Immobilisierung von Corynebakterium simplex durch Photovernetzung von vinyliertem Polyvinylalkohol zur mikrobiologischen Steroidumwandlung

Die Angewandte Makromolekulare Chemie 113 (1983) 179-202 (Nr. 1800)

Institut for Organische Chemie der Freien Universitat Berlin, D-1000 Berlin 33

Immobilisierung von Corynebakterium simplex durch Photovernetzung von vinyliertem Polyvinylalkohol zur mikrobiologischen

Steroidumwandlung

Georg Manecke und Wilfried Beier

(Eingegangen am 9. Juli 1982)

ZUSAMMENFASSUNG: Die Steroidumwandlung von Hydrocortison zu Prednisolon wurde mit immobili-

sierten Corynebakterium simplex-Zellen (A.T.C.C. 6946) untersucht. In partiell mit Acrylsaure verestertem Polyvinylalkohol wurden die Zellen durch Bestrahlung des Polymeren mit sichtbarem bzw. UV-Licht in Gegenwart von Riboflavin-5 '-monophosphat durch Photovernetzung immobilisiert. Die Steroid-Al-Dehydrogenase- Aktivitat der immobilisierten Zellen lie0 sich durch Enzyminduktion erhbhen.

Die Abhangigkeit der Steroid-Al-Dehydrogenase-Aktivitat von der Zell-, Substrat- und Cofaktorkonzentration, der Reaktionstemperatur und der Lbsungsmittelkonzen- tration wurde untersucht. Die Halbwertszeit der Immobilisate wurde mit und ohne Nahrmedium bestimmt. Die Aktivitat der Corynebakterium simplex-Immobilisate betrug 169 pmol/g,,, h mit einer relativen Aktivitat von 246%.

SUMMARY: The steroid transformation of hydrocortisone to prednisolone with immobilized

Corynebacter simplex (A.T.C.C. 6946) was investigated. The whole cells were en- trapped in a photocrosslinkable poly(viny1 alcohol) derivative, which was obtained by partial esterification of PVA with acrylic acid. The crosslinking was performed with visible or UV-light. Riboflavin-5 '-monophosphate (sodium salt) acted as photosen- sitizer.

The steroid-Al-dehydrogenase activity of the immobilized cells increased in the presence of an inducer such as hydrocortisone. The influence of cell-, substrate- and cofactor-concentration, the temperature and the organic solvent-concentration on the steroid-A1 -dehydrogenase activity was investigated. The half-life was determined with and without nutrients. The activity of the cell-polymer-conjugate was 169 pmol/ gconj. h with a relative activity of 246%.

0 1983 Hiithig & Wepf Verlag, Base1 OOO3-3146/83/$03.00/0 179

G. Manecke und W. Beier

1. Einleitung

Immobilisierte mikrobielle Zellen konnen in ihrer Eigenschaft als hetero- gene Biokatalysatoren zur Erganzung und Erweiterung von chemischen Syn- thesemoglichkeiten eingesetzt werdenlJ. Wie aus der Vielzahl der Veroffent- lichungen zu erkennen ist, haben immobilisierte Zellen ein besonderes Inter- esse auf dem Gebiet der Steroid-Chemie gefunden3. Besonders auf diesem Gebiet sind die mikrobiologischen Verfahren den rein chemischen Methoden uberlegen. Zur Immobilisierung ganzer Zellen sind im Prinzip die von der Enzymimmobilisierung bekannten Techniken anwendbar4. Am erfolgreich- sten erscheint die Immobilisierung der mikrobiellen Zellen durch Einschlul3 in die Poren vernetzter Gele. Die im Polymeren fixierten Zellen bleiben che- misch unverandert, sind jedoch im dreidimensionalen polymeren Netzwerk geometrisch fest eingeschlossen.

Die Vernetzungsreaktion des Polymeren mu13, da sie in Gegenwart der Mi- kroorganismen stattfindet, unter physiologischen Reaktionsbedingungen ab- laufen, d. h. in isotonischen Losungen bei fur die Mikroorganismen vertragli- chen pH-Werten und bei mmigen Temperaturen. Eine Schadigung der Zel- len durch toxisch wirkende Verbindungen fuhrt ebenfalls zu einem teilweisen oder auch vollstandigen Aktivitatsverlust der immobilisierten Mikroorganis- men. Wie ein kurzlich von uns zur Immobilisierung von C. simplex unter- suchtes mit Thiolgruppen funktionalisiertes Polyvinylalkohol-Derivat zeigte, ist die nachtragliche Vernetzung eines wasserloslichen Prapolymeren ein schonendes und wirksames Immobilisierungsverfahrens.

Ein durch polymeranaloge Reaktion von Polyvinylalkohol mit Acrylsaure synthetisiertes wasserlosliches Polymeres lie13 sich nach verschiedenen Ver- fahren zu unloslichen Immobilisaten kovalent vernetzen. Die Eignung des vinylierten Polyvinylalkohols zur Immobilisierung ganzer mikrobieller Zellen wurde mit Corynebakterium simplex (A.T.C.C. 6949) untersucht. Mit den C. simplex-Immobilisaten wurde Hydrocortison zu Prednisolon dehydriert:

CH2OH CH2OH I I

A I-DEHYDROGENASE

0 Cor ynebak torium simplex

HYDROCORTI SON PREDNI SOLON

180

Immobilisierung von Corynebakterium simplex

Die Steroidumwandlung wird oft in Gegenwart des Cofaktors Menadion (Vitamin K3) durchgefuhrt6.

Mehrere Autoren berichten uber die Immobilisierung von C. simplex in Polyacrylamid-Gelen, Ca-Alginat, Collagen-Membranen sowie in Polybuta- dien und Polypropylenglykol/Polyethylenglyko17-13.

2. Versuchsergebnisse und Diskussion

2. I Herstellung des Polymeren und Immobilisierung von Corynebakterium simplex

Durch eine polymeranalog durchgefiihrte Veresterung von Polyvinylalko- hol (PVAL) mit Acrylsaure wurden wasserl6sliche Polymere mit den folgenden strukturellen Einheiten hergestellt:

Durch Variation des molaren Verhaltnisses von Hydroxylgruppen des Polyvinylalkohols zu Acrylsaure wurden Polymere mit unterschiedlichem Vinylgruppen-Gehalt synthetisiert.

Die quantitative Analyse der Vinylgruppen erfolgte durch Bromaddi- tion14. In Tab. 1 ist die Zahl der in die polymere Matrix eingefuhrten Vinyl- gruppen in Abhangigkeit von der Zusammensetzung der Komponenten im Reaktionsansatz dargestellt.

