lap 48h

I 4h

I/R 8h

I/R48h

Lap8h

Lap48h

I 4h

I/R8h

I/R48h

Lap 8h

Lap 48h

I 4h

I/R8h

I/R48h

Lap 8h x x x

Lap 48h x x

I 4h x I/R 8h x x x

WT

I/R 48h

Lap 8h x x x

Lap 48h

I 4h x I/R 8h x

T-

I/R 48h x

Lap 8h

Lap 48h

I 4h I/R 8h

F-

I/R 48h

Tabelle 3: Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) der Hydropischen Degeneration der Versuchstiere, ermittelt anhand des Student`s t-test, Lap= Laparotomie, I= Ischämie, I/R= Ischämie-Reperfusion, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, WT= Wildtyp, T- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI, F- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, X= statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05)

Ergebnisse 65

5.3.6 Nekrotische Veränderungen in der Milz

Abbildung 20: Nekrotische Veränderungen in der Milz der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= geringgradige Nekrosen, 2= mittel- bis hochgradige Nekrosen

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 66

Abbildung 20 zeigt die nekrotischen Veränderungen in der Milz der verschiedenen

Versuchsgruppen. Bei der Beurteilung dieser Veränderungen konnten keine signifikanten

Unterschiede festgestellt werden. Lediglich bei den WT-Tieren in den Gruppen Laparotomie

4 h und Ischämie-Reperfusion 8 h konnten Nekrosen festgestellt werden.

Ergebnisse 67

5.3.7 Abgrenzbarkeit der weißen von der roten Milzpulpa

Abbildung 21: Abgrenzbarkeit der weißen von der roten Milzpulpa der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 1= Abgrenzung ist möglich, 2= Abgrenzung ist nicht möglich

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 68

In der Abbildung 21 ist die Abgrenzbarkeit der roten von der weißen Milzpulpa der

verschiedenen Versuchsgruppen dargestellt. Hierbei wurden keine signifikanten Unterschiede

festgestellt. Die Abgrenzbarkeit war bei allen außer einem Tier gegeben.

Ergebnisse 69

5.3.8 Lymphozytendichte in der weißen Milzpulpa

Abbildung 22: Lymphozytendichte in der weißen Milzpulpa der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM, A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 1=geringe Lymphozytendichte, 2= hohe Lymphozytendichte

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 70

In Abbildung 22 ist die Dichte der Lymphozyten in der weißen Milzpulpa der verschiedenen

Versuchsgruppen dargestellt. Das Diagramm zeigt einen signifikanten Unterschied der

Pulpafülle zwischen der Gruppe WT Laparotomie 8 h (1,70 ± 0,15) und der Gruppe WT

Ischämie-Reperfusion 48 h (1,00 ± 0,00) (p<0,05). Die Lymphozytendichte der Gruppe WT

Laparotomie 48 h (1,50 ± 0,17) ist signifikant höher als die der Gruppe WT Ischämie-

Reperfusion 48 h (1,00 ± 0,00) (p<0,05).

Ergebnisse 71

5.3.9 Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli

Abbildung 23: Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM, A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= wenig gefüllte Glomeruli 2= stark gefüllte Glomeruli

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 72

Abbildung 23 zeigt die Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli der verschiedenen

Versuchstiergruppen. Sowohl in der Gruppe WT Laparotomie 8 h (1,70 ± 0,11) als auch in

der Gruppe WT Laparotomie 48 h (1,95 ± 0,05) ist eine signifikant stärkere Dichte der Zellen

im Vergleich zur Gruppe WT Ischämie-Reperfusion 8 h (1,10 ± 0,10) festzustellen (p<0,05).

Auch zwischen den Gruppen WT Ischämie 4 h (1,80 ± 0,08) und WT Ischämie-Reperfusion 8

h (1,10 ± 0,10) ist einen signifikanter Unterschied zu beobachten (p<0,05). Die

Mesangiumzelldichte der Tiere der Gruppe WT Laparotomie 48 h (1,95 ± 0,05) ist signifikant

höher als die der Gruppe T--Laparotomie 48 h (1,29 ± 0,19) (p<0,05).

Ergebnisse 73

5.3.10 Granulozyteninfiltration in die Nieren

Abbildung 24: Granulozyteninfiltration in die Nieren der verschiedenen Versuchsgruppen (histologische Untersuchung: 3µm dickes Präparat, HE gefärbt), Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere, Scoresystem: 0= ohne besonderen Befund, 1= geringgradige Granulozyteninfiltration 2= mittel- bis hochgradige Granulozyteninfiltration

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Lap. 8 h Lap. 48 h

Scor

e

A

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

Scor

e

B

Ergebnisse 74

Abbildung 24 zeigt die Granulozyteninfiltration in die Nieren der verschiedenen

Versuchsgruppen. Größtenteils konnten keine Zellinfiltrationen beobachtet werden, bei

einigen Tieren konnten geringgradige Veränderungen festgestellt werden. Signifikante

Unterschiede waren hierbei nicht zu ermitteln.

Ergebnisse 75

5.4 Zytokine

5.4.1 IFN-γ-Konzentration

Abbildung 25: IFN-γ-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM, A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere

0

5

10

15

20

25

Lap. 8 h Lap. 48 h

pg/m

l

A

0

5

10

15

20

25

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

pg/m

l

B

Ergebnisse 76

Abbildung 25 zeigt die INF-γ-Konzentration der verschiedenen Versuchsgruppen. Es konnte

nur zwischen der Gruppe Laparotomie 48 h (9,14 ± 3,14) und der Gruppe T-Laparotomie 48 h

(0,00 ± 0,00) ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) festgestellt werden.

Ergebnisse 77

5.4.2 IL-12-Konzentration

Abbildung 26: IL-12-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM, A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere

0

5

10

15

20

25

30

35

Lap. 8 h Lap. 48 h

pg/m

l

A

0

5

10

15

20

25

30

35

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

pg/m

l

B

Ergebnisse 78

Abbildung 26 zeigt die IL-12-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen.

Nur innerhalb der T--Knockout-Mäuse sind signifikante Unterschiede festzustellen. Die IL-

12-Konzentration der Gruppe T--Laparotomie 8 h (24,98 ± 6,65) ist signigfikant höher als die

der Gruppen T--Laparotomie 48 h (0,00 ± 0,00) und T--Ischämie/Reperfusion 8 h (4,52 ±

4,52) (p<0,05).

Ergebnisse 79

5.4.3 TNF-α-Konzentration

Abbildung 27: TNF-α-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM, A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Lap. 8 h Lap. 48 h

pg/m

l

A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

pg/m

l

B

Ergebnisse 80

Abbildung 27 zeigt die TNF-α-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen.

Hierbei fällt ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen Laparotomie 48 h

(16,22 ± 5,49) und T--Laparotomie 48 h auf (0,00 ± 0,00) (p<0,05). Die Zytokinkonzentration

im Serum der Mäuse der Gruppe Ischämie/Reperfusion 8 h (72,41 ± 22,90) ist signifikant

höher (p<0,05) als die Konzentration der Gruppe Laparotomie 8 h (9,54 ± 4,97). Auch

zwischen den Gruppen Ischämie/Reperfusion 8 h (72,41 ± 22,90) und Ischämie/Reperfusion

48 h (15,48 ± 5,51) besteht ein statistisch signifikanter Unterschied(p<0,05). Weiterhin

konnte festgestellt werden, dass die TNF-α-Konzentration der Gruppe T--Laparotomie 8 h

(22,58 ± 7,17) signifikant höher war (p<0,05) als die der Gruppe T--Laparotomie 48 h (0,00 ±

0,00).

Ergebnisse 81


Abbildung 28: IL-6-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM , A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind in Tabelle 4 dargestellt, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Lap. 8 h Lap. 48 h

pg/m

l

A

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

pg/m

l

B

Ergebnisse 82


Aufgrund der großen Anzahl statistisch signifikanter Unterschiede (p<0,05) werden diese in

Tabellenform dargestellt (siehe Tabelle 4)und nicht in die Diagramme eingezeichnet.

WT T- F-

Lap 8h

Lap 48h

I 4h

I/R 8h

I/R48h

Lap8h

Lap48h

I 4h

I/R8h

I/R48h

Lap 8h

Lap 48h

I 4h

I/R8h

I/R48h

Lap 8h x

Lap 48h

I 4h x x I/R 8h x x

WT

I/R 48h x x

Lap 8h x

Lap 48h x x

I 4h x x x I/R 8h x

T-

I/R 48h x

Lap 8h x x

Lap 48h x

I 4h x I/R 8h x

F-

I/R 48h x

Tabelle 4: Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) der IL-6-Konzentration im Serum der Versuchstiere, ermittelt anhand des Student`s t-test, Lap= Laparotomie, I= Ischämie, I/R= Ischämie-Reperfusion, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, WT= Wildtyp, T- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI, F- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, X= statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05)

Ergebnisse 83


Abbildung 29: IL-10-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind durch Linien miteinander verbunden, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere

0

5

10

15

20

25

Lap. 8 h Lap. 48 h

pg/m

l

A

0

5

10

15

20

25

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

pg/m

l

B

Ergebnisse 84


Zwischen den Gruppen F--Ischämie 4 h (12,10 ± 3,93) und F--Ischämie/Reperfusion 48 h

(1,93 ± 1,93) liegt ein statistisch signifikanter Unterschied vor (p<0,05). Die IL-10-

Konzentration der Gruppe Laparotomie 48 h (6,52 ± 2,23) ist signifikant (p<0,05) höher als

die der Gruppe T--Laparotomie 48 h (0,00 ± 0,00).