Tab. 1. Vinylgruppen-Gehalt der Polymeren.

Molares Verhgltnis Vinylgruppen-Gehalt PVAL/Acrylsaure des Polymeren im Reaktionsansatz ( m ' w g )

1:l 0,41 1 :2 0,80 1:4 1,20

181

G . Manecke und W. Beier

Die funktionalisierten Polyvinylalkohol-Derivate wurden nach Dialyse und Lyophilisierung in Phosphat-Puffer aufgenommen und als 8proz. (w/v) Polymerlosung zur Immobilisierung von C. simplex eingesetzt .

Mit dem vinylierten Polyvinylalkohol wurde die Vernetzungsreaktion mittels eines niedermolekularen Vernetzers und eines Initiators sowie die Photo- vernetzung durch UV- und sichtbares Licht in Gegenwart eines Photosensi- bilisators untersucht.

Ein in Phosphat-Puffer (25 mmol l-l Na,HPO, - 12 H,O und 25 mmol l-l KH,PO,) suspendiertes C. simplex-Trockenpulver wurde rnit der Polyme- renlosung gleichmmig vermengt.

Der Mischung wurde der Vernetzer und der Initiator bzw. der Photosensi- bilisator zugesetzt. Die Immobilisierungsreaktionen erfolgten unter nichtste- rilen Reaktionsbedingungen. Die Photovernetzung des vinylierten Polyvinyl- alkohols erfolgte in Gegenwart von Riboflavin-5 '-monophosphat (Na-Salz) (Vitamin B,) als Photosensibilisator. Die Initiierung der Vernetzungsreak- tion erfolgt hier nach dem von Oster l5 formulierten Mechanismus:

1 h . v Riboflavin-H, + - 0, - Riboflavin-H + OH'

Die reduzierte Form des Riboflavins reagiert bei Bestrahlung rnit Licht rnit atmospharischem Sauerstoff zur semichinoiden Form des Riboflavins unter Bildung von freien Hydroxylradikalen. Die entstehenden Radikale fuhren dann zur vernetzenden Polymerisation der Vinylgruppen des Polymeren.

Die rnit den Bakterien und dem Photosensibilisator vermengte Polymerlo- sung wurde auf einer Glasplatte rnit UV- bzw. sichtbarem Licht bestrahlt. Nach I-stundigem Bestrahlen rnit dem UV-Licht einer 300 Watt Photolampe bzw. nach 3-stundigem Bestrahlen rnit dem sichtbaren Licht einer 250 Watt Lampe bildeten sich mechanisch stabile Folien, in denen die Mikroorganis- men durch Einschlul3 immobilisiert waren. Die Temperatur im Strahlengang der Photolampen betrug maximal 25 "C.

Die Photovernetzung des vinylierten Polyvinylalkohols ist im folgenden Reaktionsschema dargestellt:

2

"'dH..~.. ..b..;5;;-.. I c=o I

I c=o &€l cn

tnzy !HZ

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Die als Folien mit einer Dicke von ca. 0,l mm anfallenden Immobilisate wurden nach 24-stundigem Waschen mit Phosphat-Puffer lyophilisiert und danach in kleine Bruchstucke von 1 bis 9 mm2 Flache zerrieben. Fur das rnit sichtbarem Licht photovernetzte Immobilisat (0,41 d q Vinylgruppen/g Polymer) wurde die fur die Steroidurnwandlung optimale Zellkonzentration durch Variation des Gewichtsverhtiltnisses von Mikroorganismen zum Poly- meren ermittelt. Die Immobilisierungsreaktionen erfolgten nach den Anga- ben in 3.2. Die in den photovernetzten Polymeren eingeschlossene Zellmenge wurde durch Stickstoff-Analyse ermittelt. Die Ergebnisse konnten durch gravimetrische Bestimmung bestatigt werden. Es wurde gefunden, da13 zwischen 50 und 86% der bei der Immobilisierungsreaktion eingesetzten Zell- menge in den Polymeren eingeschlossen wurde.

Die Steroidumwandlungen erfolgten im auf 30 "C thermostatisierten Schuttler nach den Angaben in 3.5 mit 100 mg Immobilisat in 50 ml Sub- stratlosung, die 2,O mmol I - ' Hydrocortison, 0,5 mmol 1-' Menadion und 1 Yo DMF enthielt. Vor der Steroidumwandlung wurden die Immobilisate 24 h in Phosphat-Puffer, der 0,5 mmol 1-1 Hydrocortison und 1% DMF enthielt, bei 30°C inkubiert (s. 3.4).

In Tab. 2 ist die Aktivitat der Immobilisate in pmol Prednisolon/g,,,, h bzw. in pmol Prednisolon/g,,,., h in Abhangigkeit von der Zellkonzentra- tion angegeben.

Tab. 2. Abhangigkeit der AktivitM der C . simplex-Immobilisate von ihrer Zellkonzentration.

Gewichtsverh. Zellkonzen- Aktivitat b, Aktivitlts- C . simplex/ tration im ausbeute" Polymer beim Immobilisat a)

Immobilisieren (gBakt. /itIrnrn. 1 (vmol/g,,,. h) (vmol/gBakt. h)

1 0,30 29,l 97,O 111 2,5 0,m 61,8 103,O 118 5 0,73 135,O 184,9 212 7 3 0,79 169,O 213,9 246 9 0,82 147,2 179,5 206

10,5 0,85 125,o 147,l 169

a) Errechnet aus dem Stickstoff-Gehalt der Immobilisate. b, Aktivitatsmessung mit 100 mg Immobilisat in 50 ml Substratlosung (2,O mmol l-'

Hydrocortison, 0,5 mmol 1-' Menadion, 1070 DMF, 50 mmol 1 - I Phosphat-Puffer, pH 6,8) bei 30°C nach Inkubation.

c, Aktivitat der freien C . simplex: 87 prnol/g,,,, h.

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Die photovernetzten Immobilisate zeigten mit h8herer Zellkonzentration eine zunehmende Aktivitat bei der Steroidumwandlung. Aufgrund der er- schwerten Diffusion des Substrates und des fur die Reaktion notwendigen Sauerstoffes kommt es jedoch bei hohen Zellbeladungen (bei den Immobili- saten mit Zellkonzentrationen iiber 0,79 g C. simplex/g Immobilisat) zu einem Aktivitatsabfall. Innerhalb des untersuchten Konzentrationsbereiches von 0,41 bis 1,2 d q Vinylgruppedg Polymer zeigten die Immobilisate nur geringe Aktivitatsunterschiede. Die Steroidumwandlungen erfolgten mit ge- ringerer Aktivitat, wenn die Inkubationsdauer weniger als 24 Stunden betrug. Langere Inkubationszeiten als 24 Stunden fiihrten zu keinem weiteren Anstieg der Aktivitat. In Abb. 1 ist die Abhangigkeit der Aktivitat von der Dauer der Inkubation dargestellt.