Ergebnisse 85

5.4.6 MCP-1-Konzentration

Abbildung 30: MCP-1-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen, Angabe von Mittelwerten und SEM A= Laparotomie-Gruppen, B= Ischämie- und Ischämie/Reperfusions-Gruppen = WT = T- = F-, Lap.= Laparotomie, I/R= Ischämie/Reperfusion, Isch.= Ischämie, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, T-= Knockoutmäuse für den TNF-RI, F-= Knockoutmäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05) sind in Tabelle 5 dargestellt, ----- = Normalwerte der Kontrolltiere

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Lap. 8 h Lap. 48 h

pg/m

l

A

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Isch. 4 h I / R 8 h I / R 48 h

pg/m

l

B

Ergebnisse 86

Abbildung 30 zeigt die MCP-1-Konzentration im Serum der verschiedenen Versuchsgruppen.

Aufgrund der großen Anzahl statistisch signifikanter Unterschiede (p<0,05) werden diese in

Tabellenform (siehe Tabelle 5) dargestellt und nicht in die Diagramme eingezeichnet.

WT T- F-

Lap 8h

Lap 48h

I 4h

I/R 8h

I/R48h

Lap8h

Lap48h

I 4h

I/R8h

I/R48h

Lap 8h

Lap 48h

I 4h

I/R8h

I/R48h

Lap 8h x

Lap 48h x x x

I 4h x I/R 8h x

WT

I/R 48h

Lap 8h x x

Lap 48h

I 4h x x I/R 8h x

T-

I/R 48h

Lap 8h x

Lap 48h x x

I 4h x I/R 8h x x

F-

I/R 48h

Tabelle 5: Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) der MCP-1-Konzentration im Serum der Versuchstiere, ermittelt anhand des Student`s t-test, Lap= Laparotomie, I= Ischämie, I/R= Ischämie-Reperfusion, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, WT= Wildtyp, T- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI, F- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII, X= statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05)

Ergebnisse 87

5.5 Mortalität

Nr. Gruppe n gesamt n verstorben (%) n überlebend (%)

1 Nullwert 6 0 (0%) 6 (100%)

2 WT Lap. 8 h 10 0 (0%) 10 (100%)

3 WT Lap. 48 h 11 1 (9,1%) 10 (90,9%)

4 WT Isch. 4 h 11 1 (9,1%) 10 (90,9%)

5 WT I/R 8 h 14 4 (28,6%) 10 (71,4%)

6 WT I/R 48 h 16 5 (31,3%) 11 (68,7%)

7 F-- Lap. 8 h 7 1 (14,3%) 6 (85,7%)

8 F-- Lap. 48 h 9 1 (11,1%) 8 (88,9%)

9 F-- Isch. 4 h 7 1 (14,3%) 6 (85,7%)

10 F-- I/R 8 h 8 1 (12,5%) 7 (87,5%)

11 F-- I/R 48 h 8 2 (25%) 6 (75%)

12 T-- Lap. 8 h 5 0 (0%) 5 (100%)

13 T-- Lap. 48 h 7 0 (0%) 7 (100%)

14 T-- Isch. 4 h 8 2 (25%) 6 (75%)

15 T--I/R. 8 h 6 0 (0%) 6 (100%)

16 T--I/R. 48 h 6 0 (0%) 6 (100%)

Tabelle 6: Mortalität in den verschiedenen Versuchsgruppen in absoluten Zahlen und Prozentwerten. n = Anzahl der Tiere, Lap= Laparotomie, I= Ischämie, I/R= Ischämie-Reperfusion, x h= x Stunden nach Operationsbeginn, WT= Wildtyp, T- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI, F- = Knockout-Mäuse für den TNF-RI und den Fcγ-RIII

Ergebnisse 88

Es konnten keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf die Mortalitätsraten (siehe

Tabelle 6) festgestellt werden. Auffällig ist jedoch eine hohe Sterblichkeit in den Gruppen

WT I/R 8 h und 48 h (28,6% und 31,3%) im Vergleich zu den entsprechenden Gruppen der

T--Tiere (0%).

Diskussion 89

6 Diskussion

Bereits seit Mitte der 70er Jahre sind bei Traumapatienten das SIRS und das MODS als

Spätkomplikationen gefürchtet. Da trotz intensiver Forschung bis heute keine

zufriedenstellende Therapie dieser Syndrome entwickelt werden konnte, stellen sie weiterhin

die führende Todesursache auf chirurgischen Intensivstationen dar (RANGEL-FRAUSTO

1995). Die Behandlungsmöglichkeiten beschränken sich somit auf die symptomatische

Therapie und ein bestmögliches intensiv-medizinisches Management.

Im Rahmen eines Traumas kommt es häufig in Folge einer Hypovolämie aufgrund starker

Blutungen zu einem Ischämiezustand mit anschließender Reperfusion, die durch das

Auffüllen des Gefäßsystems mit Infusionslösung während der Rettung oder des

anschließenden Klinikaufenthaltes herbeigeführt wird. Außerdem kann eine

Gefäßkonstriktion oder -ruptur aufgrund von Frakturen eine Ischämie auslösen. Um eine

derartige Situation und deren Auswirkungen bei Mäusen zu imitieren, wurde in der

vorliegenden Arbeit ein Ischämie-Reperfusionsversuch der unteren Extremitäten durch

Abklemmen der Aorta abdominalis vorgenommen. Zum Schutze des Organismus bewirkt ein

traumatisches Ereignis die Aktivierung des Immunsystems (REGEL 1989). Primär werden

dabei lokal besonders die Zytokine TNF-α und IL-1β freigesetzt, welche unter anderem die

sekundäre Sekretion von IL-6 bewirken. Werden diese proinflammatorischen Zytokine jedoch

nicht nur lokal, sondern auch systemisch sezerniert, kommt es zu einer überschießenden

Inflammationsreaktion des gesamten Organismus (BONE 1996b;DAVIES 1997). Hieraus

entwickelt sich ein SIRS, welches schließlich durch die sekundäre Beeinträchtigung

verschiedener Organsysteme in einem MODS enden kann. Auch eine gegenregulierende

antiinflammatorische Immunantwort mit gesteigerter IL-10-Produktion kann die ausgelöste

Entzündungsreaktion häufig nicht mehr in ein physiologisches Maß eindämmen. In einigen

Fällen kann es jedoch zu einem Überschießen der antiinflammatorischen Reaktion kommen,

welche als CARS bezeichnet wird und mit erhöhter Gefahr der Entstehung einer Sepsis

einhergeht.

TNF-α ist ein sehr potentes proinflammatorisches Zytokin, welches von Monozyten,

Makrophagen und T-Lymphozyten sezerniert wird. Besonders über den TNF-Rezeptor I ist

Diskussion 90

dieses Zytokin an der Inflammationsreaktion beteiligt. Geringe TNF-α-Mengen sind für eine

adäquate Immunantwort unabdingbar, dauerhaft erhöhte Werte schädigen den Organismus

jedoch nachhaltig. Grund hierfür ist die Tatsache, dass TNF-α eine vermehrte Expression

zellulärer Adhäsionsmoleküle der Endothelzellen (ICAM, ELAM, E-Selektin) und eine

gesteigerte Permeabilität des Gefäßendothels bewirkt (BRETT 1989; MULLIGAN 1993).

Neutrophile Granulozyten können dadurch leicht aus dem Gefäßbett in das umliegende

Gewebe auswandern und schädigen dies durch die Reaktionsprodukte des respiratory burst.

Zusätzlich bewirkt TNF-α eine verstärkte Freisetzung von IL-1, IL-6 und IL-8 aus den

Endothelzellen, welche wiederum eine proinflammatorische Wirkung aufweisen (LOPPNOW

1989; NAWROTH 1986a). Auf den eingewanderten neutrophilen Granulozyten befinden sich

unter anderem Fcγ-Rezeptoren, die den Fc-Teil des Immunglobulins G binden und somit ein

wichtiges Element für die Verbindung der humoralen und der zellulären Abwehr darstellen.

Die Degranulation und Phagozytose der Granulozyten werden hauptsächlich über die Fcγ-RI

und Fcγ-RIII vermittelt. HELLER et al. (1999) zeigten anhand von F--Mäusen, bei denen

experimentell eine Immunkomplex-Peritonitis ausgelöst wurde, dass die Migration

neutrophiler Granulozyten in die Bauchhöhle bei diesen Tieren gegenüber Wildtypen

unbeeinträchtigt ist. Weiterhin konnte dabei aber eine geringere TNF-Sekretion beobachtet

werden, da diese besonders durch die Bindung von Immunglobulin an den Fcγ-RIII vermittelt

wird (HELLER 1999).

Die oben beschriebenen Tatsachen bestätigen die zentrale Rolle der neutrophilen

Granulozyten bei der Entstehung der sekundären Organschäden im Verlaufe eines SIRS

(VAN GRIENSVEN 1999a; VAN GRIENSVEN 2003). In der vorliegenden Arbeit wurde mit

Hilfe von Knockout-Tieren die Rolle der Rezeptoren TNF-RI und Fcγ-RIII und deren Einfluß

auf die posttraumatische Situation der Versuchstiere ermittelt.

Mit Hilfe eines Ischämie-Reperfusionsversuchs der unteren Extremitäten wurde in der

vorliegenden Arbeit an Mäusen ein Trauma imitiert und so ein reproduzierbarer

Lungenschaden hervorgerufen. SEEKAMP et al. (1993, 1994) nahmen ein entsprechendes

Versuchsmodell an Ratten vor.

Diskussion 91

Die im folgenden Teil der Arbeit diskutierten Ergebnisse sind jedoch nur unter Vorbehalt zu

interpretieren. Grund hierfür ist der Vergleich von rein-stämmigen Kontrolltieren mit

gemischt-stämmigen Knockout-Versuchstieren. Demnach ist es durchaus möglich, dass die

Ergebnisse nicht durch das Fehlen bestimmter Gene, sondern durch den Stammunterschied

hervorgerufen wurden. Diese Tatsache ist bei allen Parametern zu beachten.