I I I I I

0 2 L 48 72 96

lnkubationsdauer ( h I

Abb. 1 . Aktivitat der C. simplex-Immobilisate in Abhtingigkeit von der Inkuba- tionsdauer. 100 mg Immobilisat (0,79 g C. simplex/g Immobilisat) in 50 ml Substratlbsung, bestehend aus 2,O mmol 1- ' Hydrocortison, 0,5 mmol 1- ' Menadion, 1% DMF in 50 mmol 1-1 Phosphat-Puffer, pH 6,8 bei 3 O O C .

Die Inkubation bewirkte bei den polymerfixierten C. simplex eine Enzym- induktion. Diese fiihrte im Vergleich mit nicht inkubierten Immobilisaten zu h8heren Aktivitaten. Es ist bekannt, da8 die Steroid-Al-Dehydrogenase der C. simplex zu den induzierbaren Enzymen gehbrt.

184

Immobilisierung con Corynebakterium simplex

Die Hydrocortison-Konzentration in den Inkubationslosungen betrug bei allen durchgefuhrten Untersuchungen in Anlehnung an Udvardy 0,5 mmol 1-1 16. Jedoch fanden wir in unseren Untersuchungen eine hohere Aktivitat, wenn die immobilisierten Mikroorganismen in hoher-konzentrierten Hydro- cortison-Losungen inkubiert wurden. Steroidhormone wie Hydrocortison fuhren zu einer Steigerung und Spezialisierung der Proteinbiosynthese und erhohen damit die Enzymaktivitat. Eine entsprechende Behandlung von Im- mobilisatproben mit Phosphat-Puffer ohne Hydrocortison-Zusatz fuhrte zu keinem Anstieg der Enzymaktivitat. Enthielt die Inkubationsldsung den Co- faktor Menadion, so wurde die Enzyminduktion blockiert und die damit be- handelten Immobilisate zeigten keine Erhohung der Aktivitat bei den Ste- roidumsetzungen. Durch Bestimmung des Stickstoff-Gehaltes konnte ermittelt werden, da13 die Zellkonzentration der Immobilisate wahrend der Inku- bation nicht verandert wurde. Es kann daher ausgeschlossen werden, da13 die Erhohung der Aktivitat auf einer Vermehrung der Mikroorganismen in den polymeren Netzwerken beruht.

Die Enzyminduktion fuhrte auch dazu, da13 die inkubierten C . simplex- Immobilisate eine hohere Aktivitat bei den Steroidumwandlungen aufwiesen als das bei der Immobilisierungsreaktion verwendete C . simplex-Trocken- pulver . In einer vergleichenden Untersuchung wurde der zeitliche Verlauf der Prednisolon-Bildung fur inkubierte und nicht inkubierte Immobilisate sowie fur freie, nicht inkubierte C . simplex bestimmt (Abb. 2). Die Steroid- umwandlungen erfolgten mit 100 mg Immobilisat (0,79 g C . simplex/g Im- mobilisat) bzw. mit 79 mg freiem C . simplex in 50 ml Substratlosung (Zu- sammensetzung in 3.3) unter nicht-sterilen Reaktionsbedingungen.

Wie aus Abb. 2 hervorgeht, ist unter den vorhandenen Reaktionsbedin- gungen die Aktivitat sowie der erreichbare Umsatz zu Prednisolon bei den inkubierten Immobilisaten im Vergleich zu den nicht inkubierten Immobili- saten und den freien C . simplex deutlich erhoht.

Die biokatalytische Aktivitat der polymergebundenen und der freien Mi- kroorganismen kann durch den Ausdruck der Aktivitatsausbeute (y) quanti- tativ verglichen werden”. Die Aktivitatsausbeute ist ein Ma13 fur die direkt mefibare Bruttoaktivitat und ist das prozentuelle Verhaltnis der spezifischen Reaktionsgeschwindigkeiten der immobilisierten ( v ~ , ~ ~ ) und der freien Zellen

100% (1)

(Vs,frei) (GI. 1): - .

Vs,frei

Die Abhangigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v, von der Zellmasse X und der Produktkonzentration [PI ist in G1. 2 angegeben:

185


I I I I 1 1 1 2 3 4 5 6

R e a k t i o n s z c i t I h )

Abb. 2. Zeitlicher Verlauf der Prednisolon-Bildung. 0 C. simplex-Immobilisat (vor Inkubation); A C. simplex-Immobilisat (nach Inkubation); o freies C. simplex. 100 mg Immobilisat (0,79 g C. simplex/g Immobilisat) bzw. 79 mg freies C . simplex, Reaktionsbedingun- gen wie in Abb. 1 angegeben.

Aus dem linearen Anfangsbereich der Umsatzkurven aus Abb. 2 lassen sich die spezifischen Reaktionsgeschwindigkeiten v, der immobilisierten und der freien Zellen und damit die Aktivitatsausbeuten berechnen (Tab. 3).

Bei der Photovernetzung des vinylierten Polyvinylalkohols mit UV-Licht wurde eine Abhangigkeit der Aktivitat der Immobilisate von der Bestrah- lungsdauer bei der Immobilisierungsreaktion gefunden. Energiereiche UV- Strahlen konnen bei langerer Bestrahlungsdauer bei den Mikroorganismen Mutationen ausldsen und damit die biokatalytische Aktivitat erniedrigen 18.

Es wurde daher untersucht, wie die enzymatische Aktivitat der Mikroorga- nismen durch die Dauer der UV-Bestrahlung bei der Immobilisierung beein- flufit wird (Tab. 4).

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Tab. 3. Spezifische Reaktionsgeschwindigkeiten der freien und immobilisierten C. simplex.

Reaktions- Aktivitats- geschwindigkeit v, a) ausbeute (Pmol/g,a,t. h) (VO)

freies C. simplex 87,O immobilisiertes C. simplex vor Inkubation 33,O nach Inkubation 213,9

37,9 246,O

a) Messung rnit 100 mg Immobilisat (0,79 g C. simplex/g Immobilisat) bzw. mit 79 mg freiem C . simplex. Zusammensetzung der Substratliisung wie in Tab. 1 angegeben.