6.1 Lungenpermeabilität

Um den Grad der Lungenschädigung quantifizieren zu können, sind verschiedene Methoden

bekannt. Heute wird besonders die Bestimmung des relativen Proteingehaltes der BAL in

Kombination mit der Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten mittels Histologie oder

MPO-Messung genutzt. Nach PETERSON (1992) ist die Verwendung zweier

unterschiedlicher Methoden ausreichend, um eine pathophysiologisch signifikante

Veränderung der endothelialen Permeabilität in vivo nachzuweisen. Die pulmonale

Proteinextravasation und deren Quantifizierung durch eine BAL mit Berechnung des relativen

Proteingehaltes wurde sowohl in Klein- als auch in Großtiermodellen hinreichend validiert

(KLAUSNER 1989; SEEKAMP 1993b). Werte von 0,1 bis 0,2 gelten hierbei als

physiologisch, liegen sie jedoch über 0,7, so gilt dies als Nachweis für eine defekte

Kapillarpermeabilität in vivo.

Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Werte aller Gruppen lagen zwar unter dem

pathologischen Grenzwert von 0,7, jedoch war ein Unterschied zwischen den Wildtyp-Tieren

und den Knockout-Tieren festzustellen.

Innerhalb der Wildtyp-Gruppen ist der Proteingehalt der Gruppe Ischämie 4 h am niedrigsten.

Die I/R-Gruppen hingegen zeigen deutlich jedoch nicht signifikant erhöhte Werte. Diese

Beobachtung bestätigt, dass die Lungenfunktion nicht durch die Ischämie, sondern erst durch

eine nachfolgende Reperfusion geschädigt wird (WELBOURN 1991b).

Betrachtet man die Laparotomie- und I/R-Gruppen der WT, so stellt man fest, dass der

Proteingehalt in der BAL im zeitlichen Verlauf im Vergleich zu den 8 h Werten nach jeweils

48 h bereits wieder abgenommen hat. Diese Tatsache ist dadurch zu erklären, dass zwar eine

Schädigung des pulmonalen Endothels vorliegt, die aber durch Regenerationsmaßnahmen zu

Diskussion 92

beheben ist. Die Integrität und Funktionsfähigkeit des Gefäßbettes ist somit wieder

hergestellt.

Die Werte der I/R-Gruppen der T-- und F--Tiere sind deutlich niedriger als die der

entsprechenden WT-Gruppen. Diese Unterschiede sind statistisch jedoch nicht signifikant.

Das Fehlen des TNF-RI scheint einen protektiven Einfluß vor einer Erhöhung der

Lungenpermeabilität zu haben. Bestärkt wird diese Vermutung durch die Feststellung von

VAN GRIENSVEN (1999), wonach die pulmonale Endothelpermeabilität bei einem In-vitro-

Versuch durch TNF-α gesteigert werden kann. Es besteht allerdings die Möglichkeit, dass die

unterschiedlichen Werte durch die verschiedenen Stämme der Versuchs- und Kontrolltiere

verursacht wurden.

Da sich die Werte der F--Gruppen nur unwesentlich von denen der anderen Knockout-Tiere

unterscheiden, kann in diesem Falle kein synergistischer oder additiver Effekt beim

zusätzlichen Fehlen des Fcγ-Rezeptors beobachtet werden.

6.2 Myeloperoxidaseaktivität und Granulozyteninfiltration des Lungengewebes

Nach ALLAN et al. (1985) ist eine Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten mittels

MPO-Messung sensitiver und bezogen auf das gesamte Lungengewebe repräsentativer als

eine Auszählung der PMN in einem histologischen Präparat. Der Nachteil einer

histologischen Beurteilung ist, dass nur jeweils ein kleiner Ausschnitt des Organs bewertet

werden kann.

Die Myeloperoxidaseaktivität im Lungengewebe der Versuchstiere zeigte in der vorliegenden

Arbeit größtenteils keine deutlichen Unterschiede. Bei den Wildtyp-Tieren sind

erwartungsgemäß die Werte der I/R-Gruppen geringgradig höher als die der

Laparotomiegruppen. Verursacht wird dies durch eine Aktivierung der neutrophilen

Granulozyten aufgrund des Reperfusionsreizes und einem Auswandern dieser Zellen in das

pulmonale Gewebe. Der Abfall der MPO-Aktivität im zeitlichen Verlauf der I/R-Gruppen

wird begründet durch die kurze Halbwertszeit der neutrophilen Granulozyten im Gewebe von

Diskussion 93

circa 12-24 Stunden. Somit ist ein Großteil der Zellen nach 48 h bereits nicht mehr

vorhanden.

Für die T--Tiere wurden ähnliche Werte festgestellt wie für die entsprechenden Gruppen der

WT-Tiere. Auch bei den F--Tieren ist ein Abfall der Werte im zeitlichen Verlauf der I/R-

Gruppen zu beobachten und kann wie bei den WT-Tieren mit einem Zerfall der neutrophilen

Granulozyten nach circa einem Tag begründet werden.

Bei einer Myeloperoxidasebestimmung nach dieser Methode muss jedoch immer bedacht

werden, dass es zu Abweichungen kommen kann, da die Gewebeprobe gesamthaft in die

Messung eingeht und somit nicht nur die Granulozyten gemessen werden, die sich im

Parenchym befinden, sondern auch jene, die noch im Gefäßbett enthalten sind. Um einer

Verfälschung der Ergebnisse aufgrund dieser Tatsache vorzubeugen, müsste das Gefäßsystem

der Lunge nach der Entnahme des Organs perfundiert werden. Die Bewertung der Ergebnisse

sollte deshalb immer unter Berücksichtigung der histologischen Auszählung der neutrophilen

Granulozyten erfolgen. Auch in der vorliegenden Arbeit können Abweichungen zwischen der

histologischen Auswertung und der MPO-Messung beobachtet werden. In diesem Falle sollte

der Histologie eine größere Beachtung zukommen, da es sich um die tatsächlich im Gewebe

vorkommenden neutrophilen Granulozyten handelt. Hierbei ist eine Abnahme der Zellen im

Lungengewebe beider Knockout-Stämme gegenüber der WT-Tiere zu bemerken.

Erwartungsgemäß zeigen die Wildtyp-Tiere der I/R-Gruppen gegenüber den laparotomierten

Tieren eine stärkere Granulozyteninfiltration. Diese Tatsache bestätigt die Schlüsselrolle der

neutrophilen Granulozyten bei der Entstehung eines Ischämie-Reperfusionsschadens

(FUJISHIMA 1995). Da die Halbwertszeit dieser Zellen im Gewebe allerdings nur circa 24 h

beträgt, ist 48 Sunden nach der Reperfusion die Granulozytenzahl bereits deutlich gesunken.

Vergleicht man nun die beiden Knockout-Gruppen I/R 8 h mit der Gruppe WT-I/R 8 h, so

fällt jeweils eine statistisch signifikant geringere Granulozyteninfiltration in das

Lungengewebe auf. Es ist wahrscheinlich, dass der TNF-α bei den T--Tieren seine biologische

Funktion nicht ausüben kann, da der TNF-Rezeptor I bei diesen Knockout-Mäusen nicht

existent ist. TNF-α bewirkt normalerweise in Kombination mit IL-1 eine gesteigerte

Endothelpermeabilität (BRETT 1989) und eine erhöhte Expression zellulärer

Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, ELAM-1, E-Selektin) der Endothelzellen (MULLIGAN 1993).

Das L-Selektin ist ein wichtiges Molekül beim initialen Schritt des Migrationsprozesses der

Diskussion 94

neutrophilen Granulozyten (“Rolling“) in das Gewebe. Nach dem Verringern der

Fließgeschwindigkeit des Blutes bewirkt es eine transiente Adhäsion der Granulozyten, indem

es eine Bindung mit dem neutrophilen L-Selektin eingeht (ANDERSON 1987). Auch die

immunglobulinähnlichen Adhäsionsmoleküle (ICAM, ELAM) spielen bei den nun folgenden

Migrationsschritten eine wichtige Rolle, da sie die endothelialen Liganden für das neutrophile

β2-Integrin darstellen (SMITH 1989). Können die beschriebenen Prozesse bei den T--Tieren

aufgrund des Gendefektes jedoch nicht oder nur in verringerter Form ablaufen, so wird eine

Einwanderung der neutrophilen Granulozyten wirkungsvoll verhindert. BURNE et al. (2001)

zeigten allerdings mit Hilfe von IL-1-RI- und TNF-RI-Knockout-Tieren, dass es einen IL-1

und TNF unabhängigen Weg für die gesteigerte Expression von ICAM-1 und VCAM-1 nach

Ischämie-Reperfusion geben muß. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch ein positiver

Effekt auf die Verhinderung der Granulozyteninfiltration in die Lunge durch das Fehlen des

TNF-RI bemerkt werden. Erneut muss jedoch darauf hingewieden werden, dass es sich um

einen Effekt handeln kann, der durch das Vergleichen verschieden-stämmiger Tiere

hervorgerufen sein kann.

GRUTKOSKI et al. (2002) beschrieben einen hemmenden Effekt von neutrophilen

Granulozyten, die mit TNF-α stimuliert wurden, auf die Migration und Funktion anderer

neutrophiler Granulozyten, auch wenn die Zellen nicht in direktem Kontakt zueinander

standen. Es wird vermutet, dass TNF-α an einer negative feedback-Funktion beteiligt ist. Die

geringere Infiltration der PMN in der vorliegenden Arbeit könnte auf eine derartige

Hemmung zurückzuführen sein.

Auffallend ist jedoch, dass die Anzahl der Zellen 48 h nach der Reperfusion deutlich höher ist

als nach 8 h. Es ist bekannt, dass der TNF-α das primär freigesetzte Zytokin nach einem

traumatischen Einfluß auf den Organismus ist (VAN GRIENSVEN 2003). Der TNF bewirkt

daraufhin sehr schnell die Sekretion anderer proinflammatorischer Zytokine wie zum Beispiel

IL-1 und IL-6. Kann der TNF-α aufgrund des Genotyps der Knockout-Mäuse jedoch seine

proinflammatorische Funktion nicht ausüben, so muß die Aktivierung der Kaskade zur

Freisetzung anderer Zytokine über Kollateralwege erfolgen. Diese Umwege nehmen mehr

Zeit in Anspruch und auch die Infiltration der neutrophilen Granulozyten in das

Lungengewebe ist dadurch verlangsamt. Dies wird in der vorliegenden Arbeit durch die

vermehrte Anzahl von neutrophilen Granulozyten im Lungengewebe beider Knockout-Sämme

Diskussion 95

48 h nach Reperfusion verdeutlicht. Wie bereits in 2.2 beschrieben, bewirkt diese vermehrte

Infiltration die Ausbildung eines stärkeren Ödems.

Die Werte für die F--Tiere haben das gleiche Muster wie die der T--Tiere, sind jedoch

geringgradig höher. Demnach kann von einem minimal synergistischen Effekt beim

zusätzlichen Fehlen des Fcγ-RIII in Bezug auf die Granulozyteninfiltration gesprochen

werden.

6.3 Lungenödem

Bei den WT-Tieren ist innerhalb der I/R-Gruppen ein deutlich stärkeres Lungenödem im

Vergleich zu den Laparotomie-Gruppen festzustellen. Diese Beobachtung bestätigt die

Tatsache, dass eine Ischämie, gefolgt von einer Reperfusion, einen sekundären

Lungenschaden bedingt (SEEKAMP 1993b). Dabei spielt es keine Rolle, welcher Bereich des

Körpers von der Ischämie betroffen war (DUBAYBO 1988; GOLDMAN 1992). Im Verlauf

der Reperfusion werden Zytokine freigesetzt, die unter anderem auf das Endothel der Gefäße

einwirken und eine Permeabilitätserhöhung bewirken (VAN GRIENSVEN 1999a).

Infolgedessen kommt es zu einer verstärkten Extravasation von Zellen, Blutbestandteilen und

Flüssigkeit ins Gewebe.

Die Ausprägung des Lungenödems ist bei beiden Knockout-Stämmen deutlich geringer als bei

den Wildtypen. Einige dieser Unterschiede waren statistisch signifikant. Auch in diesem Falle

muss jedoch der unterschiedliche genetische Hintergrund der Versuchs- und Kontrolltiere

beachtet werden. Es ist bekannt, dass TNF-α im Zusammenspiel mit IL-1 die

Endothelpermeabilität steigert (VAN GRIENSVEN 1999a). Zusätzlich bewirkt es eine

vermehrte Expression der zellulären Adhäsionsmoleküle der Endothelzellen. Vermutlich ist

das weniger stark ausgeprägte Lungenödem der T--Tiere durch eine Verringerung der

Endothelpermeabilität und eine geringere Infiltration von neutrohpilen Granulozyten in das

umgebende Gewebe bedingt, da der TNF-α zwar im Körper vorhanden ist, er jedoch nicht an

den TNF-RI binden kann und somit keine Wirkung hat. Zusätzlich konnte anhand der

Zytokinmessung gezeigt werden, dass neben der Wirksamkeit auch die Produktion des TNF-α

Diskussion 96

bei den Knockout-Tieren deutlich vermindert ist. So ist der Zytokinwert der WT-Tiere 8 h

nach I/R fast 6 mal höher (T-) bzw. fast 3 mal höher (F-) als der der Knockout-Tiere.

Auffällig ist allerdings, dass die Gruppen I/R 48 h der Knockout-Tiere ein stärkeres

Lungenödem aufweisen als die Gruppen I/R 8 h. Ursache hierfür kann die stärkere

Granulozyteninfiltration bei diesen Gruppen sein, was mit Hilfe der histologischen Präparate

und teilweise der MPO-Messung gezeigt werden konnte. Die Infiltration dieser Zellen führt

aufgrund der bereits beschriebenen Steigerung der Endothelpermeabilität und der Schädigung

des Lungenparenchyms zu einer Ödembildung. Für die Knockout-Tiere kann somit eine

Verschlimmerung des Krankheitsbildes im zeitlichen Verlauf nach Ischämie-Reperfusion

beobachtet werden. Möglich ist eine langsamere Infiltration der neutrophilen Granulozyten

nach dem Reperfusionsreiz, da der TNF-RI bei beiden Knockout-Stämmen nicht vorhanden

ist. TNF-α wird üblicherweise nach einem Trauma primär freigesetzt und bewirkt die

Sekretion anderer proinflammatorischer Zytokine wie IL-1 und IL-6 (VAN GRIENSVEN

2003). Kann diese Kaskade jedoch aufgrund des Gendefektes nicht ablaufen, so muss eine

Aktivierung der sekundär sezernierten Zytokine auf einem Umweg, der mehr Zeit in

Anspruch nimmt, erfolgen. Die Granulozyteninfiltration ist daher verzögert. BURNE et al.

(2001) konnten mit Hilfe von B6;129S-Tnfrsf1atm1imx Il1r1tm1lmx-Mäusen zeigen, dass es für

die Infiltration von neutrophilen Granulozyten einen IL-1- und TNF-α-unabhängigen Weg

geben muß. Möglicherweise ist auch dieser Weg langsamer als eine Aktivierung der Zellen

über den TNF-α.

6.4 Leberödem

Bei der Betrachtung der Stärke des Leberödems ist auffällig, dass jeweils die Ischämie 4 h-

Gruppen die höchsten Werte innerhalb der verschiedenen Typen aufwiesen. Ein möglicher

Grund hierfür ist der durch die Ischämie herbeigeführte hypoxische Zustand, in dem sich die

Leber befindet. Das Setzen der Ligatur bewirkt eine Beeinträchtigung der Blutzirkulation.

Somit entsteht ein intrahepatischer Blutstau, der einen erhöhten hydrostatischen Druck in den

Kapillargefäßen bewirkt. Zusätzlich läuft aufgrund des Sauerstoffmangels ein anaerober

Stoffwechsel ab, der sowohl das Leberparenchym als auch das Kapillarendothel schädigt.

Diskussion 97

Eiweißreiche Flüssigkeit ist so in der Lage, die Gefäßwände zu passieren und sammelt sich in

Form von Ödemflüssigkeit im interstitiellen Raum. Des weiteren treten zelluläre Bestandteile

aus den Blutgefäßen aus, was den osmotischen Effekt im Gewebe und die Ödembildung

zusätzlich steigert.

Wird die Ischämie von einer Reperfusion gefolgt, so ist eine Abnahme des Leberödems bei

allen Maus-Stämmen zu beobachten. Die bereits nach 8 h verringerten Werte zeigen nach 48

h nochmals einen Abfall. Eine mögliche Erklärung für diese Tatsache ist, dass der Blutfluß

mit dem Durchtrennen der Ligatur wiederhergestellt ist und somit auch die Leber einer

physiologischen Durchblutung unterworfen wird. Während dieser Phase kommt es aufgrund

der aeroben Stoffwechselsituation zu Regenerationsmaßnahmen des Gefäßendothels. Die

interstitielle Ödemflüssigkeit wird nach und nach über das Lymphsystem abgeführt, wodurch

es im zeitlichen Verlauf zu einer kontinuierlichen Verbesserung kommt. Neben den

erwähnten hämodynamischen Kompensationsmechanismen sind auch zelluläre Faktoren

bekannt, die einen Abtransport der Ödemflüssigkeit bewirken (PILLER 1980). Hierbei

handelt es sich um Gewebsmakrophagen, welche die Fähigkeit besitzen interstitielle Proteine

zu phagozytieren, wodurch der osmotische Druck und damit auch die

Flüssigkeitsansammlung vermindert wird. Sekundärschäden, wie sie in der Lunge beobachtet

werden können, spielen in der Leber bei diesem Modell anscheinend eine untergeordnete

Rolle.

Auffällig ist, dass die T--Tiere ein geringeres Leberödem, die F--Tiere jedoch ein stärkeres

Ödem als die WT-Tiere aufweisen. Demnach bewirkt ein zusätzliches Fehlen des Fcγ-RIII

keine Verringerung, sondern eine Verstärkung des Ödems nach Ischämie-Reperfusion. Grund

hierfür ist bei diesen Gruppen wahrscheinlich die erhöhte Granulozyteninfiltration in die

Leber. Es ist bekannt, dass die Aktivierung der neutrophilen Granulozyten eine Schädigung

des Gefäßbettes und somit eine erhöhte Permeabilität hervorrufen. Zusätzlich wird das

Organparenchym durch die Stoffwechselprodukte (Sauerstoffradikale) migrierter Zellen

beeinträchtigt. Diese Faktoren führen zu einer Ödembildung in dem betroffenen Organ. Ein

weiterer Grund für das Auftreten eines stärkeren Leberödems bei den F--Tieren ist die

Tatsache, dass die oben beschriebene Phagozytose der interstitiellen Bestandteile aufgrund

des Fehlens des Fcγ-RIII auf Makrophagen und neutrophilen Granulozyten nicht stattfinden

Diskussion 98

kann. Ein wichtiger Kompensationsmechanismus für die Verringerung des Leberödems ist

dadurch ausgeschaltet.

6.5 Granulozyteninfiltration in die Leber

Innerhalb der WT-Gruppen ist eine ungefähr gleich starke Infiltration von nur wenigen

Granulozyten ins Lebergewebe zu beobachten. Lediglich der Wert der Gruppe I/R 8 h ist im

Vergleich zu den anderen WT-Gruppen geringgradig höher. Die Granulozyteninfiltration der

T--Tiere ist niedriger als die der entsprechenden WT-Gruppen. Auffallend ist, dass die Werte

der F--Tiere, ebenso wie bei der Beurteilung des Leberödems, deutlich über denen der WT

liegen. Nur die Gruppe F--I/R 48 h bildet hierbei eine Ausnahme. Vergleicht man die

Granulozyteninfiltration in das Lungengewebe mit der Infiltration ins Lebergewebe, so stellt

man ähnliche Werte für die WT- und T--Gruppen fest, bei den F--Gruppen fällt jedoch eine

größtenteils stärkere Zellmigration ins Lebergewebe auf. Wiederum muss beim Vergleich der

Knockout- mit den Kontrolltieren auf den unterschiedlichen genetischen Hintergrund

hingewiesen werden, wodurch es zu abweichenden Ergebnissen kommen kann.