Die Untersuchung erfolgte mit einem Immobilisat der Zellkonzentration 0,77 g C. simplex/g Immobilisat in der in 3.3 angegebenen Substratlosung. Die Photovernetzungsreaktion erfolgte nach den Angaben in 3.2.

Aus Tab. 4 geht hervor, dal3 wie zu erwarten die Aktivitat der polymerfixierten Mikroorganismen mit zunehmender Bestrahlungsdauer abnimmt. Bei einer langeren Bestrahlungsdauer als 1,5 Stunden verlieren die immobilisierten Mikroorganismen bereits einen Teil ihrer biokatalytischen Aktivitat.

Die Photovernetzungsreaktion mit sichtbarem Licht ist demnach der Pho- tovernetzung rnit UV-Licht vorzuziehen.

Tab. 4. Einflurj der Dauer der UV-Bestrahlung bei der Photovernetzung auf die Aktivitat der Immobilisate.

Bestrahlungsdauer a) mit UV-Licht Aktivitatb) (h) (Pmo1/g,mm. h)

1 165 1,s 165 2 137 395 65 4 s 29

a) Bestrahlung mit einer 300 Watt Photolampe aus 40 cm Abstand. b, Immobilisatmenge und Reaktionsbedingungen wie in Tab. 2. angegeben.

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Die radikalische Vernetzung des vinylierten Polyvinylalkohols mit K2S20, und 3-(Dimethylamino)-propionitril als Initiatoren fuhrte ebenfalls zu einem mechanisch stabilen Immobilisat. Zwei Minuten nach Zugabe der Initiatoren bildete sich ein gelartiges Reaktionsprodukt, in dem die Mikroorganismen durch EinschluD immobilisiert waren.

Ein auf diese Art hergestelltes Immobilisat mit 0,74 g C . simplex/g Immo- bilisat zeigte nach Inkubation bei den Aktivitatsbestimmungen in Substratlo- sungen nach 3.3 eine maximale Aktivitat von 15 pmol/g,-, h. Hier betrug die Aktivitatsausbeute 23,3%. Sie ist damit deutlich niedriger als bei den photovernetzten Immobilisaten.

Die Veranderung des Polymeren durch Zugabe eines niedermolekularen bifunktionellen Vernetzers (N,N '-Methylendiacrylamid) fuhrte in 1 bis 2 Mi- nuten nach Zusatz der 0. g. Initiatoren zu einer Reaktion, wobei ein vernetztes polymeres Reaktionsprodukt erwartet werden konnte.

+ H2C=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CHz

vernetztes Reaktionsprodukt

Die Aktivitatsausbeute der in diesem Polymeren eingeschlossenen Zellen betrug ebenfalls etwa 20%. Die geringe Aktivitat beruht wahrscheinlich auf einer teilweisen Schadigung der eingeschlossenen Zellen durch die toxisch wirkenden monomeren Verbindungen. Auch die geringe Kontaktzeit von nur wenigen Minuten zwischen den Mikroorganismen und den niedermolekularen Reagenzien konnte eine Schadigung der Bakterien nicht verhindern. Die Vernetzung des vinylierten Polyvinylalkohols mittels eines zusatzlichen niedermolekularen Vernetzers erwies sich somit im Vergleich mit den photovernetzten Reaktionsprodukten fur Immobilisierungsreaktionen als ungun- stig.

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2.2 Abhangigkeiten der Steroid-Al-Dehydrogenase-Aktivitat der immobilisierten und freien C. simplex

Die im nachfolgenden beschriebenen Abhangigkeiten der katalytischen Aktivitat der polymerfixierten C. simplex bei der Umwandlung von Hydro- cortison zu Prednisolon wurden mit photovernetzten Immobilisaten untersucht, die eine Zellkonzentration von 0,79 g C. simplex/g Immobilisat aufwiesen. Der Vinylgruppen-Gehalt des fur die Immobilisierung verwendeten Polymeren betrug 0,41 d q / g .

2.2.1 Abhangigkeit der Aktivitat von der Substrat-Konzentration

Die Abhangigkeit der Aktivitat der immobilisierten und der freien C . simplex von der Hydrocortison-Konzentration wurde bei gleichbleibender Me- nadion-Konzentration (0,5 mmol 1-l) und DMF-Konzentration (1 To) untersucht.

Mit zunehmender Substratkonzentration erhdhte sich die Aktivitiit der immobilisierten sowie der freien Zellen. Bei Hydrocortison-Konzentrationen uber 2,O mmol 1 - kristallisierte ein Teil des Hydrocortisons aus. Dies fiihrte dann zu niedrigeren Aktivitaten. Die ermittelten Ergebnisse sind in Tab. 5 zusammengefafit.

Tab. 5. EinfluD der Hydrocortison-Konzentration auf die Aktivitat der immobilisierten sowie der freien C. simplex.

Hydrocortison- Aktivitata) Konzentration

Immobilisat freies C. simplex (mmol l-l) (POl/g,m,. h) (WOl/gBakt. h)

30,l 76,2

108,9 158,8 169,O 135,4

22,o 48,l 70,O

100,4 -

a) Reaktionsbedingungen wie in Tab. 2 angegeben.

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Die immobilisierten C. simplex wandelten von der eingesetzten Substrat- mehge maximal 90% zu Prednisolon um, wobei der Abbau des Hydrocorti- sons vollstandig war. DaB das Hydrocortison nicht vollkommen zu Predni- s d h umgewandelt wurde, laBt sich durch einen eventuellen Abbau der Steroide im allgemeinen Stoffwechsel der Zellen deuten.

Die Bestimmung der K,(,,,,-Werte und der maximalen Reaktionsgeschwin- digkeiten v,, der immobilisierten sowie der freien C. simplex erfolgte durch Auswertung der Lineweaver-Burk-Diagramme (Abb. 3).

- I / I I / -

- 1 0 1 2 3 L 5

l / [Hydrocor t i son ] ( I . inmot-' )

Abb. 3. Lineweaver-Burk-Darstellung fur immobilisiertes und freies C. simplex. A C. simplex-Immobilisat; o freies C. simplex.

Fur die immobilisierten Mikroorganismen ergab sich ein KM(,,,)-Wert von 2,54 mmol 1-I und ein v,,-Wert von 528,9 pmol/g,,,, h. Der K,,,,-Wert fur die freien C. simplex ergab sich zu 1,32 -011-' und v,, betrug hier 168,l

190


pmol/g,,,, h. Der im Vergleich zu den freien Zellen hohere K,(,,,,-Wert der immobilisierten Zellen ist auf die eingeschrankte Diffusion des Substrates in der polymeren Matrix der Immobilisate zuriickzufiihren.