Die Leber ist ein Organ, in dem besonders zahlreich Bestandteile des Reticulo-Endothelialen-

Systems vorhanden sind, welches bei den Wildtyp-Tieren mit dem Fcγ-RIII ausgestattet ist.

Fehlt dieser Rezeptor jedoch bei den Knockout-Mäusen, so kann die phagozytierende

Tätigkeit des Reticulo-Endothelialen-Systems nicht ausgeführt werden. Als

Ausweichmöglichkeit wird eine verstärkte Infiltration neutrophiler Granulozyten ins

Lebergewebe veranlasst. Die Stärke der Granulozyteninfiltration stimmt mit der Ausprägung

des Leberödems überein. Es ist bekannt, dass die neutrophilen Granulozyten durch die

Produkte des respiratory burst (Sauerstoffradikale) das Gefäßendothel schädigen und somit

eine gesteigerte Permeabilität hervorrufen (FUJISHIMA 1995). Demnach müssten jedoch die

F--Tiere geringere Werte für das Leberödem aufweisen, da der respiratory burst durch die

Abwesenheit des Fcγ-RIII stark gehemmt wird. Es liegt also nahe, dass für die Entstehung des

Ödems weitere Faktoren verantwortlich sind. Möglicherweise ist der Blutstau in Verbindung

mit der Hypoxie, welche durch die Ischämie herbeigeführt wird, ein Hauptgrund für die

Ödembildung.

Diskussion 99

Zu klären bleibt allerdings, warum die F--Tiere insgesamt eine deutlich höhere

Granulozyteninfiltration, die T--Tiere jedoch eine niedrigere Zellzahl als die WT-Tiere

aufweisen.

Der Abfall der Granulozytenanzahl nach jeweils 48 h kann dadurch erklärt werden, dass diese

Zellen im Gewebe eine geringere Halbwertszeit als im Blut haben. Sie beträgt circa 12 bis 24

Stunden. Nach 48 Stunden ist somit bereits ein großer Teil der Granulozyten nicht mehr im

Gewebe vorhanden.

6.6 Hydropische Degeneration der Leber

Die hydropische Degeneration ist eine Art der Zellschädigung, die besonders nach Hypoxie

auftritt. Es handelt sich dabei um einen gestörten Wasserstoffwechsel der Zelle, der sich

aufgrund eines mangelhaften Sauerstoffangebotes und einer energetischen Insuffizienz

entwickelt. Der sogenannte point of no return ist dabei überschritten und es entsteht eine

dauerhafte Beeinträchtigung der Zellfunktion, was zu einem programmierten Zelltod, der

Apoptose, führen kann. Die hydropische Degeneration ist ein langsamer Untergang von

Leberzellen, bei dem es durch einen Ausfall der Ionenpumpen zu einem Einstrom von Wasser

in die Zelle kommt. Durch das Ligieren der Aorta abdominalis wird die Leber in einen

Zustand der Minderversorgung sowohl mit sauerstoff- als auch mit energierreichem Blut

versetzt, wodurch die oben beschriebenen pathologischen Vorgänge ausgelöst werden.

Betrachtet man in der vorliegenden Arbeit die Stärke der hydropischen Degeneration in der

Leber, so fällt auf, dass die höchsten Werte bei allen Maus-Stämmen 48 Stunden sowohl nach

Laparotomie als auch nach I/R zu beobachten sind. Die stärkste Degeneration ist hierbei 48

Stunden nach Reperfusion zu beobachten ist. Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, dass

die hydropische Degeneration der Leber als ein typischer Spätschaden nach Ischämie-

Reperfusion beschrieben werden kann. Der TNF-RI und der Fcγ-RIII scheinen auf die Stärke

des Schadens keinen Einfluss zu haben.

RUDIGER und CLAVIEN (2002) zeigten an T--Mäusen, dass TNF-α ein wichtiges Zytokin

bei der Apoptoseinduktion von Leberzellen nach einer Ischämie dieses Organs darstellt. Auch

TIETZE et al. (2000) beobachteten bei erhöhten TNF-α-Werten eine verstärkte Apoptose von

Diskussion 100

Leberzellen. Für die Entstehung der hydropischen Degeneration nach Ischämie-Reperfusion

der unteren Extremitäten konnte diese Beobachtung jedoch nicht gemacht werden. In der

vorliegenden Arbeit war der Schaden sowohl bei den WT- als auch bei den Knockout-Tieren

etwa gleich stark. Begründet werden kann diese Tatsache mit der Beobachtung, dass

besonders das P-Selektin eine Schlüsselfunktion bei der Entstehung eines Leberschadens nach

Ischämie-Reperfusion dieses Organs einnimmt. Untersuchungen an Patienten mit einem

chronischen Leberschaden zeigten, dass das P-Selektin im Blut signifikant erhöht gegenüber

Kontrollpatienten war (TACKE 2003). Der TNF-α bewirkt zwar eine erhöhte Expression von

ICAM-1, ELAM-1 und E-Selektin, auf die Expression von P-Selektin hat er jedoch keinen

Einfluß (MULLIGAN 1993). Demnach ist durch das Fehlen des TNF-RI kein protektiver

Einfluss auf die Ausbildung eines Leberschadens in Form einer hydropischen Degeneration

nach Ischämie-Reperfusion zu erwarten.

Warum allerdings die laparotomierten WT-Tiere in der vorliegenden Arbeit eine sehr starke

Schädigung der Leber aufweisen, kann nicht erklärt werden.

6.7 Nekrosen, Lymphozytendichte und Abgrenzbarkeit der weißen von der roten Pulpa in der Milz

Bei der histologischen Beurteilung der Milznekrosen konnten keine signifikanten

Unterschiede festgestellt werden. Lediglich bei jeweils einem Tier in den Gruppen WT-Lap. 8

h und WT-I/R 8 h konnten nekrotische Veränderungen beobachtet werden. Dabei handelt es

sich um Zufallsbefunde. Das Ischämie-Reperfusions-Versuchsmodell hat demnach keinen

Einfluss auf die Entstehung von Nekrosen in diesem Organ. Ähnlich verhält es sich mit der

Abgrenzbarkeit der weißen von der roten Milzpulpa. Auch hier war lediglich bei einem Tier

die Abgrenzung nicht möglich. Es handelt sich demnach ebenfalls um einen Zufallsbefund.

Die Dichte der Lymphozyten in der weißen Pulpa variiert deutlich zwischen den einzelnen

WT-Gruppen. Hierbei sind statistisch signifikante Unterschiede festzustellen. Die Werte der

laparotomierten Wildtypen sind signifikant höher als die der Gruppe WT-I/R 48 h. Aufgrund

der Aktivierung des Immunsystems nach einem I/R-Zustand kommt es zu einer Migration der

Diskussion 101

Lymphozyten aus der Milz in das Blutgefäßsystem und somit zu einer Abnahme der Zellen in

den Lymphfollikeln.

Die Lymphozytendichte in den F--Gruppen variiert kaum. Die Werte der I/R-Gruppen sind

jedoch geringgradig niedriger als die der übrigen F--Tiere. Begründet werden kann diese

Tatsache ebenfalls durch die Aktivierung des Immunsystems nach erfolgtem I/R-Reiz. Dass

die Dichte der Lymphozyten bei den F--Tieren insgesamt niedriger als bei den WT-Mäusen

ist, bestätigt die Beobachtung von PASPARAKIS et al. (1997), wonach der TNF-RI eine

wichtige Rolle bei der Entstehung von Lymphfollikeln und Keimzentren in der Milz spielt.

Die I/R-Gruppen der T--Tiere zeigen jedoch eine höhere Lymphozytendichte in der Pulpa als

die Tiere der entsprechenden WT-Gruppen. Möglicherweise wird durch das Fehlen des TNF-

RI die inflammatorische Reaktion auf den Ischämie-Reperfusionsreiz derartig abgeschwächt,

dass es zu einer verminderten Aktivierung der Lymphozyten und damit zu einer geringeren

Mobilisierung dieser Zellen kommt. WITTWER (2001) beschrieb ein Ausbleiben oder eine

Verzögerung der spezifischen humoralen Immunantwort durch eine fehlende B-Zell-

Aktivierung bei T--Mäusen. Eine verstärkte Präsenz der Lymphozyten in der Milz nach I/R ist

auch in der vorliegenden Arbeit zu bemerken. Da jedoch auch den F--Tieren der TNF-RI

fehlt, wären hier ähnliche Ergebnisse zu erwarten gewesen. Die Werte dieser Tiere sind

jedoch niedriger als die der T--Tiere, das heißt, es hat eine stärkere Aktivierung und Migration

der Lymphozyten stattgefunden.

6.8 Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli und Granulozyteninfiltration in die Nieren

Es konnte nur bei wenigen Tieren eine geringgradige Infiltration von neutrophilen

Granulozyten in das Nierengewebe beobachtet werden, alle anderen Tiere zeigten in dieser

Hinsicht keine pathologischen Veränderungen. Signifikante Unterschiede konnten hierbei

nicht ermittelt werden.

Die Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli zeigte hingegen deutlichere Unterschiede.

Innerhalb der WT-Tiere konnten für die I/R-Gruppen signifikant niedrigere Werte als für die

laparotomierten und ischämischen Tiere beobachtet werden. Vergleicht man die Werte der

Diskussion 102

Mesangiumzelldichte der T--Tiere, so fällt auf, dass auch hier die Werte der I/R-Gruppen am

geringsten sind. Bei den F--Mäusen hingegen konnte die geringste Zelldichte sowohl bei der

Gruppe I/R 8 h als auch bei der Gruppe Laparotomie 48 h festgestellt werden. Die Niere ist

ein Organ, das ebenfalls durch den vorausgegangenen Ischämie-Reperfusions-Reiz der

unteren Extremitäten sekundär geschädigt wird. Die pathologischen Veränderungen sind

allerdings nicht so stark wie zum Beispiel in der Lunge oder der Leber. Hauptsächlich die

Glomeruli werden bei diesem Versuchsmodell beeinträchtigt. Die Hypoxie aufgrund der

eingeschränkten Blutzirkulation bewirkt eine Schädigung der Mesangiumzellen, die in einer

Apoptoseinduktion enden kann. Diese Veränderungen sind jedoch in der vorliegenden Arbeit

nur geringgradig. Es konnte weiterhin keine deutliche Beeinflussung der Parameter durch den

Genotyp der Versuchstiere festgestellt werden.