2.2.2 Abhangigkeit der Aktivitat von der Cofaktor-Konzentration

Menadion (Vitamin K3) fungiert bei der Steroidumwandlung als Cofaktor und wurde der Substratlosung in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Nach der enzymatischen Reduktion des Menadions wird der Cofaktor durch Oxidation mit atmospharischem Luft-Sauerstoff erneut in seine chi- noide Form uberfuhrt.

Die Abhangigkeit der Aktivitat der immobilisierten und der freien Zellen von der Menadion-Konzentration ist in Vo der maximalen Aktivitat in Abb. 4 dargestellt. Die Steroidumwandlungen erfolgten in Substratlosungen nach den Angaben in 3.3.

I I I I I 0 01 1 012 01 3 014 015

M enadio n - K onzen t ra t i on [ rnrnol , 1-l I

Abb. 4. Einflurj der Menadion-Konzentration auf die Aktivitlt der immobilisierten und freien C. simplex. A C. simplex-Immobilisat; o freies C. simplex.

Fur die immobilisierten Zellen lag die optimale Menadion-Konzentration bei 0,5 mmol 1-'. Hier wurde eine Aktivitat von 169 pmol/g,,,,,. h ermittelt.

191


Bei den freien Zellen wurde bereits bei einer Menadion-Konzentration von 0,3 mmol 1-' die maximale Aktivitat erreicht.

Die Funktion des Cofaktors bei der mikrobiologischen Umwandlung von Hydrocortison zu Prednisolon kann u. a. auch von N-Methylphenazonium- methosulfat ubernommen werden. N-Methylphenazonium-methosulfat er- reichte jedoch nur 70% der Wirksamkeit des Menadions.

2.2.3 Abhangigkeit der Aktivitat von der Temperatur

Die Beeinflussung der enzymatischen Aktivitat der freien und der immobilisierten Zellen durch die Reaktionstemperatur wurde in den in 3.3 angegebenen Substratlosungen untersucht.

In Abb. 5 ist der Einflufl der Temperatur auf die Aktivitat in Vo der bei 30 "C gefundenen maximalen Aktivitat dargestellt.

1-30

- % 7 5 - c :a c

'; 5 0 ._ e Y Q

I

20 30 h 0 50

T e r n p e r a t u r ( O C )

Abb. 5. Temperaturabhangigkeit der Aktivitat der freien und immobilisierten C . simplex. A C. simplex-Immobilisat; o freies C . simplex.

Das Temperaturoptimum lag fur die immobilisierten ebenfalls wie fur die freien C. simplex bei 30°C. Bei 50°C verloren die Immobilisate ebenso wie die freien C. simplex vollstandig ihre biokatalytische Aktivitat.

192

Irnrnobilisierung von Corynebakterium simplex

2.2.4 EinfluD organischer Losungsmittel auf die Aktivitat der Zellen

Wegen der geringen Loslichkeit der Steroide in Wasser ist es oft notig, den Substratlosungen organische Losungsmittel zuzusetzen. Hier zeigte N,N-Di- methylformamid (DMF) fur Hydrocortison besonders gute Losungseigen- schaften.

Eine hohe DMF-Konzentration in der Substratlosung erhoht zwar die Lbs- lichkeit des Substrates sowie des Cofaktors, jedoch kann gleichzeitig eine Schadigung der Mikroorganismen durch das organische Losungsmittel her- vorgerufen werden. In den nach 3.3 zusammengesetzten Substratlosungen wurde die DMF-Konzentration im Bereich von 0 bis 3% variiert.

Die Aktivitaten sind in 070 der maximalen Aktivitat gegen die DMF-Kon- zentration der Substratlosung in Abb. 6 aufgetragen.

x 7 5 - w

0 1 2 3

D M F - K o n z e n t r a t i o n ( %

Abb. 6. EinfluD der DMF-Konzentration auf die Aktivitat der freien und immobilisierten C . simplex. A C . simplex-Immobilisat; o freies C. simplex.

Bei den Substratumsetzungen ohne DMF-Anteil lagen Hydrocortison und Menadion in feinverteilter Form in der Substratlosung fest vor. Das nur ge- ring wasserlosliche Hydrocortison wurde dennoch von den immobilisierten C . simplex mit 65% der maximalen Aktivitat zu Prednisolon umgewandelt.

193


Von den freien C. simplex wurden in einer DMF-freien Substratlosung das Hydrocortison mit 87% der hier maximalen Aktivitat zu Prednisolon umgesetzt. Das Optimum der DMF-Konzentration lag fur die immobilisierten C. simplex bei 1% DMF-Anteil in der Substratlosung. Bei hoheren DMF-Kon- zentrationen wurde - vermutlich aufgrund einer Schadigung der Mikro- organismen - ein Aktivitatsabfall festgestellt. Fur die freien C. simplex lag die optimale DMF-Konzentration bei 0,5 Yo.

Einige von uns ebenfalls untersuchte organische Losungsmittel besal3en zwar eine geringere Loslichkeit fur Hydrocortison, zeigten jedoch z. T. geringere toxische Nebenwirkungen bei den immobilisierten Mikroorganis- men. Die Untersuchungen wurden sowohl mit wasserldslichen als auch mit wasserunloslichen organischen Losungsmitteln, im letzteren Fall in einem Zwei-Phasen-System, durchgefuhrt. Den Substratlosungen (2,O mmol 1- Hydrocortison, 0,5 mmol 1-' Menadion in Phosphat-Puffer) wurden 10% (v/v) des Losungsmittels zugesetzt. Wegen der geringeren Loslichkeit des Hydrocortisons in den organischen Losungsmitteln wurde den Substratlo- sungen aul3erdem noch DMF zugegeben (DMF-Konzentration: 0,2% (v/v)).

Der Umsatz zu Prednisolon nach 24-stundiger Steroidumwandlung ist in Tab. 6 fur die verschiedenen Substratlosungen dargestellt.

Fur die Methanol a ls Losungsmittel enthaltende Substratlosung wurde in einer naheren Untersuchung gefunden, dal3 ahnlich wie im Falle der DMF- haltigen Substratlosung auch hier die Aktivitat der immobilisierten Mikroor- ganismen mit zunehmender Methanol-Konzentration abnimmt. Umsetzun- gen in organischen Losungsmitteln ohne Zugabe von wMrigen Pufferlosun- gen fiihrten in allen Fallen zur Inaktivierung der Immobilisate.

2.3 Halbwertszeit der Immobilisate

Ein wiederholter Einsatz der immobilisierten Mikroorganismen erscheint dann wirtschaftlich, wenn die biokatalytische Aktivitat der Immobilisate uber mehrere Umsetzungen moglichst unverandert hoch bleibt. Durch ein Wachstum der Mikroorganismen in den Polymeren oder durch Reinkuba- tion ist es auch moglich, die Aktivitat im Verlauf mehrerer Umsetzungen noch zu steigern. Es wurde von uns das katalytische Stabilitatsverhalten der C. simplex-Immobilisate bei mehreren aufeinanderfolgenden Reaktionsan- satzen untersucht.

Nach jeweils 24-stundiger Steroidumsetzung in Substratlosungen mit 2,O mmol 1-' Hydrocortison, 0,5 mmol 1-' Menadion und 1 Vo DMF wurde die

194


Tab. 6. Umwandlung von Hydrocortison zu Prednisolon mit den C. simplex- Immobilisaten in organischen Ldsungsmitteln.

Umsatz zu Prednisolona) nach 24 h (070)

wasserlosliche Losungsmittel: Substratlosung enthalt 0,2% (v/v) DMF 69,8

+ lo% (v/v) DMF 8,1 + 10% (v/v) Methanol 52,2 + lo% (v/v) Propano1 0 + lo% (v/v) Dioxan 10,6

wasserunlosliche Losungsmittel: Substratlosung enthalt 0,2070 (v/v) DMF 69,8

+lo% (v/v) n-Hexan 58,l + 10% (v/v) Chloroform 16,4 + 10% (v/v) Essigsaure-

ethylester 2,3 + l o % (v/v) Toluol 12,o

a) Messung mit 100 mg Immobilisat (0,79 g C. simplex/g Immobilisat) in 50 ml Substratlosung (2,O mmol 1- I Hydrocortison, 0,s mmol 1-' Menadion, 0,2% (v/v) DMF und 10% (v/v) organisches Losungsmittel in 50 mmol 1 -' Phosphat-Puffer) bei 30°C.

Prednisolon-Konzentration bestimmt. Die Substratltisungen wurden nach jedem Reaktionsansatz erneuert und das mit Phosphat-Puffer gewaschene Immobilisat erneut zur Steroidumwandlung eingesetzt. In Abb. 7 sind die Umsatze zu Prednisolon gegen die Zahl der Umsetzungen aufgetragen. Bei vollstandigem Hydrocortison-Abbau wurden bei dem ersten Reaktionsan- satz 90070 der eingesetzten Substratmenge zu Prednisolon umgewandelt.

Wie aus Abb. 7 zu ersehen ist, zeigen die C. simplex-Immobilisate bei den wiederholten Reaktionsansatzen nur eine geringe enzymatische Stabilitat. Die Halbwertszeit betrug unter diesen Reaktionsbedingungen 2 Tage. Lars- son et al. l9 berichten, dal3 Menadion zwar die Aktivitat der Mikroorganis- men bei den Steroidumwandlungen erhoht, jedoch die katalytische Langzeit- Stabilitat merklich erniedrigt. In einer weitergehenden Untersuchung wurde gefunden, dal3 auch geringe Konzentrationen an Menadion (0,05 mmol1k1)

195


I I I I I I I 1 3 5 7 9 11 13

U m s c t z u n g e n ( T a g e )

Abb. 7. Wiederholte Steroidumwandlungen mit C . simplex-Immobilisaten (mit und ohne Menadion). o 100 mg Immobilisat (0,79 g C. simplex/g Immobilisat) in 50 ml Substrat- losung, bestehend aus 2,O mmol 1-1 Hydrocortison, 0,s mmol 1-' Mena- dion, 1070 DMF in 50 mmol 1 - I Phosphat-Puffer, pH 6 3 bei 30 "C. A Reaktionsbedingungen und Substratldsung wie oben, jedoch ohne Me- nadion.

die enzymatische Stabilitat bei aufeinanderfolgenden Reaktionsansatzen ver- mindert. Die Halbwertszeit liea sich in keinem Falle erhohen, wenn Mena- dion als Cofaktor der Substratlosung zugesetzt wurde. Wurde N-yethyl- phenazonium-methosulfat als Cofaktor der Substratlosung zugesetzt, betrug die Halbwertszeit ebenfalls 2 Tage.

Die enzymatische Stabilitat bei wiederholten Reaktionsansatzen erhohte sich in auffklliger Weise, wenn die Steroidumwandlung in Abwesenheit eines Cofaktors durchgefuhrt wurde. Diese Untersuchungen wurden in Substrat- losungen mit 2,O mmol 1-' Hydrocortison und 1% DMF durchgefuhrt. Mit derselben Immobilisatprobe wurden 14 aufeinanderfolgende 24-stundige Substratumsetzungen durchgefuhrt. Die Substratlosung wurde nach jedem Umsatz erneuert und das Immobilisat nach Waschen mit Phosphat-Puffer erneut zur Steroidumwandlung verwendet.

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Wie ebenfalls aus Abb. 7 hervorgeht, erhohte sich der Umsatz zu Predni- solon vom ersten zum zweiten Reaktionsansatz um mehr als das Doppelte und erhohte sich in geringerem Mal3e mitunter auch wahrend der weiteren Umsetzungen. Da hier die Reaktionsbedingungen der Steroidumsetzungen den Reaktionsbedingungen der Inkubation gleichen, liegt der beobachtete Anstieg der Prednisolon-Bildung wahrscheinlich in einer erneuten Enzymin- duktion begrundet. Der maximale Umsatz zu Prednisolon lag hier jedoch nur bei 28%. Die Halbwertszeit erhohte sich unter diesen Reaktionsbedin- gungen auf 14 Tage.

Bei den ohne Cofaktor durchgefuhrten Steroidumsetzungen wurde in un- regelmaiger Folge ein Abbau von bereits gebildetem Prednisolon durch die immobilisierten Mikroorganismen festgestellt. Ein Abbau des Steroidpro- duktes wurde verstarkt beobachtet, wenn der cofaktorfreien Substratlosung Nahrstoffe in Form von 0,2070 Pepton zugesetzt wurden. Der Abbau des Prednisolons wird nach Sih 2o vermutlich durch eine 9-a-Hydroxylierung ein- geleitet. Die nachfolgende Oxidation der Hydroxylgruppe fiihrt dann zu einer Offnung des Steroid-B-Ringes.