6.9 Zytokine

Der TNF-α ist ein Zytokin, das von Makrophagen, NK-Zellen und stimulierten neutrophilen

Granulozyten gebildet wird. Er wirkt als endogenes Pyrogen, erzeugt lokale Entzündungen

und bewirkt eine Aktivierung des Endothels, wodurch es zur Thromboseneigung und einer

gestörten Mikrozirkulation kommt. Die Störung des Blutflusses ist in Verbindung mit anderen

Faktoren ein Grund für die Entstehung des ARDS. Der TNF-α wirkt zusätzlich chemotaktisch

auf PMN und verstärkt deren Adhärenz mit dem Endothel, wodurch eine Auswanderung in

das Gewebe erleichtert wird. Weiterhin hat das Zytokin Einfluß auf die PMN-Funktion: Es

steigert die Zytotoxizität und Phagozytosefähigkeit dieser Zellen (BONAVIDA 1998;

OPPENHEIM JJ. 2001). All diese Tatsachen machen den TNF-α zu einem zentralen Zytokin

bei der Entstehung des I/R-Schadens. Die Auswirkungen des Fehlens des TNF-RI oder des

TNF-RI und Fcγ-RIII auf die Immunreaktion nach einem Ischämie-/Reperfusions-Reiz

wurden im Laufe dieser Arbeit ermittelt.

Neben den oben beschriebenen Einflüssen bewirkt der TNF-α eine Freisetzung anderer

proinflammatorischer Zytokine wie IL-1 und IL-6. Ein hoher IL-6 Wert inhibiert allerdings

die TNF-α Produktion, so dass hierbei von einer negativen Rückkopplung gesprochen werden

Diskussion 103

kann. IFNγ hingegen verstärkt die Bildung von TNF-α. Für eine physiologische

Immunantwort ist das Zytokin TNF-α unabdingbar.

In der internationalen Literatur wird beschrieben, dass aufgrund der Höhe des TNF-α-Wertes

eine Aussage über das Outcome eines Traumapatienten gemacht werden kann (SEEKAMP

1998). GEBHARD et al. (2000) können derartige Beobachtungen aufgrund einer von ihnen

durchgeführten Studie nicht bestätigen. Ihrer Meinung nach läßt sich innerhalb der ersten 24

Stunden kein Zusammenhang zwischen den TNF-α-Werten im Serum der Traumapatienten

und dem Schweregrad oder Schwerpunkt des Traumas herstellen.

In der vorliegenden Arbeit betragen die TNF-α Serum-Konzentrationen bei allen Gruppen

zwischen 0 pg/ml und 37,03 pg/ml. Einzige Ausnahme bildet hierbei die Gruppe I/R 8 h der

WT-Tiere, welche einen TNF-α-Wert von 72,41 pg/ml aufweist. Dieser ist gegenüber den

Konzentrationen anderer Gruppen signifikant erhöht. Die TNF-α Konzentration der T--Tiere

(12,80 pg/ml) und F--Tiere (25,89 pg/ml), die den gleichen Versuchsbedingungen ausgesetzt

waren, sind deutlich niedriger. Da der Normalwert der Kontrolltiere 0 pg/ml ist, kann man

erkennen, dass der TNF-α nach einer Laparotomie, besonders jedoch nach der Durchführung

einer Ischämie mit anschließender Reperfusion, gebildet wird. Die WT-Tiere sind in der I/R 8

h Gruppe deutlich stärker betroffen als die beiden verschiedenen Knockout-Stämme der

gleichen Gruppen. Bei der Beurteilung dieser Ergebnisse muss jedoch bedacht werden, dass

rein-stämmige Kontrolltiere mit gemischt-stämmigen Knockout-Tieren verglichen wurden

und es allein dadurch zu Unterschieden kommen kann. Da bei den T- und F--Tieren der TNF-

RI defizient ist, kann das gebildete Zytokin hier nicht in vollem Umfang die oben

beschriebenen Effekte hervorrufen, so dass von einem Schutz vor schädlichen Auswirkungen

ausgegangen werden kann. Die geringere Beeinträchtigung der Tiere beider Knockout-

Stämme zeigte sich in der vorliegenden Arbeit besonders anhand der Lungenmesswerte.

Hierbei fielen sowohl eine geringere Lungenpermeabilität als auch eine geringere

Granulozyteninfiltration und Ödembildung auf.

Beim IL-6 handelt es sich ebenfalls um ein sehr wichtiges proinflammatorisches Zytokin. Wie

bereits erwähnt, wird die IL-6 Produktion von TNF-α und IL-1 angeregt. Das Zytokin wird

hauptsächlich von Monozyten, Makrophagen, B- und T-Zellen und Endothelzellen freigesetzt.

Diskussion 104

IL-6 ist das zentrale Zytokin der acute-phase-response nach Trauma oder Infektion, das unter

anderem die Bildung der Akuten-Phase-Proteine in den Hepatozyten anregt. Des weiteren

bewirkt es eine Differenzierung und Aktivierung von B- und T-Zellen mit einer gesteigerten

Ig-Sekretion. Zusätzlich fördert es die Ausreifung hämatopoetischer Vorläuferzellen zu

Makrophagen und Granulozyten (OPPENHEIM JJ. 2001). Die IL-6 Antwort ist abhängig

vom Traumaschweregrad und stellt somit einen guten und frühen Marker für die Intensität

eines Traumas dar (GEBHARD 2000). Sind bei einem Patienten lang anhaltende sehr hohe

zirkulierende IL-6 Werte festzustellen, so sind diese mit Komplikationen und/oder einer

erhöhten Mortalität verbunden. TANIGUCHI et al. (1999) beschrieben, dass nicht die

absoluten Werte, sondern das Verhältnis von IL-6- zu IL-10-Konzentration entscheidend für

das Outcome eines Traumapatienten sei. Ein Anstieg der Ratio korreliere demnach mit einer

ungünstigen Prognose.

In der vorliegenden Arbeit sind die IL-6 Serumwerte der Kontrolltiere 0 pg/ml. Bereits 8 h

nach Laparotomie sind bei allen Versuchstier-Stämmen erhöhte Zytokinkonzentrationen von

bis zu 2847,53 pg/ml (T-) zu beobachten, welche im zeitlichen Verlauf jedoch wieder

abnehmen, so dass in den Laparotomie 48 h-Gruppen die Werte auf maximal 115,37 pg/ml

abgesunken sind. Besonders deutlich gestiegen ist die IL-6-Konzentration in der Gruppe WT

I/R 8 h. Der Wert von 22375,60 pg/ml ist im Vergleich zu den Knockout-Tieren (T-: 1656,58

pg/ml, F-: 1890,23 pg/ml) etwa um das 12-fache höher. Bereits 48 h nach I/R sind die Werte

aller drei Versuchstier-Stämme nur noch im niedrigen zweistelligen Bereich (zwischen 15,82

pg/ml (WT) und 29,52 pg/ml (T-)). Deutlich wird die Verbesserung der posttraumatischen

Situation der Versuchstiere zusätzlich durch das Absinken der Mortalitätsrate. Verstarben in

der Gruppe I/R 8 h bei den WT noch 28,6 % der Tiere, so sank die Zahl bei den F--Tieren um

etwa die Hälfte auf 12,5 %. Bei den T--Tieren fiel die Mortalitätsrate sogar auf 0 % ab. Erneut

muss darauf hingewiesen werden, dass Versuchstiere mit einem unterschiedlichen

genetischen Hintergrund miteinander verglichen werden.

Es kann demnach bestätigt werden, dass es sich bei dem Zytokin IL-6 um ein Protein handelt,

dessen Antwortstärke sich nach dem Traumaschweregrad richtet und hauptsächlich in der

akuten Phase der Immunantwort ausgeschüttet wird. Außerdem konnte beim Fehlen des TNF-

RI oder des TNF-RI und Fcγ-RIII eine deutlich geringere IL-6-Ausschüttung beobachtet

werden. Zu erklären ist diese Tatsache damit, dass der TNF-α, der bei den WT-Tieren eine

Diskussion 105

erhöhte IL-6-Produktion auslöst, durch das Fehlen des TNF-RI bei den Knockout-Tieren

keinen Angriffspunkt hat. Die „Produktions-Kette“ TNF-α → IL-1→ IL-6 → IL-10 ist somit

unterbrochen. Es ist demnach zu erwarten, dass auch die IL-10 Konzentration bei den

Knockout-Tieren herabgesetzt ist, oder erst zu einem späteren Zeitpunkt ansteigt, da die

Produktion auf Umwegen aktiviert werden muß. In den I/R-Gruppen konnte bei beiden

Knockout-Stämmen tatsächlich eine wesentlich geringere IL-10-Konzentration im Serum

festgestellt werden. Die Werte der laparotomierten Knockout-Tiere sind allerdings höher als

die der Wildtyp-Tiere. Eine Möglichkeit zur Herstellung der Zytokine IL-1, IL-6 und IL-10

trotz des vorhandenen Gendefektes besteht in der Aktivierung der sogenannten toll-like-

receptors. Sie befinden sich unter anderem auf Makrophagen, Granulozyten und

Dendritischen Zellen. Ihre Aufgabe besteht darin, Pathogene zu erkennen und daraufhin die

Produktion proinflammatorischer Zytokine wie IL-6, IL-12, IL-1, TNF-α und IFN-γ zu

induzieren (OZATO 2002).