Der Einflun von Nahrmedien auf die Stabilitat der Steroid-A1 -Dehydro- genase-Aktivitat wurde eingehender untersucht.

Nach jeweils 24-stundiger Steroidurnwandlung mit den immobilisierten Mikroorganismen in Substratlosungen nach 3.3 wurde der Umsatz zu Pred- nisolon bestimmt. Danach wurden die Immobilisate in Nahrlosungen ver- schiedener Zusammensetzung reaktiviert. Die Reaktivierung erfolgte in 24 Stunden bei 30 "C unter aeroben Bedingungen.

Nach der Reaktivierung wurden die Immobilisate mit Phosphat-Puffer gewaschen und der Umsatz zu Prednisolon nach erneuter 24-stundiger Steroid- umwandlung bestimmt. Die Cyclen wurden wiederholt mit denselben Immo- bilisatproben durchgefuhrt.

Die Nahrlosungen bestanden wie folgt aus: a) 0,5070 Pepton (aus Sojabohnenmehl, papainisch verdaut) b) 0,5070 Pepton und 0,2070 a-D-Glucose c) 0,5070 Maisquellwasser 0,1070 Hefeextrakt (65proz., pH 7) 0,05070 Starkezucker (fliissig, 60proz.)

in Phosphat-Puffer.

Zum Vergleich wurde eine Immobilisatprobe nach den 24-stundigen Ste- roidumwandlungen in Phosphat-Puffer 24 Stunden bei 30 "C gelagert und dann die nachste Substratumsetzung vollzogen.

197


Es zeigte sich, dalj das nicht reaktivierte Immobilisat eine geringere enzymatische Stabilitat aufwies. Das in Nahrlosung c) reaktivierte Immobilisat zeigte die hochste enzymatische Stabilitat bei den aufeinanderfolgenden Re- aktionsumsatzen (Abb. 8).

- 100 , I I I I

I I I I I

1 2 3 4 5

U m s e t z u n g e n

Abb. 8. EinfluD der Reaktivierung mit Nahrldsungen auf die enzymatische Stabili- tat der Immobilisate. Reaktivierungsmedium in Phosphat-Puffer: 0 0,5% Pepton (aus Sojabohnenmehl, papainisch verdaut) A 0,5% Pepton und 0.2% a-D-Glucose o 0,5% Maisquellwasser, 0,l Yo Hefeextrakt (65proz., pH 7), 0,05%

Starkezucker (flussig, 60proz.). Reaktivierung in 24 h bei 3OoC, Sub- stratlosung wie in Abb. 1 angegeben;

4 ohne Reaktivierung.

Die photochemische Vernetzung von mit Vinylgruppen funktionalisiertem Polyvinylalkohol erwies sich als eine wirksame und schonende Methode zum EinschluD von ganzen mikrobiellen Zellen in polymere Netzwerke. Die Mi- kroorganismen kommen wahrend der Immobilisierungsreaktion nur mit dem hier offensichtlich nicht toxisch wirkenden Polymeren und dem Photo- sensibilisator in Kontakt. Die Zerlegung des Produktionsprozesses zur Her- stellung von Immobilisaten in mehrere aufeinanderfolgende Teilschritte, wie es die Verwendung von Prapolymeren mit nachfolgender Funktionalisierung

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und die anschlierjende Immobilisierung der Mikroorganismen darstellen, er- laubt die Optimierung jedes einzelnen Verfahrensschrittes. Daraus ergeben sich Vorteile gegenuber der direkten vernetzenden Copolymerisation von Monomeren und der Immobilisierung in einem einzigen Verfahrensschritt.

3. Experimen teller Teil

Herkunft der venvendeten Substanzen und Mikroorganismen: Polyvinylalkohol (Molekulargewicht ca. 72000, Hydrolysierungsgrad 98070, Merck- Schuchardt), Acrylsaure (Ferak/Berlin), Riboflavin-5 '-monophosphat (Na-Salz), (Fluka), N,N '-Methylendiacrylamid (Merck), Menadion (Merck), N-Methylphenazonium-methosulfat (Fluka), Pepton (aus Sojabohnenmehl, Merck), Hefeextrakt, Sttirkezucker, Maisquellwasser (Schering/Berlin), Hydrocortison, Prednisolon, Corynebakterium simplex-Trockenpulver (Schering/ Berlin).

Gerate: Polarecord E 505 und E 506 (Metrohm/Herisau)

3. I Herstellen des Polymeren

22 g Polyvinylalkohol (PVAL) (0,5 mol Hydroxyl-Gruppen) wurden in 250 ml 1 N Salzsaure bei 80 OC gelost. Unter Stickstoff-Atmosphare wurde Acrylsaure in unterschiedlichen molaren Verhaltnissen (1 : 1 bis 1 : 4) der Polymerlosung zugesetzt. Die Losung wurde 3 h bei 90°C und danach bei Raumtemperatur weitere 24 h geruhrt. Die Polymerlosung wurde nach Neutralisation gegen Wasser dialysiert und danach lyop hilisiert .

Die quantitative Analyse des Vinylierungsgrades erfolgte in Anlehnung an die Me- thode der Jodzahl-Bestimmung 14:

400 mg des vinylierten PVAL wurden in 15 ml Wasser gelost und mit 1 ml wariger Bromlosung (aus 1 ml Brom und 3 g NaBr in 25 ml Wasser) unter Schutteln bei 30°C im lichtgeschutzten Reaktionsgefao 2 h umgesetzt. 10 ml der Analysenlosung wurden mit 5 ml einer l0proz. KJ-Losung versetzt und das entstehende Jod mit 0,Ol N Na- triumthiosulfat-Losung unter Zusatz von Starke titriert. Eine Blindwert-Bestimmung erfolgte rnit nicht derivatisiertem PVAL.

3.2 Immobilisierungsreaktion

10 ml einer 8proz. (w/v)-Losung des vinylierten PVAL in Phosphat-Puffer (25 mmol 1-' N%HPO,. 12 H,O und 25 mmol l-' KH,PO,) wurden ublicherweise mit

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einer Suspension von 6 g C. simplex in 25 ml Phosphat-Puffer vermengt. Der Mischung wurden die niedermolekularen Reagenzien bzw. der Photosensibilisator zugesetzt.