Das IL-10 ist ein wichtiges antiinflammatorisches Zytokin, da es durch seine inhibitorische

Wirkung auf die Makrophagenfunktion eine Herunter-Regulation der Immunantwort

hervorruft. Zusätzlich verursacht IL-10 in TH1-Zellen eine Inhibition der IFNγ-Produktion.

Hauptsächlich T-Zellen und Makrophagen setzen es frei. Läuft eine Immunreaktion in

physiologischem Ausmaß ab, so wird, wie bereits oben beschrieben, zuerst TNF-α freigesetzt,

welches die Produktion weiterer proinflammatorischer Zytokine wie IL-1 und IL-6 anregt und

schließlich gleichzeitig eine Gegenregulation der Immunantwort durch die IL-10 Sekretion

auslöst (OPPENHEIM JJ. 2001).

Der Normalwert der Kontrolltiere für IL-10 in der vorliegenden Arbeit ist 0 pg/ml. Die

weiteren Ergebnisse zeigen, dass die IL-10 Konzentration besonders bei den WT 8 h nach I/R

ansteigt (16,40 pg/ml). Bei den Knockout-Tieren liegen die entsprechenden Werte hingegen

bei 0 pg/ml (T-) und 4,20 pg/ml (F-). Die Zytokin-Konzentration fällt 48 h nach I/R bei den

WT- und den T--Tieren ab. Anders hingegen verhält es sich bei den F--Tieren: Hier steigt der

Wert von 0 pg/ml auf 4,20 pg/ml. Es ist zu vermuten, dass die IL-10 Produktion bei den F--

Tieren im Vergleich zu den WT-Tieren durch das Fehlen der Rezeptoren in verringertem

Maße abläuft. Warum allerdings bei den T--Tieren erst 48 h nach dem I/R-Reiz eine IL-10

Sekretion meßbar ist, bleibt zu klären. Möglicherweise wird die IL-10 Freisetzung auf einem

Diskussion 106

anderen als dem oben beschriebenen Weg bewirkt, welcher mehr Zeit in Anspruch nimmt.

Erstaunlich ist jedoch, dass die F--Tiere, denen zusätzlich der Fcγ-RIII fehlt, mit einer

schnelleren IL-10 Produktion reagieren als die T--Tiere.

Beim Monocyte Chemotactic Peptide (MCP-1) handelt es sich um ein Zytokin, welches dem

IL-8 in der Struktur und Wirkung sehr ähnlich ist. Deswegen wurde es in der vorliegenden

Arbeit als Messgröße verwandt.

Beim MCP-1 handelt es sich um ein Zytokin, das hauptsächlich von stimulierten Monozyten,

Makrophagen, Endothelzellen, aber auch von verschiedenen anderen Zellen produziert wird.

Es hat eine proinflammatorische Wirkung, da es chemotaktisch auf alle bisher identifizierten

migratorischen Immunzellen wirkt. Zeitlich ist es jedoch dem IL-6 nachgeordnet

(OPPENHEIM JJ. 2001; VAN GRIENSVEN 2003). Für die Entstehung des I/R-Schadens ist

das MCP-1 ein besonders wichtiges Zytokin, weil es chemotaktisch auf neutrophile

Granulozyten wirkt und eine verstärkte Expression von Adhäsionsmolekülen verursacht.

Zusätzlich wandelt es das Rolling der PMN auf der Endothelwand in eine stabile Bindung

zwischen Zelle und Gefäßwand, wodurch eine Migration der Granulozyten erst ermöglicht

wird. Nach einem Kontakt der Endothelwand mit aktivierten Thrombozyten wird MCP-1

unter anderem direkt von den Gefäßwandzellen produziert. Ebenfalls wichtig für die

Pathogenese des I/R-Schadens ist die Tatsache, dass IL-8 spezifisch neutrophile Granulozyten

aktiviert, indem es einen Anstieg von Calcium im Zytosol, eine erhöhte Freisetzung von

Enzymen aus den Granula bewirkt und zusätzlich den Metabolismus der Sauerstoffradikale

heraufsetzt. Die Anwesenheit von IL-1 und TNF-α stimulieren die Freisetzung von MCP-1.

Der in dieser Arbeit ermittelte Normalwert der Kontrolltiere ist 45,53 pg/ml. Die Werte der

Laparotomie 48 h Gruppen steigen auf die maximal doppelte Konzentration an (bis 96,41

pg/ml). Liegt die Laparotomie nur 8 h zurück, so sind die Werte deutlich höher und liegen

zwischen 184,18 pg/ml (WT) und 380,60 pg/ml (T-). Es ist erkennbar, dass allein die

Laparotomiewunde das Immunsystem der Tiere aktiviert, indem es vermehrt MCP-1

ausschüttet, um so einer Infektion vorzubeugen. Neutrophile Granulozyten als

phagozytierende Zellen werden auf diese Weise schnell auf einen möglichen Infektionsherd

aufmerksam gemacht. Bereits nach 48 h nimmt die Produktion dieses Zytokins deutlich ab.

Diskussion 107

Weiterhin konnte beobachtet werden, dass die MCP-1 Konzentration der Gruppe WT I/R 8 h

auf etwa das 23-fache des Normalwertes der Kontrolltiere ansteigt (1062,74 pg/ml). Die

Werte der Knockout-Tiere sind im Vergleich hierzu deutlich geringer und steigen auf das

maximal 11-fache (T-: 480,78 pg/ml; F-: 358,53 pg/ml). Es müssen allerdings wie bereits

erwähnt Einschränkungen bei der Beurteilung gemacht werden, da rein-stämmige und

gemischt-stämmige Tiere miteinander verglichen wurden. Bereits 48 h nach I/R ist die MCP-

1 Konzentration aller Versuchstier-Stämme auf ähnliche Werte im Bereich zwischen 109,12

(F-) und 223,98 (T-) abgesunken.

Der Gendefekt scheint sich demnach auf die Höhe der MCP-1 Konzentration der

Versuchstiere auszuwirken. Wie bereits oben erwähnt stimuliert die Anwesenheit des TNF-α

die Produktion von MCP-1. Da dieser jedoch bei den Knockout-Tieren nur in geringerem

Maße produziert wird und das Zytokin aufgrund des Fehlens des TNF-RI nicht wirken kann,

scheint auch der Einfluß auf die Sekretion des MCP-1 gehemmt.

Von mehreren Autoren wurde beschrieben, dass das MCP-1 ein wichtiges Zytokin bei der

Entstehung des ARDS bei Traumapatienten ist. MATSUBARA et al. (1996) identifizierten

das IL-8 als einen Hauptchemoattractor für die neutrophilen Granulozyten in das

Lungengewebe. Sie konnten nachweisen, dass die IL-8-Konzentration mit der Zahl der PMN

in der BAL korreliert. Auch AGGARWAL et al. (2000) sehen einen Zusammenhang

zwischen der Anzahl neutrophiler Granulozyten im Lungengewebe und der Höhe der IL-8-

Konzentration. Da das Zytokin zusätzlich die Phagozytose, Degranulation und

Sauerstoffradikalfreisetzung der PMN verstärkt, ist eine Schädigung des Lungengewebes

nach der Migration nicht mehr zu verhindern. Ist der IL-8-Wert (neben IL-1β, IL-6 und

TNF-α) bei Traumapatienten permanent erhöht, so ist mit einem schlechten Outcome zu

rechnen (IKUTA 1996; MEDURI 1995b). KURDOWSKA et al. (2001) sehen jedoch keinen

prediktiven Wert für das Outcome des ARDS bei alleiniger Bestimmung der IL-8-

Konzentration. Es müsse der Komplex aus Zytokin und Anti-IL-8-Antikörpern betrachtet

werden. Bei verstorbenen Patienten seien die Werte für diesen Komplex besonders hoch.

In der vorliegenden Arbeit konnte festgestellt werden, dass ein Fehlen des TNF-RI oder des

TNF-RI in Verbindung mit dem Fcγ-RIII eine reduzierte IL-8-Freisetzung zur Folge hat. Dies

wiederum bewirkt eine verringerte Migration von neutrophilen Granulozyten und somit die

Ödembildung in Lunge und Leber.

Diskussion 108

In der vorliegenden Arbeit wurde das IL-12p70 stellvertretend für das IL-12 gemessen, da

dieses Zytokin aus einer p70 und einer r35 Untereinheit besteht. Das IL-12 wird hauptsächlich

von B-Lymphozyten produziert und stellt einen growth-factor für T- und NK-Zellen dar.

Damit löst es unter anderem die zelluläre Immunantwort aus. Außerdem ist das IL-12 in der

Lage, die Bildung von IFN-γ in peripheren Lymphozyten zu induzieren (OPPENHEIM JJ.

2001). Da die Produktion von IFN-γ und IL-12 eng miteinander verknüpft sind, konnten wie

bei dem IFN-γ auch für das IL-12 nur schwach variierende Konzentrationen im Serum der

Versuchstiere festgestellt werden und schwanken zwischen 0 und 24,98 pg/ml. Der

Normalwert der Kontrolltiere beträgt 0 pg/ml. Auch das IL-12 wird demnach nur in geringem

Maße nach einem Ischämie-/Reperfusions-Reiz gebildet und spielt somit bei der Entstehung

des I/R-Schadens keine entscheidende Rolle.

IFN-γ ist ein Zytokin, was hauptsächlich von T- und NK-Zellen produziert wird. Es hat

sowohl eine antivirale als auch eine antiparasitäre Wirkung, außerdem werden Makrophagen

durch dieses Zytokin aktiviert. Im Serum von Traumapatienten kann man häufig erhöhte

IFN-γ-Werte feststellen.

In der vorliegenden Arbeit fallen für dieses Zytokin sehr homogene Messwerte auf: Sie

variieren bei allen Gruppen zwischen 0 und 15,21 pg/ml. Der Normalwert der Kontrolltiere ist

0 pg/ml. Demnach ist keine Relevanz für die Entstehung des Ischämie/Reperfusions-Schadens

zu beobachten. Grund hierfür ist die Tatsache, dass besonders neutrophile Granulozyten für

die Organschäden verantwortlich gemacht werden können. Da IFN-γ jedoch hauptsächlich

von T-Zellen produziert wird, sind die Zytokinwerte erwartungsgemäß sehr niedrig. Eine

Beeinflussung der Messdaten aufgrund des Genotypes der Versuchstiere war ebenfalls nicht

festzustellen.

Wie bereits am Anfang der Diskussion erwähnt, müssen alle Ergebnisse unter

Berücksichtigung der Tatsache betrachtet werden, dass rein-stämmige Kontrolltiere mit

gemischt-stämmigen Versuchstieren verglichen wurden. Hierdurch könnten Unterschiede

beobachtet worden sein, die nicht auf das Fehlen bestimmter Gene, sondern auf den

Stammunterschied der Mäuse zurück zuführen sind.

Zusammenfassung 109

7 Zusammenfassung

Nina Zündel:

Der Einfluss von Fcγ-RIII und TNF-RIII auf den Respiratory Burst von neutrophilen

Granulozyten in Abhängigkeit vom Migrationsprozess in einem Ischämie-Reperfusions-

Modell der Maus

Die neutrophilen Granulozyten spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese des

Ischämie/Reperfusions-Schadens. Sie gelangen, von Zytokinen chemotaktisch geleitet, über

das Endothel ins Organparenchym, wo sie eine schädliche Wirkung ausüben und schließlich

zu einem Multiorgan-Dysfunktion-Syndrom führen können. Die Schädigung wird maßgeblich

von den Produkten des respiratory burstes hervorgerufen.

In der vorliegenden Arbeit soll mit Hilfe von Knockout-Mäusen die Rolle verschiedener

Zytokine und der Rezeptoren TNF-RI und Fcγ-RIII bei der Organschädigung untersucht

werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind jedoch nur unter Vorbehalt zu interpretieren, da bei

den Versuchen rein-stämmige Kontrolltiere mit gemischt-stämmigen Knockout-Tieren

verglichen wurden. Es besteht deshalb die Möglichkeit, dass die beobachteten Effekte nicht

durch das Fehlen einzelner Gene, sondern durch den Stammunterschied der Versuchstiere

hervorgerufen wurden.

Die Ergebnisse zeigen eine Schädigung der Organe aufgrund von PMN-Infiltrationen und

Ödembildung. In der Frühphase nach Ischämie-Reperfusion ist eine besonders starke

Affektion der Lunge (gemessen anhand der Lungenpermeabilität, des interstitiellen Ödems,

der Granulozyteninfiltration im histologischen Präparat und der MPO-Aktivität) zu

beobachten. Sie ist bereits nach acht Stunden festzustellen und bleibt auch nach 48 Stunden

bestehen. Eine Schädigung der Leberzellen, ausgedrückt durch die hydropische Degeneration,

konnte besonders in der Spätphase nach Ischämie-Reperfusion beobachtet werden, wobei die

stärkste Degeneration nach 48 h auftrat. Bei beiden Knockout-Stämmen ist eine geringere

Beeinträchtigung der Organe zu bemerken als bei den WT-Tieren. Somit wirkt sich das

Fehlen eines oder beider Rezeptoren positiv auf die Situation der Organe aus. Zusätzlich

konnte bei den Knockout-Tieren eine signifikant geringere Sekretion der für den I/R-Schaden

wichtigen Zytokine TNF-α, MCP-1 und IL-6 beobachtet werden. Bedeutende Unterschiede

Zusammenfassung 110

zwischen den T--und F--Tieren wurden bei den jeweiligen Untersuchungen nicht festgestellt,

so dass ein additiver oder synergistischer Effekt beim Fehlen beider Rezeptoren

ausgeschlossen werden kann. Insgesamt ist ein statistisch signifikanter Zusammenhang

zwischen der Art des Traumas und dem Outcome zu verzeichnen. Tiere, die einer I/R

ausgesetzt waren, verstarben häufiger als Tiere, die lediglich einer Laparotomie oder Ischämie

unterworfen wurden. Zwischen den verschiedenen Stämmen und dem Outcome war kein

signifikanter Unterschied zu bemerken, jedoch wurde in den Knockout-Gruppen eine deutlich

geringere Letalitätsrate als bei den WT beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Fehlen

des TNF-RI durchaus einen protektiven Effekt vor der Ausbildung von Organschäden hat.

Der Fcγ-RIII hat für die Pathogenese des I/R-Schadens keine Bedeutung, möglicherweise ist

er jedoch an der Vorbeugung einer Sepsis beteiligt.

Summary 111

8 Summary

Nina Zündel:

The influence of Fcγ-RIII and TNF-RI on the respiratory burst of neutrophilic

granulocytes dependent on the migration process in a murine ischemia-reperfusion-

model

Neutrophilic granulocytes are very important for the pathogenesis of a damage caused by

ischemia-reperfusion. They get into the parenchyma through the endothelium conducted

chemotactically by cytokines, where they have a damaging effect and finally lead to a MODS.

The damage is substantially caused by the products of the respiratory burst.

The influence of different cytokines and the receptors TNF-RI and Fcγ-RIII on the organic

damage is to be investigated in the paper on hand with the help of knockout-mice. Because

pure-background controll animals were compared to mixed-background knockout-mice there

is a limitation in the interpretation of the results. It might be possible that the shown

differences are reasoned by the different type of background and not by the knocked out

genes.

The results show a damage of the organs caused by PMN-infiltration and formation of

oedemas. In an early phase after ischemia-reperfusion a very strong affection of the lung can

be observed (studied by the permeability of the capillaries in the lungs, the interstitial oedema,

the infiltration of PMN into the histological preparation and the MPO-activity). It can be

diagnosed even after 8 hours and continues to exist after 48 hours. A damage of the livercells

showed by the hydropic degeneration could be observed especially in the late phase post

trauma, whereas the strongest degeneration was found after 48 h. Both knockout-lines show a

lower interference of the organs than the wildtype-animals. Obviously the lack of one or both

receptors has a positive effect on the situation of the organs. In addition the knockout-animals

showed a significantly lower secretion of the cytokines TNF-α, MCP-1 and IL-6 causing the

I/R-damage. Eminent differences between the T-- and F--animals weren’t found during the

tests so that the lack of both of the receptors excludes an additive or synergistic effect.

Summary 112

Altogether there really is a statistically significant correlation between the kind of trauma and

the outcome. Animals which were exposed to a I/R died more frequently than those which

only underwent a laparotomy or ischemia. Between the different lines and the outcome no

significant difference was found, but the groups of both knockout-lines showed a clearly

recognizable lower mortality-rate than the WT. The results show that lacking the TNF-RI

absolutely has a protective effect on the development of the organic harm. However, the Fcγ-

RIII is without meaning for the pathogenesis of the I/R-damage but possibly it is necessary

during the development of sepsis.

Literaturverzeichnis 113

9 Literaturverzeichnis

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Danksagung 139

10 Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. vet. M. Kietzmann danke ich für die bereitwillige Übernahme der Betreuung und die gute & humorvolle Zusammenarbeit. Außerdem möchte ich mich für die schnelle Korrektur der Arbeit bedanken. Leider konnte ich Sie bis heute nicht davon überzeugen, dass die Haare ROT waren und nicht blau... Prof. Dr. rer. biol. hum. M. van Griensven: Martijn, Dir gilt ein besonders großes „Dankeschön“. Nur durch Deine einzigartige Kooperation und die unkomplizierte Art war es möglich, die Arbeit so schnell erfolgreich abzuschließen. Du hast alle Fragen (sowohl fachlich als auch den Computer betreffend) geduldig beantwortet (...wenn es sein mußte, auch zweimal...) und hattest für alle kleinen und großen Problem während der Experimente ein offenes Ohr. Auch in der sehr hektischen „Endphase“ hast Du mich großartig unterstützt. VIELEN, VIELEN DANK! Frau Claudia Pütz, Frau Iris Albers, Frau Dr. Tanja Bakhausen und Frau Diana Dudacy möchte ich für die hervorragende Unterstützung im Labor und die schnelle Anfertigung der histologischen Präparate danken. In den Mittagspausen und Inkubationsphasen entstanden sehr häufig interessante und lustige Gespräche. Seither bin ich fest davon überzeugt, dass man Leute herbeireden kann. Meinen Eltern danke ich ganz besonders, da Ihr mir sowohl das Tiermedizinstudium als auch die Anfertigung der Doktorarbeit ermöglicht habt, obwohl beides mit großen Entbehrungen für Euch selbst verbunden war. Besonders die Fußmassagen von Dir, Mutti, haben zur Wortfindung in dieser Arbeit und zur Seelentröstung während der Prüfungszeiten beigetragen. Vati, Dir möchte ich für die einzigartige detektivische Leistung beim Aufspüren der Fehler in dieser Arbeit danken. Auf Deine zweifelnde Frage vom April 1980: „ Vater, was bist Du für ein Vater?“ antworte ich Dir: „Ein guter.“ Daggi, an Dich geht ebenfalls ein großer Dank für das Korrekturlesen und besonders für die finanzielle Unterstützung in der Anfangsphase der Dr.-Arbeit. Vielen Dank, Werner, dass Du das Kuckucksei in Deinem Nest geduldet und sogar unterstützt hast... Meiner Schwester Janka möchte ich danken, dass sie schon früh meinen Ehrgeiz maßgeblich beeinflußt hat (weil sie grundsätzlich besser war als ich...). Dir, Tanja, danke ich für eine außergewöhnliche Freundschaft seit dem ersten Semester! „Keiner ist so verrückt, dass er nicht einen noch Verrückteren findet, der ihn versteht.“ (F. Nietzsche) „Viele Menschen treten in Dein Leben, aber nur wenige hinterlassen Spuren.“ Michel, ich danke Dir für Deine realistischen Einschätzungen während dieser Arbeit, auch, wenn ich sie meist nicht hören wollte. Für alles, was Du für mich bist: Danke.

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