Photovernetzung : Die Polymer-Bakterien-Mischung wurde rnit 80 mg Riboflavin-5 '-monophosphat

(Na-Salz) (10 Gew.-Vo) versetzt und die Mischung gleichmuig auf einer 600 cm2 gro- Den Glasplatte ausgestrichen. Die Bestrahlung mit sichtbarem Licht erfolgte rnit einer 250 Watt Lampe aus 20 cm Abstand. Wahrend der 3-stundigen Vernetzungsreaktion wurde die Temperatur im Strahlengang mittels eines auf die Lampe gerichteten Ge- blases auf 25 "C begrenzt.

Die Bestrahlung rnit dem UV-Licht einer 300 Watt Photolampe (Osram, Vitalux) erfolgte aus 40 cm Abstand. Die Temperatur im Strahlengang betrug hier ebenfalls maximal 25 "C. Die als Folien anfallenden Immobilisate wurden 24 h bei 30 "C unter Schutteln in Phosphat-Puffer gewaschen und danach lyophilisiert. Die Folien (Dicke: ca. 0,l mm) wurden auf Bruchstucke von 1 bis 9 mm2 Flache zerrieben und bis zur Steroidumwandlung als Lyophilisat bei - 25 "C gelagert. Bei dieser Lagerbedingung wurde innerhalb von 6 Monaten kein Aktivitatsverlust festgestellt.

Vernetzung rnit niedermolekularen Reagenzien: Die Polymer-Bakterien-Mischung wurde rnit 100 mg K2S20, und 200 ~1 3-(Di-

methylamino)-propionitril versetzt. Nach Zugabe der niedermolekularen Reagenzien trat innerhalb von 2 min die Gelbildung ein. Das Immobilisat wurde 24 h in Phos- phat-Puffer gewaschen und danach lyophilisiert. Das Immobilisat wurde zermahlen und auf die KorngrdDe 0,5 - 1 ,O mm ausgesiebt. Die Veranderung des polymeren Pro- duktes mittels eines niedermolekularen bifunktionellen Vernetzers erfolgte durch Zu- gabe einer aquivalenten Menge N,N '-Methylendiacrylamid.

3.3 Substratlosung

Hydrocortison und Menadion wurden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelost und mit Phosphat-Puffer (25 mmol I - ' Na2HP04 * 12 H 2 0 und 25 mmol I- ' KH,P04) die gewunschte Substratkonzentration eingestellt. Die Substratlosung fur die Steroid- umsetzung bestand ublicherweise aus 2,O mmol 1-' Hydrocortison, 0,5 mmol 1-1 Me- nadion und 1 Yo (v/v) DMF. Eine von dieser Substratlosung abweichende Zusammen- setzung ist im Text an entsprechender Stelle angegeben.

3.4 Inkubation

100 mg des lyophilisierten C. simplex-Immobilisates wurden vor der Steroidum- wandlungsreaktion in 50 mlO,5 mM Hydrocortison-Losung (in Phosphat-Puffer, 1 Vo DMF) im thermostatisierten Schuttler bei 30°C 24 h inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Immobilisat mit Phosphat-Puffer gewaschen.

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3.5 Aktivitatsbestimmungen

Die Steroidumwandlung erfolgte mit 100 mg des inkubierten C . simplex-Immobili- sates in 50 ml einer auf 30°C thermostatisierten Substratlosung im Schuttler bei 160 U/min. Alle Steroidumwandlungen erfolgten unter nicht sterilen Reaktionsbedingun- gen.

Die Prednisolonbildungsgeschwindigkeit wurde in einstundigen Intervallen mittels Differential-Pulspolarographie bestimmt. Die quantitative Analyse des Depolarisa- tors (Prednisolon) erfolgte durch Eichung mit einer Losung bekannter Hydrocor- tison-Prednisolon-Konzentration. Es wurden ublichenveise 500 pl der Reaktionslo- sung mit 10 ml Phosphat-Puffer versetzt und ein Polarogramm aufgenommen. Durch Vergleich der Stromwerte wurde die unbekannte Prednisolonkonzentration bestimmt.

Die Aktivitat der Immobilisate wurde aus dem Umsatz zu Prednisolon innerhalb der ersten 5 h der Steroidumwandlung ermittelt. Die Aktivitaten werden in pmol Prednisolon/g,,,, h bzw. in pmol Prednisolon/g,,,, h angegeben.

Wir danken der Fa. Schering, Berlin, fur die Uberlassung des Hydrocorti- sons, des Prednisolons und des Corynebakterium simplex-Trockenpulvers.

T. R. Jack, J. E. Zajic, Adv. Biochem. Eng. 5 (1977) 126 G. Durand, J. M. Navarro, Process Biochem. 1978, 14 J. Klein, Nachr. Chem. Tech. Lab. 29 (1981) 850 und dort zitierte Literatur G. Manecke, Chimia 28 (1974) 467 G. Manecke, W. Beier, Angew. Makromol. Chem. 104 (1982) 39 R. Jerussi, H. J. Ringold, Biochemistry 4 (1965) 2113 S. Ohlson, P. 0. Larsson, K. Mosbach, Biotechnol. Bioeng. 20 (1978) 1267 P. 0. Larsson, S. Ohlson, K. Mosbach, Nature 263 (1976) 796 S. Ohlson, P. 0. Larsson, K. Mosbach, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 7 (1979) 103

lo K. Venkatasubramanian, A. Constantinides, W. R. Vieth, Enzyme Eng. 3 (1978) 29 A. Constantinides, Biotechnol. Bioeng. 22 (1980) 119

l2 T. Omata, A. Tanaka, T. Yamane, S. Fukui, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotech- nol. 6 (1979) 207

l 3 K. Sonomoto, A. Tanaka, T. Omata, T. Yamane, S. Fukui, Eur. J. Appl. Micro- biol. Biotechnol. 6 (1979) 325

l4 H. Roth, in Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl-Muller), 4. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1953, Bd. 11, S. 33

l5 G. Oster, Nature 173 (1954) 300 l6 E. N. Udvardy, Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 21 (1974) 237

201


J. Klein, Kontakte (Merck) 3 (1980) 29 E. Jawetz, J. L. Melnick, E. A. Adelberg, Medizinische Mikrobiologie, (Ubers.: G. Maass, R. Thomssen), 5. Aufl., Springer, Berlin, Heidelberg, New York 1980

l9 P. 0. Larsson, S. Ohlson, K. Mosbach, Enzyme Eng. 4 (1978) 317 2o C. J. Sih, Biochim. Biophys. Acta 62 (1962) 541

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Documents

Immobilisierung von Corynebakterium simplex durch Photovernetzung von vinyliertem Polyvinylalkohol zur mikrobiologischen Steroidumwandlung